WO2014203306A1

WO2014203306A1 - 電気泳動装置と分析方法

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Publication number: WO2014203306A1
Application number: PCT/JP2013/066570
Authority: WO
Inventors: 中村　伸
Original assignee: 株式会社島津製作所
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2014-12-24

Abstract

　上方が開口した複数の容器からなり、そのうちの少なくとも２つの容器には互いに異なるサンプルが収容されたサンプル容器群と、上方が開口したサンプルインジェクションウエルと、前記サンプル容器内の位置及び前記サンプルインジェクションウエル内の位置に移動するように支持されているノズル、及び該ノズルにつながる吸引吐出機構を備えて前記ノズルによる液の吸引と吐出を行う分注攪拌機構と、を少なくとも備えた電気泳動装置である。その制御部は、前記サンプル容器群のうちのサンプルを収容した少なくとも２つのサンプル容器からのサンプルを前記サンプルインジェクションウエルに注入して前記サンプル溶液を調製するように前記分注攪拌機構の動作を制御するサンプル混合部を備えている。

Description

電気泳動装置と分析方法

　本発明は、電気泳動分析の泳動流路としてキャピラリを備えた電気泳動装置と、その電気泳動装置を用いた分析方法に関するものである。

　電気泳動による分析方法は、ライフサイエンスの分野に限らず、医学、生物、農学、理学、薬学、工学などの基礎研究においても、分析化学においても利用することができる。標的物質を電気泳動分離して診断したり検査したりする応用分野においても利用することができ、さらに創薬研究、農水畜産物改良、新機能生物（微生物、菌など）によるバイオ燃料開発などにも利用することができる。

　サンプル注入後の電気泳動分離に関し、従来の工程は１つのサンプルに対して１分離分析が行われる構成となっている。

　分析対象がＤＮＡなどの生物サンプルの場合、サンプル量が微量で電気泳動分離に供するには少なすぎることが多い。その場合にサンプル量を増やす方法としてＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)アッセイがある。

　ＰＣＲアッセイは汎用的な増幅方法である。ＰＣＲアッセイには１つの遺伝子領域を増幅するシングルＰＣＲアッセイと、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を同時に使用することにより複数の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲアッセイがある。シングルＰＣＲアッセイは、設計が容易で、簡便であり、最も堅牢な遺伝子解析アッセイである。しかし、シングルＰＣＲアッセイは、数多く実施しようとすると、１サンプルにつき１分離分析ではトータル処理能力に限界がある。一方、マルチプレックスＰＣＲは処理能力が優れているが、同時に増幅する遺伝子領域の数が多くなる程、プライマーダイマーなどの非特異増幅が生じてプライマー設計が非常に難しい。

　従来の電気泳動装置は、サンプル容器に収容されたサンプルをキャピラリに注入して電気泳動分離するだけで、サンプル注入前にサンプルを自動的に混合する機能をもったものはない。

　本発明は、ＰＣＲ設計の難しいマルチプレックスＰＣＲ反応を用いず、設計しやすく堅牢なシングルＰＣＲ反応を基本としながらも処理能力を向上させることを目的とするものである。

　本発明の電気泳動装置は、少なくともサンプル注入端が垂直方向の下側を向くように配置されたキャピラリと、上方が開口した複数の容器からなり、そのうちの少なくとも２つの容器には互いに異なるサンプルが収容されたサンプル容器群と、上方が開口したサンプルインジェクションウエルと、上方が開口した容器にバッファ液を収容したバッファ容器と、前記サンプル容器内の位置及び前記サンプルインジェクションウエル内の位置に移動するように支持されているノズル、及び該ノズルにつながる吸引吐出機構を備えて前記ノズルによる液の吸引と吐出を行う分注攪拌機構と、前記キャピラリのサンプル注入端の下方に配置され、前記サンプルインジェクションウエル及び前記バッファ容器を支持する支持部材、並びに調製されて前記前記サンプルインジェクションウエルにあるサンプル溶液及び前記バッファ容器内のバッファ液を前記キャピラリのサンプル注入端に接触させるように前記支持部材を水平方向と垂直方向に移動させる駆動機構を備えた移動ステージと、

　前記キャピラリのサンプル注入端とその反対側の端部との間にサンプル注入電圧及び泳動電圧を印加する電源装置と、前記駆動機構及び前記電源装置の動作を制御する制御部と、前記キャピラリにより電気泳動分離されたサンプルを複数波長で検出する検出器と、を備えている。

　そして、前記制御部は、前記サンプル容器群のうちのサンプルを収容した少なくとも２つのサンプル容器からのサンプルを前記サンプルインジェクションウエルに注入して前記サンプル溶液を調製するように前記分注攪拌機構の動作を制御するサンプル混合部を備えている。

　本発明の一実施形態は、分離媒体充填ノズルにより分離媒体を供給する分離媒体充填機構をさらに備え、キャピラリは垂直方向に延びるように支持され、その上端に液を貯留できる凹部からなるリザーバを備え、前記リザーバとキャピラリの接続部分には前記分離媒体充填ノズルを液密を保って着脱可能に接続するノズル接続部を備えている。

　サンプル混合部は、例えば、前記キャピラリによる電気泳動での分離能をデータとして保持しており、混合するサンプルの数が指定されると、サンプル容器群に収容されたサンプルの中から前記分離能により互いに分離できるサンプルを選択して、混合するサンプルを自動で指定するものである

　サンプル濃度が高すぎる場合に、サンプル容器に収容されたサンプルを自動的に希釈する機能をもったものはない。本発明の一実施形態は、希釈液（例えば希釈バッファ液）を収容した希釈液容器をさらに備え、前記分注攪拌機構のノズルは希釈液容器内の位置にも移動するように支持されているか、又は希釈液容器内に前記吸引吐出機構を介して流路でつながっている。そして、前記制御部は、予め設定された希釈条件により、又は前記検出器が検出したサンプルの検出強度により希釈条件を求めてその希釈条件により、希釈液容器内の希釈液を前記分注攪拌機構によりサンプルインジェクションウエルに注入してサンプルを希釈するように前記分注攪拌機構の動作を制御する希釈部を備えている。

