WO2015025940A1 - 新規アデノウイルス及びその増殖促進方法 - Google Patents

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    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • the present invention relates to an adenovirus (hereinafter referred to as “Ad”) that can effectively propagate in desired cells. Furthermore, it relates to a method for promoting the proliferation of Ad.
  • Ad adenovirus
  • Ad vectors are used for gene transformation research and production of genetically engineered cells for industrial use as gene transfer vectors due to their excellent gene transfer characteristics, and also applicable to various diseases as gene therapy vectors. Is expected.
  • the limited growth type Ad is characterized in that it does not grow on normal cells but grows only on tumor cells or special cells. Infection with Ad (type 2 or type 5) begins when the knob at the end of the fiber protruding from the viral protein shell (capsid) is adsorbed on the cell surface coxsackie-adenovirus receptor (CAR). The penton base at the base of the fiber binds and enters the cell.
  • CAR coxsackie-adenovirus receptor
  • Ad is considered to have a higher efficiency in transferring the viral genome into the nucleus than other DNApox viruses, resulting in higher gene transfer efficiency as a vector.
  • Ad replication begins by first expressing the E1A protein and transactivating the expression of all other early proteins, E1B, E2, E3 and E4. Since the E1 substitution vector generally applied lacks E1A and E1B, HEK293 cells in which the E1 protein is constitutively expressed can replicate almost the same as the wild type. In cells other than HEK293 cells, the vector genome is efficiently transferred into the nucleus according to the previous invasion method, but since no protein expression from all subsequent viruses occurs, it does not replicate as a virus. Such vectors are classified as non-proliferating. On the other hand, attempts have been made to replicate Ad only in tumor cells and kill the tumor cells.
  • Restricted growth type Ad which does not proliferate in normal cells but specifically kills tumor cells by infecting and proliferating in tumor cells, is expected as a next-generation tumor therapeutic agent.
  • E1B mutant viruses that can grow only in p53-deficient cells and E1A are expressed from tumor cell-specific promoters, and restricted-proliferation type Ad has been developed that replicates only in tumor cells.
  • restricted-proliferation type Ad has been developed that replicates only in tumor cells.
  • a technology has been developed in which a reporter gene such as GFP is mounted on a restricted growth type Ad, and is replicated only in tumor cells so that GFP is produced and fluorescent light is emitted to detect tumor cells.
  • the conventional limited growth type Ad has a problem that a sufficient therapeutic effect cannot be obtained due to a slow growth rate in tumor cells.
  • Ad production packaging cells for producing restricted-proliferation type Ad, non-proliferation type Ad or other Ad used for gene transfer vectors, gene therapy vectors, tumor therapeutic agents, tumor detection agents, and other uses
  • Ad production packaging cells for producing restricted-proliferation type Ad, non-proliferation type Ad or other Ad used for gene transfer vectors, gene therapy vectors, tumor therapeutic agents, tumor detection agents, and other uses
  • the growth rate of Ad is slow, a sufficient amount of Ad cannot be obtained effectively.
  • VA-RNA which is a small molecule RNA, can be cited as a viral factor that promotes Ad growth.
  • VA-RNA includes VA-RNA I and VA-RNA II, both of which are untranslated RNA polymerase III transcripts (single-stranded RNA) of about 160 bases in length, especially VA-RNA I, which has a large amount of transcription Reaches ⁇ 10 8 molecules per cell during Ad replication.
  • VA-RNA I plays a central role in inhibiting the activation of protein kinase R (protein kinase R: PKR) as an antiviral response of host cells during Ad replication, and in the absence of VA-RNA I It has been reported that PKR is activated and phosphorylation of the translation initiation factor eIF-2 ⁇ is induced, resulting in inhibition of translation of viral mRNA (Non-patent Documents 1 and 2). That is, it is considered that VA-RNA promotes the translation of the viral gene by inhibiting PKR and thus promotes the growth of the virus. It has also been reported that VA-RNA inhibits ADAR (RNA-specific adenosine deaminase) (Non-patent Document 3).
  • ADAR RNA-specific adenosine deaminase
  • VA-RNA is transcribed in the nucleus, it is exported to the nucleus, that is, to the cytoplasm by Exportin-5 (XPO5), which is a nuclear export protein, and after being cleaved by Dicer, forms mivaRNA (viral miRNA),
  • XPO5 Exportin-5
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • Ago Argonaute protein
  • Non-patent Document 6 the growth of Ad is suppressed by introducing mivaRNA antisense oligonucleotides into cells.
  • An object of the present invention is to provide Ad that can effectively proliferate in desired cells such as target tumor cells. Another object of the present invention is to provide a method for promoting the growth of Ad, in which Ad is effectively propagated in desired cells. Furthermore, an object of the present invention is to provide an Ad-producing packaging cell that can effectively proliferate Ad.
  • the present inventors focused on the relationship between Ad-derived mivaRNA and virus growth in the Ad genome, and as a result of intensive studies, conventionally, Ad-derived mivaRNA has suppressed gene expression in infected cells. Despite being thought to promote virus growth (Non-Patent Documents 5 and 6), surprisingly, Ad effectively proliferated in cells by suppressing the function of Ad-derived mivaRNA. The inventors have found that the problems can be solved and completed the present invention. Moreover, it discovered that the viral growth promotion effect of VA-RNA can be acquired by suppressing the cutting
  • this invention consists of the following. 1. A method for promoting the growth of adenovirus, comprising suppressing the function of adenovirus-derived mivaRNA. 2. A method for promoting the growth of adenovirus, wherein the method promotes the growth of adenovirus by inhibiting miR-27a and / or miR-27b. 3. 3. The method of promoting the growth of adenovirus according to item 1 or 2, wherein suppressing mivaRNA function or inhibiting miR-27a and / or miR-27b inhibits at least one of Dicer and Ago2. 4). 4.
  • 3. The method for promoting the growth of an adenovirus according to item 2 wherein the inhibition of miR-27a or miR-27b is inhibition by a decoy nucleic acid for miR-27a or miR-27b, or an inhibitor for miR-27a or miR-27b.
  • An adenovirus comprising an siRNA expression cassette for Dicer or Ago2 or a decoy nucleic acid expression cassette for miR-27a or miR-27b in the adenovirus genome.
  • the siRNA for Dicer is RNA containing the oligonucleotide shown in 1) or 2) below
  • the siRNA for Ago2 is RNA containing the oligonucleotide shown in 3) or 4) below
  • the decoy nucleic acid for miR-27a Is an RNA containing the oligonucleotide shown in 5) below
  • the decoy nucleic acid against miR-27b is an RNA containing the oligonucleotide shown in 6) below; 1) GAAUCAGCCUCGCAACAAA (SEQ ID NO: 1) 2) UUUGUUGCGAGGCUGAUUC (SEQ ID NO: 2) 3) GCACGGAAGUCCAUCUGAA (SEQ ID NO: 3) 4) UUCAGAUGGACUUCCGU
  • adenovirus according to item 9 or 10 above, wherein the adenovirus is a restricted propagation adenovirus.
  • An antitumor agent or tumor detection agent comprising the restricted-proliferative adenovirus according to item 11 as an active ingredient.
  • 13 In the genome of adenovirus-producing packaging cells, an adenovirus is produced, characterized in that at least an expression cassette of siRNA for Dicer or Ago2 or an expression cassette of miR-27a or miR-27b decoy nucleic acid is introduced Packaging cells to do.
  • the siRNA for Dicer is RNA containing the oligonucleotide shown in 1) or 2) below, and the siRNA for Ago2 is RNA containing the oligonucleotide shown in 3) or 4) below, and the decoy nucleic acid for miR-27a Is a RNA containing the oligonucleotide shown in 5) below, and the decoy nucleic acid against miR-27b is an RNA containing the oligonucleotide shown in 6) below: 1) GAAUCAGCCUCGCAACAAA (SEQ ID NO: 1) 2) UUUGUUGCGAGGCUGAUUC (SEQ ID NO: 2) 3) GCACGGAAGUCCAUCUGAA (SEQ ID NO: 3) 4) UUCAGAUGGACUUCCGUGC (SEQ ID NO: 4) 5) GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA (SEQ ID NO: 10) 6) GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA (SEQ ID NO
  • a method for treating a malignant tumor comprising administering the antitumor agent according to 1.
  • B. A method for producing Ad, comprising a step of suppressing the function of Ad-derived mivaRNA in a system that produces Ad using an Ad genome and an Ad-producing packaging cell.
  • C. A method for producing Ad, comprising a step of inhibiting miR-27a and / or miR-27b in a system that produces Ad using an Ad genome and an Ad-producing packaging cell.
  • E The method for producing Ad according to item D, wherein the inhibition of Dicer or Ago2 is inhibition of Dicer or Ago2 by RNA interference.
  • F. Inhibition of Dicer or Ago2 by RNA interference is due to the expression of siRNA against Dicer mounted on Ad or the expression of siRNA against Ago2, or the expression of siRNA against Dicer or the siRNA against Ago2 introduced into Ad production packaging cells.
  • G The production method according to item D, wherein the inhibition of Dicer or Ago2 is inhibition by knockout of the Dicer gene or Ago2 gene in Ad production packaging cells.
  • the production method according to item D wherein the inhibition of Dicer or Ago2 is inhibition by an antibody of Dicer or Ago2, or inhibition by an inhibitor of Dicer or Ago2.
  • the production method according to item C wherein the inhibition of miR-27a or miR-27b is inhibition by a decoy nucleic acid for miR-27a or miR-27b, or an inhibitor for miR-27a or miR-27b.
  • the Ad of the present invention can promote the proliferation of Ad more effectively than the conventional Ad. According to the antitumor agent containing Ad of the present invention as an active ingredient, proliferation is effectively promoted in the target tumor cells, and an antitumor effect is exhibited.
  • Ad can be effectively proliferated in the desired cells, such as target tumor cells and Ad proliferation cells, it will effectively demonstrate anti-malignant tumor effects such as tumor lysis, tumor detection effects, and efficient Ad production effects Yes.
  • Ad-shDicer a figure which shows typically the structure of the genome of Ad (henceforth Ad produced in Example 1 is called "Ad-shDicer") carrying shRNA (short hairpin RNA) with respect to Dicer.
  • Ad-shDicer a figure which shows the result of having confirmed the genome growth ability of Ad-shDicer in various human cancer cells.
  • Example 1-1 It is a figure which shows the result of having confirmed the cell survival rate when making Ad-shDicer act on various human cancer cells.
  • Example 1-2 It is a figure which shows the result of having confirmed the cell survival rate when making Ad-shDicer act on various human normal cells.
  • Example 1-2 It is a figure which shows the relative value by measuring the amount of Dicer® mRNA when Ad-shDicer is allowed to act on various cancer cells.
  • Example 1-3 It is a conceptual diagram which shows the process in which Ad-derived VA-RNA is cleaved by Dicer and forms an Ago2 protein and RISC complex.
  • Example 1-4 It is a figure which shows the result of having confirmed the viral genome amount when adding wild type Ad to the said various cells made to interfere with RNA by siRNA introduction
  • Example 1-4 It is a figure which shows the result of having confirmed the influence which it has on the production of Ad origin VA-RNA I or VA-RNA II when introducing siRNA with respect to Ago2 or Dicer into various cancer cells by electrophoresis.
  • Example 1-4 It is a figure which shows the result of having confirmed the relative expression level of Ad origin mivaRNA (TM) I or mivaRNA (TM) II when siRNA with respect to Ago2 or Dicer is introduce
  • TM Ad origin mivaRNA
  • TM mivaRNA
  • Example 1-5 It is a figure which shows the result of having confirmed the viral genome amount when adding wild-type Ad to each cell when Ago2 or Dicer is overexpressed in various cancer cells.
  • Comparative Example 1 It is a figure which shows the result of having confirmed the cell killing effect with respect to the cancer cell of Ad-shDicer.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having confirmed the anticancer effect
  • Example 3 It is a figure which shows the result of having confirmed the expression level of miR-27a, b in a Dicer knockdown cell.
  • Example 4 The genome structure of an Ad carrying a tough decoy RNA against miR-27a or miR-27b (hereinafter, the Ad produced in Example 4 is referred to as “Oncolytic Ad-TuD-27a” or “Oncolytic Ad-TuD-27b”). It is a figure shown typically.
  • Example 4 It is a figure which shows the result of having confirmed the cancer cell survival rate when making Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD-27b act.
  • Example 4-1 It is a figure as a result of confirming Ad genome growth ability in a cancer cell by Oncolytic®Ad-TuD-27a or Oncolytic®Ad-TuD-27b.
  • Example 4-2 It is a figure as a result of confirming Ad genome growth ability in a cancer cell by Oncolytic®Ad-TuD-27a or Oncolytic®Ad-TuD-27b.
  • Ad means an adenovirus
  • Ad genome means genetic information possessed by Ad, that is, a DNA sequence contained in Ad.
  • the present invention relates to a method for promoting the proliferation of Ad, including suppressing the function of Ad-derived mivaRNA.
