WO2017141362A1 - 分析装置 - Google Patents

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WO2017141362A1
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flow
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宏一 加藤
達也 山下
隼司 石塚
智広 庄司
智也 桜井
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株式会社 日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention relates to an analyzer. More specifically, the present invention relates to a method for supplying a reagent to a flow cell and a nucleic acid sequence analyzer for decoding the base sequence of a nucleic acid such as DNA or RNA.
  • SBS® Sequencing® By® Synthesis
  • SBS uses four types of nucleotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) labeled with four different fluorescent dyes sequentially in a micro reaction field formed on a substrate, that is, using a base-by-base polymerase. This is a method of capturing. After one base has been incorporated, the floating fluorescent nucleotide is removed by washing, and then fluorescence measurement is performed.
  • the reason why the second base does not extend is that a substance that inhibits the extension of the second base dye is bound to the first base fluorescent dye.
  • a step of cleaving the fluorescent dye and the elongation inhibiting substance from the base with the dissociation solution after the fluorescence measurement is essential. This step allows sequential continuation of the next base extension reaction. A sequential sequence becomes possible by sending the fluorescent nucleotide again into the flow cell and repeating the reaction.
  • Patent Document 1 reports that once the substrate surface is in a dry state, the subsequent chemical reaction can proceed smoothly.
  • an SBS reaction is performed using a fluorescently labeled nucleotide in a micro reaction field, but after taking in the fluorescent label, fluorescence measurement is performed with a microarray scanner. Therefore, drying is performed to remove the solution from the substrate. The fluorescence measurement for one base is performed. Thereafter, the SBS reaction for the second base is resumed by dropping the reagent onto the substrate. When the reaction of the second base is completed, the substrate is further dried, and the fluorescence signal of the second base is measured with a scanner. By repeating this, the fluorescence signal was acquired, and it was shown that the base sequence of the template DNA fixed to the micro reaction field can be accurately determined up to 26 bases.
  • Patent Document 2 describes a method for amplifying sample DNA on a substrate. More specifically, after fixing the DNA sample on the flow cell surface in the examples, the reagent in the flow cell is sucked with a vacuum pump to dry the flow cell flow path. Thereafter, the amplification reagent is injected into the flow cell, the reaction is allowed to proceed for a certain time at the optimum reaction temperature, and the amplification reagent is further aspirated with a vacuum pump. As described above, the amplification reaction on the flow cell substrate is achieved by repeating the flow cell surface a plurality of times. That is, it has been reported that the chemical reaction can proceed even in the amplification reaction through the process of drying the flow channel in the flow cell.
  • the conventional reagent replacement method in the next-generation sequencer required a reagent amount more than three times the flow channel volume in the flow cell in order to replace the reagent A in the flow cell with a new reagent B. For this reason, the consumption of the reagent increased and the cost was high.
  • An analyzer of the present invention includes a flow cell used for analyzing a sample, a sample container containing a sample, a reagent container containing a reagent, and a pressure generating mechanism for feeding the sample and the reagent to the flow cell through a flow path.
  • An air opening portion is provided on the upstream flow path.
  • the present invention can reduce reagent consumption and reagent cost. As a result, it is possible to reduce the size of the reagent kit and the apparatus.
  • the figure which shows the structure of the analyzer of this invention The figure which shows the structure of a flow cell periphery among the analyzers shown in FIG. The figure for demonstrating the step of liquid feeding to the flow cell shown in FIG.
  • the figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG. The figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG.
  • the figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG. The figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG.
  • the figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG. The figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG.
  • the figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG. The figure which shows the other variation of the structure of the flow cell periphery shown in FIG.
  • the reagent necessary for the next reaction is fed and injected into the flow cell in the flow cell.
  • a sequence method for improving the replacement efficiency and reducing the reagent amount will be described with reference to FIG.
  • a plurality of minute reaction fields 102 are arranged on the lower surface of the flow cell 101.
  • the flow cell 101 is fixed to the heat block 103.
  • a Peltier element 104 is disposed on the lower surface of the heat block 103 to control the temperature of the flow cell 101.
  • the temperature control range is 10 to 80 ° C.
  • the temperature control is necessary for temperature adjustment in chemical reactions such as primer binding as a reaction starting point in the microreaction field 102 on the flow cell 101, substrate uptake reaction using the primer as a scaffold, and cleavage of the protecting group of the reaction substrate.
  • a resistance temperature detector (not shown) is inserted in the heat block 103 as a temperature sensor and used for temperature control feedback.
  • the heat sink 106 that comes into contact with the Peltier element 104 through the heat conductive sheet 105 radiates heat generated by driving the Peltier element 104. Heat dissipation of the heat sink 106 is achieved by blowing air to the heat sink 106 using a fan.
  • the flow cell 101 is held by an XY stage 107, and the flow cell 101 can be moved horizontally in a plane where the optical axis of the objective lens 130 is vertically incident.
  • the objective lens 130 is fixed to the Z stage 131 and can be moved up and down to focus on a plurality of minute reaction fields 102 fixed to the surface of the flow cell 101.
  • the objective lens 130 is usually an air gap, but it is also possible to adopt an immersion method in which pure water or oil is filled between the flow cell 101 and the objective lens 130 in order to achieve higher resolution.
  • Reagents for primer hybridization, extension reagents containing 4 types of fluorescent nucleotides, cleavage reagents for dissociating fluorescent nucleotide protecting groups, preventing unnecessary reaction of reactive groups after cleaving the protecting groups A cap reagent, a cleaning reagent, and the like are arranged and injected into the reagent cartridge 112 in advance.
  • the reagent cartridge 112 is installed in the reagent rack 111 and cooled to about 4 ° C.
  • the Peltier element 118 cools the heat block 114 installed in the reagent cartridge 112, and the fan 115 blows air in the reagent rack 111 to the fins 113.
  • the cooled air circulates in the reagent rack 111 and indirectly cools the plurality of reagents installed in the reagent cartridge 112 to 4 ° C.
  • the sipper tube is inserted to the bottom of each reagent well held in the reagent cartridge 112. It becomes possible to suck the reagent from the tips of these sipper tubes.
  • the sipper tube is connected to the switching valve 116.
  • An arbitrary reagent can be connected to the channel 117 by selecting with the switching valve 116.
  • the reagent selected by the switching valve 116 is sent through the flow path 117 to the flow cell 101 that holds the micro reaction field 102.
  • a syringe pump 126 serving as a power source for sucking the reagent is disposed downstream of the flow cell 101.
  • a three-way valve 122 is disposed upstream of the syringe pump 126 and a two-way valve 125 is disposed downstream.
  • the three-way valve 122 is controlled to connect the flow cell 101 and the syringe pump 126, and the two-way valve 125 is closed to drive the syringe pump 126.
  • the syringe pump 126 is driven with the three-way valve 122 closed and the 125 opened, and the reagent is fed to the waste liquid tank 127. With this operation, a plurality of reagents can be fed with one syringe pump 126. Further, if the waste liquid tank 127 is not provided, the waste liquid may spill into the apparatus cabinet, which may cause problems such as electric shock, rust of the apparatus, and generation of a strange odor.
