WO2015099302A1 - Vegf에 특이적으로 결합하는 vegf-bpb - Google Patents

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WO2015099302A1
WO2015099302A1 PCT/KR2014/011494 KR2014011494W WO2015099302A1 WO 2015099302 A1 WO2015099302 A1 WO 2015099302A1 KR 2014011494 W KR2014011494 W KR 2014011494W WO 2015099302 A1 WO2015099302 A1 WO 2015099302A1
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vegf
sequence
peptide binder
bpb
amino acid
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PCT/KR2014/011494
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전상용
김성현
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Gwangju Institute of Science and Technology
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Gwangju Institute of Science and Technology
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Definitions

  • VEGF-BPB that specifically binds to VEGF
  • the present invention relates to VEGF-BPB that specifically binds to VEGF.
  • Angiogenesis plays an important role in physiological processes such as embryonic development of the vasculature, wound healing, and the sperm of the female reproductive system during pregnancy. Usually, this process is delicately regulated by the balance of various neovascularization and inhibitory factors. Imbalances between these factors lead to abnormal blood vessel growth leading to pathological conditions such as rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy and cancer.
  • VEGFC Vascular endothelial growth factor is an endothelial cell-specific mitogen that induces proliferation and migration of endothelial cells and promotes lumen formation (TaT ela, T., Enholm, B., Alitalo, ⁇ . & Paavonen, K Cardiovasc.Res. 65, 550-563 (2005)).
  • the prominent expression of VEGF receptors on endothelial cell surfaces is motivated by anti-angiogenic strategies based on inhibiting the interaction between VEGF and its receptors (Aiello, LP et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10457-10461 (1995).
  • VEGF neutralizing monoclonal antibody bevacizumab Avastin
  • Avastin SELEX-derived RNA aptamer Macugen
  • Peptide drugs are promising alternatives to large biological molecules such as antibodies and RNA aptamers.
  • the advantages of peptides as a therapeutic agent are low production costs, Its high safety and responsiveness, less exposure to unwanted immune systems, can inhibit antibody production against the peptide itself, and modification through synthesis is easy and accurate.
  • most peptides show low affinity and specificity for specific protein targets compared to antibodies, they cannot be used in many applications (Ner i, D. & Bicknel l, R. NAt. Rev. Cancer). 5, 436-446 (2005)).
  • new peptide-based antibody replacement drugs that can overcome the disadvantages of these peptides.
  • VEGF-specific BPB VEGF-specific BPB
  • BPB2 VEG ⁇ 1 BPB2 VEG ⁇ 1 "BPB targeting another VEGF.
  • the present invention was completed by finding that the affinity for the target is much higher than that of VEGF, and thus the targeting ability for VEGF is very excellent.
  • an object of the present invention is to provide a VEGF-bipodal peptide binder (VEGF-BPB) that specifically binds to VEGF.
  • VEGF-BPB VEGF-bipodal peptide binder
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding VEGF-BPB.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenesis-related diseases.
  • Another object of the invention is to prevent or prevent angiogenesis-related diseases To provide a treatment.
  • the present invention provides a structure stabilizer (structure stabilizing region) ⁇ -hairpin; And an amino acid sequence of a target binding region I and a sequence binding second sequence including the amino acid sequence of the sequence listing first sequence bonded to both ends of the structure stabilization site directly or through a linker, respectively.
  • a VEGF-bipodal peptide binder VEGF-BPB
  • the present inventors have tried to develop peptide molecules that specifically bind human VEGF.
  • VEGF-specific BPB BPB2 VEGF
  • BPB2 VEGF the basic structure of the bipodal peptide binder (BPB) previously developed by the present inventors, and this BPB2 VEGF is more effective than other BPBs targeting VEGF.
  • the affinity for the target was very high and the targeting ability for VEGF was found to be very good.
  • the present invention basically adopts the structure of the BPB.
  • BPB is an affinity peptide first proposed by the present inventors, and peptides linked to a target are linked to both ends of a rigid peptide backbone.
  • the VEGF-BPB of the present invention contains a ⁇ -hairpin as a structure stabilizing site as a rigid peptide backbone, and the ⁇ -hairpin functions to stabilize the overall structure of ⁇ , and the target binding site I and the target binding site II are target molecules. Enhance binding to (VEGF).
  • ⁇ -hairpin refers to the simplest protein motif comprising two ⁇ strands, the two ⁇ strands representing an antiparallel alignment with each other.
  • the two ⁇ strands are generally linked by turn sequences.
  • the turn sequence applied to the ⁇ -hairpin Type I, type ⁇ , type II, type ⁇ ', type in or type ffl' turn sequence.
  • turn sequences represented by X-Pro-Gly-Glu-Val; or Ala-X-Gly-Glu-Val (X is selected from 20 amino acids) can also be used for ⁇ -hairpins.
  • the type I turn sequence is Asp-Asp-Ala-Thr-
  • type ⁇ turn sequence is Glu-Asn-Gly-Lys
  • type ⁇ turn sequence is X-Pro-Gly-Glu-Val
  • Ala-X-Gly-Glu-Val is 20 amino acids
  • type ⁇ ′ turn sequence is Glu-Gly-Asn-Lys or Glu-D-Pro-Asn- Lys.
  • Peptides with ⁇ -hairpin formulations are well known in the art. See, for example, US Pat. No. 6,914,123 and Andrea G. Cochran et al. , PNAS, tryptophan zipper disclosed in 98 (10): 5578-5583, template-fixed ⁇ -hairpin mimetic disclosed in WO 2005/047503, disclosed in US Pat. No. 5,807,979.
  • ⁇ -hairpin variants are well known.
  • peptides having a ⁇ -hairpin conformationol are described in Smith & Regan (1995) Science 270: 980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47: 251-276; Kim & Berg
  • Tryptophan zippers used in the present invention can be represented by the following general formula (I):
  • 3 ⁇ 4 is Ser or Gly-Glu, X2 and X ' 2 are independently of each other Thr, His,
  • X 3 is Trp or Tyr, is type I, type I 1 , type ⁇ , type ⁇ 'or type ⁇ or type ⁇ turn sequence, 3 ⁇ 4 is Trp or Phe, 3 ⁇ 4 is Trp or Val and X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • Xi is Ser or Gly-Glu
  • 3 ⁇ 4 and X'2 are independently of each other Th ⁇ His or Val
  • X 3 is Trp or Tyr
  • X 4 is Type I
  • Type I 1 type ⁇ or type ⁇ ′ turn sequence
  • ⁇ 5 is Trp or Phe
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Val
  • X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • Xi is Ser or Gly-Glu
  • X 2 and ⁇ ′ 2 are independently of each other Thr, His or Val
  • X 3 is Trp
  • X 5 is Trp and 3 ⁇ 4 is Trp and ⁇ X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • 3 ⁇ 4 is Ser and 3 ⁇ 4 and X'2 are
  • Trp is type ⁇ turn sequence (ENGK) or type ⁇ 1 turn sequence (EGN)
  • ⁇ 3 ⁇ 4 is Trp
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • X 7 is Lys.
  • the tryptophan zipper comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 sequence.
  • ⁇ -haepin peptides usable as structural stabilization sites in the present invention are peptides derived from B1 domaine of protein G, ie GB1 hairpin peptides.
  • the structural stabilization site may be represented by the following general formula ⁇ : Formula ⁇
  • 3 ⁇ 4 is Arg, Gly-Glu or Lys—Lys, 3 ⁇ 4 is Gin or Thr, 3 ⁇ 4 is type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ 'or type m or type ⁇ turn sequence, is Gin, Thr -Glu Or Gln-Glu.
  • the structural stabilization site of formula II is represented by the following general formula ⁇ ⁇ :
  • 3 ⁇ 4 is Gly-Glu or Lys-Lys
  • 3 ⁇ 4 is type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ 'or type m or type ⁇ ' turn sequence
  • 3 ⁇ 4 is Thr-Glu or Gln-Glu.
  • HP peptide Another ⁇ -hairpin peptide that can be used as a structural stabilization site in the present invention is an HP peptide.
  • the structural stabilization site may be represented by the following general formula m:
  • 3 ⁇ 4 is Lys or Lys-Lys
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Tyr
  • 3 ⁇ 4 is Val or Thr
  • 3 ⁇ 4 is Type I ⁇ Type 1 ', Type II, Type ⁇ ' or Type ⁇ or Type ⁇ turn sequence
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Al a
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Val
  • X 7 is Glu or Gln-Glu.
