WO2015059040A1 - Verfahren zur detektion und quantifizierung von einer einzelsträngigen ziel-nukleinsäure - Google Patents

Verfahren zur detektion und quantifizierung von einer einzelsträngigen ziel-nukleinsäure Download PDF

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WO2015059040A1
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target nucleic
nucleic acid
reporter
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Walter Gumbrecht
Stefan Hofmann
Yiwei Huang
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Siemens Corp
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Siemens AG
Siemens Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection and quantification of at least one single-stranded target nucleic acid.
  • the expression of genes in cells is tightly controlled and is re ⁇ guliert through various molecular processes.
  • mechanisms at the post-transcriptional level that is, at the level of mRNA, also play an important role.
  • short, noncoding nucleic acid molecules can interfere with gene expression by attaching highly specific to complementary sequences of mRNA molecules and thereby regulating the translation of the mRNA into the corresponding protein.
  • the short nucleic acid molecules are often called.
  • MicroRNAs short "miRNAs"
  • No. 6,344,316 describes a method for detecting nucleic acids, in which an immobilized capture oligonucleotide is covalently linked to a second, labeled oligonucleotide after the oligonucleotides have attached to the nucleic acid to be detected as a complementary strand. After removal of the nucleic acid to be detected by washing at high temperature, the covalently bound label remains. From the prior art, various problems arise. For example, the specificity and sensitivity of miRNA detection are inadequate. Among other things, in hybridization-based methods, the low specificity is that no complete hybridization of the miRNA is required for the identification process.
  • the miRNAs Because of the clotting ⁇ gen sensitivity of the method, the miRNAs often have to be amplified before their detection. This can lead to the incorporation of defective nucleotides, so that the specificity of miRNA detection is further limited. The procedures must also be performed at low temperatures because the short length of miRNA hybrids is associated with low melting temperatures. Thus, the miRNA detection is not particularly robust yet quantitatively ⁇ cycled. In addition, many methods require pre-analytical labeling of miRNA, which entails the risk of inaccurate results and artifacts. The invention is therefore based on the object of providing a method which solves these problems.
  • the inventive method for the detection and quantification ⁇ tion of at least one single-stranded target nucleic acid comprising the steps of: providing at least one solid support is immobi ⁇ lformat on the at least one capture oligonucleotide, bringing into contact the carrier at a first hybridization condition by at least one Jacobstrang- oligonucleotide and at least one single-stranded target nucleic acid, the complementary strand oligonucleotide comprising an oligonucleotide sequence at least partially complementary to the capture oligonucleotide, an oligonucleotide sequence complementary to the target nucleic acid and a
  • Oligonucleotide sequence at least partially complementary to a reporter oligonucleotide to the catcher oligonucleotide at least in sections, and the target nucleic acid with the complementary strand oligonucleotide to hybridize ⁇ Sieren, so that a first end of the target nucleic acid and a free end of the catcher Oligonukleotids with adjacent Nuk ⁇ leotiden the Jacobstrang oligonucleotide base pairs form the.
  • target nucleic acid refers to a single-stranded nucleic acid having a length of about 10 to about 50 nucleotides.
  • the nucleic acid can be a RNA or DNA.
  • Preferred naturally occurring nucleic acids are so-like chemically synthesized or recombinantly produced nucleic ⁇ leinklaren as the target nucleic acid.
  • the solid support is a chip, preferably a silicon chip.
  • Silicon chips can be cost Herge ⁇ provides and offer the possibility Elemen ⁇ te such as electrodes, temperature sensors, or cooling and heating elements easy to integrate additional on-chip.
  • At least one electrode preferably a gold electrode, is integrated on the surface of the carrier.
  • Oligonucleotides can be easily immobilized on gold surfaces.
  • the electrode can be used for electrochemical readout of the label, in particular for measuring current.
  • the solid support has a temperature control and / or a temperature sensor. Thus, a temperature of the solid support can be adjusted or measured.
  • the solid support comprises cooling and / or heating elements for cooling or heating the support.
  • the term encompasses both single-stranded and double-stranded nucleic acids
  • the term encompasses both RNA molecules, so-called oligoribonucleotides, and DNA molecules, so-called oligodeoxyribonucleotides
  • the catcher oligonucleotide comprises an oligonucleotide
  • Sequence which is at least partially complementary to the complementary strand oligonucleotide is at least partially complementary to the complementary strand oligonucleotide.
  • the portion of the capture oligonucleotide whose sequence is complementary to the complementary strand oligonucleotide preferably has a length of up to about 30 nucleotides.
  • the capture oligonucleotide is a single-stranded capture oligonucleotide. In a preferred embodiment, the capture oligonucleotide is an oligodeoxyribonucleotide.
  • the capture oligonucleotide is immobilized on the support via a thiol group.
  • the scavenger oligonucleotide via a spacer to the carrier is immobili ⁇ Siert.
  • the use of the spacer enables efficient hybridization of the capture oligonucleotide with the counter ⁇ strand oligonucleotide.
  • the spacer is preferably made
  • Constructed thymidine nucleotides It can be immobilized on the support via a thiol group.
  • the carrier is then brought into contact with at least one counterstrand oligonucleotide and at least one single-stranded target nucleic acid in a first hybridization condition.
  • the counterstrand oligonucleotide is a single-stranded one
  • An oligonucleotide which comprises at least the following oligonucleotide sequences: an oligonucleotide sequence which is at least partially complementary to the capture oligonucleotide, an oligonucleotide sequence which is complementary to the target nucleic acid, and an oligonucleotide sequence which is at least partially complementary to the reporter oligonucleotide.
  • the capture oligonucleotide and the reporter oligonucleotide can each hybridize at least in sections and the target nucleic acid with the complementary strand oligonucleotide.
  • the portions of the complementary strand oligonucleotide whose sequences are complementary to the capture oligonucleotide or the reporter oligonucleotide preferably each have a length of up to about 30 nucleotides.
  • hybridize refers to the attachment of a single-stranded RNA or DNA to an at least partially complementary single-stranded RNA or DNA with formation of ⁇ hydrogen bonds between the respective complementary bases, so that in the mutually complementary section between the two nucleic acid molecules bases
  • base pairing encompasses both Watson-Crick base pairings and non-Watson-Crick base pairings such as the so-called wobble base pairing.
  • a typical wobble base pairing is a base pairing of guanine with uracil, which may be formed, for example, upon attachment of a DNA to an RNA.
  • the oligonucleotide sequence of the complementary strand oligonucleotide is complementary to the target nucleic acid is fully complementary to the target nucleic acid.
  • the target nucleic acid can completeness, ⁇ dig hybridize to the opposite strand oligonucleotide.
  • ⁇ fully continuous annealing means that each base of the target nucleic acid forms a base pair with the Martinezstrang- oligonucleotide and thus not a single base mismatch is present.
  • the oligonucleotide sequence of the complementary strand oligonucleotide which is at least partially complementary to the capture
  • Oligonucleotide is immediately adjacent to the oligonucleotide sequence which is complementary to the target nucleic acid.
  • the first end of the target nucleic acid and the free end of the capture oligonucleotide with immediately adjacent adjacent nucleotides of the complementary strand oligonucleotide form base pairs.
  • the ends of the capture oligonucleotide to be ligated and the target nucleic acid are arranged adjacent and can be directly ligated together without a previous Auf Shel ⁇ len of missing nucleotides. Because missing nucleotides for ligating the capture oligonucleotide with the target nucleic acid need not be replenished, the method can be carried out particularly easily and quickly.
  • oligonucleotide sequence of the complementary strand oligonucleotide which is complementary to the target nucleic acid, immediately adjacent to the oligonucleotide sequence which is at least partially complementary to the reporter oligonucleotide.
  • the target nucleic acid is completely complementary to the corresponding one
  • Oligonucleotide sequence of the counterstrand oligonucleotide so that the target nucleic acid can be detected and / or quantified highly specific.
  • hybridization condition refers to at least one parameter or combination of parameters is performed to / of the at least one of the steps of hybridisation Ver ⁇ driving.
  • the hybridization condition is a condition in which the capture oligonucleotide, the target nucleic acid and / or the reporter oligonucleotide anneal to the respective complementary portions of the opposite strand oligonucleotide to form base pairings.
  • the parameters preferably include a temperature, a salt concentration, an ionic strength, a pH and / or an addition of reagents such as formamide.
  • the hybridization condition is in particular a tempera ⁇ ture.
  • the first hybridization condition is Hybridleitersbe ⁇ dingung, wherein the capture oligonucleotide at least from ⁇ hybridize section-wise and the target nucleic acid with the complementary to each portions of the opposite strand oligonucleotide.
  • the first hybridization condition is preferably selected depending on the sequence and the length of the capture oligonucleotide and the target nucleic acid. The choice of the first hybridization condition can furthermore depend on whether the capture oligonucleotide, the complementary strand oligonucleotide or the target nucleic acid are RNA and / or DNA molecules.
  • the first hybridization condition comprises a temperature of 40 ° C to 45 ° C, more preferably a temperature of 45 ° C, at 66 mM Tris / HCl pH 7.6; 50 mM NaCl; 10 mM MgCl 2 ; 1 mM dithiothreitol (DTT); 1 mM adenosine triphosphate (ATP); 7.5% PEG6000 and 1 mg / ml Rin ⁇ derserumalbumin (BSA).
  • the method of the invention further comprises ligating the first end of the target nucleic acid to the free end of the capture oligonucleotide to covalently attach the target nucleic acid to the capture oligonucleotide.
  • the terms "Ligie ⁇ ren” and “ligation” refers to the formation of a covalent chemical bond between two single th Oligonucleotides on their sugar-phosphate backbone.
  • Loading ⁇ handle comprises linking the 3 '-hydroxyl-end single-stranded RNA or DNA to the 5' phosphoryl-end of a second RNA or DNA, is also includes a ligation of RNA and DNA.
  • the production of the covalent bond can be cataly ⁇ by enzymes, the so-called ligases, preferably DNA ligases, and is ATP-dependent.
  • the method according to the invention further comprises incubating the carrier in a first reaction condition such that the target nucleic acid remains bound to the carrier only in the presence of scavenger oligonucleotide ligated at its first end and the counterstrand oligonucleotide only in the presence of a target nucleic acid, which is complementary to the corresponding oligonucleotide sequence of the opposite strand oligonucleotide and ligated to the free end of the capture oligonucleotide remains bound to the support.
  • reaction condition denotes at least one parameter or a combination of parameters in which at least one of the incubation steps of the method is carried out.
  • the reaction condition is a suitable condition for the melting of base pairings of capture oligonucleotide, target nucleic acid reporter oligonucleotide and Jacobstrang- oligonucleotide.
  • the parameters preferably comprise a Tem ⁇ temperature, salt concentration, ionic strength, a pH and / or addition of reagents such as formamide.
  • the reaction condition is in particular a temperature.
  • the first reaction condition is the reaction condition in which base pairing of the counterstrand oligonucleotide with the scavenger oligonucleotide and base pairing of the counterstrand oligonucleotide with the target nucleic acid melts if the target nucleic acid does not bind to the corresponding oligonucleotide sequence of the counterstrand oligonucleotide complementary is. In this case, the hydrogen bonds between the respective paired bases are abolished and the counterstrand oligonucleotide dissolves from the carrier.
  • the target nucleic acid is also not ligated at its first end with the capture oligonucleotide, so that the target nucleic acid also dissolves on incubation of the carrier in the first reac ⁇ tion condition of the carrier.
  • the first reaction condition comprises a higher temperature and / or a lower ionic strength than the first hybridization condition. This facilitates the breaking of the hydrogen bonds between the respective paired bases in the second reaction condition.
  • the first reaction condition comprises a temperature of 45 ° C to 55 ° C, more preferably a temperature of 50 ° C, at 20 mM Tris / HCl pH 7.6 and 20 mM NaCl.
  • the support is then contacted in a second hybridization condition with at least one reporter oligonucleotide in contact in order to hybridize the oligonucleotide Re ⁇ porter at least in sections with the common gene Trang oligonucleotide.
  • the reporter oligonucleotide comprises an oligonucleotide sequence that is least ⁇ min in sections complementary to the oligonucleotide Jacobstrang-.
  • the portion of the reporter Oligonukleo- TIDS whose sequence is complementary to the Martinezstrang- oligonucleotide preferably has a length of up to 30 nucleotides et ⁇ wa.
  • the reporter oligonucleotide is a single-stranded reporter oligonucleotide.
  • the reporter oligonucleotide is an oligodeoxyribonucleotide.
  • the second hybridization condition is hybridization ⁇ condition, wherein the reporter oligonucleotide at least section-wise from ⁇ hybridizes to the complementary portion of the Ge ⁇ gens Trang oligonucleotide.
  • the second hybridization s istsbedingung is preferably selected depending on the Se acid sequence and the length of the reporter oligonucleotide.
