WO2015016124A1 - 改良型β－グルクロニダーゼ - Google Patents

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WO2015016124A1
WO2015016124A1 PCT/JP2014/069539 JP2014069539W WO2015016124A1 WO 2015016124 A1 WO2015016124 A1 WO 2015016124A1 JP 2014069539 W JP2014069539 W JP 2014069539W WO 2015016124 A1 WO2015016124 A1 WO 2015016124A1
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WO
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glucuronidase
improved
amino acid
acid sequence
gene
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哲也 四方
武志 角南
雄大 西川
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Japan Science and Technology Agency
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Japan Science and Technology Agency
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)

Definitions

  • the present invention relates to an improved ⁇ -glucuronidase whose activity expression is accelerated as compared with the wild type, and an improved ⁇ -glucuronidase whose enzyme molecular activity (k cat ) is improved as compared with the wild type.
  • k cat enzyme molecular activity
  • the ⁇ -glucuronidase gene has been conventionally used as a particularly useful reporter gene in plant cells that do not have it.
  • ⁇ -glucuronidase gene When a ⁇ -glucuronidase gene is used as a reporter gene, ⁇ -glucuronidase is expressed from the gene. ⁇ -glucuronidase does not show activity in the monomer state, but only becomes tetramer to show activity, and its detection becomes possible.
  • the ⁇ -glucuronidase gene is used as a reporter gene, it is known that the speed of this tetramer formation process is the rate-limiting step of detection.
  • Previous studies have revealed that the expression of ⁇ -glucuronidase activity has a problem that it takes a considerable amount of time depending on the cell size (for example, T. Matsuura et al. , “Kinetic Analysis of ⁇ -Galactosidase and ⁇ -Glucuronidase Tetramerization Coupled with Protein Translation”, Journal of Biological Chem.
  • ⁇ -glucuronidase gene when ⁇ -glucuronidase gene is introduced into a cell as a reporter gene, the concentration varies dramatically if the cell size is different. If the cells are large and the local concentration of the gene is low, there is a problem that it takes time before detection. This is considered to be due to the fact that when the cell size is large, even if the same amount of ⁇ -glucuronidase monomer is expressed, its local concentration is low, making it difficult to associate and form a tetramer. It is done.
  • An object of the present invention is to provide a new and improved mutated ⁇ -glucuronidase having a high enzyme activity compared to the wild type and easy to detect.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention is characterized in that a mutation is introduced into the amino acid sequence of the ⁇ -glucuronidase monomer and has methionine or serine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence. .
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention preferably has methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence and leucine at the 520th position from the N-terminal side of the amino acid sequence.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention preferably has serine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence and has alanine at the 444th position from the N-terminal side of the amino acid sequence.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention preferably has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18 or 20.
  • the present invention also provides an improved ⁇ -glucuronidase in which a mutation is further introduced into the above-described improved ⁇ -glucuronidase, which has at least one of the following (a) to (d): -Also provides for glucuronidase.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention preferably has all of the above (a) to (d).
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention preferably has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 or 29.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention those having methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence have a much faster tetramer formation rate than wild-type ⁇ -glucuronidase. Thus, detection can be performed more quickly.
  • those having serine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence have a fast fluorescence intensity amplification, and the substrate hydrolysis rate compared to the wild type. Is high (has a large k cat ).
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention provides a new and improved ⁇ -glucuronidase that has evolved from the wild type, has higher activity, and is easy to detect. Is done.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a method for improving an enzyme in terms of evolutionary engineering, which is preferably used for producing the improved ⁇ -glucuronidase (GUS) of the present invention.
  • the time course of the GUS catalytic reaction (substrate hydrolysis) accompanying the translation reaction from the GUS gene (100 pM DNA) in a test tube is shown in comparison with the wild-type GUS and the improved GUS (C1102, C1110) of the present invention. It is a graph. It is a graph which compares and compares the wild-type GUS and the improved GUS (C1102, C1110) of this invention about the reaction rate in 60 minutes after reaction start.
  • FIG. 6 (a) is a graph showing the results of nucleotide sequence analysis of the obtained improved ⁇ -glucuronidase
  • FIG. 6 (a) is a graph showing the results of nucleotide sequence analysis of the obtained improved ⁇ -glucuronidase
  • FIG. 6 (a) shows the average value of non-synonymous substitutions of improved ⁇ -glucuronidase (per clone) (the vertical axis is the average variation) Number [/ clone], the horizontal axis is the number of selection steps (number of rounds), and FIG. 6 (b) shows the number of enriched non-synonymous substitutions (50% or more of all clones have in common) (Vertical axis is the number of rich mutations, and the horizontal axis is the number of selection steps (round number)).
  • FIG. 6 (c) is the concentration ratio of non-synonymous substitutions (of clones with mutations).
  • FIG. 5 is a graph showing the results of in-tube ⁇ -glucuronidase synthesis reaction (DNA start) for wild type, C12, and C24.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of in-tube ⁇ -glucuronidase synthesis reaction (RNA start) for wild type, C12, and C24.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a method for improving an enzyme in terms of evolutionary engineering, which is preferably used for producing the improved ⁇ -glucuronidase (GUS) of the present invention.
  • This method is a method proposed by the present applicant in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-210170, and uses a liposome encapsulating a gene library and a cell-free protein synthesis system (cell-free transcription and translation system), and a cell sorter. Details will be described later in the experimental examples.
  • a gene library in which random mutations are introduced into a gene (DNA or RNA) encoding a target enzyme using a known genetic engineering technique is prepared.
  • a gene DNA or RNA
  • a cell-free protein synthesis system are encapsulated in a liposome that is an artificial lipid bilayer vesicle. If the gene is DNA, it is transcribed into RNA, and if the gene is RNA, the gene is expressed in the liposome as it is. At that time, for example, the substrate and the expressed enzyme are reacted to evaluate the activity of the enzyme.
  • a fluorescent cell sorter is used to quantitatively evaluate the activity of the enzyme, and a liposome containing a more active enzyme is selected.
  • a gene (DNA or RNA) encoding an enzyme contained in the selected liposome is taken out, further introduced with a mutation by a known genetic engineering technique, and amplified to prepare a gene library. This is taken as one round, and this gene library is also encapsulated in a liposome together with a cell-free protein synthesis system and expressed, and rounds are repeated. This makes it possible to produce a so-called improved enzyme having a high activity for each round.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention is produced by using the above-described method using ⁇ -glucuronidase as a target enzyme and a gene encoding the enzyme.
  • ⁇ -glucuronidase as a target enzyme and a gene encoding the enzyme.
  • SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of plasmid DNA (pET_GUS) encoding wild-type ⁇ -glucuronidase is shown in SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence of wild-type ⁇ -glucuronidase expressed from the DNA is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a DNA library in which mutations are randomly introduced into such a wild-type ⁇ -glucuronidase gene by a known appropriate point mutation introduction method is prepared.
  • a DNA fragment (gus_wt) containing a T7 promoter sequence and a region encoding ⁇ -glucuronidase was added to primers (1), (2) (base sequence A PCR using DNA polymerase (for example, 30 cycles), and using this gus_wt as a template and the same primers (1) and (2), for example, DNA for random mutation introduction
  • primers (1), (2) base sequence A PCR using DNA polymerase (for example, 30 cycles)
  • DNA for random mutation introduction A DNA library into which mutations are randomly introduced can be prepared by an error-prone PCR method using a polymerase (for example, Mutzyme II DNA polymerase, Agilent Technologies).
  • a reaction solution for protein synthesis including the DNA into which the mutation has been introduced and a cell-free protein synthesis system is prepared and encapsulated in liposomes.
  • a cell-free protein synthesis system a commercially available one can be used without particular limitation, and a preferred example is PUREsystem (Gen Frontier).
  • a liposome the unilamellar liposome produced by the well-known method by allowing a W / O emulsion to pass through an oil-water interface can be used conveniently.
  • the mutated ⁇ -glucuronidase is expressed in the liposome.
  • active ⁇ -glucuronidase active ⁇ -glucuronidase
  • active ⁇ -glucuronidase active ⁇ -glucuronidase
  • PFB-FDGlcU 5- (pentafluorobenzoylamino) fluorescein di- ⁇ -D-glucuronide
  • liposomes containing DNA encoding active ⁇ -glucuronidase are collected with a cell sorter using green fluorescence as an index.
  • the encapsulated DNA is extracted from the collected liposomes.
  • QIAquick PCR Purification Kit Qiagen
  • the extracted DNA is amplified by PCR using the primers (1), (2) and DNA polymerase described above, and only the DNA of the desired length is recovered and purified by agarose gel electrophoresis.
  • the purified DNA is also introduced with a mutation, encapsulated in a liposome together with a cell-free protein synthesis system, active ⁇ -glucuronidase is detected, and DNA encoding the active ⁇ -glucuronidase is recovered from the liposome. Evolve and evolve rounds.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention is an improved ⁇ -glucuronidase in which a mutation is introduced into the amino acid sequence of a ⁇ -glucuronidase monomer, which is a methionine or methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence. It has serine. Wild-type ⁇ -glucuronidase has leucine (Leu / L) at position 561 from the N-terminal side, but in the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention, this leucine is methionine (Met / M) or serine (Ser / L). S). Interestingly, the effect of the improved ⁇ -glucuronidase varies depending on whether 561 has methionine or serine.
  • FIG. 2 shows the ⁇ -glucuronidase catalyzed reaction (substrate hydrolysis) accompanying the translation reaction from the ⁇ -glucuronidase gene in the test tube of the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention actually produced in Experimental Example 1 described later.
  • FIG. 4 is a diagram showing the time course in comparison with wild-type ⁇ -glucuronidase.
  • FIG. 3 is a graph comparing the wild-type ⁇ -glucuronidase and the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention with respect to the reaction rate 60 minutes after the start of the reaction. As is clear from FIGS.
  • C1102 is an improved ⁇ -glucuronidase having methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence (the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10, respectively).
  • C1110 base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • C1110 expresses catalytic activity much faster than wild-type ⁇ -glucuronidase (the catalytic activity can be observed more than 20 minutes faster).