  • ⁇ -hairpin peptides usable as structural stabilization sites in the present invention can be represented by the following general formula IV:
  • 3 ⁇ 4 is Lys-Thr or Gly
  • X 2 is Trp or Tyr
  • 3 ⁇ 4 is type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ 'or type m or type ⁇ turn sequence and is Thr-Glu or Gly.
  • VEGF-target binding site I and VEGF-target binding site ⁇ are directly or indirectly bound through a linker.
  • VEGF-target at both ends of the structure stabilization By binding the binding sites I and ⁇ to produce a peptide binder in a bipodal manner.
  • the VEGF-target binding sites I and ⁇ cooperatively bind to the target, thereby greatly increasing the affinity for VEGF.
  • the VEGF-BPB of the present invention may include a linker between the target binding site and the structural stabilization site to block a cross-structural effect between the VEGF-target binding site and the structural stabilization site.
  • the linker functions as a structure influence inhibiting region.
  • the linker is an amino acid linker.
  • Amino acids having relatively free rotation of ⁇ and ⁇ in a BPB peptide molecule can be used as the amino acid linker.
  • Amino acids with relatively free rotation of ⁇ and ⁇ are glycine, alanine and serine.
  • the linker is a peptide linker.
  • Peptide linkers can be used in any known in the art. The sequence of a suitable peptide linker may be selected in consideration of the following factors: (a) the ability to be applied to a flexible extended confomat ion; (b) the ability not to create secondary structures that interact with biological target molecules; And (c) the absence of hydrophobic residues or residues with charges that interact with the biological target molecule. Peptide linkers may comprise Gly, Asn and Ser residues. Other neutral amino acids such as Thr and Ala can also be included in the linker sequence. Suitable amino acid sequences for linkers are described in Maratea et al. Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8258-8562 (1986); US Pat. Nos. 4,935,233, 4,751,180, and 5,990,275.
  • the sequence of the peptide linker may consist of 1-50 amino acid residues, in one particular example 1-10 amino acids, in another specific example 1-8, in another specific example 1-3, another specific example. Examples may consist of 1-2 amino acid residues.
  • the amino acid residues include glycine, alanine and serine.
  • the bipodal peptide binder comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the VEGF-BPB of the present invention includes not only the sequences of the VEGF-BPB of the present invention, but also biological equivalents thereof, as described in the specification, within the range of the binding activity for VEGF.
  • further changes can be made to the amino acid sequence of the target binding site to further improve the binding affinity and / or other biological properties of VEGF-BPB.
  • Such modifications include, for example, insertions and / or substitutions of amino acid sequence residues.
  • Such amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent equivalents.
  • the hydropathic index of amino acids can be considered in introducing the mutation.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index depending on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is of great importance in contributing to the interacting biological funct ion of proteins. It is well known that substitution with amino acids having similar hydrophobicity indexes will retain similar biologically activeols. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitutions are made between amino acids that exhibit a hydrophobicity index difference of preferably less than 2, more preferably within 1 and even more preferably within 0.5. On the other hand, it is also well known that substitutions between amino acids having similar hydrophilicity values result in proteins with equivalent biological activity. As disclosed in US Pat. No.
  • hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+3.0 ⁇ 1); Glutamate (+ 3.0 ⁇ 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0.5 ⁇ 1); alanine (—0.5); ⁇ histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
  • the VEGF-BPB of the present invention is interpreted to include a sequence that exhibits substantial identity with the sequence described in the sequence listing.
  • the above substantial identity is at least 60% when the sequence of the present invention is randomly aligned with any other sequence as described above, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art. Means a sequence showing homology of, more preferably 70% homology, even more preferably 80) homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2: 482 / Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio.
  • VEGF-BPB of the present invention may be prepared not only L-amino acid, but also D-amino acid, and within the range of binding activity to VEGF, some amino acid residues may be selected as non-natural amino acid and / or amino acid derivative. Can be substituted.
  • At least one amino acid residue of the amino acid sequence included in the VEGF-target binding site I and / or VEGF-target binding site ⁇ is acetyl group, flu Orenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group or polyethylene glycol (PEG) and the like.
  • a functional molecule is additionally bound to the structural stabilization site, the VEGF-target binding site I or the VEGF-target binding site ⁇ (preferably a structural stabilization site).
  • Such functional molecules include, but are not limited to, labels, chemicals, biopharmaceuticals or nanoparticles that generate detectable signals. ⁇
  • Labels that generate the detectable signal include T1 contrast material (e.g. Gd chelate compound), T2 contrast material (e.g. superparamagnetic material (e.g. magnetite, Fe304, y-Fe203, manganese ferrite, cobalt ferrite and nickel ferrite)).
  • T1 contrast material e.g. Gd chelate compound
  • T2 contrast material e.g. superparamagnetic material (e.g. magnetite, Fe304, y-Fe203, manganese ferrite, cobalt ferrite and nickel ferrite)).
  • Radioisotopes e.g., U C, 15 0, 13 N, P 32 , S 35 , 44 Sc , 45 ⁇ , 118 I, 136 La, 198 ⁇ 1, 200 ⁇ 1, 205 Bi and 20 3 ⁇ 40
  • phosphors fluorine Include, but are not limited to, fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lysamine (1 issamine), and Cy3 and Cy5), chemiluminescence groups, magnetic particles, mass labels, or electron-dense particles .
  • the chemicals include, for example, anti-inflammatory drugs, analgesics, anti-arthritis agents, antispasmodics, antidepressants, antipsychotics, neurostabilizers, anti-blend agents, drug antagonists, Antiparkin's disease drugs, cholinergic agonists, anticancer agents, antiangiogenic agents, immunosuppressants, antiviral agents, antibiotics, appetite suppressants, analgesics, anticholinergic agents, antihistamines, antimigraine drugs, hormones, coronary vessels, cerebrovascular or peripheral blood vessels Dilators, contraceptives, antithrombotic agents, diuretics, antihypertensives, cardiovascular diseases treatment agents, cosmetic ingredients (eg, wrinkle improvement agents, skin aging inhibitors and skin lightening agents) and the like, but are not limited thereto.
  • cosmetic ingredients eg, wrinkle improvement agents, skin aging inhibitors and skin lightening agents
  • the biopharmaceutical is insulin, IGF-1 (insulin-like growth factor 1), growth hormone, erythropoietin, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte / macrophage I colony stimulating factors) , Interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin-1 alpha and beta, interturkin-3, interleukin ⁇ 4, interleukin-6, interleukin-2, epidermal growth factors (EGFs), calcitonin, ACTH (adrenocorticotropic hormone) ), Tumor necrosis factor (TNF), atobisban, biserel in, cetrorelix, deslorelin, desmopressin, denorphine Dynorphin A, elcatonin, eleidosin, eptifibatide, growth hormone releasing hormone I (GHRH-II), gonadorelin (gonadorel in), gosereli
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the above-described VEGF-BPB.
  • the invention provides a recombinant vector for VEGF-BPB expression comprising a nucleic acid molecule encoding VEGF-BPB.
  • the present invention provides a transformant comprising a recombinant vector for VEGF-BPB expression.
  • nucleic acid molecule has a meaning including comprehensively DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, the nucleotides that are the basic structural unit in the nucleic acid molecule is modified as well as natural nucleotides, sugar or base Analogs are also included (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • the vector of the present invention is a powerful promoter capable of promoting transcription to the nucleic acid molecule in addition to the nucleic acid molecule encoding VEGF-BPB (eg, tac promoter, lac promoter, / adJV5 promoter, Ipp Promoter, ⁇ ⁇ promoter, pf promoter, rad promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), ribosomal binding site for initiation of translation and transcription / detox termination sequence.
  • VEGF-BPB eg, tac promoter, lac promoter, / adJV5 promoter, Ipp Promoter, ⁇ ⁇ promoter, pf promoter, rad promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • Vectors of the present invention may include antibiotic resistance genes commonly used in the art as selectable markers, for example ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and Resistance genes for tetracycline.
  • antibiotic resistance genes commonly used in the art as selectable markers, for example ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and Resistance genes for tetracycline.
  • the transformants of the invention are Gram-negative bacterial cells such as E. coli
  • suitable E. coli hosts are JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-lBlue (Stratagene), including but not limited to.
  • the method of transporting the vector of the present invention into a host cell includes the CaCl 2 method (Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, DJ Mo I. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (US Pat. , 186,800, 5, 422,272, 5,750,373), and the like.