  • a micro photo sensor 129 that monitors the presence or absence of the waste liquid tank 127 is installed.
  • a liquid receiving tray 128 is installed below the waste liquid tank 127 in case the liquid waste leaks.
  • DNA chain elongation reaction is performed by reacting 4 types of nucleotides labeled with different fluorescent dyes and a polymerase in a flow cell.
  • Each nucleotide is FAM-dCTP, Cy3-dATP, Texas Red -dGTP, and Cy5-dTTP.
  • the concentration of each nucleotide is 200 nM. Further, the salt concentration, the magnesium concentration and the pH of the reaction solution are optimized so that the extension reaction can be performed efficiently.
  • the reaction solution contains a polymerase, and only one base of fluorescent nucleotide complementary to the DNA fragment is incorporated. The extension of the second base does not occur because a substance that inhibits the extension of the second base dye is bound to the first base fluorescent dye.
  • the floating fluorescent nucleotide is removed by washing, and then fluorescence measurement is performed.
  • a step of cleaving the fluorescent dye from the base and a step of cleaving the elongation inhibitor are essential. These steps enable the sequential continuation of the next base extension reaction.
  • the reaction method employed in this example is called “SequencenBy Synthesis”.
  • the two LEDs 132 and 133 are light sources for exciting the fluorescent dye.
  • the central wavelengths of the LEDs 132 and 133 are 490 and 595 nm, respectively.
  • the LED 132 is used to irradiate FAM-dCTP and Cy3-dATP
  • the LED 133 is used to irradiate Texas Red -dGTP and Cy5-dTTP.
  • the dichroic mirror 134 serves to align the light from the LEDs 132 and 133 on the same optical axis. Further, the excitation light is made incident on the pupil plane of the objective lens 130 by the dichroic mirror 135. Excitation light is applied to the minute reaction field 102 in the flow cell 101 through the objective lens 130.
  • the fluorescent dye taken into the minute reaction field 102 is excited and emits isotropically.
  • a portion of the fluorescence emitted isotropically is collected by the objective lens 130.
  • the light passing through the objective lens 130 becomes parallel light, passes through the dichroic mirror 135 and the emission filter 136, and goes straight to the dichroic mirror 137. Since the dichroic mirror 137 has gentle reflection characteristics in the four color fluorescence wavelength regions, the fluorescence is divided into transmitted light and reflected light at different ratios depending on the fluorescence wavelength of the dye.
  • the fluorescence transmitted through the dichroic mirror 137 passes through a condenser lens 138 and forms an image of a minute reaction field on the sensor surface of the CMOS camera 139.
  • the fluorescence reflected from the dichroic mirror 137 passes through the condenser lens 140 and forms an image of a minute reaction field on the sensor surface of the CMOS camera 141.
  • the area that can be observed by acquiring a single fluorescence image is a part of the region with the minute reaction field on the flow cell 101, and is specifically only 1 mm square at most.
  • This is a restriction derived from the number of fields of view of the objective lens and also a restriction on the number of minute reaction fields that can be measured for one imaging. Therefore, the XY stage 107 is used to observe a wider flow cell 101 region.
  • the flow cell 101 is moved in a plane direction perpendicular to the optical axis of the objective lens 130, for example, at a pitch of 1 mm. Fluorescence detection is performed again for a field of view 1 mm away, and this is repeated for adjacent fields of view to scan the entire flow cell 101.
  • fluorescence information that is, base sequence information
  • the flow cell 101 is subjected to an extension reaction for the next one base.
  • the fluorescent dye in the microreaction field 102 in the flow cell 101 is cut with a cutting reagent, the inside of the flow cell is washed with a washing solution, and then a reagent containing fluorescent nucleotides and polymerase is again fed into the flow cell.
  • fluorescence measurement is performed again on the entire flow cell 101.
  • a bypass flow for selectively collecting and discarding only the reagent in the flow cell 101 without affecting the arrangement / arrangement of the already sent reagent in the tube of the reagent feeding system.
  • paths 152 and 153 There are paths 152 and 153.
  • three-way valves 121 and 122 are disposed at the intersections between the bypass flow path and the conventional reagent feeding system. The three-way valves 121 and 122 are located upstream and downstream of the flow cell 101.
  • a vacuum pump 156 is connected downstream of the bypass channel 153 and operates when it is desired to replace the reagent in the flow cell 101 channel with gas.
  • a filter 151 is installed on the upstream side of the bypass channel 152 in order to prevent suction of foreign substances in the gas. The reagent is discarded into the waste liquid tank 157 sucked by the vacuum pump 156.
  • a micro photo sensor 159 and a liquid receiving tray 158 are installed in the bypass channel 156 in order to prevent liquid leakage.
  • the plurality of reagents 301 are connected to the switching valve 302 via the sipper tube 321.
  • the switching valve 302 is connected to the flow cell 304 via the flow path 303 and further connected to the downstream flow path 311.
  • the flow path 311 is connected to the syringe pump 305 and wastes the used reagent to the waste liquid tank 308.
  • the air release tube 310 is for sandwiching segmented air for preventing contamination between reagents generated by direct contact of different reagents.
  • the syringe pump in order to suck the reagent 301 into the flow cell 304 using the syringe pump 305, the syringe pump is closed in a state where the two-way valve 307 is closed and the three-way valve 306 is operated to connect the flow path 304 and the flow path 311. Negative pressure is generated by operating 305.
  • the three-way valve 306 is closed, the syringe pump 305 is driven with the two-way valve 307 opened, and the reagent is discarded by generating a positive pressure. Can be realized.
  • a three-way valve 309 is newly arranged upstream in the vicinity of the flow cell 304.
  • bypass channels 314 and 315 are connected to the two three-way valves 309 and 306, and a bypass channel is arranged separately from the channel used for the conventional liquid feeding, and only the reagent that fills the flow cell 304 by using this bypass channel is used. Can be selectively replaced with gas.
  • a dust-proof filter is attached to the open end of the bypass channel 314 to the atmosphere. As a result, it is possible to prevent foreign matter from entering the flow cell 304.
  • reagent A 406, reagent B 402, and reagent C 405 are arranged in the tube and flow cell 401 flow path via segmented air 403 and 404.
  • Liquid feeding is performed such that the segmented air 403 and 404 are arranged on the three-way valves 409 and 406 when the reagent B 402 fills the flow path in the flow cell 401.
  • the three-way valves 409 and 406 are connected to bypass channels 414 and 415 in addition to a channel for performing normal liquid feeding, respectively.
  • the upstream flow path and the downstream flow path of the flow cell 401 connected to the liquid supply flow path in which the reagent C405 and the reagent A406 are present are bypassed. Connect to paths 414 and 415.
  • the reagent B402 in the flow cell 401 is aspirated, and the reagent B is collected and discarded.
  • the flow path in the flow cell 401 is completely replaced with air.
  • the liquid suction speed of the vacuum pump used at this time is about 4000 uL / sec.
  • the three-way valves 409 and 406 are connected again to the liquid supply flow path in which the reagent C405 and the reagent A406 are present.
  • the reagent A406 and the reagent C405 are aspirated using the syringe pump 305 downstream of the liquid supply flow path.
