WO2015083763A1 - Ｖｅｇｆｒ２由来ペプチドおよびそれを含むワクチン - Google Patents

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卓也 角田
龍司 大沢
祥子 山下
朝久 渡辺
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a peptide effective for inhibiting angiogenesis and treating and preventing diseases mediated by angiogenesis.
  • the present invention also relates to angiogenesis inhibitors comprising these peptides and pharmaceutical compositions and vaccines for the treatment and / or prevention of diseases mediated by angiogenesis.
  • Tumor growth is generally limited to 1-2 mm 3 in the absence of a blood supply in which blood vessels are born, and angiogenesis has a critical role in tumor invasion, growth, and metastasis (non-patented Reference 1-4). It has also been shown that inhibition of tumor angiogenesis is associated with suppression of tumor progression.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGFR VEGF receptor
  • These studies have shown that tumor growth can be successfully suppressed in vitro or in vivo using monoclonal antibodies, recombinant receptors, or inhibitors of signaling (Non-Patent Documents 5-10). .
  • these strategies require frequent or continuous administration of reagents at relatively high dose levels, which can be associated with considerable inconvenience and side effects.
  • VEGFR1 is the first identified VEGF receptor (15), VEGF (VEGF-A), and two other members of the VEGF family, VEGF-B (16) and placenta It interacts with growth factor (PlGF) (Non-patent Document 17).
  • PlGF is expected to move VEGF from VEGFR1 so that more VEGF can bind to VEGFR2 and activate VEGFR2, thereby enhancing angiogenesis driven by VEGF (non-patent literature).
  • Other studies have shown that there is a synergy between VEGF and PlGF in vivo, especially in pathological situations, as evidenced by impaired tumorigenesis and vascular leakage in PlGF-/-mice. (Non-patent Document 19).
  • CNV human choroidal neovascularization
  • Non-patent Literature 1-2 Non-Patent Literature 20
  • these peptides are effective for the treatment of diseases mediated by angiogenesis such as tumors (Non-patent Document 21) and macular degeneration (Patent Documents 3-4).
  • the present invention relates to a peptide capable of inducing cytotoxic T cells (CTL) specific to cells expressing VEGFR2.
  • CTL cytotoxic T cells
  • APC antigen-presenting cells
  • HLA human leukocyte antigen
  • CTLs showing cytotoxic activity specific to VEGFR2-expressing cells are induced.
  • the peptides that have been identified so far and have the ability to induce CTL derived from VEGFR2 are HLA-A2 or HLA-A24-restricted peptides, and induce CTL in cells that do not express these HLA I can't. Therefore, conventional peptides are not suitable when immunotherapy is performed in subjects who do not have these HLA.
  • HLA-A11 and HLA-A33 are alleles commonly found in Asians (Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50: 201-12), but in HLA-A11 or HLA-A33 positive subjects In contrast, it is desirable to administer HLA-A11 or HLA-A33 restricted peptides. Therefore, the present invention relates to a VEGFR2-derived peptide restricted to HLA-A11 or HLA-A33 and having a CTL inducing ability. From the results disclosed herein, the peptide of the present invention is an HLA-A11 or HLA-A33-restricted epitope peptide that can induce a strong and specific immune response against cells expressing VEGFR2. Proven.
  • VEGFR2-derived peptide capable of inducing CTL in a HLA-A11 or HLA-A33-restricted manner.
  • These peptides can be used to induce CTL in vitro, ex vivo or in vivo, or can be used to administer to a subject for the purpose of inducing an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2.
  • Preferred peptides are those comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 43, 70 and 89, more preferably nonapeptides or decapeptides, more preferably SEQ ID NOs: 1, 43, 70 and A peptide consisting of an amino acid sequence selected from 89.
  • the peptides of the present invention have one, two, or more amino acids substituted, deleted, inserted and / or added so long as the resulting modified peptide retains the CTL inducibility of the original peptide Also includes peptides.
  • the present invention also provides an isolated polynucleotide that encodes any one of the peptides of the present invention. These polynucleotides, like the peptides of the present invention, can be used to induce APCs with the ability to induce CTLs, or are administered to a subject to induce an immune response against vascular endothelial cells that express VEGFR2. be able to.
  • the present invention also provides an agent or composition comprising one or more peptides of the present invention or one or more polynucleotides encoding one or more peptides of the present invention.
  • the agent or composition of the present invention is preferably a pharmaceutical agent or composition.
  • the peptides of the invention are presented on the surface of the APC, thereby inducing CTL targeting the peptide.
  • a composition for inducing CTL comprising one or more peptides of the present invention or one or more polynucleotides encoding one or more peptides of the present invention This is a further object of the present invention.
  • the present invention further provides one or more peptides of the present invention or one of the present invention formulated for the treatment and / or prevention of diseases mediated by angiogenesis and prevention of its recurrence after surgery.
  • Pharmaceutical compositions comprising one or more polynucleotides encoding one or more peptides are provided.
  • a method for inducing APC having the ability to induce CTL comprising contacting APC with one or more peptides of the present invention, or introducing a polynucleotide encoding any one of the peptides of the present invention into APC It is a further object of the present invention to provide a method comprising the steps of:
  • the present invention also comprises a step of co-culturing a CD8-positive T cell with APC that presents a complex of the HLA antigen and the peptide of the present invention on its surface, and the CD8 positive T cell is converted to an HLA antigen and the peptide of the present invention.
  • Co-cultured with exosomes presenting the complex with exosomes on their surface, or each T cell receptor (TCR) subunit capable of binding to the peptide of the invention presented by the HLA antigen on the cell surface Provided is a method for inducing CTL comprising the step of introducing a vector containing the encoding polynucleotide into CD8-positive T cells.
  • the invention further provides an isolated CTL that targets the peptide of the invention.
  • a method for inducing an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2 in a subject comprising the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the peptide, an exosome or APC presenting the peptide, and the peptide on its surface
  • FIG. 1 is composed of photographs (a) and (b) showing the results of an IFN- ⁇ ELISPOT assay in CTL induced with a VEGFR2-derived peptide.
  • a typical example of positive data showing strong IFN- ⁇ production compared to the control is shown in (a).
  • a typical example of negative data that did not show specific IFN- ⁇ production is shown in (b).
  • “+” indicates IFN- ⁇ production for target cells pulsed with an appropriate peptide
  • ⁇ indicates IFN- ⁇ production for target cells not pulsed with any peptide.
  • FIG. 2 is composed of photographs (a) and (b) showing the results of an IFN- ⁇ ELISPOT assay in CTL induced with a VEGFR2-derived peptide.
  • a typical example of positive data showing strong IFN- ⁇ production compared to the control is shown in (a).
  • a typical example of negative data that did not show specific IFN- ⁇ production is shown in (b).
  • “+” indicates IFN- ⁇ production for target cells pulsed with an appropriate peptide
  • ⁇ indicates IFN- ⁇ production for target cells not pulsed with any peptide.
  • FIG. 3 shows VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) ) (C), VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: : 27) (i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (sequence) Number: 41) (l), VEGFR2-A11
  • VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) ) (C), VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: : 27) (i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (sequence) Number: 41) (l), VEGFR2-A11-10-308
  • VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) ) (C), VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: : 27) (i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (sequence) Number: 41) (l), VEGFR2-A11-10-308
  • FIG. 4 shows VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) ) (C), VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: : 27) (i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (sequence) No.
  • VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) ) (C), VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: : 27) (i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (sequence) No.
  • VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) ) (C), VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: : 27) (i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (sequence) No.
  • FIG. 5 shows VEGFR2-A33-9-823 (SEQ ID NO: 87) (a), VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (b), VEGFR2-A33-9-214 (SEQ ID NO: 90). ) (C), VEGFR2-A33-9-577 (SEQ ID NO: 21) (d), VEGFR2-A33-10-213 (SEQ ID NO: 104) (e), VEGFR2-A33-10-97 (SEQ ID NO: 83) (f), VEGFR2-A33-10-576 (SEQ ID NO: 40) (g), VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70) (h) and VEGFR2-A33-10-1046 (SEQ ID NO: 114) Consists of a series of line graphs (a) to (i) showing the results of an IFN- ⁇ ELISA assay that in turn demonstrates IFN- ⁇ production of the CTL line stimulated in (i).
  • FIG. 5 shows VEGFR2-A33-9-823 (SEQ ID NO: 87) (a), VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (b), VEGFR2-A33-9-214 (SEQ ID NO: 90).
  • VEGFR2-A33-9-577 SEQ ID NO: 21
  • VEGFR2-A33-10-213 SEQ ID NO: 104
  • VEGFR2-A33-10-97 SEQ ID NO: 83
  • VEGFR2-A33-10-576 SEQ ID NO: 40
  • VEGFR2-A33-10-113 SEQ ID NO: 70
  • h VEGFR2-A33-10-1046
  • SEQ ID NO: 114 Consists of a series of line graphs (a) to (i) showing the results of an IFN- ⁇ ELISA assay that in turn demonstrates IFN- ⁇ production of the CTL line stimulated in (i).
  • FIG. 6 shows VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (a), VEGFR2-A33-9-214 (SEQ ID NO: 90) (b), VEGFR2-A33-9-577 (SEQ ID NO: 21). ) (C), VEGFR2-A33-10-213 (SEQ ID NO: 104) (d), VEGFR2-A33-10-97 (SEQ ID NO: 83) (e), VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70)
  • FIG. 7 consists of a series of line graphs (a)-(c) showing specific CTL activity against target cells expressing VEGFR2 and HLA-A * 1101.
  • COS7 cells transfected with HLA-A * 1101 or full-length VEGFR2 gene were prepared as controls.
  • CTL lines or clones established using VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a) and VEGFR2-A11-10-159 (SEQ ID NO: 43) (b) are VEGFR2 and HLA- It showed specific CTL activity against COS7 cells transfected with both A * 1101 (black diamonds).
  • FIG. 7 consists of a series of line graphs (a)-(c) showing specific CTL activity against target cells expressing VEGFR2 and HLA-A * 1101. COS7 cells transfected with HLA-A * 1101 or full-length VEGFR2 gene were prepared as controls.
  • VEGFR2-A11-9-319 SEQ ID NO: 1
  • VEGFR2-A11-10-159 SEQ ID NO: 43
  • b VEGFR2 and HLA- It showed specific CTL activity against COS7 cells transfected with both A * 1101 (black diamonds).
  • no significant specific CTL activity was detected against target cells expressing either HLA-A * 1101 (triangle) or VEGFR2 (circle).
  • CTL clones established using VEGFR2-A11-9-863 SEQ ID NO: 2 did not show specific CTL activity (c).
  • FIG. 8 consists of a series of line graphs (a)-(c) showing specific CTL activity against target cells expressing VEGFR2 and HLA-A * 3303.
  • COS7 cells transfected with HLA-A * 3303 or full-length VEGFR2 gene were prepared as controls.
  • CTL lines or CTL clones established using VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (a) and VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70) (b) are VEGFR2 and HLA- It showed specific CTL activity against COS7 cells transfected with both A * 3303 (black diamonds).
  • FIG. 8 consists of a series of line graphs (a)-(c) showing specific CTL activity against target cells expressing VEGFR2 and HLA-A * 3303. COS7 cells transfected with HLA-A * 3303 or full-length VEGFR2 gene were prepared as controls.
  • CTL lines or CTL clones established using VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (a) and VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70) (b) are VEGFR2 and HLA- It showed specific CTL activity against COS7 cells transfected with both A * 3303 (black diamonds). On the other hand, no significant specific CTL activity was detected against target cells expressing either HLA-A * 3303 (triangle) or VEGFR2 (circle). In contrast, although a typical example of negative data, CTL clones established using VEGFR2-A33-9-577 (SEQ ID NO: 21) did not show specific CTL activity (c).
  • the words “a”, “an” and “the” mean “at least one” unless otherwise specified.
  • isolated and purified as used with respect to a substance (eg, peptide, antibody, polynucleotide, etc.) refer to at least one substance that the substance can otherwise be contained in a natural source. Indicates that it does not contain substantially.
  • an isolated or purified peptide is substantially free of cellular material, such as carbohydrates, lipids, or other contaminating proteins from the cell or tissue source from which the peptide is derived, or is chemically synthesized. Refers to a peptide that is substantially free of chemical precursors or other chemicals.
  • substantially free of cellular material includes preparations of a peptide in which the peptide is separated from the cellular components of the cell from which it was isolated or recombinantly produced.
  • a peptide that is substantially free of cellular material is a peptide having less than about 30%, 20%, 10%, or 5% (dry weight basis) of a heterologous protein (also referred to herein as “contaminating protein”).
  • a heterologous protein also referred to herein as “contaminating protein”.
  • the peptide When the peptide is produced by chemical synthesis, the peptide is preferably substantially free of chemical precursors or other chemicals, and the chemical precursors or other chemicals involved in peptide synthesis are included in the peptide preparation. Includes preparations of peptides having less than about 30%, 20%, 10%, 5% (dry weight basis) of volume. Certain peptide preparations contain isolated or purified peptides due to the appearance of a single band after eg sodium dodecyl sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis and Coomassie brilliant blue staining of the gel. Can show. In preferred embodiments, the peptides and polynucleotides of the invention are isolated or purified.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Coomassie brilliant blue staining of the gel Can show.
  • the peptides and polynucleotides of the invention are isolated or purified.
  • polypeptide refers to a polymer of amino acid residues.
  • the term refers to amino acid polymers that are residues in which one or more amino acid residues have been modified or are non-natural residues such as artificial chemical mimetics of the corresponding natural amino acids, and natural amino acids Applied to polymer.
  • amino acid refers to natural and synthetic amino acids, as well as amino acid analogs and amino acid mimetics that function similarly to natural amino acids. Natural amino acids are those encoded by the genetic code and amino acids that are post-translationally modified in cells (eg, hydroxyproline, ⁇ -carboxyglutamic acid, and O-phosphoserine).
  • amino acid analog has the same basic chemical structure as a natural amino acid (hydrogen, carboxy group, amino group, and alpha carbon attached to the R group), but has a modified R group or modified backbone. Refers to a compound (eg, homoserine, norleucine, methionine, sulfoxide, methionine methylsulfonium).
  • amino acid mimetic refers to a compound that has a structure that is different from a common amino acid, but that has a similar function.
  • amino acid may be referred to in this specification by a generally known three-letter code or one-letter code recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (Biochemical Nomenclature Commission).
  • nucleic acid is used interchangeably herein and are referred to by the generally accepted one-letter code unless otherwise noted.
  • pharmaceutical as in the case of “pharmaceutical agents” and “pharmaceutical compositions” and the active ingredient and carrier
  • pharmaceutical agent and “pharmaceutical composition” refer to a mixture of a molecule or compound of the invention and a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier. Refers to any product made.
  • composition is intended to encompass a product containing a specific amount of a specific component and any product that results directly or indirectly from a combination of a specific amount of a specific component.
  • a pharmaceutical composition is one from a product comprising an active ingredient and an inert ingredient that constitutes a carrier, as well as a combination, complexation or aggregation of any two or more ingredients.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention encompass any composition made by admixing a compound or cell of the present invention and a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier or “physiologically acceptable carrier” includes liquid or solid fillers, diluents, excipients, solvents and encapsulating materials. It means a pharmaceutically or physiologically acceptable material, composition, substance, or vehicle that is not limited thereto.
  • the term “disease mediated by angiogenesis” refers to a disease in which angiogenesis is involved in the development and / or progression of the disease, examples of which are related to angiogenesis in various cancers and choroids.
  • Diseases neovascular macular disease: age-related macular degeneration, myopic macular degeneration, retinitis pigmentosa, central exudative chorioretinopathy, various retinitis pigmentosa, choroidal atrophy, choroideremia, choroidal osteoma Etc.
  • diabetic retinopathy rheumatoid arthritis
  • psoriasis and atherosclerosis. More specifically, it refers to a disease mediated by angiogenesis involving the expression of the VEGFR2 gene. At the diseased sites of these diseases, the VEGFR2 gene is expressed in vascular endothelial cells.
  • cytotoxic T lymphocyte refers to a sub-group of T lymphocytes that can recognize tumor / cancer cells, virus-infected cells) and induce the death of such cells.
  • HLA-A11 refers to the HLA-A11 type, including subtypes such as HLA-A * 1101, HLA-A * 1102, HLA-A * 1103, HLA-A * 1104 and the like.
  • HLA-A33 refers to the HLA-A33 type including subtypes such as HLA-A * 3303, HLA-A * 3301, and HLA-A * 3304.
  • treatment may reduce the expression of the VEGFR2 gene, inhibit angiogenesis, or A treatment is considered “effective” if it provides a clinical benefit, such as a reduction in the symptoms of a disease mediated by angiogenesis.
  • a treatment is considered “effective” if it provides a clinical benefit, such as a reduction in the symptoms of a disease mediated by angiogenesis.
  • “effective” means that the treatment delays or prevents the onset of the disease or prevents or alleviates the clinical symptoms of the disease. Efficacy is determined in connection with any known method for diagnosing or treating a particular disease type.
  • prevention is used herein to reduce the mortality or morbidity burden due to the disease. Including any work to be made. Prevention can take place at “primary, secondary, and tertiary prevention levels”. Primary prevention avoids the development of disease, whereas secondary and tertiary level prevention, in addition to preventing disease progression and the appearance of symptoms, restores function and is disease-related Including the aim of reducing the adverse effects of existing diseases by reducing the complications of Alternatively, prophylaxis can include a wide range of prophylactic treatment aimed at reducing the severity of a particular disorder, eg, reducing tumor growth and metastasis.
  • cancer treatment and / or prevention and / or prevention of its recurrence after surgery includes the following stages: surgical excision of cancer cells, inhibition of cancer cell growth, tumor regression Or any of the stages such as regression, induction of remission and suppression of cancer development, tumor regression, and reduction or inhibition of metastasis.
  • Effective treatment and / or prevention of cancer reduces mortality, improves the prognosis of individuals with cancer, decreases the level of tumor markers in the blood, and detectable symptoms associated with cancer To ease.
  • symptom relief or amelioration constitutes effective treatment and / or prevention, including 10%, 20%, 30%, or more relief or symptom stability.
  • kit as used herein is used in reference to combinations of reagents and other substances. It is contemplated herein that the kit can include a microarray, chip, marker, and the like. The term “kit” is not intended to be limited to a particular combination of reagents and / or substances.
  • antibody refers to immunoglobulins and fragments thereof that react specifically with the designated protein or peptide thereof.
  • Antibodies can include human antibodies, primatized antibodies, chimeric antibodies, bispecific antibodies, humanized antibodies, antibodies fused with other proteins or radiolabels, and antibody fragments.
  • antibody is used in a broad sense, specifically, an intact monoclonal antibody, a polyclonal antibody, a multispecific antibody formed from two or more intact antibodies (for example, a bispecific antibody). And antibody fragments as long as they exhibit the desired biological activity.
  • Antibody refers to all classes (eg, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM).
  • HLA-A11 and HLA-A33 are alleles commonly found in Asians (Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50: 201-12).
  • providing a VEGFR2-derived CTL-inducing peptide that is constrained by HLA-A11 or HLA-A33 can provide many Asians with an effective treatment for diseases mediated by angiogenesis.
  • the present invention provides a VEGFR2-derived peptide that can induce CTLs in a HLA-A11 or HLA-A33-restricted manner.
  • the peptide of the present invention is a VEGFR2-derived peptide capable of inducing CTL in a HLA-A11 or HLA-A33-restricted manner.
  • Peptides capable of inducing CTL in an HLA-A11 restricted manner include peptides having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1-5, 9, 15, 26, 27, and 39-45.
  • a peptide capable of inducing CTL in an HLA-A33-restricted manner a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114 Is mentioned.
  • CTLs having cytotoxic activity specific to these peptides can be established by in vitro stimulation of T cells by dendritic cells (DC) pulsed with these peptides. Established CTLs show specific cytotoxic activity against target cells pulsed with each peptide.
  • DC dendritic cells
  • the VEGFR2 gene is a strong target for immunotherapy because it is strongly expressed in vascular endothelial cells at the disease site in diseases mediated by angiogenesis, but is not expressed in most normal organs. Therefore, the peptide of the present invention can be suitably used for immunotherapy of diseases mediated by angiogenesis.
  • a preferred peptide is a nonapeptide (a peptide consisting of 9 amino acid residues) or a decapeptide (a peptide consisting of 10 amino acid residues), and SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 21, 26, 27, 39 to Peptides having an amino acid sequence selected from 45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114 are more preferred.
  • a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 43 is suitable for inducing CTLs that show specific cytotoxic activity against cells expressing HLA-A11 and VEGFR2, and HLA-A11 It can be suitably used for immunotherapy of diseases mediated by angiogenesis in positive patients.
  • the peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 70 or 89 is suitable for inducing CTLs that show specific cytotoxic activity against cells expressing HLA-A33 and VEGFR2, and is HLA-A33 positive It can be suitably used for immunotherapy of diseases mediated by angiogenesis in patients.
  • the peptide of the present invention is a peptide consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 43, 70 and 89.
  • the peptide of the present invention can be flanked by additional amino acid residues to the amino acid sequence of the peptide of the present invention. Additional amino acid residues can be composed of any type of amino acid as long as they do not impair the ability of the original peptide to induce CTL. Therefore, the peptide of the present invention has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 21, 26, 27, 39 to 45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114. Including peptides having the ability to induce CTLs.
  • Such peptides are, for example, less than about 40 amino acids, often less than about 20 amino acids, and usually less than about 15 amino acids. Therefore, if the original peptide is a nonapeptide, the peptide of the present invention includes a peptide having a length of 10 amino acids or a length of 11 to 40 amino acids generated by flanking an additional amino acid to the peptide. In addition, if the original peptide is a decapeptide, it includes a peptide having a length of 11 to 40 amino acids. Such peptides can be, for example, peptides that are 11-20 amino acids in length, and can be peptides that are 11-15 amino acids in length.
  • a preferred example of the additional amino acid residue is an amino acid residue adjacent to the amino acid sequence of the peptide of the present invention in the full-length amino acid sequence of VEGFR2. Therefore, the peptide of the present invention is a peptide derived from VEGFR2, and is SEQ ID NO: 1 to 5, 9, 15, 21, 26, 27, 39 to 45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114.
  • modification of one, two, or more amino acids in a peptide does not affect the function of the peptide and in some cases even enhances the desired function of the original peptide.
  • a modified peptide ie, one, two, or a few amino acid residues were modified (ie, substituted, deleted, inserted and / or added) compared to the original reference sequence
  • a peptide composed of an amino acid sequence is known to retain the biological activity of the original peptide (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids) Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13).
  • the peptide of the invention is selected from among SEQ ID NOs: 1-5, 9, 15, 21, 26, 27, 39-45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114
  • this amino acid sequence it may be a peptide comprising an amino acid sequence in which one, two, or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and having CTL inducing ability.
  • amino acid side chain properties that are desirable to preserve include, for example, hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), as well as side chains having the following functional groups or characteristics in common: aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P); hydroxyl group-containing side chains (S, T, Y); sulfur atom-containing side chains (C, M); carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q); base-containing side chains (R) , K, H); and aromatic-containing side chains (H, F, Y, W).
  • hydrophobic amino acids A, I, L, M, F, P, W, Y, V
  • hydrophilic amino acids R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T
  • side chains having the following functional groups or characteristics in common aliphatic side chains (G
  • the following eight groups each contain amino acids recognized in the art as conservative substitutions for each other: 1) Alanine (A), Glycine (G); 2) Aspartic acid (D), glutamic acid (E); 3) Asparagine (N), glutamine (Q); 4) Arginine (R), Lysine (K); 5) Isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), valine (V); 6) phenylalanine (F), tyrosine (Y), tryptophan (W); 7) serine (S), threonine (T); and 8) Cysteine (C), methionine (M) (see, for example, Creighton, Proteins 1984).
  • Such conservatively modified peptides are also included in the peptides of the present invention.
  • the peptide of the present invention is not limited to these, and may contain non-conservative modifications as long as the modified peptide retains the CTL-inducing ability of the original peptide.
  • the modified peptides do not exclude polymorphic variants of VEGFR2, interspecies homologs, and CTL inducible peptides from alleles.
  • the term “several” means 5 or fewer amino acids, such as 4 or 3 or fewer.
  • the percentage of amino acids to be modified is preferably 20% or less, more preferably 15% or less, even more preferably 10% or less, or 1-5%.
  • the peptides of the present invention When used in the context of immunotherapy, the peptides of the present invention should be presented on the surface of cells or exosomes, preferably as a complex with the HLA antigen. Therefore, the peptide of the present invention preferably has a high binding affinity for the HLA antigen. Therefore, the peptide may be modified by amino acid residue substitution, deletion, insertion and / or addition to obtain a modified peptide with improved binding affinity.
  • the second amino acid from the N-terminus and the C-terminal amino acid are often anchor residues involved in binding to HLA Class I (Rammensee HG, et al., Immunogenetics. 1995; 41 (4): 178-228.).
  • HLA-A11 threonine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine and tyrosine are the second amino acids from the N-terminus, lysine and arginine are the C-terminal amino acids, and anchor residues with high binding affinity for HLA-A11.
  • HLA-A11 has auxiliary anchor residues at the 3rd and 7th positions from the N-terminus, and the 3rd amino acid from the N-terminus is preferably leucine, phenylalanine, tyrosine, isoleucine, and alanine, It is known that leucine, isoleucine, tyrosine, valine and phenylalanine are preferred as the seventh amino acid from the N-terminal (Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9).
  • the second amino acid from the N-terminus is replaced with threonine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine or tyrosine, and / or the C-terminal amino acid is lysine.
  • the third amino acid from the N-terminus may be replaced with leucine, phenylalanine, tyrosine, isoleucine, or alanine
  • / or the seventh amino acid from the N-terminus may be replaced with leucine, isoleucine, tyrosine, valine, or phenylalanine. May be desirable.
  • the second amino acid from the N-terminus is threonine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine or tyrosine.
  • the third amino acid from the N-terminus is replaced with leucine, phenylalanine, tyrosine, isoleucine, alanine
  • the seventh amino acid from the N-terminus is replaced with leucine, isoleucine, tyrosine, valine, or phenylalanine
  • a peptide having the ability to induce CTL containing an amino acid sequence in which the C-terminal amino acid is substituted with lysine or arginine is included in the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45, wherein the second amino acid from the N-terminus is threonine, valine, Substituted with isoleucine, leucine, phenylalanine or tyrosine, the third amino acid from the N-terminus is substituted with leucine, phenylalanine, tyrosine, isoleucine or alanine, the seventh amino acid from the N-terminus is leucine, isoleucine, tyrosine, It may be a peptide having an ability to induce CTL consisting of an amino acid sequence, substituted with valine or phenylalanine, and / or substituted with lysine or arginine at the C-terminal amino acid.
  • the peptide of the present invention is selected from the following (a) to (d) in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 Including peptides having CTL inducibility, comprising an amino acid sequence having one or more substitutions: (A) the second amino acid from the N-terminus is substituted with threonine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine or tyrosine; (B) the third amino acid from the N-terminus is substituted with leucine, phenylalanine, tyrosine, isoleucine or alanine; (C) The seventh amino acid from the N-terminus is substituted with leucine, isoleucine, tyrosine, valine or phenylalanine; and (d) the C-terminal amino acid is substituted with lysine or arginine.
  • the peptide of the present invention is selected from the above (a) to (d) in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 It can be a peptide having the ability to induce CTL, consisting of an amino acid sequence having one or more substitutions.