　キャピラリ電気泳動では、キャピラリへのサンプル注入は、キャピラリ端を電極とともにサンプル容器のサンプル溶液に浸漬してサンプルを電気泳動的に注入する電気泳動的インジェクション法（ＥＫＩ法）、又は加圧・減圧によりサンプルを圧力的に導入するニューマティックインジェクション法により行われる。キャピラリへの所定量のサンプル注入後に電気泳動分離が行われる。

　サンプル注入に関して、従来のＥＫＩ法では、電極はサンプル容器に固定されているのではなく、サンプル注入のたびにキャピラリ端と電極をサンプル溶液に浸漬するので、キャピラリ端と電極の位置関係のばらつきにより、注入量が変動するなどの注入不具合を生じる。本発明の他の実施形態は、サンプルインジェクションウエルは、底部が狭くなった漏斗状をなし、前記底部に固定された電極を備えている。サンプル注入の際に、移動ステージによりキャピラリ端をサンプルインジェクションウエル内の所定の位置に位置決めすることにより、キャピラリ端とサンプルインジェクションウエルの電極との間の間隔が一定となり、キャピラリ端とサンプルインジェクションウエルの電極との間の印加電圧の再現性、ひいてはサンプル注入量の再現性が向上する。

　一般に、ニューマティックインジェクションにおいては、電気泳動用の高圧電源以外にサンプル注入のための加圧や減圧の新たな機構を要する。上記に示したような、分離媒体充填ノズルにより分離媒体を供給する分離媒体充填機構と、垂直方向に延びるように支持されたキャピラリの上端に設けられたリザーバと、そのリザーバとキャピラリの接続部分に設けられたノズル接続部を備えている一実施形態では、そのようなサンプル注入のための新たな機構が不要になる。すなわち、分離媒体充填ノズルからノズル接続部を介してキャピラリに分離媒体を注入した後、キャピラリの他端をサンプルインジェクションウエルのサンプルに浸し、分離媒体充填ノズルをノズル接続部に接続した状態で分離媒体充填機構により吸引することによりサンプルをキャピラリに吸入することができる。このようにして、分離媒体充填機構を使用してニューマティックインジェクションを行うことができる。

　サンプルインジェクションウエルは、洗浄することにより、異なるサンプルに対して繰返し使用することのできる洗浄再利用型であることが好ましい。サンプルインジェクションウエルの洗浄はどのような方法で行ってもよい。

　本発明のさらに他の実施形態は、洗浄液を収容した洗浄液容器をさらに備え、前記分注攪拌機構のノズルは前記洗浄液容器内の位置にも移動するように支持されているか、又は前記洗浄液容器内に前記吸引吐出機構を介して流路でつながっており、前記制御部は、前記洗浄液容器内の洗浄液を前記分注攪拌機構により前記サンプルインジェクションウエルに注入して前記サンプルインジェクションウエルを洗浄するように前記分注攪拌機構の動作を制御する洗浄部を備えている。

　サンプルインジェクションウエルは、保守を容易にするために、移動ステージに着脱可能に取りつけられていることが好ましい。

　本発明の電気泳動分析方法は、本発明による電気泳動装置を用いる電気泳動分析方法であり、電気泳動分析直前にサンプルインジェクションウエルで複数のサンプルを混合することによりマルチプレックス分析を行う。

　電気泳動分析方法の一実施形態では、サンプル容器群のうちの少なくとも１つのサンプル容器には反応試薬を収容しておき、電気泳動分析直前にサンプルインジェクションウエルで複数のサンプルと反応試薬を混合する。従来の電気泳動分析方法には、ＰＣＲアッセイ又はＲＴ（Real Tine）－ＰＣＲアッセイなどのアッセイ反応前処理を行う機能をもったものもないが、この実施形態では、反応試薬を複数のサンプルとともに混合してから反応経過時間の異なるサンプルを順次キャピラリに注入して電気泳動分離することにより、ＰＣＲアッセイ又はＲＴ－ＰＣＲアッセイなどのアッセイ反応前処理を行うことができるようになる。

　電気泳動分析直前にサンプルインジェクションウエルで複数のサンプルと混合するのは、反応試薬の他に、内部標準マーカ又はラダーマーカなどのコントロールサンプルとすることもできる。

　さらに、電気泳動分析直前にサンプルインジェクションウエルで複数のサンプルと混合するものとして希釈液とすることもできる。希釈液を混合する方法として、分析結果に応じて、サンプル希釈を行い再分析行うことができる。また、電気泳動サンプルをあらかじめ設定された希釈条件で希釈するようにしてもよい。このように、本発明では分注攪拌機構を備えているので、反応産物量が多い場合、一実施形態として、電気泳動前に電気泳動サンプルを自動的に希釈することができる。

　本発明の電気泳動装置では、分注攪拌機構を備え、前記制御部が前記分注攪拌機構により少なくとも２つのサンプル容器からのサンプルを前記サンプルインジェクションウエルに注入して混合するサンプル混合部を備えているので、例えば、複数のサンプル容器にシングルＰＣＲ反応により増幅されたサンプルを収容しておき、それらのサンプルを前記サンプルインジェクションウエルに注入して混合することにより複数のサンプルを１つのキャピラリに注入することができる。

　また、前記検出器が複数波長で検出するものであるので、１つのキャピラリに注入される複数のサンプルをそれぞれ異なる蛍光試薬で標識しておくことにより、各サンプルを識別して検出することができる。例えば、多色蛍光で標識することにより、使用する蛍光標識数の数だけさらにマルチプレックス化が可能となる。たとえば、電気泳動により互いに互いに分離される４つのサイズのサンプルについて、検出する部位を互いに異なる４つの波長で標識しておくことにより、１６マルチプレックス化が可能となる。

　このようにして、マルチプレックスＰＣＲ反応を用いなくても、シングルＰＣＲ反応を基本としながらも処理能力を向上させることができる。従来の単一反応－単一分離検出から、単一反応－複数分離検出の新たなアッセイ法を実現できる。

電気泳動装置の一実施例を示す概略構成図である。同実施例におけるキャピラリユニットの第１の例を示す正面断面図である。同実施例におけるキャピラリユニットの第２の例を示す正面断面図である。同実施例におけるキャピラリユニットの第３の例を示す正面断面図である。同実施例におけるキャピラリユニット設置部の一例を示す正面断面図である。同実施例における検出器の一例を示す概略斜視図である。同検出器におけるＣＣＤカメラの受光面の画像を示す図である。同実施例における制御系を示すブロック図である。同制御系における制御部を示すブロック図である。シングルＰＣＲ法によるサンプル調製方法を示すフローチャートである。一実施例における分析動作を示すフローチャートである。一実施例におけるサンプル混合動作を示すフローチャートである。混合サンプルを電気泳動して得られる波形図である。反応試薬を混合して反応時間依存性を調べる実施形態の動作を示すフローチャートである。飽和した電気泳動ピークを示す波形図である。自動希釈を行う実施形態の動作を示すフローチャートである。