  • the reagent C405 enters the completely dried flow cell 401 and fills the flow cell 401 without chewing bubbles.
  • contamination of the reagent B402 with the reagent C405 does not occur. Conventional reagent replacement in a flow cell has caused contact between the liquid and the liquid.
  • the effect of reducing the reagent consumption gradually approaches 1/4.
  • a bypass flow path is provided in the vicinity of the flow cell flow path described in the present embodiment, and only the reagent in the flow cell flow path can be selectively replaced with gas, the reagent replacement on the flow cell surface proceeds. It is possible to replace the difficult reagent on the surface of the flow cell with gas. Thereafter, the reagent necessary for the next reaction may be sent again substantially in the amount of the liquid in the flow cell. As a result, the amount of reagent necessary for reagent replacement can be reduced.
  • the suction by the vacuum pump is less than 35 KPa in consideration of damage to the chemical modification of the surface.
  • a pressure generator is placed upstream of the flow cell flow path and positive pressure is applied to the flow cell flow path, the reagent in the flow cell flow path breaks and remains in the flow cell flow path surface as a droplet. Problems can also arise.
  • the dry state in the flow cell channel can be monitored and confirmed with an optical detection system via an objective lens. Specifically, this can be confirmed by a scattered image of the remaining reagent.
  • the fluorescent dyes with different excitation and detection wavelengths from the four kinds of fluorescent dyes used for sequencing are dissolved in the reagent in advance, so that the reagent can be replaced with gas more reliably on the flow cell.
  • the state can be monitored. Further, the temperature of the heat block for fixing the flow cell can be heated within the range of 35 to 65 ° C. in order to accelerate the drying of the reagent.
  • a switching valve is arranged upstream in the vicinity of the flow cell to form a bypass flow path, and a conventional syringe pump arranged for reagent feeding is used downstream thereof.
  • the plurality of reagents 501 are connected to the switching valve 502 via the sipper tube 509.
  • the switching valve 502 is connected to the flow cell 504 via the flow path 503 and further connected to the downstream flow path 511.
  • the flow path 511 is connected to the syringe pump 505 to waste the used reagent into the waste liquid tank 508.
  • the air release tube 521 is for sandwiching segmented air for preventing contamination between reagents generated by direct contact of different reagents.
  • the two-way valve 507 is closed, the two-way valve 506 is opened, and the three-way valve 509 connects the flow path 503 to the flow cell 504 flow path.
  • the negative pressure is generated by operating the syringe pump 505.
  • the two-way valve 506 is closed, the two-way valve 507 is opened, and a positive pressure is generated by the syringe pump 505, so that the reagent is discarded. be able to.
  • the three-way valve 509 is disposed in the vicinity of the flow cell 504, and can be freely switched by connecting a normal liquid supply flow path 503 and a bypass flow path 514.
  • the expensive reagent A is filled in the flow cell 504 flow path.
  • the expensive reagent B stays in the flow path 503 through the reagent A and segmented air.
  • the upstream of the flow cell 504 can be opened to the atmosphere.
  • the two-way valves 506 and 507 are opened and the syringe pump 505 is sucked, whereby the reagent A in the flow cell 504 can be replaced with gas, specifically air.
  • the three-way valve 509 is switched to connect the flow channel for liquid feeding 503 and the flow channel in the flow cell 504, and the syringe pump is further driven to connect the reagent to the flow channel in the flow cell 504. B can be introduced.
  • the reagent B Since the reagent A in the micro reaction field on the bottom surface of the flow cell 504 is completely replaced with air, the reagent B has a form that eliminates factors that hinder the reaction such as contamination with the reagent A and a decrease in the concentration of the reagent B. Thus, the reagent B can be supplied into the flow cell 504. A notable effect is that the amount of reagent B can be reduced by adding the amount of reagent B supplied to the solution holding volume in the flow cell 504 flow path by adding the liquid feeding error amount of the apparatus. In the conventional method, since the reagent in the flow cell 504 behaves as a laminar flow, the replacement of the reagent A and the reagent B does not proceed smoothly.
  • the liquid feed error amount ⁇ 2 + the reagent amount in the flow cell 504 and the reagent holding volume ⁇ 1 is the conventional feature described in the second embodiment.
  • the amount of reagent can be reduced with a simple and inexpensive apparatus configuration in which the three-way valve 509, the bypass channel 514, and the dustproof filter 510 are added to the above configuration.
  • a bypass channel is formed, and a syringe pump is arranged downstream thereof, thereby improving reagent replacement efficiency.
  • This embodiment has a configuration similar to the device configuration described in FIG. Specifically, a vacuum pump is employed in the second embodiment for the pressure generating device disposed downstream of the bypass passage, whereas a syringe pump 615 is employed in the present embodiment (FIG. 5). More specifically, the plurality of reagents 601 are connected to the switching valve 602 via the sipper tube 609. The switching valve 602 is connected to the flow cell 604 via the flow path 603 and further connected to the downstream flow path 611. The flow path 611 is connected to the syringe pump 605 and wastes the used reagent to the waste liquid tank 608.
  • the air release tube 621 is for sandwiching segmental air for preventing contamination between reagents generated by direct contact of different reagents.
  • the syringe pump 605 is operated with the two-way valve 607 opened and the three-way valve 606 connected to the flow channel in the flow cell 604. Generate negative pressure.
  • the three-way valve 606 is closed, the two-way valve 607 is opened, and a positive pressure is generated by the syringe pump 305 to realize the discard of the reagent. Can do.
  • the three-way valve 609 is operated to connect the bypass channel 614 and the channel in the flow cell 604.
  • the three-way valve 606 is operated to connect the flow path in the flow cell 604 and the bypass flow path 616.
  • the flow path in the flow cell 604 is replaced with air and becomes dry.
  • the filter 610 since air is sucked through the filter 610, foreign substances floating in the air are not mixed into the flow cell 604.
  • the three-way valves 609 and 606 are operated to connect the flow path 603 and the flow cell 604 flow path, and the flow cell 604 flow path and the flow path 611, respectively.
  • the syringe pump 605 By driving the syringe pump 605 with the two-way valve 607 closed, the reagent already arranged in the flow channel 603 can be sucked into the flow channel in the flow cell 604 that has become dry. Since no reagent remains on the surface of the flow cell 604 that is in a dry state, the replacement of the reagent can be performed efficiently.
  • a bypass flow path is formed, and a vacuum pump is arranged upstream thereof to improve reagent replacement efficiency.
  • This embodiment has a configuration similar to the device configuration described in FIG. Specifically, in Example 2, the vacuum pump is disposed downstream of the bypass flow path, but in this embodiment, the vacuum pump is disposed upstream of the bypass flow path.
  • a plurality of reagents 701 are connected to a switching valve 702 via a sipper tube 709.
  • the switching valve 702 is connected to the flow cell 704 via the flow path 703 and further connected to the downstream flow path 711.
  • the flow path 711 is connected to the syringe pump 705 and wastes the used reagent to the waste liquid tank 708.
  • the air release tube 721 is for sandwiching segmental air for preventing contamination between reagents generated by direct contact of different reagents between the reagents.