  • FIG. 5 shows the ⁇ -glucuronidase catalyzed reaction (substrate hydrolysis) accompanying the translation reaction from the ⁇ -glucuronidase gene in the test tube of the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention actually produced in Experimental Example 1 described later.
  • a modified ⁇ -glucuronidase having serine at position 561 from the N-terminal side of the amino acid sequence (e301 (base sequence is SEQ ID NO: 13, amino acid sequence)
  • E304 base sequence is shown in SEQ ID NO: 15 and amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16
  • e314 base sequence is shown in SEQ ID NO: 17 and amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18
  • e321 The nucleotide sequence is SEQ ID NO: 19 and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 20, respectively. This is also shown). From the results shown in FIG.
  • the present invention provides a new and improved ⁇ -glucuronidase that has evolved from the wild type in terms of enzyme activity, has high activity, and is easy to detect.
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention when it has methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence, it preferably has leucine at the 520th position from the N-terminal side of the amino acid sequence. Specifically, it is particularly preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 12 (that is, C1102, C1110 described above).
  • the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention when it has serine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence, it preferably has an alanine at the 444th position from the N-terminal side of the amino acid sequence. Specifically, it is particularly preferable to have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or 20 (that is, e301, e321 described above). In addition, as another preferred specific example in the case of having serine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence, there is also a case of having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 18 (that is, e304 and e314 described above). .
  • the present invention further provides ⁇ -glucuronidase obtained by repeating the above-described rounds and further evolving ⁇ -glucuronidase having methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence.
  • the further evolved ⁇ -glucuronidase of the present invention has methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence and leucine at the 520th position. And at least one of the following (a) to (d).
  • Such an improved ⁇ -glucuronidase exhibits much higher enzyme activity, such as the ability to detect activity even at a DNA concentration of about 50 pM, which makes it difficult to detect enzyme activity in the wild type.
  • Such an improved ⁇ -glucuronidase of the present invention preferably has all of the above (a) to (d) as C12 and C24 obtained in Experimental Example 2 described later. It is particularly preferred to have the amino acid sequence shown in 27 or SEQ ID NO: 29.
  • ⁇ Experimental example 1> Screening of active ⁇ -glucuronidase (GUS) gene (1-1) Preparation of gene library A random mutant library (mt_gus) of GUS gene for use in gene screening experiments was prepared by error-prone PCR. First, from a plasmid DNA (pET_gus) encoding wild type ⁇ -glucuronidase (base sequence shown in SEQ ID NO: 1), a DNA fragment (gus_wt) containing a T7 promoter sequence and a region encoding ⁇ -glucuronidase was PCR (30 cycles).
  • pET_gus plasmid DNA
  • gus_wt a DNA fragment containing a T7 promoter sequence and a region encoding ⁇ -glucuronidase was PCR (30 cycles).
  • the DNA polymerase was KOD FX (Toyobo), primer (1) (GAGTGCCGCCCGCAAGCTTTTA: SEQ ID NO: 3) and primer (2) (CCCGCGGAATATATACGAACTCACTATAGGTCGACTGTAGATATATGATTGATTAATATTTGTATATATTTTGTTATA Using gus_wt as a template, a primer (1) and a primer (2) were used to prepare a ⁇ -glucuronidase gene into which mutation was introduced by DNA polymerase for random mutagenesis (Mutazime II DNA polymerase, Agilent Technologies).
  • reaction solution for protein synthesis a reaction solution containing a cell-free protein synthesis system (PURE system: prepared by the inventors) and mt_gus was prepared. Reagents necessary for the preparation, the solution being prepared, and the reaction solution after the preparation were stored on ice. The composition of the reaction solution is shown in Table 1.
  • the main reagents include RNase inhibitor (Promega), T7 RNA polymerase (Takara Bio), transferrin Alexa 647 (Life Technologies Japan (former Invitrogen)), PFB-FDGlcU (5- (pentafluorbenzobenzolamino) fluorescein di- ⁇ -D-glucuronide) ) (Life Technologies Japan (former Invitrogen)) was used.
  • the DNA concentration in the reaction solution was 8 pM (in the case of screening for recovering liposomes from the 80 fL region) or 100 pM (in the case of screening for recovering liposomes from the 1 fL region).
  • a liquid paraffin solution (5 mg / mL, weight ratio 9: 1) of phospholipid (POPC: 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, yorkipolar lipid) and cholesterol (Nacalai Tesque) was prepared. did.
  • the reaction solution for protein synthesis was added to the lipid solution at a rate of 5 vol%, and the mixture was vigorously stirred with a vortex mixer to prepare a W / O emulsion.
  • the W / O emulsion was layered on a buffer for liposome external solution, and this was centrifuged at 18000 ⁇ g (cooled to 4 ° C. during centrifugation) to obtain a liposome dispersion.
  • DNase I RNase-free, Takara Bio
  • 2.5 ⁇ L (12.5 units) per 100 ⁇ L of this dispersion was added to decompose the DNA existing outside the liposome.
  • the 80 fL region was set to a region where the fluorescence intensity of the reaction product> 1000 and the liposome size was 50 fL to 250 fL.
  • the 1 fL region was set to a region where the fluorescence intensity of the reaction product was> 1000 and the liposome size was 0.5 fL to 2 fL. Since the DNA concentration at the time of encapsulation was 8 pM (targeting 80 fL size) and 100 pM (targeting 1 fL size) so that the number of encapsulated genes per liposome was about one molecule, recovery of liposomes from the 80 fL region and the 1 fL region The liposomes were collected independently.
  • This plasmid DNA was introduced into competent cells (XL 10-Gold Ultracompetent Cells, Stratagene) and cultured on LB Agar plates containing ampicillin, and then colonies were recovered. Plasmid DNA was extracted from the colonies recovered using the QIAprep Spin Miniprep Kit. Introduction of the target gene in the recovered plasmid DNA was confirmed by agarose electrophoresis after treatment with restriction enzymes (NotI, BglII).
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -glucuronidase in which this C1102 was expressed was compared to the wild type ⁇ -glucuronidase, the 33rd arginine (Arg / R) from the N-terminal to the cysteine (Cys / C), and the 254th Valine (Val / V) is phenylalanine (Phe / F), 520th methionine (Met / M) is leucine (Leu / L), 561th leucine (Leu / L) is methionine (Met / M) (The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10).
  • the 30th T from the 5 ′ side is C
  • the 654th T is C
  • the 1050th T is C
  • the 1558th A is T
  • the 1681st The T of A was changed to A (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 11).
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -glucuronidase in which this C1110 was expressed was such that the 520th methionine (Met / M) from the N-terminal side was leucine (Leu / L) and the 561st compared to the wild-type ⁇ -glucuronidase.
  • the leucine (Leu / L) in the above was changed to methionine (Met / M) (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 12).
  • the 113 th C from the 5 ′ side is T
  • the 663 th A is T
  • the 1133 th A is G
  • the 1328 th G is A
  • the 1331 th The 1458th A was changed to G
  • the 1551st C was changed to T
  • the 1682th T was changed to C
  • the 1686th C was changed to T (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 13).
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -glucuronidase in which this e301 was expressed was compared with the wild-type ⁇ -glucuronidase, the 38th alanine (Ala / A) from the N-terminal side to the valine (Val / V).
  • Glutamine (Gln / Q) is histidine (His / H)
  • 378th glutamic acid (Glu / E) is glycine (Gly / G)
  • 443rd cysteine (Cys / C) is tyrosine (Tyr / Y).
  • the 444th valine (Val / V) was changed to alanine (Ala / A) and the 561st leucine (Leu / L) was changed to serine (Ser / S) (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 14). .
  • the 156th C from the 5 'side is T
  • the 579th C is T
  • the 705th A is G
  • the 1109th A is G
  • the 1352th C was changed to T
  • 1359th C was changed to A
  • 1425th C was changed to T
  • 1530th A was changed to G
  • 1682th T was changed to C (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 15).
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -glucuronidase in which this e304 was expressed was such that the 370th lysine (Lys / K) from the N-terminal side to arginine (Arg / R) compared to the wild-type ⁇ -glucuronidase, the 451st The alanine (Ala / A) was changed to valine (Val / V) and the 561st leucine (Leu / L) was changed to serine (Ser / S) (the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16).
  • the 174th A from the 5 ′ side is T
  • the 619th G is A
  • the 676th A is T
  • the 756th G is C
  • the 1317th The T of A was changed to A
  • the 1525 th A was changed to G
  • the 1682 th T was changed to C
  • the 1800 th A was changed to G (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 17).
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -glucuronidase in which this e314 was expressed was compared to the wild type ⁇ -glucuronidase, the 207th valine (Val / V) from the N-terminal side to the methionine (Met / M).
  • Threonine (Thr / T) is serine (Ser / S)
  • 509 threonine (Thr / T) is alanine (Ala / A)
  • 561 leucine (Leu / L) is serine (Ser / S) (The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18).
  • the 126 th C from the 5 ′ side is T
  • the 660 th T is A
  • the 1087 th A is G
  • the 1165 th T is C
  • the 1254 th The G of A was changed to A
  • the 1331st T was changed to C
  • the 1682th T was changed to C
  • the 1734th G was changed to A (the base sequence is shown in SEQ ID NO: 19).
  • the amino acid sequence of the improved ⁇ -glucuronidase in which this e321 was expressed was such that the 220th aspartic acid (Asp / D) from the N-terminal side to glutamic acid (Glu / E) was 363 as compared to the wild-type ⁇ -glucuronidase.
  • Isoleucine (Ile / I) is valine (Val / V)
  • 444th valine (Val / V) is alanine (Ala / A)
  • 561 leucine (Leu / L) is serine (Ser / S).
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 20).
  • a DNA fragment containing a T7 promoter sequence and a region encoding ⁇ -glucuronidase was used as a template with plasmid DNA encoding the cloned improved ⁇ -glucuronidase as a primer (4) (CCCGCGGAAATAATACGACTCAC: SEQ ID NO: 22) and primer (5)
  • a modified ⁇ -glucuronidase with His-tag was prepared by PCR reaction (30 cycles, DNA polymerase was KOD FX (Toyobo)) using (GAGTGCGGCCCAAGTCCATGGGTGGGTGTGTTGTTTGCCTCCCTGCTGCGTTTT: SEQ ID NO: 23).