  • the VEGF-BPB of the present invention exhibits very low levels (25 nM level) of K d values (dissociation constants), resulting in very high affinity for VEGF molecules.
  • K d values dissociation constants
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of angiogenesis-related diseases comprising VEGF-BPB of the present invention in a pharmaceutically effective amount.
  • the invention provides a method for preventing or treating angiogenesis-related diseases comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of VEGF-BPB of the invention.
  • VEGF-BPB of the present invention binds to VEGF with high affinity to inhibit angiogenesis, it can be applied to the prevention and treatment of various diseases related to angiogenesis.
  • the subject is a mammal, including a human.
  • Blood vessels to start-related diseases which can prevent and cure a pharmaceutical composition of the invention is, for example, cancer, macular degeneration, age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, neovascular glaucoma eu 'psoriasis, corneal ulceration, Proliferative vitreoretinopathy, immature retinopathy, ophthalmic saline, corneal graft rejection, atherosclerosis, keloids, renal glomerulopathy, restenosis, inflammatory bowel disease (IBD), rheumatoid arthritis, osteoarthritis, hemangioma and angiofibromatosis Can be.
  • AMD age-related macular degeneration
  • IBD inflammatory bowel disease
  • rheumatoid arthritis rheumatoid arthritis
  • osteoarthritis hemangioma
  • angiofibromatosis Can be.
  • cancers examples include, for example, chest cancer, lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, colorectal cancer, liver cancer, ovarian cancer, follicular carcinoma, cyanoblastoma, cervical cancer, endometrial cancer, endometrial hyperplasia, endometriosis and fibrosis.
  • Sarcoma Choroiditis, Head and Neck Cancer, Nasopharyngeal Cancer, Laryngeal Cancer, Liver Tumor, Kiposi's Sarcoma, Pigmentoma, Skin Cancer, Hemangioma, Cavernous Hemangioma, Hemangioblastoma, Pancreatic Cancer, Retinoblastoma, Astrocytoma, Glioblastoma, Neurochondroma, Pleuroglioma, Blastoma, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, osteosarcoma, smooth muscle sarcoma, urinary tract cancer, thyroid cancer, bile tumor, renal cell carcinoma and prostate cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, textose, sucrose, sorbetle, mannitol, starch, acacia rubber calcium phosphate, alginate, gelatin , Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, sorbidextr, sorbidextr, and the like.
  • composition of the present invention can be administered parenterally.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction response. Can be.
  • the oral dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.00001-100 rag / kg per day on an adult basis.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • VEGF 1 is a result of measuring the absorbance of the recombinant phage containing BPB2 VEGF by ELISA for a variety of proteins in order to test for VEGF specificity. From the left bar are the results for VEGF, S-tag antibody, streptavidin, HSA and TNF— ⁇ .
  • AAP is BPBIVEGF
  • WAAAP is BPB2 VEGF
  • GPAAP is BPB3 VEGF
  • AQAAP is BPB4VE GF
  • Figure 3 shows the HUVEC proliferation inhibitory effect of BPB binding to VEGF.
  • AAP is BPB1 VEGF and WAAAP is BPB2VE GF .
  • CDNA encoding human VEGF 121 was PCR amplified from a plasmid containing the entire DNA sequence of human VEGF 165 .
  • the clones were sourced from Bank for Cytokine Research, Korea.
  • Protein expression and purification was performed according to the previous method (Kim, J.-W. et al. Exp. Mo I. Med. 42, 514-523 (2010)). After transformation of Escherichia coli, 1 mM of IPTG was treated at 20 ° C. for 15 hours to induce thioredoxin (Trx) -VEGFm expression. The bacteria were then collected, resuspended in lysis buffer (50 mM sodium phosphate pH 8.0, 30 mM NaCl, 5 mM imidazole) and sonicated to dissolve. Lysates were centrifuged at 1550 g at 4 ° C. for 1 hour.
  • lysis buffer 50 mM sodium phosphate pH 8.0, 30 mM NaCl, 5 mM imidazole
  • the supernatant was loaded into a gravity-flow column (Bio-Rad) equipped with a pre-equi librated Ni-NTA affinity resin (Peptron) with a dissolution buffer (3 ml of bed volume per liter of culture). It was. After washing the column and the matrix with lysis buffer, the His-tag fusion protein was eluted using a solution containing 50 mM sodium phosphate ( ⁇ 8.0), 300 mM NaCl and 300 mM imidazole. Trx-VEGFm on Thrombin (Sigma) was treated for 12 hours at 4 ° C. to remove thioredoxin, and Trx-his was removed using Ni-NTA affinity resin.
  • S-tagged-VEGF 121 was further purified via gel filtration using a Superdex 2000 column (Pharmacia Biotech) pre-equilibrated with PBS pH 7.4. Fractions containing the dimer form of S-tagged-VEGF 121 were collected again. In some experiments VEGF 165 (R & D Systems) was used.
  • BPB VEGF _F1 4 ⁇ final concentration
  • BPBVEGF-BI 4 ⁇ final concentration
  • Ex TaqDNA polymerase 1 ⁇ 10 U
  • 10 x PCR complete layers were mixed, and 10 mixtures were added with distilled water to a total of 50 ⁇ .
  • This mixture was double-stranded with PCR reaction (94 ° C 5 min, 60 cycles: 30 ° C 30 sec and 72 ° C 30 sec, 72 ° C 7 min), followed by PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea Purified using).
  • Anti-S-tag antibody (Abeam, 4 ug / ml in PBS) was fixed in 96-well plate overnight at 4 ° C and then incubated with S-tagged-VEGF 121 to bind the target protein (St agged-) to the plate.
  • VEGF 121 was prepared. Plates were incubated at 25 ° C. for 1 hour in blocking buffer (PBS with 2% bovine serum albumin) to prevent nonspecific binding of the plate surface. Phage library pools were incubated for 1 hour and a half at 25 ° C. on anti-S-tagged-antibody-fixed plates to remove phages bound to anti-S-tag antibodies.
  • phages After antibody binding phages were removed, the remaining phages were incubated for 1 hour at a temperature of 25 ° C. in an S-tagged-VEGF 121 fixed plate. Unbound phage was removed by washing with PBS containing 1% TRYP-20 (7 in round 1, 15 in round 2, 15 in round 3, 25 in round 4). VEGF of 10 was incubated with 0.2 M glycine-HCKpH 2.2) for 20 minutes at 37'C at room temperature, followed by immediate neutralization with 1 M Tr i s-HCKpH 8.8) to elute bound phages. Elution phage was used to infect log-phase E. coli St ratagene (37t :, 1 h).
  • Phage infected cells were over-infected with Exl2 helper phage at 37 ° C for 1 hour.
  • LB medium containing 50 mg / L ampicillin and 10 mg / L kanamycin was added to the overinfected cells and then incubated at 37 ° C. overnight.
  • the titers of phage of all fractions were measured during panning. After five rounds of panning, phage ELISA was performed.
  • Phage Infection Colonies isolated from E. coli ER produced each BPB-containing phage. Each phage was added to the plate coated with the target protein according to the method mentioned above.
  • PBS / 0. Wash the microtiter plate with 1% TRIP-20 and PBS / 0.
  • Binding phage was detected after incubation with HRP-conjugate anti M13 antibody (GE Healthcare) at 1% TRK-20.
  • HRP-conjugate anti M13 antibody GE Healthcare
  • TMB tetramethylbenzidine
  • TMB tetramethylbenzidine
  • Phage ELISA was performed to determine specificity, BPB VEGF -phage against rhVEGFm, anti-S-tag antibody (Abeam), human TNFaChTNFa, R & D Systems), streptavidin ((New England Biolabs) and HSA (Sigma)). All proteins (10 ug / ml in PBS) were incubated overnight at 4 ° C. and fixed directly to 96-well plates 25 ° C. in plates in blocking buffer (PBS containing 2% BSA). After incubation for two hours at a temperature of BPB VEGF -phage (10 8 ) to bind for 1 hour at 25 ° C.
  • microtiter plate was washed five times with PBS / 0.1% Tween-20 and PBS / After incubation with HRP-conjugated anti-M13 antibody (GE Healthcare) at 0.1% Twen-20, binding phage was detected, using TMB as substrate (BD OptEIA), and absorbance at 450 nm to confirm absorbance.
