WO2015020162A1

WO2015020162A1 - アクアポリン３の発現亢進剤及び組織修復促進剤

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Publication number: WO2015020162A1
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Authority: WO
Inventors: 洋一郎礒濱
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Abstract

ウルソール酸を有効成分として含有するアクアポリン３の発現亢進剤及び組織修復促進剤。

Description

アクアポリン３の発現亢進剤及び組織修復促進剤

　本発明は、アクアポリン３の発現亢進剤及び組織修復促進剤に関する。

　アクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎ：以下ＡＱＰと略すことがある）は、アグレにより１９９２年に発見された膜６回貫通タンパクで、細胞内の水分量を調節する水チャネルとして機能する重要なタンパクである。アクアポリンは細菌から哺乳類に至るまで普遍的に存在しており、これまでに哺乳類で、ＡＱＰ０からＡＱＰ１２まで１３種類のアクアポリンが確認されている。

　水チャネルの一種であるアクアポリン３（ＡＱＰ３）は、皮膚ケラチノサイトに多く存在し、水やグリセロールの輸送促進作用を示すことが知られており、皮膚の生理的保湿に重要な成分である。
　また、アクアポリン３の発現は皮膚炎症部位で著明に低下しており、アクアポリン３の発現量の変動が種々の皮膚疾患に伴う乾燥症状の形成と密接な関係にあることが示唆されている。さらに、アクアポリン３はケラチノサイトの増殖又は遊走能の亢進にも関わり、創傷時の治癒促進に関与すると考えられている（例えば、特開２０１１－３２１９１号公報参照）。

　ウルソール酸（ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）は、５環性トリテルペン酸の一種である。ウルソール酸は、メラニン産生抑制作用（例えば、特開２０１３－３２３００号公報参照）や、抗酸化作用（例えば、特開２０１２－５１９４０号公報参照）を示すことが知られている。

　しかしながら、ウルソール酸がアクアポリン３の発現亢進作用又は組織修復促進作用を示すことは知られていなかった。
　本発明の課題は、ウルソール酸の新たな用途を提供することである。
　また、本発明の課題は、新規なアクアポリン３の発現亢進剤、及びアクアポリン３の発現亢進作用に基づく新規な生理活性剤を提供することである。

　本発明は以下の通りである。
＜１＞　ウルソール酸を有効成分として含有するアクアポリン３の発現亢進剤。
＜２＞　ウルソール酸を有効成分として含有する組織修復促進剤。
＜３＞　組織修復促進が、潰瘍、褥瘡、外傷及び手術創からなる群より選ばれる少なくとも１種の肉芽形成促進である＜２＞に記載の組織修復促進剤。
＜４＞　植物からアルコールを用いて抽出したアルコール抽出液を得ることと、得られたアルコール抽出液を、アルコール、炭化水素及び水の混合液に混合分散させてアルコール層を得ることと、得られたアルコール層を、水に混合分散させて水不溶層を得ることと、を含む、ウルソール酸の製造方法。
＜５＞　ウルソール酸を対象に投与することを含むアクアポリン３の発現亢進方法。
＜６＞　ウルソール酸を対象に投与することを含む組織修復促進方法。
＜７＞　組織修復促進が、潰瘍、褥瘡、外傷及び手術創からなる群より選ばれる少なくとも１種の肉芽形成促進である＜６＞に記載の組織修復促進方法。
＜８＞　組織修復促進に使用するためのウルソール酸。
＜９＞　組織修復促進が、潰瘍、褥瘡、外傷及び手術創からなる群より選ばれる少なくとも１種の肉芽形成促進である＜８＞に記載の組織修復促進に使用するためのウルソール酸。

　本発明によれば、ウルソール酸の新たな用途を提供することができる。
　また、本発明によれば、新規なアクアポリン３の発現亢進剤、及びアクアポリン３の発現亢進作用に基づく新規な生理活性剤を提供することができる。