  • This gene fragment was electrophoresed using E-Gel Clone Well (0.8% agarose gel, Life Technologies Japan (former Invitrogen)), and only the DNA fragment of the desired length was recovered and purified, and then the gene was obtained by PCR. The fragment was amplified (20 cycles, DNA polymerase was KOD FX (Toyobo)).
  • An improved ⁇ -glucuronidase gene fragment with His-tag was inserted into a DpnI-treated vector (a vector was prepared using pET_gusA as a template) by the In-fusion method (In-Fusion HD Cloning Kit, Clontech), and His-tag Plasmid DNA into which the attached gene was introduced was prepared.
  • This plasmid DNA was introduced into competent cells (XL 10-Gold Ultracompetent Cells, Stratagene) and cultured on LB Agar plates containing ampicillin, and then colonies were collected. Plasmid DNA was extracted from colonies collected using QIAprep Spin Miniprep Kit.
  • nucleotide sequence was decoded by the Dye Terminator method to confirm the introduction of the improved ⁇ -glucuronidase gene with His-tag.
  • the concentration gradient was as follows.
  • the concentrated sample was filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and then applied to a HiLoad 16/600 Superdex 200 pg column equilibrated with a gel filtration buffer, followed by gel filtration.
  • the buffer composition used for gel filtration is shown below.
  • the initial reaction rate for each substrate concentration was determined from the change in fluorescence intensity over time.
  • the k cat and K m of wild-type ⁇ -glucuronidase and improved ⁇ -glucuronidase were evaluated.
  • FIG. 2 shows the time course of ⁇ -glucuronidase catalyzed reaction (substrate hydrolysis) associated with the translation reaction from the ⁇ -glucuronidase gene (100 pM DNA) in a test tube, and the improved ⁇ -glucuronidase of the present invention. It is a graph which compares and shows glucuronidase (C1102, C1110), a vertical axis
  • shaft is reaction product amount (fluorescence intensity) (a unit is arbitrary), and a horizontal axis is reaction time (minute).
  • FIG. 3 is a graph showing a comparison of the wild-type ⁇ -glucuronidase and the improved ⁇ -glucuronidase (C1102, C1110) of the present invention with respect to the reaction rate 60 minutes after the start of the reaction. Decomposition rate (after normalization).
  • Tables 4 and 5 show comparison of characteristic parameters (k cat , K m ) of wild type ⁇ -glucuronidase and improved ⁇ -glucuronidase (C1102, C1110), and Table 4 shows TG-bGlcU ( Table 5 shows the results of evaluation using PFB-FDGlcU as a substrate when evaluation was performed using Tokyo Green- ⁇ GlcU (Na), Sekisui Medical) as a substrate.
  • Table 6 also shows k t1 k t2 (rate at which ⁇ -glucuronidase is synthesized from DNA), k 1 2 k 2 (four) for wild-type ⁇ -glucuronidase and the improved ⁇ -glucuronidase (C1102, C1110) of the present invention. ( Mer formation rate) and k cat (enzyme activity).
  • FIG. 4 schematically shows the meanings of k t1 , k t2 , k 1 , k 2 , and k cat .
  • C1102 and C1110 which are improved ⁇ -glucuronidases having methionine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence, are compared with wild-type ⁇ -glucuronidase. It can be seen that the catalytic activity is remarkably rapidly developed (the catalytic activity can be observed more rapidly than 20 minutes). This is because in the improved ⁇ -glucuronidase, the rate of tetramer formation is markedly higher than that of wild-type ⁇ -glucuronidase (as shown in Table 6, at least for C1110, k 1 2 k 2 (tetramer). This is considered to be because the formation speed) is about 10 times faster.
  • FIG. 5 shows the time course of ⁇ -glucuronidase catalyzed reaction (substrate hydrolysis) associated with the translation reaction from the ⁇ -glucuronidase gene (100 pM DNA) in vitro as well as C1102 and C1110 as improved ⁇ -glucuronidase. Also shown are improved ⁇ -glucuronidases (e301, e304, e314, e321) having serine at the 561st position from the N-terminal side of the amino acid sequence. From the results shown in FIG.
  • ⁇ Experimental example 2> An improved ⁇ -glucuronidase was created using liposomes as a micro reaction field. First, 100 ⁇ L of chloroform was added to 10 mg of lipid (POPC: Cholesterol 9: 1 (mass ratio)) and mixed well. Next, 2 mL of liquid paraffin was added and mixed well. The mixture was warmed at 80 ° C. for 30 minutes to volatilize chloroform and removed from the solvent as much as possible. Inner liquid, outer liquid, and diluted liquid were prepared on ice.
  • the encapsulating liquid is a reaction liquid encapsulated inside the liposome, and its composition is as follows.
  • DNA of various concentrations ( ⁇ -glucuronidase gene is encoded downstream of the T7 promoter: the nucleotide sequence of the gene encoding wild-type ⁇ -glucuronidase used in this experiment is SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 25 Show.) ⁇ 330 mM sucrose ⁇ 1 ⁇ M Transfer from human serum, Alexa Fluor 647 conjugate (Life Technologies Japan) ⁇ 50 ⁇ M 5- (Pentafluorobenzoylamino) fluorescein di-beta-D-glucuronide (abbreviated as “PFB-FDGlcU”) (Life Technologies Japan) ⁇ 1 mM Phenylethyl beta-D-thiogalactopyranoside (PETG) ⁇ 5mU / ⁇ L T7 RNA polymerase (Takara Bio) ⁇ Cell-free protein synthesis system (PUREsystem)
  • the PFB-FDGlcU is a reagent for detecting ⁇ -
  • PFB-fluorescein (abbreviated as “PFB-F”), which is a green fluorescence product, is used. Arise.
  • PUREsystem The detailed composition of the cell-free protein synthesis system (PUREsystem) is described in Kita et al. , Replication of genetic information with self-encoded replicate in liposomes, Chembiochem, 9 (15), 2403-2410 (2008).
  • the external solution is a solution that exists outside the liposome during the synthesis of ⁇ -glucuronidase in the liposome, and is composed of 333 mM glucose, 1 mM PETG, and a low molecular component of a cell-free protein synthesis system.
  • glucose was added to the external liquid instead of sucrose in order to give a difference in specific gravity between the internal and external liposomes.
  • PETG and the low molecular weight component of the cell-free protein synthesis system leak from the liposome, they were also added to the external solution.
  • the diluent is a diluent used to adjust the concentration before measuring and fractionating the liposomes with a fluorescent cell sorter. 50 mM HEPES-KOH (pH 7.6), 100 mM potassium glutamate, 13 mM Mg (OAc) 2 Consists of
  • the DNA for the next round was prepared in a tube by RT-PCR using the selected RNA as a template.
  • a random mutation was artificially introduced into the ⁇ -glucuronidase gene by GeneMorph II Random Mutagenesis kit (Agilent Technologies).
  • evolution experiments were conducted up to round 44, and cloning and nucleotide sequence analysis were performed.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of nucleotide sequence analysis of the obtained improved ⁇ -glucuronidase.
  • FIG. 6 (a) shows the average value (per clone) of non-synonymous substitutions of the improved ⁇ -glucuronidase (vertical). The axis is the average number of mutations [/ clone], and the horizontal axis is the number of selection steps (number of rounds).
  • FIG. 6 (b) shows the number of enriched non-synonymous substitutions (more than 50% of all clones 6 is a graph showing the number of rich mutations (the vertical axis is the number of rich mutations, the horizontal axis is the number of selection steps (number of rounds)), and FIG. (Ratio of clones having) (vertical axis is rich ratio (% total), horizontal axis is the number of selection steps (round number)).
  • C12 Two particularly active ones were selected and named “C12” and “C24”, respectively.
  • the analyzed base sequence of C12 is shown in SEQ ID NO: 26, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 27, respectively.
  • the 59th aspartic acid (Asp / D) from the N-terminal side is glycine (Gly / G), and the 64th alanine (Ala / A) is valine (Val).
  • the analyzed base sequence of C24 is shown in SEQ ID NO: 28, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 29, respectively.
  • the 59th aspartic acid (Asp / D) from the N-terminal side is asparagine (Asn / N), and the 64th alanine (Ala / A) is valine (Val).
  • ⁇ -glucuronidase synthesis and substrate degradation reaction were carried out using DNA and RNA as starting materials, respectively.
  • DNA of various concentrations ( ⁇ -glucuronidase gene (wild type, C12 or C24) is encoded downstream of the T7 promoter) ⁇ 330 mM sucrose ⁇ 1 ⁇ M Transfer from human serum, Alexa Fluor 647 conjugate (Life Technologies Japan) ⁇ 50 ⁇ M 5- (Pentafluorobenzoylamino) fluorescein di-beta-D-glucuronide (PFB-FDGlcU) (Life Technologies Japan) ⁇ 1 mM Phenylethyl beta-D-thiogalactopyranoside (PETG) ⁇ 5mU / ⁇ L T7 RNA polymerase (Takara Bio) ⁇ Cell-free protein synthesis (PUREsystem) Using the above reaction solution, the following flow reaction (T7 RNA polymerase transcribes mRNA from DNA.
  • T7 RNA polymerase transcribes mRNA from DNA.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of in-tube ⁇ -glucuronidase synthesis reaction (DNA start) for wild type, C12, and C24.
  • FIG. 7 (a) is for 50 pM DNA
  • FIG. 7 (b) is 1000 pM DNA. Shows the case. 7 (a) and (b), the vertical axis represents the green fluorescence intensity, the horizontal axis represents the reaction time (minutes), and from the results shown in FIGS. 7 (a) and (b), C12 and C24 are It can be seen that it has a high activity in a much shorter time.
  • RNA synthesis using various concentrations of RNA DNA for ⁇ -glucuronidase synthesis (wild type, C12 or C24) using T7 RNA polymerase and standard buffer (Takara Bio), using RNeasy Mini Kit (Qiagen) Purified product.
  • RNA DNA for ⁇ -glucuronidase synthesis (wild type, C12 or C24) using T7 RNA polymerase and standard buffer (Takara Bio), using RNeasy Mini Kit (Qiagen) Purified product.