  • the preferred number of substitutions is 1, 2, 3, or 4 substitutions selected from the above (a) to (d).
  • the peptide of the present invention is the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45, wherein the second amino acid from the N-terminal is threonine, valine, isoleucine, It can be a peptide capable of inducing CTL, including an amino acid sequence, substituted with leucine, phenylalanine or tyrosine and / or substituted with lysine or arginine at the C-terminal amino acid.
  • the second amino acid from the N-terminal is threonine, valine, isoleucine. , Leucine, phenylalanine or tyrosine, and / or a C-terminal amino acid substituted with lysine or arginine, and a peptide capable of inducing CTL consisting of an amino acid sequence.
  • the peptide of the present invention is selected from the following (a) and (b) in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45
  • a peptide capable of inducing CTLs comprising an amino acid sequence having one or more substitutions: (A) the second amino acid from the N-terminus is substituted with threonine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine or tyrosine; and (b) the C-terminal amino acid is substituted with lysine or arginine.
  • the peptide of the present invention is selected from the above (a) to (b) in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 It can be a peptide having the ability to induce CTL, consisting of an amino acid sequence having one or more substitutions.
  • the second amino acid from the N-terminus is substituted with threonine, valine, isoleucine or leucine.
  • phenylalanine, tyrosine, alanine, isoleucine, leucine, and valine are the second amino acids from the N-terminus, and arginine and lysine as the C-terminal amino acids have a high binding affinity for HLA-A33.
  • anchor residues Falk, alket al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Takiguchi, et al., .Tissue Antigens 2000: 55: 296-302.
  • the first amino acid residue from the N-terminus also functions as an anchor residue, and aspartic acid and glutamic acid are known to be preferred as the first amino acid from the N-terminus.
  • the first amino acid from the N terminus is replaced with aspartic acid or glutamic acid
  • the second amino acid from the N terminus is phenylalanine, tyrosine, alanine, isoleucine
  • the ability to induce CTL including amino acid sequences, in which the second amino acid from the N-terminus is substituted with phenylalanine, tyrosine, alanine, isoleucine, leucine or valine, and / or the C-terminal amino acid is substituted with arginine or lysine
  • the peptide having is included in the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention has aspartic acid as the first amino acid from the N-terminus in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114.
  • the second amino acid from the N-terminus is substituted with phenylalanine, tyrosine, alanine, isoleucine, leucine or valine, and / or the C-terminal amino acid is substituted with arginine or lysine, It may be a peptide having the ability to induce CTL consisting of an amino acid sequence.
  • the peptide of the present invention has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114, from among the following (a) to (c): Includes peptides capable of inducing CTLs, including amino acid sequences having one or more selected substitutions: (A) the first amino acid from the N-terminus is substituted with aspartic acid or glutamic acid; (B) the second amino acid from the N-terminus is substituted with phenylalanine, tyrosine, alanine, isoleucine, leucine or valine; and (c) the C-terminal amino acid is substituted with arginine or lysine.
  • the peptide of the present invention has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114, and is It may be a peptide having the ability to induce CTL, consisting of an amino acid sequence having one or more selected substitutions.
  • the preferred number of substitutions is one, two or three substitutions selected from the above (a) to (c).
  • the second amino acid from the N-terminus is substituted with phenylalanine or tyrosine.
  • Substitutions can be introduced not only at the terminal amino acid, but also at the potential T cell receptor (TCR) recognition site of the peptide.
  • TCR T cell receptor
  • Some studies have shown that peptides with amino acid substitutions, such as CAP1, p53 (264-272) , Her-2 / neu (369-377) , or gp100 (209-217) , are as active as the original peptide. Have demonstrated or may have superior activity (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-7, 1997, TK Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1; 168 (3 ): 1338-47., SO Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206, and SO Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-14).
  • the invention also selects from peptides of the invention (eg, SEQ ID NOs: 1-5, 9, 15, 21, 26, 27, 39-45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114) It is contemplated that one, two, or several amino acids can be added to the N-terminal and / or C-terminal of a peptide consisting of the amino acid sequence to be determined. Such modified peptides that retain CTL inducibility are also included in the present invention. For example, a peptide having 1, 2, or several amino acids added to the N-terminal and / or C-terminal of a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 43, 70 or 89 is brought into contact with APC.
  • the peptide is incorporated into APC and processed to become a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 43, 70, or 89. Thereafter, CTL can be induced by presenting on the cell surface of APC via the antigen presentation pathway.
  • the amino acid sequence of the peptide is identical to part of the amino acid sequence of an endogenous or exogenous protein with different functions, side effects such as autoimmune disorders and / or allergic symptoms to certain substances can be induced There is sex. Therefore, in order to avoid a situation where the amino acid sequence of a peptide matches the amino acid sequence of another protein, it is preferable to perform a homology search using an available database. If the homology search reveals that there is not even a peptide that differs by one or two amino acids compared to the peptide of interest, without the risk of such side effects, The peptide of interest can be modified to increase its binding affinity and / or to increase its ability to induce CTLs.
  • the “peptide having the ability to induce CTL” refers to a peptide from which CTL is induced by APC stimulated with the peptide.
  • “Induction of CTL” includes induction of CTL activation, induction of CTL proliferation, induction of target cell lysis by CTL, and induction of increased CTL IFN- ⁇ production.
  • Confirmation of the ability to induce CTL is to induce APC (for example, B lymphocytes, macrophages, and dendritic cells (DC)) carrying HLA antigen, stimulate with peptide, mix with CD8 positive T cells, This can be done by measuring IFN- ⁇ released by CTL against the target cells.
  • APC for example, B lymphocytes, macrophages, and dendritic cells (DC)
  • DC dendritic cells
  • a transgenic animal prepared to express HLA antigen for example, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61 (8) : 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A * 0201 / DR1 transgenic mice: those described in dependence on HLA class II restricted T (H) response
  • HLA A * 0201 / DR1 transgenic mice those described in dependence on HLA class II restricted T (H) response
  • the target cells are radiolabeled with 51 Cr or the like, and the cytotoxic activity of CTL induced by the peptide can be calculated from the radioactivity released from the target cells.
  • the ability of CTL to be induced can be measured by measuring IFN- ⁇ produced and released by CTL and visualizing the inhibition zone on the medium using anti-IFN- ⁇ monoclonal antibody. Can be evaluated.
  • the peptides of the present invention can be linked to other peptides as long as the resulting linked peptide retains the ability to induce CTL.
  • suitable peptides to be linked to the peptides of the present invention include CTL inducible peptides derived from tumor associated antigens (TAA).
  • TAA tumor associated antigens
  • the peptides of the present invention can be linked together. Suitable linkers that can be used to link peptides are known in the art, such as AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M . Sutmuller et al., J Immunol.
  • Peptides can be linked in various configurations (eg, linked, overlapping, etc.), and more than two peptides can be linked.
  • the peptide of the present invention can also be linked to other substances as long as the resulting linked peptide retains the ability to induce CTL.
  • suitable substances linked to the peptides of the present invention include, for example, peptides, lipids, sugars or sugar chains, acetyl groups, and natural or synthetic polymers.
  • the peptide of the present invention can be modified such as glycosylation, side chain oxidation, or phosphorylation as long as the CTL inducing ability is not impaired. Such types of modifications can be made to provide additional functions (eg, targeting and delivery functions) or to stabilize the peptide.
  • Peptide stability can be assayed in several ways. For example, peptidases and various biological media such as human plasma and serum can be used to test the stability (see, eg, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302). I want to be)
  • the modified peptide in which one, two, or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added is the same as or compared with the original peptide. Those having higher activity can be screened or selected. Accordingly, the present invention also provides a method for screening or selecting for a modified peptide having the same or higher activity compared to the original.
  • the present invention provides a method for screening a peptide having the ability to induce CTL, comprising the following steps: (A) SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 21, 26, 27, 39 to 45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114, the original amino acid consisting of an amino acid sequence Creating a candidate sequence consisting of an amino acid sequence wherein one, two, or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added to the sequence; (B) selecting a candidate sequence having no significant homology (sequence identity) with any known human gene product other than VEGFR2 from the candidate sequences prepared in (a); (C) contacting the peptide comprising the candidate sequence selected in (b) with APC; (D) contacting the APC of (c) with a CD8-positive T cell; and (e) selecting a peptide having a CTL inducing ability that is equal to or higher than that of the peptide consisting of the original amino acid sequence.
  • the peptide of the present invention is also described as “VEGFR2 peptide” or “VEGFR2 polypeptide”.
  • VEGFR2 peptides The peptides of the present invention can be prepared using well-known techniques. For example, the peptides of the invention can be prepared using recombinant DNA technology or chemical synthesis. The peptides of the present invention can be synthesized individually or as longer polypeptides comprising two or more peptides. After being produced in a host cell using recombinant DNA technology or chemically synthesized, the peptides of the invention can be isolated from the host cell or synthesis reaction. That is, the peptides of the invention can be purified or isolated so that they are substantially free of other host cell proteins and fragments thereof, or any other chemicals.
  • the peptide of the present invention may contain modifications such as glycosylation, side chain oxidation, or phosphorylation, as long as the modification does not impair the biological activity of the original peptide.
  • modifications include the incorporation of D-amino acids or other amino acid mimetics that can be used, for example, to increase the serum half-life of the peptide.
  • the peptide of the present invention can be obtained by chemical synthesis based on the selected amino acid sequence.
  • Examples of conventional peptide synthesis methods that can be adapted for the synthesis include those described in the literature as follows: (I) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; (Ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976; (Iii) “Peptide Synthesis” (Japanese), Maruzen, 1975; (Iv) “Basics and Experiments of Peptide Synthesis” (Japanese), Maruzen, 1985; (V) "Development of drugs” (Japanese), Vol.
  • any known genetic engineering method for producing a peptide can be adapted to obtain a peptide of the invention (eg, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.) 1983, 101: 347-62).
  • an appropriate vector containing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form eg, downstream of a regulatory sequence corresponding to a promoter sequence
  • the host cell is then cultured to produce the peptide of the invention.
  • the peptides of the present invention can be generated in vitro using an in vitro translation system.
  • polynucleotides that encode any of the peptides of the present invention. These include polynucleotides derived from the native VEGFR2 gene (eg, GenBank accession number NM — 002253.2 (SEQ ID NO: 122)) and polynucleotides having conservatively modified nucleotide sequences thereof. As used herein, the phrase “conservatively modified nucleotide sequence” refers to sequences that encode the same or essentially the same amino acid sequence. Because of the degeneracy of the genetic code, a large number of functionally identical nucleic acids encode any particular protein.
  • the codons GCA, GCC, GCG, and GCU all encode the amino acid alanine.
  • the codon can be changed to any of the corresponding codons without changing the encoded polypeptide.
  • Such nucleic acid mutations are “silent mutations” and are a type of mutation conservatively modified. Every nucleic acid sequence herein that encodes a peptide also represents every possible silent variation of the nucleic acid. Those skilled in the art will be able to modify each codon in the nucleic acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan) to obtain a functionally identical molecule. You will recognize. Accordingly, each silent variation of a nucleic acid that encodes a peptide is implicitly described in each disclosed sequence.
  • the polynucleotide of the present invention can be composed of DNA, RNA, and derivatives thereof.
  • DNA is suitably composed of bases such as A, T, C and G, and T is replaced by U in RNA.
  • the polynucleotide of the present invention can encode a plurality of peptides of the present invention with or without an intervening amino acid sequence in between.
  • the intervening amino acid sequence can provide a cleavage site (eg, an enzyme recognition sequence) for the polynucleotide or translated peptide.
  • the polynucleotide may comprise any additional sequence to the coding sequence that encodes a peptide of the invention.
  • the polynucleotide may be a recombinant polynucleotide containing regulatory sequences necessary for expression of the peptide, or an expression vector (eg, a plasmid) having a marker gene or the like.
  • such recombinant polynucleotides can be prepared, for example, by manipulating the polynucleotide by conventional recombinant techniques using polymerases and endonucleases.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced using any of recombinant techniques and chemical synthesis techniques.
  • a polynucleotide can be made by inserting into an appropriate vector, which can be expressed when transfected into competent cells.
  • polynucleotides can be amplified using PCR techniques or expression in a suitable host (see, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989) I want to be)
  • polynucleotides can be synthesized using the solid phase technique described in Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5. it can.
  • Exosomes The present invention further provides intracellular vesicles, called exosomes, that present complexes formed between the peptides of the present invention and HLA antigens on their surface. Exosomes can be prepared using, for example, the methods detailed in JP-A-11-510507 and WO99 / 03499, and prepared using APC obtained from a patient to be treated and / or prevented can do. The exosomes of the present invention can be vaccinated as a vaccine in the same manner as the peptides of the present invention.
  • HLA-A11 eg, HLA-A * 1101
  • HLA-A33 eg, HLA-A * 3303
  • these HLA antigen types are Asian It is considered suitable for the treatment of human patients.
  • a clinic has a high level of binding affinity for a specific HLA antigen or through a specific HLA antigen by pre-examining the type of HLA antigen of the patient in need of treatment Appropriate selection of peptides having the ability to induce CTL by presentation is possible.
  • the exosome of the present invention presents a complex of the peptide of the present invention and HLA-A11 or HLA-A33 on its surface.
  • the peptide of the present invention is selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27, and 39 to 45 It is preferably a peptide having an amino acid sequence or a modified peptide thereof, and is a peptide consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 or a modified peptide thereof It is more preferable.
  • the peptide of the present invention is selected from among SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104, and 114. It is preferably a peptide having an amino sequence selected or a modified peptide thereof, a peptide comprising an amino sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114 or More preferably, the modified peptide.
  • the present invention also provides an antigen presenting cell (APC) that presents on its surface the complex formed between the HLA antigen and the peptide of the present invention.
  • the present invention provides an APC having on its cell surface a complex formed between an HLA antigen and a peptide of the present invention.
  • the APC of the present invention can be an isolated APC.
  • isolated when used in reference to a cell (APC, CTL, etc.) refers to the cell being separated from other types of cells.
  • the APC of the present invention may be derived from an APC derived from a patient to be treated and / or prevented, and alone or another drug containing the peptide, exosome, or CTL of the present invention Can be used as a vaccine.
  • the APCs of the present invention are not limited to specific types of cells, including dendritic cells (DCs) that are known to present proteinaceous antigens on their cell surface as recognized by lymphocytes. ), Langerhans cells, macrophages, B cells, and activated T cells. Since DC is a representative APC having the strongest CTL inducing action among APCs, DC can be preferably used as the APC of the present invention. In the present invention, preferred DC is human-derived isolated DC, or a mixture thereof. That is, DCs presenting different peptides as antigens can be mixed and used.
  • DCs dendritic cells
  • the APC of the present invention can be obtained by inducing DCs from peripheral blood monocytes and then stimulating them with the peptides of the present invention in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the peptide of the present invention is administered to a subject, APC presenting the peptide of the present invention is induced in the subject's body. Therefore, the APC of the present invention can be obtained by administering the peptide of the present invention to a subject and then recovering the APC from the subject.
  • the APC of the present invention can be obtained by contacting APC recovered from a subject with the peptide of the present invention.
  • the APC of the invention is administered to the subject alone or in combination with other agents, including peptides, exosomes, or CTLs of the invention, to induce an immune response against vascular endothelial cells that express VEGFR2.
  • ex vivo administration may include the following steps: a: recovering APC from the first subject; b: contacting the APC of step a with a peptide; and c: administering the bpc of step b to a second subject.
  • the first object and the second object may be the same individual or different individuals.
  • the HLA of the first object and the second object is preferably the same type.
  • the APC obtained by step b above can be a vaccine for treating and / or preventing diseases mediated by angiogenesis.
  • the APC of the present invention obtained by the method as described above has the ability to induce CTL.
  • CTL inducing ability refers to the ability of APC to induce CTL when contacted with CD8 positive T cells.
  • CTL inducing ability includes APC ability to induce CTL activation, APC ability to induce CTL proliferation, APC ability to promote lysis of target cells by CTL, and IFN- ⁇ production by CTL Includes APC ability to increase.
  • the CTL induced by the APC of the present invention is a CTL specific for VEGFR2, and exhibits a cytotoxic activity specific to VEGFR2-expressing cells.
  • the APC of the present invention can also be prepared by introducing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into APC in vitro.
  • the polynucleotide to be introduced may be in the form of DNA or RNA.
  • introduction methods include, but are not limited to, various methods conventionally practiced in the art, such as lipofection, electroporation, and the calcium phosphate method. More specifically, it is described in Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Patent Publication No. 2000-509281 Such a method can be used.
  • the polynucleotide By introducing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into APC, the polynucleotide undergoes transcription, translation, etc. in the cell, and then the resulting peptide is processed by MHC class I and passed through the presentation pathway to the main pathway.
  • the peptides of the invention are presented on the cell surface of APC.
  • the APC of the present invention is a complex formed between HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303) and the peptide of the present invention.
  • APC presenting the body on its own cell surface.
  • the HLA that forms a complex with the peptide of the present invention is HLA-A11
  • the peptide of the present invention is an amino acid selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27, and 39 to 45
  • a peptide having a sequence or a modified peptide thereof is preferable, and a peptide consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27, and 39 to 45 is more preferable.
  • the peptide of the present invention is selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114.
  • the APC of the present invention is preferably an APC derived by a method comprising the steps described in a or b below: a: contacting APC expressing HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-33 (more preferably HLA-A * 3303) with the peptide of the present invention; b: introducing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into APC expressing HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303) .
  • the peptide of the present invention to be contacted with APC expressing HLA-A11 is a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 or a modification thereof A peptide is preferable, and a peptide consisting of an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27, and 39 to 45 is more preferable.
  • the peptide of the present invention to be contacted with APC expressing HLA-A33 has an amino sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114. It is preferably a peptide or a modified peptide thereof, more preferably a peptide consisting of an amino sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114.
  • the present invention uses of the peptide of the present invention for producing a pharmaceutical composition for inducing APC having CTL inducing ability is provided.
  • the present invention provides a method or process for producing a pharmaceutical composition that induces APC having the ability to induce CTL.
  • the present invention also provides a peptide of the present invention for inducing APC having CTL inducibility.
  • Cytotoxic T lymphocyte (CTL) CTL induced by the peptide of the present invention can be used as a vaccine in the same manner as the peptide of the present invention because it enhances the immune response targeting vascular endothelial cells expressing VEGFR2 in vivo. Accordingly, the present invention provides CTL induced or activated by the peptides of the present invention.
  • the CTL of the present invention is a CTL that targets the peptide of the present invention, and is a CTL that can bind to a complex of the peptide of the present invention and an HLA antigen. Binding of CTL to the complex is performed via a T cell receptor (TCR) present on the cell surface of CTL.
  • TCR T cell receptor
  • the CTL of the present invention can be an isolated CTL.
  • a preferred CTL is an isolated CTL derived from human, or a mixture thereof. That is, CTLs that recognize HLA complexes on which different peptides are presented as antigens can be mixed and used.
  • the CTL of the present invention comprises (1) administering the peptide of the present invention to a subject, or (2) stimulating APC and CD8 positive T cells or peripheral blood mononuclear cells derived from the subject with the peptide of the present invention in vitro. Or (3) contacting CD8 positive T cells or peripheral blood mononuclear cells in vitro with APCs or exosomes that present complexes of HLA antigens and peptides of the invention on their surface, or ( 4) It can be obtained by introducing a vector comprising a polynucleotide encoding each subunit of T cell receptor (TCR) capable of binding to the peptide of the present invention presented by the HLA antigen on the cell surface.
  • TCR T cell receptor
  • exosome and APC used in the above method (2) or (3) can be prepared by the methods described in the sections “V. Exosomes” and “VI. Antigen-presenting cells (APC)”, respectively. Details of the method (4) will be described in the section “VIII. T cell receptor (TCR)”.
  • the CTL of the present invention can be administered alone to a patient to be treated and / or prevented, or used in combination with other drugs including the peptide, APC or exosome of the present invention for the purpose of regulating the effect. Can be administered.
  • the CTL of the present invention can be a CTL derived from a CD8-positive T cell derived from a patient to whom the CTL is administered.
  • the CTL of the present invention specifically acts on a target cell presenting the peptide of the present invention, for example, the same peptide used for induction of the CTL of the present invention.
  • the target cells may be cells that endogenously express VEGFR2, such as endothelial cells of tumor tissue, or cells that have been transfected with the VEGFR2 gene.
  • the target cell of CTL of the present invention is preferably a cell positive for HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303).
  • the CTLs of the invention are specific for cells expressing both HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303) and VEGFR2.
  • CTL “targets” a cell means that CTL recognizes a cell presenting a complex of HLA and the peptide of the present invention on the cell surface, and cytotoxicity against the cell. Indicates activity. Further, “specifically targeting” means that CTL shows cytotoxic activity against the cell but does not show cytotoxic activity against other cells.
  • the term “recognize a cell” is specific to the cell that binds to the complex of HLA presented on the cell surface and the peptide of the present invention via its TCR. It shows that it shows a cytotoxic activity. Therefore, the CTL of the present invention preferably comprises HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303) displayed on the cell surface and the peptide of the present invention. Is a CTL that can be bound to the complex formed between and via TCR.
  • the CTL of the present invention is preferably a CTL induced by a method comprising the steps described in the following a or b: a: A CD8 positive T cell is placed on its surface with a complex of HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303) and the peptide of the present invention. Contacting the presenting APC or exosome in vitro; b: binds to the peptide of the present invention presented on CD8 positive T cells by HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) or HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303) on the cell surface. Introducing a polynucleotide encoding each subunit of the resulting TCR.
  • T cell receptor The present invention also includes a composition comprising a polynucleotide encoding each subunit of a T cell receptor (TCR) capable of binding to the peptide of the present invention presented by the HLA antigen on the cell surface, and a method of using the same I will provide a.
  • the polynucleotide confers CD8 positive T cells with specificity for vascular endothelial cells expressing VEGFR2 by forming a TCR on the cell surface that can bind to the peptides of the present invention presented by the HLA antigen.
  • PCR primers for analysis can be used as a primer set for amplification by combining the following 5′-side primer with the following 3′-side primer, but are not limited thereto.
  • TCR formed by introducing the identified polynucleotide into a CD8-positive T cell can bind with high binding force to a target cell presenting the peptide of the present invention, and presents the peptide of the
  • the polynucleotide encoding each subunit of TCR can be incorporated into an appropriate vector, for example, a retroviral vector. These vectors are well known in the art.
  • the polynucleotide or a vector containing them in an expressible form can be introduced into a CD8-positive T cell, eg, a patient-derived CD8-positive T cell.
  • the present invention makes it possible to quickly and easily produce modified T cells with superior vascular endothelial cell killing properties by rapid modification of the patient's own T cells (or another mammalian T cell).
  • a composition is provided.
  • the specific TCR specifically indicates a complex of the peptide of the present invention and the HLA antigen presented on the surface of a target cell when the TCR is present on the surface of a CD8-positive T cell. It is a TCR that can recognize and confer specific cytotoxic activity on target cells. Specific recognition of the complex can be confirmed by any known method, and preferred examples include HLA multimer staining analysis using HLA molecules and peptides of the present invention, and ELISPOT assay. By performing the ELISPOT assay, it can be confirmed that the T cell introduced with the polynucleotide specifically recognizes the target cell by TCR and that the signal is transmitted intracellularly.
  • confirmation that the TCR can impart a target cell-specific cytotoxic activity to the CD8-positive T cell is also performed by a known method. be able to. Preferred methods include measuring cytotoxic activity against target cells, such as by a chromium release assay.
  • the present invention also relates to each subunit of TCR that binds to a peptide having an amino acid sequence selected from, for example, SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27, and 39 to 45 in the context of HLA-A11 CTLs prepared by transducing the encoding polynucleotide are provided.
  • the invention in the context of HLA-A33, the invention relates to each sub-unit of TCR that binds to a peptide having an amino acid sequence selected from, for example, SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114.
  • CTLs prepared by transducing a polynucleotide encoding the unit are provided.
  • Transduced CTL can be homed in vivo and can be propagated by well-known in vitro culture methods (eg, Kawakami et al., J Immunol., 142, 2-3452-61 (1989)).
  • the CTLs of the invention can be used to form immunogenic compositions useful for the treatment or prevention of disease in patients in need of treatment or prevention, the contents of which are hereby incorporated by reference. (See WO2006 / 031221).
  • composition or pharmaceutical composition comprising at least one active ingredient selected from: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC of the present invention; (D) the exosome of the present invention; (E) CTL of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain carriers, excipients and the like that are usually used for pharmaceuticals as necessary, in addition to the above-mentioned active ingredients.
  • carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include sterilized water, physiological saline, phosphate buffer, culture solution, and the like.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising at least one active ingredient selected from the following (a) to (e) and a pharmaceutically acceptable carrier: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC of the present invention; (D) the exosome of the present invention; (E) CTL of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a stabilizer, a suspension, a preservative, a surfactant and the like, if necessary.
  • VEGFR2 expression is elevated in vascular endothelial cells at disease sites in diseases mediated by angiogenesis compared to normal tissues. Therefore, the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the peptide can be used for treatment and / or prevention of a disease mediated by angiogenesis and / or prevention of its recurrence after surgery.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of a disease mediated by angiogenesis and / or prevention of its recurrence after surgery, comprising one kind of the peptide or polynucleotide of the present invention Or the composition which contains multiple types as an active ingredient is provided.
  • the peptides of the invention can be presented on the surface of exosomes or APCs for use as pharmaceutical compositions.
  • a CTL of the present invention that targets any one of the peptides of the present invention can also be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount of the above-mentioned active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be used as a vaccine.
  • the phrase “vaccine” also referred to as “immunogenic composition” is a composition having the function of inducing an immune response that provides an anti-angiogenic effect when inoculated into an animal. Point to.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be used to induce an immune response that provides an anti-angiogenic effect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used to treat and / or prevent a disease mediated by angiogenesis and / or prevent its recurrence after surgery in a human subject or patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be preferably used for HLA-A11 positive or HLA-A33 positive subjects.
  • the present invention also provides the use of an active ingredient selected from among the following in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease mediated by angiogenesis: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • an active ingredient selected from among the following in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease mediated by angiogenesis: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the
  • the present invention further provides an active ingredient selected from the following for use in the treatment or prevention of diseases mediated by angiogenesis: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • the present invention further provides a method or process for producing a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease mediated by angiogenesis, comprising at least one active ingredient selected from A method or process comprising formulating a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier with: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • the present invention also provides a method or process for producing a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease mediated by angiogenesis, comprising an active ingredient selected from A method or process is provided that comprises mixing with a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier comprises mixing with a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease mediated by angiogenesis, comprising the step of administering to a subject at least one active ingredient selected from the following: I will provide a: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 is capable of inducing a strong and specific immune response. It was found as a sex epitope peptide.
  • a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114 is capable of inducing a strong and specific immune response. It was found as a sex epitope peptide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprising at least one peptide having an amino acid sequence selected from among SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 is HLA antigen as HLA antigen.
  • composition of the present invention comprising at least one peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104, and 114 is an HLA antigen.
  • HLA-A33 eg, HLA-A * 3303.
  • compositions containing the targeted CTL ie, the CTLs of the present invention. That is, a pharmaceutical composition comprising an active ingredient related to a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 is a subject having HLA-A11 (Ie, suitable for administration to HLA-A11 positive subjects).
  • a pharmaceutical composition comprising an active ingredient related to a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114 is HLA-A33.
  • Suitable for administration to a subject having a HLA-A33 positive ie, HLA-A33 positive subject.