実施例２にかかるアクアポリン３の発現量に対するウルソール酸の作用を示す写真である。実施例２にかかるアクアポリン３の発現量に対するウルソール酸の作用を示すグラフである。実施例３にかかるケラチノサイトの遊走能に対するウルソール酸の作用を示すグラフである。

　本発明のアクアポリン３の発現亢進剤及び組織修復促進剤は、ウルソール酸を有効成分とした生理活性剤である。
　本発明のアクアポリン３の発現亢進剤は、細胞に対して、アクアポリン３の発現亢進作用を有し、且つアクアポリン３の発現亢進作用に基づく組織修復促進作用を有する。
　なお、本明細書では、特に断らない限り、アクアポリン３の発現亢進剤及び組織修復促進剤を「生理活性剤」と総称する。

　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　本明細書において「細胞」とは、アクアポリン３を発現する細胞であれば特に限定されない。具体的には、気道上皮細胞、腎上皮細胞、消化管上皮細胞及び皮膚細胞が挙げられる。皮膚細胞には、表皮細胞（ケラチノサイト）、色素細胞（メラノサイト）、ランゲルハンス細胞、α樹状細胞、メルケル細胞が含まれ、中でも表皮細胞（ケラチノサイト）が好ましい。
　以下、本発明について説明する。

＜生理活性剤＞
　本発明にかかる生理活性剤において有効成分となるウルソール酸は、化学式Ｃ_３０Ｈ_４８Ｏ_３（分子量４５６．７、ＣＡＳ登録番号７７－５２－１）で表される化合物であり、以下の構造式で表される。

　ウルソール酸としては、一般的に用いられる合成物及び植物由来の抽出物等のいずれをも使用することができる。
　ウルソール酸は、リンゴ、バジル、ビルベリー、クランベリー、エルダーフラワー、ペパーミント、ローズマリー、ラベンダー、オレガノ、タイム、サンザシ、プルーン等の植物由来の抽出物を用いることができる。
　また、ウルソール酸は市販品を使用することができる。市販品としては例えば、Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＳｉｇｍａＡｒｄｒｉｃｈ社）、Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）、Ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ（東京化成工業社）、ウルソル酸（和光純薬工業社）等を挙げることができる。

　ウルソール酸は、アクアポリン３の発現亢進作用を有するため、アクアポリン３の機能異常に起因する病態の治療のための医薬の有効成分として有用である。
　アクアポリン３の機能異常とは、健常な組織内細胞のアクアポリン３の状態とは異なる、病態下の組織内細胞のアクアポリン３の状態をいい、アクアポリン３の機能減退、細胞におけるアクアポリン３の数の減少等を含む。
　ウルソール酸を有効成分として含有するアクアポリン３の発現亢進剤は、具体的には、組織修復促進剤として用いることができるが、これらの用途のみに限定されず、アクアポリン３を発現する組織や器官の疾病の予防及び治療のために用いることができる。

（アクアポリン３の発現亢進剤）
　本発明にかかるアクアポリン３の発現亢進剤は、有効成分としてウルソール酸を含有する。これにより、アクアポリン３の発現亢進剤は、ウルソール酸未使用時に比べて、細胞中のアクアポリン３の発現を亢進させることができる。また、アクアポリン３の発現亢進剤は、組織修復を促進する作用を有する。
　さらに、アクアポリン３の発現亢進剤には、皮膚水分保持機能向上、皮膚ターンオーバーの改善、皮膚の乾燥防止、乾燥等による肌荒れの改善、掻痒感の改善、美肌等の効果が期待できる。

　アクアポリン３の発現亢進剤は、ウルソール酸の未使用時に比べて、細胞中のアクアポリン３の発現を亢進する作用を有するものであればよい。
　細胞内のアクアポリン３の発現亢進作用は、特に限定されるものではないが、例えば、細胞中のアクアポリン３の発現量を測定することにより評価することができる。
　評価方法としては具体的には、培養細胞、市販の三次元表皮モデル、テープストリッピング等で採取した角層由来の細胞又はアクアポリン３を発現する皮膚由来の表皮細胞株のアクアポリン発現量をウェスタンブロッティングにより測定する方法、ＰＣＲ法及びノーザンブロット法によりアクアポリン３ｍＲＮＡ発現量を測定する方法、ストップトフロー法による細胞膜水透過性を測定する方法、標識グリセロールの細胞膜透過性を測定する方法等が挙げられる。