  • RNA DNA for ⁇ -glucuronidase synthesis (wild type, C12 or C24) using T7 RNA polymerase and standard buffer (Takara Bio), using RNeasy Mini Kit (Qiagen) Purified product.
  • ⁇ ⁇ -glucuronidase forms a homotetramer with activity.
  • ⁇ PFB-FDGlcU by ⁇ -glucuronidase. Is decomposed to produce a green fluorescent product (PFBF).
  • PFBF green fluorescent product
  • the green fluorescence intensity (Ex. 492 nm, Em. 516 nm) derived from the reaction product PFB-F is measured by Mx3005P qPCR System (Agilent Technology). did.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of in-tube ⁇ -glucuronidase synthesis reaction (RNA start) for wild type, C12, and C24.
  • FIG. 8 (a) is for 50 pM RNA
  • FIG. 8 (b) is 500 pM RNA.
  • FIG. 8 (c) shows the case of 5000 pM RNA.
  • the vertical axis represents the green fluorescence intensity
  • the horizontal axis represents the reaction time (minutes). From the results shown in FIGS. 8 (a), (b) and (c) It can be seen that C12 and C24 have a higher activity in a much shorter time than the wild type.

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Abstract

　β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列に変異が導入された改良型のβ－グルクロニダーゼであって、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンまたはセリンを有する、改良型のβ－グルクロニダーゼにより、野生型と比較して高い酵素活性を有し、検出が容易な、変異させた改良型の新しいβ－グルクロニダーゼを提供することができる。

Description

改良型β－グルクロニダーゼ
　本発明は、野生型と比較して活性の発現が高速化された改良型のβ－グルクロニダーゼ、ならびに、野生型と比較して酵素分子活性（ｋｃａｔ）が改善された改良型のβ－グルクロニダーゼに関する。
　細胞内などにおいて目的とする遺伝子を発現させて解析するためには、当該遺伝子の転写産物を定量、同定する必要がある。しかしながら、転写産物を直接解析する場合には、ｍＲＮＡを精製し、ハイブリダイゼーションや電気泳動で分析するなどの手間がかかり、また、当該細胞に内在する他のｍＲＮＡと区別する必要もあるため注意深い操作が必要となる。このような場合に有用な手法として、酵素をコードするレポーター遺伝子を用いて、間接的に分析することが知られている。
　β－グルクロニダーゼ遺伝子は、それを有さない植物細胞などにおいて特に有用なレポーター遺伝子として従来から用いられている。β－グルクロニダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合、当該遺伝子からβ－グルクロニダーゼを発現させる。β－グルクロニダーゼは、モノマー（単量体）の状態では活性を示さず、四量体となって初めて活性を示し、その検出が可能となる。そして、β－グルクロニダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合、この四量体の形成プロセスの速度が検出の律速段階となることが知られている。これまでの研究により、β－グルクロニダーゼの活性の発現には、細胞の大きさによっては相当の時間を必要とするという問題点があることが明らかとなっている（たとえば、Ｔ．　Ｍａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，”Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ａｎｄ　β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ　Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，（２０１１），　２８６，　２２０２８（非特許文献１）を参照。）。
特開２０１２－２１０１７０号公報
Ｔ．　Ｍａｔｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ａｎｄ　β－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ　Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ"，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，（２０１１），　２８６，　２２０２８
　たとえば、β－グルクロニダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入した場合、細胞の大きさが異なれば、濃度が劇的に相違してくる。細胞が大きく、遺伝子の局所濃度が低くなってしまう場合には、検出できるまでに時間がかかってしまうという問題がある。これは、細胞のサイズが大きいと、同じ量のβ－グルクロニダーゼの単量体が発現したとしても、その局所濃度が低いために、会合して四量体を形成しにくくなることに起因すると考えられる。
　これまでも、β－グルクロニダーゼについて点変異導入の技術による酵素改変が試みられてきたが、酵素活性が低下してしまうものが殆どであった。
　本発明の目的は、野生型と比較して高い酵素活性を有し、検出が容易な、変異させた改良型の新しいβ－グルクロニダーゼを提供することである。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列に変異が導入されており、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンまたはセリンを有することを特徴とする。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有し、かつ、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５２０番目の位置にロイシンを有することが好ましい。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有し、かつ、前記アミノ酸配列のＮ末端側から４４４番目の位置にアラニンを有することが好ましい。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列を有することが好ましい。
　本発明はまた、上述した改良型のβ－グルクロニダーゼにさらに変異が導入された改良型のβ－グルクロニダーゼであって、以下の（ａ）～（ｄ）の少なくともいずれかを有する、改良型のβ－グルクロニダーゼについても提供する。
　（ａ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から６４番目の位置にバリンを有する、
　（ｂ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から１２３番目の位置にバリンを有する、
　（ｃ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から１４５番目の位置にロイシンを有する、
　（ｄ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から４５１番目の位置にバリンを有する。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、上述した（ａ）～（ｄ）を全て有することが好ましい。
　また本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、配列番号２７または２９のアミノ酸配列を有することが好ましい。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼによれば、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有するものでは、四量体の形成速度が野生型β－グルクロニダーゼと比較して格段に速くなり、より迅速に検出を行うことが可能となる。また、本発明の改良型β－グルクロニダーゼによれば、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有するものでは、蛍光輝度の増幅が速く、野生型と比較して、基質加水分解速度が高い（大きなｋｃａtを有する）ことが分かる。このように本発明の改良型β－グルクロニダーゼでは、酵素活性に関し、それぞれ野生型よりも進化し、高い活性を有し、かつ、検出が容易となった、新たな改良型のβ－グルクロニダーゼが提供される。
本発明の改良型β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を製造するために好適に用いられる、酵素を進化工学的に改良する方法を模式的に示す図である。 試験管内におけるＧＵＳ遺伝子（１００ｐＭ　ＤＮＡ）からの翻訳反応に伴ったＧＵＳ触媒反応（基質加水分解）のタイムコースについて、野生型ＧＵＳと本発明の改良型ＧＵＳ（Ｃ１１０２、Ｃ１１１０）とを比較して示すグラフである。 反応開始後６０分における反応速度について、野生型ＧＵＳと本発明の改良型ＧＵＳ（Ｃ１１０２、Ｃ１１１０）とを比較して示すグラフである。 ｋｔ１、ｋｔ２、ｋ１、ｋ２、ｋｃａｔのそれぞれ意味するところを模式的に示す図である。 実験例１にて実際に作製した、本発明の改良型β－グルクロニダーゼの試験管内におけるβ－グルクロニダーゼ遺伝子からの翻訳反応に伴ったβ－グルクロニダーゼ触媒反応（基質加水分解）のタイムコースについて、改良型β－グルクロニダーゼとしてＣ１１０２、Ｃ１１１０、ｅ３０１、ｅ３０４、ｅ３１４、ｅ３２１の結果を示すグラフである。 得られた改良型β－グルクロニダーゼの塩基配列解析の結果を示すグラフであり、図６（ａ）は、改良型β－グルクロニダーゼの非同義置換の平均値（１クローンあたり）（縦軸は平均変異数［／ｃｌｏｎｅ］、横軸は選択ステップ数（ラウンド数））を示すグラフであり、図６（ｂ）は、濃縮された非同義置換の数（全クローンの５０％以上が共通して持っている変異）（縦軸はリッチな変異の数、横軸は選択ステップ数（ラウンド数））を示すグラフであり、図６（ｃ）は、非同義置換の濃縮率（変異を持つクローンの割合）（縦軸はリッチな割合（％トータル）、横軸は選択ステップ数（ラウンド数））を示すグラフである。 野生型、Ｃ１２、Ｃ２４について、チューブ内β－グルクロニダーゼ合成反応（ＤＮＡスタート）の結果を示すグラフである。 野生型、Ｃ１２、Ｃ２４について、チューブ内β－グルクロニダーゼ合成反応（ＲＮＡスタート）の結果を示すグラフである。
　図１は、本発明の改良型β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を製造するために好適に用いられる、酵素を進化工学的に改良する方法を模式的に示す図である。当該方法は、たとえば特開２０１２－２１０１７０号公報などで本出願人が提案した方法であり、遺伝子ライブラリーと無細胞タンパク質合成系（無細胞転写翻訳システム）を封入したリポソームと、セルソーターを用いる。詳細は実験例で後述するが、当該方法では、まず、目的の酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に、公知の遺伝子工学手法を用いてランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーを作製し、遺伝子型と表現型を１対１対応させるために１分子の遺伝子と、無細胞タンパク質合成系とを人工脂質二分子膜小胞であるリポソームに封入する。遺伝子がＤＮＡであればＲＮＡに転写した後に、遺伝子がＲＮＡであればそのまま、リポソーム内で遺伝子を発現させる。その際、たとえば基質と発現させた酵素とを反応させ、酵素の活性を評価する。次に、蛍光セルソーターを用い、酵素の活性を定量的に評価し、より活性の高い酵素を含むリポソームを選択する。選択されたリポソームに含まれる酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を取り出し、公知の遺伝子工学手法により、さらに変異を導入し、増幅して遺伝子ライブラリーを作製する。これを１つのラウンドとし、この遺伝子ライブラリーをまた無細胞タンパク質合成系と共にリポソームに封入して発現させ、ラウンドを重ねるようにする。これによって、ラウンドを重ねるごとに、高い活性を有する、いわば改良型の酵素を作製することができる。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、目的の酵素をβ－グルクロニダーゼとし、これをコードする遺伝子を用いて上述した手法に用いて、作製されたものである。ここで、野生型のβ－グルクロニダーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ＿ＧＵＳ）の塩基配列を配列番号１に、当該ＤＮＡから発現された野生型のβ－グルクロニダーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。このような野生型のβ－グルクロニダーゼ遺伝子に、公知の適宜の点変異導入法（たとえば、エラープローンＰＣＲ法）によりランダムに変異を導入したＤＮＡライブラリーを作製する。具体的には、野生型のβ－グルクロニダーゼをコードするプラスミドＤＮＡから、Ｔ７プロモータ配列とβ－グルクロニダーゼをコードする領域を含むＤＮＡ断片（ｇｕｓ＿ｗｔ）を、プライマー（１）、（２）（塩基配列を配列番号３、４にそれぞれ示す）およびＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ（たとえば３０サイクル）を作製し、このｇｕｓ＿ｗｔを鋳型として、同じプライマー（１）、（２）を用い、たとえばランダム変異導入用のＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｍｕｔａｚｙｍｅ　ＩＩ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、アジレント・テクノロジーズ）を用いたエラープローンＰＣＲ法によりランダムに変異を導入したＤＮＡライブラリーを作製することができる。