  • the choice of the second hybridization condition may further depend on whether the reporter oligonucleotide and the counterstrand oligonucleotide are RNA and / or DNA molecules.
  • the second hybridization condition may be the same as the first hybridization condition.
  • the second hybridization condition comprises a temperature of 35 ° C at 66 mM
  • the ends of the target nucleic acid and the reporter oligonucleotide to be ligated are arranged adjacent and can be directly ligated together without a previous Auf Shel ⁇ len of missing nucleotides. Because missing nucleotides for ligating the Reporting ter oligonucleotide with the target nucleic acid be ⁇ do not have to be filled, the method can be carried out particularly easily and quickly.
  • the reporter oligonucleotide has a label.
  • label refers to a property that can be used for indicating the presence of Re ⁇ porter oligonucleotide on the support of Repor ⁇ ter-oligonucleotide.
  • the label is preferably a reporter molecule, the di- is directly or indirectly connected to the reporter oligonucleotide and can generate a readable signal.
  • the reporter molecule may be attached to a second end of the reporter oligonucleotide.
  • the reporter molecule may also be linked to the reporter oligonucleotide between the two ends of the reporter oligonucleotide, for example bound to a base.
  • the label is a portion of the reporter oligonucleotide that is an adapter. At least one reporter molecule is attached directly or indirectly to the adapter in one or more subsequent steps.
  • the adapter is a universal one ⁇ set oligonucleotide sequence.
  • the method of the invention further comprises ligating the second end of the target nucleic acid to the first end of the reporter oligonucleotide to covalently attach the target nucleic acid to the reporter oligonucleotide.
  • the method of the invention further comprises incubating the carrier under a second reaction condition such that the reporter oligonucleotide remains attached to the carrier only in the presence of target nucleic acid ligated at both ends thereof.
  • the second reaction condition is the reaction condition in which the base pairing of the counterstrand oligonucleotide with the capture oligonucleotide, the target nucleic acid and the Repor ⁇ ter oligonucleotide is melted.
  • the second reaction condition may be the same as the first reaction condition.
  • the second reaction condition comprises a higher temperature and / or a lower ionic strength than the second hybridization condition. This facilitates the breaking of the hydrogen bonds between the respective paired bases in the second reaction condition.
  • the second reaction condition comprises a temperature of 55 ° C at 2 mM Tris / HCl pH 7.6 and 2 mM NaCl.
  • the counterstrand oligonucleotide dissolves from the carrier by dissociating from the capture oligonucleotide, the target nucleic acid, and the reporter oligonucleotide.
  • the counterstrand oligonucleotide remains on the support.
  • the second reaction condition preferably has a lower temperature and / or a higher ionic strength than the reaction condition in which the counterstrand oligonucleotide dissolves from the support. Due to a power ⁇ profit by the two ligations the presence of the opposite strand oligonucleotide affects the scavenger with the oligonucleotide, the target nucleic acid and the reporter
  • Oligonucleotide is linked by base pairings, energetically stabilizing. Stabilization allows reading of the label on the support under milder conditions compared to the absence of the opposite strand oligonucleotide.
  • the inventive method further comprises reading the label of the reporter oligonucleotide on the carrier. With the presence of the label on the support will have verified that the the target nucleic acid was ligated at both their ends, the first end of the target nucleic acid with the free end of the capture oligonucleotide and the second de En ⁇ the target Nucleic acid with the first end of the reporter Oligonucleotide was ligated. Since the reporter oligonucleotide remains attached to the support only in the presence of target nucleic acid ligated at its both ends, by detecting the label of the reporter oligonucleotide on the support, the target nucleic acid is detected. The detection of the label on the support can also serve to quantify the target nucleic acid.
  • step b) is combined with step c) and / or step e) with step f).
  • the reagents required for ligation such as, for example, ligase, can be supplied to the carrier in step b) or step e).
  • step b) and step c) and / or step e) and step f) take place successively.
  • An advantage of the method according to the invention is that the target nucleic acid is directly detected and / or quantified. In particular, it is not necessary to chemically or enzymatically modify the target nucleic acid. Since certain target nucleic acids preferentially undergo modification, the quantification of modified target nucleic acids can lead to inaccurate results. These inaccuracies are avoided by the direct detection of the target nucleic acid. Furthermore, artifacts that may occur when modifying the target nucleic acid are avoided.
  • the inventive method is very sensitive, so that even small amounts of the target nucleic acid can be detected can. Thus it is not necessary to amplify the target nucleic acid prior to the identification, so that also incorporated false nucleotides in the target nucleic acid ⁇ to. This increases the specificity of the process.
  • the inventive method has the fact that both En ⁇ the target nucleic acid involved in their identification, a high selectivity.
  • the reporter oligonucleotide is covalently bound to the carrier via the target nucleic acid and the capture oligonucleotide.
  • the detection of the labeling of the reporter oligonucleotide is independent of the sequence and the length of the oligonucleotides and the target nucleic acid leading to the temperature dependence of the investment ⁇ tion of reporter oligonucleotide, target nucleic acid and Desin ⁇ ger oligonucleotide to the opposite strand Oligonucleotide lead.
  • the reading of the mark can be carried out even under conditions in which stable base pairing is not possible.
  • the readout of the marking can be carried out under optimum conditions, for example with a readout temperature and / or readout ion strength optimally adapted to the type of marking used, without it being necessary to look for a stable base pairing.
  • non-specific background signals are reduced and a highly sensitive reading of the marking is made possible. This contributes to the high sensitivity of the process.
  • the stably covalent binding of the reporter oligonucleotide to the carrier enables a robust and quantitatively evaluable reading of the label.
  • a further advantage of the method according to the invention is that the counterstrand oligonucleotide remains connected to the carrier in step d) only in the presence of a target nucleic acid which is complementary to the corresponding oligonucleotide sequence of the complementary strand oligonucleotide. This prevents the reaction added in step e) from occurring. 1 b
  • porter oligonucleotide to a complementary strand oligonucleotide anla ⁇ siege to which no target nucleic acid is hybridized The linkage of reporter oligonucleotide to such a " ⁇ negati ves" complementary strand oligonucleotide can be difficult to completely ge ⁇ dissolves even by washing of the carrier at high temperature.
  • the resulting non-specific signals ⁇ the prevented by the removal of the complementary strand oligonucleotides to which no complementary target nucleic acid is hybridized, from the carrier before the carrier is brought into contact with the reporter oligonucleotide. This increases the specificity of the process.
  • the carrier prior to step c) and / or in step d) and / or before step f) and / or in step g) and / or before step h), the carrier is additionally washed.
  • the washing removes unbound nucleic acids, unbound reporter oligonucleotides and / or dissolved counterstrand oligonucleotides from the support. This especially prevents the reverse strand oligonucleotide from being rearranged onto a free capture oligonucleotide on the support to which no target nucleic acid has been ligated, and prevents the reporter oligonucleotide from being attached to this complementary strand oligonucleotide during readout of the label. This increases the specificity of the detection of the label on the support and thus the specificity of the detection of the target nucleic acid.
  • the washing of the carrier before step c) takes place under a stringent reaction condition.
  • stringent reaction condition refers to a reaction condition under which only fully hybridized target nucleic acid ver ⁇ connected remains with the counter-strand oligonucleotide, while the target nucleic acid molecules, the sequence of one or more base mismatches with respect to the corresponding oligonucleotide Sequence of the counter-strand
  • Oligonucleotide having lö ⁇ sen from the opposite strand oligonucleotide Washing the support in a stringent reaction condition prior to ligating the first end of the target Nucleic acid with the free end of the capture oligonucleotide enhances the specificity of the method.
  • the first reaction condition is a stringent reaction condition.
  • the target nucleic acid in step d) only completely remains connected to the target nucleic acid in step d) with the target nucleic acid hyb ⁇ ridinstrumentes strand oligonucleotide, while Jacobstrang- oligonucleotides to a target nucleic acid molecules is ised hybri-, the sequence of one or more base-
  • the target nucleic acid is an RNA, preferably a microRNA (miRNA).
  • miRNAs are noncoding, single-stranded RNAs about 17 to about 25 nucleotides in length that are effective in the post-transcriptional regulation of gene expression. MiRNAs highly specifically attach to complementary sequences of mRNA molecules, thereby regulating the translation of the mRNA into the corresponding protein.
  • the target nucleic acid is a single-stranded small interfering RNA (siRNA).
  • siRNAs small interfering RNA
  • the miRNAs and siRNAs can be involved in post-transcriptional regulation of gene expression by storing specifically to complementary sequences of mRNA molecules on and regulate the translation of the mRNA into the corresponding Pro ⁇ tein.
  • At least two different target nucleic acids are detected simultaneously, where ⁇ in the double strand generated in step c) has an identical melting point for all target nucleic acids.
  • Particularly preferred are 32 different target nucleic acids detected simultaneously. This can be detected on a common carrier, for example, in each ⁇ wells four replicates.
  • a different counterstrand oligonucleotide is used for each target nucleic acid. The counterstrand oligonucleotides differ at least in the
  • Oligonucleotide sequence that is complementary to the target nucleic acid.
  • Oligonucleotide sequence of the opposite strand oligonucleotide that is at least partially complementary to the catcher oligonucleotide and the sequence of the catcher oligonucleotide are selected such that the) it comprises in step c ⁇ witnessed duplex for all target nucleic acids a same melting temperature.
  • the double strand is formed by the portion of the capture oligonucleotide that is complementary to the corresponding portion of the opposite strand oligonucleotide and the target nucleic acid, which together with the Komple to each ⁇ mentary oligonucleotide sequences of Martinezstrang- oligonucleotide base pairs.
  • the term "same melting temperature” means that the melting Tempe ⁇ temperature of the double strand for different target nucleic acids by more than 4 ° C, preferably deviate from each other by more than 2 ° C. The same melt temperature is particularly before ⁇ Trains t an identical melting temperature.
  • Step e) perform at a uniform for all target nucleic acids chen ⁇ first reaction condition. This is a prerequisite for simultaneously detecting and / or quantifying (multiplexing) various target nucleic acids with high specificity simultaneously on a common carrier.
  • the counterstrand oligonucleotides also differ in the
  • Oligonucleotide sequence which is at least partially com ⁇ plementary to the reporter oligonucleotide and it is used for each target nucleic acid, a different reporter oligonucleotide.
  • the reporter oligonucleotides also differ in their labeling, so that the signals obtained when reading the labels can each be assigned to a specific target nucleic acid.
  • the reading out of the marking on the carrier takes place position-specifically in order to simultaneously detect and / or quantify different target nucleic acids.
  • Position-specific readout of the label also allows multiple samples to be analyzed with a single procedure.
  • the capture oligonucleotide and / or the reporter oligonucleotide is a chimeric oligonucleotide containing ribonucleotides and
  • chimeric oligonucleotides prevents the formation of secondary structures, which frequently occur in the case of pure oligoribonucleotides
  • the secondary structures are suitable both for the hybridization of the capture oligonucleotide or of the reporter oligonucleotide with the oligonucleotide and oligonucleotide in each case complementary sections of the complementary strand oligonucleotide as well as for their
  • a 3'-hydroxyl end of the chimeric oligonucleotide has at least one
  • Ribonucleotide preferably four ribonucleotides. If the 3'-hydroxyl end of the capture oligonucleotide or of the reporter oligonucleotide to be ligated with the 5'-phosphoryl end of the target nucleic acid has at least one ribonucleotide, in the event that the target nucleic acid is an RNA is done by RNA RNA ligation. For example, miRNAs have a 5'-phosphoryl end which, with the help of available ligases, is virtually absent from the 3'-hydroxyl end of a ligand
  • Oligodesoxyribonukleotids can be connected. By using chimeric oligonucleotides with a ribonucleotide at the 3'-hydroxyl end, ligation can be accomplished with the 5'-phosphoryl end of the miRNA.
  • T4 DNA ligase is used for the ligation.
  • T4 DNA ligase is an enzyme encoding the ATP-dependent ligation of a 3'-hydroxyl end of a first nucleic acid molecule to an immediately adjacent 5'-phosphoryl end of a second nucleic acid molecule in double-stranded DNA, RNA / DNA or catalyzes RNA molecules. This is a covalent
  • the ligation takes place at a ligation temperature.
  • the ligation temperature is in a range in which the ligase used has a high enzymatic activity.
  • the ligation temperature is preferably 35 ° C to 37 ° C, more preferably 37 ° C.
  • the counterstrand oligonucleotide is an oligodeoxyribonucleotide.
  • Oligodeoxyribonucleotides are more stable to oligoribonucleotides and rarely form secondary structures.
  • the backbone oligonucleotide, the capture oligonucleotide and the Reporter oligonucleotide Oligodesoxyribonukleotide, while the target nucleic acid is an RNA, so that at least partially RNA / DNA duplexes are formed in the Hybridi ⁇ tion, which are thermodynamically very stable.