　電気泳動装置の一実施例は図１に示されるものである。この電気泳動装置では図２、図３又は図４に示されるキャピラリユニット１、１ａ又は１ｂが使用される。

　まず、キャピラリユニット１、１ａ、１ｂについて説明する。図２～図４において、キャピラリ２を正面図で示し、キャピラリ２以外の部分を断面図で示している。

　キャピラリユニット１は直線形状のキャピラリ２とリザーバブロック４により構成されている。リザーバブロック４は液を貯留することができる凹部からなるリザーバ８を備えている。リザーバ８の凹部は底部から開口部に向かって開いた漏斗状に形成されている。キャピラリ２は、その一端がノズル接続部１０を介してリザーバ８の底部に接続されるように、フェルル６によりリザーバブロック４に固定されている。キャピラリ２はリザーバ８の開口部とは反対の方向へ延びている。リザーバブロック４の材質は特に限定されるものではないが、例えばポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）である。

　キャピラリ２の一部は検出位置２ａとなっている。検出位置２ａは、キャピラリ２の表面を覆っている保護膜が除去された部分である。検出位置２ａでは、キャピラリ２内を泳動するサンプルが吸光度測定や蛍光測定などの光学的な測定がなされる。

　ノズル接続部１０は、リザーバ８の底部とキャピラリ２の一端との間を接続するとともに、リザーバ８側から挿入されるノズルを、液密を保って着脱可能に接続するものである。そのノズルは、例えば分離媒体をキャピラリ２内に注入するためのものである。

　図３はキャピラリユニットの他の実施例を示す部分断面図である。この実施例のキャピラリユニット１ａは、複数のキャピラリ２とリザーバブロック４ａにより構成されている。リザーバブロック４ａには各キャピラリ２に対応するリザーバ８が設けられており、各キャピラリ２の一端がそれぞれのリザーバ８の底部側においてリザーバブロック４ａにフェルル６によって固定されている。

　各リザーバ８の底部とキャピラリ２の一端側端部との間にはノズル接続部１０が設けられ、分離媒体を注入するノズルをノズル接続部１０に液密を保って着脱可能に接続することができる。

　図４はキャピラリユニットのさらに他の実施例を示す部分断面図である。この実施例のキャピラリユニット１ｂは、複数のキャピラリ２とリザーバブロック４ｂにより構成されている。リザーバブロック４ｂには全てのキャピラリ２に共通のリザーバ８が設けられており、各キャピラリ２の一端が共通のリザーバ８の底部側においてリザーバブロック４ｂにフェルル６によって固定されている。

　リザーバ８の底部と各キャピラリ２の一端側端部との間にはノズル接続部１０が設けられ、分離媒体を注入するノズルをノズル接続部１０に液密を保って着脱可能に接続することができる。

　これらのキャピラリユニット１，１ａ、１ｂにおいて、リザーバブロック４、４ａ、４ｂに対するキャピラリ２の固定は接着剤による接着によって行なわれていてもよい。

　図１に戻って電気泳動装置の一実施例について説明する。なお、図１の電気泳動装置では、図２を用いて説明したキャピラリユニット１が用いられているが、図３を用いて説明したキャピラリユニット１ａ、図４を用いて説明したキャピラリユニット１ｂも同様に用いることができる。

　キャピラリユニット１を設置するキャピラリユニット設置部１２が設けられている。キャピラリユニット設置部１２は、設置されたキャピラリユニット１がそのリザーバブロック４を上にし、キャピラリ２がリザーバブロック４から下方に鉛直方向に延びるように構成されている。一例として、キャピラリユニット設置部１２は、その上面にフェルル６がはまり込む凹部が形成され、その凹部から垂直方向に延びる通路が形成され、その通路にキャピラリ２が配置されるようになっている。キャピラリ２の下端部はキャピラリユニット設置部１２よりも下方へ突出しており、後述するサンプルチューブ２８、サンプルインジェクションウエル２９やバッファリザーバ３０の内部へ入ることができる。

　キャピラリユニット設置部１２は、図５に示されているように、例えばアルミニウムなど熱伝導性のよい金属からなる２つのブロック１２－１，１２－２により構成されている。それらブロック１２－１，１２－２の間にキャピラリユニット１のフェルル６とキャピラリ２（下端部を除く）を挟み込んで保持するために、２つのブロックの互いの内側の面にはフェルル６を嵌め込む凹部とキャピラリ２を嵌めこむ溝がつながって形成されている。

　キャピラリユニット設置部１２にはヒータ１３と温度センサ１４が設けられており、キャピラリ２の温度が一定温度になるように、温度センサ１４の検出信号に基づいてヒータ１３への通電が制御される。ヒータ１３はシート状のラバーヒータであり、キャピラリユニット設置部１２を構成する一方のブロック１２－１の表面全体に貼付されている。ヒータ１３によってブロック１２－１の表面全体を加熱する構造であるため、キャピラリ２を保持するブロック１２－１，１２－２及びキャピラリ２に垂直方向の温度勾配が生じにくくなり、キャピラリ２の温度を垂直方向に対して均一にすることができる。

　ブロック１２－１及びヒータ１３の所定の位置にそれぞれ穴１２ａ，１３ａが設けられており、キャピラリ２の検出位置２ａにおいてキャピラリ２内を泳動するサンプル成分を検出部１５により光学的に検出することができるようになっている。

　検出部１５の一例は、キャピラリ２により電気泳動分離されたサンプルを複数波長で検出する検出器であり、図６Ａと図６Ｂに示されたものである。ここでは、キャピラリ２として、図３又は図４に示されるキャピラリユニット１ａ又は１ｂのように複数個のキャピラリ２が一列に配列されたものを想定しているが、図２のキャピラリユニット１のように１本のキャピラリ２のみを備えたものであってもよい。