　その後、変異を導入したＤＮＡと無細胞タンパク質合成系を含むタンパク質合成用反応液を調製して、リポソームに封入する。無細胞タンパク質合成系としては、市販されているものを特に制限なく用いることができ、好適な例としてＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍ（ジーンフロンティア）を挙げることができる。またリポソームとしては、Ｗ／Ｏエマルションを油水界面通過させることによる公知の手法で作製した単層膜リポソームを好適に用いることができる。変異を導入したＤＮＡと無細胞タンパク質合成系を封入したリポソームをインキュベートすることで、リポソーム内で変異が導入されたβ－グルクロニダーゼを発現させる。活性を有するβ－グルクロニダーゼ（活性型β－グルクロニダーゼ）が発現されたか否かは、たとえば、５－（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵ）を基質とし、その酵素反応生成物（ＰＦＢ－Ｆ）の緑色蛍光をセルソーターにより検出することで確認できる。
　次に、活性型β－グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ（活性型ＧＵＳ遺伝子）を含むリポソームを、緑色蛍光を指標としてセルソーターにより回収する。回収したリポソームから、封入されているＤＮＡを抽出する。このリポソームからのＤＮＡの抽出には、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いることができる。抽出したＤＮＡを、上述したプライマー（１）、（２）およびＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲにより増幅し、アガロースゲル電気泳動により目的の長さのＤＮＡだけを回収し、精製する。精製したＤＮＡに、また、変異を導入し、無細胞タンパク質合成系と共にリポソームに封入し、活性型のβ－グルクロニダーゼを検出し、当該活性型のβ－グルクロニダーゼをコードするＤＮＡをリポソームから回収する、というラウンドを重ね、進化させる。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼは、β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列に変異が導入された改良型のβ－グルクロニダーゼであって、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンまたはセリンを有することを特徴とする。野生型のβ－グルクロニダーゼでは、Ｎ末端側から５６１番目にはロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）を有するが、本発明の改良型β－グルクロニダーゼでは、このロイシンがメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）またはセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）に置き換わっている。興味深いことに、この５６１番目にメチオニン、セリンのいずれを有するかによって、当該改良型β－グルクロニダーゼが奏する効果が異なる。
　図２は、後述する実験例１にて実際に作製した、本発明の改良型β－グルクロニダーゼの試験管内におけるβ－グルクロニダーゼ遺伝子からの翻訳反応に伴ったβ－グルクロニダーゼ触媒反応（基質加水分解）のタイムコースについて、野生型β－グルクロニダーゼと比較して示す図である。図３は、反応開始後６０分における反応速度について、野生型β－グルクロニダーゼと本発明の改良型β－グルクロニダーゼとを比較して示すグラフである。図２、３から明らかなように、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有する改良型β－グルクロニダーゼであるＣ１１０２（塩基配列を配列番号９、アミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す）、Ｃ１１１０（塩基配列を配列番号１１、アミノ酸配列を配列番号１２にそれぞれ示す）は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して格段に速く触媒活性を発現する（２０分以上速く触媒活性を観測できる）ことが分かる。これは、改良型β－グルクロニダーゼにおいては、四量体の形成速度が野生型β－グルクロニダーゼと比較して格段に速くなっているためであると考えられる。
　また図５は、後述する実験例１にて実際に作製した、本発明の改良型β－グルクロニダーゼの試験管内におけるβ－グルクロニダーゼ遺伝子からの翻訳反応に伴ったβ－グルクロニダーゼ触媒反応（基質加水分解）のタイムコースについて、改良型β－グルクロニダーゼとしてＣ１１０２、Ｃ１１１０だけでなく、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する改良型β－グルクロニダーゼ（ｅ３０１（塩基配列を配列番号１３、アミノ酸配列を配列番号１４にそれぞれ示す）、ｅ３０４（塩基配列を配列番号１５、アミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す）、ｅ３１４（塩基配列を配列番号１７、アミノ酸配列を配列番号１８にそれぞれ示す）、ｅ３２１（塩基配列を配列番号１９、アミノ酸配列を配列番号２０にそれぞれ示す））も併せて示している。図５に示す結果から、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する改良型β－グルクロニダーゼであるｅ３０１、ｅ３０４、ｅ３１４、ｅ３２１は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、タイムコースの傾きが大きく、蛍光輝度の増幅が速い（反応開始からの立ち上がりが早い）ことが分かる。すなわち、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する改良型β－グルクロニダーゼは、野生型と比較して、基質加水分解速度が高い（大きなｋｃａtを有する）ことが分かる。
　このように本発明では、酵素活性に関し、それぞれ野生型よりも進化し、高い活性を有し、かつ、検出が容易となった、新たな改良型のβ－グルクロニダーゼが提供される。
　本発明の改良型β－グルクロニダーゼにおいて、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有する場合、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５２０番目の位置にロイシンを有することが、好ましい。具体的には、配列番号１０または１２に示すアミノ酸配列を有する（すなわち、上述したＣ１１０２、Ｃ１１１０）ことが特に好ましい。
　また本発明の改良型β－グルクロニダーゼにおいて、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する場合、前記アミノ酸配列のＮ末端側から４４４番目の位置にアラニンを有することが、好ましい。具体的には、配列番号１４または２０に示すアミノ酸配列を有する（すなわち、上述したｅ３０１、ｅ３２１）であることが特に好ましい。また、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する場合の他の好ましい具体例として、配列番号１６または１８に示すアミノ酸配列を有する（すなわち、上述したｅ３０４、ｅ３１４）場合も挙げられる。
　本発明は、さらに、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有する場合のβ－グルクロニダーゼについて、上述したラウンドを重ね、さらに進化させたβ－グルクロニダーゼについても提供する。実験例２にて詳細は述べるが、さらに進化された本発明のβ－グルクロニダーゼは、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有し、かつ、５２０番目の位置にロイシンを有することに加え、以下の（ａ）～（ｄ）の少なくともいずれかを有する。このような改良型のβ－グルクロニダーゼは、野生型では酵素活性の検出が困難となる５０ｐＭ程度のＤＮＡ濃度でも、活性を検出することができるなど、一層格段に優れた高い酵素活性を示す。
　（ａ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から６４番目の位置にバリンを有する、
　（ｂ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から１２３番目の位置にバリンを有する、
　（ｃ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から１４５番目の位置にロイシンを有する、
　（ｄ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から４５１番目の位置にバリンを有する。
　このような本発明の改良型のβ－グルクロニダーゼは、後述する実験例２で得られたＣ１２、Ｃ２４のように、上記（ａ）～（ｄ）の全てを兼ね備えていることが好ましく、配列番号２７または配列番号２９に示すアミノ酸配列を有していることが、特に好ましい。
　＜実験例１＞
　（１）活性型β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子のスクリーニング
　（１－１）遺伝子ライブラリーの作製
　遺伝子スクリーニング実験に用いるためのＧＵＳ遺伝子のランダム変異体ライブラリ（ｍｔ＿ｇｕｓ）をエラープローンＰＣＲにより作製した。まず、野生型β－グルクロニダーゼ（塩基配列を配列番号１に示す）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ＿ｇｕｓ）より、Ｔ７プロモーター配列とβ－グルクロニダーゼをコードする領域を含むＤＮＡ断片（ｇｕｓ＿ｗｔ）をＰＣＲ（３０サイクル、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡）、プライマー（１）（ＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡ：配列番号３）およびプライマー（２）（ＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴ：配列番号４））により作製した。ｇｕｓ＿ｗｔをテンプレートにプライマー（１）とプライマー（２）を用いてランダム変異導入用のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｕｔａｚｙｍｅ　ＩＩ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、アジレント・テクノロジーズ）により変異を導入したβ－グルクロニダーゼ遺伝子を作製した。
　（１－２）タンパク質合成用反応液の調製
　β－グルクロニダーゼを遺伝子より合成するために、無細胞タンパク質合成系（ＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍ：発明者により調製）とｍｔ＿ｇｕｓを含む反応溶液を調製した。調製に必要な試薬および調製中の溶液、調製後の反応液は氷上で保存した。反応液の組成を表１に示す。主な試薬としては、ＲＮａｓｅインヒビター（プロメガ）、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、トランスフェリンアレクサ６４７（ライフテクノロジーズジャパン（旧インビトロジェン））、ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵ（５－（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）（ライフテクノロジーズジャパン（旧インビトロジェン））を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＊：反応液中のＤＮＡ濃度は８ｐＭ（８０ｆＬ領域からリポソームを回収するスクリーニングの場合）または１００ｐＭ（１ｆＬ領域からリポソームを回収するスクリーニングの場合）とした。
　＊＊：ＳｏｌＡおよびＳｏｌＢの組成は既報（Ｈｏｓｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｇｍｕｉｒ，　２００８に記載された「ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｂｌｅ　Ｓ１）」）に従った。
　（１－３）単層膜リポソームの作製
　Ｗ／Ｏエマルションを油水界面通過させることにより単層膜リポソームを作製した。
　まず、リン脂質（ＰＯＰＣ：１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、アヴァンティポーラーリピッド）とコレステロール（ナカライテスク）の流動パラフィン溶液（５ｍｇ／ｍＬ、重量比９：１）を調製した。脂質溶液にタンパク質合成用反応液を５ｖｏｌ％の割合で添加し、ボルテックスミキサーで激しく撹拌することでＷ／Ｏエマルションを作製した。Ｗ／Ｏエマルションをリポソーム外液用緩衝液に重層化し、これを１８０００×ｇで遠心する（遠心中は４℃に冷却）ことでリポソーム分散液を得た。遺伝子選択における目的遺伝子の濃縮効率を上げるために、この分散液１００μＬ当たりＤＮａｓｅ　Ｉ（ＲＮａｓｅフリー、タカラバイオ）２．５μＬ（１２．５ｕｎｉｔｓ）添加することでリポソーム外に存在するＤＮＡを分解した。
　（１－４）リポソーム内におけるβ－グルクロニダーゼの合成と酵素活性の評価
　β－グルクロニダーゼ遺伝子とＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍを内封するリポソームを３７℃でインキュベーションし、β－グルクロニダーゼ遺伝子の発現（β－グルクロニダーゼ合成と活性発現）を行った。β－グルクロニダーゼの合成の確認は５－（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵ）を基質とし、その酵素反応生成物（ＰＦＢ－Ｆ）の緑色蛍光をセルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ：ＢＤ）により検出した。
　（１－５）活性型β－グルクロニダーゼ遺伝子を含むリポソームの回収