  • the counterstrand oligonucleotide is an oligodeoxyribonucleotide and the target nucleic acid is an RNA, while the capture oligonucleotide and the reporter oligonucleotide are chimeric oligonucleotides having preferably at least one ribonucleotide at the 3'-hydroxyl end.
  • the backbone oligonucleotide comprises an oligonucleotide sequence that is completely complementary to the capture oligonucleotide, and / or an oligonucleotide sequence that is completely complementary to the reporter oligonucleotide.
  • the label is read by means of a "branched DNA” test: the “branched DNA” test (“branched DNA”), which is also known by the term “branched DNA assay” , is a signal amplification assay for amplifying the reporter signal.
  • branched DNA a so-called “preamplifier” is used, which hybridizes directly or indirectly to the target nucleic acid to be detected.
  • ampfiers in German: amplifiers
  • Preamplifier and “Amplifier” are short single-stranded oligodeoxyribonucleotides.
  • the "Amplifier” branched are oligodeoxyribonucleotides reporter molecules'm ⁇ .
  • the signal amplification is achieved by tying several "Amplifier” to a “preamplifier” and each
  • “Amplifier” typically binds multiple reporter molecules. By branching the “Amplifier” a high density of the “Amplifier” on the “Preamplifier” can be achieved, which leads to a high sensitivity of the branched DNA test. Thus, the use of the "branched DNA” test further increases the sensitivity of the method
  • DNA "test is also suitable for the detection of multiple Various ⁇ NEN target nucleic acids in a multiplex method.
  • the specificity and the reliability of the Detek- tion are preferably increased by combinatorial fluorescence.
  • the reporter oligonucleotide is a "preamplifier.”
  • the "amplifiers” hybridize directly to the reporter oligonucleotide, so that additional hybridization steps are omitted.
  • the reading out of the marking can be carried out particularly efficiently by means of the "branched DNA” test.
  • phosphorylation takes place from one end of the target nucleic acid, the capture oligonucleotide and / or the reporter oligonucleotide.
  • phosphorylation refers to attaching a phosphate moiety to the 5 'hydroxyl end of RNA or DNA, ligating two immediately adjacent ones
  • Oligonucleotides or nucleic acid molecules require a 5'-phosphoryl end to the second nucleic acid molecule.
  • the presence of a 5'-phosphoryl end of the second nucleic acid molecule depends inter alia on its synthesis.
  • a missing 5'-phosphoryl end can be added by the phosphorylation so that the capture oligonucleotide can be ligated to the target nucleic acid and the target nucleic acid to the reporter oligonucleotide.
  • the phosphorylation is an enzymatic phosphorylation.
  • the phosphorylation is carried out by bringing the phosphorylating moiety into contact. leküls with a T4 polynucleotide kinase.
  • Polynucleotide kinase is an enzyme that catalyzes the phosphorylation of 5 'hydroxyl ends of RNA or DNA molecules.
  • a second readout of the marking takes place on the carrier.
  • a reference value is obtained, while during the second readout of the marking a measured value is obtained.
  • the measured value is preferably ge in relation to the reference value is set ⁇ .
  • the reference value may be, for example, a measure of the number of capture oligonucleotides immobilized on the support. If fewer capture oligonucleotides are immobilized on a first support than on a second support, then both the reference value and the measured value of the first support are lower. Thus, a calibration of the individual carriers can be performed.
  • a quotient of the measured value and the reference value remains approximately constant for different numbers of immobilized capture oligonucleotides on different carriers. As a result, scatters of measured values obtained by different carriers can be eliminated. Thus, a better reproducibility and low ⁇ re standard deviations for the values obtained during the reading of the mark achieved.
  • the first readout and the second readout occur under the same reaction condition. This will ensure that the enzyme activity depends on the reaction condition, in particular depends on the temperature, is the same in the first and second readings.
  • the label of the reporter oligonucleotide is an enzyme, preferably a
  • thermostable esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius.
  • the esterase 2 is constructed from a single Prote ⁇ inkette and can therefore be coupled in a simple manner to the reporter oligonucleotide.
  • the enzyme is covalently linked to the reporter oligonucleotide.
  • the En ⁇ zym is stably connected to the reporter oligonucleotide and can not become detached due to washing operations or the changing temperatures of the reporter oligonucleotide.
  • reliable detection and quantitation of the target nucleic acid can be ensured.
  • the label is a fluorescent dye which is preferably covalently bound to the reporter oligonucleotide.
  • the use of the fluorescent dye allows a particularly simple and fast readout of the label. Furthermore, no substrate is required for readout, so that the method can be carried out particularly cost- effectively .
  • the label is read electrochemically. In an electrochemical readout, substrates are converted to redox-active reaction products at the label, which is preferably an enzyme, so that a current or a change in the voltage can be measured at an electrode.
  • the readout is carried out by redox cycling of p-aminophenol and quinoneimine.
  • the reading of the mark on the carrier takes place at a readout temperature.
  • the readout temperature is in a range in which the enzyme has a high enzymatic activity. If esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius is used as the label, then the readout temperature is preferably about 35 ° C.
  • the readout of the marking on the carrier takes place optically.
  • Optical readout of the mark is simple and inexpensive.
  • FIG. 1 shows the identification of a single-stranded target nucleic acid (9) by means of the inventive procedural ⁇ proceedings.
  • the target nucleic acid (9) is miDNA-96.
  • the miDNA-96 has a 5'-phosphoryl end and is a synthetically produced version of miRNA-96 DNA.
  • a silicon chip with two integrated gold electrodes as solid support (1) is used, on which a single-stranded capture oligonucleotide (5) is immobilized via a spacer (3).
  • the chip is first for 15 minutes at 35 ° C with a Blo ⁇ cktechniks gracefullyzes ( "The Blocking Solution” CANDOR Bioscience GmbH Wangen, Germany) incubated in order to saturate free binding sites ⁇ len on the surface of the chip.
  • the chip buffer 3 minutes at 45 ° C in a first washing, comprising 20 mM Tris / HCl pH 7.6 and 20 mM NaCl.
  • a first step of erfindungsge ⁇ MAESSEN method in which the chip at a hybridization temperature of 45 ° C. with 100 nM of complementary strand oligonucleotide (7) and 10 nM of miDNA-96 in a reaction buffer
  • the reaction buffer has 66 mM Tris / HCl pH 7.6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2; 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM adenosine triphosphate (ATP);.
  • oligonucleotide sequences 7.5% PEG6000 and 1 mg / ml bovine serum albumin ⁇ (BSA) on the opposite strand oligonucleotide (7) three oligonucleotide sequences arranged to be immediately adjacent to each other.
  • An oligonucleotide sequence is completely complementary to the capture oligonucleotide (5). This is followed by an oligonucleotide sequence which is completely complementary to miRNA-96. Since ⁇ up followed by a oligonucleotide sequence that is fully com plement ⁇ a reporter oligonucleotide (11).
  • the chip is incubated for 5 minutes at 45 ° C., so that the capture oligonucleotide (5) and the miDNA-96 completely hybridize with the respective complementary sections of the complementary strand oligonucleotide (7).
  • the arrangement of the oligonucleotide sequences on the counterstrand oligonucleotide (7) results in a lower end of the miDNA-96 and a free upper end of the capture oligonucleotide (5) each having contiguous nucleotides of the Hybridize to opposite strand oligonucleotide (7).
  • the chip is washed for 5 minutes at 45 ° C in the reaction buffer.
  • the chip is contacted with 100 units / ml T4 DNA ligase and incubated for 5 minutes at a ligation temperature of 35 ° C in the reaction buffer.
  • the T4 DNA ligase ligated together the adjacent ends of the catcher oligonucleotide (5) and the midna-96 in ei ⁇ ner first ligation (15). This covalently attaches the miDNA-96 at the lower end to the capture oligonucleotide (5).
  • the chip is then at a first reaction temperature of 50 ° C in the first
  • thermostable esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius covalently bound to the reporter oligonucleotide (11).
  • the chip is for Incubated for 5 minutes at 35 ° C, so that the reporter oligonucleotide (11) with the complementary portion of the complementary strand oligonucleotide (7) completely hybridized.
  • the arrangement of the leads As shown in Figure 1, the arrangement of the leads
  • Oligonucleotide sequences on the opposite strand oligonucleotide (7) cause an upper end of midna-96 and a lower end of the reporter oligonucleotide (11) with adjacent nuc ⁇ leotiden of the counter-strand oligonucleotide (7) hybridize.
  • the T4 DNA ligase in a second ligation (17) ligates the adjacent ends of the miDNA-96 and the reporter oligonucleotide (11) together. This covalently attaches the miDNA-96 to the reporter oligonucleotide (11) at the top.
  • the chip is then incubated at a second reaction temperature of 55 ° C in a second washing buffer containing 2 mM Tris / HCl pH 7.6 and 2 mM NaCl for 15 minutes.
  • a second washing buffer containing 2 mM Tris / HCl pH 7.6 and 2 mM NaCl for 15 minutes.
  • the reading is carried out electrochemically.
  • Esterase 2 para-aminophenol butyrate brought into contact.
  • the para-aminophenol butyrate flows over the chip and is converted by the esterase 2 into a reaction product (21) para-aminophenol, which is redox-active.
  • control (not shown in Figure 1) was used in parallel a control capture oligonucleotide and a control stranded oligonucleotide.
  • control counterstrand oligonucleotide comprises three oligonucleotide sequences arranged to immediately border one another. In this case, an oligonucleotide sequence is completely complementary to the control capture oligonucleotide. This is followed by an oligonucleotide sequence that is fully complementary to miRNA-21. This is followed by one
  • Oligonucleotide sequence that is fully complementary to the reporter oligonucleotide (11) and thus with the entspre ⁇ sponding oligonucleotide sequence of the oligonucleotide Jacobstrang- (7) coincide.
  • the miDNA-96 does not hybridize to the control counterstrand oligonucleotide upon incubation of the chip at 45 ° C, so that the current measured at the control will produce a nonspecific background signal on the control surface
  • Chip indicates.
  • a signal slope of 0.0061 nA / s was measured in this experiment, the standard deviation is 0.0124 ⁇ nA / s.
  • a conventional method for identifying miDNA-96 was performed under the same conditions.
  • the chip is contacted in one step with the opposite strand oligonucleotide (7), the miDNA-96 and the reporter oligonucleotide (11), and the first and second ligation (15, 17) also occur in egg ⁇ nem common step. This eliminates over the method of the invention the step of incubating the chip in a first reaction condition.
  • Figure 2 and Figure 3 show, the inventive method using a nucleic acid (23, 25), whose sequence only in sections with the sequence to be identi ⁇ filingerden midna-96 do not match or right ( Figure 2 and 3 respectively).
  • a nucleic acid (23, 25) is used as a negative control for the verification of the method according to the invention.
  • FIG. 2 shows that a nucleic acid (23) whose sequence does not correspond to the sequence of the miDNA-96, in which
  • the T4 DNA ligase can not ligate the free end of the capture oligonucleotide (5) to one end of the nucleic acid (23).
  • the backbone oligonucleotide (7) is released from the capture oligonucleotide (5). Due to the lacking counterstrand oligonucleotide (7), the reporter oligonucleotide (11) can not bind to the complementary strand oligonucleotide (7) in the subsequent step. As a result, the reporter oligonucleotide (11) becomes the second
  • Figure 3 shows that a nucleic acid (25), whose sequence from ⁇ sectionally match is consistent with the sequence of the midna-96, during the incubation of the carrier (1) in the hybridization temperature of 45 ° C in the portion corresponding to the sequence of miDNA-96 hybridized with the opposite strand oligonucleotide (7).
  • the first end of the nucleic acid (25) and the free end of the capture oligonucleotide (5) hybridize with adjacent nucleotides of the complementary strand oligonucleotide (7), so that in the next step, the T4 DNA ligase be ⁇ the adjacent ends of the capture oligonucleotide ( 5) and the nuc ⁇ leinkla (25) ligated together.
  • the nucleic acid ⁇ (25) covalently bound to the capture oligonucleotide (5) to.
  • the complementary strand oligonucleotide (7) from the capture oligonucleotide (5) and only partially hybridized nucleic acid (25) dissolves.
  • the nucleic acid (25) remains on the support (1) by the covalent bond to the capture oligonucleotide (5).