　検出部１５はキャピラリ２の検出位置２ａを照射する励起光源１５ａとして青色固体レーザ（励起波長Ｅｘは例えば４８８－５０５ｎｍ）を備えている。励起光により励起されて検出位置２ａから発生する蛍光を検出するために、凹面回折格子１５ｂと二次元検出器としてのＣＣＤカメラ１５ｃを含むポリクロメータＣＣＤイメージ分光検出光学系が設けられている。励起光源１５ａからのレーザ光を検出位置２ａに照射するための光学系やポリクロメータＣＣＤイメージ分光検出光学系内のレンズなどの図示は省略されている。

　図６Ａのように、複数のキャピラリ２が配置されている場合は、ＣＣＤカメラ１５ｃの受光面には、図６Ｂに示されるような画像が得られる。図６Ｂで横軸は位置座標でありキャピラリ２の位置に対応し、縦軸は波長である。このように、ＣＣＤカメラ１５ｃの受光面にはキャピラリ２の位置ごとに波長分散された蛍光画像が集光される。

　検出部１５の励起／蛍光集光／結像光学系および画像信号からの分光強度データ取得方法は、使用するキャピラリ本数および標識蛍光波長により設計される。励起光源１５ａの種類、波長、光源強度、分光検出光学系は前記に限定されるものではなく、ＬＥＤ、ハロゲンなどの光源、プリズムやダイクロイックミラー・フィルターによる分光、シリコン検出器や光電子増倍管などの検出器により構成してもよい。光ファイバーを用いて光学系を構成することもできる。

　図１に戻って説明を続けると、検出部１５で得られた検出信号は演算部２０に取り込まれ、サンプル成分の同定などが行なわれる。演算部２０は例えば電気泳動装置に接続されたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）又は電気泳動装置に設けられた専用のコンピュータによって実現される。

　キャピラリ２に分離媒体であるポリマーを充填するために、キャピラリユニット１の上方にオフラインの分離媒体充填機構２２が設けられている。分離媒体充填機構２２はノズル２２ａとシリンジポンプ２２ｂを有し、ノズル２２ａとシリンジポンプ２２ｂはチューブを介して接続されている。ノズル２２ａは水平方向と鉛直方向への移動できるように支持機構（図示略）により支持されている。ノズル２２ａの支持機構は、後述の分離媒体充填機構駆動部３６により駆動されてノズル２２ａを所定の位置に移動させて位置決めする。シリンジポンプ２２ｂも分離媒体充填機構駆動部３６により駆動される。

　キャピラリ２に分離媒体を充填するときは、シリンジポンプ２２ｂにポリマーをつめた状態で、ノズル２２ａが支持機構により移動させられ、キャピラリユニット１のリザーバブロック４に設けられたノズル接続部１０にノズル２２ａの先端が挿入されてノズル２２ａがキャピラリ２に接続される。その後、シリンジポンプ２２ｂが分離媒体充填機構駆動部３６により押されることにより、ノズル２２ａ上流からキャピラリ２に連続的にポリマーを加圧充填される。

　分離媒体充填機構２２は、シリンジポンプ２２ｂ内に水が入った状態で、ノズル２２ａの先端からポリマー容器に入ったポリマーを吸引した後、ノズル接続部１０にノズル２２ａの先端が挿入されてキャピラリ２に接続され、加圧充填することもできる。この動作も分離媒体充填機構駆動部３６により駆動される。その際には，水とポリマーの混合を防ぐために水とポリマーの間にエアギャップが挿入されることが好ましい。

　ポリマー充填後、ノズル２２ａをリザーバブロック４のノズル接続部１０に接続したままでキャピラリ２のカソード端にサンプルインジェクションウエル２９のサンプルに接液し、ノズル２２ａで吸引を行うことで、キャピラリーカソード端へサンプルのインジェクションを行うようにしてもよい。

　キャピラリユニット設置部１２の下方に移動ステージ２６が設けられている。移動ステージ２６にはサンプルチューブ２８（サンプル収容部）が複数個と、サンプルインジェクションウエル２９、バッファリザーバ３０及びドレインポート３２が載置されている。移動ステージ２６は、ステージ駆動機構２７によって駆動されて水平方向と鉛直方向へ移動し、サンプルチューブ２８のうちの１つ、サンプルインジェクションウエル２９、バッファリザーバ３０又はドレインポート３２をキャピラリ２の下端部に対して位置決めする。

　サンプルチューブ２８は内部にサンプルを収容している。バッファリザーバ３０は内部にバッファ液を収容する。バッファリザーバ３０のバッファ液には電極３３の一端が浸され、電極３３の他端は泳動用の電源装置に接続される。ドレインポート３２にはドレインチューブ３４が接続されており、ドレインポート３２を通じてノズル２２ａ、２４ａから不要な液を排出する。サンプルチューブ２８サンプルインジェクションウエル２９及びバッファリザーバ３０はともに上面が開放されており、移動ステージ２６の移動によってキャピラリ２の下端をサンプルチューブ２８内のサンプル、サンプルインジェクションウエル２９内のサンプル又はバッファリザーバ３０内のバッファ液に浸すことができる。

　サンプルチューブ２８はサンプルのほか、反応試薬、コントロールサンプルなどを収容するもできる。反応試薬、コントロールサンプルなどは後述の分注攪拌機構２４によりサンプルに混合される。

　サンプルチューブ２８は、移動ステージ２６に乗せてこの電気泳動装置のワークエリアに入ることができればよいので、サンプルチューブ２８の形状や大きさについての制約が少ない。

　サンプルインジェクションウエル２９は底部が狭くなった漏斗状をなし、ウエルの底部に固定された電極３１を備えている。電極３１の材質は例えば白金（Ｐｔ）、ステンレス（例えばＳＵＳ３１６）、カーボンなど、耐薬品性をもつ導電性材料であり、ウエル２９の電極３１以外の部分はバイオイナートな絶縁材料で構成されている。バイオイナートは生体試料が吸着しにくい性質、又は生体試料を分解させにくい性質をいう。バイオイナートな絶縁材料の例としては、ポリプロピレン（ＰＰ）やポリエチレン（ＰＥ）など、一般的に生化学分析の分野で使用されている樹脂材料を用いることができる。電極３１は電極線３１ａによってステージ２６の外部に導かれて電気泳動用高電圧電源に接続され、キャピラリ２へのサンプル注入の際に電圧が印加される。ウエル２９の形状と配置は、取り扱うサンプル容量およびキャピラリの本数と配置に合わせて決められる。