  • HRP-conjugated anti-M13 antibody GE Healthcare
  • TMB substrate
  • Affinity was established using the BIAcore X instrument (BIAcore). All peptides were synthesized by Anygen Inc. The interaction between BPB VEGF and VEGF 121 was analyzed by immobilizing VEGFm on CM5 chip (BIAcore). After injecting different concentrations of BPBIVEGF, BPB2VEGF, BPB3VEGF or BPB4 VEGF , interaction with VEGF 121 was established at a flow rate of 30 ul / min using PBS / 0.1% NaN 3 as the running buffer. All kinetics data of the interactions were evaluated using BIA evaluation 3.1 software.
  • HUVECs were grown to confluency by culturing in 0.2% gelatin coated plates in endothelial cell growth medium 2 (PromoCell).
  • Starving badge starving medi a; 1% PBS and 25 mM HEPES pH7.4 and then containing the M199
  • the HUVEC in a 96-well tissue culture plates containing culture medium is gumgim material was dispensed at a density of 5,000 cells / well.
  • the medium was replaced with or without rhVEGF 121 (200 ng / ml) with a hunger medium containing inhibitors (BPB1 VEGF , BPB2VE GF ).
  • the cells were further incubated at 37 ° C for 72 hours. At the end of the experiment the cells were washed and proliferation was assessed using the EZ-cytox cell viability assay kit (Dae i U ab Servi ce Co.). Plates were incubated at 37 ° C. for 4 hours and measured at 450 nm.
  • FIG. 1 shows the results of specificity test of BPB2 VEGF among the three candidate groups.
  • BPB2 VEGF -recombinant phage was subjected to ELISA on various proteins to measure absorbance.
  • BPB2 VEGF has specificity for VEGF (see FIG. 1).
  • the affinity of the chemically synthesized BPB1-4 VEGF peptide for VEGF 121 was analyzed by surface plasmon resonance technique.
  • the binding properties of the BPB peptides were analyzed in real time using a BIAcore chip having the rhVEGF 121 target protein bound to the surface. The measurement results are shown in Table 2 and FIG.
  • the peptide with the highest affinity was BPB2 VEGF
  • the BPB2VEGF had a ⁇ (association rate constant) of ⁇ 5.3 X 10 5 M— 1 and a dissociat ion rate of ⁇ 1.3 X 10 "2 S— 1 constant), ⁇ 25 nM / equilibrium binding constant) (see Table 2 and Figure 2)
  • Endothelial cell proliferation is VEGF dependent and mainly mediated by VEGFR-2 activation.
  • BPB inhibits the action of VEGF on endothelial cells
  • HUVEC was activated with 200 ng / m ⁇ rhVEGF 121 and different concentrations of peptides were treated for 72 hours.
  • optimized BPB2VEGF inhibited endothelial cell proliferation by VEGF more effectively than BPB1 VEGF (see FIG. 3).

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Abstract

본 발명은 VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF-BPB, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 VEGF-BPB를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 VEGF-BPB에서 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있는 이격된(distal) 두 개의 VEGF-타겟 결합 부위는 서로 협동적으로(cooperatively), 시너직(synergetically)하게 타겟에 결합하여 VEGF-유도 신생혈관형성(angiogenesis)을 억제한다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF-BPB 【기술 분야】
본 발명은 VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF-BPB에 관한 것이다.
【배경 기술】
신생혈관형성 (Angiogenesis)은 혈관계의 배 발달 (embryonic development), 상처 치유 (wound healing) 및 임신 동안의 여성 생식계의 순웅과 같은 생리학적 과정에 있어 중요한 역할을 한다. 보통， 이러한 과정은 다양한 신생혈관형성 유발 및 억제 인자의 균형에 의하여 섬세하게 조절된다. 이러한 인자들 사이의 불균형은 비정상적인 혈관의 성장을 유도하여 류마티스 관절염， 당뇨병성 망막증 및 암과 같은 병적 상태를 초래한다.
VEGFCVascular endothelial growth factor)는 내피세포의 증식과 이동을 유도하고， 루멘 형성을 촉진하는 내피세포—특이적 미토겐이다 (Ta匪 ela, T. , Enholm, B. , Alitalo, Κ. & Paavonen, K. Cardiovasc. Res. 65, 550-563 (2005)). 내피세포 표면의 VEGF 수용체의 두드러진 발현은 VEGF와 이의 수용체 사이의 상호작용을 억제하는 것을 기반으로 하는 항-신생혈관형성 전략에 모티브를 준다 (Aiello, L.P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92， 10457-10461 (1995)). 현재, FDA 승인받은 두 개의 항 -VEGF 약품이 있다: VEGF 중화 단일클론항체 bevacizumab (Avastin)(Ferrara, N. , Hi 1 lan, K.J. , Gerber, H.-P. & Novotny, W. Nat. Rev. Drug Discov. 3, 391-400 (2004)) 및 SELEX 유래 RNA 앱타머 Macugen(Ng, E.W.M. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 123-132 (2006)). 비록 이들 약물이 암 치료와 연령 관련 황반변성 (AMD)에 대한 치료효과를 보이고 있지만， 고혈압과 단백뇨와 같은 장기적인 부작용뿐만 아니라， 약물 내성의 발생과 눈 염증은 여전히 해결해야 할 문제로 남아있다.
펩타이드 약물은 항체와 RNA 앱타머와 같은 거대한 생물학적 분자의 유망한 대체 수단이다. 치료제로서 펩타이드의 장점은 생산단가가 낮고， 안전성 및 반웅성이 높으며 , 원하지 않는 면역시스템에 덜 노출되어 펩타이드 자체에 대한 항체 생산을 억제할 수 있으며, 합성을 통한 변형이 쉽고 정확하다는 것이다. 그러나， 대부분의 펩타이드는 항체에 비해 특정 단백질 타겟에 대해 낮은 친화력과 특이성을 보이기 때문에， 여러 웅용분야에서 사용되지 못하는 한계가 있다 (Ner i , D . & Bi cknel l , R . NAt . Rev. Cancer 5， 436-446 (2005) ) . 따라서, 이러한 펩타이드의 단점을 극복할 수 있는 새로운 펩타이드 기반 항체 대체 약물 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. 【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 인간 VEGF에 특이적으로 결합하는 펩타이드 분자를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들에 의해 종전에 개발된 바이포달 펩타이드 바인더 (BPB)의 기본 구조를 이용하여 VEGF- 특이적 BPB(BPB2VEGF)를 개발하고, 이 BPB2VEG^1" 다른 VEGF를 타겟팅하는 BPB들 보다 타겟에 대한 친화도가 매우 높아 VEGF에 대한 타겟팅 능력이 매우 우수함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF- 바이포달 펩타이드 바인더 (VEGF-BPB)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 VEGF-BPB를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 VEGF-BPB 발현용 재조합 백터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 구조안정화 부위 (structure stabi l izing region)로서 β -헤어핀; 및 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 직접 또는 링커를 통하여 각각 결합된 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 포함하는 타겟 결합 부위 I (target binding region I ) 및 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하는 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π )를 포함하는 VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF-바이포달 펩타이드 바인더 (VEGF-BPB)를 제공한다. 본 발명자들은 인간 VEGF 에 특이적으로 결합하는 펩타이드 분자를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들에 의해 종전에 개발된 바이포달 펩타이드 바인더 (BPB)의 기본 구조를 이용하여 VEGF- 특이적 BPB(BPB2VEGF)를 개발하고, 이 BPB2VEGF 가 다른 VEGF 를 타겟팅하는 BPB 들 보다 타겟에 대한 친화도가 매우 높아 VEGF 에 대한 타겟팅 능력이 매우 우수함을 규명하였다.
본 발명은 기본적으로 BPB의 구조를 채택한다. BPB는 본 발명자들에 의해 최초로 제안된 친화성 펩타이드로서, 리지드한 펩타이드 골격의 양 말단에 타겟에 결합되는 펩타이드가 연결되어 있다.
본 발명의 VEGF-BPB 는 리지드한 펩타이드 골격으로서 β—헤어핀을 구조 안정화 부위로서 포함하는데， β -헤어핀은 ΒΡΒ 의 전체적인 구조를 안정화시키는 작용을 하며， 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 I I 가 타겟 분자 (VEGF)에 결합되는 것을 강화시킨다.
본 명세서에서 사용된 용어， " β -헤어핀 "은 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며， 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴 한 정렬을 나타낸다. 이 β -헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다. β -헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I， 타입 Γ, 타입 II， 타입 π', 타입 in 또는 타입 ffl' 턴 서열일 수 있다. 또한, X-Pro-Gly-Glu-Val； 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val(X 는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-Ala-Thr-
Lys-Thr 이고， 타입 Γ 턴 서열은 Glu-Asn-Gly-Lys 이며 , 타입 Π 턴 서열은 X-Pro-Gly-Glu-Val； 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20 개의 아미노산으로부터 선택된다)이고, 타입 Π' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn- Lys이다.