  • the pharmaceutical composition of the invention is a pharmaceutical composition comprising at least one peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 43, 70 and 89.
  • Diseases to be treated and / or prevented by the pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited, and various cancers, diseases related to angiogenesis in the choroid (neovascular maculopathy: age-related macular degeneration, myopia) Macular degeneration, retinitis pigmentosa, central exudative retina choroidopathy, various retinal pigment epitheliopathy, choroidal atrophy, choroideremia, choroidal osteoma, etc.), diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, or atheroma Includes all types of angiogenesis-mediated diseases involving VEGFR2, including atherosclerosis and the like.
  • angiogenesis at the tumor site is also closely associated with solid tumor growth and metastasis (Folkman, J. (1995) NatureN Med. 1: 27-31; Bicknell et al., (1996) Curr. Opin . Oncol. 8: 60-5). Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can also be used to suppress the growth and / or metastasis of cancer (solid tumor).
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises, in addition to the above-mentioned active ingredient, other peptides having the ability to induce CTLs against vascular endothelial cells at disease sites (for example, peptide CTL-inducing peptides derived from VEGFR1), the other peptides Other polynucleotides encoding the other, other cells presenting the other peptides, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention when the pharmaceutical composition of the present invention is particularly for treating and / or preventing cancer, the pharmaceutical composition of the present invention has the ability to induce CTL against cancer cells.
  • a peptide for example, a cancer antigen-derived CTL-inducing peptide
  • a polynucleotide encoding the peptide, a cell presenting the peptide, and the like may be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may optionally contain other therapeutic substances as an active ingredient as long as the anti-angiogenic effect of the active ingredient such as the peptide of the present invention is not inhibited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may optionally include an anti-inflammatory composition, an analgesic, a chemotherapeutic agent and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be administered sequentially or simultaneously with one or more other pharmaceutical compositions. it can.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention and other pharmaceutical compositions depends, for example, on the type of pharmaceutical composition used, the disease to be treated, and the schedule and route of administration.
  • compositions of the invention may also contain other ingredients customary in the art in view of the type of formulation. Should.
  • the present invention also provides a product or kit comprising the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the product or kit of the present invention may comprise a container containing the pharmaceutical composition of the present invention.
  • suitable containers include, but are not limited to, bottles, vials, and test tubes.
  • the container can be formed from a variety of materials such as glass or plastic.
  • a label may be attached to the container, and the label can describe a disease or a disease state in which the pharmaceutical composition of the present invention is to be used.
  • the label may also indicate directions for administration and the like.
  • the product or kit of the present invention may optionally further comprise a second container containing a pharmaceutically acceptable diluent in addition to the container containing the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the product or kit of the present invention further includes other materials desirable from a commercial and user standpoint, such as other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts with instructions for use. May be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be provided in a pack or dispenser device that may contain one or more unit dosage forms containing the active ingredient.
  • the pack may include metal foil or plastic foil, such as a blister pack.
  • the pack or dispenser device can be accompanied by instructions for administration.
  • composition containing a peptide as an active ingredient can be formulated by a conventional formulation method, if necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain carriers, excipients and the like that are commonly used in pharmaceuticals as needed without particular limitation. Examples of carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include sterilized water, physiological saline, phosphate buffer, culture solution, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a stabilizer, a suspension, a preservative, a surfactant and the like, if necessary. Since the pharmaceutical composition of the present invention can induce specific immunity against vascular endothelial cells expressing VEGFR2, it can be used for anti-angiogenic purposes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also contain a combination of two or more kinds of the peptides of the present invention.
  • the peptide combination may take the form of a cocktail in which the peptides are mixed, or the peptides may be linked together using standard techniques.
  • the peptides may be chemically conjugated or expressed as a single fusion polypeptide sequence.
  • APC eg, DC
  • APCs that present any of the peptides of the invention on their cell surface.
  • APCs can be re-administered to a subject to induce CTL in the subject, resulting in increased aggression against vascular endothelial cells that express VEGFR2.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also include an adjuvant known to efficiently establish cellular immunity.
  • An adjuvant refers to a compound that, when administered with (or sequentially) an antigen having immunological activity, enhances the immune response to the antigen.
  • the adjuvant for example, known ones described in documents such as Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89 can be used.
  • suitable adjuvants include aluminum phosphate, aluminum hydroxide, alum, cholera toxin, salmonella toxin, incomplete Freund's adjuvant (IFA), complete Freund's adjuvant (CFA), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, oil-in-water type Although emulsion etc. are included, it is not limited to these.
  • the adjuvant may be contained in a container separate from the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention.
  • the adjuvant and the pharmaceutical composition may be administered to the subject sequentially or may be mixed immediately before administration to the subject.
  • a kit containing a pharmaceutical composition containing such a peptide of the present invention and an adjuvant is also provided by the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a liposome preparation encapsulating the peptide of the present invention, a granule preparation in which the peptide is bound to beads having a diameter of several micrometers, or a preparation in which a lipid is bound to the peptide. Also good.
  • the peptide of the invention may also be administered in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the salt include a salt with an alkali metal, a salt with a metal, a salt with an organic base, a salt with an amine, an organic acid (acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, And salts with citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid and the like, and salts with inorganic acids (hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, etc.).
  • the phrase “pharmaceutically acceptable salt” retains the biological effectiveness and properties of the compound, and includes hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid. , Methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid and the like such salts obtained by reaction with inorganic bases. Accordingly, pharmaceutical compositions comprising pharmaceutically acceptable salts of the peptides of the present invention are also encompassed by the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise an ingredient that stimulates CTL.
  • Lipids have been identified as substances that can stimulate CTLs in vivo against viral antigens.
  • palmitic acid residues can be attached to the ⁇ and ⁇ amino groups of lysine residues and then linked to the peptides of the invention.
  • the lipidated peptide can then be administered directly in the form of micelles or particles, administered in liposomes, or emulsified in an adjuvant.
  • Another example of lipid stimulation of the CTL response is when E.
  • coli lipoproteins such as tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine (P3CSS) are used when covalently bound to the appropriate peptide.
  • P3CSS tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine
  • Suitable methods of administration of the peptides or pharmaceutical compositions of the invention include oral, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraosseous, peritoneal, intravenous injection, and the like, and systemic administration or local to the target site It may be administration (ie direct injection). Among them, a common administration method is, for example, subcutaneous injection. Administration can be by a single dose or can be boosted by multiple doses.
  • the peptide of the present invention is a pharmaceutically effective amount for treating a disease mediated by angiogenesis or a pharmaceutically effective amount for inducing immunity (more specifically, CTL) against vascular endothelial cells expressing VEGFR2. Can be administered to a subject.
  • the dose of the peptide of the present invention can be appropriately adjusted according to the disease to be treated, the age, body weight, administration method, etc. of the patient, and this is usually 0.001 mg to 1000 mg, for example 0.01 mg, for each peptide of the present invention. It can be ⁇ 100 mg, such as 0.1 mg to 30 mg, such as 0.1 mg to 10 mg, for example 0.5 mg to 5 mg. Further, the administration interval can be once every several days to several months. For example, administration can be performed once a week. Those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose (dose).
  • composition comprising polynucleotide as active ingredient
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also comprise a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in a form capable of expression.
  • the phrase “in an expressible form” means that the peptide of the invention is expressed when the polynucleotide is introduced into a cell.
  • the sequence of the polynucleotide of the invention includes regulatory elements necessary for expression of the peptide of the invention.
  • the polynucleotides of the invention can be provided with the sequences necessary to achieve stable insertion into the genome of the target cell (for a description of homologous recombination cassette vectors, see eg, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12). See, for example, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; US Pat. Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; and WO98 / 04720 I want to be.
  • DNA-based delivery technologies include “naked DNA”, facilitated (bupivacaine, polymer, peptide-mediated) delivery, cationic lipid complexes, and particle-mediated (“gene gun”) or pressure-mediated Delivery is included (see, eg, US Pat. No. 5,922,687).
  • the peptide of the present invention can also be expressed by a viral vector or a bacterial vector.
  • expression vectors include attenuated viral hosts such as vaccinia virus or fowlpox virus.
  • vaccinia virus can be used as a vector for expressing the peptide of the present invention.
  • vaccinia virus When introduced into a host, recombinant vaccinia virus expresses an immunogenic peptide, thereby eliciting an immune response.
  • Vaccinia vectors and methods useful for immunization protocols are described, for example, in US Pat. No. 4,722,848.
  • Another vector is BCG (Bacilli Calmette Guerin). BCG vectors are described in Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60.
  • adenovirus vectors and adeno-associated virus vectors such as adenovirus vectors and adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, Salmonella typhi vectors, detoxified anthrax toxin vectors, etc.
  • retrovirus vectors such as Salmonella typhi vectors, detoxified anthrax toxin vectors, etc.
  • Salmonella typhi vectors such as Salmonella typhi vectors, detoxified anthrax toxin vectors, etc.
  • Delivery of the polynucleotide of the present invention into a patient may be direct, and in this case, the patient can be directly exposed to a vector carrying the polynucleotide of the present invention.
  • it may be indirect, in which case the cells are first transformed in vitro with a vector carrying the polynucleotide of the invention and then the cells are transplanted into the patient.
  • Each of these two approaches is known as in vivo and ex vivo gene therapy.
  • polynucleotide administration may be by oral, intradermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraosseous and / or peritoneal injection, etc., and systemic administration or near the target site Topical administration of will find use. Administration can be by a single dose or can be boosted by multiple doses.
  • the polynucleotide of the present invention has a pharmaceutically effective amount for treating a disease mediated by angiogenesis or a pharmaceutically effective amount for inducing immunity (more specifically, CTL) against vascular endothelial cells expressing VEGFR2. Can be administered to the subject.
  • the dosage of the polynucleotide in a suitable carrier, or the dosage of the polynucleotide in a cell transformed with a polynucleotide encoding a peptide of the invention will depend on the disease being treated, the age, weight of the patient, method of administration, etc. This can usually be from 0.001 mg to 1000 mg, such as from 0.01 mg to 100 mg, such as from 0.1 mg to 30 mg, such as from 0.1 mg to 10 mg, such as from 0.5 mg to 5 mg.
  • the dosing interval can be once every few days to once every several months, for example, once a week. Those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose (dose).
  • peptides and polynucleotides of the present invention can be used to induce APCs and CTLs.
  • CTLs can also be induced using the exosomes and APCs of the present invention.
  • the peptides, polynucleotides, exosomes, and APCs of the present invention can be used in combination with any other compound as long as their ability to induce CTLs is not inhibited. Therefore, a CTL of the present invention can be induced using a pharmaceutical composition comprising any of the peptide, polynucleotide, APC and exosome of the present invention.
  • APC of this invention can be induced
  • the present invention provides a method for inducing APC having CTL inducing ability using the peptide or polynucleotide of the present invention.
  • the method of the invention comprises contacting APC with a peptide of the invention in vitro, ex vivo or in vivo.
  • a method of contacting APC with the peptide ex vivo may comprise the following steps: a: recovering APC from the subject; and b: contacting the APC of step a with the peptide of the invention.
  • the APC is not limited to a particular type of cell, but is known to present proteinaceous antigens on its cell surface as recognized by lymphocytes, DCs, Langerhans cells, macrophages, B cells, and Activated T cells can be used. Since DC has the strongest CTL inducing ability among APCs, DC can be preferably used.
  • any peptide of the invention can be used alone or with other peptides of the invention.
  • the peptide of the present invention can be used in combination with another CTL-inducing peptide (for example, a VEGFR1-derived CTL-inducing peptide or a cancer antigen-derived CTL-inducing peptide).
  • the methods of the invention can include the step of administering to the subject a peptide of the invention.
  • the polynucleotide of the present invention is administered to a subject in an expressible form, the peptide of the present invention is expressed in vivo, which comes into contact with APC in vivo, and as a result, APC having high CTL inducing ability is Induced in the subject's body.
  • the present invention can also include the step of administering a polynucleotide of the present invention to a subject.
  • the present invention can also include the step of introducing the polynucleotide of the present invention into APC in order to induce APC having CTL inducing ability.
  • the method may include the following steps: a: recovering APC from the subject; and b: introducing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into the APC of step a.
  • Step b can be performed as described above in section "VI. Antigen-presenting cells (APC)".
  • the present invention provides a method for inducing APC having CTL inducing ability, comprising the following steps a or b: a: contacting APC with a peptide of the invention; b: introducing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into APC.
  • the present invention also provides a method for preparing APC having CTL inducing ability, comprising the following steps a or b: a: contacting APC with a peptide of the invention; b: introducing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into APC.
  • the above method can be performed in vitro, ex vivo, or in vivo, but is preferably performed in vitro or ex vivo.
  • the APC used in the above method may be derived from a subject to whom administration of induced APC is scheduled, but may be derived from a different subject.
  • APC derived from a subject (donor) that is different from the subject to be administered, the HLA type of the subject and the donor needs to be the same.
  • the peptide of the present invention when a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 or a modified peptide thereof is used as the peptide of the present invention, administration
  • the HLA type of the subject and the donor is preferably HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101).
  • the APC used in the above method is preferably an APC expressing HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101).
  • the donor HLA is preferably HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303).
  • the APC used in the above method is preferably an APC expressing HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303).
  • APC can be prepared from blood collected from a donor by specific gravity centrifugation or the like, and then prepared from the PBMC using a known method.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for inducing ACTL having the ability to induce CTL, comprising the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the peptide.
  • the present invention further provides use of the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the peptide in the manufacture of a pharmaceutical composition for inducing APC having CTL inducing ability.
  • the present invention further provides a peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the peptide for use in the induction of APC having the ability to induce CTL.
  • the present invention further relates to a method or process for producing a pharmaceutical composition for inducing APC comprising a peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the peptide, pharmaceutically or physiologically.
  • a method or process is provided that includes the step of formulating an acceptable carrier.
  • the present invention also provides a method or process for producing a pharmaceutical composition for inducing APC having CTL inducing ability, comprising the peptide of the present invention or a polynucleotide encoding the peptide.
  • a method or process is provided that comprises admixing with a pharmaceutically or physiologically acceptable carrier.
  • APC induced by the method of the present invention can induce a CTL specific for VEGFR2 (ie, the CTL of the present invention).
  • the present invention also provides a method for inducing CTL using the peptide, polynucleotide, exosome, or APC of the present invention.
  • the invention also provides one or more polynucleotides that encode a polypeptide (ie, TCR subunit) that can form a T cell receptor (TCR) that can recognize a complex of a peptide of the invention and an HLA antigen.
  • TCR T cell receptor
  • the method of inducing CTL comprises at least one step selected from the following: a. Contacting a CD8 positive T cell with an antigen presenting cell that presents a complex of the HLA antigen and a peptide of the invention on its surface; b.
  • CD8 positive T cell Contacting a CD8 positive T cell with an exosome that presents a complex of HLA antigen and a peptide of the invention on its surface; and c. Introducing one or more polynucleotides encoding a polypeptide capable of forming a TCR capable of recognizing a complex of the peptide of the present invention and an HLA antigen into CD8 positive T cells.
  • the methods of the invention can include administering to the subject a peptide, polynucleotide, APC, or exosome of the invention.
  • CTLs can be induced by using them in vitro or ex vivo.
  • the method of the present invention may include the following steps: a. Recovering APC from the subject, b. Contacting the APC of step a with a peptide of the invention, and c. Co-culturing the APC of step b with CD8 positive T cells. The induced CTL may then be returned to the subject.
  • APC co-cultured with CD8-positive T cells in the above step c can be obtained by introducing a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into APC as described above in the section “VI. Antigen-presenting cells (APC)”. It can also be prepared.
  • APC Antigen-presenting cells
  • the APC used in the method of the present invention is not limited to this, and any APC that presents a complex of the HLA antigen and the peptide of the present invention on its surface can be used.
  • an exosome that presents a complex of the HLA antigen and the peptide of the present invention on its surface can be used instead of such APC. That is, the method of the present invention can include the step of co-culturing exosomes that present a complex of the HLA antigen and the peptide of the present invention on its surface.
  • exosomes can be prepared by the methods described above in the section “V. Exosomes”.
  • CTL can be induced by introducing a vector containing a polynucleotide encoding each subunit of TCR capable of binding to the peptide of the present invention presented by the HLA antigen on the cell surface into CD8-positive T cells. it can.
  • Such transduction can be performed as described above in the section “VIII. T Cell Receptor (TCR)”.
  • the present invention provides a method for inducing CTL comprising the step selected from: a: co-culturing CD8 positive T cells with APC presenting a complex of HLA antigen and peptide of the invention on its surface; b: co-culturing CD8 positive T cells with exosomes presenting a complex of HLA antigen and a peptide of the invention on its surface; and c: of the invention presented by HLA antigen on the cell surface Introducing a vector comprising a polynucleotide encoding each subunit of TCR capable of binding to a peptide into a CD8-positive T cell.
  • the above method can be performed in vitro, ex vivo, or in vivo, but is preferably performed in vitro or ex vivo.
  • the APC or exosome and CD8 positive T cell used in the above method may be derived from a subject to whom the induced CTL is to be administered, or may be derived from a different subject. Good.
  • APC or exosome derived from a subject (donor) different from the subject to be administered, and CD8 positive T cells the HLA type of the subject and the donor needs to be the same.
  • the administration subject and donor The HLA type is preferably HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101).
  • the APC or exosome used in the above method is HLA-A11 (more preferably HLA-A * 1101) and the peptide of the present invention (SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45). It is preferably an APC or exosome that presents a complex with a peptide having an amino acid sequence selected from the above or a modified peptide thereof on its surface.
  • the induced CTL exhibits specific cytotoxic activity against cells that present a complex of HLA-A11 and the peptide of the present invention (for example, HLA-A11 positive cells expressing VEGFR2).
  • HLA-A11 positive cells expressing VEGFR2
  • a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114 or a modified peptide thereof is used as the peptide of the present invention
  • the donor HLA is preferably HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303).
  • the APC or exosome used in the above method is HLA-A33 (more preferably HLA-A * 3303) and the peptide of the present invention (SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104).
  • the induced CTL exhibits specific cytotoxic activity against cells that present a complex of HLA-A33 and the peptide of the present invention (for example, HLA-A33 positive cells that express VEGFR2). .
  • the present invention also provides a composition or pharmaceutical composition for inducing CTL comprising at least one active ingredient selected from the following: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptides of the present invention on its surface; and (d) exosomes presenting the peptides of the present invention on its surface.
  • the present invention also provides the use of an active ingredient selected from among the following in the manufacture of a composition or pharmaceutical composition for inducing CTL: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptides of the present invention on its surface; and (d) exosomes presenting the peptides of the present invention on its surface.
  • an active ingredient selected from among the following in the manufacture of a composition or pharmaceutical composition for inducing CTL: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptides of the present invention on its surface; and (d) exosomes presenting the peptides of the present invention on its surface.
  • the present invention further provides an active ingredient selected from among the following for use in the induction of CTL: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptides of the present invention on its surface; and (d) exosomes presenting the peptides of the present invention on its surface.
  • the present invention further relates to a method or process for producing a composition or pharmaceutical composition for inducing CTLs, comprising an active ingredient selected from the following, pharmaceutically or physiologically
  • a method or process comprises formulating an acceptable carrier with: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptides of the present invention on its surface; and (d) exosomes presenting the peptides of the present invention on its surface.
  • the present invention also provides a method or process for producing a composition or pharmaceutical composition for inducing CTL, wherein an active ingredient selected from the following is pharmaceutically or physiologically
  • a method or process comprising the step of admixing with a chemically acceptable carrier is provided: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptides of the present invention on its surface; and (d) exosomes presenting the peptides of the present invention on its surface.
  • Suitable diseases are those mediated by angiogenesis, including various cancers, diseases related to angiogenesis in the choroid (neovascular macular disease: age-related macular degeneration, myopic macular degeneration, retina) Pigment streaks, central exudative chorioretinopathy, various retinal pigment epitheliopathy, choroidal atrophy, choroideremia, choroidal osteoma), diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, and atherosclerosis Including, but not limited to.
  • the present invention also provides a method for inducing an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2.
  • VEGFR2 is found to be strongly expressed in vascular endothelial cells at the disease site. Therefore, when an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2 is induced, angiogenesis at the disease site is inhibited as a result.
  • the present invention also provides a method of inhibiting angiogenesis at a disease site of a disease mediated by angiogenesis.
  • the method of the present invention may comprise the step of administering a composition comprising any of the peptides of the present invention or a polynucleotide encoding them.
  • the methods of the present invention also contemplate administration of exosomes or APCs that present any of the peptides of the present invention.
  • exosomes and APCs that can be used in the methods of the invention to induce an immune response include the aforementioned “V. exosomes”, “VI. Antigen presenting cells (APCs)”, and “X. It is described in detail in the sections (1) and (2) of “Method Using Exosome, APC, and CTL”.
  • the invention also provides a pharmaceutical composition or vaccine for inducing an immune response against a disease site of a disease mediated by angiogenesis, comprising an active ingredient selected from:
  • a pharmaceutical composition or vaccine is provided: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition or vaccine for inducing an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2, which comprises an active ingredient selected from the following: I will provide a: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • a pharmaceutical composition or vaccine for inducing an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2 which comprises an active ingredient selected from the following: I will provide a: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exo
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition or vaccine for inhibiting angiogenesis at a disease site of a disease mediated by angiogenesis, comprising an active ingredient selected from the following: Provide a composition or vaccine: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • a composition or vaccine for inhibiting angiogenesis at a disease site of mediated by angiogenesis, comprising an active ingredient selected from the following: Provide a composition or vaccine: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome
  • the present invention also provides the use of an active ingredient selected from among the following in the manufacture of a pharmaceutical composition or vaccine for inducing an immune response against a disease site of a disease mediated by angiogenesis: provide: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting the peptide of the present invention in its own surface; and (e) a CTL of the present invention.
  • the present invention further provides the use of an active ingredient selected from the following in the manufacture of a pharmaceutical composition or vaccine for inducing an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • an active ingredient selected from the following in the manufacture of a pharmaceutical composition or vaccine for inducing an immune response against vascular endothelial cells expressing VEGFR2: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptid
  • the present invention further provides the use of an active ingredient selected from among the following in the manufacture of a pharmaceutical composition or vaccine for inhibiting angiogenesis at a disease site of a disease mediated by angiogenesis: : (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • an active ingredient selected from among the following in the manufacture of a pharmaceutical composition or vaccine for inhibiting angiogenesis at a disease site of a disease mediated by angiogenesis: : (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting
  • the invention also includes a method or process for producing a pharmaceutical composition that induces an immune response, comprising mixing or formulating a peptide or polynucleotide of the invention with a pharmaceutically acceptable carrier. Provide a way to get.
  • the present invention is for inhibiting angiogenesis at a disease site of a disease mediated by angiogenesis, comprising administering to a subject a vaccine or pharmaceutical composition comprising an active ingredient selected from the following:
  • a method or method of inducing an immune response against a disease site of a disease mediated by angiogenesis is provided: (A) the peptide of the present invention; (B) a polynucleotide encoding the peptide of the present invention in an expressible form; (C) APC presenting the peptide of the invention on its surface; (D) an exosome presenting a peptide of the invention on its surface; and (e) a CTL of the invention.
  • diseases mediated by angiogenesis associated with VEGFR2 expression can be treated by administering the peptides, polypeptides, APCs, exosomes and / or CTLs of the present invention.
  • administration of the peptides, polypeptides, APCs, exosomes and / or CTLs of the present invention can induce an immune response against the disease site of a disease mediated by angiogenesis associated with VEGFR2 expression.
  • diseases include various cancers, diseases related to angiogenesis in the choroid (neovascular macular disease: age-related macular degeneration, myopic macular degeneration, retinitis pigmentosa, central exudation Retinopathy of the retina, various retinitis pigmentosa, choroidal atrophy, choroideremia, choroidal osteoma, etc.), diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, and atherosclerosis.
  • neovascular macular disease age-related macular degeneration, myopic macular degeneration, retinitis pigmentosa, central exudation Retinopathy of the retina, various retinitis pigmentosa, choroidal atrophy, choroideremia, choroidal osteoma, etc.
  • diabetic retinopathy rheumatoid arthritis
  • psoriasis psoriasis
  • atherosclerosis by administering the
  • the invention provides a method of treating a disease in a patient in need of treatment of a disease mediated by angiogenesis associated with VEGFR2 expression, such method comprising the following steps: i) measuring the expression level of VEGFR2 in a biological sample obtained from a disease site of a subject having a disease to be treated; ii) comparing the expression level of VEGFR2 with a normal control; and iii) overexpressing VEGFR2 compared to the normal control with at least one component selected from the group consisting of (a) to (e) above Administering to a subject having a disease.
  • the present invention also comprises at least one active ingredient selected from the group consisting of (a) to (e) above for administration to a subject having a disease mediated by angiogenesis associated with VEGFR2 expression.
  • a vaccine or pharmaceutical composition comprising is provided.
  • the present invention further relates to a method for identifying a subject to be treated with at least one active ingredient selected from the group consisting of (a) to (e) above, wherein the expression level of VEGFR2 in a biological sample derived from the subject is determined.
  • the subject is treated with at least one active ingredient selected from the group consisting of (a)-(e) above, wherein the level is elevated compared to the normal control level. Methods are provided that are identified as being obtained.
  • VEGFR2 expression in a biological sample can be measured by a known method, for example, a method of detecting a transcript of the VEGFR2 gene by a probe or PCR method (for example, cDNA microarray method, Northern blot method, RT-PCR method, etc.)
  • a method for detecting a translation product of the VEGFR2 gene with an antibody for example, Western blotting, immunostaining, etc.
  • the expression level of the VEGFR2 gene in cells that overexpress VEGFR2 is increased by, for example, 10%, 25% or 50% from the control level (e.g., levels in normal cells) or more than 1.1 fold It can be determined that it has risen if it rises above 1.5 times, above 2.0 times, above 5.0 times, above 10.0 times, or more.
  • Control levels should be determined by using previously collected and stored samples from subjects with known angiogenesis-related disease states (with or without the disease) associated with VEGFR2 expression Can do.
  • normal cells obtained from areas that do not require treatment of the organ having the disease to be treated may be used as normal controls.
  • the control level may be determined by statistical methods based on results obtained by analyzing a predetermined expression level of the VEGFR2 gene in a sample derived from a subject with known disease state. Good.
  • the control level can be derived from a database of expression patterns from previously tested cells.
  • the expression level of the VEGFR2 gene in the biological sample may be compared to a plurality of control levels determined from a plurality of reference samples.
  • a control level determined from a reference sample derived from a tissue type similar to that of the subject-derived biological sample is used.
  • a reference value for the expression level of the VEGFR2 gene in a population whose disease state is known can be obtained by any method known in the art. For example, an average value +/ ⁇ 2 S.D. or a range of average value +/ ⁇ 3 S.D. can be used as the reference value.
  • control nucleic acid whose expression level has been found not to vary depending on the state of the disease mediated by angiogenesis associated with VEGFR2 expression, for example It can be normalized to the expression level of the housekeeping gene.
  • control genes include, but are not limited to, ⁇ -actin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, and ribosomal protein P1.
  • an HLA-A11 positive subject is selected as an administration subject of an active ingredient related to a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 26, 27 and 39 to 45 It is preferable to do.
  • an administration target of an active ingredient related to a peptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 21, 40, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114 an HLA-A33 positive subject Is preferably selected.
  • the present invention also provides a complex of the peptide of the present invention and HLA.