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9) beschrieben. Das Verfahren umfasst ein In-Kontaktbringen mindestens eines festen Trägers (1), auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid (5) immobilisiert ist, mit mindestens einem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) und mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9). Das Verfahren umfasst weiter ein Ligieren der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Fänger-Oligonukleotid (5), ein In-Kontaktbringen des Trägers (1) mit mindestens einem Reporter-Oligonukleotid (11), das eine Markierung (13) aufweist, und ein Ligieren der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Reporter-Oligonukleotid (11). Durch Auslesen der Markierung (13) des Reporter-Oligonukleotids (11) auf dem Träger (1) wird die Ziel-Nukleinsäure (9) detektiert.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von einer
einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel- Nukleinsäure . Die Expression von Genen in Zellen unterliegt einer strengen Kontrolle und wird durch vielfältige molekulare Prozesse re¬ guliert. Neben der komplexen Regulation der Transkription der Gene spielen auch Mechanismen auf der post-transkriptionalen Ebene, das heißt auf der Ebene der mRNA, eine wichtige Rolle. Insbesondere können kurze, nicht-kodierende Nukleinsäure- Moleküle in die Genexpression eingreifen, indem sie sich hochspezifisch an komplementäre Sequenzen von mRNA-Molekülen anlagern und dadurch die Translation der mRNA in das entsprechende Protein regulieren. Die kurzen Nukleinsäure-Moleküle sind häufig sog. microRNAs (kurz „miRNAs"), die in den letz¬ ten Jahren zunehmend das Interesse der molekularbiologischen und medizinischen Forschung geweckt haben. So konnte gezeigt werden, dass manche miRNAs in einem direkten Zusammenhang mit dem Entstehen bestimmter Krebserkrankungen wie Brustkrebs, Lungenkrebs oder Leukämie stehen. Dabei weisen die Krebszel¬ len eine erhöhte oder verminderte Anzahl spezifischer miRNAs auf. Auch bei immunologischen Erkrankungen, wie Rheuma, treten bestimmte miRNAs in veränderten Konzentrationen auf. Es wird davon ausgegangen, dass allein beim Menschen über 1000 verschiedene miRNA-Moleküle vorkommen.
Aufgrund der wachsenden Bedeutung und der Vielzahl von miRNAs werden Verfahren zu deren spezifischer Detektion und Quantifizierung benötigt. Es sind verschiedene Verfahren zum Nach- weis von miRNAs bekannt, beispielsweise die Sequenzierung der miRNAs oder die Amplifizierung von miRNAs mittels real-time PCR. Die US 6,322,971 beschreibt ein hybridisierungsbasiertes Ver¬ fahren zum Nachweis einer Nukleinsäure. Dabei wird die nach¬ zuweisende Nukleinsäure mit einer zweiten, markierten Nukle¬ insäure kovalent verbunden, nachdem sich die beiden Nuklein- säuren an ein immobilisiertes Gegenstrang-Oligonukleotid an¬ gelagert haben und fehlende Nukleotide zwischen der nachzu¬ weisenden und der markierten Nukleinsäure durch eine DNA- Polymerase aufgefüllt worden sind. Ungebundene markierte Nuk¬ leinsäuren werden durch Temperaturerhöhung entfernt.
Die US 6,344,316 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, bei dem ein immobilisiertes Fänger- Oligonukleotid mit einem zweiten, markierten Oligonukleotid kovalent verbunden wird, nachdem sich die Oligonukleotide an die nachzuweisende Nukleinsäure als Gegenstrang angelagert haben. Nach dem Entfernen der nachzuweisenden Nukleinsäure durch Waschen bei hoher Temperatur bleibt die kovalent gebundene Markierung zurück. Aus dem Stand der Technik ergeben sich verschiedene Probleme. Beispielsweise sind die Spezifität und die Sensitivität des miRNA-Nachweises unzureichend. Bei hybridisierungsbasierten Verfahren liegt die geringe Spezifität unter anderem daran, dass keine vollständige Hybridisierung der miRNA für den Identifizierungsprozess erforderlich ist. Aufgrund der gerin¬ gen Sensitivität der Verfahren müssen die miRNAs häufig vor ihrem Nachweis amplifiziert werden. Dabei kann es zu einem Einbau von fehlerhaften Nukleotiden kommen, so dass die Spezifität des miRNA-Nachweises noch weiter begrenzt wird. Die Verfahren müssen außerdem bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, weil die geringe Länge von miRNA-Hybriden mit niedrigen Schmelztemperaturen verbunden ist. Dadurch ist der miRNA-Nachweis weder besonders robust noch quantitativ aus¬ wertbar. Zudem ist für viele Verfahren ein prä-analytisches Markieren der miRNA notwendig, das die Gefahr von ungenauen Ergebnissen und von Artefakten mit sich bringt. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren, das diese Probleme löst, bereit zu stellen.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion und Quantifizie¬ rung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure umfasst die Schritte: Bereitstellen mindestens eines festen Trägers, auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid immobi¬ lisiert ist, In-Kontaktbringen des Trägers bei einer ersten Hybridisierungsbedingung mit mindestens einem Gegenstrang- Oligonukleotid und mindestens einer einzelsträngigen Ziel- Nukleinsäure, das Gegenstrang-Oligonukleotid umfassend eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid, eine Oligonukleotid-Sequenz komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure und eine
Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu einem Reporter-Oligonukleotid, um das Fänger- Oligonukleotid mindestens abschnittsweise und die Ziel- Nukleinsäure mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid zu hybridi¬ sieren, so dass ein erstes Ende der Ziel-Nukleinsäure und ein freies Ende des Fänger-Oligonukleotids mit benachbarten Nuk¬ leotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basenpaarungen bil- den. Es folgen die Schritte Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger- Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Fänger-Oligonukleotid zu binden, und Inkubieren des Trägers bei einer ersten Reaktionsbedingung derart, dass die Ziel- Nukleinsäure nur bei Gegenwart von an ihrem ersten Ende li- giertem Fänger-Oligonukleotid mit dem Träger verbunden bleibt und das Gegenstrang-Oligonukleotid nur bei Gegenwart einer Ziel-Nukleinsäure, die komplementär zu der entsprechenden Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids und an das freie Ende des Fänger-Oligonukleotids ligiert ist, mit dem Träger verbunden bleibt. Es folgen die Schritte In- Kontaktbringen des Trägers bei einer zweiten Hybridisierungs¬ bedingung mit mindestens einem Reporter-Oligonukleotid, das eine Markierung aufweist, um das Reporter-Oligonukleotid min¬ destens abschnittsweise mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid zu hybridisieren, so dass ein zweites Ende der Ziel-Nukleinsäure und ein erstes Ende des Reporter-Oligonukleotids mit benach- barten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basen¬ paarungen bilden, Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Reporter-Oli¬ gonukleotid zu binden, Inkubieren des Trägers bei einer zwei- ten Reaktionsbedingung derart, dass das Reporter-Oligonu¬ kleotid nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel-Nukleinsäure mit dem Träger verbunden bleibt, und Ausle¬ sen der Markierung des Reporter-Oligonukleotids auf dem Trä¬ ger .
Der Begriff „Ziel-Nukleinsäure" bezeichnet eine einzel- strängige Nukleinsäure mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 50 Nukleotiden. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA sein. Bevorzugt sind natürlich vorkommende Nukleinsäuren so- wie chemisch hergestellte oder rekombinant hergestellte Nuk¬ leinsäuren als Ziel-Nukleinsäure.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird zunächst mindestens ein fester Träger bereit gestellt. In einer bevorzugten Aus- führungsform ist der feste Träger ein Chip, vorzugsweise ein Silizium-Chip. Silizium-Chips können kostengünstig herge¬ stellt werden und bieten die Möglichkeit, zusätzliche Elemen¬ te wie beispielsweise Elektroden, Temperatursensoren oder Kühl- und Heizelemente einfach auf dem Chip zu integrieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine Elektrode, vorzugsweise eine Goldelektrode, auf der Oberfläche des Trägers integriert. Nukleinsäuren und
Oligonukleotide lassen sich auf einfache Weise auf Goldober- flächen immobilisieren. Die Elektrode kann für ein elektrochemisches Auslesen der Markierung verwendet werden, insbesondere zum Messen eines Stroms. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der feste Träger eine Temperatursteuerung und/oder einen Temperatursensor auf. Damit kann eine Temperatur des festen Trägers eingestellt bzw. gemessen werden. In einer weiteren Ausführungsform um- fasst der feste Träger Kühl- und/oder Heizelemente zum Abkühlen bzw. Erwärmen des Trägers.
Auf dem festen Träger ist mindestens ein Fänger-Oligonu¬ kleotid immobilisiert. Der Begriff „Oligonukleotid" bezeich- net eine Nukleinsäure. Der Begriff umfasst sowohl einzel- strängige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren. Der Begriff umfasst sowohl RNA-Moleküle, sog. Oligoribonukleotide, als auch DNA-Moleküle, sog. Oligodesoxyribonukleotide . Das Fänger-Oligonukleotid umfasst eine Oligonukleotid-
Sequenz, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Gegenstrang-Oligonukleotid ist. Der Abschnitt des Fänger- Oligonukleotids, dessen Sequenz komplementär zu dem Gegenstrang-Oligonukleotid ist, weist vorzugsweise eine Länge von bis etwa 30 Nukleotide auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fänger- Oligonukleotid ein einzelsträngiges Fänger-Oligonukleotid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fänger- Oligonukleotid ein Oligodesoxyribonukleotid .
In einer weiteren Ausführungsform ist das Fänger- Oligonukleotid über eine Thiol-Gruppe auf dem Träger immobi- lisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fänger- Oligonukleotid über einen Spacer auf dem Träger immobili¬ siert. Die Verwendung des Spacers ermöglicht die effiziente Hybridisierung des Fänger-Oligonukleotids mit dem Gegen¬ strang-Oligonukleotid. Der Spacer ist vorzugsweise aus
Thymidinnukleotiden aufgebaut. Er kann über eine Thiol-Gruppe auf dem Träger immobilisiert sein. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird anschließend der Träger bei einer ersten Hybridisierungsbedingung mit mindestens einem Gegenstrang-Oligonukleotid und mindestens einer einzel- strängigen Ziel-Nukleinsäure in Kontakt gebracht.
Das Gegenstrang-Oligonukleotid ist ein einzelsträngiges
Oligonukleotid, das mindestens die folgenden Oligonukleotid- Sequenzen umfasst: eine Oligonukleotid-Sequenz , die mindes- tens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleo- tid ist, eine Oligonukleotid-Sequenz, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist, und eine Oligonukleotid-Sequenz, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter- Oligonukleotid ist. Somit können das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid jeweils mindestens ab¬ schnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure mit dem Gegenstrang- Oligonukleotid hybridisieren.
Die Abschnitte des Gegenstrang-Oligonukleotids , deren Sequen- zen komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid oder dem Reporter-Oligonukleotid sind, weisen vorzugsweise jeweils eine Länge von bis etwa 30 Nukleotide auf.
Der Begriff „hybridisieren" bezeichnet das Anlagern einer einzelsträngigen RNA oder DNA an eine mindestens abschnittsweise komplementäre einzelsträngige RNA oder DNA unter Aus¬ bildung von Wasserstoffbrücken zwischen den jeweils komplementären Basen, so dass sich in dem zueinander komplementären Abschnitt zwischen den zwei Nukleinsäure-Molekülen Basen- paarungen bilden. Der Begriff „Basenpaarung" umfasst sowohl Watson-Crick-Basenpaarungen als auch nicht Watson-Crick- Basenpaarungen wie die sog. Wobble-Basenpaarung . Eine typische Wobble-Basenpaarung ist eine Basenpaarung von Guanin mit Uracil, die sich beispielsweise beim Anlagern einer DNA an eine RNA bilden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oligonukleotid- Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist, vollständig komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure . Somit kann die Ziel-Nukleinsäure vollstän¬ dig mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid hybridisieren. Voll¬ ständiges Hybridisieren bedeutet, dass jede einzelne Base der Ziel-Nukleinsäure eine Basenpaarung mit dem Gegenstrang- Oligonukleotid bildet und damit kein einziger Basen-Mismatch vorliegt .
Die Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-
Oligonukleotid ist, grenzt unmittelbar an die Oligonukleotid- Sequenz an, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist. Dadurch bilden das erste Ende der Ziel-Nukleinsäure und das freie Ende des Fänger-Oligonukleotids mit unmittelbar an- schließend benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang- Oligonukleotids Basenpaarungen. Damit sind die zu ligierenden Enden des Fänger-Oligonukleotids und der Ziel-Nukleinsäure benachbart angeordnet und können ohne ein vorheriges Auffül¬ len von fehlenden Nukleotiden unmittelbar miteinander ligiert werden. Weil fehlende Nukleotide für das Ligieren des Fänger- Oligonukleotids mit der Ziel-Nukleinsäure nicht aufgefüllt werden müssen, kann das Verfahren besonders einfach und schnell durchgeführt werden. An das andere Ende der Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, die komplementär zu der Ziel- Nukleinsäure ist, grenzt unmittelbar die Oligonukleotid- Sequenz an, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ziel-Nukleinsäure vollständig komplementär zu der entsprechenden
Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, so dass die Ziel-Nukleinsäure hochspezifisch nachgewiesen und/oder quantifiziert werden kann.