β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어， 미국'특허 제 6,914,123호 및 Andrea G. Cochran et al. , PNAS, 98(10) :5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼 , W0 2005/047503 에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱， 미국 특허 제 5，807，979호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도， β-헤어핀 콘포메이션올 갖는 펩타이드는 Smith & Regan (1995) Science 270:980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251-276; Kim & Berg
(1993) Nature 362:267-270； Minor & Kim (1994) Nature 367:660-663； Minor & Kim (1993) Nature 371:264-267; Smith et al . Biochemistry
(1994) 33:5510-5517； Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999- 1006； Haque & Gel 1 man (1997) J, Am. Chem. Soc. 119:2303-2304; Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888； de Alba et al . (1996) Fold. Des. 1： 133-144； de Alba et al . (1997) Protein Sci. 6:2548-2560; Rami rez-Alvar ado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604-612; St anger & Gel 1 man (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237; Maynard & Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298； Griffiths-Jones et al . (1998) Chem. Co誦 un. 789-790； Maynard et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996- 2007； 및 Blanco et al . (1994) Nat. Struct. Biol. 1:584-590 에 개시되어 있으며， 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우， 트립토판 지퍼를 이용한다. 본 발명에서 이용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I 로 표시될 수 있다:
일반식 I
Xi-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7
¾은 Ser 또는 Gly-Glu이고， X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His,
Val, He, Phe또는 Tyr 이며, X3은 Trp또는 Tyr 이고， 는 타입 I， 타입 I1， 타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 ΙΠ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， ¾는 Trp 또는 Phe이며， ¾은 Trp또는 Val이고， X7은 Lys 또는 Thr-Glu이다.
하나의 특정예에서, 상기 일반식 I에서 Xi은 Ser 또는 Gly-Glu이고， ¾ 및 X'2 는 서로 독립적으로 Th^ His 또는 Val 이며, X3 은 Trp 또는 Tyr이고, X4는 타입 I， 타입 I1， 타입 Π 또는 타입 Π' 턴 서열이고， Χ5는 Trp또는 Phe이며， ¾는 Trp또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다. 다른 특정예에서 , 일반식 I 에서 Xi은 Ser 또는 Gly-Glu 이고, X2 및 χ'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val 이며 , X3는 Trp 이고, 는 타입 I, 타입 1'， 타입 Π 또는 타입 ΓΓ 턴 서열이고， X5는 Trp 이몌 ¾는 Trp이고ᅳ X7는 Lys또는 Thr-Glu이다.
또 다른 특정예에서， 일반식 I 에서 은 Ser 이고, X2 및 X'2 는 Thr 이며， ¾는 Trp 이고, X4는 타입 Γ 또는 타입 Π ' 턴 서열이고, X5는 Trp이며， ¾는 Trp이고， X7는 Lys이다.
또 다른 특정예에서， 일반식 I 에서 ¾ 은 Ser 이고 ¾ 및 X'2 는
Thr 이며， ¾는 Trp 이고， X4는 타입 Γ 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 Π1 턴 서열 (EGN )이고ᅳ ¾는 Trp이며 , ¾는 Trp이고, X7는 Lys이다.
본 발명에 적합한 트립토판 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 3서열 내지 제 11서열에 기재되어 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 트립토판 지퍼는 서열목록 제 4서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 다른 β-해어핀 펩타이드는 단백질 G의 B1 도멘인으로부터 유래된 펩타이드， 즉 GB1 헤어핀 펩타이드이다 .
본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우， 구조안정화 부위는 다음 일반식 Π로 표시될 수 있다: 일반식 Π
X -Trp— X2-Tyr-¾-Phe-Thr-Va 1 -
¾은 Arg, Gly-Glu또는 Lys—Lys이고, ¾는 Gin또는 Thr이며, ¾는 타입 I， 타입 Γ , 타입 Π , 타입 Π ' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 는 Gin , Thr -Glu 또는 Gln-Glu이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 일반식 Π의 구조안정화 부위는 다음 일반식 Ι Γ으로 표시된다:
일반식 Π '
Xi-Trp-Thr -Tyr -X2 ~Phe-Thr -Va 1 -¾
¾은 Gly-Glu 또는 Lys-Lys 이고， ¾는 타입 I， 타입 Γ， 타입 Π , 타입 Π ' 또는 타입 m 또는 타입 ΙΠ ' 턴 서열이고， ¾ 는 Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β -헤어핀 펩타이드로는 HP 펩타이드가 있다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우， 구조안정화 부위는 다음 일반식 m으로 표시될 수 있다:
일반식 m
Xi-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
¾은 Lys 또는 Lys-Lys이고, ¾는 Trp 또는 Tyr이고, ¾는 Val 또는 Thr 이며 , ¾는 타입 Iᅳ 타입 1 '， 타입 II， 타입 Π ' 또는 타입 ΙΠ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， ¾는 Trp 또는 Al a 이며， ¾는 Trp 또는 Val 이고, X7은 Glu또는 Gln-Glu이다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β -헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 IV로 표시될 수 있다:
일반식 IV
Figure imgf000008_0001
¾은 Lys-Thr 또는 Gly이고, X2는 Trp 또는 Tyr 이고, ¾는 타입 I , 타입 Γ , 타입 Π , 타입 Π ' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 는 Thr-Glu 또는 Gly이다. '
상기 구조 안정화 부위의 양 말단에는 VEGF-타겟 결합 부위 I 및 VEGF-타겟 결합 부위 Π가 직접 혹은 링커를 통하여 간접적으로 결합된다. 본 발명의 큰 특징 중 하나는， 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 VEGF-타겟 결합 부위 I 및 π를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 상기 VEGFᅳ타겟 결합 부위 I 및 Π는 서로 협동적으로 (cooperatively) 타켓에 결합함으로써， VEGF 에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 VEGF-BPB 는 VEGF-타켓 결합 부위와 구조 안정화 부위 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 링커를 타겟 결합 부위와 구조안정화 부위의 사이에 포함할 수 있다. 이 경우， 상기 링커는 구조영향 억제부위 (structure influence inhibiting region)로서 기능한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 링커는 아미노산 링커이다. BPB 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산을 상기 아미노산 링커로 사용할 수 있다. φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신, 알라닌 및 세린 등이다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면， 상기 링커는 펩타이드 링커이다. 펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션 (flexible extended confomat ion)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력 ; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있다. Thr 및 Ala 과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al . Gene 40:39- 46(1985)； Murphy et al . Proc. Natl. Acad Sci. USA 83:8258-8562(1986)； 미국 특허 제 4,935,233호， 제 4,751,180호 및 제 5,990,275호에 개시되어 있다.
펩타이드 링커의 서열은 1-50 개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있으며, 하나의 특정예에서는 1ᅳ 10 개의 아미노산， 다른 특정예에서는 1ᅳ8 개， 또 다른 특정예에서는 1ᅳ3 개， 또 다른 특정예에서는 1-2 개의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 상기 아미노산 잔기로는 글라이신， 알라닌 및 세린을 들 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 바이포달 펩타이드 바인더는 서열목록 제 12서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 VEGF-BPB 에는 VEGF 에 대한 결합 활성을 나타내는 범위 내에서， 본ᅳ명세서에 기재돤 본 발명의 VEGF-BPB 의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물들도 포함된다. 예를 들면 VEGF-BPB 의 결합 친화도 및 /또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 타겟 결합 부위의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 삽입 및 /또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 결사슬 치환체의 상대적 유사성， 예컨대， 소수성， 친수성， 전하， 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 결사슬 치환체의 크기， 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여 , 아르기닌， 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌， 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌， 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것올 알 수 있다. 따라서， 이러한 고려 사항에 기초하여， 아르기닌， 라이신과 히스티딘; 알라닌， 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기등 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5) ; 발린 (+4.2) ; 루이신 (+3.8) ; 페닐알라닌 (+2.8) ; 시스테인 /시스타인 (+2.5) ; 메티오닌 (+1.9) ; 알라닌 (+1.8)； 글라이신 (-0.4) ; 쓰레오닌 (-0.7) ; 세린 (-0.8) ; 트립토판 (-0.9) ; 타이로신 (-1.3) ; 프롤린 (-1.6) ; 히스티딘 (-3.2) ; 글루타메이트 (-3.5) ; 글루타민 (-3.5) ; 아스파르테이트 (-3.5) ; 아스파라긴 (-3.5)； 라이신 (-3.9) ; 및 아르기닌 (-4.5) .