  • “suppressing the function of mivaRNA” means “inhibition of mivaRNA production” or “inhibition of mivaRNA activity”. Specifically, it means “inhibition of mivaRNA production by inhibiting cleavage of VA-RNA” or “inhibition of mivaRNA activity by inhibiting RISC formation of mivaRNA and Ago2.” Such “suppressing the function of mivaRNA” is achieved by inhibiting at least one of Dicer and Ago2. In addition, by inhibiting Dicer, “inhibiting cleavage of VA-RNA”, it is possible to obtain a virus growth promoting effect of VA-RNA.
  • the present invention also relates to a method for promoting the proliferation of Ad by inhibiting miR-27a and / or miR-27b.
  • inhibition of miR-27a and / or miR-27b is achieved by inhibiting at least one of Dicer and Ago2.
  • Other methods include, for example, inhibition by mico-27a or miR-27b described later with a decoy nucleic acid, inhibition with an inhibitor against miR-27a or miR-27b, inhibition by miR-27a or miR-27b knockout, etc. .
  • the method for inhibiting Dicer or Ago2 is not particularly limited, but for example, inhibition by RNA interference with Dicer or Ago2, inhibition by Dicer gene or Ago2 gene knockout, or inhibition by using antibodies or inhibitors against Dicer or Ago2 etc. Can be mentioned. Inhibition by RNA interference and inhibition by gene knockout are preferred, and inhibition by RNA interference is most preferred. Inhibition by RNA interference with Dicer or Ago2 can be achieved by allowing the Ad genome or Ad producing cells to act with siRNA against Dicer or Ago2. In order to cause siRNA to act on Dicer or Ago2, an siRNA expression cassette for Dicer or Ago2 can be mounted on the Ad genome or introduced into an Ad-producing cell. Moreover, siRNA for Dicer or Ago2 may be added to the culture system of Ad-producing cells.
  • the siRNA for Dicer or Ago2 may be any siRNA having an RNA interference function for Dicer or Ago2, and is not particularly limited and may be any siRNA known per se or developed in the future.
  • Examples of siRNA and shRNA having an RNA interference function for Dicer known per se include shRNAs shown in the following papers. Inhibition of Dicer or Ago2 by RNA interference and inhibition of Dicer gene or Ago2 gene by knockout are known methods such as NucleicNAcids Research, (2006) Vol. 34, No. 17 4801-4815 (doi: 10.1093 / nar / gkl646), Cell 141, 1195-1207, June 25 (2010), Molecular Therapy vol. 17 no. 4, 725-732 apr.
  • siRNA against Dicer examples include oligonucleotides having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 below. ⁇ GAAUCAGCCUCGCAACAAA (SEQ ID NO: 1) ⁇ UUUGUUGCGAGGCUGAUUC (SEQ ID NO: 2)
  • an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is used as a vector based on the sequence of shRNA that is the precursor of siRNA. It can be mounted and used.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 7 is the base sequence of the underlined part in SEQ ID NO: 5, and this part is considered to be the most important part in RNA interference action.
  • GATCCC GAATCAGCCTCGCAACAAA TTCAAGAGA TTTGTTGCGAGGCTGATTC TTTTTGGAAAT (SEQ ID NO: 5)
  • GAATCAGCCTCGCAACAAA GAATCAGCCTCGCAACAAA
  • SEQ ID NO: 7 ⁇ TTTGTTGCGAGGCTGATTC (SEQ ID NO: 7)
  • siRNA against Ago2 include oligonucleotides comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 below.
  • GCACGGAAGUCCAUCUGAA SEQ ID NO: 3
  • UUCAGAUGGACUUCCGUGC SEQ ID NO: 4
  • siRNA against Dicer or Ago2 when RNA interference is used to inhibit Dicer or Ago2, it can be achieved by inhibition by expression of siRNA against Dicer or Ago2 mounted on Ad. Similarly, it can be achieved by expression of siRNA against Dicer or Ago2 introduced into packaging cells for producing Ad. Specific examples of siRNA against Dicer or Ago2 are as described above.
  • the “expression of siRNA against Dicer or Ago2” may be an siRNA expression cassette containing siRNA against Dicer or Ago2.
  • siRNA expression cassette containing “siRNA against Dicer or Ago2” may be, for example, an siRNA expression cassette containing “siRNA against Dicer or Ago2,” or an siRNA expression cassette containing “shRNA against Dicer or Ago2.” There may be. Since shRNA is a precursor of siRNA, it is also included in “expression of siRNA” in this specification that siRNA is produced after shRNA is expressed.
  • Dicer or Ago2 when Dicer or Ago2 is inhibited using a Dicer or Ago2 antibody, or a Dicer or Ago2 inhibitor, a known antibody or inhibitor (decoy nucleic acid or aptamer nucleic acid is used). Can be used).
  • Dicer or Ago2 of Ad proliferation cells By inhibiting Dicer or Ago2 of Ad proliferation cells with the antibody or the inhibitor, Ad proliferation in the Ad proliferation cells can be promoted.
  • a decoy nucleic acid against miR-27a or miR-27b can act on Ad to inhibit miR-27a or miR-27b.
  • a decoy nucleic acid expression cassette for miR-27a or miR-27b can be mounted on the Ad genome or introduced into Ad-producing cells.
  • an antisense oligonucleotide against miR-27a or miR-27b or a reagent commercially available as an inhibitor of miR-27a or miR-27b, such as miRVana miRNA inhibitor (Ambion) may be used.
  • the decoy nucleic acid for miR-27a may be a sequence containing at least one or more of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • Specific examples of the decoy nucleic acid for miR-27a include an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 below.
  • the underlined part of SEQ ID NO: 12 is an antisense sequence for miR-27a, which corresponds to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • the decoy nucleic acid for miR-27b may be a sequence containing at least one or more of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • a specific example of a decoy nucleic acid for miR-27b includes an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 below.
  • the underlined part of SEQ ID NO: 13 is an antisense sequence for miR-27b and corresponds to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • an oligonucleotide necessary as appropriate may be included.
  • GCGCAACUUAGAUCUCCACUGUGAA (SEQ ID NO: 10) GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA (SEQ ID NO: 11) ⁇ GACGGCGCUAGGAUCAUCAAC GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAAC GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU (SEQ ID NO: 12) ⁇ GACGGCGCUAGGAUCAUCAAC GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAAC GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU (SEQ ID NO: 13)
  • Examples of the Ad whose proliferation is promoted in the “method for promoting the proliferation of Ad” of the present invention include an Ad that can be replicated only in a specific cell type, that is, a restricted proliferation Ad and a non-proliferation Ad vector. Particularly preferred is restricted growth type Ad.
  • restricted growth type Ad As shown in the background art section of this specification, a restricted growth type Ad that does not grow in normal cells but specifically infects and proliferates and kills tumor cells or detects tumor cells is a next generation tumor. Although it has been expected as a therapeutic drug and a tumor detection drug, the conventional limited growth type Ad has a problem that a sufficient therapeutic effect cannot be obtained due to a slow growth rate in tumor cells.
  • Ad growth promotion method an antitumor agent or tumor cell that causes Ad to replicate only in tumor cells and kills tumor cells is detected. It can be effectively used as a detection agent.
  • Restricted growth type Ad is an Ad that occurs only in tumor cells, for example, and can be exemplified by those reported in NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001).
  • Ad carrying a promoter that controls gene expression in a tumor cell-specific manner can be mentioned. As long as it is a promoter capable of exhibiting such a function, either a promoter known per se or a promoter developed in the future may be used.
  • Examples include hTERT promoter, IAI.3B promoter, midkine promoter, ⁇ -HCG promoter, SCCA1 promoter, cox-2 promoter, PSA promoter, or other tumor-specific promoters.
  • a suitable promoter that can correspond to the virus used for expression of the target gene, in addition to a tumor-specific promoter, for example, CMV promoter, SV40 late promoter, MMTV LTR promoter, RSV LTR promoter, SR ⁇ promoter, etc. may be used. it can.
  • the “Ad” that promotes proliferation of the present invention must be devised to suppress the function of Ad-derived mivaRNA or to inhibit miR-27a and / or miR-27b in the Ad genome.
  • expression cassettes such as decoy nucleic acids and aptamer nucleic acids for Dicer or Ago2
  • expression cassettes such as antisense oligonucleotides for Dicer or Ago2 genes may be mounted.
  • expression cassettes such as decoy nucleic acids and aptamer nucleic acids for miR-27a or miR-27b, antisense oligonucleotides for miR-27a or miR-27b, etc.
  • the expression cassette may be mounted.
  • the siRNA or shRNA for Dicer and Ago2 or the decoy nucleic acid for miR-27a or miR-27b is as described above.
  • Ad is typically a human type 2, type 5, type 11, type 35 Ad, a non-human type host Ad, mouse Ad, dog Ad, sheep Ad and bird Ad and so on.
  • the E1 region-deficient Ad refers to an Ad that is functionally deficient in the E1 gene region so that the E1 protein is not expressed in the Ad genome.
  • the E1 gene region specifically corresponds to positions 342 to 3523 in the human type 5 Ad genome (GenBank Accession Number: M73260, M29978), for example.
  • the functional deletion of the E1 gene region means, for example, that the E1 protein that functions in the host cell is not expressed, and it is not necessary to delete all of the genomic region encoding the E1 protein.
  • the Ad that can be used for the Ad of the present invention may be, for example, a 5-type Ad that functionally lacks the E3 gene region in addition to the E1 region.
  • the E3 region of the type 5 Ad genome (GenBank Accession number: M73260, M29978) refers to a site corresponding to the 28133-30308th or 27865-30309th.
  • Ad can be promoted by applying the “method for promoting the proliferation of Ad” of the present invention to at least either “Ad” or “Ad proliferation cell”.
  • the Ad in this case is not limited to the restricted growth type Ad, and may be a non-growth type Ad. Regardless of the restricted growth type Ad or the non-growth type Ad, Ad can be effectively utilized if virus growth can be promoted in vitro.
  • Examples of the “Ad proliferation cell” for producing Ad by effectively promoting proliferation include “Ad production packaging cell”.
  • Ad production packaging cell is not particularly limited as long as it is a cell capable of producing Ad.
  • examples of cells that can be used as packaging cells for producing Ad include HEK293 cells in addition to various tumor cells.
  • Ad production packaging cells to effectively promote growth of Ad are designed to suppress the function of Ad-derived mivaRNA or to inhibit miR-27a and / or miR-27b It must be a cell.
  • An expression cassette such as a decoy nucleic acid or aptamer nucleic acid for Dicer or Ago2 or an antisense cassette for a Dicer or Ago2 gene may be introduced.
  • expression cassettes such as decoy nucleic acids and aptamer nucleic acids for miR-27a or miR-27b, antisense oligonucleotides for miR-27a or miR-27b, etc.
  • the expression cassette may be introduced.
  • the siRNA or shRNA for Dicer and Ago2 or the decoy nucleic acid for miR-27a or miR-27b is as described above.
  • the present invention extends to an antitumor agent or a tumor detection agent containing the Ad of the present invention as an active ingredient.
  • the antitumor agent of the present invention includes tablets, capsules, powders, granules, pills, liquids, syrups and other oral administration agents, injections, external preparations, suppositories, ophthalmic preparations and the like. Depending on the form, it can be administered orally or parenterally. Preferably, local injection into a tumor, muscle, abdominal cavity, etc., injection into a vein, etc. are exemplified.
  • the antitumor agent or tumor detection agent containing an effective amount of Ad of the present invention is produced according to a conventional method, and generally a physiological saline, a cell culture solution or the like can be used as a diluent. Further, if necessary, bactericides, preservatives, stabilizers, tonicity agents, soothing agents and the like may be added.
  • the antitumor agent of the present invention can be applied to almost all malignant tumors, and the types of cancer to be treated are ovarian cancer, squamous cell carcinoma (cervical cancer, skin cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, Lung cancer etc.), digestive organ cancer (colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer, gastric cancer etc.), neuroblastoma, brain tumor, breast cancer, testicular cancer, prostate cancer and the like.
  • ovarian cancer squamous cell carcinoma
  • squamous cell carcinoma cervical cancer, skin cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, Lung cancer etc.
  • digestive organ cancer colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer, gastric cancer etc.
  • neuroblastoma brain tumor, breast cancer, testicular cancer, prostate cancer and the like.
  • the present invention extends to a method for treating malignant tumors. Specifically, it is by administering an effective amount of the antitumor agent of the present invention for the treatment and / or prevention of any of the aforementioned malignant tumors.
  • the antitumor agent of the present invention can be applied to the affected area as it is, or any known method such as intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection, inhalation from the nasal cavity, oral cavity or lung, oral administration, It can also be introduced into a living body (target cell or organ) by intravascular administration using a catheter or the like.
  • a known pharmaceutically acceptable carrier such as an excipient, a bulking agent, a binder or a lubricant, a known additive (buffering agent, isotonicity) Agents, chelating agents, coloring agents, preservatives, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, etc.).