　アクアポリン３の発現亢進剤は、細胞内のアクアポリン３の発現量を測定した際に、ウルソール酸未使用時に比べて、アクアポリン３の発現量が、１．５倍～４倍に増加することが好ましく、２倍～４倍に増加することがより好ましく、３倍～４倍に増加することがさらに好ましい。
　なお、アクアポリン３の発現量の測定方法は、Ｈｏｒｉｅ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，３８７，　５６４－８，　２００９に記載の方法に準じればよい。
　評価に用いる培養細胞として、例えばケラチノサイト株ＤＪ－Ｍ１細胞（理研細胞銀行）、Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｈｕｍａｎ　Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｃｅｌｌｓ（ライフテクノロジーズ社）、正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ社）等が挙げられる。
　評価に用いる市販の三次元表皮モデルとしては、ＬａｂｏＣｙｔｅ　Ｅｐｉｍｏｄｅｌ（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング）、ＥＰＩ－２００（クラボウ社）、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＴＯＹＯＢＯ社）等が挙げられる。

（組織修復促進剤）
　本発明にかかる組織修復促進剤は、有効成分としてウルソール酸を含有する。これにより、組織修復促進剤は、細胞の集合体である組織に生じた創傷の修復を、ウルソール酸未使用時に比べて促進させることができる。
　細胞の集合体である組織としては、皮膚、気道、胃及び小腸等の消化管が挙げられ、好ましくは皮膚が挙げられる。

　創傷としては、火傷、凍傷、潰瘍、褥瘡、外傷及び手術創からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
　また、組織修復としては、創傷部位の肉芽形成を促進させること、創傷部位の治癒（創傷治癒）を促進させること、気道及び消化管粘膜上皮の再生を促進すること等が挙げられる。
　好ましくは、組織修復促進が、潰瘍、褥瘡、外傷及び手術創からなる群より選ばれる少なくとも１種の肉芽形成促進であることが挙げられる。

　組織修復促進作用は、具体的には、ケラチノサイトの遊走能、動物の実験的外傷の修復能を測定することにより評価することができる。
　例えば、ケラチノサイトの遊走能の評価は、特開２０１１－３２１９１号公報の段落［００３７］に記載の方法に準じて行えばよい。

　本発明にかかる生理活性剤を組成物の形態で用いる場合、当該組成物におけるウルソール酸の含有量は、剤型によって異なる。
　一般に組成物の全質量に対して、好ましくは０．００００００１質量％～１質量％であり、より好ましくは０．０００１質量％～０．０５質量％であり、特に好ましくは０．００１質量％～０．０１質量％である。

　本発明にかかる生理活性剤を使用する場合、生理活性剤の形態には特に制限はない。ウルソール酸の他、後述する他の成分（医薬や化粧品として許容可能な担体や、必要に応じた他の任意成分）を含む組成物の形態としてもよい。
　組成物の形態としては、オイル組成物、乳化組成物、粉末組成物等が挙げられる。オイル組成物、乳化組成物、粉末組成物は、公知の方法に従い調製することができる。

　本発明にかかる生理活性剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。アクアポリン３の発現亢進作用の観点から、非経口的に投与することが好ましく、具体的には、ウルソール酸を直接皮膚細胞へ投与可能な局所投与が好ましく、経皮投与がより好ましい。
　本発明にかかる生理活性剤の投与量としては、剤型等によって異なるが、一般に、１日あたり、体重ｋｇあたり、有効成分として１ｍｇ～１５ｍｇとすることができ、好ましくは２ｍｇ～１０ｍｇとすることができ、より好ましくは３ｍｇ～５ｍｇとすることができる。