단백질의 상호적인 생물학적 기능 ( interact ive biological funct ion)올 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성올 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우， 바람직하게는 士 2 이내， 보다 바람직하게는 土 1 이내, 보다 더 바람직하게는 土 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다. 한편， 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제 4,554,101 호에 개시된 바와 같이， 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트 (+3.0士 1); 글루타메이트 (+3.0±1)； 세린 (+0.3)； 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1)； 알라닌 (—0.5); ᅳ 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val , Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/I le Leu/Val , Ala/Glu 및 Asp/GIy 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 VEGF-BPB 는 서열목톡에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도톡 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에， 최소 60%의 상동성， 보다 바람직하게는 70%의 상동성， 보다 더 바람직하게는 80 )의 상동성， 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl . Math. (1981) 2:482/ Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24： 307-31； Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44； Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151—3; Corpet et al. , Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90； Huang et al. , Comp. Appl. BioSci. (1992) 8： 155-65 및 Pearson et al . , Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31 에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Alt schul et al . , J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx 와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html에서 확인할 수 있다.
또한， 본 발명의 VEGF-BPB 는 L-아미노산뿐만 아니라， D- 아미노산으로도 제조될 수 있으며， VEGF에 대한 결합 활성올 나타내는 범위 내에서, 일부의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산 및 /또는 아미노산 유도체로 치환될 수 있다.
또한, .본 발명의 VEGF-BPB 는 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여， VEGF-타겟 결합 부위 I 및 /또는 VEGF-타겟 결합 부위 Π에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기， 플루오레닐 메톡시 카르보닐기， 포르밀기， 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등으로 변형될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 구조 안정화 부위, VEGF-타겟 결합 부위 I 또는 VEGF-타겟 결합 부위 Π(바람직하게는 구조안정화 부위)에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있다.
상기 기능성 분자의 예는, 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블， 화학약물， 바이오약물 또는 나노입자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 、
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질 (예컨대， Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질 (예컨대 , 초상자성 물질 (예： 마그네타이트， Fe304, y-Fe203, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트))， 방사성 동위 원소 (예컨대， UC, 150, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Τί, 118I, 136La, 198Τ1 , 200Τ1 , 205Bi 및 20¾0， 형광물질 (플루오리신 (fluorescein) , 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 ( 1 issamine)， 그리고 Cy3 와 Cy5), 화학발광단， 자기입자， 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학약물은 예를 들어， 항염증제， 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제， 항정신병약물， 신경안정제， 항블안제， 마약길항제, 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제， 면역억제제， 항바이러스제， 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제 , 피임약, 항혈전제 , 이뇨제， 항고혈압제 , 심혈관질환 치료제 , 미용성분 (예컨대, 주름개선제, 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바이오약물은 인슐린， IGF-1( insulin— like growth factor 1)， 성장호르몬， 에리쓰로포이에틴， G-CSFs(granulocyte-colony stimulating factors) , GM-CSFs (granulocyte/macrophage一 colony stimulating factors) , 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨 -1 알파 및 베타, 인터투킨 -3, 인터루킨ᅳ4， 인터루킨— 6, 인터루킨— 2， EGFs( epidermal growth factors) , 칼시토닌 (calcitonin) , ACTH( adrenocorticotropic hormone) , TNF( tumor necrosis factor), 아토비스반 (atobisban) , 부세레린 (biserel in)， 세트로렉릭스 (cetrorelix), 데스로레린 (deslorel in)， 데스모프레신 (desmopressin) , 디노르핀 A(dynorphin A), 엘카토닌 (elcatonin) , 엘레이도신 (eleidosin), 엡티피바타이드 (eptifibatide), GHRH-II (growth hormone releasing hormone一 II), 고나도레린 (gonadorel in) , 고세레린 (goserelin), 히스트레린 (hist re 1 in) ,ᅳ 류프로레린 (leuprorelin), 라이프레신 (lypressin), 옥트레오타이드 (octreot ide) , 옥시토신 (oxytocin)， 피트레신 (pitressin), 세크레틴 (secretin) , 신칼라이드 (sincalide) , 테르리프레신 (terlipressin), 티모펜틴 (thymopent in)， 티모신 (thymosine) αΐ, 트리프토레린 (triptorelin), 바이발리루딘 (bival irudin) , 카르베토신 (carbetocin), 사이클로스포린 , 액세딘 (exedine) , - 란레오타이드 (lanreotide) , LHRH( luteinizing hormonereleasing hormone) , 나파레린 (nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드 (pramiint ide)， T- 20(enfuvirtide), 타이말파신 (thymalfasin), 지코노타이드, R A, DNA, cDNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 가 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 VEGF-BPB 를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 VEGF-BPB 를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 VEGF-BPB 발현용 재조합 백터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 VEGF-BPB 발현용 재조합 백터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자" 는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며， 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980)； Uhlman 및 Peyman , Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 VEGF-BPB 를 코딩하는 핵산 분자 이외에 상기 핵산 분자에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대， tac 프로모터, lac 프로모터， /adJV5 프로모터, Ipp 프로모터 , ίλ 프로모터， pf 프로모터 , rad 프로모터， amp 프로모터 , recA 프로모터 , SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함한다.
본 발명의 백터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린， 겐타마이신， 카베니실린， 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신， 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 형질전환체는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며， 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-lBlue(Stratagene)를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al. Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973))， 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D. J. Mo I. Biol. , 166：557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (미국 특허 제 5，186,800 호, 제 5, 422,272호， 제 5,750,373호) 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 VEGF-BPB는 매우 낮은 수준 (25 nM 수준)의 Kd 값 (해리상수)을 나타내어, VEGF 분자에 매우 높은 친화도를 나타내는 펩타이드를 제공한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이， 본 발명의
BPB2VEGF는 BPBIVEGF 보다 6배 정도 높은 친화도를 나타낸다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 VEGF-BPB를 약제학적 유효량으로 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 VEGF-BPB 를 약제학적 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 VEGF-BPB 는 VEGF 에 높은 친화도로 결합하여 신생혈관형성을 억제할 수 있으므로， 혈관신생과 관련된 다양한 질환의 예방 및 치료에 적용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 개체는 인간을 포함하는 포유동물이다.
본 발명의 약제학적 조성물로 예방 및 치료할 수 있는 혈관신생 관련 질환으로는， 예를 들면， 암, 황반 변성， 연령 관련 황반변성 (AMD) , 당뇨 망막병증， 혈관신생 녹내장ᅳ' 건선， 각막궤양， 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염층, 각막 이식거부， 아테름성 동맥경화증， 켈로이드, 신사구체병증， 재협착， 염증성 장 질환 ( IBD) , 류마티스 관절염， 골관절염， 혈관종 및 혈관섬유종 등을 들 수 있다.
상기 암으로는， 예를 들면, 흉부암， 폐암， 위암， 식도암, 대장암， 결장직장암， 간암, 난소암， 난포악종， 남화아세포종， 경부암, 자궁내막암， 자궁내막과형성， 자궁내막증， 섬유육종, 맥락막염, 두경암， 비인강암, 후두암, 간종양, 키포시 육종, 색소세포종， 피부암, 혈관종, 해면상혈관종， 혈관아세포종， 췌장암, 망막아종, 성상세포종， 교아세포종， 신경초종， 꼽지 신경교종， 수아세포종， 신경아세포종, 횡문근육종, 골형성 육종， 평활근 육종, 요로암, 갑상선암， 빌름종양, 신장세포암 및 전립선암 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스 , 텍스트로스， 수크로스， 솔비틀， 만니틀， 전분, 아카시아 고무 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴, 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스, 폴리비닐피롤리돈, 샐를로스， 물, 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제, 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington ' s Pharmaceut i cal Sc i ences ( 19th ed . , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식 환자의 연령， 체중, 성, 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 성인 기준으로 1일 당 0.00001-100 rag/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 VEGF 에 대한 특이성 검사를 하기 위해 BPB2VEGF를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다. 왼쪽 막대부터 VEGF , S-tag 항체， 스트렙트아비딘， HSA 및 TNF— α에 대한 결과이다.