  • the dose for treatment can be appropriately determined according to the size / type of the tumor, the degree of symptoms, the administration route, the administration subject, the age of the patient, the body weight, and the like.
  • the antitumor agent of the present invention may be administered to a patient several times, or may be divided into multiple courses, and the number of administrations per course, the administration interval, etc. may be arbitrarily set.
  • the amount of the virus of the present invention which is usually an active ingredient, can be about 10 6 to 10 11 PFU (plaque forming units), preferably about 10 9 to 10 11 PFU.
  • the antitumor agent of this invention can also make it easy to infect Ad contained as an active ingredient by suppressing a living body's immunity by using a well-known immunosuppressive agent etc.
  • the antitumor agent of the present invention can be used in combination with at least one anticancer agent selected from the group consisting of known anticancer agents and radiation.
  • Anticancer agents include, but are not limited to: (A) Alkylation activator: This preparation has an action of introducing an alkyl group into a nucleic acid protein of cancer cells to cause cell damage. For example, carbocon, psulfan (mustard drug), nimustine (nitrosoureas) ) Etc.
  • Antimetabolite active agent This preparation has an action of antagonizing an enzyme in the metabolic process and inhibiting cell synthesis. For example, methotrexate (folic acid), mercaptopurine (purine), cytarabine (pyrimidine) System), fluorouracil, tegafur, carmofur and the like.
  • C Antibiotics: Actinomycin D, preomycin, adriamycin, mitomycin C, etc. having anticancer activity.
  • Microtubule inhibitory active agent This preparation acts on microtubules and exhibits an antitumor effect, such as docetaxel, paclitaxel (taxane), vinorelbine, pinklistin, vinblastine (alkaloids), etc.
  • Platinum preparation This preparation has an action of inhibiting DNA synthesis by forming intra-DNA chain or inter-chain bond or DNA protein bond, and examples thereof include cisplatin, arboplatin, nedaplatin and the like.
  • Topoisomerase inhibitory activator Examples include irinotecan (topoisomerase I inhibitor), podophyllotoxin derivative (topoisomerase II inhibitor), which inhibit topoisomerase. Topoisomerase is an enzyme that catalyzes a reaction that temporarily cuts DNA and changes the linking number of DNA strands.
  • the present invention extends to a highly sensitive detection method for malignant tumors. Specifically, for detection of any of the above-mentioned malignant tumors, the target cell, cultured cell, cultured tissue, collected blood or biopsy tissue of the tumor detection agent of the present invention loaded with a reporter gene such as GFP Or by administering to a living body.
  • the tumor detection agent of the present invention can be applied to the affected part of a living body as it is, or any known method, for example, injection such as vein, muscle, intraperitoneal or subcutaneous, inhalation from nasal cavity, oral cavity or lung, oral It can also be introduced into a living body (target cells or organs) by administration, intravascular administration using a catheter or the like.
  • a known pharmaceutically acceptable carrier such as an excipient, a bulking agent, a binder or a lubricant, a known additive (buffering agent, isotonicity) Agents, chelating agents, coloring agents, preservatives, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, etc.).
  • the amount used to detect malignant tumors is appropriately determined according to the collection conditions, culture conditions, tumor size / type, degree of symptoms, administration route, administration target, animal species, patient age, body weight, etc. be able to.
  • the tumor detection agent of the present invention may be administered to a living body several times, or may be divided into multiple courses, and the number of administrations per course, the administration interval, etc. may be arbitrarily set. It is also possible to collect and inspect blood and biopsy material from a living body. For example, referring to J. Clin. Invest., 119: 3172-3181 (2009) and VNATURE MEDICINE, 12: 1214-12193181 (2006), the amount of use of the tumor detection agent of the present invention can be appropriately determined. .
  • Ad as an active ingredient can be promoted effectively compared with the conventional method.
  • the cells in which the proliferation of Ad of the present invention is promoted include ovarian cancer, squamous cell carcinoma (cervical cancer, skin cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, lung cancer, etc.), digestive organ cancer (colon cancer, pancreatic cancer, liver cancer, gastric cancer). Etc.), target tumor cells such as neuroblastoma, brain tumor, breast cancer, testicular cancer, prostate cancer and the like. If Ad can be effectively proliferated in a desired cell such as a target tumor cell, an anti-malignant tumor effect such as tumor lysis or a tumor detection effect can be effectively exhibited. Then, by applying the growth promotion method of the present invention to an in vitro vitro Ad production system using cells, such as a virus production system using HEK293 cells, Ad can be produced more effectively. it can.
  • Example 1 Production of Ad loaded with shRNA against Dicer
  • a cassette loaded with shRNA against Dicer hereinafter referred to as "shDicer” in the Examples and Experimental Examples
  • Ad-shDicer The production of Ad carrying a cassette capable of expressing siRNA will be described.
  • Ad-shDicer The genomic structure of the produced Ad-shDicer is as shown in FIG.
  • the human type 5 Ad genome (GenBank Accession No .: M73260, M29978) lacks the E1 region (342-3523) and E3 region (28133-30818) of the genome. It was constructed based on a vector plasmid that can insert a foreign gene into the E1-deficient region.
  • the hTERT promoter which is a tumor-specific promoter
  • E1A, IRES, E1B, and polyA (pA) signal sequences are ligated and mounted in the E1 deficient region of the vector plasmid pAdHM19 to obtain an oncolytic Ad genome. It was.
  • the shDicer expression cassette was mounted in the E3-deficient region.
  • the sequence corresponding to shDicer in the shDicer expression cassette used in this example consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. What is important for exerting the RNA interference function is considered to be the base sequence shown underlined in SEQ ID NO: 5, specifically the base sequence part shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7. (SEQ ID NO: 5) GATCCC GAATCAGCCTCGCAACAAA TTCAAGAGA TTTGTTGCGAGGCTGATTC TTTTTGGAAAT (SEQ ID NO: 6) GAATCAGCCTCGCAACAAA (SEQ ID NO: 7) TTTGTTGCGAGGCTGATTC
  • Ad-shDicer genome prepared in 1) above was cleaved and washed with the restriction enzyme PacI present at the end of the viral genome, and transferred to HEK293 cells using the transfection reagent Lipofectamine2000 TM (Invitrogen). Transfected to produce Ad-shDicer.
  • Example 1-1 Confirmation of Ad Genome Proliferation Ability in Cancer Cells by Ad-shDicer
  • the amount of virus genome when Ad-shDicer prepared in Example 1 was allowed to act on various cancer cells was confirmed.
  • the cancer cells were confirmed for HeLa cells (human cervical cancer cells), SK HEP-1 cells (human hepatocellular carcinoma cells) and H1299 cells (human non-small cell lung cancer cells).
  • Ad-E3 (-) having the same genomic structure as Ad-shDicer prepared in Example 1 and expressing shRNA (shLuc) for firefly luciferase instead of shDicer Expressed Ad-shLuc was used.
  • Example 1-2 Confirmation of cell viability when Ad-shDicer was allowed to act The cell viability when Ad-shDicer prepared in Example 1 was allowed to act on various cancer cells and normal cells was confirmed. The control shown in Experimental Example 1-1 was confirmed in the same manner. In addition, a mock system without Ad was also used as a control. Cancer cells are HeLa cells (human cervical cancer cells), H1299 cells (human non-small cell lung cancer cells) and HepG2 cells (human hepatocellular carcinoma cells), normal cells are HUVEC (human umbilical vein endothelial cells), NHLF (human lung fibroblasts) and PrSC (prostate stromal cells) were confirmed.
  • HeLa cells human cervical cancer cells
  • H1299 cells human non-small cell lung cancer cells
  • HepG2 cells human hepatocellular carcinoma cells
  • normal cells are HUVEC (human umbilical vein endothelial cells), NHLF (human lung fibroblasts) and PrSC (prostate stromal cells) were confirmed.
  • Example 1-3 Confirmation of Dicer mRNA Level when Ad-shDicer was Acted
  • the cancer cells were confirmed for HeLa cells (human cervical cancer cells), H1299 cells (human non-small cell lung cancer cells) and SK HEP-1 cells (human hepatocellular carcinoma cells).
  • siRNA sequence for Dicer GAAUCAGCCUCGCAACAAA (SEQ ID NO: 1)
  • siRNA sequence for Dicer UUUGUUGCGAGGCUGAUUC (SEQ ID NO: 2)
  • Sequence of siRNA against Ago2 GCACGGAAGUCCAUCUGAA (SEQ ID NO: 3)
  • siRNA sequence for Ago2 UUCAGAUGGACUUCCGUGC (SEQ ID NO: 4)
  • siRNA sequence for XPO5 CUCGAUUGGAGAAGGUGUA (SEQ ID NO: 8) 6) siRNA sequence for XPO5: UACACCUUCUCCAAUCGAG (SEQ ID NO: 9)
  • SiRNA against Ago2 Dicer or XPO5 was introduced into HeLa cells (human cervical cancer cells) or H1299 cells (human non-small cell lung cancer cells).
  • HeLa cells human cervical cancer cells
  • H1299 cells human non-small cell lung cancer cells
  • control siRNA Allstars negative control siRNA; Qiagen
  • the Ad genome copy number was confirmed by quantitative PCR.
  • the copy number of the Ad genome was significantly increased compared to the control (see FIG. 7).
  • siRNA against XPO5 was allowed to act, the copy number of the Ad genome showed a value equal to or lower than that of the control (see FIG. 7).
  • SisiRNA against Dicer or Ago2 was introduced into each cell of HeLa cells or H1299 cells.
  • ControlAllsiRNA Allstars negative control siRNA
  • a VA-RNA expression plasmid was introduced.
  • the copy number of VA-RNA was measured by quantitative RT-PCR. That is, knocking down Dicer or Ago2 is thought to increase the copy number of full-length VA-RNA (see FIG. 9).
  • VA-RNA is transcribed in the cell nucleus, it is not a stage where it is transported out of the nucleus by XP05, or by suppressing the production of Ad-derived mivaRNA by introducing siRNA against Dicer or Ago2, etc. Alternatively, it was confirmed that by suppressing the activity of mivaRNA, an effect of promoting Ad proliferation can be obtained.
  • the shDicer expression cassette was introduced into H1299 cells (human non-small cell lung cancer cells), SK HEP-1 cells (human hepatocellular carcinoma cells) or HepG2 cells (human hepatocellular carcinoma cells).
  • H1299 cells human non-small cell lung cancer cells
  • SK HEP-1 cells human hepatocellular carcinoma cells
  • HepG2 cells human hepatocellular carcinoma cells
  • the Ad genome copy number was confirmed by quantitative PCR.
  • the copy number of the Ad genome was significantly increased compared to the control (see FIG. 10). From this, it was confirmed that by suppressing the production of Ad-derived mivaRNA with shDicer, the effect of promoting Ad growth can be obtained.
  • Ago2 or Dicer expression plasmids were introduced into HeLa cells (human cervical cancer cells) or H1299 cells (human non-small cell lung cancer cells).
  • the control was a cell into which a control plasmid (p3 ⁇ FLAG-CMV10) that expresses nothing was introduced.
  • the wild-type Ad solution was infected at 37 ° C. for 24 hours so that the MOI was 5%.
  • the Ad genome copy number was confirmed by quantitative PCR.
  • the copy number of the Ad genome was significantly reduced compared to the control (see FIG. 11).
  • Example 2 Cell killing effect of Ad-shDicer on each cancer cell
  • Ad-shDicer prepared by the same method as in Example 1 was used for each of HeLa cells (human cervical cells) or H1299 cells (human non-small cell lung cancer cells). The cell viability when acting on cancer cells was confirmed.
  • the control shown in Experimental Example 1-1 was confirmed in the same manner.
  • various virus suspensions prepared using the culture medium are allowed to act at MOI 0.01, 0.1, 1, 10, 100, and 37 ° C. For 24 hours. Thereafter, the virus solution was removed, a culture solution was added, and the mixture was cultured at 37 ° C.
  • the Ad-shDicer of the present invention showed a higher cell killing effect than the control Ad-E3 ( ⁇ ) and Ad-shLuc (see FIG. 12).
  • Example 3 Anti-cancer effect of Ad-shDicer on each cancer cell (anti-tumor effect)
  • the control shown in Experimental Example 1-1 was confirmed in the same manner.
  • Ad-shDicer of the present invention has a higher antitumor activity than the control Ad-E3 ( ⁇ ) and Ad-shLuc (see FIG. 13).
  • VA-RNAI and II expression plasmids (pAdvantage) -DNaeI, pAdVantage, VA-RNAI expression plasmid (pVAI) or VA-RNAII expression plasmid (pVAII) are transfected, and VA-RNA (I and II), VA-RNAI or HeLa cells overexpressing VA-RNAII were cultured for 48 hours, and the expression levels of miR-27a and miR-27b were measured by quantitative RT-PCR. As a result, it was shown that the expression levels of miR-27a and miR-27b decreased due to overexpression of VA-RNA, respectively (see FIG. 15A).