Der Begriff „Hybridisierungsbedingung" bezeichnet mindestens einen Parameter oder eine Kombination von Parametern, bei dem/der mindestens einer der Hybridisierungsschritte des Ver¬ fahrens durchgeführt wird. Die Hybridisierungsbedingung ist eine Bedingung, bei der sich das Fänger-Oligonukleotid, die Ziel-Nukleinsäure und/oder das Reporter-Oligonukleotid an die jeweils dazu komplementären Abschnitte des Gegenstrang- Oligonukleotids unter Bildung von Basenpaarungen anlagern. Die Parameter umfassen vorzugsweise eine Temperatur, eine Salzkonzentration, eine Ionenstärke, einen pH-Wert und/oder einen Zusatz von Reagenzien wie beispielsweise Formamid.
Die Hybridisierungsbedingung ist insbesondere eine Tempera¬ tur .
Die erste Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierungsbe¬ dingung, bei der das Fänger-Oligonukleotid mindestens ab¬ schnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure mit den jeweils dazu komplementären Abschnitten des Gegenstrang-Oligonukleotids hybridisieren. Die erste Hybridisierungsbedingung wird vorzugsweise in Abhängigkeit der Sequenz und der Länge des Fän- ger-Oligonukleotids und der Ziel-Nukleinsäure gewählt. Die Wahl der ersten Hybridisierungsbedingung kann weiterhin davon abhängen, ob das Fänger-Oligonukleotid, das Gegenstrang- Oligonukleotid bzw. die Ziel-Nukleinsäure RNA- und/oder DNA- Moleküle sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Hybridisierungsbedingung eine Temperatur von 40°C bis 45°C, besonders bevorzugt eine Temperatur von 45°C, bei 66 mM Tris/HCl pH 7,6; 50 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 1 mM Dithiothreitol (DTT) ; 1 mM Adenosintriphosphat (ATP); 7,5% PEG6000 und 1 mg/ml Rin¬ derserumalbumin (BSA) .
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids , um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Fänger-Oligonukleotid zu binden. Die Begriffe „Ligie¬ ren" und „Ligation" bezeichnen die Ausbildung einer kovalen- ten chemischen Bindung zwischen zwei einzelsträngigen Oligonukleotiden an deren Zucker-Phosphat-Rückgrat. Der Be¬ griff umfasst die Bindung des 3 ' -Hydroxyl-Endes einzel- strängiger RNA oder DNA an das 5 ' -Phosphoryl-Ende einer zweiten RNA oder DNA, wobei auch ein Ligieren von RNA und DNA um- fasst ist. Die Herstellung der kovalenten Bindung kann durch Enzyme, die sog. Ligasen, vorzugsweise DNA-Ligasen, kataly¬ siert werden und ist ATP-abhängig .
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Inkubieren des Trägers bei einer ersten Reaktionsbedingung derart, dass die Ziel-Nukleinsäure nur bei Gegenwart von an ihrem ersten Ende ligiertem Fänger-Oligonukleotid mit dem Träger verbunden bleibt und das Gegenstrang-Oligonukleotid nur bei Gegenwart einer Ziel-Nukleinsäure, die komplementär zu der entsprechen- den Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids und an das freie Ende des Fänger-Oligonukleotids ligiert ist, mit dem Träger verbunden bleibt.
Der Begriff „Reaktionsbedingung" bezeichnet mindestens einen Parameter oder eine Kombination von Parametern, bei dem/der mindestens einer der Inkubationsschritte des Verfahrens durchgeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Reaktionsbedingung eine geeignete Bedingung für das Aufschmelzen von Basenpaarungen von Fänger-Oligonukleotid, Ziel- Nukleinsäure, Reporter-Oligonukleotid und Gegenstrang- Oligonukleotid. Die Parameter umfassen vorzugsweise eine Tem¬ peratur, eine Salzkonzentration, eine Ionenstärke, einen pH- Wert und/oder einen Zusatz von Reagenzien wie beispielsweise Formamid .
Die Reaktionsbedingung ist insbesondere eine Temperatur.
Die erste Reaktionsbedingung ist die Reaktionsbedingung, bei der die Basenpaarung des Gegenstrang-Oligonukleotids mit dem Fänger-Oligonukleotid und die Basenpaarung des Gegenstrang- Oligonukleotids mit der Ziel-Nukleinsäure aufschmilzt, falls die Ziel-Nukleinsäure zu der entsprechenden Oligonukleotid- Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids nicht komplementär ist. In diesem Fall werden die Wasserstoffbrücken zwischen den jeweils gepaarten Basen aufgehoben und das Gegenstrang- Oligonukleotid löst sich von dem Träger. In diesem Fall ist die Ziel-Nukleinsäure auch nicht an ihrem ersten Ende mit dem Fänger-Oligonukleotid ligiert, so dass sich die Ziel- Nukleinsäure bei Inkubieren des Trägers bei der ersten Reak¬ tionsbedingung ebenfalls von dem Träger löst.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Reak- tionsbedingung eine höhere Temperatur und/oder eine geringere Ionenstärke als die erste Hybridisierungsbedingung . Dadurch wird das Aufbrechen der Wasserstoffbrücken zwischen den jeweils gepaarten Basen bei der zweiten Reaktionsbedingung erleichtert .
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Reaktionsbedingung eine Temperatur von 45°C bis 55°C, besonders bevorzugt eine Temperatur von 50°C, bei20 mM Tris/HCl pH 7,6 und 20 mM NaCl .
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird anschließend der Träger bei einer zweiten Hybridisierungsbedingung mit mindestens einem Reporter-Oligonukleotid in Kontakt gebracht, um das Re¬ porter-Oligonukleotid mindestens abschnittsweise mit dem Ge- genstrang-Oligonukleotid zu hybridisieren. Das Reporter- Oligonukleotid umfasst eine Oligonukleotid-Sequenz , die min¬ destens abschnittsweise komplementär zu dem Gegenstrang- Oligonukleotid ist. Der Abschnitt des Reporter-Oligonukleo- tids, dessen Sequenz komplementär zu dem Gegenstrang- Oligonukleotid ist, weist vorzugsweise eine Länge von bis et¬ wa 30 Nukleotide auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reporter- Oligonukleotid ein einzelsträngiges Reporter-Oligonukleotid.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reporter- Oligonukleotid ein Oligodesoxyribonukleotid . Die zweite Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierungs¬ bedingung, bei der das Reporter-Oligonukleotid mindestens ab¬ schnittsweise mit dem dazu komplementären Abschnitt des Ge¬ genstrang-Oligonukleotids hybridisiert. Die zweite Hybridi- sierungsbedingung wird vorzugsweise in Abhängigkeit der Se¬ quenz und der Länge des Reporter-Oligonukleotids gewählt. Die Wahl der zweiten Hybridisierungsbedingung kann weiterhin davon abhängen, ob das Reporter-Oligonukleotid und das Gegen- strang-Oligonukleotid RNA- und/oder DNA-Moleküle sind. Die zweite Hybridisierungsbedingung kann mit der ersten Hybridisierungsbedingung übereinstimmen .
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Hybridisierungsbedingung eine Temperatur von 35°C bei66 mM
Tris/HCl pH 7,6; 50 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 1 mM DTT ; 1 mM ATP; 7,5% PEG6000 und 1 mg/ml BSA.
Die Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter- Oligonukleotid ist, grenzt unmittelbar an die Oligonukleotid- Sequenz an, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist. Dadurch bilden das zweite Ende der Ziel-Nukleinsäure und das erste Ende des Reporter-Oligonukleotids mit unmittelbar an¬ schließend benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang- Oligonukleotids Basenpaarungen. Damit sind die zu ligierenden Enden der Ziel-Nukleinsäure und des Reporter-Oligonukleotids benachbart angeordnet und können ohne ein vorheriges Auffül¬ len von fehlenden Nukleotiden unmittelbar miteinander ligiert werden. Weil fehlende Nukleotide für das Ligieren des Repor- ter-Oligonukleotids mit der Ziel-Nukleinsäure nicht aufge¬ füllt werden müssen, kann das Verfahren besonders einfach und schnell durchgeführt werden.
Das Reporter-Oligonukleotid weist eine Markierung auf. Der Begriff „Markierung" bezeichnet eine Eigenschaft des Repor¬ ter-Oligonukleotids, die zum Anzeigen der Anwesenheit des Re¬ porter-Oligonukleotids auf dem Träger verwendet werden kann. Die Markierung ist vorzugsweise ein Reportermolekül, das di- rekt oder indirekt mit dem Reporter-Oligonukleotid verbunden ist und ein auslesbares Signal erzeugen kann. Das Reportermo¬ lekül kann beispielsweise ein Enzym, insbesondere eine
Esterase, oder ein Fluoreszenzfarbstoff sein. Das Reportermo- lekül kann an einem zweiten Ende des Reporter-Oligonukleotids angebracht sein. Das Reportermolekül kann auch zwischen den beiden Enden des Reporter-Oligonukleotids, beispielsweise an eine Base gebunden, mit dem Reporter-Oligonukleotid verbunden sein .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung ein Abschnitt des Reporter-Oligonukleotids, der ein Adapter ist. An den Adapter wird in einem oder mehreren nachfolgenden Schritten mindestens ein Reportermolekül direkt oder indirekt angebracht. Vorzugsweise ist der Adapter eine universell ein¬ gesetzte Oligonukleotid-Sequenz .
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kova- lent an das Reporter-Oligonukleotid zu binden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Inkubieren des Trägers bei einer zweiten Reaktionsbedingung derart, dass das Reporter-Oligonukleotid nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel-Nukleinsäure mit dem Träger verbunden bleibt.
Die zweite Reaktionsbedingung ist die Reaktionsbedingung, bei der die Basenpaarung des Gegenstrang-Oligonukleotids mit dem Fänger-Oligonukleotid, der Ziel-Nukleinsäure und dem Repor¬ ter-Oligonukleotid aufgeschmolzen wird. Dabei werden die Was¬ serstoffbrücken zwischen den jeweils gepaarten Basen aufgehoben. Ist die Ziel-Nukleinsäure nicht an beiden Enden ligiert, löst sich das Reporter-Oligonukleotid von dem Träger. Die zweite Reaktionsbedingung kann mit der ersten Reaktionsbedingung übereinstimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Reaktionsbedingung eine höhere Temperatur und/oder eine geringere Ionenstärke als die zweite Hybridisierungsbedingung . Dadurch wird das Aufbrechen der Wasserstoffbrücken zwischen den je- weils gepaarten Basen bei der zweiten Reaktionsbedingung erleichtert .
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Reaktionsbedingung eine Temperatur von 55°C bei 2 mM Tris/HCl pH 7,6 und 2 mM NaCl .
In einer Ausführungsform löst sich das Gegenstrang- Oligonukleotid von dem Träger, indem es sich von dem Fänger- Oligonukleotid, der Ziel-Nukleinsäure und dem Reporter- Oligonukleotid löst.
In einer weiteren Ausführungsform verbleibt das Gegenstrang- Oligonukleotid auf dem Träger. Um dies zu erreichen, weist die zweite Reaktionsbedingung im Vergleich zu der Reaktions- bedingung, bei der sich das Gegenstrang-Oligonukleotid von dem Träger löst, vorzugsweise eine niedrigere Temperatur und/oder eine höhere Ionenstärke auf. Aufgrund eines Energie¬ gewinns durch die zwei Ligationen wirkt die Anwesenheit des Gegenstrang-Oligonukleotids , das mit dem Fänger- Oligonukleotid, der Ziel-Nukleinsäure und dem Reporter-
Oligonukleotid durch Basenpaarungen verbunden ist, energetisch stabilisierend. Durch die Stabilisierung kann das Auslesen der Markierung auf dem Träger unter milderen Bedingungen im Vergleich zur Abwesenheit des Gegenstrang- Oligonukleotids durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Auslesen der Markierung des Reporter-Oligonukleotids auf dem Träger. Mit der Anwesenheit der Markierung auf dem Träger wird nach- gewiesen, dass die Ziel-Nukleinsäure an ihren beiden Enden ligiert wurde, wobei das erste Ende der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids und das zweite En¬ de der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter- Oligonukleotid ligiert wurde. Da das Reporter-Oligonukleotid nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel- Nukleinsäure mit dem Träger verbunden bleibt, wird durch Nachweisen der Markierung des Reporter-Oligonukleotids auf dem Träger die Ziel-Nukleinsäure detektiert. Der Nachweis der Markierung auf dem Träger kann auch der Quantifizierung der Ziel-Nukleinsäure dienen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei oder mehr Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens miteinander kombi¬ niert. Dadurch kann das Verfahren besonders effizient durch¬ geführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt b) mit Schritt c) und/oder Schritt e) mit Schritt f) kombiniert. Dazu können die für das Ligieren erforderlichen Reagenzien wie beispielsweise Ligase schon in Schritt b) bzw. Schritt e) dem Träger zugeführt werden.