　本発明にかかる生理活性剤を含む組成物に含有される他の成分は、本発明の組成物の形態、目的等に応じて適宜選択することができる。他の成分の好適な例としては、例えば、乳化剤、その他の添加成分等が挙げられる。

　その他の添加成分としては、上記成分の他、医薬品、機能性食品、化粧品等の分野において通常用いられる添加成分を、本発明の組成物に、その形態に応じて適宜含有させてもよい。他の添加成分は、その特性によって、油溶性又は水溶性の添加成分として、本発明の組成物に含有させることができる。

　例えば、その他の添加成分としては、グリセリン、１，３－ブチレングリコール等の多価アルコール；グルコース、果糖、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ペクチン、カッパーカラギーナン、ローカストビーンガム、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアガム、キサンタンガム、カラヤガム、タマリンド種子多糖、アラビアガム、トラガカントガム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デキストリン等の単糖類又は多糖類；ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクトース、マルトトリイトール、キシリトール等の糖アルコール；塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等の無機塩；カゼイン、アルブミン、メチル化コラーゲン、加水分解コラーゲン、水溶性コラーゲン、ゼラチン等の分子量５０００超のタンパク質；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリン等のアミノ酸及びそれらの誘導体；カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、酸化エチレン・酸化プロピレンブロック共重合体等の合成高分子；ヒドロキシエチルセルロース・メチルセルロース等の水溶性セルロース誘導体；等を挙げることができ、その機能に基づいて、例えば機能性成分、賦形剤、粘度調整剤、ラジカル捕捉剤等として含んでもよい。
　その他、本発明においては、例えば、種々の薬効成分、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、着色剤等、通常、その用途で使用される他の添加物を併用することができる。

　生理活性剤は、医薬品、化粧料又は機能性食品等として用いることができる。
　また、生理活性剤は、ヒト及び家畜に投与することができる。家畜としては、イヌ、サル、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。

　なお、生理活性剤は、ウルソール酸を有効成分として含有するアクアポリン３の発現亢進方法に使用することができる。また、生理活性剤は、ウルソール酸を有効成分として含有する組織修復促進方法に使用することもできる。

＜ウルソール酸の製造方法＞
　ウルソール酸の製造方法は、植物からアルコールを用いて抽出したアルコール抽出液を得ること（以下、「抽出工程」と称する。）と、得られたアルコール抽出液を、アルコール、炭化水素及び水の混合液に混合分散させてアルコール層を得ること（以下、「分離工程」と称する。）と、得られたアルコール層を、水に混合分散させて水不溶層を得ること（以下、「単離工程」と称する。）と、を含む。
　これにより、高純度なウルソール酸を得ることができる。
　また、ウルソール酸の製造方法は、抽出工程、分離工程及び単離工程以外の工程を含んでいてもよい。

　抽出工程は、植物からアルコールを用いて抽出した抽出物を得る工程である。好ましくは、抽出工程において、適度に切断又は粉砕した植物を、アルコールに分散させ、室温から加温下で抽出することによりアルコール抽出液を得ることが挙げられる。
　抽出に用いるアルコールとしては、例えば５０ｗ／ｗ％～１００ｗ／ｗ％のメチルアルコール、２０ｗ／ｗ％～１００ｗ／ｗ％のエチルアルコール、１０ｗ／ｗ％～１００ｗ／ｗ％のプロパノール又は１０ｗ／ｗ％～１００ｗ／ｗ％のブタノールを用いてもよく、７０ｗ／ｗ％～１００ｗ／ｗ％のメチルアルコール又は５０ｗ／ｗ％～１００ｗ／ｗ％のエチルアルコールが好ましい。またアルコールの他に、ケトン類、例えばアセトン、液状の脂肪酸エステル類、例えばリノール酸ギリセライド及びグリコール類例えばエチレングリコール等を用いることもできる。抽出工程においてアルコール以外を用いた場合にも、以下に記載されるアルコールを用いた抽出工程、分離工程及び単離工程の条件を適用してよい。