  • HeLa cells were transfected with a VA-RNA expression plasmid and a reporter plasmid (psiCHECK-2-mR-27aT or -miR-27bT) containing 2 copies of the miR-27a or miR-27b complementary sequence in the 3'-UTR of the RLuc gene And cultured for 48 hours. Thereafter, luciferase activity was measured. As a result, it was shown that the expression levels of miR-27a and miR-27b were decreased by VA-RNA (see FIG. 15B).
  • Example 4 Preparation of Ad loaded with a tough decoy RNA expression cassette that inhibits miR-27a, b
  • a tough decoy RNA against miR-27a or miR-27b (hereinafter referred to as "TuD- 27a or TuD-27b "), and the production of an oncolytic Ad carrying a cassette capable of expressing siRNA against miR-27a or miR-27b will be described.
  • the Ad in this example is referred to as “Oncolytic Ad-TuD-27a” or “Oncolytic Ad-TuD-27b”.
  • the genomic structure of the produced Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD-27b is as shown in FIG.
  • E1 It was constructed based on a vector plasmid that lacks the region (342-3523) and the E3 region (28133-30818) and can insert a foreign gene into the E1-deficient region.
  • the hTERT promoter which is a tumor-specific promoter
  • E1A, IRES, E1B, and polyA (pA) signal sequences were ligated and mounted on the E1 deficient region of the vector plasmid pAdHM19 to obtain an Oncolytic Ad genome.
  • TuD-27a or TuD-27b an expression cassette for TuD-27a or TuD-27b was mounted in the E3-deficient region.
  • the sequence corresponding to TuD-27a or TuD-27b used in this example consists of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 or 13.
  • the underlined portion is an antisense sequence against miR-27a or miR-27b.
  • TuD-27a GACGGCGCUAGGAUCAUCAAC GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAAC GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU (SEQ ID NO: 12)
  • TuD-27b GACGGCGCUAGGAUCAUCAAC GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAAC GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA CAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU (SEQ ID NO: 13)
  • Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD-27b The TuD-27a or TuD-27b genome produced in 1) above is cleaved with the restriction enzyme PacI present at the end of the viral genome, washed, and transferred.
  • Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD-27b was prepared by transfecting HEK293 cells using the injection reagent Lipofectamine2000 TM (Invitrogen).
  • Example 4-1 Confirmation of cell viability when Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD-27b was allowed to act Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD-27b produced in Example 4 The cell viability was confirmed when this was allowed to act on HeLa cells or H1299 cells.
  • the control (conventional Oncolytic Ad) shown in Ad-E3 (-) that does not express any tough decoy RNA was also confirmed in the same manner.
  • a mock system without Ad was also used as a control.
  • Example 4-2 Confirmation of Ad Genomic Proliferation Ability in Cancer Cells by Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD-27b Oncolytic Ad-TuD-27a or Oncolytic Ad-TuD- produced in Example 4 The amount of viral genome when 27b was allowed to act on HeLa cells or H1299 cells was confirmed. The control (conventional Oncolytic Ad) was confirmed in the same manner as in Experimental Example 4-1.
  • the Ad of the present invention can promote the proliferation of Ad more effectively than the conventional Ad.
  • the antitumor agent containing Ad of the present invention as an active ingredient proliferation is effectively promoted in the target tumor cells, and an antitumor effect is exhibited. Thereby, a more effective antitumor agent can be provided and useful.
  • Ad contained as an active ingredient in the antitumor agent of the present invention has a growth promoting ability in a desired target cell, and therefore can be used at a lower concentration than normal restricted growth Ad, and is also economically useful. .
  • the proliferation promoting method of the present invention it is possible to effectively promote the proliferation of Ad as compared with the conventional method. If Ad can be effectively propagated in a desired cell such as a target tumor cell, an antimalignant effect such as tumor lysis can be effectively exerted. Then, by applying the growth promotion method of the present invention to an Ad production system in cells, Ad can be produced more effectively, which is useful.

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Abstract

標的腫瘍細胞等、所望の細胞で効果的に増殖しうるアデノウイルス（Ad）を提供することを課題とする。また、所望の細胞でAdを効果的に増殖させる、Ad増殖促進方法を提供する。さらに、Adを効果的に増殖しうるAd産生用パッケージング細胞を提供する。標的腫瘍細胞等、所望の細胞で効果的に増殖しうるAdは、AdゲノムにおいてAd由来mivaRNAの機能を抑制すること、又はAdゲノムにおいてmiR-27a及び／又はmiR-27bを阻害することにより作製される。Ad由来mivaRNAの機能抑制、あるいはmiR-27a及び／又はmiR-27bの阻害は、少なくともDicer又はAgo2のいずれか一方を阻害することにより達成される。

Description

新規アデノウイルス及びその増殖促進方法
　本発明は、所望の細胞で効果的に増殖しうるアデノウイルス（以下、「Ad」という。）に関する。さらにAdの増殖促進方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１３－１７２８１０号優先権を請求する。
　近年、様々な疾患に対する遺伝子治療法の開発が試みられている。遺伝子治療法開発の鍵は、安全かつ効率良く治療遺伝子を目的の組織や細胞へと送達する技術開発であるが、克服すべき問題点も多く残されているのが現状である。
　Adベクターは、その優れた遺伝子導入特性から、遺伝子導入用ベクターとして細胞の形質転換による研究や産業向けの遺伝子組み換え細胞の製造に用いられており、また、遺伝子治療用ベクターとして各種疾患への適用が期待されている。一方、制限増殖型Adの特徴は、正常な細胞では増殖せず、腫瘍細胞や特殊な細胞のみで増殖する点である。Ad（2 型又は5型）の感染は、細胞表面のcoxsackie-adenovirus receptor（CAR）にウイルスのタンパク質の殻（カプシド）から突出するファイバーの先端のノブが吸着することにより始まり、細胞表面のインテグリンとファイバーの根本のペントンベースが結合して細胞内に侵入する。その後ライソゾームを酸性化してライソゾームから脱出し、ウイルスゲノムは核内に至り、ゲノムの複製が始まる。Adは他のDNA ウイルスと比較してウイルスゲノムの核内への移行効率が高く、その結果ベクターとしても遺伝子導入効率が高いと考えられている。
　Ad複製は、まずE1Aタンパク質が発現し、他の全ての初期タンパク質であるE1B、E2、E3 及びE4の発現をトランスアクティベートすることにより始まる。一般的に応用されているE1置換型ベクターはこのE1A やE1Bが欠失しているため、E1タンパク質が恒常的に発現しているHEK293細胞では野生型とほぼ同程度の複製が可能である。HEK293細胞以外の細胞ではベクターゲノムを先の侵入方法に則って効率よく核内に移行するものの、それ以降の全てのウイルス由来のタンパク質の発現が起きないためウイルスとして複製することがない。このようなベクターは非増殖型に分類される。
　一方、Adを腫瘍細胞でのみ複製させて腫瘍細胞を死滅させるという試みも行われている。正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞特異的に感染・増殖し腫瘍細胞を死滅させる制限増殖型Adは、次世代の腫瘍治療薬として期待を集めている。例えば、p53 欠損細胞でのみ増殖が可能なE1Bの変異ウイルスやE1Aを腫瘍細胞特異的プロモーターから発現させ、腫瘍細胞でのみ複製させる等の制限増殖型Adが開発されている。更に、制限増殖型AdにGFP等のレポーター遺伝子を搭載し、腫瘍細胞でのみ複製させることによりGFPを産生させて蛍光発光させ、腫瘍細胞を検出する技術が開発されている。しかしながら、従来の制限増殖型Adは、腫瘍細胞における増殖速度が遅いために、十分な治療効果が得られないことが問題点として挙げられる。
　また、遺伝子導入用ベクター、遺伝子治療用ベクター、腫瘍治療薬、腫瘍検出薬、その他の用途に用いられる制限増殖型Ad、非増殖型Ad又はその他のAdを産生するためのAd産生用パッケージング細胞において、Adの増殖速度が遅いために、十分な量のAdを効果的に得られないことが問題点として挙げられる。
　Adの増殖を促進するウイルス側因子として小分子RNAであるVA-RNAが挙げられる。VA-RNAにはVA-RNA I とVA-RNA IIが存在するが、ともに約160塩基長の非翻訳RNAポリメラーゼIII転写産物（一本鎖RNA）であり、特に転写量が多いVA-RNA Iは、Ad複製時には細胞あたり～108分子にも達する。VA-RNA Iは、Ad複製時に宿主細胞の抗ウイルス反応としてのプロテインキナーゼR（protein kinase R:PKR）の活性化を阻害する中心的な働きをしており、VA-RNA I非存在下ではPKRが活性化し、翻訳開始因子のeIF-2αのリン酸化が誘導され、結果としてウイルスmRNAの翻訳が阻害されることが報告された（非特許文献１、２）。すなわち、VA-RNAはPKRを阻害することにより、ウイルス遺伝子の翻訳を促進、ひいてはウイルスの増殖を促進していると考察されている。また、VA-RNAはADAR（RNA-specific adenosine deaminase）を阻害することも報告された（非特許文献３）。
　VA-RNAが核内で転写されたのち、核外輸送タンパク質であるExportin-5（XPO5）によって核外、すなわち細胞質に輸送され、Dicerによる切断を受けた後mivaRNA（viral miRNA）を形成し、Ago（Argonaute）タンパク質とともにRISC（RNA-induced silencing complex）を形成することが報告された（非特許文献４）。RISCに取り込まれたmivaRNAは、miRNA（microRNA）と同様の機構により感染細胞の遺伝子発現を制御するとともに、ウイルス増殖を促進することが報告された（非特許文献５）。恐らくこれはmivaRNAがmiRNAと同様の機構で感染細胞の遺伝子発現を制御することで、感染細胞内をウイルス増殖に適した環境にしているものと考えられた（非特許文献６）。実際に、mivaRNAのアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することでAdの増殖が抑制されている。
　従来の制限増殖型Adに比べて、標的腫瘍細胞でのウイルス増殖を促進して抗腫瘍効果を高める高い増殖能を有する制限増殖型Adの開発が求められている。