  • the complex of the present invention may be a monomer or a multimer.
  • the number of polymerizations is not particularly limited, and can be a multimer of any number of polymerizations. Examples include, but are not limited to, tetramer, pentamer, hexamer and the like.
  • Dextramers WO2002 / 072631
  • streptamers KnabelnaM et al.,. Nat Med. 2002 Jun; 8 (6): 631-7.
  • the complex of the peptide of the present invention and HLA can be prepared according to a known method (for example, Altman JD et al., Science.1996,274 (5284): 94-6, WO2002 / 072631, WO2009 / 003492 Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun; 8 (6): 631-7 etc.).
  • the complex of the present invention can be used, for example, for quantification of CTL specific for the peptide of the present invention.
  • a blood sample is collected from a subject administered with the pharmaceutical composition of the present invention, PBMCs are separated, CD4 negative cells are prepared, and the complex of the present invention conjugated with a fluorescent dye and the CD4 negative cells Make contact.
  • the ratio of CTL specific for the peptide of the present invention can be measured by analyzing by flow cytometry. For example, by measuring CTL specific for the peptide of the present invention before, during and / or after administration of the pharmaceutical composition of the present invention, the immune response inducing effect of the pharmaceutical composition of the present invention can be increased. Can be monitored.
  • the present invention further provides antibodies that bind to the peptides of the present invention.
  • Preferred antibodies specifically bind to peptides of the invention and do not bind (or bind weakly) to non-peptides of the invention.
  • such antibodies may include antibodies that recognize peptides in the context of HLA molecules, ie, antibodies that bind to peptide-MHC complexes.
  • the binding specificity of the antibody can be confirmed by an inhibition test. That is, if the binding between the antibody to be analyzed and the full-length VEGFR2 polypeptide is inhibited in the presence of the peptide of the invention, this indicates that the antibody specifically binds to the peptide of the invention.
  • the antibodies against the peptides of the present invention can be used in disease diagnosis and prognostic assays, as well as in the selection of subjects for administration of the pharmaceutical compositions of the present invention and monitoring of the pharmaceutical compositions of the present invention.
  • the present invention also provides various immunological assay methods for detecting and / or quantifying the peptides of the present invention or fragments thereof.
  • immunological assays include, but are not limited to, radioimmunoassay, immunochromatography, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme-linked immunofluorescence assay (ELIFA), etc. It is performed within a variety of immunological assay formats well known in the art.
  • the antibodies of the present invention can be used in immunological imaging methods that can detect diseases expressing VEGFR2, examples of which include radioscintigraphic imaging methods using labeled antibodies of the present invention.
  • Such assays are used clinically in the detection, monitoring, and prognosis of diseases that express VEGFR2, and examples of such diseases include diseases associated with various cancers, angiogenesis in the choroid (neoplasia)
  • diseases associated with various cancers angiogenesis in the choroid (neoplasia)
  • Vascular macular degeneration age-related macular degeneration, myopic macular degeneration, retinitis pigmentosa, central exudative retinochoroidosis, various retinal pigment
  • the antibody of the present invention can be used in any form such as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, for example, antiserum obtained by immunizing animals such as rabbits with the peptide of the present invention, all classes of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. It may further include antibodies, human antibodies, and humanized antibodies produced by genetic recombination.
  • the peptide of the present invention or a fragment thereof used as an antigen for obtaining an antibody can be obtained by chemical synthesis or genetic engineering techniques based on the amino acid sequence disclosed in the present specification.
  • the peptide used as an immunizing antigen may be a peptide of the present invention or a fragment of the peptide of the present invention.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • Methods for conjugating KLH and peptides are also well known in the art.
  • Rodentia Lagomorpha, or Primate animals
  • Rodent animals include, for example, mice, rats, and hamsters.
  • Rabbits include, for example, rabbits.
  • Primatological animals include, for example, monkeys of the Catarrhini (Old World monkey) such as cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis), rhesus monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • antigen Intraperitoneal or subcutaneous injection of antigen is a standard method for immunizing mammals. More specifically, the antigen is diluted with an appropriate amount of phosphate buffered saline (PBS), physiological saline or the like and suspended. If desired, the antigen suspension can be mixed with an appropriate amount of a standard adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, emulsified and administered to a mammal. Thereafter, the antigen mixed with an appropriate amount of Freund's incomplete adjuvant is preferably administered several times every 4 to 21 days. A suitable carrier may be used for immunization. After immunization as described above, serum can be examined by standard methods for increasing amounts of the desired antibody.
  • PBS phosphate buffered saline
  • a suitable carrier may be used for immunization. After immunization as described above, serum can be examined by standard methods for increasing amounts of the desired antibody.
  • Polyclonal antibodies against the peptides of the present invention can be prepared by recovering blood from the immunized mammal examined for an increase in the desired antibody in the serum and separating the serum from the blood by any conventional method.
  • Polyclonal antibodies may include serum containing polyclonal antibodies, and fractions containing polyclonal antibodies may be isolated from the serum.
  • Immunoglobulin G or M is obtained from a fraction that recognizes only the peptide of the present invention by using, for example, an affinity column to which the peptide of the present invention is bound, and further using this protein A or protein G column. It can be purified and prepared.
  • immune cells are collected from a mammal immunized with an antigen, and after confirming an increase in the level of a desired antibody in serum as described above, it is subjected to cell fusion.
  • the immune cells used for cell fusion can be preferably obtained from the spleen.
  • Other preferred parental cells to be fused with the above immune cells include, for example, mammalian myeloma cells, and more preferably myeloma cells that have acquired properties for selection of fusion cells with drugs.
  • the above immune cells and myeloma cells can be fused.
  • Hybridomas resulting from cell fusion can be selected by culturing them in a standard selective medium such as HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine). Cell culture typically continues in HAT medium for days to weeks, a period sufficient for all other cells (non-fused cells) except the desired hybridoma to die. Thereafter, standard limiting dilution can be performed to screen and clone hybridoma cells producing the desired antibody.
  • HAT medium medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • human lymphocytes such as lymphocytes infected with EB virus can be transformed with peptides, cells expressing the peptides, or lysates thereof. It is also possible to immunize in vitro. Subsequently, the lymphocyte after immunization is fused with an infinitely-dividable human-derived myeloma cell such as U266 to obtain a hybridoma that produces a desired human antibody that can bind to the peptide (Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho A). 63-17688).
  • the obtained hybridoma is transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites is extracted.
  • the obtained monoclonal antibody can be purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A or protein G column, DEAE ion exchange chromatography, or an affinity column to which the peptide of the present invention is bound.
  • immune cells that produce antibodies can be immortalized by oncogenes and used to prepare monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibodies thus obtained can also be prepared recombinantly using genetic engineering techniques (see, for example, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the UK by MacMillan Publishers LTD (1990)).
  • Wanna For example, DNA encoding an antibody is cloned from an immune cell such as an antibody-producing hybridoma or immunized lymphocyte, inserted into an appropriate vector, and then introduced into a host cell to prepare a recombinant antibody. Can do.
  • the present invention also provides a recombinant antibody prepared as described above.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody as long as it binds to the peptide of the present invention.
  • the antibody fragment desirably contains an antigen-binding site of an antibody.
  • the antibody fragment may be Fab, F (ab ′) 2 , Fv, or a single chain Fv (scFv) in which Fv fragments derived from H and L chains are linked by an appropriate linker.
  • an antibody fragment can be prepared by treating an antibody with an enzyme such as papain or pepsin.
  • a gene encoding the antibody fragment can be constructed, inserted into an expression vector, and expressed in a suitable host cell (eg, Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); see Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).
  • Antibodies can be modified by binding with various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention provides such modified antibodies.
  • Modified antibodies can be obtained by chemically modifying antibodies. These modification methods are routine in the art.
  • the antibody of the present invention is a chimeric antibody between a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody, or a complementarity determining region (CDR) derived from a non-human antibody and a human antibody. It can also be obtained as a humanized antibody comprising a framework region (FR) derived from and a constant region.
  • Such antibodies can be prepared according to known techniques. Humanization can be performed by replacing the corresponding sequence of a human antibody with a rodent CDR or CDR sequence (see, for example, Verhoeyenyet al., Science 239: 1534-6 (1988)). . Accordingly, such humanized antibodies are chimeric antibodies in which substantially less than a human variable domain has been replaced by the corresponding sequence from a non-human species.
  • human antibodies containing human variable regions can also be used.
  • Such antibodies can be generated using various techniques known in the art. For example, in vitro methods include the use of recombinant libraries of human antibody fragments displayed on bacteriophages (eg, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 1991 (1991)).
  • human antibodies can be made by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals, such as mice, in which the endogenous immunoglobulin genes are partially or completely inactivated. This approach is described, for example, in US Pat. Nos. 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425;
  • the antibody obtained as described above may be purified to homogeneity.
  • separation and purification of antibodies can be performed according to separation and purification methods used for general proteins. For example, but not limited to, appropriately selecting and combining the use of column chromatography such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and isoelectric focusing
  • column chromatography such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and isoelectric focusing
  • Protein A and protein G columns can be used as affinity columns.
  • Exemplary protein A columns to be used include, for example, HyperD, POROS, and Sepharose F. F. (Pharmacia) is included.
  • Exemplary chromatography includes, in addition to affinity chromatography, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Chromatographic procedures can be performed by liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the antigen-binding activity of the antibody of the present invention using absorbance measurement, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), radioimmunoassay (RIA), and / or immunofluorescence.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA the antibody of the present invention is immobilized on a plate, the peptide of the present invention is added to the plate, and then a sample containing a desired antibody such as a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added.
  • a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase is then added and the plate is incubated.
  • an enzyme substrate such as p-nitrophenyl phosphate is added to the plate, the absorbance is measured, and the antigen binding activity of the sample is evaluated.
  • a peptide fragment such as a C-terminal or N-terminal fragment may be used as an antigen.
  • BIAcore Pharmacia
  • the peptide of the present invention can be obtained by the above method. Can be detected or measured. Since the method for detecting or measuring a peptide according to the present invention can specifically detect or measure a peptide, this method can be used in various experiments using the peptide.
  • the antibodies of the present invention can also be used to detect the peptides of the present invention present in a blood sample (eg, a serum sample) of interest. Alternatively, conversely, the antibody of the present invention present in the blood sample (eg, serum sample) of the subject can be detected using the peptide of the present invention.
  • the result of measuring the peptide of the present invention or the antibody of the present invention in the blood sample of the subject can be useful for selecting the administration target of the pharmaceutical composition of the present invention or monitoring the effect of the pharmaceutical composition of the present invention. it can.
  • the present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding the peptide of the present invention and a host cell into which the vector has been introduced.
  • the vectors of the present invention can be used to retain a polynucleotide of the present invention in a host cell, to express a peptide of the present invention in a host cell, or to administer a polynucleotide of the present invention for gene therapy. .
  • E. coli When E. coli is the host cell and the vector is amplified in large quantities by amplification in E. coli (eg, JM109, DH5 ⁇ , HB101, or XL1Blue), the vector is a “replication origin” for amplification in E. coli, It is necessary to have a marker gene (for example, a drug resistance gene selected by a drug such as ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol) for selecting the transformed E. coli.
  • a marker gene for example, a drug resistance gene selected by a drug such as ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol
  • M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script and the like can be used.
  • an expression vector can be used.
  • an expression vector to be expressed in E. coli must have the above characteristics in order to amplify in E. coli.
  • E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, or XL1 Blue is used as a host cell
  • the vector may be a promoter that can efficiently express a desired gene in E.
  • the vector may contain a signal sequence for peptide secretion.
  • An exemplary signal sequence that causes the peptide to be secreted into the periplasm of E. coli is the pelB signal sequence (Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)).
  • Means for introducing the vector into the target host cell include, for example, the calcium chloride method and the electroporation method.
  • expression vectors derived from mammals for example, pcDNA3 (Invitrogen), and pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18 (17): 5322 (1990)
  • pEF pCDM8
  • insect cell-derived expression Vectors eg, “Bac-to-BAC baculovirus expression system” (GIBCO BRL), pBacPAK8)
  • plant-derived expression vectors eg, pMH1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors eg, pHSV, pMV, pAdexLcw
  • Retrovirus-derived expression vectors eg, pZIpneo
  • yeast-derived expression vectors eg, “Pichia expression kit” (Invitrogen), pNV11, SP-Q01
  • Bacillus subtilis Expression vectors eg, pPL608, pKTH50
  • pPL608, pKTH50 Bacillus subtilis Expression vectors
  • the vector In order for a vector to be expressed in animal cells such as CHO, COS, or NIH3T3 cells, the vector must be a promoter required for expression in such cells, such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979 )), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), CMV promoter and the like, and preferably a marker gene (eg, drug (eg , Neomycin, G418).
  • a promoter required for expression in such cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979 )), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), CMV promoter and the like, and preferably a marker gene (eg, drug
  • a peptide of less than 15 amino acids having an ability to induce cytotoxic T cells comprising an amino acid sequence selected from the following group: (A) an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-5, 9, 15, 21, 26, 27, 39-45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114; and (b ) SEQ ID NOs: 1-5, 9, 15, 21, 26, 27, 39-45, 70, 83, 87, 89, 90, 104, and 114 in the amino acid sequence selected from the group An amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added.
  • a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and at least one active ingredient selected from the group consisting of the following (a) to (e): (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; (D) an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (e) any one of [1] to [4] CTL targeting the peptide according to one item.
  • APC antigen-presenting cell
  • D an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA
  • a composition for inducing CTL comprising at least one active ingredient selected from the group consisting of the following (a) to (d): (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (d) [1] to [ [4] An exosome that presents a complex of the peptide of any one of [4] and an HLA antigen on its cell surface.
  • APC antigen-presenting cell
  • composition according to [6] which is a pharmaceutical composition.
  • the group consisting of (i) treatment of diseases mediated by angiogenesis, (ii) prevention of diseases mediated by angiogenesis, and (iii) prevention of postoperative recurrence of diseases mediated by angiogenesis The composition according to [8], which is a pharmaceutical composition for one or more uses selected from the above.
  • Diseases mediated by angiogenesis are cancer, diseases associated with angiogenesis in the choroid (neovascular macular disease), diabetic retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, and atherosclerosis.
  • Diseases related to angiogenesis in the choroid are age-related macular degeneration, myopic macular degeneration, retinitis pigmentosa, central exudative reticulochoroidosis, various retinal pigment epitheliopathy, choroidal atrophy
  • the composition according to [11] which is choroideremia or choroidal osteoma.
  • a method for inducing APC having CTL inducing ability comprising a step selected from the group consisting of: (A) contacting APC with the peptide according to any one of [1] to [4] in vitro, ex vivo or in vivo; and (b) any one of [1] to [4] Introducing a polynucleotide encoding the peptide of APC into APC.
  • a method of inducing CTL comprising a step selected from the group consisting of: (A) co-culturing CD8-positive T cells with APC that presents a complex of the HLA antigen and the peptide according to any one of [1] to [4] on its surface; (B) co-culturing a CD8-positive T cell with an exosome that presents a complex of the HLA antigen and the peptide of any one of [1] to [4] on its surface; and (c) A polynucleotide encoding each subunit of a T cell receptor (TCR) capable of binding to the peptide according to any one of [1] to [4] presented on the cell surface by an HLA antigen is a CD8 positive T cell Stage to introduce.
  • TCR T cell receptor
  • APC that presents a complex of the HLA antigen and the peptide according to any one of [1] to [4] on its surface.
  • Angiogenesis at a disease site of a disease mediated by angiogenesis comprising administering to a subject a composition comprising at least one active ingredient selected from the group consisting of the following (a) to (e): How to inhibit: (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; (D) an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (e) any one of [1] to [4] CTL targeting the peptide according to one item.
  • APC antigen-presenting cell
  • D an exosome that presents
  • Treatment and / or prevention of a disease mediated by angiogenesis comprising the step of administering to a subject a composition comprising at least one active ingredient selected from the group consisting of (a) to (e) below: How to do and / or prevent its recurrence after surgery: (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; (D) an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (e) any one of [1] to [4] CTL targeting the peptide according to one item.
  • APC anti
  • a method for screening a peptide having CTL inducing ability comprising the following steps: (A) SEQ ID NOs: 1 to 5, 9, 15, 21, 26, 27, 39 to 45, 70, 83, 87, 89, 90, 104 and 114, the original amino acid consisting of an amino acid sequence Creating a candidate sequence consisting of an amino acid sequence in which one, two, or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added to the sequence; (B) selecting a candidate sequence having no significant homology (sequence identity) with any known human gene product other than VEGFR2 from the candidate sequences prepared in (a); (C) contacting the peptide comprising the candidate sequence selected in (b) with APC; (D) contacting the APC of (c) with a CD8-positive T cell; and (e) selecting a peptide having a CTL inducing ability that is equal to
  • APC antigen-presenting cell
  • D an exosome that presents a complex
  • [26] The group consisting of the following (a) to (e) in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of a disease mediated by angiogenesis and / or prevention of its recurrence after surgery: Use of at least one active ingredient selected from: (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; (D) an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (e) any one of [1] to [4] CTL targeting the peptide according to one item.
  • APC antigen-
  • [27] Use of at least one active ingredient selected from the group consisting of the following (a) to (e) for inhibiting angiogenesis at a disease site of a disease mediated by angiogenesis: (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; (D) an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (e) any one of [1] to [4] CTL targeting the peptide according to one item.
  • APC antigen-presenting cell
  • D an exosome that presents a complex of the peptide according
  • Use of two active ingredients: (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; (D) an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (e) any one of [1] to [4] CTL targeting the peptide according to one item.
  • APC antigen-presenting cell
  • D an exo
  • a method for inducing cytotoxic activity against cells expressing VEGFR2 comprising the step of administering to a subject a composition comprising at least one active ingredient selected from the group consisting of the following (a) to (e): : (A) one or more peptides according to any one of [1] to [4]; (B) one or a plurality of polynucleotides encoding the peptide of any one of [1] to [4] in a form capable of being expressed; (C) an antigen-presenting cell (APC) that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; (D) an exosome that presents a complex of the peptide according to any one of [1] to [4] and an HLA antigen on its cell surface; and (e) any one of [1] to [4] CTL targeting the peptide according to one item.
  • APC antigen-presenting cell
  • D an exosome that
  • Cell line HLA-A and HLA-B negative human B lymphoblastoid cell line C1R, and African green monkey kidney cell line COS7 were purchased from ATCC.
  • HLA-A * 1101 or HLA-A * 3303 Creating stably expressing stimulator cells with HLA-A * 1101 or HLA-A * 3303 the C1R stably expressing (C1R-A11 and C1R-A33) is Used as stimulator cells.
  • CDNA encoding the open reading frame of HLA-A * 1101 or HLA-A * 3303 was amplified by PCR and cloned into an expression vector.
  • C1R cells were transformed with the above expression vector using Neon transfection system (Invitorogen) and then selected for 2 weeks using G418 (Invitrogen). G418-selected cells were seeded into the wells of a 96-well plate containing a culture medium supplemented with G418. Expression of exogenous HLA-A * 1101 or HLA-A * 3303 in C1R cells was confirmed by flow cytometry analysis.
  • Tables 1 and 2 show the HLA-A11 binding 9mer peptide and 10mer peptide of VEGFR2 in descending order of binding affinity. A total of 86 peptides with potential HLA-A11 binding ability were selected.
  • Table 3 and Table 4 show the HLA-A33-binding 9mer peptide and 10mer peptide of VEGFR2 in descending order of binding affinity. A total of 51 peptides with potential HLA-A33 binding ability were selected.
  • CTL-derived monocyte-derived dendritic cells were used as antigen-presenting cells to induce cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to peptides presented on human leukocyte antigen (HLA).
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • HLA human leukocyte antigen
  • DCs were generated in vitro as described elsewhere (Nakahara S et al., Cancer Res 2003, 63 (14): 4112-8).
  • peripheral blood mononuclear cells isolated from healthy volunteers positive for HLA-A * 1101 or HLA-A * 3303
  • Ficoll-Paque plus (Pharmacia) solution were transformed into plastic tissue culture dishes (Becton Dickinson) and separated as monocyte fractions.
  • AIM-V medium Invitrogen
  • AS heat-inactivated autoserum
  • a population enriched for monocytes was cultured in the presence of 4 (R & D System). After 7 days of culture, cytokine-induced DCs were pulsed with 20 ⁇ g / ml of each synthetic peptide in AIM-V medium for 3 hours at 37 ° C. in the presence of 3 ⁇ g / ml ⁇ 2-microglobulin.
  • the generated cells appeared to express DC related molecules such as CD80, CD83, CD86, and HLA class II on their cell surface (data not shown).
  • DC related molecules such as CD80, CD83, CD86, and HLA class II on their cell surface (data not shown).
  • These peptide-pulsed DCs were then inactivated by X-ray irradiation (20 Gy) and mixed with autologous CD8 + T cells obtained by positive selection using CD8 Positive Isolation Kit (Dynal) at a ratio of 1:20 . These cultures were seeded in 48-well plates (Corning). Each well was filled with 1.5 x 10 4 peptide-pulsed DC, 3 x 10 5 CD8 + T cells and 10 ng / ml IL-7 (R & D System) in 0.5 ml AIM-V / 2% AS medium. ) Included.
  • IL-2 (CHIRON) was added to these cultures to a final concentration of 20 IU / ml.
  • T cells were further stimulated with peptide-pulsed autologous DCs.
  • DC was prepared each time by the same method as above.
  • CTL clones Dilution was carried out so that the number of CTL was 0.3, 1, and 3 / well in a 96 round bottom microtiter plate (Nalge Nunc International).
  • CTL was combined with two human B lymphoblastoid cell lines, 1 x 10 4 cells / well, 30 ng / ml anti-CD3 antibody, and 125 IU / ml IL-2 for a total of 150 ⁇ l / well of 5% AS
  • the cells were cultured in a containing AIM-V medium. Ten days later, 50 ⁇ l / well of IL-2 was added to the medium so that the final concentration of IL-2 reached 125 IU / ml.
  • an interferon (IFN) - ⁇ enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay and an IFN- ⁇ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were performed. Specifically, peptide-pulsed C1R-A11 or C1R-A33 (1 ⁇ 10 4 cells / well) was prepared as stimulating cells. Cultured cells in 48 well plates were used as responder cells. IFN- ⁇ ELISPOT and IFN- ⁇ ELISA assays were performed according to the manufacturer's procedures.
  • VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) (c) , VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f ), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: 27) ( i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (SEQ ID NO: 41) (L), VEGFR2-A11-10-308 (SEQ
  • VEGFR2-A11-9-319 (SEQ ID NO: 1) (a), VEGFR2-A11-9-863 (SEQ ID NO: 2) (b), VEGFR2-A11-9-521 (SEQ ID NO: 3) (c) , VEGFR2-A11-9-973 (SEQ ID NO: 4) (d), VEGFR2-A11-9-309 (SEQ ID NO: 5) (e), VEGFR2-A11-9-860 (SEQ ID NO: 9) (f ), VEGFR2-A11-9-134 (SEQ ID NO: 15) (g), VEGFR2-A11-9-195 (SEQ ID NO: 26) (h), VEGFR2-A11-9-502 (SEQ ID NO: 27) ( i), VEGFR2-A11-9-1281 (SEQ ID NO: 39) (j), VEGFR2-A11-10-576 (SEQ ID NO: 40) (k), VEGFR2-A11-10-397 (SEQ ID NO: 41) (L), VEGFR2-A11-10-308 (SEQ
  • VEGFR2-A33-9-823 (SEQ ID NO: 87) (a), VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (b), VEGFR2-A33-9-214 (SEQ ID NO: 90) (c) , VEGFR2-A33-9-577 (SEQ ID NO: 21) (d), VEGFR2-A33-10-213 (SEQ ID NO: 104) (e), VEGFR2-A33-10-97 (SEQ ID NO: 83) (f ), VEGFR2-A33-10-576 (SEQ ID NO: 40) (g), VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70) (h) and VEGFR2-A33-10-1046 (SEQ ID NO: 114) ( The CTL line induced in i) showed strong IFN- ⁇ production against target cells pulsed with the corresponding peptide compared to target cells not pulsed with the peptide (FIG.
  • VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (a), VEGFR2-A33-9-214 (SEQ ID NO: 90) (b), VEGFR2-A33-9-577 (SEQ ID NO: 21) (c) , VEGFR2-A33-10-213 (SEQ ID NO: 104) (d), VEGFR2-A33-10-97 (SEQ ID NO: 83) (e), VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70) (f ) And VEGFR2-A33-10-1046 (SEQ ID NO: 114) (g) stimulated strong IFN- ⁇ production from CTL clones (FIG. 6).
  • VEGFR2-A11-9-319 SEQ ID NO: 1
  • VEGFR2-A11-10-159 SEQ ID NO: 43
  • HLA-A * 1101 Showed strong CTL activity against COS7 cells expressing both.
  • no significant specific CTL activity was detected with respect to the control cells (FIG. 7).
  • VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) (a) and VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70) (b) are expressed in COS7 cells expressing both VEGFR2 and HLA-A * 3303 On the other hand, it showed strong CTL activity. On the other hand, no significant specific CTL activity was detected with respect to the control cells (FIG. 8).
  • VEGFR2-A33-9-114 (SEQ ID NO: 89) and VEGFR2-A33-10-113 (SEQ ID NO: 70) are peptides generated by endogenous processing of VEGFR2 and HLA-A * It is clearly demonstrated that it is presented on target cells with the 3303 molecule and recognized by CTL.
  • the present invention can induce a strong and specific immune response against vascular endothelial cells at a disease site with abnormal angiogenesis, and has applicability to a wide variety of diseases mediated by angiogenesis. Obtained is a novel peptide derived from VEGFR2.
  • Such peptides may be useful as peptide vaccines against diseases mediated by angiogenesis associated with VEGFR2, and examples of such diseases include various cancers, diseases associated with angiogenesis in the choroid (neovascular Macular dysfunction: age-related macular degeneration, myopic macular degeneration, retinitis pigmentosa, central exudative retina choroidopathy, various retinal pigment epitheliopathy, choroidal atrophy, choroideremia, choroidal osteoma, etc.), diabetes Include, but are not limited to, retinopathy, rheumatoid arthritis, psoriasis, and atherosclerosis.