  • the two-way valve 707 is closed and the three-way valve 706 is operated to connect the flow path 704 and the flow path 711 together, and similarly the three-way valve 709. Is operated to connect the channel 703 and the channel in the flow cell 704, and the syringe pump 705 is operated to generate a negative pressure.
  • the three-way valve 706 is closed, the two-way valve 707 is opened, and the positive pressure is generated by the syringe pump 705 to realize the disposal of the reagent. Can do.
  • the three-way valve 709 is disposed in the vicinity of the flow cell 704, and can be freely switched by connecting a normal liquid feeding flow path 703 and a bypass flow path 714.
  • the three-way valve 706 is disposed in the vicinity of the flow cell 704, and can operate the connection between the normal flow cell 704 flow path and the liquid supply flow path 711 or the bypass flow path 716.
  • the expensive reagent A is filled in the flow cell 704 flow path.
  • the expensive reagent B stays in the flow path 703 through the reagent A and segmented air.
  • the upstream of the flow cell 704 can be opened to the atmosphere by operating the three-way valve 709 to connect the flow path in the flow cell 704 and the bypass flow path 714.
  • the three-way valve 706 is operated to connect the flow path in the flow cell 704 and the bypass flow path 716.
  • the three-way stool 709, 706 is switched to connect the flow channel for liquid supply 703, the flow channel in the flow cell 704, the flow channel 711, and the flow channel in the flow cell 704, and the syringe pump 705.
  • the reagent B can be introduced into the flow channel in the flow cell 704. Since the reagent A in the micro reaction field on the bottom surface of the flow cell 704 is completely replaced with air, the reagent B has a form that eliminates factors that hinder the reaction such as contamination with the reagent A and a decrease in the concentration of the reagent B. Thus, the reagent B can be supplied into the flow cell 704 flow path.
  • a notable effect is that the amount of reagent B can be reduced to the amount that the amount of reagent B supplied is equal to the solution holding volume in the flow path of the flow cell 704 plus the liquid feeding error amount of the apparatus.
  • the reagent in the flow cell 704 behaves as a laminar flow, the replacement of the reagent A and the reagent B does not proceed smoothly.
  • a bypass channel is formed, and a syringe pump is arranged upstream thereof to improve reagent replacement efficiency.
  • This embodiment has a configuration similar to the device configuration described in FIG. Specifically, in Example 2, a vacuum pump is disposed downstream of the bypass flow path, but in this embodiment, a syringe pump is disposed upstream of the bypass flow path.
  • the reagent in the flow channel in the flow cell 804 is selectively replaced with air, and the reagent disposed in the flow channel 803 is sent to the flow channel in the flow cell 804, so that in the flow cell 804 flow channel Reagent replacement can be performed with a smaller amount of reagent.
  • a switching valve is arranged upstream and downstream in the vicinity of the flow cell to form a bypass flow path, and a vacuum pump is arranged upstream thereof to improve reagent replacement efficiency.
  • This embodiment has a configuration similar to the device configuration described in FIG. Specifically, although the pressure generating mechanism is not disposed in the upstream bypass flow path in the third embodiment, the three-way valve 909 and the two-way valve 906 are disposed in the vicinity of the flow cell 904 in the present embodiment. Further, a bypass flow path 912 connected to the three-way valve 909 and a vacuum pump 910 are disposed upstream of the bypass flow path 912. This realizes a configuration in which the reagent in the flow channel in the flow cell 904 can be positively replaced with gas.
  • a switching valve is arranged upstream and downstream in the vicinity of the flow cell to form a bypass flow path, and a vacuum pump is arranged downstream thereof to improve reagent replacement efficiency.
  • This embodiment has a configuration similar to the device configuration described in FIG. Specifically, in the second embodiment, the type of reagent to be sucked into the flow path 303 is determined by immersing the sipper tube 209 in the reagent 201 and driving the switching valve 309. In the present embodiment, instead of this, a method of sucking and feeding the reagent by the nozzle 1021 is adopted.
  • the reagent cartridge 1001 has a structure that can hold a plurality of reagents 1002.
  • the reagent cartridge 1001 has a plurality of reagents 1002 arranged in the circumferential direction, and can be rotated in the circumferential direction by a motor.
  • the nozzle 1021 can be driven in the Z direction by a motor. Therefore, the nozzle 1021 can access a plurality of different reagents 1002, and can suck and feed any reagent 1002 to the channel 1022 via the syringe pump 1005 downstream of the channel.
  • segmented air can be sandwiched between the reagents in order to avoid contact between the different reagents 1002 in the flow path 1022 during liquid feeding. More specifically, an arbitrary amount of air is sucked in a state where the nozzle 1021 is held in the air, and then a different reagent 1002 is sucked. Thereby, the liquid feeding function similar to Example 2 is realizable with the structure of a present Example.
  • the flow path 1022 after the nozzle 1021 is connected to the flow path in the flow cell 1004 in the same manner as the apparatus described in FIG.
  • the flow path in the flow cell 1004 is further connected to the downstream flow path 1021.
  • the channel 1021 can be connected to a syringe pump 1005 to drain the used reagent 1002 to the waste liquid tank 1008.
  • the nozzle 1021 is brought into contact with the reagent 1002 and the three-way valve 1009 is driven to connect the channel 1022 and the channel in the flow cell 1004.
  • the three-way valve 1006 is further driven to connect the flow path in the flow cell 1004 and the flow path 1021, and the two-way valve 1007 is closed.
  • the reagent 1002 can be aspirated by generating a negative pressure by operating the syringe pump 1005.
  • the used reagent 1002 is generated by generating a positive pressure with the syringe pump 1005 while the three-way valve 1006 is closed and the two-way valve 1007 is opened. Disposal of 1002 can be realized.
  • the following method is used. That is, the reagent in the flow cell 1004 is separated from the adjacent reagent by segmental air.
  • the segmental air adjacent to both ends of the reagent stays in the three-way valve 1009 and the three-way valve 1006, which are branch points of the flow path, respectively.
  • the three-way valve 1009 is driven to connect the bypass flow path 1014 and the flow cell 1004 flow path
  • the three-way valve 1006 is driven to connect the bypass flow path 1013 and the flow cell 1004 flow path.
  • the three-way valve 1009 is driven to reconnect the flow path 1022 and the flow path in the flow cell 1004, and the three-way valve 1006 is further driven to reconnect the flow path 1021 and the flow cell 1004 in the flow cell 1004.
  • a new reagent can be introduce
  • the new reagent eliminates factors that hinder the reaction, such as contamination with the previous reagent or a decrease in the concentration of the new reagent. It becomes possible to supply a new reagent into the flow cell 1004 flow path.
  • a notable effect is that the amount of new reagent can be reduced by adding a new reagent supply amount to the solution holding volume in the flow cell 1004 flow path and adding the liquid feeding error amount of the apparatus.
  • the reagent in the flow cell 1004 behaves as a laminar flow, the replacement of the old reagent and the new reagent does not proceed smoothly.
  • an automatic immune analyzer detects an antigen in a biological sample by utilizing an antigen / antibody reaction.