Akusjarvi G et al., Mol Cell Biol. 1987 Jan;7(1):549-51 Kitajewski J et al., Cell. 1986 Apr 25;45(2):195-200 Lei M et al., Virology. 1998 Jun 5;245(2):188-96 Shihua Lu et al., J Virol. 2004 December; 78(23): 12868-12876 Aparicio O et al., Nucleic Acids Res. 2010 Jan;38(3):750-63. doi: 10.1093/nar/gkp1028. Epub 2009 Nov 19. Aparicio O et al., J Virol. 2006 Feb;80(3):1376-84
　本発明は、標的腫瘍細胞等、所望の細胞で効果的に増殖しうるAdを提供することを課題とする。また、本発明は所望の細胞でAdを効果的に増殖させる、Ad増殖促進方法を提供することを課題とする。さらに、本発明はAdを効果的に増殖しうるAd産生用パッケージング細胞を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、Adゲノムにおいて、Ad由来mivaRNAとウイルス増殖との関係に着目し、鋭意検討を重ねた結果、従来はAd由来mivaRNAが感染細胞の遺伝子発現を抑制しウイルス増殖を促進すると考えられていた（非特許文献５、６）にも関わらず、驚くべきことに、Ad由来mivaRNAの機能を抑制することでAdが細胞内で効果的に増殖し、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。また、Ad由来VA-RNAの切断を抑制することにより、VA-RNAのウイルス増殖促進効果を得ることができることを見出した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．アデノウイルスの増殖を促進する方法であって、アデノウイルス由来mivaRNAの機能を抑制することを含む、アデノウイルスの増殖促進方法。
２．アデノウイルスの増殖を促進する方法であって、miR-27a及び／又はmiR-27bを阻害することによるアデノウイルスの増殖促進方法。
３．mivaRNAの機能を抑制、あるいはmiR-27a及び／又はmiR-27bを阻害することが、少なくともDicer又はAgo2のいずれか一方を阻害することによる、前項１又は２に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
４．Dicer又はAgo2の阻害が、RNA干渉によるDicer又はAgo2の阻害である、前項３に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
５．RNA干渉によるDicer又はAgo2の阻害が、Dicer又はAgo2に対するsiRNAによる阻害であって、Dicer又はAgo2に対するsiRNAが、当該アデノウイルスに搭載されたDicer又はAgo2に対するsiRNA、アデノウイルス産生用パッケージング細胞に導入されたDicer又はAgo2に対するsiRNA、あるいはDicer又はAgo2に対するsiRNAである、前項４に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
６．Dicer又はAgo2の阻害が、アデノウイルス産生用パッケージング細胞におけるDicer遺伝子又はAgo2遺伝子のノックアウトによる阻害である、前項３に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
７．Dicer又はAgo2の阻害が、Dicer又はAgo2の抗体による阻害、あるいはDicer又はAgo2の阻害剤による阻害である、前項３のアデノウイルスの増殖促進方法。
８．miR-27a又はmiR-27bの阻害が、miR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸、あるいはmiR-27a又はmiR-27bに対する阻害剤による阻害である、前項２に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
９．アデノウイルスゲノム において、Dicer又はAgo2に対するsiRNAの発現カセット、あるいはmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸の発現カセットが搭載されていることを特徴とするアデノウイルス。
１０．Dicerに対するsiRNAが、以下の１）又は２）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、Ago2に対するsiRNAが、以下の３）又は４）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27aに対するデコイ核酸が、以下の５）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27bに対するデコイ核酸が、以下の６）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAである、前項９に記載のアデノウイルス；
１）GAAUCAGCCUCGCAACAAA（配列番号１）
２）UUUGUUGCGAGGCUGAUUC（配列番号２）
３）GCACGGAAGUCCAUCUGAA（配列番号３）
４）UUCAGAUGGACUUCCGUGC（配列番号４）
５）GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１０）
６）GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１１）
１１．アデノウイルスが制限増殖型アデノウイルスである、前項９又は１０に記載のアデノウイルス。
１２．前項１１に記載の制限増殖型アデノウイルスを有効成分として含む抗腫瘍剤又は腫瘍検出剤。
１３．アデノウイルス産生用パッケージング細胞におけるゲノムにおいて、少なくともDicer又はAgo2に対するsiRNAの発現カセット、あるいはmiR-27a又はmiR-27bのデコイ核酸の発現カセットが導入されていることを特徴とする、アデノウイルスを作製するためのパッケージング細胞。
１４．Dicerに対するsiRNAが、以下の１）又は２）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、Ago2に対するsiRNAが、以下の３）又は４）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27aに対するデコイ核酸が、以下の５）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27bに対するデコイ核酸が、以下の６）に示すオリゴヌクレオチドでを含むRNAである、前項１３に記載のパッケージング細胞：
１）GAAUCAGCCUCGCAACAAA（配列番号１）
２）UUUGUUGCGAGGCUGAUUC（配列番号２）
３）GCACGGAAGUCCAUCUGAA（配列番号３）
４）UUCAGAUGGACUUCCGUGC（配列番号４）
５）GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１０）
６）GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１１）
１５．アデノウイルス産生用パッケージング細胞におけるゲノムにおいて、Dicer又はAgo2のいずれかの遺伝子、あるいはmiR-27a又はmiR-27bがノックアウトされていることを特徴とする、アデノウイルスを作製するためのパッケージング細胞。
　さらに本発明は、以下の概念も包含するものである。
Ａ．前項１２．に記載の抗腫瘍剤を投与することによる、悪性腫瘍の治療方法。
Ｂ．AdゲノムとAd産生用パッケージング細胞を用いてAdを産生する系において、Ad由来mivaRNAの機能を抑制する工程を含むAdの産生方法。
Ｃ．AdゲノムとAd産生用パッケージング細胞を用いてAdを産生する系において、miR-27a及び／又はmiR-27bを阻害する工程を含むAdの産生方法。
Ｄ．Ad由来mivaRNAの機能を抑制する工程、あるいはmiR-27a及び／又はmiR-27bを阻害する工程が、Dicer又はAgo2を阻害する工程である、前項Ｂ又はＣに記載の産生方法。
Ｅ．Dicer又はAgo2の阻害が、RNA干渉によるDicer又はAgo2の阻害である、前項Ｄに記載のAdの産生方法。
Ｆ．RNA干渉によるDicer又はAgo2の阻害が、Adに搭載されたDicerに対するsiRNA又はAgo2に対するsiRNAの発現による阻害、あるいはAd産生用パッケージング細胞に導入されたDicerに対するsiRNA又はAgo2に対するsiRNAの発現による阻害である、前項Ｅに記載のAd産生方法。
Ｇ．Dicer又はAgo2の阻害が、Ad産生用パッケージング細胞におけるDicer遺伝子又はAgo2遺伝子のノックアウトによる阻害である、前項Ｄに記載の産生方法。
Ｈ．Dicer又はAgo2の阻害が、Dicer又はAgo2の抗体による阻害、あるいはDicer又はAgo2の阻害剤による阻害である、前項Ｄに記載の産生方法。
Ｉ．miR-27a又はmiR-27bの阻害が、miR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸、あるいはmiR-27a又はmiR-27bに対する阻害剤による阻害である、前項Ｃに記載の産生方法。
　本発明のAdは、従来のAdに比べて効果的にAdを増殖促進させることができる。本発明のAdを有効成分として含む抗腫瘍剤によれば、効果的に標的となる腫瘍細胞内で増殖が促進され、抗腫瘍効果が発揮される。
　本発明のAdの増殖促進方法によれば、従来の方法に比べて、効果的にAdを増殖促進させることができる。標的腫瘍細胞やAd増殖用細胞等、所望の細胞で効果的にAdを増殖させることができれば、効果的に腫瘍溶解等の抗悪性腫瘍効果、腫瘍検出効果やAdの効率的な産生効果を発揮しうる。
Dicerに対するshRNA（short hairpin RNA）を搭載したAd（以下、実施例１で作製したAdを「Ad-shDicer」という。）のゲノムの構造を模式的に示す図である。（実施例１） 各種ヒト癌細胞内でのAd-shDicerのゲノム増殖能を確認した結果を示す図である。（実験例１－１） 各種ヒト癌細胞にAd-shDicerを作用させたときの細胞生存率を確認した結果を示す図である。（実験例１－２） 各種ヒト正常細胞にAd-shDicerを作用させたときの細胞生存率を確認した結果を示す図である。（実験例１－２） Ad-shDicerを各種癌細胞に作用させたときのDicer mRNA量を測定し、相対値を示す図である。（実験例１－３） Ad由来のVA-RNAがDicerに切断され、Ago2タンパク質とRISC複合体を形成するプロセスを示す概念図である。（実験例１－４） 各種癌細胞において、Ago2、Dicer又はXPO5に対するsiRNA導入によりRNA干渉させた前記各種細胞に野生型Adを加えて培養したときのウイルスゲノム量を確認した結果を示す図である。（実験例１－４） 各種癌細胞に、Ago2又はDicerに対するsiRNAを導入した場合の、Ad由来VA-RNA I又はVA-RNA IIの産生に及ぼす影響を電気泳動で確認した結果を示す図である。（実験例１－４） 各種癌細胞に、Ago2又はDicerに対するsiRNAを導入した場合の、Ad由来mivaRNA I又はmivaRNA IIの相対的発現量を確認した結果を示す図である。（実験例１－４） 各癌細胞にshDicerの発現カセットを導入してRNA干渉させた前記各細胞に野生型Adを加えて培養したときのウイルスゲノム量を確認した結果を示す図である。（実験例１－５） 各種癌細胞に、Ago2又はDicerを過剰発現させた場合の、各細胞に野生型Adを加えて培養したときのウイルスゲノム量を確認した結果を示す図である。（比較例１） Ad-shDicerの癌細胞に対する殺細胞効果を確認した結果を示す図である。（実施例２） Ad-shDicerの各種癌細胞に対する抗癌作用を確認した結果を示す図である。（実施例３） Dicerノックダウン細胞におけるmiR-27a,bの発現量を確認した結果を示す図である。（参考例１） VA-RNAの過剰発現とDicer及びmiR-27a,bに及ぼす影響を確認した結果を示す図である。Ａ：VA-RNAの過剰発現によりmiR-27a,bの発現量が減少することを示す図である。Ｂ：miR-27a,bの発現量がVA-RNAにより減少することを示す図である。（参考例２） Adの感染によるmiR-27a,bの発現量との関係を確認した結果を示す図である。（参考例３） miR-27a,bがAdの増殖に及ぼす影響について確認した結果を示す図である。（参考例４） miR-27a又はmiR-27bに対するタフデコイRNAを搭載したAd（以下、実施例４で作製したAdを「Oncolytic Ad-TuD-27a」又は「Oncolytic Ad-TuD-27b」という。）のゲノムの構造を模式的に示す図である。（実施例４） Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bを作用させたときの癌細胞生存率の確認した結果を示す図である。（実験例４－１） Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bによる癌細胞内でのAdゲノム増殖能を確認した結果図である。（実験例４－２）
　本明細書において、「Ad」とはアデノウイルスを意味し、「Adゲノム」は、Adが有する遺伝情報、即ちAdに含まれるDNA配列をいう。
　本発明は、Ad由来mivaRNAの機能を抑制することを含む、Adの増殖促進方法に関する。本明細書において、「mivaRNAの機能を抑制する」とは、「mivaRNA産生の阻害」又は「mivaRNAの活性阻害」を意味する。具体的には、「VA-RNAの切断を阻害することによるmivaRNA産生の阻害」又は「mivaRNAとAgo2のRISC形成を阻害することによるmivaRNA活性の阻害」を意味する。このような「mivaRNAの機能を抑制する」ことは、少なくともDicer又はAgo2のいずれか一方を阻害することにより達成される。また、Dicerを阻害することにより「VA-RNAの切断を阻害すること」によって、VA-RNAのウイルス増殖促進効果を得ることもできる。
　本発明は、miR-27a及び／又はmiR-27bを阻害することによるAdの増殖促進方法にも関する。本明細書において、miR-27a及び／又はmiR-27bの阻害は、少なくともDicer又はAgo2のいずれか一方を阻害することにより達成される。他の方法としては、例えば後述するmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸による阻害、miR-27a又はmiR-27bに対する阻害剤による阻害、miR-27a又はmiR-27bのノックアウトによる阻害等が挙げられる。
　Dicer又はAgo2の阻害の方法としては、特に制限されないが、例えばDicer又はAgo2に対するRNA干渉による阻害、Dicer遺伝子又はAgo2遺伝子のノックアウトによる阻害、あるいはDicer又はAgo2に対する抗体や阻害剤の使用による阻害等が挙げられる。好適には、RNA干渉による阻害や遺伝子のノックアウトによる阻害であり、最も好適にはRNA干渉による阻害である。Dicer又はAgo2に対するRNA干渉による阻害としては、Adゲノム又はAd産生細胞にDicer又はAgo2に対するsiRNA作用させることで達成することができる。Dicer又はAgo2に対するsiRNA作用させるために、Dicer又はAgo2に対するsiRNAの発現カセットをAdゲノムに搭載し、あるいはAd産生細胞に導入することができる。また、Dicer又はAgo2に対するsiRNAをAd産生細胞の培養系に添加してもよい。
　Dicer又はAgo2に対するsiRNAとしてはDicer又はAgo2に対してRNA干渉機能を有するsiRNAであればよく、特に制限されず、自体公知又は今後開発されるあらゆるsiRNAであってもよい。自体公知のDicerに対するRNA干渉機能を有するsiRNAやshRNAとしては、以下の各論文に示すshRNAがあげられる。Dicer又はAgo2に対するRNA干渉による阻害や、Dicer遺伝子又はAgo2遺伝子のノックアウトによる阻害の手法は、自体公知の方法、例えばNucleic Acids Research, (2006) Vol. 34, No. 17 4801-4815（doi:10.1093/nar/gkl646）、Cell 141, 1195-1207, June 25 (2010)、Molecular Therapy vol. 17 no. 4, 725-732 apr.(2009)、Nucleic Acids Research, Vol. 38, No. 21, 7736-7748 (2010)、Nucleic Acids Research, Vol. 38, No. 15 5141-5151 (2010)、PNAS, vol.107, no.17, 7904-7909, April 27, (2010)、JOURNAL OF VIROLOGY, Vol. 85, No. 5, p.2342-2350, Mar. (2011)、PLoS ONE 8(3): e59445. doi:10.1371/journal.pone.0059445等に開示する方法を参照することができる。また、Dicerに対するshRNA又はAgo2に対するshRNAについても、これらの文献に示されているものを適宜選択して使用することができる。