　活性型β－グルクロニダーゼ遺伝子を含むリポソームを、緑色蛍光を指標としてセルソーターにより回収した。活性型β－グルクロニダーゼを発現しているリポソームを選択的に回収するために、セルソーターにおける二次元ドットプロット（横軸：酵素活性の発現により生じる反応産物（ＰＦＢ－Ｆ）の蛍光強度、縦軸：リポソーム内に封入したトランスフェリンアレクサ６４７由来の蛍光強度（リポソームのサイズに換算した））において、回収対象となるリポソームの分布を２箇所（８０ｆＬ領域と１ｆＬ領域）設定した。８０ｆＬ領域は反応産物の蛍光強度＞１０００かつリポソームサイズが５０ｆＬ～２５０ｆＬの領域に設定した。１ｆＬ領域は反応産物の蛍光強度＞１０００かつリポソームサイズが０．５ｆＬ～２ｆＬの領域に設定した。なお、リポソーム当たりの封入遺伝子が１分子程度になるように封入時のＤＮＡ濃度を８ｐＭ（８０ｆＬサイズを対象）および１００ｐＭ（１ｆＬサイズを対象）としたため、８０ｆＬ領域からのリポソームの回収と１ｆＬ領域からのリポソームの回収は独立に行なった。
　（１－６）リポソームからのβ－グルクロニダーゼ遺伝子の回収
　ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収したリポソームよりＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをＰＣＲ（３０サイクル、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡）、上記プライマー（１）および上記プライマー（２））で増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＥ－Ｇｅｌ　Ｃｌｏｎｅ　Ｗｅｌｌ（０．８％　アガロースゲル、ライフテクノロジーズジャパン（旧インビトロジェン））を用いて電気泳動し、目的の長さのＤＮＡ断片だけを回収・精製し、２回目の増幅（２０サイクル、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡））に供した。得られたＤＮＡ断片を次の遺伝子選択実験に供した。
　（２）スクリーニング実験で得られた改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子のクローニング、シーケンス解析
　（２－１）改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子のクローニング
　遺伝子選択実験を１１回繰り返すことで、活性型β－グルクロニダーゼ変異体を濃縮し（進化させ）、得られた改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子のクローニングを行なった。１１回目の選択実験で得られた遺伝子プール（精製および増幅済み）をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ法（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ、クローンテック）により、ＤｐｎＩ処理したベクター（ｐＥＴ＿ｇｕｓＡをテンプレートにしてベクターを作製）に挿入し、改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡを作製した。このプラスミドＤＮＡをコンピテントセル（ＸＬ　１０－Ｇｏｌｄ　Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ、ストラタジーン）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ　Ａｇａｒプレート上で培養した後、コロニーを回収した。ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用いて回収したコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出した。回収したプラスミドＤＮＡにおける目的遺伝子の導入は制限酵素（ＮｏｔＩ、ＢｇｌＩＩ）処理後にアガロース電気泳動で確認した。
　（２－２）改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子のシーケンス解析
　４種類のシーケンス用のプライマー（３－１）（ＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ：配列番号５）、プライマー（３－２）（ＴＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧ：配列番号６）、プライマー（３－３）（ＡＴＴＣＧＡＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧ：配列番号７）、プライマー（３－４）（ＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣ：配列番号８）を用い、Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子（プラスミドＤＮＡ）の塩基配列を解読した。
　上述した８０ｆＬサイズのリポソームを反応場とする選択実験で得られた中で、特に高い活性を示した２つの改良型β－グルクロニダーゼ（それぞれ「Ｃ１１０２」、「Ｃ１１１０」と名付けた）を選択した。
　Ｃ１１０２では、野生型のβ－グルクロニダーゼ遺伝子から、５’側から９７番目のＣがＴに、７５４番目のＣがＴに、７６０番目のＧがＴに、１５５８番目のＡがＴに、１６８１番目のＴがＡに変わっていた（塩基配列を配列番号９に示す）。このＣ１１０２を発現させた改良型β－グルクロニダーゼのアミノ酸配列は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、Ｎ末端側から３３番目のアルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）がシステイン（Ｃｙｓ／Ｃ）に、２５４番目のバリン（Ｖａｌ／Ｖ）がフェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ）に、５２０番目のメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）がロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）に変わっていた（アミノ酸配列を配列番号１０に示す）。
　Ｃ１１１０では、野生型のβ－グルクロニダーゼ遺伝子から、５’側から３０番目のＴがＣに、６５４番目のＴがＣに、１０５０番目のＴがＣに、１５５８番目のＡがＴに、１６８１番目のＴがＡに変わっていた（塩基配列を配列番号１１に示す）。このＣ１１１０を発現させた改良型β－グルクロニダーゼのアミノ酸配列は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、Ｎ末端側から５２０番目のメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）がロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）に変わっていた（アミノ酸配列を配列番号１２に示す）。
　また上述した１ｆＬサイズのリポソームを反応場とする選択実験で得られた中で、特に高い活性を示した４つの改良型β－グルクロニダーゼ（それぞれ「ｅ３０１」、「ｅ３０４」、「ｅ３１４」、「ｅ３２１」と名付けた）を選択した。
　ｅ３０１では、野生型のβ－グルクロニダーゼ遺伝子から、５’側から１１３番目のＣがＴに、６６３番目のＡがＴに、１１３３番目のＡがＧに、１３２８番目のＧがＡに、１３３１番目のＴがＣに、１４５８番目のＡがＧに、１５５１番目のＣがＴに、１６８２番目のＴがＣに、１６８６番目のＣがＴに変わっていた（塩基配列を配列番号１３に示す）。このｅ３０１を発現させた改良型β－グルクロニダーゼのアミノ酸配列は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、Ｎ末端側から３８番目のアラニン（Ａｌａ／Ａ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、２２１番目のグルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）がヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）に、３７８番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）がグリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）に、４４３番目のシステイン（Ｃｙｓ／Ｃ）がチロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）に、４４４番目のバリン（Ｖａｌ／Ｖ）がアラニン（Ａｌａ／Ａ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）に変わっていた（アミノ酸配列を配列番号１４に示す）。
　ｅ３０４では、野生型のβ－グルクロニダーゼ遺伝子から、５’側から１５６番目のＣがＴに、５７９番目のＣがＴに、７０５番目のＡがＧに、１１０９番目のＡがＧに、１３５２番目のＣがＴに、１３５９番目のＣがＡに、１４２５番目のＣがＴに、１５３０番目のＡがＧに、１６８２番目のＴがＣに変わっていた（塩基配列を配列番号１５に示す）。このｅ３０４を発現させた改良型β－グルクロニダーゼのアミノ酸配列は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、Ｎ末端側から３７０番目のリシン（Ｌｙｓ／Ｋ）がアルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）に、４５１番目のアラニン（Ａｌａ／Ａ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）に変わっていた（アミノ酸配列を配列番号１６に示す）。
　ｅ３１４では、野生型のβ－グルクロニダーゼ遺伝子から、５’側から１７４番目のＡがＴに、６１９番目のＧがＡに、６７６番目のＡがＴに、７５６番目のＧがＣに、１３１７番目のＴがＡに、１５２５番目のＡがＧに、１６８２番目のＴがＣに、１８００番目のＡがＧに変わっていた（塩基配列を配列番号１７に示す）。このｅ３１４を発現させた改良型β－グルクロニダーゼのアミノ酸配列は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、Ｎ末端側から２０７番目のバリン（Ｖａｌ／Ｖ）がメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）に、２２６番目のトレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）がセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）に、５０９番目のトレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）がアラニン（Ａｌａ／Ａ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）に変わっていた（アミノ酸配列を配列番号１８に示す）。
　ｅ３２１では、野生型のβ－グルクロニダーゼ遺伝子から、５’側から１２６番目のＣがＴに、６６０番目のＴがＡに、１０８７番目のＡがＧに、１１６５番目のＴがＣに、１２５４番目のＧがＡに、１３３１番目のＴがＣに、１６８２番目のＴがＣに、１７３４番目のＧがＡに変わっていた（塩基配列を配列番号１９に示す）。このｅ３２１を発現させた改良型β－グルクロニダーゼのアミノ酸配列は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、Ｎ末端側から２２０番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）に、３６３番目のイソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、４４４番目のバリン（Ｖａｌ／Ｖ）がアラニン（Ａｌａ／Ａ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）に変わっていた（アミノ酸配列を配列番号２０に示す）。
　（３）クローン化改良型β－グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ断片の作製と改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子の活性測定
　（３－１）クローン化改良型β－グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ断片の作製
　クローン化改良型β－グルクロニダーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（上述のＣ１１０２、Ｃ１１１０、ｅ３０１、ｅ３０４、ｅ３１４、ｅ３２１）より、Ｔ７プロモーター配列とβ－グルクロニダーゼをコードする領域を含むＤＮＡ断片（ｇｕｓ＿ｗｔ）をＰＣＲ（３０サイクル、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡）、プライマー（１）（配列番号３）およびプライマー（２）（配列番号４））により作製した。
　（３－２）改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子を用いたβ－グルクロニダーゼ活性の測定
　下記表２に示す反応液組成を用い、改良型β－グルクロニダーゼをコードするＤＮＡ断片からのβ－グルクロニダーゼ活性の発現を測定した。各改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子を含む反応液２０μＬを測定用のチューブに分注し、これをリアルタイムＰＣＲ機（Ｍｘ３００５Ｐ、アジレント・テクノロジー）に設置し、３７℃でインキュベートしながら基質分解に伴う蛍光強度の時間変化を記録した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＊＊：ＳｏｌＡおよびＳｏｌＢの組成は既報（Ｈｏｓｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｌａｎｇｍｕｉｒ，　２００８に記載された「ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｂｌｅ　Ｓ１）」）に従った。
　（４）クローン化改良型β－グルクロニダーゼの精製酵素の作製と精製酵素を用いた速度論パラメータの評価
　（４－１）改良型β－グルクロニダーゼへのヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）の付与