  • an antigen / antibody reaction For example, in a small reaction vessel, a labeled solid such as a fluorescent molecule or complex is reacted with the antigen in the sample, and a magnetic particle suspension of micrometer order is added and mixed to hold the reaction product on the particle surface. To do. Next, the reaction liquid is sucked into the detection flow path, a magnet is brought close to the flow cell provided in the middle of the flow path, and the particles at the detection position on the inner surface of the flow cell are washed out and discharged to the waste liquid tank on the downstream side.
  • reagent replacement in the flow cell requires a reagent amount more than three times the flow cell capacity, but the bypass channel described in this embodiment is provided to selectively select the reagent in the flow cell. By substituting, the amount of reagent can be reduced.
  • a reagent is directly injected into a flow cell by a direct injection method using a nozzle, a switching valve is disposed downstream of the flow cell, a bypass flow path is formed, and a vacuum is formed downstream of the flow path.
  • the reagent cartridge 1301 has a structure that can hold a plurality of reagents 1302.
  • the reagent cartridge 1301 has a plurality of reagents 1302 arranged in the circumferential direction thereof, and can be rotated in the circumferential direction by a motor.
  • the direct injection method is adopted.
  • the direct injection method is a method of injecting the reagent 1302 into the flow cell 1304 flow path by inserting the nozzle 1321 directly into the reagent injection port 1310 of the flow cell 1304.
  • the nozzle 1321 can be driven in the vertical direction by a motor.
  • the nozzle 1321 can be moved in the horizontal direction by the rotation mechanism 1314.
  • the nozzle 1321 moves between the reagent 1302 of the reagent cartridge 1301 and the inlet 1310 of the flow cell 1304, so that an arbitrary reagent 1302 can be injected into the inlet 1310 of the flow cell 1303. Further, when aspirating the reagent 1302 having a different composition, there is a concern about the occurrence of contamination that brings the reagent 1302 attached to the outer wall of the nozzle 1321 into the different reagent 1302.
  • the reagent 1302 can be aspirated and discharged by the nozzle 1321 by operating the two-way valve 1323 to be opened and closed.
  • the syringe pump 1305 is connected to a flow path 1322 that is driven by the pump 1309 to continuously circulate system water. Since the nozzle flow path can be filled with pure water by using the system water, it is possible to eliminate the influence of the damper due to the gas that is an elastic body and achieve high suction accuracy and suction reproducibility. Further, the inside of the nozzle can be easily cleaned, and contamination that may occur when the reagent 1302 is aspirated can be prevented.
  • the reagent 1302 inserted into the flow cell 1304 is discarded into the flow channel 1316 or the flow channel 1307 according to the reagent cost.
  • the three-way valve 1306 is operated to connect the flow cell internal channel 1304 and the channel 1316.
  • the vacuum pump 1311 By driving the vacuum pump 1311 in this state, the reagent 1302 filling the flow channel 1304 can be selectively replaced with air.
  • the flow path 1304 and the flow path 1307 are connected using the three-way valve 1306.
  • a reagent that is less expensive than the nozzle 1321 can be injected from the injection port 1310 to achieve reagent replacement in the flow channel in the flow cell 1304.
  • the discharge speed of the nozzle 1321 is at most 10 uL / sec, whereas the liquid and gas suction speed of the vacuum pump 1311 is about 4000 uL / sec.
  • the reagent replacement via the vacuum pump 1316 is faster than the nozzle 1321, and the surface of the flow cell 1304 can be further completely dried without any residue such as droplets. Can be achieved. That is, by using the vacuum pump 1316, it is possible to reduce reagent consumption, particularly consumption of expensive reagents.
  • the particularly effective point of this embodiment is that it is possible to avoid contamination of a trace amount sample adhering to the flow channel upstream of the flow cell 1304.
  • sample DNA is fed onto the flow cell 1304 via a flow path such as a tube and the amplification reaction is performed on the flow cell 1304, there is a problem that the sample DNA is adsorbed on the wall surface of the flow path.
  • liquid is fed into the flow cell 1304 flow path as a contamination and amplified, resulting in serious noise.
  • protocols have been developed to remove this by channel cleaning for each measurement, this problem still plagues the measurer as a serious problem.
  • the flow path to the flow cell becomes at least 300 mm or longer. Further, it is necessary to insert the sipper tube into the sample DNA solution during the measurement time. However, since this is a consumable part and it is difficult to replace each measurement, it is a cause of contamination.
  • the sample is fed only through a short flow path system in the vicinity of the nozzle 1321, contamination can be suppressed to an extremely low level.
  • contamination can be kept extremely low.
  • the nozzle is made of metal, so that higher strength cleaning, such as stronger alkali cleaning, is applied when cleaning at the end of measurement. can do.
  • a switching valve is disposed upstream and downstream in the vicinity of the flow cell, a bypass flow path capable of circulating the flow cell flow path and the reagent is formed, and a syringe pump is disposed downstream.
  • the present embodiment has a configuration similar to the apparatus configuration described in FIG. As shown in FIG. 11, the characteristic point of this embodiment is that a bypass flow path capable of circulating the reagent is formed with respect to the flow path in the flow cell 1106.
  • This circulation bypass flow path is composed of flow paths 1122, 1118, 1123.
  • This circulation bypass channel is used not only to selectively discard the reagent once the reaction is completed in the flow cell 1106 but also to reuse it.
  • the reagent shown in gray in FIG. 12A (a) completes the reaction to the micro reaction field in the flow channel 1251.
  • the concentrations of the reaction components contained in the reagent specifically, four types of fluorescent nucleotides, a polymerase that is an enzyme that promotes base elongation, or a polymerase, primer, nucleotide, etc. required for the amplification reaction, More than 99% is retained after the reaction.
  • the three-way valve 1221 connects the flow path in the flow cell 1251 and the flow path 1228, and the three-way valve 1222 connects the flow paths 1228 and 1229.
  • the two-way valve 1211 is in a closed state.
  • the syringe pump 1212 is sucked in FIG. 12A (b). Then, the reagent moves into the flow path 1229 due to the generated negative pressure.
  • the three-way valve 1222 is operated to connect the flow path 1229 and the flow path 1226. Further, the three-way valve 1223 is operated to connect the flow path 1225 and the flow path 1226.
  • the channel 1225 is open to the atmosphere, and thus air can flow in through the channel 1225.
  • the three-way valve 1223 is operated to connect the flow path 1226 and the flow path 1227.
  • the flow path 1227 and the flow path in the flow cell 1251 are connected via the three-way valve 1224.
  • the three-way valve 1221 is operated to connect the flow cell 1251 internal flow path and the flow path 1252.
  • the two-way valve 1210 is closed.
  • the reagent can be reused by following the procedure of FIG. 12B (d). This reuse can in principle be repeated until the substrate concentration is reduced below a certain standard. By using this method, the consumption of the reagent can be reduced.
  • the three-way valve 1224 is operated as shown in FIG. 12B (e) to connect the conventional liquid feeding flow path 1253 and the flow path in the flow cell 1251. Furthermore, the syringe pump 1212 is sucked in a state where the flow channel 1251 internal flow path and the flow path 1252 are connected. As a result, the reagent can be sucked into the flow path 1252 and a new reagent similarly shown in black can be introduced into the flow cell 1251 flow path.