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Abstract

本発明は、細胞障害性T細胞誘導能を有するVEGFR2由来のエピトープペプチドを提供する。本発明はまた、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ペプチドを提示する抗原提示細胞および該ペプチドを標的とする細胞障害性T細胞、ならびに該抗原提示細胞または該CTLを誘導する方法を提供する。本発明はさらに、これらを有効成分として含む組成物および薬学的組成物を提供する。さらに本発明は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、抗原提示細胞、細胞障害性T細胞、または本発明の薬学的組成物を用いて、血管新生により媒介される疾患を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防する方法を提供する。また血管新生により媒介される疾患の疾患部位における血管新生を阻害する方法を提供する。

Description

ＶＥＧＦＲ２由来ペプチドおよびそれを含むワクチン
　本発明は、血管新生の阻害ならびに血管新生により媒介される疾患の治療および予防に有効なペプチドに関する。本発明はまた、これらのペプチドを含む血管新生阻害剤ならびに血管新生により媒介される疾患の治療および／または予防のための薬学的組成物およびワクチンに関する。
　本出願は、２０１３年１２月６日に出願された日本特許出願（特願２０１３－２５３０００）の恩典を主張し、その全内容が参照によって本明細書に組み入れられる。
　腫瘍増殖は一般に、血管が新生される血液供給がない場合は1～2mm3に制限されており、血管形成は、腫瘍の浸潤、増殖、および転移において重大な役割を有している（非特許文献1-4）。腫瘍血管形成の阻害が、腫瘍進行の抑制に関連していることも示されている。血管形成の抑制を達成するため、多数の研究者が、血管形成の過程の調節において重大な役割を果たしている血管内皮増殖因子（VEGF）およびVEGF受容体（VEGFR）を標的とした治療戦略を調査してきた。これらの研究は、モノクローナル抗体、組換え受容体、またはシグナル伝達の阻害剤を使用して、インビトロまたはインビボで、腫瘍増殖が成功裡に抑制され得ることを示した（非特許文献5-10）。しかしながら、これらの戦略は、比較的高い用量レベルで高頻度にまたは連続的に試薬を投与することを必要とし、これは、かなりの不便さおよび副作用に関連し得る。
　VEGFは、腫瘍組織内の内皮細胞に強発現するが、正常組織においてはそうではない2つの関連するチロシンキナーゼ受容体である、VEGFR1（Flt-1）およびVEGFR2（KDR）に結合する（非特許文献11-14）。VEGFR1は、最初に同定されたVEGF受容体であり（非特許文献15）、VEGF（VEGF-A）、ならびにVEGFファミリーの他の2つのメンバーである、VEGF-B（非特許文献16）および胎盤増殖因子（PlGF）（非特許文献17）と相互作用する。PlGFは、VEGFR1からVEGFを移動させることにより、より多くのVEGFがVEGFR2に結合してVEGFR2を活性化できるようにし、それによりVEGFにより駆動される血管形成を増強すると予想されている（非特許文献18）。その他の研究は、PlGF-/-マウスにおける腫瘍形成障害および血管漏出により証明されるように、特に病理学的状況においては、インビボのVEGFとPlGFとの間に相乗作用が存在することを示している（非特許文献19）。
　また、VEGFのこの2種類の受容体は、ヒト脈絡膜血管新生（CNV）膜においても発現する。しかしながら、CNVにおけるVEGFR1シグナル伝達経路の役割については、依然として議論の余地がある。例えばある研究では、抗体の経口投与、遺伝子ノックダウン、またはsiRNAによるVEGFR1シグナル伝達の阻害により、CNVが阻害されると報告している。別の研究では、眼内において、VEGF、またはVEGFR2のリガンドである胎盤増殖因子1（PIGF1）によるVEGFR1の活性化により、SPARCによるVEGFR2の活性化を介してCNVが活性化されると報告している。一方でVEGFR2については、VEGFR2シグナル伝達の活性化によりCNV増殖が促進されるという知見が一般に受け入れられている。
最近では、細胞傷害性T細胞（CTL）誘導能を有するVEGFR1またはVEGFR2由来のHLA-A2またはHLA-A24拘束性のペプチド断片が同定されており、これらのペプチドが血管新生阻害効果を有することが報告されている（特許文献1-2、非特許文献20）。また、これらのペプチドが、腫瘍（非特許文献21）や黄班変性症（特許文献3-4）などの血管新生によって媒介される疾患の治療に有効であることも報告されている。
WO2004/024766 WO2006/093030 WO2008/099908 WO2010/143435
Folkman,J.(2002)Semin.Oncol.29:15-8, Kerbel and Folkma,(2002).Nature Rev.Cancer.2:727-39 Brown et al.,(1995)Hum.Pathol.26:86-915 Eberhard et al.,(2000)Cancer Res.60:1388-93） El-Mousawi et al.,(2003)J.Biol.Chem.278:46681-91 Stefanik et al.,(2001)J.Neurooncol.55:91-100 Wood et al.,(2000)Cancer Res.60:2178-89 Luttun et al.,(2002)Nat.Med.8:831-40 Lyden et al.,(2001)Nat.Med.7:1194-201 Lu et al.,(2001)Cancer Res.61:7002-8 Risau,W.(1997)Nature.386:671-4 Ferrara and Davis-Smyth,(1997)Endor.Rev.18:4-25 Shibuya et al.,(1999)Curr.Topics.Microbiol.Immunol.237:59-83 Plate et al.,(1994)Int.J.Cancer.59:520-9 Shibuya et al.,(1990)Oncogene 5:519-24 Olofsson et al.,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2576-81 Maglione et al.,1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9267-71 Park et al.,(1994)J.Biol.Chem.269:25646-54 Carmeliet et al.,(2001)Nat.Med.7:575-83 Wada et al.,(2005) Cancer Res. 65(11):4939-46 Ogawa et al.,(2010) Biotherapy 24(2):129-37
　本発明は、VEGFR2を発現する細胞に対して特異的な細胞傷害性T細胞（CTL）を誘導し得るペプチドに関する。これらのペプチドが、ヒト白血球抗原（HLA）によって抗原提示細胞（APC）上に提示されると、VEGFR2発現細胞に特異的な細胞傷害活性を示すCTLが誘導される。これまでに同定されているVEGFR2由来のCTL誘導能を有するペプチドは、HLA-A2またはHLA-A24拘束性のペプチドであり、これらのHLAを発現していない細胞に対しては、CTLを誘導することができない。そのため、これらのHLAを有さない対象において免疫療法を行う場合には、従来のペプチドは適さない。HLA-A11およびHLA-A33は、アジア人の中でよく見られるアリルであるが（Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50:201-12）、HLA-A11またはHLA-A33陽性の対象に対しては、HLA-A11またはHLA-A33拘束性のペプチドを投与することが望まれる。よって、本発明は、HLA-A11またはHLA-A33拘束性のVEGFR2由来ペプチドであって、CTL誘導能を有するペプチドに関する。本明細書に開示された結果から、本発明のペプチドが、VEGFR2を発現する細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るHLA-A11またはHLA-A33拘束性エピトープペプチドであることが実証される。
　したがって、HLA-A11またはHLA-A33拘束性の様式で、CTLを誘導し得るVEGFR2由来のペプチドを提供することは、本発明の1つの目的である。これらのペプチドは、CTLをインビトロ、エクスビボまたはインビボで誘導するために用いることができ、または、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導する目的で対象に投与するために用いることができる。好ましいペプチドは配列番号：1、43、70および89の中より選択されるアミノ酸配列を含むものであり、より好ましくはノナペプチドまたはデカペプチドであり、さらに好ましくは、配列番号：1、43、70および89の中より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
　本発明のペプチドは、結果として生じた改変ペプチドが元のペプチドのCTL誘導能を保持する限り、1個、2個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているペプチドも包含する。
　本発明はまた、本発明のペプチドのいずれか1つをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、本発明のペプチドと同様に、CTL誘導能を有するAPCを誘導するために用いることができ、またはVEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導するために対象に投与することができる。
　本発明はまた、本発明の1種類もしくは複数種のペプチドまたは本発明の1種類もしくは複数種のペプチドをコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む剤または組成物を提供する。本発明の剤または組成物は好ましくは薬学的な剤または組成物である。対象に投与した場合、本発明のペプチドは、APCの表面上に提示され、それにより該ペプチドを標的とするCTLが誘導される。したがって、CTLを誘導する組成物であって、本発明の1種類もしくは複数種のペプチドまたは本発明の1種類もしくは複数種のペプチドをコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む組成物を提供することは、本発明のさらなる目的である。本発明はさらに、血管新生により媒介される疾患の治療および／または予防、ならびに術後のその再発の予防のために製剤化された、本発明の1種類もしくは複数種のペプチドまたは本発明の1種類もしくは複数種のペプチドをコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を提供する。
　CTL誘導能を有するAPCを誘導する方法であって、APCを本発明の1種類もしくは複数種のペプチドと接触させる段階、または本発明のペプチドのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階を含む方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
　本発明はまた、CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCと共培養する段階、CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、または細胞表面上にHLA抗原により提示された本発明のペプチドに結合し得るT細胞受容体（TCR）の各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むベクターをCD8陽性T細胞に導入する段階を含む、CTLを誘導する方法を提供する。
　HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する単離されたAPCを提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明はさらに、本発明のペプチドを標的とする単離されたCTLを提供する。これらのAPCおよびCTLは、血管新生により媒介される疾患に対する免疫療法に用いることができる。
　対象においてVEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ペプチドを提示するエキソソームまたはAPCおよび該ペプチドを自身の表面上に提示する細胞を認識することができるCTLの中より選択される少なくとも1つの成分を含む組成物を該対象に投与する段階を含む方法を提供することは、本発明の別の目的である。
　上記に加え、本発明の他の目的および特徴は、添付の図表および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになる。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図表、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
図1は、VEGFR2由来のペプチドを用いて誘導したCTLにおけるIFN-γ ELISPOTアッセイの結果を示す写真（a）および（b）から構成される。対照と比較して強力なIFN-γ産生を示した陽性データの典型例を（a）に示す。特異的なIFN-γ産生を示さなかった陰性データの典型例を（b）に示す。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。
図2は、VEGFR2由来のペプチドを用いて誘導したCTLにおけるIFN-γ ELISPOTアッセイの結果を示す写真（a）および（b）から構成される。対照と比較して強力なIFN-γ産生を示した陽性データの典型例を（a）に示す。特異的なIFN-γ産生を示さなかった陰性データの典型例を（b）に示す。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。
図3は、VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）、VEGFR2-A11-10-278（配列番号：44）（o）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（p）で刺激したCTL株のIFN-γ産生を順に実証するIFN-γ ELISAアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（a）～（p）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTL株が、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。 図3は、VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）、VEGFR2-A11-10-278（配列番号：44）（o）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（p）で刺激したCTL株のIFN-γ産生を順に実証するIFN-γ ELISAアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（a）～（p）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTL株が、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。 図3は、VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）、VEGFR2-A11-10-278（配列番号：44）（o）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（p）で刺激したCTL株のIFN-γ産生を順に実証するIFN-γ ELISAアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（a）～（p）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTL株が、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。
図4は、VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（o）で刺激したCTL株から限界希釈によって樹立されたCTLクローンのIFN-γ産生を示す一連の折れ線グラフ（a）～（o）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTLクローンが、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。 図4は、VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（o）で刺激したCTL株から限界希釈によって樹立されたCTLクローンのIFN-γ産生を示す一連の折れ線グラフ（a）～（o）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTLクローンが、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。 図4は、VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（o）で刺激したCTL株から限界希釈によって樹立されたCTLクローンのIFN-γ産生を示す一連の折れ線グラフ（a）～（o）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTLクローンが、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。
図5は、VEGFR2-A33-9-823（配列番号：87）（a）、VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（b）、VEGFR2-A33-9-214（配列番号：90）（c）、VEGFR2-A33-9-577（配列番号：21）（d）、VEGFR2-A33-10-213（配列番号：104）（e）、VEGFR2-A33-10-97（配列番号：83）（f）、VEGFR2-A33-10-576（配列番号：40）（g）、VEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（h）およびVEGFR2-A33-10-1046（配列番号：114）（i）で刺激したCTL株のIFN-γ産生を順に実証するIFN-γ ELISAアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（a）～（i）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTL株が、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。 図5は、VEGFR2-A33-9-823（配列番号：87）（a）、VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（b）、VEGFR2-A33-9-214（配列番号：90）（c）、VEGFR2-A33-9-577（配列番号：21）（d）、VEGFR2-A33-10-213（配列番号：104）（e）、VEGFR2-A33-10-97（配列番号：83）（f）、VEGFR2-A33-10-576（配列番号：40）（g）、VEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（h）およびVEGFR2-A33-10-1046（配列番号：114）（i）で刺激したCTL株のIFN-γ産生を順に実証するIFN-γ ELISAアッセイの結果を示す一連の折れ線グラフ（a）～（i）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTL株が、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。
図6は、VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（a）、VEGFR2-A33-9-214（配列番号：90）（b）、VEGFR2-A33-9-577（配列番号：21）（c）、VEGFR2-A33-10-213（配列番号：104）（d）、VEGFR2-A33-10-97（配列番号：83）（e）、VEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（f）およびVEGFR2-A33-10-1046（配列番号：114）（g）で刺激したCTL株から限界希釈によって樹立されたCTLクローンのIFN-γ産生を示す一連の折れ線グラフ（a）～（g）から構成される。これらの結果は、各ペプチドによる刺激によって樹立されたCTLクローンが、対照と比較して強力なIFN-γ産生を示すことを実証している。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するIFN-γ産生を示し、「－」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するIFN-γ産生を示す。
図7は、VEGFR2およびHLA-A*1101を発現する標的細胞に対する特異的CTL活性を示す一連の折れ線グラフ（a）～（c）から構成される。HLA-A*1101または全長VEGFR2遺伝子をトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）およびVEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（b）を用いて樹立されたCTL株またはCTLクローンは、VEGFR2およびHLA-A*1101の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞に対して特異的CTL活性を示した（黒菱形）。一方、HLA-A*1101（三角）またはVEGFR2（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的CTL活性は検出されなかった。陰性データの典型的な例であるが、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）を用いて樹立されたCTLクローンは、特異的CTL活性を示さなかった（c）。 図7は、VEGFR2およびHLA-A*1101を発現する標的細胞に対する特異的CTL活性を示す一連の折れ線グラフ（a）～（c）から構成される。HLA-A*1101または全長VEGFR2遺伝子をトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）およびVEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（b）を用いて樹立されたCTL株またはCTLクローンは、VEGFR2およびHLA-A*1101の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞に対して特異的CTL活性を示した（黒菱形）。一方、HLA-A*1101（三角）またはVEGFR2（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的CTL活性は検出されなかった。陰性データの典型的な例であるが、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）を用いて樹立されたCTLクローンは、特異的CTL活性を示さなかった（c）。
図8は、VEGFR2およびHLA-A*3303を発現する標的細胞に対する特異的CTL活性を示す一連の折れ線グラフ（a）～（c）から構成される。HLA-A*3303または全長VEGFR2遺伝子をトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（a）およびVEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（b）を用いて樹立されたCTL株またはCTLクローンは、VEGFR2およびHLA-A*3303の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞に対して特異的CTL活性を示した（黒菱形）。一方、HLA-A*3303（三角）またはVEGFR2（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的CTL活性は検出されなかった。対照的に、陰性データの典型的な例であるが、VEGFR2-A33-9-577（配列番号：21）を用いて樹立されたCTLクローンは、特異的CTL活性を示さなかった（c）。 図8は、VEGFR2およびHLA-A*3303を発現する標的細胞に対する特異的CTL活性を示す一連の折れ線グラフ（a）～（c）から構成される。HLA-A*3303または全長VEGFR2遺伝子をトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（a）およびVEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（b）を用いて樹立されたCTL株またはCTLクローンは、VEGFR2およびHLA-A*3303の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞に対して特異的CTL活性を示した（黒菱形）。一方、HLA-A*3303（三角）またはVEGFR2（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して、有意な特異的CTL活性は検出されなかった。対照的に、陰性データの典型的な例であるが、VEGFR2-A33-9-577（配列番号：21）を用いて樹立されたCTLクローンは、特異的CTL活性を示さなかった（c）。
　本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
Ｉ．定義
　本明細書で用いる「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも１つ」を意味する。
　物質（例えば、ペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して用いる「単離された」および「精製された」という用語は、該物質がそうでなければ天然源中に含まれ得る少なくとも1種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製されたペプチドは、細胞材料、例えば糖質、脂質、またはペプチドが由来する細胞もしくは組織源からの他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合には化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないペプチドを指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語は、それが単離された細胞または組換え産生された細胞の細胞成分から、ペプチドが分離されたペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないペプチドは、約30%、20%、10%または5%（乾燥重量ベース）未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）を有するペプチドの調製物を含む。ペプチドを組換え産生する場合、ペプチドは、好ましくは培養培地も実質的に含まず、培養培地をペプチド調製物の容量の約20%、10%、または5%未満で有するペプチドの調製物を含む。ペプチドを化学合成によって生成する場合、ペプチドは、好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、ペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容量の約30%、20%、10%、5%（乾燥重量ベース）未満で有するペプチドの調製物を含む。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含むことは、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の単一バンドの出現によって示すことができる。好ましい態様では、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは単離または精製されている。
　「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、1個もしくは複数個のアミノ酸残基が修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマー、および天然アミノ酸ポリマーに適用される。
　本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたR基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
　アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）の推奨する、一般に公知の3文字表記または1文字表記により参照されてもよい。
　「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、一般に受け入れられている1文字コードにより参照される。
　「剤」および「組成物」という用語は本明細書では互換的に用いられ、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに、特定量の特定成分の組合せから直接的または間接的に生じる任意の生成物を指す。そのような用語は、（「薬学的な剤」および「薬学的組成物」の場合のように）「薬学的（な）」という修飾語に関連して使用されるとき、有効成分と、担体を構成する不活性成分とを含む生成物、ならびに、任意の２つもしくはそれ以上の成分の組合せ、複合体化または凝集から、あるいは、１つもしくは複数の成分の解離から、あるいは、１つもしくは複数の成分の他の種類の反応または相互作用から直接的または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明との関連において、「薬学的な剤」および「薬学的組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と、薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の生成物を指す。
　本明細書で使用する「組成物」という用語は、特定量の特定成分を含む生成物、および特定量の特定成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。薬学的組成物に関するそのような用語は、有効成分と担体を構成する不活性成分とを含む生成物、ならびに任意の2つもしくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、もしくは凝集から、1つもしくは複数の成分の解離から、または1つもしくは複数の成分の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図される。したがって、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物または細胞と薬学的または生理学的に許容される担体とを混合することにより作製される任意の組成物を包含する。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒および封入材料を含むがこれらに限定されない、薬学的または生理学的に許容される材料、組成物、物質、または媒体を意味する。
　特記しない限り、「血管新生により媒介される疾患」という用語は、疾患の発生および／または進行に血管新生が関与する疾患を指し、その例としては、各種がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症：加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫など）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、およびアテローム性動脈硬化などが含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、VEGFR2遺伝子の発現が関与する血管新生により媒介される疾患を指す。これらの疾患の疾患部位では、血管内皮細胞において、VEGFR2遺伝子が発現されている。
　特記しない限り、「細胞傷害性Tリンパ球」、「細胞傷害性T細胞」、および「CTL」という用語は本明細書において互換的に用いられ、特に別段の定めのない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍／がん細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるTリンパ球の亜群を指す。
　特記しない限り、「HLA-A11」という用語は、HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104などのサブタイプを含むHLA-A11型を指す。
　特記しない限り、「HLA-A33」という用語は、HLA-A*3303、HLA-A*3301、HLA-A*3304などのサブタイプを含むHLA-A33型を指す。
　本発明の方法および組成物ががんなどの血管新生により媒介される疾患の「治療」との関連において有用である限り、治療が、対象において、VEGFR2遺伝子の発現の低下、血管新生の阻害または血管新生により媒介される疾患の症状の軽減などの臨床的利点をもたらす場合に、治療は「有効である」と見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効な」とは、治療によって、疾患への罹患が遅延するもしくは妨げられるか、または疾患の臨床症状が妨げられるもしくは緩和されることを意味する。有効性は、特定の疾患の種類を診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定される。本発明の方法および組成物が血管新生により媒介される疾患の「予防」との関連において有用である限り、「予防」という用語は本明細書において、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の働きを含む。予防は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベル」で行われ得る。第一次の予防は疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防は、疾患の進行および症状の出現を予防することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした働きを包含する。あるいは、予防は、特定の障害の重症度を緩和すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含み得る。
　本発明との関連において、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、がん細胞の外科的切除、がん細胞の増殖阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を緩和する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、10%、20%、30%、もしくはそれ以上の軽減もしくは症状が安定した状態を含む。
　別段の定めのない限り、本明細書で用いる「キット」という用語は、試薬と他の物質との組合せに関して用いられる。本明細書では、キットはマイクロアレイ、チップ、マーカーなどを含み得ることが企図される。「キット」という用語は、試薬および／または物質の特定の組合せに限定することを意図しない。
　本発明との関連において、「抗体」という用語は、指定のタンパク質またはそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射標識と融合させた抗体、および抗体断片が含まれ得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的にはインタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、2以上のインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM）を示す。
　特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている用語と同じ意味を有する。
ＩＩ．ペプチド
　HLA-A11およびHLA-A33は、アジア人の中でよく見られるアリルである（Sette A, Sidney J., Immunogenetics 1999, 50:201-12）。そのため、HLA-A11またはHLA-A33によって拘束されるVEGFR2由来のCTL誘導性ペプチドを提供することにより、多くのアジア人に、血管新生により媒介される疾患の有効な治療方法を提供することができる。よって、本発明は、HLA-A11またはHLA-A33拘束性の様式でCTLを誘導し得るVEGFR2由来のペプチドを提供する。
　本発明のペプチドは、HLA-A11またはHLA-A33拘束性の様式でCTLを誘導し得るVEGFR2由来のペプチドである。HLA-A11拘束性の様式でCTLを誘導し得るペプチドとしては、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。また、HLA-A33拘束性の様式でCTLを誘導し得るペプチドとしては、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
　これらのペプチドでパルスした樹状細胞（dendritic cell; DC）によるT細胞のインビトロでの刺激により、これらのペプチドに特異的な細胞傷害活性を有するCTLが樹立され得る。樹立されたCTLは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して特異的細胞傷害活性を示す。
　VEGFR2遺伝子は、血管新生により媒介される疾患において、疾患部位の血管内皮細胞で強発現しているが、ほとんどの正常器官では発現しないため、免疫療法のための優れた標的である。したがって本発明のペプチドは、血管新生により媒介される疾患の免疫療法のために好適に用いることができる。好ましいペプチドは、ノナペプチド（アミノ酸残基9個からなるペプチド）またはデカペプチド（アミノ酸残基10個からなるペプチド）であり、配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。例えば、配列番号：1または43に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、HLA-A11とVEGFR2とを発現する細胞に対して特異的な細胞傷害活性を示すCTLの誘導に適しており、HLA-A11陽性患者における血管新生により媒介される疾患の免疫療法のために好適に使用することができる。また、配列番号70または89に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、HLA-A33とVEGFR2とを発現する細胞に対して特異的な細胞傷害活性を示すCTLの誘導に適しており、HLA-A33陽性患者における血管新生により媒介される疾患の免疫療法のために好適に用いることができる。より好ましい態様では、本発明のペプチドは、配列番号：1、43、70および89の中から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
　本発明のペプチドは、結果として生じるペプチドが元のペプチドCTL誘導能を保持する限り、本発明のペプチドのアミノ酸配列に付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。付加的なアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのCTL誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。したがって本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中より選択されるアミノ酸配列を含む、CTL誘導能を有するペプチドを包含する。そのようなペプチドは、例えば約40アミノ酸未満であり、多くの場合には約20アミノ酸未満であり、通常は約15アミノ酸未満である。したがって、本発明のペプチドは、元のペプチドがノナペプチドであれば、当該ペプチドに付加的なアミノ酸を隣接させることによって生じる10アミノ酸長、または11～40アミノ酸長のペプチドを包含する。また、元のペプチドが、デカペプチドであれば、11～40アミノ酸長のペプチドを包含する。そのようなペプチドは、例えば、11～20アミノ酸長のペプチドであることができ、11～15アミノ酸長のペプチドであることができる。付加的なアミノ酸残基の好ましい例は、VEGFR2の全長アミノ酸配列において本発明のペプチのアミノ酸配列に隣接するアミノ酸残基である。したがって、本発明のペプチドは、VEGFR2由来のペプチドであって、配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中より選択されるアミノ酸配列を含む、CTL誘導能を有するペプチドを包含する。
　一般的に、あるペプチド中の1個、2個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のペプチドの所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、1個、2個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、欠失、挿入および／または付加された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。したがって、一態様において、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中より選択されるアミノ酸配列において1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつCTL誘導能を有するペプチドであり得る。
　当業者は、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向がある、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の置換を認識することができる。したがって、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質の類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存するのが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；ヒドロキシル基含有側鎖（S、T、Y）；硫黄原子含有側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（D、N、E、Q）；塩基含有側鎖（R、K、H）；ならびに芳香族含有側鎖（H、F、Y、W）。加えて、以下の8群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められているアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、スレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）（例えば、Creighton， Proteins 1984を参照されたい）。
　このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドに包含される。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、改変ペプチドが元のペプチドのCTL誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、VEGFR2の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子由来のCTL誘導可能なペプチドを排除しない。
　元のペプチドのCTL誘導能を保持する限り、少数の（例えば、1個、2個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（すなわち、置換、欠失、挿入および／または付加する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、5個またはそれ未満のアミノ酸、例えば4個もしくは3個またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは20%もしくはそれ未満、より好ましくは15%もしくはそれ未満、さらにより好ましくは10%もしくはそれ未満、または1～5%である。
　免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはHLA抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、本発明のペプチドは、HLA抗原に対する高い結合親和性を有することが好ましい。そのため、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドを得てもよい。HLA抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302.）、そのような規則性に基づいた改変を本発明のペプチドに導入することができる。
　例えば、HLA Class Iに対する結合性を有するペプチドでは、一般に、N末端から2番目のアミノ酸およびC末端のアミノ酸がHLA Class Iへの結合に関与するアンカー残基であることが多い（Rammensee HG, et al., Immunogenetics. 1995;41(4):178-228.）。例えば、HLA-A11では、N末端から2番目のアミノ酸としてスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンが、C末端のアミノ酸としてリジンおよびアルギニンが、HLA-A11に対する結合親和性が高いアンカー残基として知られている（Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9）。さらに、HLA-A11では、N末端から3番目および7番目の位置に補助的なアンカー残基を有し、N末端から3番目のアミノ酸としてはロイシン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、およびアラニンが好ましく、N末端から7番目のアミノ酸としてはロイシン、イソロイシン、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンが好ましいことが知られている（Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Chujoh, et al., Tissue Antigens 1998: 52: 501-9）。
　そのため、HLA-A11結合親和性を維持あるいは増大させるためには、N末端から2番目のアミノ酸をスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換すること、および／またはC末端のアミノ酸をリジンもしくはアルギニンで置換することが望ましい可能性がある。さらに、N末端から3番目のアミノ酸をロイシン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、もしくはアラニンで置換すること、および／またはN末端から7番目のアミノ酸をロイシン、イソロイシン、チロシン、バリンもしくはフェニルアラニンで置換することも望ましい可能性がある。したがって、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から2番目のアミノ酸がスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている、N末端から3番目のアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アラニンで置換されている、N末端から7番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、チロシン、バリンもしくはフェニルアラニンで置換されている、および／またはC末端のアミノ酸がリジンもしくはアルギニンで置換されている、アミノ酸配列を含むCTL誘導能を有するペプチドは、本発明のペプチドに包含される。
　好ましい態様では、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、N末端から2番目のアミノ酸がスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている、N末端から3番目のアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンもしくはアラニンで置換されている、N末端から7番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、チロシン、バリンもしくはフェニルアラニンで置換されている、および／またはC末端のアミノ酸がリジンもしくはアルギニンで置換されている、アミノ酸配列からなるCTL誘導能を有するペプチドであり得る。すなわち、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、以下の（a）～（d）の中より選択される1以上の置換を有するアミノ酸配列を含む、CTL誘導能を有するペプチドを包含する：
（a）N末端から2番目のアミノ酸がスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンで置換されている；
（b）N末端から3番目のアミノ酸がロイシン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンまたはアラニンで置換されている；
（c）N末端から7番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシン、チロシン、バリンまたはフェニルアラニンで置換されている；および