　改良型β－グルクロニダーゼの精製酵素を作製するために必要なＨｉｓ－ｔａｇ配列（（Ｈｉｓ）６）（ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＧ：配列番号２１）をクローン化改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子のＣ末端に導入した。まず、クローン化改良型β－グルクロニダーゼをコードするプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、Ｔ７プロモーター配列とβ－グルクロニダーゼをコードする領域を含むＤＮＡ断片をプライマー（４）（ＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ：配列番号２２）およびプライマー（５）（ＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＴ：配列番号２３）を用いてＰＣＲ反応（３０サイクル、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡））することでＨｉｓ－ｔａｇ付き改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子断片を作製した。この遺伝子断片をＥ－Ｇｅｌ　Ｃｌｏｎｅ　Ｗｅｌｌ（０．８％アガロースゲル、ライフテクノロジーズジャパン（旧インビトロジェン））を用いて電気泳動し、目的の長さのＤＮＡ断片だけを回収・精製した後、ＰＣＲにより遺伝子断片を増幅（２０サイクル、ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ　ＦＸ（東洋紡））した。
　Ｈｉｓ－ｔａｇ付き改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子断片をＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ法（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ、クローンテック）により、ＤｐｎＩ処理したベクター（ｐＥＴ＿ｇｕｓＡをテンプレートにしてベクターを作製）に挿入し、Ｈｉｓ－ｔａｇ付き遺伝子を導入したプラスミドＤＮＡを作製した。このプラスミドＤＮＡをコンピテントセル（ＸＬ　１０－Ｇｏｌｄ　Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ、ストラタジーン）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ　Ａｇａｒプレート上で培養した後、コロニーを回収した。ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用いて回収したコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡについて、上述した４種類のシーケンスプライマー（３－１）（配列番号５）、プライマー（３－２）（配列番号６）、プライマー（３－３）（配列番号７）、プライマー（３－４）（配列番号８）を用い、Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により塩基配列を解読し、Ｈｉｓ－ｔａｇ付き改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子の導入を確認した。
　（４－２）Ｈｉｓ－ｔａｇ付き改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子を用いた改良型β－グルクロニダーゼ精製酵素の作製
　ＯＤ０．４まで培養したＨｉｓ－ｔａｇ付き改良型β－グルクロニダーゼ遺伝子（プラスミド）を持つ大腸菌を含む培養液２Ｌに対してＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加え、６時間培養した大腸菌２９．１ｇにＡバッファを２ｖｏｌとガラスビーズを菌体＋Ａバッファを合計した分を加えてマルチビーズショッカーで菌体破砕を行った。８０００ｒｐｍで１５分間遠心してガラスビーズを除去し、さらに１４０００ｒｐｍで３０分間遠心を行った。遠心の後、上清を回収し、その上清を０．４５μｍのフィルターでろ過後５％　Ｂバッファを含むＡバッファで平衡化したＨｉｓ　Ｔｒａｐ　ＨＰカラム　５ｍＬ×２本×４セットに手動でアプライした。濃度勾配は以下の通りとした。
　（濃度勾配）
　・条件：　０分　　　　６０分
　　％Ｂ　　５％　　　　６８％
　・流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
　また、ＡバッファおよびＢバッファの組成は以下のとおりとした。
　（Ａバッファ（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　　　　１Ｍ　ＮＨ４Ｃｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　（Ｂバッファ（ｐＨ７．６、ろ過後））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　５００ｍＭ　イミダゾール
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　溶出したフラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥで目的物を含むフラクションを集め、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行った。濃縮を行ったサンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過後、ゲルろ過バッファで平衡化したＨｉＬｏａｄ　１６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｇカラムにかけ、ゲルろ過を行った。ゲルろ過に用いたバッファ組成を以下に示す。
　（ゲルろ過バッファ（ｐＨ７．６））
　　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）
　１００ｍＭ　ＫＣｌ
　　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
　　　７ｍＭ　２－メルカプトエタノール
　ゲルろ過溶出画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより目的フラクションを確認後、分子量１００００カットの遠心濃縮器により濃縮を行い、改良型β－グルクロニダーゼ精製酵素を得た。
　（４－３）改良型β－グルクロニダーゼ精製酵素の速度論パラメータの評価
　下記表３に示す反応液組成を用い、作製した改良型β－グルクロニダーゼ精製酵素の速度論パラメータを評価した。酵素濃度を７．５ｎＭにした時の反応初速度を基質濃度が０．１μＭ～１０μＭの間で測定した。各改良型β－グルクロニダーゼ精製酵素を含む反応液２０μＬを測定用のチューブに分注し、これをリアルタイムＰＣＲ機（Ｍｘ３００５Ｐ、アジレント・テクノロジー）に設置し、３７℃でインキュベートしながら基質分解に伴う蛍光強度の時間変化を記録した。蛍光強度の時間変化より、各基質濃度に対する反応初速度を求めた。基質濃度と反応初速度の関係をＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎの式を用いてフィッティングすることにより、野生型β－グルクロニダーゼと改良型β－グルクロニダーゼ（Ｃ１１０２、Ｃ１１１０）のｋｃａｔおよびＫｍを評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図２は、試験管内におけるβ－グルクロニダーゼ遺伝子（１００ｐＭ　ＤＮＡ）からの翻訳反応に伴ったβ－グルクロニダーゼ触媒反応（基質加水分解）のタイムコースについて、野生型β－グルクロニダーゼと本発明の改良型β－グルクロニダーゼ（Ｃ１１０２、Ｃ１１１０）とを比較して示すグラフであり、縦軸は反応産物量（蛍光強度）（単位は任意）、横軸は反応時間（分）である。また、図３は、反応開始後６０分における反応速度について、野生型β－グルクロニダーゼと本発明の改良型β－グルクロニダーゼ（Ｃ１１０２、Ｃ１１１０）とを比較して示すグラフであり、縦軸は基質加水分解速度（規格化後）である。また、表４、５は、野生型β－グルクロニダーゼと改良型β－グルクロニダーゼ（Ｃ１１０２、Ｃ１１１０）の特性パラメータ（ｋｃａｔ、Ｋｍ）を比較して示しており、表４は、ＴＧ－ｂＧｌｃＵ（ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ－βＧｌｃＵ（Ｎａ）、積水メディカル）を基質に用いて評価した場合、表５は、ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵを基質に用いて評価した場合の結果を示している。また表６は、野生型β－グルクロニダーゼと本発明の改良型β－グルクロニダーゼ（Ｃ１１０２、Ｃ１１１０）について、ｋｔ１ｋｔ２（ＤＮＡからβ－グルクロニダーゼが合成される速度）、ｋ１ ２ｋ２（四量体形成速度）、ｋｃａｔ（酵素活性）を比較して示している。また図４に、ｋｔ１、ｋｔ２、ｋ１、ｋ２、ｋｃａｔのそれぞれ意味するところを模式的に示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図２、３および表４～６から明らかなように、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有する改良型β－グルクロニダーゼであるＣ１１０２、Ｃ１１１０は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して格段に速く触媒活性を発現する（２０分以上速く触媒活性を観測できる）ことが分かる。これは、改良型β－グルクロニダーゼにおいては、四量体の形成速度が野生型β－グルクロニダーゼと比較して格段に（表６に示すように少なくともＣ１１１０については、ｋ１ ２ｋ２（四量体形成速度）で約１０倍）速くなっているためであると考えられる。
　また図５は、試験管内におけるβ－グルクロニダーゼ遺伝子（１００ｐＭ　ＤＮＡ）からの翻訳反応に伴ったβ－グルクロニダーゼ触媒反応（基質加水分解）のタイムコースについて、改良型β－グルクロニダーゼとしてＣ１１０２、Ｃ１１１０だけでなく、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する改良型β－グルクロニダーゼ（ｅ３０１、ｅ３０４、ｅ３１４、ｅ３２１）も併せて示している。図５に示す結果から、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する改良型β－グルクロニダーゼであるｅ３０１、ｅ３０４、ｅ３１４、ｅ３２１は、野生型β－グルクロニダーゼと比較して、タイムコースの傾きが大きく、蛍光輝度の増幅が速い（反応開始からの立ち上がりが早い）ことが分かる。すなわち、アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有する改良型β－グルクロニダーゼは、野生型と比較して、基質加水分解速度が高い（大きなｋｃａtを有する）ことが分かった。
　＜実験例２＞
　微小反応場としてリポソームを用い、改良型β－グルクロニダーゼの創出を行なった。まず、１０ｍｇの脂質（ＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝９：１（質量比））に、１００μＬのクロロホルムを添加してよく混ぜた。次に、２ｍＬの流動パラフィンを添加してよく混ぜた。８０℃で３０分間温めてクロロホルムを揮発させ、なるべく溶媒から除去した。内封液、外液、希釈液を氷上で調製した。ここで、内封液は、リポソームの内部に封入する反応液であり、その組成は以下のとおりである。
　・各種濃度のＤＮＡ（Ｔ７プロモーター下流にβ－グルクロニダーゼ遺伝子がコードされている：本実験に用いた野生型のβ－グルクロニダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２４に、アミノ酸配列を配列番号２５示す。）
　・３３０ｍＭ　スクロース
　・１μＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ，　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ライフテクノロジーズジャパン）
　・５０μＭ　５－（Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（「ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵ」と略す）（ライフテクノロジーズジャパン）
　・１ｍＭ　Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ　ｂｅｔａ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＰＥＴＧ）
　・５ｍＵ／μＬ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）
　・無細胞タンパク質合成系（ＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍ）
　なお、上記ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵは、β－グルクロニダーゼ合成を緑色蛍光として検出するための試薬であり、β－グルクロニダーゼに分解されると緑色蛍光産物であるＰＦＢ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（「ＰＦＢ－Ｆ」と略す）を生じる。また、無細胞タンパク質合成系（ＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍ）の詳細な組成は、Ｋｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｅｌｆ－ｅｎｃｏｄｅｄ　ｒｅｐｌｉｃａｓｅ　ｉｎ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，　Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，　９（１５），　２４０３－２４１０（２００８）を参照。
　また、外液は、リポソーム内β－グルクロニダーゼ合成の際に、リポソームの外部に存在する溶液であり、３３３ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ　ＰＥＴＧ、無細胞タンパク質合成系の低分子成分から構成される。なお、本実験例で用いた外液では、リポソームの内外比重差を付けるために、外液にはＳｕｃｒｏｓｅではなくＧｌｕｃｏｓｅを添加した。また、ＰＥＴＧ、無細胞タンパク質合成系の低分子成分については、リポソーム内から漏洩するため、外液にも添加した。また、希釈液は、蛍光セルソーターでリポソームを測定・分取する前に、濃度調節のために用いる希釈液であり、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ、１３ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２から構成される。