　植物を切断又は粉砕する方法は、公知の方法により行えばよく、例えば植物が粉末状になるまで鋏又は臼を用いて切断又は粉砕する方法が挙げられる。
　抽出温度は、室温から加温下であればよく、具体的には、０℃～１００℃が挙げられ、２０℃～９０℃が好ましい。
　抽出時間は、数分から数日間が挙げられ、例えば植物の色が抽出液に移るまでの間抽出を行えばよい。

　また、抽出工程においては、必要に応じてアルコールを攪拌する撹拌工程を含んでいてもよい。撹拌速度は特に制限されるものではない。
　アルコール抽出液は、例えば植物を濾過して抽出残渣を除去する濾過工程により得ることができる。

　分離工程は、得られたアルコール抽出液を、アルコール、炭化水素及び水の混合液に混合分散させてアルコール層を得る工程である。
　得られたアルコール抽出液を、アルコール、炭化水素及び水の混合液（以下、「混合液」と称する。）に混合分散する場合には、必要に応じてアルコール抽出液及び混合液を撹拌する撹拌工程を含んでいてもよい。撹拌速度は特に制限されるものではない。
　分離工程は、得られたアルコール抽出液を、混合液に混合分散した後に、アルコール層が分離するまでの一定時間放置し、アルコール層を分取するアルコール層分取工程を含んでいてもよい。アルコール層を分取する方法は特に制限はされず、公知の方法を採用することができる。

　単離工程は、得られたアルコール層を、水に混合分散させて水不溶層を得る工程である。
　得られたアルコール層を水に混合分散する場合には、必要に応じてアルコール層及び水を撹拌する撹拌工程を含んでいてもよい。撹拌速度は特に制限されるものではない。
　単離工程は、得られたアルコール層を、水に混合分散したのちに、水不溶層が分離するまでの一定時間放置し、水不溶層を分取する水不溶層分取工程を含んでいてもよい。
　水不溶層を分取する方法は特に制限はされず、公知の方法を採用することができる。

　また、ウルソール酸の製造方法は、抽出工程、分離工程及び単離工程に加えて、得られた水不溶層から、ウルソール酸を精製する精製工程を含んでいてもよい。
　ウルソール酸を水不溶層から精製する方法としては、限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。例えば、シリカゲル、アルミナ及び疎水クロマト担体を用いたカラムクロマト等を用いた方法が挙げられる。

　植物は、ウルソール酸を含有する植物であれば、未乾燥植物及び乾燥植物のいずれであってもよい。
　未乾燥植物としては、生薬、ハーブ、果物等が挙げられる。
　乾燥植物としては、天日乾燥又は凍結乾燥した植物のいずれであってもよいが、回収効率の観点より、天日乾燥した植物であることが好ましい。

　植物の種類としては、ウルソール酸を含有する植物であればいずれの植物であってもよい。例えば、シソ科、バラ科、ツツジ科、スイカズラ科等が挙げられる。
　具体的には、シソ科のオドリコソウ亜科に属するケイガイ（Ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ　ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ　Ｂｒｉｑｕｅｔ（ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｋｉｔａｇａｗａ））の花穂、シソ科のマンネンロウ属に属するローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ　Ｌ．）及びバラ科のナシ亜科リンゴ属に属するリンゴの皮等が挙げられる。

　アルコールとしては、低級アルコール（メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール等）等を挙げることができる。これらのアルコールは単独で用いてもよいし、２種類以上のアルコールを混合して用いてもよい。
　また、アルコールとしては、低級アルコールが好ましく、メタノールが特に好ましい。
　植物を分散するアルコールの量は、植物の全質量に対して約２倍量～１００倍量、好ましくは３倍量～３０倍量のアルコールを用いることができる。

　アルコール、炭化水素及び水の混合液としては、体積基準で、アルコール：炭化水素：水が、１：１：１～５：２：１：１、２：２：１～１：１：２、又は３：２：１～３：２：２である混合液を用いることができる。
　アルコールとしては、低級アルコール（メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール等）等を挙げることができるが、低級アルコールが好ましく、中でもメタノールを用いることがより好ましい。
　炭化水素としては、ベンゼン、ヘキサン等が挙げられるが、ヘキサンを用いることが好ましい。
　アルコール抽出液を混合分散する混合液の量としては、アルコール抽出液の全体積に対して約２倍量～１００倍量、好ましくは１０倍量～５０倍量の混合液を用いることができる。