In einer weiteren Ausführungform erfolgen Schritt b) und Schritt c) und/oder Schritt e) und Schritt f) nacheinander. Das Durchführen von Hybridisierung und Ligation in separaten Verfahrensschritten führt zu einer verbesserten
Ligationseffizienz sowie zu geringeren unspezifischen Reaktionen. Zudem vereinfacht es die Anwendung des Verfahrens auf Ziel-Nukleinsäuren biologischer Proben.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die Ziel-Nukleinsäure direkt detektiert und/oder quantifiziert wird. Insbesondere ist es nicht notwendig, die Ziel- Nukleinsäure chemisch oder enzymatisch zu modifizieren. Da bestimmte Ziel-Nukleinsäuren bevorzugt eine Modifizierung eingehen, kann die Quantifizierung von modifizierten Ziel- Nukleinsäuren zu ungenauen Ergebnissen führen. Diese Unge- nauigkeiten werden durch den direkten Nachweis der Ziel- Nukleinsäure vermieden. Ferner werden Artefakte, die beim Mo- difizieren der Ziel-Nukleinsäure auftreten können, vermieden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr sensitiv, so dass auch geringe Mengen der Ziel-Nukleinsäure nachgewiesen werden können. Dadurch ist es nicht notwendig, die Ziel-Nukleinsäure vor der Identifizierung zu amplifizieren, so dass auch keine falschen Nukleotide in die Ziel-Nukleinsäure eingebaut wer¬ den. Dadurch wird die Spezifität des Verfahrens erhöht.
Das erfindungsgemäße Verfahrens weist dadurch, dass beide En¬ den der Ziel-Nukleinsäure an deren Identifizierung beteiligt sind, eine hohe Selektivität auf. Durch die zwei Ligationen wird das Reporter-Oligonukleotid über die Ziel-Nukleinsäure und das Fänger-Oligonukleotid ko- valent an den Träger gebunden. Damit ist der Nachweis der Markierung des Reporter-Oligonukleotids unabhängig von der Sequenz und der Länge der Oligonukleotide und der Ziel- Nukleinsäure, die zu der Temperaturabhängigkeit der Anlage¬ rung von Reporter-Oligonukleotid, Ziel-Nukleinsäure und Fän¬ ger-Oligonukleotid an das Gegenstrang-Oligonukleotid führen. Dies hat den Vorteil, dass das Auslesen der Markierung auch bei Bedingungen durchgeführt werden kann, bei denen keine stabile Basenpaarung möglich ist. Dadurch kann das Auslesen der Markierung bei optimalen Bedingungen, beispielsweise bei einer optimal an die Art der verwendeten Markierung angepass- ten Auslesetemperatur und/oder Ausleseionenstärke durchgeführt werden, ohne dass auf eine stabile Basenpaarung Rück- sieht genommen werden muss. Dadurch werden unspezifische Hintergrundsignale verringert und ein hochsensitives Auslesen der Markierung ermöglicht. Dies trägt zu der hohen Sensitivi- tät des Verfahrens bei. Des Weiteren wird durch die stabile kovalente Bindung des Reporter-Oligonukleotids an den Träger ein robustes und quantitativ auswertbares Auslesen der Markierung ermöglicht.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass das Gegenstrang-Oligonukleotid in Schritt d) nur bei Gegenwart einer Ziel-Nukleinsäure, die komplementär zu der entsprechenden Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang- Oligonukleotids ist, mit dem Träger verbunden bleibt. Dadurch wird verhindert, dass sich das in Schritt e) hinzugefügte Re- 1 b
porter-Oligonukleotid an ein Gegenstrang-Oligonukleotid anla¬ gert, an das keine Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist. Die Bindung von Reporter-Oligonukleotid an ein solches "negati¬ ves" Gegenstrang-Oligonukleotid kann selbst durch ein Waschen des Trägers bei hoher Temperatur nur schwer vollständig ge¬ löst werden. Daraus resultierende unspezifische Signale wer¬ den durch das Entfernen von Gegenstrang-Oligonukleotiden, an die keine komplementäre Ziel-Nukleinsäure hybridisiert ist, von dem Träger bevor der Träger mit dem Reporter- Oligonukleotid in Kontakt gebracht wird, verhindert. Dadurch wird die Spezifität des Verfahrens erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt vor Schritt c) und/oder in Schritt d) und/oder vor Schritt f) und/oder in Schritt g) und/oder vor Schritt h) zusätzlich ein Waschen des Trägers. Durch das Waschen werden ungebundene Nukleinsäuren, ungebundene Reporter-Oligonukleotide und/oder gelöste Gegen- strang-Oligonukleotide von dem Träger entfernt. Dadurch wird insbesondere ein Wiederanlagern des Gegenstrang- Oligonukleotids an ein freies Fänger-Oligonukleotid auf dem Träger, an das keine Ziel-Nukleinsäure ligiert ist, und ein Anlagern des Reporter-Oligonukleotids an dieses Gegenstrang- Oligonukleotid während des Auslesen der Markierung vermieden. Dies erhöht die Spezifität des Nachweises der Markierung auf dem Träger und damit die Spezifität der Detektion der Ziel- Nukleinsäure .
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Waschen des Trägers vor Schritt c) bei einer stringenten Reaktionsbedin- gung. Der Begriff „stringente Reaktionsbedingung" bezeichnet eine Reaktionsbedingung, bei der nur vollständig hybridisierte Ziel-Nukleinsäure mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid ver¬ bunden bleibt, während sich Ziel-Nukleinsäure-Moleküle, deren Sequenz eine oder mehrere Basen-Mismatches gegenüber der ent- sprechenden Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-
Oligonukleotids aufweist, vom Gegenstrang-Oligonukleotid lö¬ sen. Das Waschen des Trägers bei einer stringenten Reaktionsbedingung vor dem Ligieren des ersten Endes der Ziel- Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids erhöht die Spezifität des Verfahrens.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Reaktions- bedingung eine stringente Reaktionsbedingung. Dadurch bleibt in Schritt d) nur vollständig mit der Ziel-Nukleinsäure hyb¬ ridisiertes Gegenstrang-Oligonukleotid mit der Ziel- Nukleinsäure verbunden, während sich Gegenstrang- Oligonukleotide, an die ein Ziel-Nukleinsäure-Moleküle hybri- disiert ist, dessen Sequenz eine oder mehrere Basen-
Mismatches gegenüber der entsprechenden Oligonukleotid- Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids aufweist, von der Ziel-Nukleinsäure lösen. Dadurch wird die Spezifität des Ver¬ fahrens erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ziel- Nukleinsäure eine RNA, vorzugsweise eine microRNA (miRNA) . miRNAs sind nicht kodierende, einzelsträngige RNAs mit einer Länge von etwa 17 bis etwa 25 Nukleotiden, die in der post- transkriptionalen Regulation der Genexpression wirksam sind. MiRNAs lagern sich hochspezifisch an komplementäre Sequenzen von mRNA-Molekülen an und regulieren dadurch die Translation der mRNA in das entsprechende Protein. In einer weiteren Ausführungsform ist die Ziel-Nukleinsäure eine einzelsträngige small interfering RNA (siRNA) . Ähnlich der miRNAs können auch siRNAs an der post-transkriptionalen Regulation der Genexpression beteiligt sein, indem sie sich spezifisch an komplementäre Sequenzen von mRNA-Molekülen an- lagern und die Translation der mRNA in das entsprechende Pro¬ tein regulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens zwei verschiedene Ziel-Nukleinsäuren, vorzugsweise drei bis 130 verschiedene Ziel-Nukleinsäuren gleichzeitig detektiert, wo¬ bei der in Schritt c) erzeugte Doppelstrang für alle Ziel- Nukleinsäuren eine gleiche Schmelztemperatur aufweist. Besonders bevorzugt werden 32 verschiedene Ziel-Nukleinsäuren gleichzeitig detektiert. Diese können beispielsweise in je¬ weils vier Replikaten auf einem gemeinsamen Träger nachgewiesen werden. Für die gleichzeitige Detektion verschiedener Ziel- Nukleinsäuren wird für jede Ziel-Nukleinsäure ein anderes Ge- genstrang-Oligonukleotid verwendet. Die Gegenstrang- Oligonukleotide unterscheiden sich mindestens in der
Oligonukleotid-Sequenz , die komplementär zu der Ziel- Nukleinsäure ist.
Die Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids , die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist, und die
Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger- Oligonukleotid ist, und die Sequenz des Fänger- Oligonukleotids werden so gewählt, dass der in Schritt c) er¬ zeugte Doppelstrang für alle Ziel-Nukleinsäuren eine gleiche Schmelztemperatur aufweist. Der Doppelstrang wird durch den Abschnitt des Fänger-Oligonukleotids , der komplementär zu dem entsprechenden Abschnitt des Gegenstrang-Oligonukleotids ist, und die Ziel-Nukleinsäure, die mit den jeweils dazu komple¬ mentären Oligonukleotid-Sequenzen des Gegenstrang- Oligonukleotids Basenpaarungen bilden, erzeugt. Der Begriff „gleiche Schmelztemperatur" bedeutet, dass die Schmelztempe¬ ratur des Doppelstrangs für verschiedene Ziel-Nukleinsäuren um höchstens 4°C, vorzugsweise um höchstens 2°C voneinander abweicht. Die gleiche Schmelztemperatur ist besonders bevor¬ zugt eine identische Schmelztemperatur.
Die gleiche Schmelztemperatur und die Auftrennung der zwei Ligationen in separate Verfahrensschritte erlauben es,
Schritt e) bei einer für alle Ziel-Nukleinsäuren einheitli¬ chen ersten Reaktionsbedingung durchzuführen. Dies ist eine Grundvoraussetzung, um verschiedene Ziel-Nukleinsäuren mit hoher Spezifität gleichzeitig auf einen gemeinsamen Träger zu detektieren und/oder quantifizieren (multiplexing) . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform unterscheiden sich die Gegenstrang-Oligonukleotide außerdem in der
Oligonukleotid-Sequenz , die mindestens abschnittsweise kom¬ plementär zu dem Reporter-Oligonukleotid ist und es wird für jede Ziel-Nukleinsäure ein anderes Reporter-Oligonukleotid verwendet. Die Reporter-Oligonukleotide unterscheiden sich außerdem in ihrer Markierung, so dass die Signale, die beim Auslesen der Markierungen erhalten werden, jeweils einer bestimmten Ziel-Nukleinsäure zugeordnet werden können.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Auslesen der Markierung auf dem Träger positionsspezifisch, um verschiedene Ziel-Nukleinsäuren gleichzeitig zu detektieren und/oder quantifizieren. Durch ein positionsspezifisches Auslesen der Markierung können auch mehrere zu untersuchende Proben mit einem einzigen Verfahren analysiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fänger- Oligonukleotid und/oder das Reporter-Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid, das Ribonukleotide und
Desoxyribonukleotide aufweist. Der Begriff „chimäres
Oligonukleotid" bezeichnet ein Oligonukleotid, das sowohl Ribonukleotide als auch Desoxyribonukleotide aufweist. Die Verwendung chimärer Oligonukleotide verhindert die Ausbildung von Sekundärstrukturen, die bei reinen Oligoribonukleotiden häufig auftreten. Die Sekundärstrukturen sind sowohl für die Hybridisierung des Fänger-Oligonukleotids bzw. des Reporter- Oligonukleotids mit den jeweils dazu komplementären Abschnit¬ ten des Gegenstrang-Oligonukleotids als auch für deren
Ligation mit der Ziel-Nukleinsäure hinderlich und würden so¬ mit die Sensitivität des Verfahrens beeinträchtigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das chimäre
Oligonukleotid eine Mehrheit von Desoxyribonukleotiden auf. Dadurch bleibt die höhere Stabilität der Desoxyribonukleotide in dem Chimären Oligonukleotid weitgehend erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein 3'-Hydroxyl- Ende des Chimären Oligonukleotids mindestens ein
Ribonukleotid, vorzugsweise vier Ribonukleotide auf. Weist das mit dem 5 ' -Phosphoryl-Ende der Ziel-Nukleinsäure zu li- gierende 3 ' -Hydroxyl-Ende des Fänger-Oligonukleotids oder des Reporter-Oligonukleotids mindestens ein Ribonukleotid auf, kann für den Fall, dass die Ziel-Nukleinsäure eine RNA ist, eine RNA-RNA-Ligation erfolgen. Beispielsweise weisen miRNAs ein 5 ' -Phosphoryl-Ende auf, das mit Hilfe der erhältlichen Ligasen praktisch nicht mit dem 3 ' -Hydroxyl-Ende eines
Oligodesoxyribonukleotids verbunden werden kann. Durch die Verwendung chimärer Oligonukleotide mit einem Ribonukleotid am 3 ' -Hydroxyl-Ende kann die Ligation mit dem 5 ' -Phosphoryl- Ende der miRNA erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für das Ligieren eine T4 DNA Ligase verwendet. T4 DNA Ligase ist ein Enzym, das die ATP-abhängige Ligation eines 3 ' -Hydroxyl-Endes eines ersten Nukleinsäure-Moleküls an ein unmittelbar anschließend benachbartes 5 ' -Phosphoryl-Ende eines zweiten Nukleinsäure- Moleküls in doppelsträngigen DNA-, RNA/DNA- oder RNA- Molekülen katalysiert. Dabei wird eine kovalente
Phosphodiesterbindung hergestellt . In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Ligieren bei einer Ligationstemperatur. Die Ligationstemperatur liegt in einem Bereich, in dem die verwendete Ligase eine hohe enzyma- tische Aktivität aufweist. Wird T4 DNA Ligase verwendet, so liegt die Ligationstemperatur vorzugsweise bei 35°C bis 37°C, besonders bevorzugt bei 37°C.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gegenstrang- Oligonukleotid ein Oligodesoxyribonukleotid .