　Dicerに対するsiRNAとしては、具体的には以下の配列番号１又は配列番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
・GAAUCAGCCUCGCAACAAA（配列番号１）
・UUUGUUGCGAGGCUGAUUC（配列番号２）
　遺伝子組換えの手法により、Adや細胞にDicerに対するsiRNAを発現させるために、siRNAの前駆体であるshRNAの配列をもとにして、例えば配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをベクターに搭載して用いることができる。配列番号６又は配列番号７に示す塩基配列は、配列番号５において下線を施した部位の塩基配列であり、当該部位が、RNA干渉作用において最も重要な部位と考えられる。
・GATCCCGAATCAGCCTCGCAACAAATTCAAGAGATTTGTTGCGAGGCTGATTCTTTTTGGAAAT（配列番号５）
・GAATCAGCCTCGCAACAAA（配列番号６）
・TTTGTTGCGAGGCTGATTC（配列番号７）
　Ago2に対するsiRNAとしては、具体的には以下の配列番号３又は配列番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる
・GCACGGAAGUCCAUCUGAA（配列番号３）
・UUCAGAUGGACUUCCGUGC（配列番号４）
　「Adの増殖を促進する方法」において、RNA干渉を用いてDicer又はAgo2を阻害する場合は、Adに搭載されたDicer又はAgo2に対するsiRNAの発現による阻害で達成できる。また同様に、Ad産生用パッケージング細胞に導入されたDicer又はAgo2に対するsiRNAの発現で達成できる。Dicer又はAgo2に対するsiRNAの具体例は、上述のとおりである。ここにおいて、「Dicer又はAgo2に対するsiRNAの発現」とは、Dicer又はAgo2に対するsiRNAを含むsiRNAの発現カセットであってもよい。「Dicer又はAgo2に対するsiRNA」を含むsiRNAの発現カセットは、例えば「Dicer又はAgo2に対するsiRNA」を含むsiRNAの発現カセットであってもよいし、「Dicer又はAgo2に対するshRNA」を含むsiRNAの発現カセットであってもよい。shRNAはsiRNAの前駆体であるため、shRNAが発現されたのちにsiRNAが産生されることも、本明細書において「siRNAの発現」に含まれる。
　「Adの増殖を促進する方法」において、Dicer又はAgo2の抗体、あるいはDicer又はAgo2の阻害剤を用いてDicer又はAgo2を阻害する場合は、自体公知の抗体や阻害剤（デコイ核酸やアプタマー核酸を含む）を使用することができる。前記抗体や前記阻害剤によってAd増殖用細胞のDicer又はAgo2を阻害することで、当該Ad増殖用細胞におけるAdの増殖を促進することができる。
「Adの増殖を促進する方法」において、miR-27a又はmiR-27bを阻害する場合は、miR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸による阻害、miR-27a又はmiR-27bに対する阻害剤による阻害が挙げられる。例えばmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸をAdに作用させ、miR-27a又はmiR-27bを阻害することができる。具体的にはmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸の発現カセットを、Adゲノムに搭載し、あるいはAd産生細胞に導入することができる。また、miR-27a又はmiR-27bに対する阻害剤としては、miR-27a又はmiR-27bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドや、miR-27a又はmiR-27bの阻害剤として市販されている試薬、例えばmiRVana miRNA inhibitor（Ambion社）を用いてもよい。
　miR-27aに対するデコイ核酸は、配列番号１０に示す塩基配列を少なくとも１又は２以上含む配列であればよい。miR-27aに対するデコイ核酸の具体例として、以下の配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号１２の下線に示す部位が、miR-27aに対するアンチセンス配列であり、配列番号１０に示す塩基配列に該当する。また、miR-27bに対するデコイ核酸は、配列番号１１に示す塩基配列を少なくとも１又は２以上含む配列であればよい。同様に、miR-27bに対するデコイ核酸の具体例として、以下の配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号１３の下線に示す部位が、miR-27bに対するアンチセンス配列であり、配列番号１１に示す塩基配列に該当する。遺伝子組換えの手法により、Adや細胞にmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸を発現させるために、適宜必要なオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
・GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１０）
・GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１１）
・GACGGCGCUAGGAUCAUCAACGCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAACGCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU（配列番号１２）
・GACGGCGCUAGGAUCAUCAACGCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAACGCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU（配列番号１３）
　本発明の「Adの増殖を促進する方法」において増殖が促進されるAdは、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたAd、即ち制限増殖型Adや非増殖型Adベクターが挙げられるが、特に好適には制限増殖型Adである。本明細書の背景技術の欄でも示した通り、正常細胞では増殖せず、腫瘍細胞特異的に感染・増殖し腫瘍細胞を死滅させる又は腫瘍細胞を検出する制限増殖型Adは、次世代の腫瘍治療薬、腫瘍検出薬として期待を集めているが、従来の制限増殖型Adは腫瘍細胞における増殖速度が遅いために、十分な治療効果が得られないのが問題点であった。本発明の「Adの増殖促進方法」により、Adを腫瘍細胞特異的に感染・増殖させることができれば、Adを腫瘍細胞でのみ複製させて腫瘍細胞を死滅させる抗腫瘍剤又は腫瘍細胞を検出する検出剤として有効に利用することができる。制限増殖型Adは、E1タンパク質の発現が例えば腫瘍細胞でのみ起こるAdであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。例えば、腫瘍細胞特異的に遺伝子発現を制御するプロモーターを搭載するAdが挙げられる。このような機能を発揮しうるプロモーターであれば、自体公知のプロモーター又は今後開発されるプロモーターのいずれであってもよい。例えばhTERTプロモーター、IAI.3Bプロモーター、ミッドカインプロモーター、β-HCGプロモーター、SCCA1プロモーター、cox-2プロモーター、PSAプロモーター、又はその他の腫瘍特異的プロモーターが挙げられる。目的とする遺伝子の発現に用いるウイルスに対応しうる、適切なプロモーターとしては、腫瘍特異的プロモーターの他、例えばCMVプロモーター、SV40後期プロモーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTRプロモーター、SRαプロモーター等を用いることができる。
　本発明の増殖が促進される「Ad」は、Adゲノム において、Ad由来mivaRNAの機能を抑制するか、あるいはmiR-27a及び／又はmiR-27bを阻害するように工夫されていることが必要である。具体的には、Dicer又はAgo2に対するデコイ核酸やアプタマー核酸などの発現カセットや、Dicer又はAgo2の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの発現カセットが搭載されていてもよい。また、miR-27a又はmiR-27bの抑制のみに着目した場合は、miR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸やアプタマー核酸などの発現カセットや、miR-27a又はmiR-27bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの発現カセットが搭載されていてもよい。Dicer及びAgo2各々に対するsiRNA 又はshRNA、あるいはmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸は上述したごとくである。
　本明細書においてAdは、代表的にはヒトを宿主とする2型、5型、11型、35型の各Ad、ヒト以外を宿主とするサルAd、マウスAd、イヌAd、ヒツジAd及びトリAdなどが挙げられる。
　本明細書において、E1領域欠損型Adとは、AdゲノムのうちE1タンパク質を発現させないようにE1遺伝子領域を機能的に欠損するAdをいう。E1遺伝子領域とは、例えばヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において、具体的には342～3523番目に相当する。E1遺伝子領域を機能的に欠損するとは、例えば、宿主細胞内で機能するE1タンパク質を発現させないようにすることであり、E1タンパク質をコードするゲノム領域のすべてを欠損している必要はない。本発明のAdに使用可能なAdは、E1領域の他に、例えばE3遺伝子領域を機能的に欠損する5型Adであっても良い。5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のE3領域とは、28133～30818番目又は27865～30995番目に相当する部位をいう。
　また、本発明の「Adの増殖を促進する方法」を、少なくとも「Ad」と「Ad増殖用細胞」のいずれかに適用することで、Adの産生を促進することができる。この場合のAdとしては、制限増殖型Adに限定されず、非増殖型Adであってもよい。制限増殖型Ad及び非増殖型Adのいずれであっても、in vitroでウイルス増殖を促進することができれば、効果的にAdを活用することができる。Adを効果的に増殖促進させて作製するための「Ad増殖用細胞」としては、「Ad産生用パッケージング細胞」が挙げられる。
　本明細書において、「Ad産生用パッケージング細胞」とは、Adを産生しうる細胞であればよく、特に限定されない。Ad産生用パッケージング細胞に使用可能な細胞は、各種腫瘍細胞の他、HEK293細胞が挙げられる。Adを効果的に増殖促進させて作製するためのAd産生用パッケージング細胞は、Ad由来mivaRNAの機能を抑制するか、あるいはmiR-27a及び／又はmiR-27bを阻害するように工夫されている細胞であることが必要である。Dicer又はAgo2に対するデコイ核酸やアプタマー核酸などの発現カセットや、Dicer又はAgo2の遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの発現カセットが導入されていてもよい。また、miR-27a又はmiR-27bの抑制のみに着目した場合は、miR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸やアプタマー核酸などの発現カセットや、miR-27a又はmiR-27bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの発現カセットが導入されていてもよい。Dicer及びAgo2各々に対するsiRNA 又はshRNA、あるいはmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸は上述したごとくである。
　本発明は、本発明のAdを有効成分として含む抗腫瘍剤又は腫瘍検出剤にも及ぶ。本発明の抗腫瘍剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、腫瘍、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。本発明のAdを有効量含む抗腫瘍剤又は腫瘍検出剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に生理食塩水、細胞培養液等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えてもよい。
　本発明の抗腫瘍剤は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用することができ、治療対象となる癌の種類は、卵巣癌、扁平上皮癌（子宮頚部癌、皮膚癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌等）、消化器癌（大腸癌、膵癌、肝癌、胃癌等）、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、前立腺癌などが例示される。
　本発明は、悪性腫瘍の治療方法にも及ぶ。具体的には、上述のいずれかの悪性腫瘍の治療及び／又は予防のために、本発明の抗腫瘍剤を有効量投与することによる。本発明の抗腫瘍剤は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合することができる。
　治療のための投与量は、腫瘍の大きさ・種類、症状の程度、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重などに応じて適宜決定することができる。本発明の抗腫瘍剤は、数回にわたり患者に投与してもよいし、複数回のクールに分け、一クール当たりの投与回数、投与間隔などを任意に設定してもよい。一日投与量として、通常有効成分である本発明ウイルスの量を106～1011PFU（plaque forming units）程度、好ましくは109～1011PFU程度とすることができる。また、本発明の抗腫瘍剤を使用する際には、公知の免疫抑制剤等を用いることにより、生体の免疫を抑制し、有効成分として含まれるAdを感染し易くすることもできる。更に、本発明の抗腫瘍剤は、公知の抗癌剤及び放射線からなる群から選ばれる少なくとも１種の抗癌剤を併用することもできる。抗癌剤には、以下のものがあるが、これらに限定されない。
（a）アルキル化活性剤：この製剤は、癌細胞の核酸タンパク質にアルキル基を導入して細胞障害を起こさせる作用を有するものであり、例えばカルボコン、プスルファン（マスタード薬）、ニムスチン（ニトロソウレア類）などがあげられる。
（b）代謝拮抗活性剤：この製剤は、代謝過程で酵素に拮抗して、細胞合成を阻害する作用を有するものであり、例えばメトトレキサート（葉酸系）、メルカプトプリン（プリン系）、シタラビン（ピリミジン系）、フルオロウラシル、テガフール、カルモフールなどがあげられる。
（c）抗生物質：抗癌作用を有する、アクチノマイシンD、プレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシンCなどがあげられる。
（d）微小管阻害活性剤：この製剤は、微小管に作用して抗腫瘍効果を示すものであり、例えばドセタキセル、パクリタキセル（タキサン）、ビノレルビン、ピンクリスチン、ビンブラスチン（アルカロイド系）などがあげられる。
（e）白金製剤：この製剤は、DNA鎖内又は鎖間結合あるいはDNAタンパク質結合を構成して、DNA合成を阻害する作用を有するものであり、例えば、シスプラチン、アルボプラチン、ネダプラチンなどがあげられる。
（f）トポイソメラーゼ阻害活性剤：トポイソメラーゼを阻害する、イリノテカン（トポイソメラーゼI阻害薬）、ポドフィロトキシン誘導体（トポイソメラーゼII阻害薬）などがあげられる。なお、トポイソメラーゼとは、DNAに一時的に切れ目を入れてDNA鎖のリンキング数を変える反応を触媒する酵素である。