　サンプルインジェクションウエル２９は、洗浄することにより、異なるサンプルに対して繰返し使用することのできる洗浄再利用型である。この実施例のように、ウエル２９の電極３１以外の部分がバイオイナートな材質からなり、電極３１が耐薬品性をもっている場合には、洗浄再利用型として使用するのに好都合である。

　サンプルインジェクションウエル２９は、保守のため、移動ステージ２６に着脱可能になっている。移動ステージ２６にはサンプルインジェクションウエル２９を着脱可能に保持する凹部が設けられ、さらに、移動ステージ２６にはその凹部から電極線３１ａを外部に導くための穴又は切欠きが設けられている。

　移動ステージ２６の上方には分注攪拌機構２４が配置されている。分注攪拌機構２４はノズル２４ａ、吸引吐出機構としてのポンプユニット２４ｂ、洗浄液容器２４ｃ及び切替えバルブ２４ｄを備えている。ポンプユニット２４ｂは例えばシリンジポンプである。ポンプユニット２４ｂが切替えバルブ２４ｄのセンターポートに接続され、ノズル２４ａと洗浄液容器２４ｃが切替えバルブ２４ｄの周辺ポートに接続されていることにより、ポンプユニット２４ｂが切替えバルブ２４によりノズル２４ａ又は洗浄液容器２４ｃに切り替えて接続されるようになっている。取り扱う洗浄液の種類の数に応じて、切替えバルブのポート数とラインを用意する。

　ポンプユニット２４ｄは例えばシリンジポンプ又はプランジャーポンプである。ノズル２４ａは接液部が使い捨て型のチップ構造でもよい。

　分注攪拌機構２４の数は１つでも複数でもよい。サンプルインジェクションウエル２９の吸引専用として、吸引ノズルと吸引ポンプより構成される吸引ユニットを設置することもできる。

　ノズル２４ａは水平方向と鉛直方向への移動できるように支持機構（図示略）により支持されている。ノズル２４ａの支持機構は、後述の分注攪拌機構駆動部３７により駆動されてノズル２４ａを所定の位置に移動させて位置決めする。ポンプユニット２４ｂも分注攪拌機構駆動部３７により駆動される。

　分注攪拌機構駆動部３７は少なくとも２つのサンプル容器２８からのサンプルをサンプルインジェクションウエル２９に注入して混合する動作を行う。分注攪拌機構駆動部３７は、サンプルインジェクションウエル２９からキャピラリ２へのサンプル注入後に洗浄液容器２４ｃの洗浄液をサンプルインジェクションウエル２９へ注入し、洗浄した後、その洗浄液をドレインポート３２へ排出する動作も行う。さらに、バッファリザーバ３０又は他の容器に収容されているバッファ液を吸入してリザーバ８へ注入する動作も行う。

　これらの動作は後述の制御部４６が分注攪拌機構駆動部３７を制御して行う。特に、サンプルインジェクションウエル２９に複数のサンプルを注入して混合する動作は、分析条件設定部４７に予め設定された分析条件に従って、制御部４６のサンプル混合部４９から分注攪拌機構駆動部３７を介して行われる。分析条件設定部４７は制御部４６を構成するコンピュータのメモリであり、分析条件設定部４７への分析条件の設定はコンピュータの入力装置を介して予め入力される。

　キャピラリ２、サンプルチューブ２８及びサンプルインジェクションウエル２９の数は任意である。サンプルチューブ２８として、例えば汎用のマイクロタイタープレートのウエルを使用する場合は、マイクロタイタープレートの９６（８×１２）穴や３８４（１６×２４）穴のフォーマットを考慮すると、サンプルチューブ２８の数は１，２，４，８，１２，１６，２４，４８，９６，１９６又は３８４として扱うことができる。その場合、サンプルインジェクションウエル２９の数をサンプルチューブ２８の数と等しい数にするのが好ましい。そして、キャピラリ２の数をサンプルインジェクションウエル２９の数に等しい数とすれば、全てのサンプルインジェクションウエル２９からキャピラリ２に一度にサンプル注入できて、好都合である。

　図１の電気泳動装置の制御系統について図７と図８を用いて説明する。

　この制御系統は、分離媒体充填機構２２のノズル２２ａとシリンジポンプ２２ｂを駆動する分離媒体充填機構駆動部３６と、分注撹拌機構２４のノズル２４ａの移動、切替えバルブ２４ｄの切替え動作及びポンプユニット２４ｂの動作を駆動する分注撹拌機構駆動部３８と、移動ステージ２６を駆動するステージ駆動機構２７と、電極１６、３１ａ、３３に電圧を印加する電圧印加部４４が設けられている。これらはヒータ１３とともに制御部４６により制御される。

　制御部４６は、図８に示されるように、分析条件設定部４７に予め設定された分析条件にしたがって分注撹拌機構駆動部３８を制御して、複数のサンプルをサンプルインジェクションポート２９に注入し、撹拌して混合するために、サンプル混合部４９を備えている。サンプル混合部４９は次のように構成されている。

（ＰＣＲ産物の混合）
　混合＃ｎ番目サンプルのＰＣＲ設計鎖長＝Ｌｎ（ｂｐ）、
　混合＃ｎ＋１番目サンプルのＰＣＲ設計鎖長＝Ｌｎ＋１（ｂｐ）、
　分離能＝Ｒｅｓ（ｂｐ）（分離能はベースライン分離時の値とする。）
　サイズ分離レンジ
　　最小＝ＳＥＰｍｉｎ（ｂｐ）、
　　最大＝ＳＥＰｍａｘ（ｂｐ）、
　マージン定数＝Ｑ（１～ｍ）とする。マージン定数は使用する分離媒体の分解能と実験的な変動誤差により決める。

　これらのデータは分析条件保持部４７に入力されて保持されている。サンプル混合部４９は、混合すべきサンプルの数が指定されると、これらのデータを分析条件保持部４７から呼び出し、混合するサンプルの組合せを以下の条件（１）と（２）を満たすように決定し、分注撹拌機構駆動部３８を介して分注撹拌機構２４によりサンプルの混合動作を実行する。
　　Ｌｎ＋１－Ｌｎ＞Ｒｅｓ×Ｑ　　（１）　及び
　　ＳＥＰｍｉｎ＜Ｌ１・・・Ｌｎ・Ｌｎ＋１・・・＜ＳＥＰｍａｘ　（２）