　アルコール層を混合分散する水の量としては、アルコール層の全体積に対して約０．１倍量～２倍量、好ましくは０．５倍量～１．５倍量の水を用いることができる。

　このようにして得られた水不溶層にはウルソール酸が含有されているため、水不溶層を構成する水不溶性成分を、そのまま本発明の生理活性剤として利用することができる。

　以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。

［実施例１：ウルソール酸の製造］
　乾燥ケイガイ３００ｇ（ウチダ社製）にメタノール３０００ｍｌを加え、２時間かけて７０℃で加熱抽出し、アルコール抽出液３０ｇを得る。
　得られたアルコール抽出液を、メタノール、ヘキサン及び水の混合液（２１０：９０：７０（容積基準））１０００ｍｌに混合分散させて、３０分経過後、メタノール層を分液ロートにより分取し、蒸発乾固させる（メタノール層２４ｇ）。得られたメタノール層を、水５００ｍｌに混合分散させて、２０分経過後、水不溶層を遠心により分取する（水不溶層３．８ｇ）。得られた水不溶層を、積載容積２００ｍＬのシリカゲルカラムに供し、クロロホルム：メタノール：水（７：２：０．１）２００ｍＬ、クロロホルム：メタノール：水（７：３：０．５）２００ｍＬ及びメタノール２００ｍＬで順次溶出し、得られた第３分画から第４分画（溶出液量２０ｍＬ～１００ｍＬ）を分取、濃縮乾固させて、約１００ｍｇのウルソール酸を得た。

［実施例２：アクアポリン３の発現量に対するウルソール酸の作用］
　ケラチノサイト株ＤＪ－Ｍ１細胞（理研細胞銀行）は、１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｖ／ｖ％　ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ（ＧＩＢＣＯ社）を含むＭＥＭ培地を用いて、５ｖ／ｖ％二酸化炭素、３７°Ｃで静置培養した。
　ケラチノサイト株ＤＪ－Ｍ１細胞をコンフルエンシー８０％～９０％まで培養後、ＭＥＭ培地を、ウルソール酸（シグマアルドリッチ社）０．００５ｍｇ／ｍｌを添加した無血清培地に置換し、２４時間静置して、ウルソール酸処理した細胞を得た。
　ウルソール酸処理した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、セルスクレイパーを用いて掻き取り、遠心してペレットを得た。
　得られたペレットにＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ：ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　ＮＰ－４０、０．１％　ＳＤＳ、０．５％　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１％ｖ／ｖ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ）（シグマアルドリッチ社）を０．０５ｍｌ加え、ピペッティングして可溶化し、再度、遠心して、その上清を細胞溶解液として得た。
　細胞溶解液を試料として以下の通りポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロッティングを行った。
　細胞溶解液１０μｌを、１２ｖ／ｖ％　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、細胞溶解液に含まれる各種タンパクを各バンドに分離後、ＰＶＤＦ膜（サーモサイエンス社）に転写した。
　転写したＰＶＤＦ膜は５％スキムミルク液中、室温で１時間振盪してブロッキングし、その後、１：１０００に希釈した抗アクアポリン３（ＡＱＰ３）抗体（アロモン社）を用いて一次抗体反応（４°Ｃ、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）を行い、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄した後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－標識抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００００）（サンタクルズ社）を用いて二次抗体反応（室温、１ｈ）を行った。
　さらに、メンブレンを洗浄後、ＥＣＬ（登録商標）ａｄｖａｎｃｅ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて抗体反応を検出した。
　なお、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌへの試料のロード量が均一であることは、一次抗体に抗β－アクチン抗体を用いた同様の実験で検証した。