　本発明は、悪性腫瘍の高感度な検出方法にも及ぶ。具体的には、上述のいずれかの悪性腫瘍の検出のために、GFP等のレポーター遺伝子を搭載した本発明の腫瘍検出剤を対象となる細胞、培養細胞、培養組織、採取血液または生検組織に添加すること、あるいは生体に投与することによる。本発明の腫瘍検出剤は、そのまま生体の患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体（対象となる細胞や臓器）に導入することもできる。また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合することができる。
　悪性腫瘍検出のための使用量は、対象の採取条件、培養条件、腫瘍の大きさ・種類、症状の程度、投与経路、投与対象、動物種、患者の年齢、体重などに応じて適宜決定することができる。本発明の腫瘍検出剤は、数回にわたり生体に投与してもよいし、複数回のクールに分け、一クール当たりの投与回数、投与間隔などを任意に設定してもよい。また、生体の血液や生検材料を採取して検査することもできる。例えば、J. Clin. Invest., 119:3172-3181 (2009)やVNATURE MEDICINE, 12:1214-12193181 (2006)を参照しつつ、本発明の腫瘍検出剤の使用量を適宜決定することができる。
　さらに、本発明の増殖促進方法によれば、従来の方法に比べて、効果的に有効成分としてのAdを増殖促進させることができる。本発明のAdの増殖が促進される細胞は、卵巣癌、扁平上皮癌（子宮頚部癌、皮膚癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌等）、消化器癌（大腸癌、膵癌、肝癌、胃癌等）、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、前立腺癌などの標的腫瘍細胞が挙げられる。標的腫瘍細胞等、所望の細胞で効果的にAdを増殖することができれば、効果的に腫瘍溶解等の抗悪性腫瘍効果や腫瘍検出効果を発揮しうる。そして、本発明の増殖促進方法を、細胞を用いたin vitroでのAdの産生系、例えばHEK293細胞等を用いたウイルスの産生系に適用することで、より効果的にAdを産生することができる。
　以下に実施例及び実験例並びに参考例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）Dicerに対するshRNAを搭載したAdの作製
　本実施例では、Dicerに対するshRNA（以下、実施例、実験例において「shDicer」ということとする。）を搭載したカセットであって、Dicerに対するsiRNAを発現しうるカセットを搭載したAdの作製について説明する。以降、本実施例のAdを「Ad-shDicer」ということとする。作製したAd-shDicerのゲノム構造は図１に示すとおりである。
１）Ad-shDicerゲノムの作製
　本実施例では、ヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において、当該ゲノムのうちE1領域（342～3523）並びにE3領域（28133～30818）を欠損しており、E1欠損領域に外来遺伝子を挿入できるベクタープラスミドを元に構築した。当該ベクタープラスミドpAdHM19のE1欠損領域に、腫瘍特異的プロモーターであるhTERTプロモーターと、E1A、IRES、E1B、ポリA（pA） シグナル配列をライゲーションして搭載し、腫瘍溶解性（Oncolytic）Adゲノムを得た。さらに、E3欠損領域に、shDicerの発現カセットを搭載した。本実施例において使用したshDicerの発現カセットにおけるshDicerに対応する配列は、配列番号５に示す塩基配列からなる。RNA干渉機能の発揮に重要であるのは、配列番号５において、下線に示す塩基配列、具体的には配列番号６又は配列番号７に示す塩基配列部分であると考えられる。
（配列番号５）GATCCCGAATCAGCCTCGCAACAAATTCAAGAGATTTGTTGCGAGGCTGATTCTTTTTGGAAAT
（配列番号６）GAATCAGCCTCGCAACAAA
（配列番号７）TTTGTTGCGAGGCTGATTC
２）Ad-shDicerの作製
　上記１）で作製したAd-shDicerゲノムを、ウイルスゲノム末端に存在する制限酵素PacIで切断して洗浄し、トランスフェクション試薬Lipofectamine2000TM（Invitrogen社）を用いてHEK293細胞へトランスフェクションし、Ad-shDicerを作製した。
（実験例１－１）Ad-shDicerによる癌細胞内でのAdゲノム増殖能の確認
　実施例１で作製したAd-shDicerを各種癌細胞に作用させたときのウイルスゲノム量を確認した。癌細胞は、HeLa細胞（ヒト子宮頸癌細胞）、SK HEP-1細胞（ヒト肝細胞癌細胞）及びH1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）について確認した。従来型Oncolytic Adコントロールとして、実施例１で作製したAd-shDicerと同様のゲノム構造であって、shRNAを何ら発現しないAd-E3（-）、及びshDicerの代わりにホタルルシフェラーゼに対するshRNA（shLuc）を発現するAd-shLucを用いた。
　各種癌細胞に対して、細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、培養液を用いて調製した各種ウイルス懸濁液をMOI 2となるように作用させ、37℃で24時間感染させた。その後ウイルス液を除去し、培養液を加えて37℃で培養した。培養開始後50時間目のAdゲノムコピー数を定量的PCR法により確認した。その結果、上記３種類のいずれの癌細胞においても、Ad-shDicerの場合は、その他コントロールのAdと比較して、顕著なAdゲノム増殖能が認められた（図２参照）。
（実験例１－２）Ad-shDicerを作用させたときの細胞生存率の確認
　実施例１で作製したAd-shDicerを各種癌細胞及び正常細胞に作用させたときの細胞生存率を確認した。実験例１－１に示すコントロールについても同様に確認した。さらに、Adを加えないmockの系もコントロールとした。癌細胞は、HeLa細胞（ヒト子宮頸癌細胞）、H1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）及びHepG2細胞（ヒト肝細胞癌細胞）について、正常細胞は、HUVEC（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）、NHLF（ヒト肺線維芽細胞）、PrSC（前立腺ストローマ細胞）について確認した。
　各種細胞に対して、細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、培養液を用いて調製した各種ウイルス懸濁液をMOI 2となるように作用させ、37℃で24時間感染させた。その後ウイルス液を除去し、培養液を加えて37℃で培養した。測定時点においてAd非作用群の細胞生存率を100％としたとき、培養３日目（day3）及び５日目（day5）の各細胞の生存率を確認した。細胞生存率はアラマーブルー(R)アッセイ法（Invitrogen社）により確認した。
　その結果、Ad-shDicerを作用させた場合は、コントロール群と比べて癌細胞で顕著な殺細胞効果が認められ（図３参照）、正常細胞では生存率にほとんど差を認めなかった（図４参照）。
（実験例１－３）Ad-shDicerを作用させたときのDicer mRNA量の確認
　実施例１で作製したAd-shDicerを各種癌細胞に作用させたときのDicer mRNA量を測定した。癌細胞は、HeLa細胞（ヒト子宮頸癌細胞）、H1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）及びSK HEP-1細胞（ヒト肝細胞癌細胞）について確認した。
　各種細胞に対して、細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、培養液を用いて調製した各種ウイルス懸濁液をMOI 2となるように作用させ、37℃で48時間感染させた。感染後、感染細胞からRNAを回収し、Dicer mRNA量を定量的RT-PCR法にて測定した。
　その結果、上記３種類のいずれの癌細胞においても、Ad-shDicerの場合は、その他コントロールAdと比較して、顕著なDicer mRNA量の低下が認められた（図５参照）。
（実験例１－４）Ago2、Dicer又はXPO5をノックダウンしたときの野生型Adの増殖
　各種癌細胞に、Ago2、Dicer又はXPO5に対するsiRNAを作製し、各siRNAを各細胞に導入してRNA干渉させた。前記各細胞に野生型Adを加えて培養したときの、Adゲノム量を確認した。背景技術の欄でも示したように、VA-RNAが細胞核内で転写されたのち、XPO5によって核外に輸送され、細胞質内でDicerによる切断を受けた後、Ago2タンパク質とともにRISCを形成する（図６参照）。そこで、各種癌細胞に対して、Ago2、Dicer又はXPO5に対するsiRNAを導入することで、Adの増殖に対してどのように影響するかを確認した。
　本実施例で使用した各siRNAの塩基配列は、配列番号１～４、８及び９に示した。
１）Dicerに対するsiRNAの配列：GAAUCAGCCUCGCAACAAA（配列番号１）
２）Dicerに対するsiRNAの配列：UUUGUUGCGAGGCUGAUUC（配列番号２）
３）Ago2に対するsiRNAの配列：GCACGGAAGUCCAUCUGAA（配列番号３）
４）Ago2に対するsiRNAの配列：UUCAGAUGGACUUCCGUGC（配列番号４）
５）XPO5に対するsiRNAの配列：CUCGAUUGGAGAAGGUGUA（配列番号８）
６）XPO5に対するsiRNAの配列：UACACCUUCUCCAAUCGAG（配列番号９）
　HeLa細胞（ヒト子宮頸癌細胞）又はH1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）に、Ago2、Dicer又はXPO5に対するsiRNAを導入した。コントロールは、control siRNA（Allstars negative control siRNA; Qiagen社）を導入した細胞とした。前記各種癌細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、野生型Ad溶液をMOI 5となるように、37℃で24時間感染させた。野生型AdはshDicer発現カセットを搭載しておらず、ウイルスの自己増殖に必須のE1遺伝子がウイルス自身のプロモーターで転写される。
　Adを感染した各細胞について、Adゲノムコピー数を定量的PCR法により確認した。その結果、上記２種類のいずれの癌細胞においても、細胞にAgo2又はDicerに対するsiRNAを導入した場合は、コントロールに比べて有意にAdゲノムのコピー数が増加した（図７参照）。一方、XPO5に対するsiRNAを作用させた場合には、Adゲノムのコピー数はコントロールと同等又は低い値を示した（図７参照）。
　次に、Ago2又はDicerに対するsiRNAを導入した場合のmivaRNA I又はmivaRNA IIの産生に及ぼす影響を電気泳動で確認した。その結果、何れの細胞においても、mivaRNA I及びmivaRNA IIの産生が抑制されていることが確認された（図８参照）。
 HeLa細胞又はH1299細胞の各細胞に、Dicer又はAgo2に対するsiRNAを各々導入した。コントロールはControl siRNA（Allstars negative control siRNA）を用いた。siRNA導入48時間後、VA-RNA発現プラスミドを導入した。プラスミド導入24時間後、VA-RNAのコピー数を定量的RT-PCR法により測定した。すなわち、DicerやAgo2をノックダウンすることで、全長のVA-RNAのコピー数が増加すると考えられる（図９参照）。
　以上の結果より、VA-RNAが細胞核内で転写されたのち、XP05によって核外に輸送される段階ではなく、Dicer又はAgo2に対するsiRNAを導入すること等によりAd由来mivaRNAの産生を抑制するか、又はmivaRNAの活性を抑制することで、Adの増殖促進効果が得られることが確認された。
（実験例１－５）各種細胞においてDicerをノックダウンしたときの野生型Adの増殖
　本実施例では、各癌細胞にshDicerの発現カセットを導入してRNA干渉させた前記各細胞に野生型Adを加えて培養したときのウイルスゲノム量を確認した。shDicer発現カセットにおけるshDicerに対応する配列は、配列番号５に示す塩基配列からなる。
（配列番号５）GATCCCGAATCAGCCTCGCAACAAATTCAAGAGATTTGTTGCGAGGCTGATTCTTTTTGGAAAT
　H1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）、SK HEP-1細胞（ヒト肝細胞癌細胞）又はHepG2細胞（ヒト肝細胞癌細胞）に、shDicer発現カセットを導入した。コントロールは、shRNAを導入しない細胞とした。前記各種癌細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、野生型Ad溶液をMOI 5となるように、37℃で24時間感染させた。
　Adを感染した各細胞について、Adゲノムコピー数を定量的PCR法により確認した。その結果、各癌細胞においても、細胞にshDicer発現カセットを導入した場合は、コントロールに比べて有意にAdゲノムのコピー数が増加した（図１０参照）。このことから、Ad由来mivaRNAの産生をshDicerで抑制することで、Adの増殖促進効果が得られることが確認された。
（比較例１）Ago2又はDicerを過剰発現させた場合の野生型Adの増殖
　癌細胞に、Ago2又はDicerを過剰発現させたときのAdの増殖を確認した。
　HeLa細胞（ヒト子宮頸癌細胞）又はH1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）に、Ago2又はDicer発現プラスミドを導入した。コントロールは、何も発現しないコントロールプラスミド（p3ｘFLAG-CMV10）を導入した細胞とした。前記各種癌細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、野生型Ad溶液をMOI 5となるように、37℃で24時間感染させた。
　Adを感染した各細胞について、Adゲノムコピー数を定量的PCR法により確認した。その結果、上記２種類のいずれの癌細胞においても、細胞にAgo2又はDicerが過剰発現している場合は、コントロールに比べて有意にAdゲノムのコピー数が減少した（図１１参照）。
（実施例２）Ad-shDicerの各癌細胞に対する殺細胞効果
　実施例１と同手法により作製したAd-shDicerをHeLa細胞（ヒト子宮頸細胞）又はH1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）の各癌細胞に作用させたときの細胞生存率を確認した。実験例１－１に示すコントロールについても同様に確認した。各細胞に対して、細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、培養液を用いて調製した各種ウイルス懸濁液をMOI 0.01、0.1、1、10、100となるように作用させ、37℃で24時間感染させた。その後ウイルス液を除去し、培養液を加えて37℃で培養した。測定時点においてAd非作用群の細胞生存率を100％としたとき、培養５日目の各細胞の生存率を確認した。細胞生存率はアラマーブルー(R)アッセイ法（Invitrogen社）により確認した。その結果、本発明のAd-shDicerは、コントロールのAd-E3(-)及びAd-shLucに比べて高い殺細胞効果を示した（図１２参照）。
（実施例３）Ad-shDicerの各癌細胞に対する抗癌作用（抗腫瘍効果）
　実施例１と同手法により作製したAd-shDicerのマウス皮下腫瘍に対する抗腫瘍効果を検討した。実験例１－１に示すコントロールについても同様に確認した。5週齢のヌードマウス（BALB/c nu/nu、雌）皮下にH1299細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）又はSK-OV-3細胞（ヒト卵巣癌細胞）を各マウスについて2×106個移植し、直径5-6mmの固形癌を形成させた。その後、各々n=6のグループについて、形成した固形癌内にAdを107 ifu（Infectious Units）局所投与した。また初回投与後の３日後、再度Adを局所投与した。その後、経日的に腫瘍径を測定した。その結果、本発明のAd-shDicerはコントロールのAd-E3(-)及びAd-shLucに比べて高い抗腫瘍活性を有していることが示された（図１３参照）。
（参考例１）Dicerノックダウン細胞におけるmiR-27a,bの発現量