　サンプル混合に関する別の実施形態として、混合しようとするサンプルを予め決めて分析条件保持部４７に入力し保持させておく。混合しようとするサンプルを決める際にはそれらのサンプルが上の条件（１）と（２）を満たすように決定する。サンプル混合部４９はサンプルを混合するときになると、分析条件保持部４７から混合するサンプルを呼び出し、分注撹拌機構駆動部３８を介して分注撹拌機構２４によりサンプルの混合動作を実行する。

　制御部４６は、さらに、図８に示されるように、予め設定された希釈条件により、又は検出器１５が検出したサンプルの検出強度により希釈条件を求めてその希釈条件により、希釈を行う希釈部５１を備えている。希釈を行うために希釈用サンプルインジェクションウエルを用意しておく、希釈部５１は、サンプルを調製したサンプルインジェクションウエル２９に残っているサンプルから、例えば、分注攪拌機構２４のポンプユニット２４ｂ（例えばシリンジポンプ）により所定量のサンプルを吸入して、それを希釈用サンプルインジェクションウエルに注入し、希釈液容器２４ｃ内の希釈液を希釈条件により求まる量だけ分注攪拌機構２４によりサンプルインジェクションウエル２９に注入して、サンプルを希釈するように、分注攪拌機構２４の動作を制御する。

　分注攪拌機構２４における希釈液容器２４ｃを洗浄液を収容した洗浄液容器としてもすることができる。切換えバルブ２４ｄがさらに接続ポートを備えたものとして、希釈液容器２４ｃとは別に洗浄液容器を接続することもできる。また、洗浄液容器を別途設け、分注攪拌機構２４のノズル２４ａが洗浄液容器内の位置にも移動するように支持されているようにすることできる。サンプルインジェクションウエル２９を洗浄して繰り返して使用できるようにするための実施形態として、制御部４６は、図８に示されるように、洗浄液容器内の洗浄液を分注攪拌機構２４によりサンプルインジェクションウエル２９に注入してサンプルインジェクションウエル２９を洗浄するように分注攪拌機構２４の動作を制御する洗浄部５３を備えている。

　サンプル混合部４９、サンプル希釈部５１及び洗浄部５３は、コンピュータからなる制御部４６により実現される機能であり、

　この実施例の動作およびアッセイ例を示す。

　個々のサンプルチューブ２８に収容されるシングルＰＣＲ増幅されたサンプルの調製は図９に示されるように行う。複数のゲノム標的領域を対象に、図１の実施例のキャピラリ電気泳動装置による分離性能上、十分分離されてサイズ認識できる程度の鎖長となるようシングルＰＣＲ設計を行う。ＰＣＲ反応時にＦｗ（フォワード）あるいはＲｖ（リバース）プライマーに多色蛍光標識する。ＳＮＰアッセイの場合、一塩基伸張法のプライマー鎖長を分離性能上十分に分離できる程度の長さになるよう変えながら設計し、ｄｄＮＴＰを多色蛍光標識する。

　ＰＣＲサンプル容器として、シングル容器、８連チューブ、１２連チューブ、又は９６／３８４／１５３６ウエルＭＴＰを用いて反応を行い、反応後のサンプルを容器そのまま移動ステージ２６にセットする。

　装置側でサンプルの混合条件、電気泳動条件及び検出条件をあらかじめ分析条件設定部４７に設定して保存管理する。すべての分析条件を設定した後、分析を開始する。

　分析は図１０に示されるように自動的に実行される。制御部４６は分析条件設定部４７に設定された分析条件を呼び出す。制御部４６は分注攪拌機構駆動部３８を介して分注攪拌機構２４を駆動し、設定された分析条件によりサンプル混合部４９が指定した複数のサンプルをサンプルウエル２８から吸引し、サンプルインジェクションウエル２９に注入する。サンプルインジェクションウエル２９に注入された複数のサンプルをノズル２４ａによる吸引と吐出を繰り返すことにより混合攪拌する。

　サンプル混合部４９によるサンプル混合は図１１のように行われる。混合するサンプルの数が指定される。この指定はその都度オペレータが指定してもよく、又は分析条件保持部４７に予め設定しておいてもよい。サンプル混合部４９は分析条件保持部４７からサンプルの設計鎖長を呼出し、混合条件（１）と（２）を満たすサンプルを選択して、分注攪拌機構２４によりサンプルの混合を実行する。

　サンプル混合部４９はサンプルの混合だけでなく、反応試薬やコントロールサンプルの混合も行う。

　分注攪拌機構２４のノズル２４ａがその先端に使い捨てチップが装填されたものである場合は、サンプルインジェクションウエル２９での作業完了後、サンプルの混合攪拌に使用した使い捨てチップを取り外して廃棄し、新たなチップを装填する。チップの装填と取外しは自動で行われる。ただし、そのための機構部についてはこの種の分析装置ではよく知られたものであるので図示を省略する。ノズル２４ａがその先端に使い捨てチップが装填されたものでなく、ノズル２４ａを使いまわす構造の場合は、ノズル２４ａドレインポート３２又は専用のリンスポート（図示なし）により洗浄する。

　サンプルインジェクションウエル２９でのサンプルの混合攪拌と前後して、キャピラリ２に分離媒体を充填する。図１０ではサンプルの混合攪拌後に分離媒体を充填する場合を示しているが、サンプルの混合攪拌前に分離媒体を充填してもよく、サンプルの混合攪拌と並行して分離媒体の充填を行ってもよい。

　分離媒体の充填は次のように行われる。新規分離媒体（流動性の水溶性線形ポリマー溶液）は分離媒体充填機構のシリンジポンプ２２ｂに吸引されている。ステージ駆動機構２７によりバッファリザーバ３０がキャピラリ２のカソード端（図１では下端）の位置に移動させられ、キャピラリ２のカソード端がバッファリザーバ３０のバッファ液に浸される。キャピラリ２のカソード端専用の水容器（図示なし）をバッファリザーバ３０の隣に設置することもでき、その場合は、キャピラリ２のカソード端がその水に浸される。キャピラリ２のカソード端がバッファ液又は水に浸された状態で、分離媒体充填機構２２によりノズル２２ａがリザーバ８の底部のノズル接続部１０に差し込まれて、ノズル２２ａがキャピラリ２と接続される。シリンジポンプ２２ｂが駆動されることにより、新規分離媒体がキャピラリ２に加圧充填される。一定量以上の充填が完了した後、分離媒体充填機構２２のノズル２２ａがノズル接続部１０から引き抜かれ、ノズル２２ａは別途の洗浄ポート（図示なし）で乾燥しないよう退避する。