Abstract

次世代シーケンサにおける従来の溶液交換方法はフローセル内の試薬Aを新たな試薬Bに置換して、効率よく化学反応を進行させるためにフローセル内流路体積の４倍以上の試薬量を必要としている。このため試薬の消費量が増加し、高コストであった。これに対して、本発明の分析装置は、試料の分析に用いるフローセルと、試料を含む試料容器と、試薬を含む試薬容器と、試料及び試薬を流路を介してフローセルへ送液する圧力発生機構を備え、フローセルの上流側の流路上に大気開放部を有している。

Description

分析装置
　本発明は分析装置に関わる。より具体的には、DNAあるいはRNAなどの核酸の塩基配列を解読するため試薬をフローセルに供給する方法および核酸配列解析装置に関わる。
　微小反応場を有するフローセル上で遂行されるケミストリにはさまざまな方式が採用されている。それらは、蛍光、pH、化学発光、あるいは電気計測などであるが、その中でも最も有力であるのが蛍光法を用いるSBS (Sequencing By Synthesis)と呼ばれる方式である。SBSは異なる４種類の蛍光色素でそれぞれ標識された4種類のヌクレオチド（dATP, dTTP, dCTP, dGTP）を、基板上に形成された微小反応場に逐次的に、すなわち1塩基ずつポリメラーゼを用いて取り込ませる方式である。1塩基が取り込まれた後、浮遊する蛍光ヌクレオチドを洗浄により除去した後、蛍光計測を行う。2塩基目の伸長が発生しないのは、1塩基目の蛍光色素に2塩基目の色素の伸長を阻害する物質が結合しているからである。なお、以降の最小ユニットの反応を行うために、蛍光計測後、解離溶液により塩基から蛍光色素および伸長阻害物質を切断する工程が必須である。この工程により、次の塩基伸長反応の逐次的継続が可能となる。再び蛍光ヌクレオチドをフローセル内に送液し、反応を繰り返すことにより、逐次的なシーケンスが可能となる。
　通常SBS反応過程では、微小反応場が多数配置されている基板表面がウェットな状態で化学反応を進行させる。しかし、基板表面をいったん乾燥状態にしても、その後の化学反応を円滑に進めることができることが特許文献１で報告されている。特許文献１では微小反応場に蛍光標識されたヌクレオチドを用いてSBS反応を行っているが、蛍光標識の取り込み後、マイクロアレイ用のスキャナで蛍光計測を行うため、基板から溶液を除去するために乾燥させ、1塩基分の蛍光計測を行っている。その後、再び2塩基目についてのSBS反応を基板に試薬を滴下することで再開している。2塩基目の反応が完了したところで、さらに基板を乾燥させ、2塩基目の蛍光信号をスキャナで計測している。これを繰り返すことで蛍光信号を取得し、それより微小反応場に固定された鋳型DNAの塩基配列を26塩基まで精度よく判定できることを示した。
　同様に基板上において微小反応場を増幅する工程においても、ウェットな状態であるフローセルの表面をいったん乾燥させても、後段の化学反応に関してなんら問題が発生しないことについて特許文献２に報告されている。特許文献２は基板上でサンプルＤＮＡを増幅する方法について記載している。より具体的には実施例の中でＤＮＡサンプルをフローセル表面に固定した後、フローセル内の試薬をバキュームポンプで吸引し、フローセル流内路を乾燥させる。その後増幅試薬をフローセルに注入し、至適反応温度で一定時間反応を進行させ、さらに増幅試薬をバキュームポンプで吸引する。上述したようにフローセル表面を複数回繰り返してフローセル基板上の増幅反応を達成している。すなわち増幅反応においてもフローセル内流路を乾燥させる工程を経ても、化学反応を進行できることについて報告している。
WO2008/069973 US2013/0225421
　次世代シーケンサにおける従来の試薬交換方法はフローセル内の試薬Aを新たな試薬Bに置換するために、フローセル内流路体積の3倍以上の試薬量を必要としていた。このため試薬の消費量が増加し、高コストであった。
　本発明の分析装置は、試料の分析に用いるフローセルと、試料を含む試料容器と、試薬を含む試薬容器と、試料及び試薬を流路を介してフローセルへ送液する圧力発生機構を備え、フローセルの上流側の流路上に大気開放部を有している。
　本発明により、試薬消費量および試薬コストを低減できる。結果として試薬キットおよび装置サイズを小さくできるという効果をもたらす。
本発明の分析装置の構成を示す図。 図１に示す分析装置のうちフローセル周辺の構成を示す図。 図２に示すフローセルへの送液のステップを説明するための図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図２に示すフローセル周辺の構成の他のバリエーションを示す図。 図１１に示すフローセルへの送液のステップを説明するための図。 図１１に示すフローセルへの送液のステップを説明するための図。
　本発明の第1の実施例として、フローセル内流路を満たす試薬を選択的に気体で置換した後、次の反応に必要となる試薬をフローセル内流路に送液・注入することにより、試薬置換効率を向上させ、試薬量を低減するシーケンス方法について図１を用いて説明する。
　フローセル１０１の下面には微小反応場１０２が複数配置されている。フローセル１０１はヒートブロック１０３に固定される。ヒートブロック１０３の下面にはペルチェ素子１０４が配置され、フローセル１０１の温調を行う。温度制御範囲は１０～８０℃である。温度制御はフローセル１０１上の微小反応場１０２における反応開始点となるプライマの結合、プライマを足場とした基質の取り込み反応、および反応基質の保護基の切断などの化学反応における温度調節に必要となる。ヒートブロック１０３内部には温度センサとして測温抵抗体（不図示）が挿入され、温度制御のフィードバックに使用される。ペルチェ素子１０４に熱伝導シート１０５を介して接触するヒートシンク１０６は、ペルチェ素子１０４の駆動に伴って発生した熱を放熱する。ヒートシンク１０６の放熱はヒートシンク１０６に対してファンを用いて空気を送風することにより達成される。さらにフローセル１０１はＸＹステージ１０７に保持されており、フローセル１０１を対物レンズ１３０の光軸が垂直に入射する面内について水平に移動することができる。対物レンズ１３０はＺステージ１３１に固定され、フローセル１０１表面に固定された複数の微小反応場１０２にフォーカスを合わせるために上下に移動することができる。対物レンズ１３０は通常エアーギャップであるが、より高い分解能を達成するためフローセル１０１と対物レンズ１３０の間に純水あるいは油を満たす液浸方式を採用することも可能である。