Oligodesoxyribonukleotide sind gegenüber Oligoribonukleotiden stabiler und bilden nur selten Sekundärstrukturen aus.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind das Ge- genstrang-Oligonukleotid, das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid Oligodesoxyribonukleotide, während die Ziel-Nukleinsäure eine RNA ist, so dass bei der Hybridi¬ sierung mindestens abschnittsweise RNA/DNA-Duplexe gebildet werden, welche thermodynamisch sehr stabil sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Gegenstrang- Oligonukleotid ein Oligodesoxyribonukleotid und die Ziel- Nukleinsäure eine RNA, während das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid chimäre Oligonukleotide mit vor- zugsweise mindestens einem Ribonukleotid am 3 ' -Hydroxyl-Ende sind .
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Gegenstrang- Oligonukleotid eine Oligonukleotid-Sequenz , die vollständig komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid ist, und/oder eine Oligonukleotid-Sequenz, die vollständig komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid ist. Dadurch wird eine besonders stabile Hybridisierung des Gegenstrang-Oligonukleotids mit dem Fänger-Oligonukleotid und/oder dem Reporter- Oligonukleotid erreicht. Dies trägt zu einer zuverlässigen Detektion und Quantifizierung der Ziel-Nukleinsäure bei.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Auslesen der Markierung mittels eines „branched DNA"-Tests. Der „branched DNA" -Test („branched DNA", auf deutsch: verzweigte DNA), der auch unter der Bezeichnung „branched DNA Assay" bekannt ist, ist ein Signalamplifizierungs-Assay zur Amplifizierung des Reportersignals. Dazu wird ein sogenannter "Preamplifier" (auf deutsch: Vorverstärker) eingesetzt, der direkt oder in- direkt an die nachzuweisende Ziel-Nukleinsäure hybridisiert. In nachfolgenden Schritten werden sogenannte "Amplifier" (auf deutsch: Verstärker) an den „Preamplifier" hybridisiert.
„Preamplifier" und „Amplifier" sind kurze einzelsträngige Oligodesoxyribonukleotide. Dabei sind die „Amplifier" ver- zweigte Oligodesoxyribonukleotide, die Reportermoleküle bin¬ den. Die Signalamplifizierung wird erreicht, indem mehrere „Amplifier" an einen „Preamplifier" binden und jeder
„Amplifier" typischerweise mehrere Reportermoleküle bindet. Durch die Verzweigung der „Amplifier" kann eine hohe Dichte der „Amplifier" auf dem „Preamplifier" erreicht werden, die zu einer hohen Sensitivität des „branched DNA"-Tests führt. Somit wird durch den Einsatz des „branched DNA"-Tests die Sensitivität des Verfahrens weiter erhöht. Der „branched
DNA"-Test ist auch für den Nachweis von mehreren verschiede¬ nen Ziel-Nukleinsäuren im Multiplex-Verfahren geeignet. Hierbei werden die Spezifität und die Zuverlässigkeit der Detek- tion vorzugsweise durch kombinatorische Fluoreszenz erhöht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Repor- ter-Oligonukleotid ein „Preamplifier" . In diesem Fall hybridisieren die „Amplifier" direkt an das Reporter- Oligonukleotid, so dass zusätzliche Hybridisierungsschritte entfallen. Dadurch kann das Auslesen der Markierung mittels des „branched DNA"-Tests besonders effizient durchgeführt werden .
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine Phosphory- lierung von einem Ende der Ziel-Nukleinsäure, des Fänger- Oligonukleotids und/oder des Reporter-Oligonukleotids. Der Begriff „Phosphorylierung" bezeichnet das Anhängen eines Phosphatrestes an das 5 ' -Hydroxyl-Ende von RNA oder DNA. Das Ligieren von zwei unmittelbar anschließend benachbarten
Oligonukleotiden bzw. Nukleinsäure-Molekülen erfordert ein 5' -Phosphoryl-Ende an dem zweiten Nukleinsäure-Molekül . Das Vorliegen eines 5 ' -Phosphoryl-Endes des zweiten Nukleinsäure- Moleküls hängt unter anderem von dessen Synthese ab. Ein fehlendes 5 ' -Phosphoryl-Ende kann durch die Phosphorylierung an- gefügt werden, damit das Fänger-Oligonukleotid mit der Ziel- Nukleinsäure und die Ziel-Nukleinsäure mit dem Reporter- Oligonukleotid ligiert werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Phosphorylierung eine enzymatische Phosphorylierung.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Phosphorylierung durch In-Kontaktbringen des zu phosphorylierenden Mo- leküls mit einer T4 Polynukleotidkinase. T4
Polynukleotidkinase ist ein Enzym, das die Phosphorylierung von 5 ' -Hydroxyl-Enden von RNA- oder DNA-Molekülen katalysiert .
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt vor Schritt f) und/oder g) ein erstes Auslesen der Markierung auf dem Träger und/oder in Schritt h) erfolgt ein zweites Auslesen der Markierung auf dem Träger. Bei dem ersten Auslesen der Markie- rung wird ein Referenzwert erhalten, während bei dem zweiten Auslesen der Markierung ein Messwert erhalten wird. Der Messwert wird vorzugsweise in Relation zu dem Referenzwert ge¬ setzt. Dadurch können von verschiedenen Trägern gewonnene Daten untereinander verglichen werden. Der Referenzwert kann beispielsweise ein Maß für die Anzahl der Fänger- Oligonukleotide, die auf dem Träger immobilisiert sind, sein. Sind auf einem ersten Träger weniger Fänger-Oligonukleotide immobilisiert als auf einem zweiten Träger, dann ist sowohl der Referenzwert als auch der Messwert des ersten Trägers niedriger. Somit kann eine Kalibierung der einzelnen Träger durchgeführt werden.
Ein Quotient aus dem Messwert und dem Referenzwert bleibt bei unterschiedlicher Anzahl an immobilisierten Fänger- Oligonukleotiden auf unterschiedlichen Trägern näherungsweise konstant. Dadurch können Streuungen von Messwerten, die von verschiedenen Trägern gewonnen werden, eliminiert werden. Somit werden auch eine bessere Reproduzierbarkeit und niedrige¬ re Standardabweichungen für die Werte, die beim Auslesen der Markierung erhalten werden, erreicht.
Weiterhin wird eine Kalibrierung einzelner Positionen auf dem selben Träger ermöglicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgen das erste Auslesen und das zweite Auslesen bei einer gleichen Reaktionsbedingung. Dadurch wird sichergestellt, dass die Enzymaktivität, die von der Reaktionsbedingung, insbesondere von der Temperatur, abhängig ist, bei dem ersten und den zweiten Auslesen gleich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung des Reporter-Oligonukleotids ein Enzym, vorzugsweise eine
Esterase .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die
Esterase die thermostabile Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius . Die Esterase 2 ist aus einer einzigen Prote¬ inkette aufgebaut und kann somit auf einfache Weise an das Reporter-Oligonukleotid gekoppelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym kovalent an das Reporter-Oligonukleotid gebunden. Dadurch ist das En¬ zym stabil mit dem Reporter-Oligonukleotid verbunden und kann sich nicht aufgrund von Waschvorgängen oder den sich ändernden Temperaturen von dem Reporter-Oligonukleotid ablösen. Somit kann eine zuverlässige Detektion und Quantifizierung der Ziel-Nukleinsäure sicher gestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff, der vorzugsweise kovalent an das Reporter- Oligonukleotid gebunden ist. Die Verwendung des Fluoreszenz- farbstoffs ermöglicht ein besonders einfaches und schnelles Auslesen der Markierung. Ferner wird für das Auslesen kein Substrat benötigt, so dass das Verfahren besonders kosten¬ günstig durchgeführt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung elektrochemisch ausgelesen. Bei einem elektrochemischen Auslesen werden an der Markierung, die vorzugweise ein Enzym ist, Substrate zu redoxaktiven Reaktionsprodukten umgesetzt, so dass ein Strom oder eine Änderung der Spannung an einer Elektrode gemessen werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Auslesen durch Redoxcycling von p-Aminophenol und Quinonimin. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Auslesen der Markierung auf dem Träger bei einer Auslesetemperatur. Die Auslesetemperatur liegt in einem Bereich, in dem das Enzym eine hohe enzymatische Aktivität aufweist. Wird Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius als Markierung verwendet, so liegt die Auslesetemperatur vorzugsweise bei etwa 35°C.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Auslesen der Markierung auf dem Träger optisch. Ein optisches Auslesen der Markierung ist einfach und kostengünstig.
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand schematischer Zeichnungen dar- gestellt.
Figur 1 zeigt die Identifizierung einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9) mittels des erfindungsgemäßen Verfah¬ rens. Die Ziel-Nukleinsäure (9) ist miDNA-96. Die miDNA-96 weist ein 5 ' -Phosphoryl-Ende auf und ist eine synthetisch hergestellte DNA-Version vom miRNA-96. Es wird ein Silizium- Chip mit zwei integrierten Goldelektroden als fester Träger (1) verwendet, auf dem ein einzelsträngiges Fänger- Oligonukleotid (5) über einen Spacer (3) immobilisiert ist. Der Chip wird zunächst für 15 Minuten bei 35°C mit einer Blo¬ ckierungslösung („The Blocking Solution", CANDOR Bioscience GmbH, Wangen, Deutschland) inkubiert, um freie Bindungsstel¬ len auf der Oberfläche des Chips abzusättigen . Anschließend wird der Chip für 3 Minuten bei 45°C in einem ersten Wasch- puffer, der 20 mM Tris/HCl pH 7,6 und 20 mM NaCl aufweist, gewaschen. Darauf folgt ein erster Schritt des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens, in dem der Chip bei einer Hybridisierungs- temperatur von 45°C mit 100 nM Gegenstrang-Oligonukleotid (7) und 10 nM miDNA-96 in einem Reaktionspuffer in Kontakt ge- bracht wird. Der Reaktionspuffer weist 66 mM Tris/HCl pH 7,6; 50 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 1 mM Dithiothreitol (DTT) ; 1 mM Ade- nosintriphosphat (ATP); 7,5% PEG6000 und 1 mg/ml Rinderserum¬ albumin (BSA) auf. Das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) umfasst drei Oligonukleotid-Sequenzen, die so angeordnet sind, dass sie unmittelbar aneinander grenzen. Eine Oligonukleotid- Sequenz ist vollständig komplementär zu dem Fänger- Oligonukleotid (5) . Daran schließt sich eine Oligonukleotid- Sequenz an, die vollständig komplementär zu miRNA-96 ist. Da¬ rauf folgt eine Oligonukleotid-Sequenz , die vollständig kom¬ plementär zu einem Reporter-Oligonukleotid (11) ist. Der Chip wird für 5 Minuten bei 45°C inkubiert, so dass das Fänger- Oligonukleotid (5) und die miDNA-96 mit den jeweils dazu kom- plementären Abschnitten des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) vollständig hybridisieren. Wie in Figur 1 dargestellt, führt die Anordnung der Oligonukleotid-Sequenzen auf dem Gegen- strang-Oligonukleotid (7) dazu, dass ein unteres Ende der miDNA-96 und ein freies oberes Ende des Fänger- Oligonukleotids (5) jeweils mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) hybridisieren. Anschließend wird der Chip für 5 Minuten bei 45°C in dem Reaktionspuffer gewaschen. In einem nächsten Schritt wird der Chip mit 100 units/ml T4 DNA Ligase in Kontakt gebracht und für 5 Minuten bei einer Ligationstemperatur von 35°C in dem Reaktionspuffer inkubiert. In diesem Schritt ligiert die T4 DNA Ligase in ei¬ ner ersten Ligation (15) die benachbarten Enden des Fänger- Oligonukleotids (5) und der miDNA-96 miteinander. Dadurch wird die miDNA-96 am unteren Ende kovalent an das Fänger- Oligonukleotid (5) gebunden. Der Chip wird anschließend bei einer ersten Reaktionstemperatur von 50°C in dem ersten
Waschpuffer für 5 Minuten inkubiert. Da das Gegenstrang- Oligonukleotid (7) vollständig an das Fänger-Oligonukleotid (5) und die miDNA-96 hybridisiert hat und die miDNA-96 an das Fänger-Oligonukleotid (5) ligiert ist, bleibt das Gegen- strang-Oligonukleotid (7) auf dem Chip. In einem nächsten Schritt wird der Chip bei einer Hybridisierungs- und
Ligationstemperatur von 35°C mit 250 nM Reporter- Oligonukleotid (11) und 100 units/ml T4 DNA Ligase in Reakti- onspuffer in Kontakt gebracht. Das Reporter-Oligonukleotid
(11) weist als Markierung (13) eine thermostabile Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius auf, die kovalent an das Reporter-Oligonukleotid (11) gebunden ist. Der Chip wird für 5 Minuten bei 35°C inkubiert, so dass das Reporter- Oligonukleotid (11) mit dem dazu komplementären Abschnitt des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) vollständig hybridisiert. Wie in Figur 1 dargestellt, führt die Anordnung der
Oligonukleotid-Sequenzen auf dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) dazu, dass ein oberes Ende der miDNA-96 und ein unteres Endes des Reporter-Oligonukleotids (11) mit benachbarten Nuk¬ leotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) hybridisieren. In diesem Schritt ligiert die T4 DNA Ligase in einer zweiten Ligation (17) die benachbarten Enden der miDNA-96 und des Reporter-Oligonukleotids (11) miteinander. Dadurch wird die miDNA-96 am oberen Ende kovalent an das Reporter- Oligonukleotid (11) gebunden. Der Chip wird anschließend bei einer zweiten Reaktionstemperatur von 55°C in einem zweiten Waschpuffer, der 2 mM Tris/HCl pH 7,6 und 2 mM NaCl aufweist, für 15 Minuten inkubiert. Dadurch wird die Basenpaarung des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) mit dem Fänger-Oligonukleotid (5), der miDNA und dem Reporter-Oligonukleotid (11) auf¬ geschmolzen, so dass sich das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) löst. Anschließend wird der Chip für 3 Minuten bei 35°C in dem ersten Waschpuffer gewaschen, um das gelöste Gegenstrang- Oligonukleotid (7) zu entfernen. Anschließend wird die
Esterase 2 auf dem Chip bei einer Auslesetemperatur von
35 ° ausgelesen . Das Auslesen wird elektrochemisch durchge- führt. Dazu wird der Chip mit einem Substrat (19) der
Esterase 2 para-Aminophenol-butyrat in Kontakt gebracht. Das para-Aminophenol-butyrat fließt über den Chip und wird von der Esterase 2 zu einem Reaktionsprodukt (21) para- Aminophenol umgesetzt, welches redoxaktiv ist. Durch
Redoxcycling von para-Aminophenol und Quinonimin wird Strom erzeugt, der bei Stopp des Substratflusses über den Chip an der Goldelektrode gemessen wird. Die Messung des Stroms dient als Nachweis der Esterase 2 auf dem Chip, wobei eine Signal¬ steigung die Gegenwart der miDNA-96 anzeigt.