　分離媒体の充填後、キャピラリ２の両端が電極液（バッファ液）と接液するよう、リザーバ８へはバッファリザーバ３０又は他の容器に収容されているバッファ液が分注撹拌機構２４のノズル２４ａにより送液され、バッファリザーバ３０がステージ移動機構２７によりキャピラリ２の下端がバッファ液に浸る位置まで移動させられる。その後、電極１６と３３の間に初期電圧が印加され、分離媒体の充填に問題がないことが電流値の状態で確認される。

　その後、キャピラリ２の下端がサンプル溶液に浸るように、サンプルインジェクションウエル２９がステージ移動機構２７により移動させられる。このとき、キャピラリ２の下端がウエル２６の底に固定されている電極３１に対して設定された間隔をもつ位置になるように、サンプルインジェクションウエル２９がステージ移動機構２７により正確に位置決めされる。その状態で電極１６と３１の間にサンプル注入のためのインジェクション電圧が所定時間印加される。

　サンプル注入後、サンプルインジェクションウエル２９は洗浄工程に入る。洗浄はサンプルインジェクションウエル２９に残ったサンプル溶液をノズル２４ａにより吸引してドレインポート３２へ排出した後、ノズル２４ａにより洗浄水又は専用の洗浄液をサンプルインジェクションウエル２９へ分注し、攪拌し、吸引してドレインポート３２へ排出することにより行われる。これと平行して、キャピラリ２の下端がバッファリザーバ３０のバッファ液に浸され、電極１６と３３の間に泳動電圧が印加されてサンプルの分離分析泳動が行われる。

　サンプルがＤＮＡの場合、分離されたＤＮＡ断片は検出部１５により時系列な蛍光強度データの泳動波形として取得される。演算部２０は、この泳動波形の情報をもとにジェノタイピング解析を行う。

　サンプルを混合して電気泳動した場合に分離されたサンプルがどのように検出されるのかを示す一例を図１２に示す。ＬＭは低分子側の内部標準マーカ、ＵＭは高分子側の内部標準マーカである。泳動分離したサンプルは、下から順に次のようなものであった。
（１）１００ｂｐステップラダー
（２）１００ｂｐ　シングルプレックスＰＣＲサンプル
（３）５００ｂｐ　シングルプレックスＰＣＲサンプル
（４）１ｋｂｐ　シングルプレックスＰＣＲサンプル
（５）１００ｂｐ＋５００ｂｐ＋１ｋｂｐ混合サンプル

　この結果、サンプルを混合してもそれぞれのサイズごとに分離されて検出することができることがわかる。

　本発明は、複数のサンプルチューブ２８からの複数のサンプルを分注撹拌機構２４によりサンプルインジェクションウエル２９で混合攪拌するようになっていることから、サンプルと反応試薬との混合攪拌も自動で行うことができる。そのような実施の形態として、サンプルチューブ２８の１つに反応試薬を収容しておき、サンプルインジェクションウエル２９でサンプルと反応試薬を分注混合することができる。反応試薬と混合するサンプルは１つでもよく複数でもよく、また反応試薬も２種類以上を使用することもできる。

　この実施形態を図１３に示す。制御部４６は分析条件保持部４７から分析条件を呼び出し、サンプルをサンプルインジェクションウエル２９に分注する。分注されるサンプルは単一の場合も複数の場合もある。続いて、サンプルインジェクションウエル２９に反応試薬が分注され、撹拌して混合される。サンプルと反応試薬の分注の順序はいずれか先であってもよい。

　サンプルと反応試薬との混合により反応が始まる。反応開始から一定時間間隔で異なるキャピラリにサンプルを注入して電気泳動分析を行う。この操作は反応経過をみるために設定された所定時間が経過するまで繰り返される。

　この実施形態によれば、サンプルと反応試薬との反応時間依存性を見るアッセイを行うことができる。

　別の実施形態として、サンプル分析結果を装置が所定の基準（例えば検出ダイナミックレンジを超える巨大なサチュレーション信号など）で自動的に判断し、同じサンプルを希釈液で希釈した後再分析するために、制御部４６はサンプル希釈部５１を備えている。

　サンプル希釈部５１の動作を図１５に示す。サンプル希釈部５１は演算部２０からサンプル分析結果を取り込み、サンプルの希釈が必要であるかどうかを判断し、必要と判断したときは希釈率を決定し、分注撹拌機構駆動部３８を介して分注撹拌機構２４によりサンプル希釈動作を実行する。サンプルの希釈のための希釈液は、切替えバルブ２４ｄの１つのポートら希釈液容器を接続しておいてもよく、別途希釈液容器を用意しておき、ノズル２４ａによりその希釈液容器の希釈液をサンプルインジェクションウエル２９に分注するようにしてもよい。

　サンプル希釈部５１もコンピュータからなる制御部４６により実現される機能である。サンプル希釈部５１は希釈率を次のように決定するように構成されている。
　ＩＣ（インターナルコントロール）やマーカなどの基準ピーク高さ＝Ｓｃ、
　検出ダイナミックレンジ最大値＝Ｒｍａｘ、
　サンプル（＃ｎ）のピーク高さ＝Ｓｎ、
　飽和ピークのガウシアン外挿高さ＝ＳｎＨ、
　マージン定数＝Ｇ（例えば、２より大きい整数。）
　希釈率＝ＤＲ、
　最小ピーク高さ＝Ｓｍｉｎ
とする。マージン定数としては、「分離系の分離能と分離サイズ範囲」と「一度に分離する試料の断片長の種類の数とそれらの設計鎖長」から最適な値を算出する。Ｒｍａｘ、ＳｎＨは図１４に示されている。