　プライマのハイブリダイゼーションを行うための試薬、4種類の蛍光ヌクレオチドを含んだ伸長試薬、蛍光ヌクレオチドの保護基を解離させるための切断試薬、保護基が切断された後の反応基の不要な反応を防止するためのキャップ試薬および洗浄試薬などが試薬カートリッジ１１２にあらかじめ配置・注入されている。試薬カートリッジ１１２は試薬ラック１１１に設置され、約４℃に冷却される。ペルチェ素子１１８は試薬カートリッジ１１２内に設置されたヒートブロック１１４を冷却し、ファン１１５は試薬ラック１１１庫内の空気をフィン１１３に送風する。冷却された空気は試薬ラック１１１庫内を循環し、間接的に試薬カートリッジ１１２内に設置された複数の試薬を４℃に冷却する。
　試薬カートリッジ１１２に保持されたそれぞれの試薬ウェルの底まで、シッパーチューブが挿入される。これらのシッパーチューブの先端より試薬を吸引することが可能となる。シッパーチューブは切り替えバルブ１１６に接続される。切り替えバルブ１１６で選択し、任意の試薬を流路１１７に接続することができる。切り替えバルブ１１６により選択された試薬は流路１１７を経て、微小反応場１０２を保持するフローセル１０１に送液される。試薬を吸引する動力源となるシリンジポンプ１２６はフローセル１０１下流に配置される。シリンジポンプ１２６の上流には三方弁１２２、下流には二方弁１２５が配置される。試薬の吸引を行うときは三方弁１２２を制御して、フローセル１０１流路とシリンジポンプ１２６間を接続させ、かつ二方弁１２５を閉状態にしてシリンジポンプ１２６を駆動させる。また、試薬を廃棄する場合、三方弁１２２を閉状態、１２５を開状態にしてシリンジポンプ１２６を駆動させ、試薬を廃液タンク１２７に送液する。この動作により、複数の試薬の送液を１つのシリンジポンプ１２６で行うことが可能となる。また、廃液タンク１２７がないと装置庫内に廃液がこぼれ、電気感電、装置の錆び、異臭の発生といった問題が発生する可能性がある。これを回避するためには廃液タンク１２７を装置内に配置することが必要であり、これを検知するために廃液タンク１２７の有無を監視するマイクロフォトセンサ１２９を設置する。さらに安全のため、廃液が漏れた場合のために廃液タンク１２７の下に液受けトレイ１２８を設置する。
　ＤＮＡ鎖の伸長反応はそれぞれ異なる蛍光色素でラベルされた４種類のヌクレオチドおよびポリメラーゼをフローセルで反応させることで行う。各ヌクレオチドはそれぞれ ＦＡＭ-ｄＣＴＰ, Ｃｙ３-ｄＡＴＰ, Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ -ｄＧＴＰ, Ｃｙ５-ｄＴＴＰである。各ヌクレオチドの濃度は２００ｎＭである。また、反応液は伸張反応が効率よく行なわれるように塩濃度、マグネシウム濃度およびｐＨが最適化されている。反応溶液中にはポリメラーゼが含まれており、ＤＮＡ断片に相補的な蛍光ヌクレオチドが１塩基だけ取り込まれる。2塩基目の伸長が発生しないのは、１塩基目の蛍光色素に2塩基目の色素の伸長を阻害する物質が結合しているからである。１塩基が取り込まれた後、浮遊する蛍光ヌクレオチドを洗浄により除去した後、蛍光計測を行う。なお、以降の最小ユニットの反応を行うために、蛍光計測後、解離溶液により塩基から蛍光色素を切断する工程および伸長阻害物質を切断する工程が必須である。これらの工程により、次の塩基伸長反応の逐次的継続が可能となる。再び蛍光ヌクレオチドをフローセル内に送液し、反応を繰り返すことにより、の逐次的なシーケンスが可能となる。本実施例で採用している反応方式はＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓと呼ばれる。
　２つのＬＥＤ１３２、１３３は蛍光色素を励起するための光源である。ＬＥＤ１３２、１３３の中央波長はそれぞれ４９０、５９５ｎｍである。ＬＥＤ１３２はＦＡＭ－ｄＣＴＰ, Ｃｙ3－ｄＡＴＰを、ＬＥＤ１３３はＴｅｘａｓ Ｒｅｄ -ｄＧＴＰ, Ｃｙ５-ｄＴＴＰの励起光照射に用いる。ダイクロイックミラー１３４はＬＥＤ１３２、１３３からの光を同一光軸上に揃える役割を持つ。さらにダイクロイックミラー１３５により励起光は対物レンズ１３０の瞳面に入射させられる。対物レンズ１３０を介して励起光はフローセル１０１内の微小反応場１０２に照射される。微小反応場１０２内に取り込まれた蛍光色素には励起され、等方的に蛍光を発する。等方的に発光した蛍光の一部分は対物レンズ１３０で集光される。対物レンズ１３０を経た光は平行光となり、ダイクロイックミラー１３５およびエミッションフィルタ１３６を通過し、ダイクロイックミラー１３７まで直進する。ダイクロイックミラー１３７は４色の蛍光波長領域について緩やかな反射特性を持つため、色素の蛍光波長に応じて異なる比率で蛍光が透過光と反射光に分割される。ダイクロイックミラー１３７を透過した蛍光は集光レンズ１３８を経てＣＭＯＳカメラ１３９のセンサ面に微小反応場の像を結ぶ。同様にダイクロイックミラー１３７を反射した蛍光は集光レンズ１４０を経てＣＭＯＳカメラ１４１のセンサ面に微小反応場の像を結ぶ。２つのＣＭＯＳカメラに結像する複数の微小反応場を対応付け、蛍光強度比を算出することにより、それぞれの微小反応場に取り込まれた蛍光色素が４色のいずれであるかを特定することが可能となる。
　また、一回の蛍光画像の取得で観察できる面積はフローセル１０１上の微小反応場がある領域の一部であり、具体的には高々１ｍｍ角に過ぎない。これは対物レンズの視野数に由来する制約であり、１回の撮像について計測できる微小反応場数の制約ともなる。このため、より広いフローセル１０１領域を観察するためにＸＹステージ１０７を用いる。フローセル１０１を対物レンズ１３０の光軸について垂直な面方向に、たとえば１ｍｍピッチで移動させる。１ｍｍ離れた視野について再度蛍光検出を行い、これを隣接した視野について繰り返し、フローセル１０１全域をスキャンできる。これにより多くの微小反応場について蛍光情報、つまり塩基配列情報を取得することができる。フローセル１０１全面について蛍光計測を行った後、フローセル１０１に次の一塩基分の伸長反応を行う。具体的にはフローセル１０１内における微小反応場１０２内の蛍光色素を切断試薬で切断し、洗浄液でフローセル内を洗浄した後、再度蛍光ヌクレオチドおよびポリメラーゼを含んだ試薬をフローセル内に送液する。化学反応を完了させた後に、再度フローセル１０１全面について蛍光計測を行う。これら化学反応と蛍光計測を必要な塩基分行うことで計測対象となるＤＮＡの大量の塩基配列解析を取得することが可能となる。
　ここまでの説明は蛍光検出を用いたシーケンス方法についてであるが、以下に本実施例の特徴である試薬の置換効率を向上し、試薬量を低減するための装置構成について説明する。より具体的には、試薬送液系のチューブ内のすでに送液した試薬の配置・配列に影響を与えずに、フローセル１０１流路内の試薬のみを選択的に回収・廃棄するためのバイパス流路１５２、１５３を有する。また、バイパス流路と従来の試薬送液系との交点に三方弁１２１、１２２を配置する。三方弁１２１、１２２はフローセル１０１の上流および下流に位置する。バイパス流路１５３の下流にはバキュームポンプ１５６が接続されており、フローセル１０１流路内の試薬を気体で置換したいときに稼働する。なお、バイパス流路１５２の上流側には、気体中の異物の吸引を防止するため、フィルタ１５１が設置される。バキュームポンプ１５６により吸引された廃液タンク１５７へ試薬を廃棄する。試薬送液系と同様に、バイパス流路１５６についても液漏れを防止するためにマイクロフォトセンサ１５９および液受けトレイ１５８を設置する。