도 2 는 VEGF 에 결합하는 BPB 의 친화력을 측정한 결과이다. AAP 는 BPBIVEGF 이고， WAAAP 는 BPB2VEGF 이며， GPAAP 는 BPB3VEGF 이고, AQAAP 는 BPB4VEGF이다. 도 3 은 VEGF 에 결합하는 BPB 의 HUVEC 증식 억제효과를 보여준다. AAP는 BPB1VEGF이고 , WAAAP는 BPB2VEGF이다 .
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
인간 VEGFm 제작
인간 VEGF121 을 코딩하는 cDNA 를 인간 VEGF165 의 전체 DNA 서열을 포함하는 플라스미드로부터 PCR 증폭하였다. 클론은 싸이토카인 은행 (Bank for Cytokine Research, Korea)으로부터 공급받았다. 프라이머 5'-ATA GAA TTC GCA CCC ATG GCA GM-3' (정방향, 서열목록 제 13 서열) 및 5'-ATT AAG CTT TCA CCG CCT CGG CTT GTC ACA ATT TTC TTG TCT TGC-3' (역방향， 서열목록 제 14 서열)를 사용하여 인간 VEGF121 을 pET32a 플라스미드 (Novagen)로 클로닝하였다. 수득한 발현 플라스미드를 사용하여 E. coli AD494(Stratagene)를 형질전환하였다. 단백질 발현과 정제는 이전의 방법 (Kim, J.-W. et al. Exp. Mo I. Med. 42， 514-523 (2010))에 따라 실시하였다. 대장균의 형질전환 후， 20°C에서 15 시간 동안 1 mM 의 IPTG 를 처리하여 티오레독신 (Trx)-VEGFm 발현을 유도하였다. 이후， 박테리아를 모으고, 용해 버퍼 (50 mM 인산나트륨 pH 8.0, 30으 mM NaCl, 5 mM 이미다졸)에 재현탁 시킨 후, 초음파 처리하여 용해시켰다. 용해물을 4°C에서 1 시간 동안 1550 g로 원심 분리하였다. 용해버퍼 (배양액 리터당 3 ml 의 BV(bed volume))로 전-처리된 (pre-equi librated) Ni-NTA 친화성 레진 (Peptron)을 구비하는 gravity-flow 컬럼 (Bio-Rad)에 상청액을 로딩하였다. 용해 버퍼로 컬럼과 매트릭스를 세척한 후, 50 mM 의 인산나트륨 (ρΗ 8.0), 300 mM 의 NaCl 및 300 mM 의 이미다졸이 함유된 용액을 사용하여 His-tag 융합 단백질을 용출시켰다. Trx-VEGFm 에 트롬빈 (Sigma)을 4°C에서 12 시간 동안 처리하여 티오레독신을 제거하고, Ni-NTA 친화성 레진을 사용하여 Trx-his 를 제거하였다. PBS(pH 7.4)로 전- 처리 (pre-equilibrated)된 Superdex 2000 컬럼 (Pharmacia Biotech)을 사용한 겔 여과를 통하여 S-tagged-VEGF121 을 추가 정제하였다. S-tagged- VEGF121의 다이머 형태를 포함하는 분획물을 다시 모았다. 일부 실험에서는 VEGF165(R&D Systems)를 사용하였다.
BPBVEGF 라이브러리 제작
BPBVEGF ( AAPTSFGSWTWENGKWTWKGWQMWHR , 서열목록 제 15 서열) 최적화 라이브러리를 만들기 위해 두 개의 을리고뉴클레오타이드 (5'-TTC TAT GCG GCC CAG CTG GCC NNK NNK GCG GCC CCG ACC AGC TTT GGA TCT TGG ACA TGG GAA AAC GGA AAA-3' , 서열목록 제 16 서열) (BPBVEGF_F1)와 (5'-AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC MNN MNN GCG ATG CCA CAT CTG CCA TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT— 3'ᅳ 서열목록 제 17서열) (BPBVEGF_B1)를 합성하였다 (N = A, T, G또는 C; K = G또는 T; M = C 또는 A).
BPBVEGF 이중가닥을 만들기 위해서 BPBVEGF_F1 4 μΜ (최종 농도)， BPBVEGF-BI 4 μΜ (최종 농도)， 2.5 mM dNTP 흔합물 4 ^， Ex TaqDNA 중합효소 1 ^(10 U)(Takara, Seoul , Korea), 10 x PCR 완층액 5 μί를 섞고 총 50 ^가 되도록 증류수를 추가한 흔합액을 10 개 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반웅 (94°C 5 분, 60 사이클: 30°C 30 초와 72°C 30 초， 72°C 7 분)을 하여 이중가닥으로 만든 후 PCR 정제 키트 (GeneAll, Seoul , Korea)를 이용하여 정제하였다. BPBVEGF 의 인서트 유전자를 pIGT2 phagemid 백터 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)에 연결하기 위해 인서트 유전자와 pIGT2 phagemid 백터에 제한효소 처리를 시행하였다. 약 10 의 인서트 DNA를 5///(NEB)와 Λ¾ /(ΝΕΒ)로 각각 4 시간씩 반웅시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 그리고 약 40 의 pIGT2 phagemid 백터를 5//ΛΝΕΒ)와 ? /(ΝΕΒ)로 각각 4 시간씩 반웅시킨 후 CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 1 시간 반웅한 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기 (Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 백터 12 / g과 18°C에서 15 시간 동안 연결한 후, 에탄을로 침전시켜 TE 버퍼 100 ^로 DNA 를 용해시켰다. 이를 E. coli XL-1 컴피턴트 세포에 전기천공으로 형질전환시켜 최종적으로 각각 1 X 107 의 BPBVEGF 최적화 라이브러리를 만들었다. 파아지 디스플레이선별
항 S-tag 항체 (Abeam , 4 ug/ml i n PBS)를 4°C에서 96-웰 플레이트에 하룻밤 동안 고정시킨 후 S-tagged-VEGF121 과 함께 인큐베이션 하여 플레이트에 결합된 타겟 단백질 (S-t agged-VEGF121)을 제조하였다. 플레이트를 25°C에서 1 시간 동안 블로킹 버퍼 (2% 소혈청 알부민이 포함된 PBS)에서 인큐베이션 하여 플레이트 표면의 비특이적 결합을 방지하였다. 파아지 라이브러리 풀을 항 S-tagged-항체가 고정된 플레이트 상에서 25°C에서 1시간 반 동안 인큐베이션 하여 항 S-tag 항체에 결합한 파아지를 제거하였다. 항체 결합 파아지를 제거한 후, 남아있는 파아지를 S-tagged- VEGF121 고정된 플레이트에서 25°C의 온도로 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 0. 1% 트뷘 -20 이 포함된 PBS 로 세척하여 비결합 파아지를 제거하였다 (라운드 1에서 7번， 라운드 2에서 15번， 라운드 3에서 15번， 라운드 4 에서 25 번) . 10 의 VEGF 을 사용하여 37 'C에서 상온에서 20 분간 0.2 M 의 글라이신 -HCKpH 2.2)과 함께 인큐베이션한 후， 1 M 의 Tr i s-HCKpH 8.8)으로 즉시 중화하여 결합 파아지를 용출시켰다. 용출 파아지를 log-phase E. coli St ratagene)을 감염시키는데 사용하였다 (37t：， 1 시간) . 파아지 감염 세포를 37°C에서 1 시간 동안 Exl2 헬퍼 파아지로 중복감염 시켰다. 50 mg/L 암피실린과 10 mg/L 카나마이신이 함유된 LB 배지를 중복감염된 세포에 첨가한 다음, 37 °C에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 패닝 동안 모든 분획의 파아지의 역가를 측정하였다. 5 라운드의 패닝 후, 파아지 ELISA 를 실시하였다. 파아지 감염 E. coli ER 로부터 분리된 콜로니는 각 BPB-포함 파아지를 생산하였다. 위에서 언급한 방법에 따라 각 파아지를 타겟 단백질이 코팅된 플레이트에 첨가하였다. PBS/0. 1% 트휜 -20 으로 마이크로타이터 플레이트를 세척하고， PBS/0. 1% 트뷘 -20 에서 HRP-컨쥬게이트 항 M13 항체 (GE Hea l thcare)와 함께 인큐베이션한 후 결합 파아지를 검출하였다. 기질 (BD OptEIA)로서 TMB(tetramethylbenzidine)를 사용하여 450 nm 에서 홉광도를 모니터링하여 결합된 HRP 의 양을 측정하였다. 파아지미드 프라이머 5'-GAT TAC GCC AAG CTT TGG AGC-3'CGenotech, 서열목록 제 18 서열)를 이용하여 양성 클론의 DNA 서열분석을 하였다. 파아지 ELISA
특이성을 측정하기 위하여 파아지 ELISA 를 실시하여 , rhVEGFm, 항- S-tag 항체 (Abeam), 인간 TNFaChTNFa , R&D Systems), 스트렙트아비딘 ((New England Biolabs) 및 HSA(Sigma)에 대하여 BPBVEGF- 파아지를 테스트하였다. 모든 단백질들 (PBS 내 10 ug/ml)을 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하여 96-웰 플레이트에 직접 고정시켰다. 플레이트를 블로킹 버퍼 (2% BSA 를 함유하는 PBS)에서 25°C의 온도로 두 시간 동안 인큐베이션 한 다음， 25°C에서 1시간 동안 BPBVEGF-파아지 (108)가 결합하도록 하였다. PBS/0.1% 트원 -20 으로 마이크로타이터 플레이트를 다섯 번 세척하고， PBS/0.1% 트원 -20 에서 HRP-컨쥬게이트 항 M13 항체 (GE Healthcare)와 함께 인큐베이션 한 후， 결합파지를 검출하였다. 기질 (BD OptEIA)로서 TMB를 사용하고， 450 nm 에서 흡광도를 확인하여 HRP 결합량을 측정하였다. 표면 폴라즈몬 공명에 의한친화도 측정