　Ｓｃ、Ｒｍａｘ、Ｇ、及びＳｍｉｎは予めサンプル希釈部５１に設定されている。サンプル希釈部５１は演算部２０からＳｎを取り込み、ＳｎがＲｍａｘとなったときはピークがガウシアン分布をしているとして、ＳｎＨ計算する。そして、その求めたＳｎＨから以下の条件（３）と（４）を満たす希釈率ＤＲを算定し、希釈動作を行う。
　ＳｎＨ÷Ｒｍａｘ×Ｇ＝ＤＲ　（３）
　Ｓｃ÷ＤＲ＞Ｓｍｉｎ　（４）

　さらに他の実施形態として、サンプル希釈部５１は予め定められた固定希釈率を保持しており、ＳｎがＲｍａｘとなったときはその固定希釈率に従って希釈動作を行うようにしてもよい。

　　１、１ａ、１ｂ　　　キャピラリユニット
　　２　　　キャピラリ
　　２ａ　　　検出位置
　　４、４ａ、４ｂ　　　リザーバブロック
　　８　　　リザーバ
　１０　　　ノズル接続部
　１２　　　キャピラリユニット設置部
　１５　　　検出部
　１６、３１ａ、３３　　　電極
　２２　　　分離媒体充填機構
　２４　　　分注撹拌機構
　２６　　　移動ステージ
　２７　　　ステージ駆動機構
　２８　　　サンプルチューブ
　２９　　　サンプルインジェクションウエル
　３０　　　バッファリザーバ
　３６　　　分離媒体充填機構駆動部
　３８　　　分注撹拌機構駆動部
　４４　　　電圧印加部
　４６　　　制御部
　４７　　　分析条件設定部
　４９　　　サンプル混合部
　５１　　　希釈部
　５３　　　洗浄部

Claims

　少なくともサンプル注入端が垂直方向の下側を向くように配置されたキャピラリと、
　上方が開口した複数の容器からなり、そのうちの少なくとも２つの容器には互いに異なるサンプルが収容されたサンプル容器群と、
　上方が開口したサンプルインジェクションウエルと、
　上方が開口した容器にバッファ液を収容したバッファ容器と、
　前記サンプル容器内の位置及び前記サンプルインジェクションウエル内の位置に移動するように支持されているノズル、及び該ノズルにつながる吸引吐出機構を備えて前記ノズルによる液の吸引と吐出を行う分注攪拌機構と、
　前記キャピラリのサンプル注入端の下方に配置され、前記サンプルインジェクションウエル及び前記バッファ容器を支持する支持部材、並びに調製されて前記前記サンプルインジェクションウエルにあるサンプル溶液及び前記バッファ容器内のバッファ液を前記キャピラリのサンプル注入端に接触させるように前記支持部材を水平方向と垂直方向に移動させる駆動機構を備えた移動ステージと、
　前記キャピラリのサンプル注入端とその反対側の端部との間にサンプル注入電圧及び泳動電圧を印加する電源装置と、
　前記駆動機構及び前記電源装置の動作を制御する制御部と、
　前記キャピラリにより電気泳動分離されたサンプルを複数波長で検出する検出器と、
を備え、
　前記制御部は、前記サンプル容器群のうちのサンプルを収容した少なくとも２つのサンプル容器からのサンプルを前記サンプルインジェクションウエルに注入して前記サンプル溶液を調製するように前記分注攪拌機構の動作を制御するサンプル混合部を備えている電気泳動装置。
　分離媒体充填ノズルにより分離媒体を供給する分離媒体充填機構をさらに備え、
　前記キャピラリは垂直方向に延びるように支持され、その上端に液を貯留できる凹部からなるリザーバを備え、前記リザーバとキャピラリの接続部分には前記分離媒体充填ノズルを液密を保って着脱可能に接続するノズル接続部を備えている請求項１に記載の電気泳動装置。
　前記サンプル混合部は、前記キャピラリによる電気泳動での分離能をデータとして保持しており、
　混合するサンプルの数が指定されると、前記サンプル容器群に収容されたサンプルの中から前記分離能により互いに分離できるサンプルを選択して、混合するサンプルを自動で指定するものである請求項１又は２に記載の電気泳動装置。
　希釈液を収容した希釈液容器をさらに備え、
　前記ノズルは前記希釈液容器内の位置にも移動するように支持されているか、又は前記希釈液容器内に前記吸引吐出機構を介して流路でつながっており、
　前記制御部は、予め設定された希釈条件により、又は前記検出器が検出したサンプルの検出強度により希釈条件を求めてその希釈条件により、前記希釈液容器内の希釈液を前記分注攪拌機構により前記サンプルインジェクションウエルに注入してサンプルを希釈するように前記分注攪拌機構の動作を制御する希釈部を備えている請求項１から３のいずれか一項に記載の電気泳動装置。
　前記サンプルインジェクションウエルは、底部が狭くなった漏斗状をなし、前記底部に固定された電極を備えている請求項１から４のいずれか一項に記載の電気泳動装置。
　前記サンプルインジェクションウエルは、洗浄することにより、異なるサンプルに対して繰返し使用することのできる洗浄再利用型である請求項１から５のいずれか一項に記載の電気泳動装置。
　前記サンプルインジェクションウエルは、前記移動ステージに着脱可能に取りつけられている請求項１から６のいずれか一項に記載の電気泳動装置。
　洗浄液を収容した洗浄液容器をさらに備え、
　前記分注攪拌機構のノズルは前記洗浄液容器内の位置にも移動するように支持されているか、又は前記洗浄液容器内に前記吸引吐出機構を介して流路でつながっており、
　前記制御部は、前記洗浄液容器内の洗浄液を前記分注攪拌機構により前記サンプルインジェクションウエルに注入して前記サンプルインジェクションウエルを洗浄するように前記分注攪拌機構の動作を制御する洗浄部を備えている請求項１から７のいずれか一項に記載の電気泳動装置。
　請求項１から８のいずれかに記載の電気泳動装置を用い、
　電気泳動分析直前に前記サンプルインジェクションウエルで複数のサンプルを混合することによりマルチプレックス分析を行う電気泳動分析方法。
　前記サンプル容器群のうちの少なくとも１つのサンプル容器には反応試薬を収容しておき、
　電気泳動分析直前に前記サンプルインジェクションウエルで複数のサンプルと反応試薬を混合する請求項９に記載の電気泳動分析方法。
　用いる電気泳動装置は請求項４に記載の電気泳動装置であり、
　分析結果に応じて、サンプル希釈を行い再分析行う請求項９に記載の電気泳動分析方法。