（d）C末端のアミノ酸がリジンまたはアルギニンで置換されている。
　好ましい態様では、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、上記（a）～（d）の中より選択される1以上の置換を有するアミノ酸配列からなる、CTL誘導能を有するペプチドであり得る。本発明において、好ましい置換の数は、前記（a）～（d）から選択される1個、2個、3個あるいは4個の置換である。
　また、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、N末端から2番目のアミノ酸がスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている、および／またはC末端のアミノ酸がリジンもしくはアルギニンで置換されている、アミノ酸配列を含むCTL誘導能を有するペプチドであり得る。好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、N末端から2番目のアミノ酸がスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンもしくはチロシンで置換されている、および／またはC末端のアミノ酸がリジンもしくはアルギニンで置換されている、アミノ酸配列からなるCTL誘導能を有するペプチドであり得る。すなわち、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、以下の（a）および（b）の中より選択される1以上の置換を有するアミノ酸配列を含む、CTL誘導能を有するペプチドであり得る：
（a）N末端から2番目のアミノ酸がスレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンで置換されている；および
（b）C末端のアミノ酸がリジンまたはアルギニンで置換されている。
　好ましい態様では、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列において、上記（a）～（b）の中より選択される1以上の置換を有するアミノ酸配列からなる、CTL誘導能を有するペプチドであり得る。より好ましい態様では、N末端から2番目のアミノ酸はスレオニン、バリン、イソロイシンまたはロイシンで置換されている。
　また、例えば、HLA-A33では、N末端から2番目のアミノ酸としてフェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンが、C末端のアミノ酸としてアルギニンおよびリジンが、HLA-A33に対する結合親和性が高いアンカー残基として知られている（Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302.）。さらに、HLA-A33では、N末端から1番目のアミノ酸残基もアンカー残基として機能することが知られており、N末端から1番目のアミノ酸としてアスパラギン酸およびグルタミン酸が好ましいことが知られている（Falk, et al., Immunogenetics 1994 40 232-41; Takiguchi, et al., Tissue Antigens 2000: 55: 296-302.）。
　そのため、HLA-A33結合親和性を維持あるいは増大させるためには、N末端から1番目のアミノ酸をアスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換すること、N末端から2番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシンもしくはバリンで置換すること、および／またはC末端のアミノ酸をアルギニンもしくはリジンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列において、N末端から1番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換されている、N末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシンもしくはバリンで置換されている、および／またはC末端のアミノ酸がアルギニンもしくはリジンで置換されている、アミノ酸配列を含むCTL誘導能を有するペプチドは、本発明のペプチドに包含される。
　好ましい態様では、本発明のペプチドは、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から1番目のアミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換されている、N末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシンもしくはバリンで置換されている、および／またはC末端のアミノ酸がアルギニンもしくはリジンで置換されている、アミノ酸配列からなるCTL誘導能を有するペプチドであり得る。すなわち、本発明のペプチドは、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列において、以下の（a）～（c）の中より選択される1以上の置換を有するアミノ酸配列を含む、CTL誘導能を有するペプチドを包含する：
（a）N末端から1番目のアミノ酸がアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されている；
（b）N末端から2番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリンで置換されている；および
（c）C末端のアミノ酸がアルギニンまたはリジンで置換されている。
　好ましい態様では、本発明のペプチドは、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列において、上記（a）～（c）の中より選択される1以上の置換を有するアミノ酸配列からなる、CTL誘導能を有するペプチドであり得る。本発明において、好ましい置換の数は、前記（a）～（c）から選択される1個、2個あるいは3個の置換である。より好ましい態様では、N末端から2番目のアミノ酸はフェニルアラニンまたはチロシンで置換されている。
　末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（TCR）認識部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばCAP1、p53（264-272）、Her-2／neu（369-377）、またはgp100（209-217）など、アミノ酸置換を有するペプチドが元のペプチドと同等の活性を有するかまたはより優れた活性を有し得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-7, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-14）。
　本発明はまた、本発明のペプチド（例えば、配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド）のN末端および／またはC末端に、1個、2個、または数個のアミノ酸を付加することができることを企図する。CTL誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に含まれる。例えば、配列番号1、43、70または89に記載のアミノ酸配列からなるペプチドのN末端および／またはC末端に1個、2個、または数個のアミノ酸が付加されたペプチドは、APCに接触させると、APC内に取り込まれてプロセッシングを受け、配列番号1、43、70または89に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとなる。その後、抗原提示経路を経て、APCの細胞表面に提示さることにより、CTLを誘導し得る。
　しかしながら、ペプチドのアミノ酸配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。したがって、ペプチドのアミノ酸配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して1個または2個のアミノ酸が異なるペプチドさえも存在しないことが明らかになった場合には、そのような副作用の危険を伴うことなしに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのCTL誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
　本発明のペプチドの1個、2個、または数個のアミノ酸が改変されたペプチドは、元のペプチドのCTL誘導能を保持し得ると予測されるが、改変ペプチドに関してCTL誘導能を確認することが好ましい。本明細書において「CTL誘導能を有するペプチド」とは、そのペプチドで刺激されたAPCによって、CTLが誘導されるペプチドを指す。「CTLの誘導」には、CTL活性化の誘導、CTL増殖の誘導、CTLによる標的細胞の溶解の誘導、およびCTLのIFN-γ産生増加の誘導が含まれる。
　CTL誘導能の確認は、HLA抗原を保有するAPC（例えば、Bリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（DC））を誘導し、ペプチドで刺激した後、CD8陽性T細胞と混合し、その後、標的細胞に対してCTLによって放出されたIFN-γを測定することにより行うことができる。APCは、好ましくは、ヒト末梢血単核白血球由来のDCを使用することができる。反応系として、HLA抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることもできる。また、例えば、標的細胞を51Cr等で放射標識し、標的細胞から放出された放射活性からペプチドで誘導されたCTLの細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、ペプチドで刺激したAPCの存在下で、CTLによって産生および放出されたIFN-γを測定し、抗IFN-γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって、CTL誘導能を評価することができる。
　上記の改変に加えて、本発明のペプチドは、結果として生じる連結ペプチドがCTL誘導能を保持する限り、他のペプチドに連結させることもできる。本発明のペプチドと連結させる適切なペプチドの例としては、腫瘍関連抗原（TAA）に由来するCTL誘導性ペプチドが挙げられる。また、本発明のペプチド同士を連結させることもできる。ペプチド間の連結に使用できる適切なリンカーは当技術分野で公知であり、例えばAAY（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、AAA、NKRK（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-15）、またはK（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-6、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-15）のようなリンカーを使用することができる。ペプチドは、様々な配置（例えば、連鎖状、重複など）で連結することができ、3つ以上のペプチドを連結することもできる。
　本発明のペプチドはまた、結果として生じる連結ペプチドがCTL誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。本発明のペプチドと連結させる適切な物質の例としては、例えば、ペプチド、脂質、糖もしくは糖鎖、アセチル基、および天然もしくは合成のポリマー等が挙げられる。本発明のペプチドは、CTL誘導能が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を行うこともできる。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはペプチドを安定化することができる。
　例えば、ペプチドのインビボ安定性を高めるために、D-アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念を本発明のペプチドに適合させることもできる。ペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生体媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
　さらに、上述したように、1個、2個、または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加された改変ペプチドの中から、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有するものをスクリーニングまたは選択することができる。したがって本発明はまた、元のものと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択する方法を提供する。具体的には、本発明は、CTL誘導能を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：
（a）配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列からなる元のアミノ酸配列に対して、1個、2個、または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる候補配列を作成する段階；
（b）（a）で作成した候補配列の中からVEGFR2以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物とも有意な相同性（配列同一性）を有さない候補配列を選択する段階；
（c）（b）で選択した候補配列からなるペプチドと、APCとを接触させる段階；
（d）（c）のAPCとCD8陽性T細胞とを接触させる段階；および
（e）元のアミノ酸配列からなるペプチドよりも同等かまたはより高いCTL誘導能を有するペプチドを選択する段階。
　本明細書において、本発明のペプチドはまた、「VEGFR2ペプチド」または「VEGFR2ポリペプチド」とも記載される。
ＩＩＩ．VEGFR2ペプチドの調製
　周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えDNA技術または化学合成を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または2つもしくはそれ以上のペプチドを含むより長いポリペプチドとして、合成することができる。組換えDNA技術を用いて宿主細胞内で産生させた後、または化学合成した後、宿主細胞または合成反応物から、本発明のペプチドを単離することができる。すなわち、他の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他のいかなる化学物質も実質的に含まないように、本発明のペプチドを精製または単離することができる。
　本発明のペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれない限り、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えば当該ペプチドの血清半減期を延長させるために用いることができる、D-アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。
　選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のような文献に記載の方法が含まれる：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）, 丸善, 1975；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）, 丸善, 1985；
（ｖ）「医薬品の開発」（日本語）, 続第１４巻（ペプチド合成）, 広川書店, 1991；
（ｖｉ）WO99／67288；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, Solid Phase Peptide Synthesis, Academic Press, New York, 1980, 100-18。
　あるいは、ペプチドを産生するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて、本発明のペプチドを得ることもできる（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu et al.) 1983, 101: 347-62）。例えば、最初に、本発明のペプチドを発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）コードするポリヌクレオチドを含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、本発明のペプチドを産生させる。あるいは、インビトロ翻訳系を用いて、本発明のペプチドをインビトロで作製することもできる。
ＩＶ．ポリヌクレオチド
　本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらには、天然VEGFR2遺伝子（例えば、GenBankアクセッション番号NM_002253.2（配列番号：122））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一の核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定される任意の位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを前記の対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸のあらゆる可能なサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、開示した各配列において非明示的に記載されている。
　本発明のポリヌクレオチドは、DNA、RNAおよびそれらの誘導体から構成され得る。DNAはA、T、CおよびGなどの塩基から適切に構成され、RNAではTはUに置き換えられる。
　本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
　組換え技法および化学合成技法のいずれを用いても、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクターに挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、PCR技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することもできる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311；Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されている固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することもできる。
Ｖ．エキソソーム
　本発明はさらに、本発明のペプチドとHLA抗原との間に形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞を提供する。エキソソームは、例えば特表平11-510507号およびWO99/03499に詳述されている方法を用いて調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたAPCを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
　前記複合体中に含まれるHLA抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えばアジア人集団では、HLA-A11（例えば、HLA-A*1101）およびHLA-A33（例えば、HLA-A*3303）は広く一般的に見られるアリルであり、これらのHLA抗原の型はアジア人患者の治療に適していると考えられる。典型的には、クリニックにおいて、治療を必要とする患者のHLA抗原の型を予め調べることにより、特定のHLA抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または特定のHLA抗原を介した抗原提示によるCTL誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。
　本発明のエキソソームは、本発明のペプチドとHLA-A11またはHLA-A33との複合体をその表面上に提示する。本発明のペプチドと複合体を形成するHLAがHLA-A11である場合、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27、および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドであることが好ましく、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその改変ペプチドであることがより好ましい。あるいは、本発明のペプチドと複合体を形成するHLAがHLA-A33である場合、本発明のペプチドは、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドであることが好ましく、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ配列からなるペプチドまたはその改変ペプチドであることがより好ましい。
ＶＩ．抗原提示細胞（APC）
　本発明はまた、HLA抗原と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞（APC）を提供する。あるいは、本発明は、HLA抗原と本発明のペプチドとの間に形成された複合体をその細胞表面上に有するAPCを提供する。本発明のAPCは、単離されたAPCであり得る。細胞（APC、CTL等）に関して用いられる場合、「単離された」という用語は、該細胞が他の種類の細胞から分離されていることを指す。本発明のAPCは、治療および／または予防の対象となる患者に由来するAPCから誘導されたものであってもよく、かつ単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはCTLを含む他の薬物と併用して、ワクチンとして投与することができる。
　本発明のAPCは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られている樹状細胞（DC）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、B細胞、および活性化T細胞が含まれる。DCは、APCの中で最も強力なCTL誘導作用を有する代表的なAPCであるため、DCは本発明のAPCとして好ましく使用され得る。本発明において、好ましいDCは、ヒト由来の単離されたDC、あるいはそれらの混合物である。すなわち、異なるペプチドを抗原提示したDCを混合して用いることもできる。
　例えば、末梢血単球からDCを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドで刺激することによって、本発明のAPCを得ることができる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するAPCが該対象の体内で誘導される。したがって、本発明のAPCは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からAPCを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のAPCは、対象から回収されたAPCを本発明のペプチドと接触させることによって得ることもできる。
　対象において、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導するために、本発明のAPCを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはCTLを含む他の薬剤と併用して、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
a：第1の対象からAPCを回収する段階、
b：段階aのAPCをペプチドと接触させる段階、および
c：段階bのAPCを第2の対象に投与する段階。
　第1の対象と第2の対象は同一の個体であってもよく、または異なる個体であってもよい。第1の対象と第2の対象が異なる個体である場合、第1の対象と第2の対象のHLAは同一の型であることが好ましい。上記の段階bによって得られたAPCは、血管新生により媒介される疾患を治療および／または予防するためのワクチンとなり得る。
　上記のような方法によって得られた、本発明のAPCはCTL誘導能を有する。APCに関して用いられる「CTL誘導能」という用語は、CD8陽性T細胞と接触させたときに、CTLを誘導することができるAPCの能力を指す。さらに、「CTL誘導能」には、CTL活性化を誘導するAPCの能力、CTL増殖を誘導するAPCの能力、CTLによる標的細胞の溶解を促進するAPCの能力、および、CTLによるIFN-γ産生を増加させるAPCの能力が含まれる。本発明のAPCによって誘導されたCTLは、VEGFR2に特異的なCTLであり、VEGFR2発現細胞に対して特異的な細胞障害活性を示す。
　本発明のAPCは、上記の方法に加え、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでAPCに導入することによって調製することもできる。導入するポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAの形態であってよい。導入の方法の例には、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などの、当分野において従来より実施されている様々な方法が含まれる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7；J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第2000-509281号に記載されているような方法を用いることができる。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入することによって、該ポリヌクレオチドは細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、生じたペプチドはMHCクラスIによってプロセシングされて、提示経路を経て本発明のペプチドがAPCの細胞表面に提示される。
　好ましい態様において、本発明のAPCは、HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）またはHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）と本発明のペプチドとの間に形成される複合体を、自身の細胞表面上に提示しているAPCである。本発明のペプチドと複合体を形成するHLAがHLA-A11である場合、本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドであることが好ましく、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであることがより好ましい。また、本発明のペプチドと複合体を形成するHLAがHLA-A33である場合、本発明のペプチドは、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドであることが好ましく、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ配列からなるペプチドであることがより好ましい。
　また、本発明のAPCは、好ましくは、以下のaまたはbに記載される段階を含む方法によって誘導されるAPCである：
a：HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）またはHLA-33（より好ましくはHLA-A*3303）を発現しているAPCを本発明のペプチドと接触させる段階；
b：HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）またはHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）を発現しているAPCに、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。HLA-A11を発現しているAPCと接触させる本発明のペプチドは、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドであることが好ましく、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであることがより好ましい。また、HLA-A33を発現しているAPCと接触させる本発明のペプチドは、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドであることが好ましく、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ配列からなるペプチドであることがより好ましい。
　また、本発明によれば、CTL誘導能を有するAPCを誘導する薬学的組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、CTL誘導能を有するAPCを誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供する。さらに、本発明はまた、CTL誘導能を有するAPCを誘導するための本発明のペプチドを提供する。
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）
　本発明のペプチドによって誘導されたCTLは、インビボでVEGFR2を発現する血管内皮細胞を標的とする免疫応答を増強するため、本発明のペプチドと同様にワクチンとして用いることができる。したがって本発明は、本発明のペプチドによって誘導または活性化された、CTLを提供する。本発明のCTLは、本発明のペプチドを標的とするCTLであり、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体に結合することができるCTLである。該複合体へのCTLの結合は、CTLの細胞表面上に存在するT細胞受容体（TCR）を介して行われる。本発明のCTLは、単離されたCTLであり得る。好ましいCTLは、ヒト由来の単離されたCTL、あるいはその混合物である。すなわち、異なるペプチドが抗原提示されたＨＬＡ複合体を認識するＣＴＬを混合して用いることもできる。
　本発明のCTLは、（１）本発明のペプチドを対象に投与すること、または（２）対象由来のAPC、およびCD8陽性T細胞、もしくは末梢血単核球をインビトロで本発明のペプチドで刺激すること、または（３）CD8陽性T細胞もしくは末梢血単核球を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCもしくはエキソソームとインビトロで接触させること、または（４）細胞表面上にHLA抗原により提示された本発明のペプチドに結合し得るT細胞受容体（TCR）の各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入することによって得ることができる。上記（２）または（３）の方法で使用されるエキソソームおよびAPCは、それぞれ「Ｖ．エキソソーム」および「ＶＩ．抗原提示細胞（APC）」の章に記載の方法によって調製することができ、上記（４）の方法の詳細は「ＶＩＩＩ．T細胞受容体（TCR）」の章において記載する。
　本発明のCTLは、治療および／または予防の対象となる患者に対して、単独で投与することができ、または効果を調節する目的で本発明のペプチド、APCもしくはエキソソームを含む他の薬物と併用して投与することができる。また、本発明のCTLは、該CTLの投与対象となる患者に由来するCD8陽性T細胞から誘導されたCTLであり得る。本発明のCTLは、本発明のペプチド、例えば本発明のCTLの誘導に用いたものと同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、腫瘍組織の内皮細胞のようにVEGFR2を内因的に発現する細胞、またはVEGFR2遺伝子をトランスフェクトした細胞であってよい。本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、本発明のCTLの攻撃の標的となり得る。また、本発明のCTLの標的細胞は、好ましくは、HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）陽性またはHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）陽性の細胞である。
　好ましい態様において、本発明のCTLは、HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）またはHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）とVEGFR2の両方を発現している細胞を特異的に標的とする。本明細書において、CTLが細胞を「標的とする」とは、HLAと本発明のペプチドとの複合体を細胞表面に提示している細胞をCTLが認識して、該細胞に対して細胞傷害活性を示すことをいう。また、「特異的に標的とする」とは、CTLが該細胞に対して細胞傷害活性を示すが、それ以外の細胞に対しては傷害活性を示さないことをいう。また、CTLとの関連では、「細胞を認識する」という用語は、細胞表面に提示されるHLAと本発明のペプチドとの複合体にそのTCRを介して結合し、該細胞に対して特異的な細胞傷害活性を示すことを指す。したがって、本発明のCTLは、好ましくは、細胞表面上に提示されたHLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）またはHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）と本発明のペプチドとの間に形成される複合体に、TCRを介して結合することができるCTLである。
　また、本発明のCTLは、好ましくは、以下のaまたはbに記載される段階を含む方法によって誘導されたCTLである：
a：CD8陽性T細胞を、HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）またはHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソームとインビトロで接触させる段階；
b：CD8陽性T細胞に、細胞表面上にHLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）またはHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）により提示された本発明のペプチドに結合し得るTCRの各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入する段階。
ＶＩＩＩ．T細胞受容体（TCR）
　本発明はまた、細胞表面上にHLA抗原により提示された本発明のペプチドに結合し得るT細胞受容体（TCR）の各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む組成物、およびそれを使用する方法を提供する。該ポリヌクレオチドは、細胞表面上にHLA抗原により提示された本発明のペプチドに結合し得るTCRを形成させることにより、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する特異性をCD8陽性T細胞に付与する。当技術分野における公知の方法を用いることにより、本発明のペプチドで誘導されたCTLのTCRサブユニットとしてのα鎖およびβ鎖をコードするポリヌクレオチドを同定することができる（WO2007/032255、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 （2003））。例えば、TCRを分析するためにはPCR法が好ましい。分析のためのPCRプライマーは、例えば、次の5'側プライマーに、以下の3'側プライマーを組み合わせて増幅用プライマーセットとすることができるでが、これらに限定されない。
　5'側プライマー：
　5'-Rプライマー（5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3'）（配列番号：124）
3'側プライマー：
　　TCRα鎖C領域に特異的：
　3-TRa-Cプライマー（5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3'）（配列番号：125）；
　　TCRβ鎖C1領域に特異的
　3-TRb-C1プライマー（5'-tcagaaatcctttctcttgac-3'）（配列番号：126）；または
　　TCRβ鎖C2領域に特異的：
　3-TRβ-C2プライマー（5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3'）（配列番号：127）
　同定されたポリヌクレオチドをCD8陽性T細胞に導入することによって形成されるTCRは、本発明のペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ、本発明のペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介する。
　TCRの各サブユニットをコードするポリヌクレオチドは、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該ポリヌクレオチドまたはそれらを発現可能な形態で含むベクターを、CD8陽性T細胞、例えば患者由来のCD8陽性T細胞に導入することができる。本発明は、患者自身のT細胞（または別の哺乳動物のT細胞）の迅速な改変により、優れた血管内皮細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする既成の組成物を提供する。
　本明細書において、特異的TCRとは、該TCRがCD8陽性T細胞の表面上に存在する場合に、標的細胞表面上に提示された本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的な細胞傷害活性を付与し得るTCRである。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、その好ましい例には、HLA分子および本発明のペプチドを用いるHLA多量体染色分析、ならびにELISPOTアッセイ法が含まれる。ELISPOTアッセイを行うことにより、上記ポリヌクレオチドを導入したT細胞がTCRによって標的細胞を特異的に認識すること、およびシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。上記TCRがCD8陽性T細胞表面上に存在する場合に、該TCRが、CD8陽性T細胞に対して、標的細胞特異的な細胞細胞傷害活性を付与し得るという確認もまた、公知の方法によって行うことができる。好ましい方法には、例えば、クロム放出アッセイ法などにより標的細胞に対する細胞傷害活性を測定することが含まれる。
　また本発明は、HLA-A11との関連では、例えば配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに結合するTCRの各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを形質導入することによって調製されるCTLを提供する。あるいは本発明は、HLA-A33との関連では、例えば配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに結合するTCRの各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを形質導入することによって調製されるCTLを提供する。
　形質導入されたCTLは、インビボでホーミングすることができ、かつ周知のインビトロ培養法によって増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-61 (1989)）。本発明のCTLは、治療または予防を必要としている患者における疾患の治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成するために使用することができる（その内容が参照により本明細書に組み入れられるWO2006/031221を参照されたい）。
ＩＸ．薬学的な剤または組成物
　本発明はまた、以下の中から選択される少なくとも1つの有効成分を含む、組成物または薬学的組成物を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のAPC；
（d）本発明のエキソソーム；
（e）本発明のCTL。
　本発明の薬学的組成物は、上記の有効成分に加えて、医薬品に通常用いられる担体、賦形剤等を特に制限なく必要に応じて含み得る。本発明の薬学的組成物に使用可能な担体の例としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等が挙げられる。したがって、本発明はまた、以下の（a）～（e）から選択される少なくとも1つの有効成分と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のAPC；
（d）本発明のエキソソーム；
（e）本発明のCTL。
　さらに、本発明の薬学的組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。
　VEGFR2の発現は、正常組織と比較して、血管新生により媒介される疾患において、疾患部位の血管内皮細胞で上昇する。そのため、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、血管新生により媒介される疾患の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。したがって本発明は、血管新生により媒介される疾患の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物であって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの1種類または複数種を有効成分として含む組成物を提供する。あるいは、薬学的組成物として用いるために、本発明のペプチドを、エキソソームまたはAPCの表面上に提示させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれか1つを標的とする本発明のCTLもまた、本発明の薬学的組成物の有効成分として用いることができる。本発明の薬学的組成物は、治療的有効量または薬学的有効量の上記有効成分を含み得る。
　本発明の薬学的組成物はまた、ワクチンとして使用され得る。本発明との関連において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗血管新生作用をもたらす免疫応答を誘導する機能を有する組成物を指す。したがって、本発明の薬学的組成物は、抗血管新生作用をもたらす免疫応答を誘導するために用いることができる。
　本発明の薬学的組成物は、ヒトである対象または患者において、血管新生により媒介される疾患を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。本発明の薬学的組成物は、HLA-A11陽性またはHLA-A33陽性の対象に対して、好ましく使用することができる。
　別の態様において、本発明はまた、血管新生により媒介される疾患を治療または予防するための薬学的組成物の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　あるいは、本発明はさらに、血管新生により媒介される疾患の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　あるいは、本発明はさらに、血管新生により媒介される疾患を治療または予防するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される少なくとも1つの有効成分と、薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　別の態様において、本発明はまた、血管新生により媒介される疾患を治療または予防するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　別の態様において、本発明はまた、血管新生により媒介される疾患を治療または予防するための方法であって、以下の中より選択される少なくとも1つの有効成分を対象に投与する段階を含む方法を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　本発明において、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るHLA-A11拘束性エピトープペプチドとして見出された。また、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るHLA-A33拘束性エピトープペプチドとして見出された。したがって、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも1つを含む本発明の薬学的組成物は、HLA抗原としてHLA-A11（例えば、HLA-A*1101）を有する対象への投与に特に適している。また、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも1つを含む本発明の薬学的組成物は、HLA抗原としてHLA-A33（例えば、HLA-A*3303）を有する対象への投与に特に適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、本発明のポリヌクレオチド）、これらのペプチドを提示するAPCまたはエキソソーム（すなわち、本発明のAPCまたはエキソソーム）、およびこれらのペプチドを標的とするCTL（すなわち、本発明のCTL）を含む薬学的組成物にも当てはまる。すなわち、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに関連する有効成分を含む薬学的組成物は、HLA-A11を有する対象（すなわち、HLA-A11陽性の対象）への投与に適している。また、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに関連する有効有効成分を含む薬学的組成物は、HLA-A33を有する対象（すなわち、HLA-A33陽性の対象）への投与に適している。より好ましい態様では、本発明の薬学的組成物は、配列番号：1、43、70および89の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも1つを含む薬学的組成物である。
　本発明の薬学的組成物によって治療および／または予防される疾患は、特に限定されず、各種がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症：加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫など）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、またはアテローム性動脈硬化などを含む、VEGFR2が関与するあらゆる種類の血管新生により媒介される疾患を含む。
　また、腫瘍部位における血管新生は、固形腫瘍の増殖および転移とも密接に関連している（Folkman,J. （1995）Nature Med.1：27-31; Bicknell et al.,（1996）Curr.Opin.Oncol.8：60-5）。そのため、本発明の薬学的組成物は、がん（固形腫瘍）の増殖および／または転移を抑制するためにも使用され得る。
　本発明の薬学的組成物は、前述の有効成分に加えて、疾患部位の血管内皮細胞に対するCTLを誘導する能力を有するその他のペプチド（例えばVEGFR1由来のペプチドCTL誘導性ペプチド）、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。また、本発明の薬学的組成物が、特にがんを治療および／または予防するためのものである場合には、本発明の薬学的組成物は、がん細胞に対するCTLを誘導する能力を有するペプチド（例えば、がん抗原由来のCTL誘導性ペプチド）、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ペプチドを提示する細胞等を含んでもよい。
　本発明の薬学的組成物は、本発明のペプチドなどの上記有効成分の抗血管新生効果が阻害されない限り、その他の治療物質もまた有効成分として任意に含み得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、抗炎症組成物、鎮痛剤、化学療法薬等を任意に含み得る。本発明の薬学的組成物自体にその他の治療物質を含めることに加えて、本発明の薬学的組成物を、1つまたは複数のその他の薬学的組成物と連続してまたは同時に投与することもできる。本発明の薬学的組成物およびその他の薬学的組成物の投与量は、例えば、使用する薬学的組成物の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび経路に依存する。
　本明細書において具体的に言及される成分に加えて、本発明の薬学的組成物は、製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的なその他の成分も含み得ることが理解されるべきである。
　本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む製品またはキットを提供する。本発明の製品またはキットは、本発明の薬学的組成物を収容した容器を含み得る。適切な容器の例としては、ボトル、バイアル、および試験管が挙げられるが、これらに限定されない。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器には、ラベルが貼付されていてもよく、ラベルには、本発明の薬学的組成物が使用されるべき疾患または疾患の状態を記載することができる。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
　本発明の製品またはキットは、本発明の薬学的組成物を収容した容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第2の容器をさらに含み得る。本発明の製品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書などの、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