　上述の方法により得られたアクアポリン３の発現量の測定結果を図１及び図２に示す。
　図１は、ウェスタンブロッティングにより得られたメンブレン（アクアポリン３に該当するバンド）の写真である。
　図２は、ウェスタンブロッティングの結果に基づき、各バンドのタンパク量を画像解析装置（ＬＡＳ-１０００、フジフイルム社）にて定量化して得られたグラフである。なお、図２の縦軸はコントロールであるβ－アクチン量に対する、アクアポリン３の発現量の比率（％）を示しており、横軸はウルソール酸処理に用いたウルソール酸の添加量（Ｍ）を示す。

　図１及び図２の結果から明らかである通り、ウルソール酸添加により、アクアポリン３の発現亢進が認められた。

［実施例３：ケラチノサイトの遊走能に対するウルソール酸の作用］
　ケラチノサイト株ＤＪ－Ｍ１細胞のコンフルエントカルチャーのＭＳＭ培地を、ウルソール酸０．００５ｍｇ／ｍｌ添加無血清培地に置換し、２４時間培養した。
　培養皿底部の細胞を２００μｌピペットチップの先端を接触させ、一定の圧力を維持したまま直線的に移動させることで細胞を剥離（ｓｃｒａｔｃｈ）し、このｓｃｒａｔｃｈ幅を測定した（Ｉｎｉｔｉａｌ　Ｗｏｕｎｄ）。
　無血清培地を、１ｖ／ｖ％ＦＢＳ及び０．００５ｍｇ／ｍｌのウルソール酸を含む培地に置換後、さらに２４時間培養し、再びｓｃｒａｔｃｈ幅を測定した。
　Ｓｃｒａｔｃｈ幅は１ディッシュ当り５ヶ所で測定し、その平均値を１つのデータとした。
　細胞遊走能は、Ｉｎｉｔｉａｌ　Ｗｏｕｎｄと最終的なｓｃｒａｔｃｈ幅との差（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ）として算出した。

　図３の結果から明らかである通り、ウルソール酸添加によりケラチノサイトの遊走能が促進され、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの実験的創傷の回復が促進された。

［実施例４：ウルソール酸の製造］
　乾燥ケイガイ（荊芥）３００ｇをメタノールに分散し、メタノール抽出エキスを得た。その後、メタノール抽出液を、ヘキサン／水（７：３）で分配し、ヘキサン及び水に不溶性画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（メルク社）により２０分画した。
　得られた各画分について、実施例１と同様にアクアポリン３の発現量に対する作用を確認した。その結果、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝７：２：０．２で溶出した第３画分を構成する成分に強いアクアポリン３の発現亢進活性を認めた。
　第３画分を構成する成分を、ＮＭＲ及びＦＡＢ-ＭＳを用いて構造解析した結果、当該成分はウルソール酸と同定した。

　２０１３年８月９日に出願された日本国特許出願２０１３－１６６３２６の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。本発明の例示的実施形態についての以上の記載は例示および説明の目的でされたものであり、網羅的であることあるいは発明を開示されている形態そのものに限定することを意図するものではない。明らかなことではあるが、多くの改変あるいは変更が当業者には自明である。上記実施形態は発明の原理及び実用的応用を最もうまく説明し、想定される特定の用途に適するような種々の実施形態や種々の改変と共に他の当業者が発明を理解できるようにするために選択され、記載された。本発明の範囲は以下の請求項およびその均等物によって規定されることが意図されている。

Claims

　ウルソール酸を有効成分として含有するアクアポリン３の発現亢進剤。
　ウルソール酸を有効成分として含有する組織修復促進剤。
　組織修復促進が、潰瘍、褥瘡、外傷及び手術創からなる群より選ばれる少なくとも１種の肉芽形成促進である請求項２に記載の組織修復促進剤。
　植物からアルコールを用いて抽出したアルコール抽出液を得ることと、
　得られたアルコール抽出液を、アルコール、炭化水素及び水の混合液に混合分散させてアルコール層を得ることと、
　得られたアルコール層を、水に混合分散させて水不溶層を得ることと、
　を含む、ウルソール酸の製造方法。