　４００μＬの流動パラフィン（脂質含有）に２０μＬの内封液を添加した。ボルテックスで良く混合することでＷ／Ｏエマルションを作製した。次に、１５０μＬの外液を入れたチューブに、上記のＷ／Ｏエマルションを全量重層した。４℃、１８０００×ｇで３０分間遠心を行い、リポソームを作製した。チューブの底に針を刺してリポソームを回収した。０．１ｍｇ／ｍＬになるようＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をリポソーム溶液に添加した。３７℃で３時間反応を行った後、反応後のリポソーム液を希釈液で約２０倍希釈し、蛍光セルソーターであるＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定し、緑色蛍光の高いリポソームを分取した。分取したリポソームから、ＲＮｅａｓｙ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｃｌｅａｎｕｐ　ｋｉｔ（キアゲン）によりＲＮＡを回収した。
　選択されたＲＮＡを鋳型として、ＲＴ－ＰＣＲによりチューブ内で次のラウンド用のＤＮＡを調製した。ラウンド１０およびラウンド３４の終了後に、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ　ＩＩ　Ｒａｎｄｏｍ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（アジレント・テクノロジーズ）により、β－グルクロニダーゼ遺伝子に人為的にランダム変異を導入した。最終的には、ラウンド４４まで進化実験を行い、クローニングおよび塩基配列解析を行った。
　図６は、得られた改良型β－グルクロニダーゼの塩基配列解析の結果を示すグラフであり、図６（ａ）は、改良型β－グルクロニダーゼの非同義置換の平均値（１クローンあたり）（縦軸は平均変異数［／ｃｌｏｎｅ］、横軸は選択ステップ数（ラウンド数））を示すグラフであり、図６（ｂ）は、濃縮された非同義置換の数（全クローンの５０％以上が共通して持っている変異）（縦軸はリッチな変異の数、横軸は選択ステップ数（ラウンド数））を示すグラフであり、図６（ｃ）は、非同義置換の濃縮率（変異を持つクローンの割合）（縦軸はリッチな割合（％トータル）、横軸は選択ステップ数（ラウンド数））を示すグラフである。
　特に活性の高いものを２つ選択し、「Ｃ１２」、「Ｃ２４」とそれぞれ名付けた。Ｃ１２の解析された塩基配列を配列番号２６に、アミノ酸配列を配列番号２７にそれぞれ示す。Ｃ１２では、野生型のβ－グルクロニダーゼのアミノ酸配列において、Ｎ末端側から５９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）がグリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）に、６４番目のアラニン（Ａｌａ／Ａ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、１２３番目のイソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、１４５番目のプロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）がロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）に、２１５番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）がリシン（Ｌｙｓ／Ｋ）に、２７７番目のリシン（Ｌｙｓ／Ｋ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）に、４３１番目のアラニン（Ａｌａ／Ａ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、４５１番目のアラニン（Ａｌａ／Ａ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、５２０番目のメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）がロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）に、６０２番目のリシン（Ｌｙｓ／Ｋ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）に置き換わっていた。
　また、Ｃ２４の解析された塩基配列を配列番号２８に、アミノ酸配列を配列番号２９にそれぞれ示す。Ｃ２４では、野生型のβ－グルクロニダーゼのアミノ酸配列において、Ｎ末端側から５９番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）がアスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）に、６４番目のアラニン（Ａｌａ／Ａ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、１２３番目のイソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、１４５番目のプロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）がロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）に、２０１番目のセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）がチロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）に、２１３番目のセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）がアスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）に、２１５番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）がリシン（Ｌｙｓ／Ｋ）に、２７７番目のリシン（Ｌｙｓ／Ｋ）がグルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）に、４５１番目のアラニン（Ａｌａ／Ａ）がバリン（Ｖａｌ／Ｖ）に、５２０番目のメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）がロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）に、５３５番目のアルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）がセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）に、５６１番目のロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）がメチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）に置き換わっていた。
　以下の手順で、それぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡを出発物質とした場合のβ－グルクロニダーゼ合成及び基質分解反応（変異体の活性測定）を行なった。
　（ＤＮＡスタートの場合）
　氷上で以下の組成からなる反応液を調製した。
　・各種濃度のＤＮＡ（Ｔ７プロモーター下流にβ－グルクロニダーゼ遺伝子（野生型、Ｃ１２またはＣ２４）がコードされている。）
　・３３０ｍＭ　スクロース
　・１μＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ，　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ライフテクノロジーズジャパン）
　・５０μＭ　５－（Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵ）（ライフテクノロジーズジャパン）
　・１ｍＭ　Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ　ｂｅｔａ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＰＥＴＧ）
　・５ｍＵ／μＬ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）
　・無細胞タンパク質合成（ＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍ）
　上記反応液を用いて、以下の流れの反応（Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡからｍＲＮＡが転写される。→ｍＲＮＡからβ－グルクロニダーゼ単量体が翻訳される。→β－グルクロニダーゼが活性を有するホモ四量体を形成する。→β－グルクロニダーゼによりＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵが分解され、緑色蛍光産物（ＰＦＢＦ）を生じる。）の後、反応産物であるＰＦＢ－Ｆ由来の緑色蛍光強度（Ｅｘ．４９２ｎｍ，　Ｅｍ．５１６ｎｍ）を、Ｍｘ３００５Ｐ　ｑＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（アジレント・テクノロジー）で測定した。
　図７は、野生型、Ｃ１２、Ｃ２４について、チューブ内β－グルクロニダーゼ合成反応（ＤＮＡスタート）の結果を示すグラフであり、図７（ａ）は５０ｐＭ　ＤＮＡの場合、図７（ｂ）は１０００ｐＭ　ＤＮＡの場合を示している。図７（ａ），（ｂ）において、縦軸は緑色蛍光強度、横軸は反応時間（分）であり、図７（ａ），（ｂ）に示す結果から、Ｃ１２およびＣ２４が野生型と比較して格段に短い時間で高い活性を有することが分かる。
　（ＲＮＡスタートの場合）
　氷上で以下の組成からなる反応液を調製した。
　・各種濃度のＲＮＡ（β－グルクロニダーゼ合成用のＤＮＡ（野生型、Ｃ１２またはＣ２４）を用いて、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ及び標準バッファ（タカラバイオ）を用いてＲＮＡ合成を行い、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した産物。）
　・３３０ｍＭ　スクロース
　・１μＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ，　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ライフテクノロジーズジャパン）
　・５０μＭ　５－（Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（ＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵ）（ライフテクノロジーズジャパン）
　・１ｍＭ　Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ　ｂｅｔａ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＰＥＴＧ)
　・無細胞タンパク質合成（ＰＵＲＥｓｙｓｔｅｍ）
　上記反応液を用いて、以下の流れの反応（ｍＲＮＡからβ－グルクロニダーゼ単量体が翻訳される。→β－グルクロニダーゼが活性を有するホモ四量体を形成する。→β－グルクロニダーゼによりＰＦＢ－ＦＤＧｌｃＵが分解され、緑色蛍光産物（ＰＦＢＦ）を生じる。）の後、反応産物であるＰＦＢ－Ｆ由来の緑色蛍光強度（Ｅｘ．４９２ｎｍ，　Ｅｍ．５１６ｎｍ）を、Ｍｘ３００５Ｐ　ｑＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（アジレント・テクノロジー）で測定した。
　図８は、野生型、Ｃ１２、Ｃ２４について、チューブ内β－グルクロニダーゼ合成反応（ＲＮＡスタート）の結果を示すグラフであり、図８（ａ）は５０ｐＭ　ＲＮＡの場合、図８（ｂ）は５００ｐＭ　ＲＮＡの場合、図８（ｃ）は５０００ｐＭ　ＲＮＡの場合を示している。図８（ａ），（ｂ），（ｃ）において、縦軸は緑色蛍光強度、横軸は反応時間（分）であり、図８（ａ），（ｂ），（ｃ）に示す結果から、Ｃ１２およびＣ２４が野生型と比較して格段に短い時間で高い活性を有することが分かる。

Claims (7)

  1. 　β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列に変異が導入された改良型のβ－グルクロニダーゼであって、
    　前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンまたはセリンを有する、改良型のβ－グルクロニダーゼ。
  2. 　前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にメチオニンを有し、かつ、前記アミノ酸配列のＮ末端側から５２０番目の位置にロイシンを有する、請求項１に記載の改良型のβ－グルクロニダーゼ。
  3. 　前記アミノ酸配列のＮ末端側から５６１番目の位置にセリンを有し、かつ、前記アミノ酸配列のＮ末端側から４４４番目の位置にアラニンを有する、請求項１に記載の改良型のβ－グルクロニダーゼ。
  4. 　配列番号１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の改良型のβ－グルクロニダーゼ。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の改良型のβ－グルクロニダーゼにさらに変異が導入された改良型のβ－グルクロニダーゼであって、以下の（ａ）～（ｄ）の少なくともいずれかを有する、改良型のβ－グルクロニダーゼ。
    　（ａ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から６４番目の位置にバリンを有する、
    　（ｂ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から１２３番目の位置にバリンを有する、
    　（ｃ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から１４５番目の位置にロイシンを有する、
    　（ｄ）前記β－グルクロニダーゼ単量体のアミノ酸配列のＮ末端側から４５１番目の位置にバリンを有する。
  6. 　前記（ａ）～（ｄ）を全て有する、請求項５に記載の改良型のβ－グルクロニダーゼ。
  7. 　配列番号２７または２９のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の改良型のβ－グルクロニダーゼ。
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