Mittels dieses Verfahrens wurde eine Signalsteigung von
36,6812 nA/s gemessen, wobei die Standardabweichung 1,3894 nA/s beträgt. Als Kontrolle (in Figur 1 nicht gezeigt) wurde parallel ein Kontroll-Fänger-Oligonukleotid und ein Kontroll- Gegenstrang-Oligonukleotid eingesetzt. Auch das Kontroll- Gegenstrang-Oligonukleotid umfasst drei Oligonukleotid- Sequenzen, die so angeordnet sind, dass sie unmittelbar anei- nander grenzen. Dabei ist eine Oligonukleotid-Sequenz vollständig komplementär zu dem Kontroll-Fänger-Oligonukleotid. Daran schließt sich eine Oligonukleotid-Sequenz an, die vollständig komplementär zu miRNA-21 ist. Darauf folgt eine
Oligonukleotid-Sequenz, die vollständig komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid (11) ist und somit mit der entspre¬ chenden Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang- Oligonukleotids (7) übereinstimmt. Die miDNA-96 hybridisiert bei der Inkubation des Chips bei 45°C nicht mit dem Kontroll- Gegenstrang-Oligonukleotid, so dass der an der Kontrolle ge- messene Strom ein unspezifisches Hintergrundsignal auf dem
Chip anzeigt. Für die Kontrolle wurde in diesem Versuch eine Signalsteigung von 0,0061 nA/s gemessen, wobei die Standard¬ abweichung 0,0124 nA/s beträgt. Parallel dazu wurde unter gleichen Bedingungen ein herkömmliches Verfahren zur Identifizierung vom miDNA-96 durchgeführt. In dem herkömmlichen Verfahren wird der Chip in einem Schritt mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7), der miDNA-96 und dem Reporter-Oligonukleotid (11) in Kontakt gebracht und die ers- te und die zweite Ligation (15, 17) erfolgen ebenfalls in ei¬ nem gemeinsamen Schritt. Damit entfällt gegenüber dem erfindungsgemäßen Verfahren der Schritt des Inkubierens des Chips bei einer ersten Reaktionsbedingung. Bei der Identifizierung von miDNA-96 mittels des herkömmlichen Verfahrens wurde eine Signalsteigung von 27,2097 nA/s gemessen, wobei die Standardabweichung 2,0325 nA/s beträgt. Im Vergleich dazu ist die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gemessene Signalsteigung mit 36,6812 nA/s etwa 30% höher. Dies zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine höhere Sensitivität gegenüber dem herkömmlichen Verfahren aufweist . Für die Kontrolle wurde im herkömmlichen Verfahren eine Signalsteigung von 0,1921 nA/s gemessen, wobei die Standardabweichung 0,0403 nA/s beträgt. Im Gegensatz dazu wurde im er¬ findungsgemäßen Verfahren lediglich eine Signalsteigung von 0,0061 nA/s gemessen. Damit beträgt das unspezifische Hinter¬ grundsignal des erfindungsgemäßen Verfahrens weniger als 10% im Vergleich zu dem herkömmlichen Verfahren. Dies zeigt, dass unspezifische Signale durch das erfindungsgemäße Verfahren effektiv verhindert werden. Dadurch weist das erfindungsgemä- ße Verfahren eine höhere Spezifität als das herkömmliche Ver¬ fahren auf.
Figur 2 und Figur 3 zeigen das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Nukleinsäure (23, 25) , deren Sequenz nicht oder nur abschnittsweise mit der Sequenz der zu identi¬ fizierenden miDNA-96 überein stimmt (Figur 2 bzw. 3) . Eine solche Nukleinsäure (23, 25) wird als Negativkontrolle zur Verifizierung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt. Figur 2 zeigt, dass eine Nukleinsäure (23) , deren Sequenz nicht mit der Sequenz der miDNA-96 überein stimmt, bei der
Inkubation des Trägers (1) bei der Hybridisierungstemperatur von 45°C nicht mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) hybri¬ disiert. Daher kann die T4 DNA Ligase das freie Ende des Fän- ger-Oligonukleotids (5) nicht mit einem Ende der Nukleinsäure (23) ligieren. Während der Inkubation des Trägers (1) bei der ersten Reaktionstemperatur von 50°C löst sich das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) von dem Fänger-Oligonukleotid (5). Aufgrund des fehlenden Gegenstrang-Oligonukleotids (7) kann im nachfolgenden Schritt das Reporter-Oligonukleotid (11) nicht an das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) binden. Dadurch wird das Reporter-Oligonukleotid (11) bei der zweiten
Reaktitemperatur von dem Träger (1) entfernt, so dass keine Esterase 2 auf dem Träger (1) verbleibt. Folglich wird beim Auslesen der Esterase 2 kein Strom gemessen.
Figur 3 zeigt, dass eine Nukleinsäure (25) , deren Sequenz ab¬ schnittsweise mit der Sequenz der miDNA-96 überein stimmt, bei der Inkubation des Trägers (1) bei der Hybridisierungs- temperatur von 45°C in dem Abschnitt, der mit der Sequenz der miDNA-96 übereinstimmt, mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) hybridisiert. Das erste Ende der Nukleinsäure (25) und das freie Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) hybridisieren mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7), so dass im nächsten Schritt die T4 DNA Ligase die be¬ nachbarten Enden des Fänger-Oligonukleotids (5) und der Nuk¬ leinsäure (25) miteinander ligiert. Damit wird die Nuklein¬ säure (25) kovalent an das Fänger-Oligonukleotid (5) gebun- den. Beim Inkubieren des Trägers bei der ersten Reaktionstemperatur von 50°C löst sich das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) von dem Fänger-Oligonukleotid (5) und der nur abschnittsweise hybridisierten Nukleinsäure (25) . Die Nukleinsäure (25) bleibt durch die kovalente Bindung an das Fänger- Oligonukleotid (5) auf dem Träger (1) . Durch das Fehlen des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) kann das Reporter- Oligonukleotid (11), das in einem nachfolgenden Schritt hin¬ zugefügt wird, nicht an das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) binden und wird beim Waschen des Trägers (1) bei der zweiten Reaktionstemperatur von 55°C von dem Träger (1) entfernt. Damit verbleibt keine Esterase 2 auf dem Träger (1), so dass beim Auslesen der Esterase 2 kein Strom gemessen wird.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9), umfas¬ send die Schritte
a) Bereitstellen mindestens eines festen Trägers (1), auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid (5) immobili¬ siert ist;
b) In-Kontaktbringen des Trägers (1) bei einer ersten Hybridisierungsbedingung mit mindestens einem Gegen- strang-Oligonukleotid (7) und mindestens einer
einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9), das Gegenstrang- Oligonukleotid (7) umfassend eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger- Oligonukleotid (5) , eine Oligonukleotid-Sequenz komple¬ mentär zu der Ziel-Nukleinsäure (9) und eine
Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komple¬ mentär zu einem Reporter-Oligonukleotid (11), um das Fän¬ ger-Oligonukleotid (5) mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) zu hybridisieren, so dass ein erstes Ende der Ziel- Nukleinsäure (9) und ein freies Ende des Fänger- Oligonukleotids (5) mit benachbarten Nukleotiden des Ge- genstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden;
c) Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) , um die Ziel-Nukleinsäure (9) kovalent an das Fänger- Oligonukleotid (5) zu binden;
d) Inkubieren des Trägers (1) bei einer ersten Reaktions¬ bedingung derart, dass die Ziel-Nukleinsäure (9) nur bei Gegenwart von an ihrem ersten Ende ligiertem Fänger- Oligonukleotid (5) mit dem Träger (1) verbunden bleibt und das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) nur bei Gegenwart einer Ziel-Nukleinsäure (9), die komplementär zu der ent¬ sprechenden Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang- Oligonukleotids (7) und an das freie Ende des Fänger- Oligonukleotids (5) ligiert ist, mit dem Träger (1) ver¬ bunden bleibt; e) In-Kontaktbringen des Trägers (1) bei einer zweiten Hybridisierungsbedingung mit mindestens einem Reporter- Oligonukleotid (11), das eine Markierung (13) aufweist, um das Reporter-Oligonukleotid (11) mindestens ab¬ schnittsweise mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) zu hybridisieren, so dass ein zweites Ende der Ziel- Nukleinsäure (9) und ein erstes Ende des Reporter- Oligonukleotids (11) mit benachbarten Nukleotiden des Ge- genstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden;
f) Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids (11), um die Ziel-Nukleinsäure (9) kovalent an das Reporter- Oligonukleotid (11) zu binden;
g) Inkubieren des Trägers (1) bei einer zweiten Reaktionsbedingung derart, dass das Reporter-Oligonukleotid (11) nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligier- ter Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Träger (1) verbunden bleibt ;
h) Auslesen der Markierung (13) des Reporter- Oligonukleotids (11) auf dem Träger (1) .
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c) und/oder in Schritt d) und/oder vor
Schritt f) und/oder in Schritt g) und/oder vor Schritt h) zusätzlich ein Waschen des Trägers (1) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Waschen des Trägers (1) vor Schritt c) bei einer stringenten Reaktionsbedingung erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel-Nukleinsäure (9) eine RNA, vorzugsweise eine miRNA, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei verschiedene Ziel-Nukleinsäuren (9), vorzugsweise drei bis 130 ver¬ schiedene Ziel-Nukleinsäuren (9) gleichzeitig detektiert werden, wobei der in Schritt c) erzeugte Doppelstrang für alle Ziel-Nukleinsäuren (9) eine gleiche Schmelztempera¬ tur aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fänger-Oligonukleotid (5) und/oder das Reporter-Oligonukleotid (11) ein chimäres Oligonukleotid, das Ribonukleotide und
Desoxyribonukleotide aufweist, ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein 3 ' -Hydroxyl-Ende des Chimären Oligonukleotids mindes¬ tens ein Ribonukleotid, vorzugsweise vier Ribonukleotide aufweist .
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für das Ligieren eine T4 DNA Ligase verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) ein Oligodesoxyribonukleotid ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen der Markierung (13) mittels eines „branched DNA"-Tests erfolgt und das Reporter-Oligonukleotid (11) vorzugsweise ein
"Preamplifier" ist.
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