BIAcore X 장비 (BIAcore)를 사용하여 친화도를 축정하였다. 모든 펩타이드는 Anygen Inc.에서 합성하였다. BPBVEGF 와 VEGF121 사이의 상호작용을 CM5 칩 (BIAcore)에 VEGFm을 고정하여 분석하였다. 다른 농도의 BPBIVEGF, BPB2VEGF, BPB3VEGF 또는 BPB4VEGF 를 주입한 후, VEGF121 과의 상호작용을 러닝 버퍼로서 PBS/0.1% NaN3 을 사용하여 30 ul/분의 흐름 속도로 축정하였다. 상호작용의 모든 동역학 데이터는 BIA evaluation 3.1 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
HUVEC증식 어세이
HUVEC 를 내피세포 성장 배지 2(PromoCell) 내 0.2% 젤라틴 코팅 플레이트에서 배양하여 컨폴루언시까지 성장시켰다. 굶김 배지 (starving medi a ; 1% PBS 와 25 mM HEPES pH7.4 가 함유된 M199)에서 '하룻밤 인큐베이션한 후, HUVEC 를 굶김 배지가 담긴 96-웰 조직 배양 플레이트에 5 , 000 세포 /웰의 밀도로 재분주하였다. 세포를 12 시간 동안 부착하도톡 한 뒤， 배지를 억제제 (BPB1VEGF , BPB2VEGF)를 함유하는 굶김 배지로 rhVEGF121(200 ng/ml )과 함께 혹은 없이 교체해 주었다. 세포를 37°C에서 72 시간 동안 추가 인큐베이션 하였다. 실험 끝에 세포를 세척하고， EZ-cytox 세포 생존율 분석 키트 (Dae i U ab Servi ce Co . )를 사용하여 증식율을 평가하였다. 플레이트는 37°C에서 4 시간 동안 인큐베이션 하였고， 450 nm 에서 측정하였다. 실험결과
BPB 라이브러리로부터 VEGF-결합 파아지의 선별
VEGF 의 억제력이 가장 높은 BPB1VEGF 펩타이드를 최적화하기 위하여 양쪽 끝에 두 개의 가변 부위를 추가하는 라이브러리 (XXAAPTSFGSWTWENGKWTWKGWQMWHRXX , X= 무작위 아미노산, 서열목록 제 19 서열)를 107 개 만들었다. 이를 이용하여 VEGF 단백질에 대해 바이오패닝을 실시한 후 30 개의 시퀀싱을 한 다음 특이성이 좋은 최종 3 개의 후보군을 선택하였다. 특이성이 좋은 것으로 선정된 3 개 후보군의 서열정보는 표 1에 나타내었다.
【표 1】
Figure imgf000021_0001
도 1 은 상기 3 종의 후보군 중 BPB2VEGF의 특이성 검사 결과로서， VEGF 에 대해 특이성 검사를 하기 위하여 BPB2VEGF-재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA 를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다. 도 1 에 나타난 바와 같이， BPB2VEGF은 VEGF에 대하여 특이성을 갖는다 (도 1 참조) . 표면 플라즈몬 공명에 의한친화도 측정 결과
화학적으로 합성한 BPB1-4VEGF 펩타이드의 VEGF121 에 대한 친화도를 표면 플라즈몬 공명 기술로 분석하였다. rhVEGF121 타겟 단백질이 표면에 결합된 BIAcore 칩을 사용하여， 상기 BPB 펩타이드의 결합 특성을 실시간 분석하였다. 측정결과는 표 2 및 도 2에 나타내었다.
【표 2】
Figure imgf000022_0001
그 결과, 가장 높은 친화도를 보인 펩타이드는 BPB2VEGF였으며 , 상기 BPB2VEGF는 ~5.3 X 105 M— 1의 ^(association rate constant), -1.3 X 10"2 S—1의 ^¾(dissociat ion rate constant ) , ~25 nM 의 / equilibrium binding constant) 값을 나타내었다 (표 2 및 도 2 참조). 이러한 결과는, 최적화된 BPB2VEGF가 BPBIVEGF 보다 VEGF 에 대해 6 배 향상된 친화도를 가지고 있음을 보여준다.
HUVEC증식 어세이 결과
내피세포 증식은 VEGF 의존적이며， VEGFR-2 활성화에 의하여 주로 매개된다. BPB 가 내피세포에 대한 VEGF 의 작용을 억제하는지 알아보기 위하여， 내피세포에서 VEGF 유도 분열촉진 활성 (mi togenic activity)에 대한 BPB1VEGF 및 BPB2VEGF 의 영향을 평가하였다. HUVEC 를 200 ng/m^ rhVEGF121로 활성화시키고, 다른 농도의 펩타이드를 72시간 동안 처리하였다. 그 결과, 도 3 에 나타난 바와 같이， 최적화된 BPB2VEGF 는 BPB1VEGF 보다 VEGF 에 의한 내피세포 증식을 보다 더 효과적으로 억제하였다 (도 3 참조). W 201
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
구조안정화 부위 (structure stabi l i zing region)로서 β -헤어핀; 및 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 직접 또는 링커를 통하여 각각 결합된 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 포함하는 타켓 결합 부위 I (target binding region I ) 및 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열을 포함하는 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π )를 포함하는 VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF-바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 β -헤어핀은 트립토판 지퍼인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 트립토판 지퍼는 서열목록 제 3 서열 내지 제 11 서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 바이포달 펩타이드 바인더는 서열목록 제 12 서열의 아미노산 서열을 포함하는 것올 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 5]
제 1 항에 있어서ᅳ 상기 타겟 결합 부위 1 및 타겟 결합 부위 Π는 공동으로 작용하여 VEGF에 결합하는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더 .
【청구항 6】 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위， 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Π에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
【청구항 7】
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 VEGF-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자.
【청구항 8】
제 7 항의 핵산 분자를 포함하는 VEGF-바이포달 펩타이드 바인더 발현용 재조합 백터.
【청구항 9】
제 1 항 내지 제 6 항 증 어느 한 항에 따른 VEGF—바이포달 펩타이드 바인더를 약제학적 유효량으로 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 10]
제 9 항에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 암 황반 변성, 연령 관련 황반변성 (AMD) , 당뇨 망막병증， 혈관신생 녹내장， 건선， 각막궤양， 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증， 안과 염증， 각막 이식거부， 아테름성 동맥경화증, 켈로이드， 신사구체병증, 재협착， 염증성 장 질환 ( IBD) , 류마티스 관절염， 골관절염, 혈관종 및 혈관섬유종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
【청구항 11】
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 VEGF-바이포달 펩타이드 바인더를 약제학적 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료방법.
【청구항 12】 제 11 항에 있어서， 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 황반 변성, 연령 관련 황반변성 (AMD) , 당뇨 망막병증， 혈관신생 녹내장 건선， 각막궤양， 증식성 유리체 망막병증， 미성숙 망막병증， 안과 염증， 각막 이식거부， 아테롬성 동맥경화증， 켈로이드, 신사구체병증， 재협착, 염증성 장 질환 ( IBD) , 류마티스 관절염, 골관절염， 혈관종 및 혈관섬유종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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