　必要に応じて、有効成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、本発明の薬学的組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
（1）有効成分としてペプチドを含む薬学的組成物
　本発明のペプチドを含む薬学的組成物は、必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、本発明のペプチドに加えて、医薬品に通常用いられる担体、賦形剤等を特に制限なく必要に応じて含み得る。本発明の薬学的組成物に使用可能な担体の例としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等が挙げられる。さらに、本発明の薬学的組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的組成物は、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対して特異的な免疫を誘導することができるため、抗血管新生目的に用いることができる。
　本発明の薬学的組成物は、本発明のペプチドの2種類またはそれ以上の種類の組み合わせを含むこともできる。ペプチドの組み合わせは、ペプチドが混合されたカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いてペプチドを互いに結合させてもよい。例えば、ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはHLA抗原によってAPC上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該HLA抗原との間に形成された複合体に対して特異的に反応するCTLが誘導される。あるいは、対象からAPC（例えば、DC）を取り出し、次に本発明のペプチドにより刺激して、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するAPCを得る。これらのAPCを対象に再度投与して、該対象においてCTLを誘導し、結果として、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
　本発明の薬学的組成物は、細胞性免疫を効率的に確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。アジュバントとは、免疫学的活性を有する抗原と共に（または連続して）投与した場合に、該抗原に対する免疫応答を増強する化合物を指す。アジュバントとしては、例えばClin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89等の文献に記載されている公知のものを使用することができる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（IFA）、完全フロイントアジュバント（CFA）、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、水中油型エマルション等が含まれるが、これらに限定されない。アジュバントは、本発明の薬学的組成物を含むキットにおいて、本発明のペプチドを含む薬学的組成物とは別の容器に収容されていてもよい。この場合、該アジュバントと該薬学的組成物は、連続して対象に投与されてもよく、対象への投与直前に混合されてもよい。このような本発明のペプチドを含む薬学的組成物とアジュバントとを含むキットもまた、本発明によって提供される。
　さらに、本発明の薬学的組成物は、本発明のペプチドを封入したリポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、またはペプチドに脂質が結合している製剤であってもよい。
　本発明の別の態様において、本発明のペプチドはまた、薬学的に許容される塩の形態で投与してもよい。塩の好ましい例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、アミンとの塩、有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、および無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸など）との塩が含まれる。本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という語句は、その化合物の生物学的な有効性および特性を保持し、かつ、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p－トルエンスルホン酸、サリチル酸などの無機酸または無機塩基との反応によって得られるそのような塩を指す。したがって、本発明のペプチドの薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物もまた、本発明に包含される。
　いくつかの態様において、本発明の薬学的組成物は、CTLを刺激する成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでCTLを刺激し得る物質として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与するか、リポソーム中に取り込ませて投与するか、またはアジュバント中に乳化させて投与することができる。CTL応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル-S-グリセリルシステイニル-セリル-セリン（P3CSS）などの大腸菌（E．coli）リポタンパク質を用いてCTLを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
　本発明のペプチドまたは薬学的組成物の適切な投与方法の例には、経口、皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹膜、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与（すなわち、直接注射）であってよい。中でも一般的な投与方法は、例えば皮下注射である。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のペプチドは、血管新生により媒介される疾患を治療するための薬学的有効量またはVEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫（より具体的にはCTL）を誘導するための薬学的有効量で、対象に投与することができる。本発明のペプチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調製することができ、これは各本発明のペプチドに関して、通常0.001mg～1000mg、例えば0.01mg～100mg、例えば0.1mg～30mg、例えば0.1mg～10mgであり、例えば0.5mg～5mgであることができる。また、投与間隔は数日～数ヶ月に1度であることができ、例えば週に1回の間隔で投与することができる。当業者は、適切な投与量（用量）を適宜選択することができる。
（2）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的組成物
　本発明の薬学的組成物はまた、本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチドを含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞に導入された場合に、本発明のペプチドが発現されることを意味する。例示的な態様において、本発明のポリヌクレオチドの配列は、本発明のペプチドの発現に必要な調節エレメントを含む。本発明のポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノムへの安定した挿入が達成されるために必要な配列を備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第5,580,859号;第5,589,466号;第5,804,566号;第5,739,118号;第5，736,524号;第5,679,647号;およびWO98/04720を参照されたい。DNAに基づく送達技術の例には、「naked DNA」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第5,922,687号を参照されたい）。
　ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。例えば、本発明のペプチドを発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスを使用することができる。宿主に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第4,722,848号に記載されている。別のベクターはBCG（カルメット・ゲラン桿菌）である。BCGベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的な投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71；Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806；Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
　本発明のポリヌクレオチドの患者内への送達は、直接的であってもよく、この場合には本発明のポリヌクレオチドを保有するベクターに患者を直接曝露することができる。または間接的であってもよく、この場合にはまずインビトロで細胞を本発明のポリヌクレオチドを保有するベクターで形質転換し、次いで該細胞を患者内に移植する。これら2つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
　遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505；Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96；Mulligan, Science 1993, 260: 926-32；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217；Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えDNA技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
　ペプチドの投与と同様に、ポリヌクレオチドの投与が、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、骨内および／または腹膜注射などによって行われる場合があり、また、全身投与または標的部位近傍への局所投与は使用が見出される。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によってブーストすることもできる。本発明のポリヌクレオチドは、血管新生により媒介される疾患を治療するための薬学的有効量またはVEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫（より具体的にはCTL）を誘導するための薬学的有効量で、対象に投与することができる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療される疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に応じて適宜調製することができ、これは通常0.001mg～1000mg、例えば0.01mg～100mg、例えば、0.1mg～30mg、例えば0.1mg～10mg、例えば0.5mg～5mgであることができる。投与間隔は数日に1度～数ヶ月に1度であることができ、例えば週に1回の間隔で投与することができる。当業者は、適切な投与量（用量）を適宜選択することができる。
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、APC、およびCTLを用いる方法
　本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、APCおよびCTLを誘導することができる。本発明のエキソソームおよびAPCを用いて、CTLを誘導することもできる。本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびAPCは、それらのCTL誘導能が阻害されない限り、任意の他の化合物と組み合わせて用いることができる。したがって、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、APCおよびエキソソームのいずれかを含む薬学的組成物を用いて本発明のCTLを誘導することができる。また、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を用いて本発明のAPCを誘導することができる。
（1）APCを誘導する方法
　本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、CTL誘導能を有するAPCを誘導する方法を提供する。
　本発明の方法は、APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、APCを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
a：対象からAPCを回収する段階；および
b：段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階。
　前記APCは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているDC、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、B細胞、および活性化T細胞を用いることができる。DCはAPCの中で最も強力なCTL誘導能を有するため、好ましくはDCを用いることができる。本発明の任意のペプチドを単独で、または本発明の他のペプチドと共に用いることができる。また、本発明のペプチドと、他のCTL誘導性ペプチド（例えば、VEGFR1由来のCTL誘導性ペプチドやがん抗原由来のCTL誘導性ペプチド）とを組み合わせて用いることもできる。
　一方、本発明のペプチドを対象に投与した場合、APCは該ペプチドとインビボで接触し、結果的に、高いCTL誘導能を有するAPCが該対象の体内で誘導される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチドを対象に投与する段階を含み得る。同様に、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与した場合、本発明のペプチドがインビボで発現し、これがAPCとインビボで接触し、結果的に、高いCTL誘導能を有するAPCが該対象の体内で誘導される。したがって本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを対象に投与する段階を含み得る。
　本発明はまた、CTL誘導能を有するAPCを誘導するために、本発明のポリヌクレオチドをAPCに導入する段階を含み得る。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
a：対象からAPCを回収する段階；および
b：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを段階aのAPCに導入する段階。
段階bは、「ＶＩ．抗原提示細胞（APC）」の章に上述したように行うことができる。
　したがって、一態様において、本発明は、以下のaまたはbの段階を含む、CTL誘導能を有するAPCを誘導する方法を提供する：
a：APCを本発明のペプチドで接触させる段階；
b：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
　また、本発明は、以下のaまたはbの段階を含む、CTL誘導能を有するAPCを調製する方法を提供する：
a：APCを本発明のペプチドで接触させる段階；
b：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
　上記の方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボのいずれでも行うことができるが、インビトロまたはエクスビボで行うことが好ましい。上記方法で使用されるAPCは、誘導されたAPCの投与が予定されている対象に由来するものであってもよいが、異なる対象に由来するものであってもよい。投与が予定されている対象とは異なる対象（ドナー）に由来するAPCを使用する場合、投与対象者とドナーのHLA型は、同一である必要がある。本発明の方法において、本発明のペプチドとして配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドを使用する場合、投与対象者とドナーのHLA型は、いずれもHLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）であることが好ましい。あるいは、上記の方法で使用するAPCは、HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）を発現しているAPCであることが好ましい。また、本発明のペプチドとして配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドを使用する場合、投与対象者とドナーのHLAは、いずれもHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）であることが好ましい。あるいは、上記の方法で使用するAPCは、HLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）を発現しているAPCであることが好ましい。APCは、ドナーから採取された血液から比重遠心分離法等によりPBMCを分離した後、該PBMCから公知の方法を用いて調製することができる。
　別の態様において、本発明はまた本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、CTL誘導能を有するAPCを誘導するための薬学的組成物を提供する。
　あるいは、本発明はさらに、CTL誘導能を有するAPCを誘導するするための薬学的組成物の製造における、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
　あるいは、本発明はさらに、CTL誘導能を有するAPCの誘導において用いるための、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
　あるいは、本発明はさらに、APCを誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。
　別の態様において、本発明はまた、CTL誘導能を有するAPCを誘導するための薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドまたは該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する。
　本発明の方法によって誘導されたAPCは、VEGFR2に特異的なCTL（すなわち本発明のCTL）を誘導することができる。
（2）CTLを誘導する方法
　本発明はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またはAPCを用いてCTLを誘導する方法を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識し得るＴ細胞受容体（TCR）を形成し得るポリペプチド（すなわち、TCRサブユニット）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを使用してCTLを誘導する方法を提供する。好ましくは、CTLを誘導する方法は、以下の中より選択される少なくとも1つの段階を含む:
a．CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する抗原提示細胞と接触させる段階;
b．CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと接触させる段階;および
c．本発明のペプチドとHLA抗原との複合体を認識することができるTCRを形成し得るポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドをCD8陽性T細胞に導入する段階。
　本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、またはAPCを対象に投与すると、該対象の体内でCTLが誘導され、VEGFR2を発現する血管内皮細胞を標的とする免疫応答の強度が増強される。したがって本発明の方法は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、APC、またはエキソソームを対象に投与する段階を含み得る。
　あるいは、それらをインビトロまたはエクスビボで用いることによってCTLを誘導することもできる。例えば、本発明の方法は以下の段階を含み得る：
a．対象からAPCを回収する段階、
b．段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階、および
c．段階bのAPCをCD8陽性T細胞と共培養する段階。
　誘導されたCTLは、その後対象に戻してもよい。
　上記の段階cにおいてCD8陽性T細胞と共培養するAPCは、「ＶＩ．抗原提示細胞（APC）」の章に上述したように、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入することによって調製することもできる。しかしながら、本発明の方法で用いられるAPCはこれに限定されず、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する任意のAPCを用いることができる。
　本発明の方法では、そのようなAPCの代わりに、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いることもできる。すなわち、本発明の方法は、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームとを共培養する段階を含み得る。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章に上述した方法によって調製することができる。
　さらに、細胞表面上にHLA抗原により提示された本発明のペプチドに結合し得るTCRの各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むベクターをCD8陽性T細胞に導入することによって、CTLを誘導することもできる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．T細胞受容体（TCR）」の章に上述したように行うことができる。
　したがって、一態様において、本発明は、以下の中より選択される段階を含む、CTLを誘導する方法を提供する：
a：CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCと共培養する段階；
b：CD8陽性T細胞を、HLA抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
ｃ： 細胞表面上にHLA抗原により提示された本発明のペプチドに結合し得るTCRの各サブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、CD8陽性T細胞に導入する段階。
　上記の方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボのいずれでも行うことができるが、インビトロまたはエクスビボで行うことが好ましい。上記方法で使用されるAPCもしくはエキソソーム、およびCD8陽性T細胞は、誘導されたCTLの投与が予定されている対象に由来するものであってもよいが、異なる対象に由来するものであってもよい。投与が予定されている対象とは異なる対象（ドナー）に由来するAPCもしくはエキソソーム、およびCD8陽性T細胞を使用する場合、投与対象者とドナーのHLA型は、同一である必要がある。例えば、本発明のペプチドとして配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドを用いる場合、投与対象者とドナーのHLA型は、いずれもHLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）であることが好ましい。あるいは、上記の方法で使用するAPCまたはエキソソームは、HLA-A11（より好ましくはHLA-A*1101）と本発明のペプチド（配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチド）との複合体を自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソームであることが好ましい。この場合、誘導されたCTLは、HLA-A11と本発明のペプチドとの複合体を提示する細胞（例えば、VEGFR2を発現するHLA-A11陽性細胞）に対して、特異的な細胞傷害活性を示す。また、本発明のペプチドとして配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチドを用いる場合、投与対象者とドナーのHLAは、いずれもHLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）であることが好ましい。あるいは、上記の方法で使用するAPCまたはエキソソームは、HLA-A33（より好ましくはHLA-A*3303）と本発明のペプチド（配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはその改変ペプチド）との複合体を自身の表面上に提示するAPCまたはエキソソームであることが好ましい。この場合、誘導されたCTLは、HLA-A33と本発明のペプチドとの複合体を提示する細胞（例えば、VEGFR2を発現するHLA-A33陽性細胞）に対して、特異的な細胞傷害活性を示す。
　別の態様において、本発明はまた、以下の中より選択される少なくとも1つの有効成分を含む、CTLを誘導するための組成物または薬学的組成物を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；および
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム。
　別の態様において、本発明はまた、CTLを誘導するための組成物または薬学的組成物の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；および
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム。
　あるいは、本発明はさらに、CTLの誘導において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド； 
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；および
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム。
　あるいは、本発明はさらに、CTLを誘導するための組成物または薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分と、薬学的にまたは生理学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；および
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム。
　別の態様において、本発明はまた、CTLを誘導するための組成物または薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；および
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム。
ＸＩ．免疫応答を誘導する方法
　さらに本発明は、VEGFR2に関連する疾患に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。適切な疾患は、血管新生により媒介される疾患であり、これには各種がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症：加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫など）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、およびアテローム性動脈硬化などが含まれるが、これらに限定されない。
　本発明はまた、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。VEGFR2は、上記のような血管新生により媒介される疾患において、疾患部位の血管内皮細胞で強発現していることが認められる。そのため、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答が誘導されると、その結果として、疾患部位における血管新生が阻害される。したがって、本発明はまた、血管新生により媒介される疾患の疾患部位において、血管新生を阻害する方法も提供する。
　本発明の方法は、本発明のペプチドのいずれかまたはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与する段階を含み得る。本発明の方法はまた、本発明のペプチドのいずれかを提示するエキソソームまたはAPCの投与を企図する。詳細については、「ＩＸ．薬学的な剤または組成物」の項、特に本発明の薬学的組成物のワクチンとしての使用について記載している部分を参照されたい。加えて、免疫応答を誘導するために本発明の方法に使用することができるエキソソームおよびAPCは、前記の「Ｖ．エキソソーム」、「ＶＩ．抗原提示細胞（APC）」、ならびに「Ｘ．ペプチド、エキソソーム、APC、およびCTLを用いる方法」の（1）および（2）の項において詳述されている。
　別の態様において、本発明はまた、血管新生により媒介される疾患の疾患部位に対する免疫応答を誘導するための薬学的組成物またはワクチンであって、以下の中より選択される有効成分を含む、薬学的組成物またはワクチンを提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　あるいは、本発明はさらに、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導するための薬学的組成物またはワクチンであって、以下の中より選択される有効成分を含む、薬学的組成物またはワクチンを提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　あるいは、本発明はさらに、血管新生により媒介される疾患の疾患部位において、血管新生を阻害するための薬学的組成物またはワクチンであって、以下の中より選択される有効成分を含む、薬学的組成物またはワクチンを提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　別の態様において、本発明はまた、血管新生により媒介される疾患の疾患部位に対する免疫応答を誘導するための薬学的組成物またはワクチンの製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表目状に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　あるいは、本発明はさらに、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導するための薬学的組成物またはワクチンの製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　あるいは、本発明はさらに、血管新生により媒介される疾患の疾患部位において、血管新生を阻害するための薬学的組成物またはワクチンの製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　本発明はまた、免疫応答を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体と共に混合または製剤化する段階を含み得る方法を提供する。
　あるいは、本発明は、以下の中より選択される有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、血管新生により媒介される疾患の疾患部位において血管新生を阻害するための方法、または血管新生により媒介される疾患の疾患部位に対する免疫応答を誘導する方法を提供する：
（a）本発明のペプチド；
（b）本発明のペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド；
（c）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するAPC；
（d）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するエキソソーム；および
（e）本発明のCTL。
　本発明との関連において、本発明のペプチド、ポリペプチド、APC、エキソソームおよび／またはCTLを投与することにより、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患を治療することができる。あるいは、本発明のペプチド、ポリペプチド、APC、エキソソームおよび／またはCTLを投与することにより、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患の疾患部位に対する免疫応答を誘導することができる。そのような疾患の例には、各種がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症：加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫など）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、およびアテローム性動脈硬化などが含まれるが、これらに限定されない。また、本発明の本発明のペプチド、ポリペプチド、APC、エキソソームおよび／またはCTLを投与することにより、VEGFR2を発現する血管内皮細胞に対する免疫応答を誘導することができる。したがって、上記の有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する前に、治療する対象の疾患部位におけるVEGFR2の発現レベルが増強されているかどうかを確認することが好ましい。
　したがって一態様において、本発明は、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患の治療を必要とする患者において該疾患を治療する方法を提供し、そのような方法は以下の段階を含む：
ｉ）治療すべき疾患を有する対象の疾患部位から得られた生体試料中のVEGFR2の発現レベルを測定する段階；
ｉｉ）VEGFR2の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの成分を、正常対照と比較してVEGFR2を過剰発現する疾患を有する対象に投与する段階。
　あるいは、本発明はまた、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患を有する対象に投与するための、上記の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、上記の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分で治療する対象を同定する方法であって、対象由来の生体試料中のVEGFR2の発現レベルを測定する段階を含み、該レベルが正常対照レベルと比較して上昇していることにより、該対象が上記の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分で治療され得る対象であると同定される方法を提供する。生体試料中のVEGFR2発現は公知の方法で測定することができ、例えば、VEGFR2遺伝子の転写産物をプローブやPCR法により検出する方法（例えば、cDNAマイクロアレイ法、ノーザンブロット法、RT-PCR法など）、VEGFR2遺伝子の翻訳産物を抗体により検出する方法（例えば、ウェスタンブロット法、免疫染色法など）等を用いることができる。
　VEGFR2を過剰発現する細胞におけるVEGFR2遺伝子の発現レベルは、そのレベルが、対照レベル(例えば、正常な細胞におけるレベル)から、例えば、10%、25%もしくは50%上昇するか、または、1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超もしくはそれ以上に上昇する場合には上昇していると判定され得る。
　対照レベルは、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患の状態（当該疾患を有するまたは有しない）が判明している対象から予め採取し保存しておいた試料を用いることにより決定することができる。加えて、治療すべき疾患を有する器官の治療を要しない領域から得られた正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患の状態が判明している対象に由来する試料におけるVEGFR2遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて統計学的方法によって決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。さらに、本発明の1つの局面によれば、生体試料におけるVEGFR2遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定された複数の対照レベルと比較してもよい。対象由来の生体試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるVEGFR2遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値+/-2S.D.または平均値+/-3S.D.の範囲を、基準値として用いることができる。
　対象由来の生体試料の発現レベルと対照レベルとの差を、その発現レベルが、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患の状態に応じて異ならないことが判明している対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化することができる。例示的な対照遺伝子には、β-アクチン、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素、およびリボソームタンパク質P1が含まれるが、これらに限定されない。
　好ましい態様では、上記の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を投与する前に、対象のHLA型を確認することが好ましい。例えば、配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに関連する有効成分の投与対象としては、HLA-A11陽性の対象を選択することが好ましい。また、配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドに関連する有効成分の投与対象としては、HLA-A33陽性の対象を選択することが好ましい。
　本発明はまた、本発明のペプチドとHLAとの複合体を提供する。前記本発明の複合体は、単量体であっても多量体であってもよい。本発明の複合体が多量体である場合、重合数は特に限定されず、任意の重合数の多量体であることができる。例としては、四量体、五量体、六量体等が挙げられるが、これらに限定されない。また、デキストラマー（WO2002/072631）、ストレプタマー（Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun;8(6):631-7.）もまた本発明の多量体に包含される。本発明のペプチドとHLAとの複合体は、公知の方法に従って調製することができる（例えば、Altman JD et al., Science.1996,274(5284):94-6、WO2002/072631、WO2009/003492、Knabel M et al., Nat Med. 2002 Jun;8(6):631-7等）。本発明の複合体は、例えば、本発明のペプチドに特異的なCTLの定量に用いることができる。例えば、本発明の薬学的組成物を投与した対象から血液試料を採取し、PBMCを分離した後CD4陰性細胞を調製し、蛍光色素を結合させた本発明の複合体と該CD4陰性細胞とを接触させる。その後、フローサイトメトリーで解析することにより、本発明のペプチドに特異的なCTLの割合を測定することができる。例えば、本発明の薬学的組成物の投与前、投与中、および／または投与後に、本発明のペプチドに特異的なCTLを測定することにより、本発明の薬学的組成物による免疫応答誘導効果をモニタリングすることができる。
ＸＩI．抗体
　本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は本発明のペプチドに特異的に結合し、本発明のペプチドではないものには結合しない（または弱く結合する）。別の態様において、そのような抗体は、HLA分子との関連でペプチドを認識する抗体、すなわちペプチド-MHC複合体に結合する抗体を含み得る。抗体の結合特異性は、阻害試験で確認することができる。すなわち、分析する抗体と全長VEGFR2ポリペプチドとの間の結合が、本発明のペプチドの存在下で阻害される場合、この抗体が本発明のペプチドに特異的に結合することが示される。本発明のペプチドに対する抗体は、疾患の診断および予後診断のアッセイ、ならびに本発明の薬学的組成物の投与対象の選択および本発明の薬学的組成物のモニタリングにおいて使用され得る。
　本発明はまた、本発明のペプチドもしくはその断片を検出および／または定量するための様々な免疫学的アッセイ法を提供する。そのような免疫学的アッセイ法は、放射免疫測定法、免疫クロマトグラフ法、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、酵素結合免疫蛍光測定法（ELIFA）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の様々な免疫学的アッセイ形式の範囲内で行われる。
　本発明の抗体は、VEGFR2を発現する疾患を検出し得る免疫学的画像化法に用いることができ、その例には、本発明の標識抗体を使用する放射性シンチグラフィー画像化法が含まれるが、これに限定されない。そのようなアッセイ法は、VEGFR2を発現する疾患の検出、モニタリング、および予後診断において臨床的に使用され、そのような疾患の例には、各種がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症：加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫など）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、およびアテローム性動脈硬化などが含まれるが、これらに限定されない。
　本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することにより得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えにより作製されたヒト化抗体をさらに含み得る。
　抗体を得るための抗原として用いられる本発明のペプチドもしくはその断片は、本明細書に開示するアミノ酸配列に基づいて、化学合成により、または遺伝子工学的手法により得ることができる。
　免疫抗原として用いられるペプチドは、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの断片であってよい。また、免疫原性を高めるために、ペプチドを担体と結合または連結させてもよい。担体として、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）が周知である。KLHとペプチドを結合する方法もまた、当技術分野において周知である。
　任意の哺乳動物を前記抗原で免疫することができるが、細胞融合に用いられる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯目（Rodentia）、ウサギ目（Lagomorpha）、または霊長目（Primate）の動物を使用することができる。齧歯目科の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（Catarrhini）（旧世界ザル）のサルが含まれる。
　動物を抗原で免疫する方法は、当技術分野で公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的には、抗原を適量のリン酸緩衝食塩水（PBS）、生理食塩水等で希釈し、懸濁させる。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的アジュバントと混合し、乳化した後、哺乳動物に投与することができる。その後、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、4～21日ごとに数回投与することが好ましい。免疫化には、適切な担体を用いてもよい。上記のように免疫した後、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法で調べることができる。
　本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して調べた免疫後の哺乳動物から血液を回収し、任意の従来法により血液から血清を分離することによって、調製することができる。ポリクローナル抗体はポリクローナル抗体を含む血清を含んでよく、またポリクローナル抗体を含む画分を該血清から単離してもよい。免疫グロブリンGまたはMは、本発明のペプチドのみを認識する画分から、例えば、本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いた上で、この画分をプロテインAまたはプロテインGカラムを用いてさらに精製して、調製することができる。
　モノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を回収し、上記のように血清中の所望の抗体のレベル上昇について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合に用いる免疫細胞は、好ましくは脾臓から得ることができる。上記の免疫細胞と融合させるもう一方の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは薬物による融合細胞の選択のための特性を獲得した骨髄腫細胞が含まれる。
　公知の方法、例えば、Milstein et al.（Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞を融合させることができる。
　細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択することができる。細胞培養は典型的に、ＨＡＴ培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である数日間から数週間にわたって継続する。その後、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローニングすることができる。
　ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、EBウイルスに感染したリンパ球などのヒトリンパ球を、ペプチド、ペプチドを発現している細胞、またはそれらの溶解物でインビトロにおいて免疫することもできる。次いで、免疫後のリンパ球を、U266などの無限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、該ペプチドに結合し得る所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（特開昭63-17688号）。
　続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のペプチドを結合させたアフィニティーカラムにより精製することができる。
　あるいは、免疫したリンパ球などの、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
　このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子操作技法を用いて組換えにより調製することもできる（例えば、MacMillan Publishers LTD (1990)により英国で刊行された、Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodiesを参照されたい）。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターに挿入した上で、宿主細胞に導入して、組換え抗体を調製することができる。本発明はまた、上記のようにして調製された組換え抗体を提供する。
　さらに、本発明の抗体は、本発明のペプチドに結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、抗体の抗原結合部位を含むことが望ましい。具体的には、抗体断片は、Fab、F（ab'）2、Fv、またはH鎖およびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Fv（scFv）であってよい（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞内で発現させることができる（例えば、Co et al., J Immunol 152: 2968-76 (1994)；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
　抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）などの様々な分子との結合によって修飾することができる。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。
　あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR）および定常領域とを含むヒト化抗体として得ることもできる。そのような抗体は、公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、齧歯類のCDRまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 239:1534-6 (1988)を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全には満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である。
　ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えて、ヒト可変領域をも含む完全なヒト抗体を用いることもできる。そのような抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)）。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは、例えば米国特許第6,150,584号、第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号に記載されている。
　上記のようにして得られた抗体は、均一になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、抗体を分離および単離することができる（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインAカラムには、例えば、Hyper D、POROS、およびSepharose F．F．（Pharmacia）が含まれる。
　例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順は、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
　例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、および／または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ELISAの場合、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のペプチドを該プレートに添加し、次に抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を添加する。次いで、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を添加し、プレートをインキュベートする。続いて洗浄後に、p-ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を該プレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。抗体の結合活性を評価するために、C末端またはN末端断片などのペプチドの断片を抗原として用いてもよい。本発明の抗体の活性を評価するために、BIAcore（Pharmacia）を用いてもよい。
　本発明の抗体を本発明のペプチドを含むと考えられる試料に対して曝露し、該抗体と該ペプチドとによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、上記の方法によって本発明のペプチドの検出または測定が可能になる。本発明によるペプチドを検出または測定する方法はペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法は、該ペプチドを使用する種々の実験において使用され得る。
　例えば、本発明の抗体は、対象の血液試料（例えば血清試料）中に存在する本発明のペプチドを検出するために用いることもできる。あるいは、逆に、対象の血液試料（例えば血清試料）中に存在する本発明の抗体を、本発明のペプチドを用いて検出することもできる。対象の血液試料中において本発明のペプチドまたは本発明の抗体を測定した結果は、本発明の薬学的組成物の投与対象の選択、または本発明の薬学的組成物の効果のモニタリングに役立てることができる。
ＸIII．ベクターおよび宿主細胞
　本発明はまた、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターおよび該ベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のポリヌクレオチドを保持するため、宿主細胞に本発明のペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のポリヌクレオチドを投与するために使用され得る。
　大腸菌が宿主細胞であり、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blue）内で増幅して大量に生成する場合、ベクターは、大腸菌内で増幅するための「複製起点」と、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の薬物によって選択される薬物耐性遺伝子）とを有する必要がある。例えば、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script等を用いることができる。加えて、pGEM-T、pDIRECT、およびpT7もまた上記のベクターと同様にクローニングのために用いることができる。ベクターを本発明のペプチドの産生に用いる場合には、発現ベクターが使用され得る。例えば、大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するために上記の特徴を有する必要がある。JM109、DH5α、HB101、またはXL1 Blueなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現し得るプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1989)）、araBプロモーター（Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)）、T7プロモーター等を有する必要がある。この点に関して、例えば、pGEX-5X-1（Pharmacia）、「QIAexpressシステム」（Qiagen）、pEGFP、およびpET（この場合、宿主は好ましくはＴ7 RNAポリメラーゼを発現するBL21である）を上記のベクターの代わりに用いることができる。さらにベクターは、ペプチド分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。ペプチドを大腸菌のペリプラズムに分泌させる例示的なシグナル配列は、pelBシグナル配列（Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入する手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
　大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen）、およびpEGF-BOS（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば、「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」（GIBCO BRL）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「ピキア（Pichia）発現キット」（Invitrogen）、pNV11、SP-Q01）、および枯草菌（Bacillus subtilis）由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。
　ベクターをCHO、COS、またはNIH3T3細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターはこのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)）、ＭＭLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、CMVプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（例えば、ネオマイシン、G418）によって選択される薬物耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばpMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。
　上記説明本発明の態様を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されない。
[1]　以下の群より選択されるアミノ酸配列を含む、細胞障害性T細胞（CTL）誘導能を有する15アミノ酸未満のペプチド：
（a）配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列；および
（b）配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列において、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列。
[2]　配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45からなる群より選択されるアミノ酸配列において、以下の（a）～（d）から選択される1以上の置換を有する、[1]記載のペプチド：
（a）N末端から2番目のアミノ酸が、スレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；
（b）N末端から３番目のアミノ酸が、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；
（c）N末端から７番目のアミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；および
（d）Ｃ末端のアミノ酸が、アルギニンに置換されている。
[3]　配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列において、以下の（a）～（c）から選択される1以上の置換を有する、[1]記載のペプチド：
（a）N末端から1番目のアミノ酸が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；
（b）N末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；および
（c）C末端のアミノ酸が、アルギニンおよびリジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている。
[4]　配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、[1]記載のペプチド。
[5]　[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
[6]　薬学的に許容される担体と、以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む組成物：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[7]　CTLを誘導するための組成物であって、以下の（a）～（d）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む、[6]記載の組成物：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；および
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム。
[8]　薬学的組成物である、[6]記載の組成物。
[9]　（i）血管新生により媒介される疾患の治療、（ii）血管新生により媒介される疾患の予防、および（iii）血管新生により媒介される疾患の術後の再発の予防からなる群より選択される1以上の用途ための薬学的組成物である、[8]記載の組成物。
[10]　血管新生により媒介される疾患の疾患部位において、血管新生を阻害するための薬学的組成物である、[8]記載の組成物。
[11]　血管新生により媒介される疾患が、がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、およびアテローム性動脈硬化である、[9]または[10]記載の組成物。
[12]　脈絡膜における血管新生に関連する疾患が、加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫である、[11]記載の組成物。
[13]　がんの増殖または転移を抑制するために使用される、[11]記載の組成物。
[14]　HLA-A11陽性またはHLA-A33陽性である対象への投与のために製剤化される、[6]～[13]のいずれか一項記載の組成物。
[15]　以下からなる群より選択される段階を含む、CTL誘導能を有するAPCを誘導する方法：
（a）APCを、[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
[16]　以下からなる群より選択される段階を含む、CTLを誘導する方法：
（a）CD8陽性Ｔ細胞を、HLA抗原と[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCと共培養する段階、
（b）CD8陽性Ｔ細胞を、HLA抗原と[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、および
（c）細胞表面上にHLA抗原により提示された[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（TCR）の各サブユニットをコードするポリヌクレオチドをCD8陽性Ｔ細胞に導入する段階。
[17]　HLA抗原と[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPC。
[18]　[15]記載の方法によって誘導される、17記載のAPC。
[19]　[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[20]　[16]記載の方法によって誘導される、19記載のCTL。
[21]　以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む組成物を対象に投与する段階を含む、血管新生により媒介される疾患の疾患部位における血管新生を阻害する方法：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[22]　以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む組成物を対象に投与する段階を含む、血管新生により媒介される疾患を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防する方法：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[23]　[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドに結合する抗体。
[24]　CTL誘導能を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列からなる元のアミノ酸配列に対して、 1個、2個、または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる候補配列を作成する段階；
（b）（a）で作成した候補配列の中からVEGFR2以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物とも有意な相同性（配列同一性）を有さない候補配列を選択する段階；
（c）（b）で選択した候補配列からなるペプチドと、APCとを接触させる段階；
（d）（c）のAPCとCD8陽性T細胞とを接触させる段階；および
（e）元のアミノ酸配列からなるペプチドよりも同等かまたはより高いCTL誘導能を有するペプチドを選択する段階。
[25]　血管新生により媒介される疾患の疾患部位における血管新生を阻害するための組成物の製造における、以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分の使用：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[26]　血管新生により媒介される疾患の治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的組成物の製造における、以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分の使用：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[27]　血管新生により媒介される疾患の疾患部位における血管新生を阻害するための、以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分の使用：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[28]　血管新生により媒介される疾患を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防するための、以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分の使用：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
[29]　以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む組成物を対象に投与する段階を含む、VEGFR2を発現する細胞に対する細胞傷害活性を誘導する方法：
（a）[1]～[4]のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
（b）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（c）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
（d）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
（e）[1]～[4]のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
　本発明をその特定の態様に関して本明細書において詳細に説明してきたが、前述の説明は事実上、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、慣例的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に理解するであろう。したがって本発明は、上記の説明によって規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によって規定されることが意図される。
　以下、実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。しかしながら、以下の材料、方法および実施例は、本発明のある形態の作製および使用において当業者を支援するために役立ち得る一方、本発明の局面を説明するためのものにすぎず、したがって本発明の範囲を決して限定することを意図しない。当業者は、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
材料および方法
細胞株
　HLA-AおよびHLA-B陰性ヒトBリンパ芽球様細胞株であるC1R、ならびにアフリカミドリザル腎細胞株であるCOS7は、ATCCから購入した。
HLA-A * 1101またはHLA-A * 3303を安定的に発現する刺激細胞の作成
　HLA-A*1101またはHLA-A*3303を安定的に発現するC1R（C1R-A11およびC1R-A33）は、刺激細胞として使用された。HLA-A*1101またはHLA-A*3303のオープンリーディングフレームをコードするcDNAはPCRで増幅され、発現ベクターへクローニングされた。C1R細胞はNeonトランスフェクションシステム（Invitorogen）を用いて上記発現ベクターで形質転換され、その後、G418（Invitrogen）を用いて2週間選択された。G418選択細胞はG418が添加された培養培地を含む96ウェルプレートのウェルへ蒔かれた。外来性HLA-A*1101またはHLA-A*3303のC1R細胞における発現はフローサイトメトリー解析で確認された。
VEGFR2由来のペプチドの候補選択
　HLA-A*1101分子またはHLA-A*3303分子に結合するVEGFR2由来の9merおよび10merのペプチドを、結合予測ソフトウェア「NetMHC」(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al., Tissue Antigens. 2003 Nov, 62(5):378-84; Nielsen et al., Protein Sci. 2003 May, 12(5):1007-17, Bioinformatics. 2004 Jun 12:20(9):1388-97)を用いて予測した。
　表1および表2は、VEGFR2のHLA-A11結合性9merペプチドおよび10merペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なHLA-A11結合能を有する合計86種類のペプチドを選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表3および表4は、VEGFR2のHLA-A33結合性9merペプチドおよび10merペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なHLA-A33結合能を有する合計51種類のペプチドを選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
ペプチドの合成
　これらのペプチドは、標準的な固相合成法に従って合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって精製した。該ペプチドの純度（>90%）および同一性は、それぞれ分析用HPLCおよび質量分析によって測定した。ペプチドはジメチルスルホキシド（DMSO）に20mg/mlで溶解し、-80℃で保存した。
インビトロでのCTL誘導
　単球由来の樹状細胞（DC）を抗原提示細胞として使用し、ヒト白血球抗原（HLA）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答を誘導した。他所に記載されているように、DCはインビトロで作製した（Nakahara S et al.,Cancer Res 2003,63(14):4112-8）。具体的には、Ficoll-Paque plus (Pharmacia)溶液によって健常なボランティア（HLA-A*1101またはHLA-A*3303陽性）から単離した末梢血単核細胞を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Becton Dickinson）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。2%の加熱不活化した自己血清（AS）を含むAIM-V培地（Invitrogen）中、1000 IU/mlの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（R&D System）および1000 IU/mlのインターロイキン（IL）-4（R&D System）の存在下で、単球が濃縮された集団を培養した。7日間の培養後、サイトカインで誘導したDCに、AIM-V培地中に37℃で3時間、3μg/mlのβ2-ミクログロブリンの存在下で20μg/mlの各合成ペプチドをパルスした。作製された細胞は、自身の細胞表面上にCD80、CD83、CD86、およびHLA class IIなどのDC関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのDCをX線照射（20Gy）によって不活化し、CD8 Positive Isolation Kit（Dynal）を用いた陽性選択によって得られた自己CD8+T細胞と1：20の比率で混合した。これらの培養物を48ウェルプレート（Corning）中に播種した。各ウェルは、0.5mlのAIM-V/2%AS培地中に、1.5 x 104個のペプチドパルスしたDC、3 x 105個のCD8+T細胞および10ng/mlのIL-7（R&D System）を含むようにした。3日後、これらの培養物に、IL-2（CHIRON）を最終濃度20IU/mlまで添加した。7日目および14日目に、ペプチドパルスした自己DCでＴ細胞をさらに刺激した。DCは上記と同一の方法によって毎回調製した。21日目に、3回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたC1R-A11またはA33細胞に対してCTLを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506）。
CTLの増殖
　Riddellら（Walter EA et al., N Engl J Med 1995, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996, 2(2): 216-23）によって記載されている方法と類似の方法を使用して、CTLを培養下で増殖させた。40ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体（Pharmingen）の存在下で、マイトマイシンCによって不活化した2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株とともに、合計5 x 104個のCTLを25mlのAIM-V/5%AS培地中に懸濁した。培養開始1日後に、120IU/mlのIL-2を該培養物に添加した。5、8および11日目に、30IU/mlのIL-2を含む新鮮なAIM-V/5%AS培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001, 84(1): 94-9; Umano Y et al. ,Br J Cancer 2001, 84(8): 1052-7, Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9, Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8): 498-506）。
CTLクローンの樹立
　96丸底マイクロタイタープレート（Nalge Nunc International）においてCTL 0.3個、1個、および3個／ウェルとなるように、希釈を行った。CTLを、1 x 104個細胞／ウェルの2種類のヒトBリンパ芽球様細胞株、30ng/mlの抗CD3抗体、および125IU/mlのIL-2とともに、合計150μl／ウェルの5%AS含有AIM-V培地中で培養した。10日後、50μl／ウェルのIL-2を、IL-2の最終濃度が125IU/mlに達するように該培地に添加した。14日目にCTL活性を試験し、上記と同一の方法を使用してCTLクローンを増殖させた（Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005, 96(8）): 498-506）。
特異的CTL活性
　特異的CTL活性を調べるために、インターフェロン（IFN）-γ酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイおよびIFN-γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を実施した。具体的には、ペプチドパルスしたC1R‐A11またはC1R‐A33（1 x 10４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。48ウェルプレート中の培養細胞を応答細胞として使用した。IFN-γ ELISPOTアッセイおよびIFN-γ ELISAアッセイは、製造業者の手順に従って実施した。
標的遺伝子およびHLAを強制発現させた標的細胞の樹立
　標的遺伝子またはHLA-A*1101もしくはHLA-A*3303のオープンリーディングフレームをコードするｃDNAをPCRによって増幅した。PCR増幅産物を発現ベクターにクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン2000（Invitrogen）を使用して、標的遺伝子およびHLAの陰性細胞株であるCOS7に標的遺伝子の発現ベクターおよびHLA-A*1101もしくはHLA-A*3303の発現ベクターのいずれかまたは両方をトランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Invitrogen）を用いて回収し、CTL活性アッセイのための標的細胞（5 x 104個細胞／ウェル）として使用した。
結果
HLA-A * 1101拘束性のVEGFR2由来予測ペプチドによるCTLの誘導
　VEGFR2由来のペプチドに対するCTLを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。IFN-γ ELISPOTアッセイによって、ペプチド特異的なCTL活性を測定した。表1および表2に示されるペプチドのうち、対照ウェルと比較して強力なIFN-γ産生を示すペプチドがいくつか見出された。一方、他のペプチドは、HLA-A*1101との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドでの刺激によっては、特異的なCTL活性が測定されなかった。IFN-γ ELISPOTアッセイにおける陽性データと陰性データの典型例を図1に示す。
HLA-A * 3303拘束性のVEGFR2由来予測ペプチドによるCTLの誘導
　VEGFR2由来のペプチドに対するCTLを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。IFN-γ ELISPOTアッセイによって、ペプチド特異的なCTL活性を測定した。表3および表4に示されるペプチドのうち、対照ウェルと比較して強力なIFN-γ産生を示すペプチドがいくつか見出された。一方、表3および表4に示される他のペプチドは、HLA-A*3303との結合活性を有する可能性があるにもかかわらず、それらのペプチドでの刺激によっては、特異的なCTL活性が測定されなかった。IFN-γ ELISPOTアッセイにおける陽性データと陰性データの典型例を図2に示す。
HLA-A * 1101拘束性のVEGFR2由来ペプチドに対するCTL株およびクローンの樹立
　IFN-γ ELISPOTアッセイにおいてペプチド特異的CTL活性を示した細胞を増殖させ、CTL株を樹立した。これらのCTL株のCTL活性をIFN-γ ELISAアッセイによって測定した。VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）、VEGFR2-A11-10-278（配列番号：44）（o）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（p）で誘導したCTL株は、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なIFN-γ産生を示した（図3）。さらに、CTL株から限界希釈によってCTLクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するCTLクローンからのIFN-γ産生をIFN-γ ELISAアッセイによって測定した。VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）、VEGFR2-A11-9-863（配列番号：2）（b）、VEGFR2-A11-9-521（配列番号：3）（c）、VEGFR2-A11-9-973（配列番号：4）（d）、VEGFR2-A11-9-309（配列番号：5）（e）、VEGFR2-A11-9-860（配列番号：9）（f）、VEGFR2-A11-9-134（配列番号：15）（g）、VEGFR2-A11-9-195（配列番号：26）（h）、VEGFR2-A11-9-502（配列番号：27）（i）、VEGFR2-A11-9-1281（配列番号：39）（j）、VEGFR2-A11-10-576（配列番号：40）（k）、VEGFR2-A11-10-397（配列番号：41）（l）、VEGFR2-A11-10-308（配列番号：42）（m）、VEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（n）およびVEGFR2-A11-10-972（配列番号：45）（o）で刺激したCTLクローンから強力なＩＦＮ-γ産生が測定された（図4）。
HLA-A ＊ 3303拘束性のVEGFR2由来ペプチドに対するCTL株およびクローンの樹立
　IFN-γ ELISPOTアッセイにおいてペプチド特異的CTL活性を示した細胞を増殖させ、CTL株を樹立した。これらのCTL株のCTL活性をIFN-γ ELISAアッセイによって測定した。VEGFR2-A33-9-823（配列番号：87）（a）、VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（b）、VEGFR2-A33-9-214（配列番号：90）（c）、VEGFR2-A33-9-577（配列番号：21）（d）、VEGFR2-A33-10-213（配列番号：104）（e）、VEGFR2-A33-10-97（配列番号：83）（f）、VEGFR2-A33-10-576（配列番号：40）（g）、VEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（h）およびVEGFR2-A33-10-1046（配列番号：114）（i）で誘導したCTL株は、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なIFN-γ産生を示した（図5）。さらに、CTL株から限界希釈によってCTLクローンを樹立し、ペプチドをパルスした標的細胞に対するCTLクローンからのIFN-γ産生をIFN-γ ELISAアッセイによって測定した。VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（a）、VEGFR2-A33-9-214（配列番号：90）（b）、VEGFR2-A33-9-577（配列番号：21）（c）、VEGFR2-A33-10-213（配列番号：104）（d）、VEGFR2-A33-10-97（配列番号：83）（e）、VEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（f）およびVEGFR2-A33-10-1046（配列番号：114）（g）で刺激したCTLクローンから強力なＩＦＮ-γ産生が測定された（図6）。
VEGFR2およびHLA-A ＊ 1101を発現する標的細胞に対する特異的CTL活性
　HLA-A＊1101拘束性ペプチドに対して樹立されたCTL株およびCTLクローンを、VEGFR2およびHLA-A＊1101分子を発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。全長VEGFR2およびHLA-A＊1101遺伝子の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞（VEGFR2およびHLA-A＊1101遺伝子を発現する応答細胞の特異的モデル）を刺激細胞として調製した。全長VEGFR2またはHLA-A＊1101のいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）（a）およびVEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）（b）で刺激したCTL株およびCTLクローンが、VEGFR2およびHLA-A＊1101の両方を発現するCOS7細胞に対して強力なCTL活性を示した。一方、対照細胞に対して有意な特異的CTL活性は検出されなかった（図7）。これらのデータにより、VEGFR2-A11-9-319（配列番号：1）およびVEGFR2-A11-10-159（配列番号：43）が、VEGFR2の内因的プロセシングにより生じるペプチドであり、かつHLA-A＊1101分子とともに標的細胞上に提示されてCTLによって認識されることが明確に実証される。これらの結果は、VEGFR2に由来するこれらのペプチドが、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患の治療および／または予防のためのワクチンとして適していることを示し、特にHLA-A11陽性患者に対して有用性が高いことを示す。
VEGFR2およびHLA-A ＊ 3303を発現する標的細胞に対する特異的CTL活性
　HLA-A＊3303拘束性ペプチドに対して樹立されたCTL株およびCTLクローンを、VEGFR2およびHLA-A＊3303分子を発現する標的細胞を認識する能力に関して調べた。全長VEGFR2およびHLA-A＊3303遺伝子の両方をトランスフェクトしたCOS7細胞（VEGFR2およびHLA-A＊3303遺伝子を発現する応答細胞の特異的モデル）を刺激細胞として調製した。全長VEGFR2またはHLA-A＊3303のいずれかをトランスフェクトしたCOS7細胞を対照として調製した。VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）（a）およびVEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）（b）が、VEGFR2およびHLA-A＊3303の両方を発現するCOS7細胞に対して強力なCTL活性を示した。一方、対照細胞に対して有意な特異的CTL活性は検出されなかった（図8）。これらのデータにより、VEGFR2-A33-9-114（配列番号：89）およびVEGFR2-A33-10-113（配列番号：70）が、VEGFR2の内因的プロセシングにより生じるペプチドであり、かつHLA-A＊3303分子とともに標的細胞上に提示されてCTLによって認識されることが明確に実証される。これらの結果は、VEGFR2に由来するこれらのペプチドが、VEGFR2発現に関連する血管新生により媒介される疾患の治療および／または予防のためのワクチンとして適していることを示し、特にHLA-A33陽性患者に対して有用性が高い示す。
抗原ペプチドの相同性解析
　上記の試験においてペプチド特異的なCTL活性を誘導したペプチドは、ヒト免疫系を感作する他の分子と相同な配列を有しているためにCTL活性を誘導できた可能性がある。この可能性を排除するために、BLASTアルゴリズム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて、これらのペプチドの配列をクエリーとして相同性解析を行った。その結果、これらのペプチドの配列に対して有意な相同性を有する配列は認められなかった。したがって、これらのペプチドが、VEGFR2とは関連のない分子に対して意図しない免疫応答を引き起こす可能性はほとんどないと考えられる。結論として、これらのペプチドは、副作用なく免疫療法に使用し得ることが示された。
　本発明は、異常な血管新生を伴う疾患部位の血管内皮細胞に対して、強力かつ特異的な免疫応答を誘導することができ、血管新生により媒介される幅広い種類の疾患に対する適用性を有し得る、VEGFR2由来の新規ペプチドを提供する。このようなペプチドは、VEGFR2に関連した血管新生により媒介される疾患に対するペプチドワクチンとして有用であり得、そのような疾患の例には、各種がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症：加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫など）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、およびアテローム性動脈硬化などが含まれるが、これらに限定されない。

Claims (24)

  1. 　以下の群より選択されるアミノ酸配列を含む、細胞障害性T細胞（CTL）誘導能を有する15アミノ酸未満のペプチド：
    （a）配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列；および
    （b）配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列において、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列。
  2. 　配列番号：1～5、9、15、26、27および39～45からなる群より選択されるアミノ酸配列において、以下の（a）～（d）から選択される1以上の置換を有する、請求項1記載のペプチド：
    （a）N末端から2番目のアミノ酸が、スレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；
    （b）N末端から３番目のアミノ酸が、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンおよびアラニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；
    （c）N末端から７番目のアミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；および
    （d）Ｃ末端のアミノ酸が、リジンおよびアルギニンに置換されている。
  3. 　配列番号：21、40、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列において、以下の（a）～（c）から選択される1以上の置換を有する、請求項1記載のペプチド：
    （a）N末端から1番目のアミノ酸が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；
    （b）N末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている；および
    （c）C末端のアミノ酸が、アルギニンおよびリジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている。
  4. 　配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1記載のペプチド。
  5. 　請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  6. 　薬学的に許容される担体と、以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む組成物：
    （a）請求項1～4のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
    （b）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
    （c）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
    （d）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
    （e）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
  7. 　CTLを誘導するための組成物であって、以下の（a）～（d）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む、請求項6記載の組成物：
    （a）請求項1～4のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
    （b）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
    （c）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；および
    （d）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム。
  8. 　薬学的組成物である、請求項6記載の組成物。
  9. 　（i）血管新生により媒介される疾患の治療、（ii）血管新生により媒介される疾患の予防、および（iii）血管新生により媒介される疾患の術後の再発の予防からなる群より選択される1以上の用途ための薬学的組成物である、請求項8記載の組成物。
  10. 　血管新生により媒介される疾患の疾患部位において、血管新生を阻害するための薬学的組成物である、請求項8記載の組成物。
  11. 　血管新生により媒介される疾患が、がん、脈絡膜における血管新生に関連する疾患（新生血管黄斑症）、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、およびアテローム性動脈硬化である、請求項9または10記載の組成物。
  12. 　脈絡膜における血管新生に関連する疾患が、加齢黄班変性症、近視性黄斑変性症、網膜色素線条症、中心性滲出性網脈絡膜症、種々の網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、コロイデレミア、脈絡膜骨腫である、請求項11記載の組成物。
  13. 　がんの増殖または転移を抑制するために使用される、請求項11記載の組成物。
  14. 　HLA-A11陽性またはHLA-A33陽性である対象への投与のために製剤化される、請求項6～13のいずれか一項記載の組成物。
  15. 　以下からなる群より選択される段階を含む、CTL誘導能を有するAPCを誘導する方法：
    （a）APCを、請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階、および
    （b）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階。
  16. 　以下からなる群より選択される段階を含む、CTLを誘導する方法：
    （a）CD8陽性Ｔ細胞を、HLA抗原と請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPCと共培養する段階、
    （b）CD8陽性Ｔ細胞を、HLA抗原と請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階、および
    （c）細胞表面上にHLA抗原により提示された請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドに結合し得るＴ細胞受容体（TCR）の各サブユニットをコードするポリヌクレオチドをCD8陽性Ｔ細胞に導入する段階。
  17. 　HLA抗原と請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するAPC。
  18. 　請求項15記載の方法によって誘導される、請求項17記載のAPC。
  19. 　請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
  20. 　請求項16記載の方法によって誘導される、請求項19記載のCTL。
  21. 　以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む組成物を対象に投与する段階を含む、血管新生により媒介される疾患の疾患部位における血管新生を阻害する方法：
    （a）請求項1～4のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
    （b）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
    （c）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
    （d）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
    （e）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
  22. 　以下の（a）～（e）からなる群より選択される少なくとも1つの有効成分を含む組成物を対象に投与する段階を含む、血管新生により媒介される疾患を治療および／もしくは予防する、ならびに／または術後のその再発を予防する方法：
    （a）請求項1～4のいずれか一項記載の1種類もしくは複数種のペプチド；
    （b）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを発現可能な形態でコードする1種類もしくは複数種のポリヌクレオチド；
    （c）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示する抗原提示細胞（APC）；
    （d）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドとHLA抗原との複合体を自身の細胞表面上に提示するエキソソーム；および
    （e）請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドを標的とするCTL。
  23. 　請求項1～4のいずれか一項記載のペプチドに結合する抗体。
  24. 　CTL誘導能を有するペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
    （a）配列番号：1～5、9、15、21、26、27、39～45、70、83、87、89、90、104および114の中から選択されるアミノ酸配列からなる元のアミノ酸配列に対して、1個、2個、または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる候補配列を作成する段階；
    （b）（a）で作成した候補配列の中からVEGFR2以外のいかなる公知のヒト遺伝子産物とも有意な相同性（配列同一性）を有さない候補配列を選択する段階；
    （c）（b）で選択した候補配列からなるペプチドと、APCとを接触させる段階；
    （d）（c）のAPCとCD8陽性T細胞とを接触させる段階；および
    （e）元のアミノ酸配列からなるペプチドよりも同等かまたはより高いCTL誘導能を有するペプチドを選択する段階。
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