　実験例１－４等の結果より、Dicerのノックダウンにより、Adの増殖が促進されることが確認された。このことより、Dicerをノックダウンした場合、いずれかのmiRNAの産生が抑制されることが予想される。そこで、Dicerノックダウンによりある種のmiRNA量が減少し、それによってウイルス増殖を促進する遺伝子の発現が回復して、Adの増殖が促進している可能性が考えられた。
　上記知見に基づき、miR-27a及びmiR-27bに着目し、Dicerノックダウン細胞におけるmiR-27a及びmiR-27bの発現量を測定した。ドキシサイクリン（Dox：テトラサイクリン誘導体）依存的にshDicerを発現するカセットをHeLa細胞に挿入した。HeLa細胞をDoxを100ng/mlを含む培地、又は含まない培地で48時間培養した。miR-27a又はmiR-27b量は定量的RT-PCRにより測定した。その結果、Dox存在下でHeLa細胞を培養したときに、miR-27a及びmiR-27bがDicerノックダウンにより発現低下していることが明らかとなった（図１４参照）。
（参考例２）VA-RNA、Dicer及びmiR-27a,bの関係について
　従来、VA-RNAはDicerの発現を抑制することが報告されている。そこでVA-RNAを過剰発現させることでmiR-27a及びmiR-27bの発現が抑制されるか否かを検討した。VA-RNAI及びII発現プラスミド（pAdvantage）-DNaeI、pAdVantage、VA-RNAI発現プラスミド（pVAI）又はVA-RNAII発現プラスミド（pVAII）をトランスフェクトし、VA-RNA（I及びII）、VA-RNAI又はVA-RNAIIが過剰発現したHeLa細胞を48時間培養し、miR-27a及びmiR-27bの発現量を定量的RT-PCRにより測定した。その結果、VA-RNAの過剰発現によりmiR-27a及びmiR-27bの発現量が各々減少することが示された（図１５Ａ参照）。HeLa細胞をVA-RNA発現プラスミド及びRLuc遺伝子の3'-UTRにmiR-27a又はmiR-27bの相補配列を2コピー含むレポータープラスミド (psiCHECK-2-mR-27aT or -miR-27bT)をトランスフェクトし、48時間培養した。その後ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、miR-27a及びmiR-27bの発現量がVA-RNAにより減少することが示された（図１５Ｂ参照）。
（参考例３）Adの感染及びmiR-27a,bとの関係について
　参考例２の結果、VA-RNAによりmiR-27a及びmiR-27bの発現量が減少することが確認されたので、Adの感染及びmiR-27a及びmiR-27bの発現量との関係を確認した。野生型Ad（WT-Ad）をHeLa細胞に100VP（vector particles）/cell加え、各時間感染させたところ、感染後24時間目でmiR-27a及びmiR-27bの発現量が有意に上昇することが確認された（図１６参照）。
（参考例４）miR-27a,bとAdの感染との関係について
　次にmiR-27a及びmiR-27bがAdの増殖に及ぼす影響について検討した。HeLa細胞にmimic miR-27a又はmimic miR-27b（合成されたmiR-27a又はmiR-27b）、あるいはmiR-27a又はmiR-27bの阻害剤（miR-27a又はmiR-27bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド：miRVana miRNA inhibitor：Ambion社）を1, 3, 10又は30 nMトランスフェクトし、次に野生型Ad（WT-Ad）を100VP/cell加え、24時間感染させた。Adゲノム量を定量的RT-PCRにより測定した。その結果、mimic miR-27a又はmimic miR-27bを含む系でAdの増殖が抑制され、阻害剤を含む系ではAdの増殖促進が認められた（図１７Ａ，Ｂ）。H1299細胞についてもmimic miR-27a又はmiR-27bを30 nM、あるいはmiR-27a又はmiR-27bの阻害剤（inhibitor）を30 nM加えたところ、mimic miR-27a又はmimic miR-27bを加えた系ではAdの増殖が抑制されたが、阻害剤（inhibitor）を含む系ではAdの増殖促進が認められた（図１７Ｃ）。
（実施例４）miR-27a,b を阻害するタフデコイRNA 発現カセットを搭載したAdの作製
　本実施例では、miR-27a又はmiR-27bに対するタフデコイRNA（以下、実施例、実験例において「TuD-27a又はTuD-27b」ということとする。）を搭載したカセットであって、miR-27a又はmiR-27bに対するsiRNAを発現しうるカセットを搭載した腫瘍溶解性（Oncolytic）Adの作製について説明する。以降、本実施例のAdを「Oncolytic Ad-TuD-27a」又は「Oncolytic Ad-TuD-27b」ということとする。作製したOncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bのゲノム構造は図１８に示すとおりである。
１）Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bゲノムの作製
　本実施例では、実施例１と同様にヒト5型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）において、当該ゲノムのうちE1領域（342～3523）並びにE3領域（28133～30818）を欠損しており、E1欠損領域に外来遺伝子を挿入できるベクタープラスミドを元に構築した。当該ベクタープラスミドpAdHM19のE1欠損領域に、腫瘍特異的プロモーターであるhTERTプロモーターと、E1A、IRES、E1B、ポリA（pA）シグナル配列をライゲーションして搭載し、Oncolytic Adゲノムを得た。
　さらに、E3欠損領域に、TuD-27a又はTuD-27bの発現カセットを搭載した。本実施例において使用したTuD-27a又はTuD-27bに対応する配列は、配列番号１２又は１３に示す塩基配列からなる。下線部は、miR-27a又はmiR-27bに対するアンチセンス配列である。
TuD-27a：GACGGCGCUAGGAUCAUCAACGCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAACGCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU（配列番号１２）
TuD-27b：GACGGCGCUAGGAUCAUCAACGCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGUAUUCUGGUCACAGAAUACAACGCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAACAAGAUGAUCCUAGCGCCGUCUU（配列番号１３）
２）Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bの作製
　上記１）で作製したTuD-27a又はTuD-27bゲノムを、ウイルスゲノム末端に存在する制限酵素PacIで切断して洗浄し、トランスフェクション試薬Lipofectamine2000TM（Invitrogen社）を用いてHEK293細胞へトランスフェクションし、Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bを作製した。
（実験例４－１）Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bを作用させたときの細胞生存率の確認
　実施例４で作製したOncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bをHeLa細胞又はH1299細胞に作用させたときの細胞生存率を確認した。タフデコイRNAを何ら発現しないAd-E3（-）に示すコントロール（従来型Oncolytic Ad）についても同様に確認した。さらに、Adを加えないmockの系もコントロールとした。
　各細胞に対して、細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、培養液を用いて調製した各種ウイルス懸濁液をMOI 2となるように作用させ、37℃で24時間感染させた。その後ウイルス液を除去し、培養液を加えて37℃で培養した。測定時点においてAd非作用群の細胞生存率を100％としたとき、培養３日目（day3）及び５日目（day5）の各細胞の生存率を確認した。細胞生存率はアラマーブルー(R)アッセイ法（Invitrogen社）により確認した。その結果、Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bを作用させた場合、コントロール群よりも顕著な殺細胞効果が認められた（図１９参照）。
（実験例４－２）Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bによる癌細胞内でのAdゲノム増殖能の確認
　実施例４で作製したOncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bをHeLa細胞又はH1299細胞に作用させたときのウイルスゲノム量を確認した。実験例４－１と同様にコントロール（従来型Oncolytic Ad）についても同様に確認した。
　各細胞に対して、細胞が70％コンフルエントの状況になった時に、培養液を用いて調製した各種ウイルス懸濁液をMOI 2となるように作用させ、37℃で24時間感染させた。その後ウイルス液を除去し、培養液を加えて37℃で培養した。培養開始後48時間目のAdゲノムコピー数を定量的PCR法により確認した。その結果、Oncolytic Ad-TuD-27a又はOncolytic Ad-TuD-27bを作用させた場合、コントロール群よりも癌細胞内での高い増殖能が認められた（図２０参照）。
　以上詳述したように、本発明のAdは、従来のAdに比べて効果的にAdを増殖促進させることができる。本発明のAdを有効成分として含む抗腫瘍剤によれば、効果的に標的となる腫瘍細胞内で増殖が促進され、抗腫瘍効果が発揮される。これにより、より効果的な抗腫瘍薬を提供することができ、有用である。
　本発明の抗腫瘍剤において有効成分として含まれるAdは、所望の標的細胞において増殖促進能を有するので、通常の制限増殖Adよりも低い濃度で使用することができ、経済的にも有用である。
　さらに、本発明の増殖促進方法によれば、従来の方法に比べて、効果的にAdを増殖促進させることができる。標的腫瘍細胞等、所望の細胞で効果的にAdを増殖することができれば、効果的に腫瘍溶解等の抗悪性効果を発揮しうる。そして、本発明の増殖促進方法を、細胞におけるAdの産生系に適用することで、より効果的にAdを産生することができ、有用である。

Claims (15)

  1. アデノウイルスの増殖を促進する方法であって、アデノウイルス由来mivaRNAの機能を抑制することを含む、アデノウイルスの増殖促進方法。
  2. アデノウイルスの増殖を促進する方法であって、miR-27a及び／又はmiR-27bを阻害することによるアデノウイルスの増殖促進方法。
  3. mivaRNAの機能を抑制、あるいはmiR-27a及び／又はmiR-27bを阻害することが、少なくともDicer又はAgo2のいずれか一方を阻害することによる、請求項１又は２に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
  4. Dicer又はAgo2の阻害が、RNA干渉によるDicer又はAgo2の阻害である、請求項３に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
  5. RNA干渉によるDicer又はAgo2の阻害が、Dicer又はAgo2に対するsiRNAによる阻害であって、Dicer又はAgo2に対するsiRNAが、当該アデノウイルスに搭載されたDicer又はAgo2に対するsiRNA、アデノウイルス産生用パッケージング細胞に導入されたDicer又はAgo2に対するsiRNA、あるいはDicer又はAgo2に対するsiRNAである、請求項４に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
  6. Dicer又はAgo2の阻害が、アデノウイルス産生用パッケージング細胞におけるDicer遺伝子又はAgo2遺伝子のノックアウトによる阻害である、請求項３に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
  7. Dicer又はAgo2の阻害が、Dicer又はAgo2の抗体による阻害、あるいはDicer又はAgo2の阻害剤による阻害である、請求項３のアデノウイルスの増殖促進方法。
  8. miR-27a又はmiR-27bの阻害が、miR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸、あるいはmiR-27a又はmiR-27bに対する阻害剤による阻害である、請求項２に記載のアデノウイルスの増殖促進方法。
  9. アデノウイルスゲノム において、Dicer又はAgo2に対するsiRNAの発現カセット、あるいはmiR-27a又はmiR-27bに対するデコイ核酸の発現カセットが搭載されていることを特徴とするアデノウイルス。
  10. Dicerに対するsiRNAが、以下の１）又は２）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、Ago2に対するsiRNAが、以下の３）又は４）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27aに対するデコイ核酸が、以下の５）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27bに対するデコイ核酸が、以下の６）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAである、請求項９に記載のアデノウイルス；
    １）GAAUCAGCCUCGCAACAAA（配列番号１）
    ２）UUUGUUGCGAGGCUGAUUC（配列番号２）
    ３）GCACGGAAGUCCAUCUGAA（配列番号３）
    ４）UUCAGAUGGACUUCCGUGC（配列番号４）
    ５）GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１０）
    ６）GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１１）
  11. アデノウイルスが制限増殖型アデノウイルスである、請求項９又は１０に記載のアデノウイルス。
  12. 請求項１１に記載の制限増殖型アデノウイルスを有効成分として含む抗腫瘍剤又は腫瘍検出剤。
  13. アデノウイルス産生用パッケージング細胞におけるゲノムにおいて、少なくともDicer又はAgo2に対するsiRNAの発現カセット、あるいはmiR-27a又はmiR-27bのデコイ核酸の発現カセットが導入されていることを特徴とする、アデノウイルスを作製するためのパッケージング細胞。
  14. Dicerに対するsiRNAが、以下の１）又は２）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、Ago2に対するsiRNAが、以下の３）又は４）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27aに対するデコイ核酸が、以下の５）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAであり、miR-27bに対するデコイ核酸が、以下の６）に示すオリゴヌクレオチドを含むRNAである、請求項１３に記載のパッケージング細胞：
    １）GAAUCAGCCUCGCAACAAA（配列番号１）
    ２）UUUGUUGCGAGGCUGAUUC（配列番号２）
    ３）GCACGGAAGUCCAUCUGAA（配列番号３）
    ４）UUCAGAUGGACUUCCGUGC（配列番号４）
    ５）GCGGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１０）
    ６）GCAGAACUUAGAUCUCCACUGUGAA（配列番号１１）
  15. アデノウイルス産生用パッケージング細胞におけるゲノムにおいて、Dicer又はAgo2のいずれかの遺伝子、あるいはmiR-27a又はmiR-27bがノックアウトされていることを特徴とする、アデノウイルスを作製するためのパッケージング細胞。
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