　次に本発明の第２の実施例として、フローセル近傍の上流および下流に切り替えバルブを配置することで、バイパス流路を形成し、その下流にバキュームポンプを配置することで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図２および３を用いて説明する。
　複数の試薬３０１はシッパーチューブ３２１を介して切り替えバルブ３０２に接続している。切り替えバルブ３０２は流路３０３を介してフローセル３０４に接続し、さらに下流の流路３１１に接続する。流路３１１はシリンジポンプ３０５に接続し、廃液タンク３０８へと使用済みの試薬を廃液する。ここで大気開放チューブ３１０は、異なる試薬の直接接触により発生する試薬間のコンタミを防止するための分節空気を試薬間に挟むためのものである。ここでシリンジポンプ３０５を用いてフローセル３０４に試薬３０１を吸引するためには、二方弁３０７を閉じ、三方弁３０６を操作してフローセル３０４内流路と流路３１１を接続した状態でシリンジポンプ３０５を動作させることで陰圧を発生させる。また、使用済みの試薬を廃液タンク３０８に廃棄する場合は、逆に三方弁３０６を閉じ、二方弁３０７を開放した状態でシリンジポンプ３０５を駆動し、陽圧を発生させることで試薬の廃棄を実現することができる。
　上記構成に加え、本実施例では、フローセル３０４近傍の上流に新たに三方弁３０９を配置する。さらに二つの三方弁３０９、３０６についてバイパス流路３１４および３１５を接続し、従来の送液に用いる流路とは別に、バイパス流路を配置し、これを用いてフローセル３０４を満たしている試薬のみを選択的に気体と置換できるようにする。またバイパス流路３１４の大気開放端には防塵用のフィルタが装着されている。これによりフローセル３０４内に対する異物の混入を防止することが可能となる。
　ここで特筆すべきは従来の試薬送液流路３０３に分節空気を介して配置された複数の試薬の状態はそのままで、フローセル３０４を満たしている試薬のみを選択的に廃棄できるという点である。より具体的な方法について図３を用いて説明する。
　図３（ａ）においてはチューブおよびフローセル４０１流路内に試薬Ａ４０６、試薬Ｂ４０２、試薬Ｃ４０５が分節空気４０３および４０４を介して配置されている。フローセル４０１内流路を試薬Ｂ４０２が満たしたときに分節空気４０３および４０４が三方弁４０９および４０６上に配置するように送液を行う。三方弁４０９および４０６は通常の送液を行うための流路の他に、バイパス流路４１４および４１５にそれぞれ接続している。
次に具体的にフローセル４０１流路内の試薬Ｂ４０２を選択的に排出することでフローセル４０１内の試薬置換率を向上させる方法について説明する。図３（ｂ）において三方弁４０９および４０６を切り替えることで、試薬Ｃ４０５および試薬Ａ４０６が存在する送液用流路と接続していたフローセル４０１の上流側流路と下流側流路を、バイパス流路４１４および４１５に接続する。次に、図３（ｃ）においてバイパス流路４１５下流に接続されたバキュームポンプを使用することによりフローセル４０１内の試薬Ｂ４０２を吸引し、試薬Ｂを回収し、廃棄する。（ｃ）においてフローセル４０１内流路は完全に空気で置換される。この際に使用するバキュームポンプの液体吸引速度は約４０００ｕＬ/ｓｅｃである。これはシリンジポンプなどにおける吸引速度である１０ｕＬ/ｓｅｃと比較して高速かつ大容量であり、また試薬Ｂ４０２吸引後にフローセル４０１流路底面に残る試薬Ｂ４０２のストリーク（ｓｔｒｅａｋ）を完全に乾燥させるのに有効である。試薬Ｂ４０２のストリークが残った状態で試薬Ｃ４０５をフローセル４０１内に送液すると、試薬Ｃ４０５が空気を包み込み、結果としてフローセル４０１流路内に気泡を発生させる要因となるため、ストリークは可能な限り完全に乾燥させることが望ましい。次に、図３（ｄ）で三方弁４０９および４０６を試薬Ｃ４０５および試薬Ａ４０６が存在する送液用流路に再び接続する。次に（ｅ）の状態で送液用流路下流のあるシリンジポンプ３０５を用いて試薬Ａ４０６および試薬Ｃ４０５の吸引を行う。試薬Ｃ４０５は完全に乾燥したフローセル４０１流路内に浸入し、気泡を噛むことなくフローセル４０１内を満たす。本実施例の場合に置換前に存在していた試薬Ｂ４０２は完全に吸引されているため、試薬Ｂ４０２の試薬Ｃ４０５へのコンタミネーションは発生しない。従来フローセルにおける試薬の置換には、液体と液体の接触が発生していた。しかしながらフローセル内における流体の挙動は層流であり、２つの異なる液体間の置換が極めて混ざりにくいことがわかっている。しかも本実施例では反応が進行する微小反応場は基板表面に固定されているため、特に試薬置換の効率が悪かった。このため、従来ではフローセル内流路における試薬置換では通常経験的にフローセル内容量の少なくとも3倍量の試薬量を持って試薬置換が行われている。一般に試薬の置換に必要な送液量を解析的に算出することはきわめて難しい。これは、フローセルの形状（流路の幅、長さ、高さ）や、用いる試薬の粘性や表面張力、さらに送液時の流体の速度、温度条件などにも依存するためである。したがって実際にはそれぞれ固有の系で試薬置換に必要な液量を実験的に見積もることが必要であり、経験的にはこれに必要とされる試薬置換量は３倍以上とされている。
　結果として、フローセル容量が１０ｕＬである場合、従来方では試薬の置換に６０ｕＬ（＝１０＋１０＋３０＋１０ｕＬ）必要であるのに対して、本実施例ではこれを半分の３０ｕＬ（＝１０＋１０＋１０ｕＬ）まで低減できる。一方、フローセル容量が１０ｕＬより大きくなるに従い、試薬消費量の低減効果は１／４に漸近する。
　本実施例で述べた、フローセル流路の近傍にバイパス流路を設け、それを介してフローセル内流路の試薬のみを選択的に気体で置換することができれば、フローセル表面の試薬置換が進行しにくいフローセル表面の試薬も気体で置換することが可能となる。その後に改めて次の反応に必要となる試薬を実質的にフローセル内流路の液量分送液すればよい。結果として試薬置換に必要となる試薬量を低減することが可能となる。
　なお、フローセル流路表面の化学処理状態にも依存するが、表面の化学修飾へのダメージを考慮し、バキュームポンプによる吸引は３５ＫＰａ未満で吸引することが望ましい。また、フローセル流路内に試薬の液滴を残さないためにも本実施例で報告したようにフローセル流路の下流に陰圧を発生できる圧力発生装置を配置し、試薬を吸引することが望ましい。逆にフローセル流路の上流側に圧力発生装置を配置し、陽圧をフローセル流路に対してかける場合、フローセル流路内の試薬が割れ、液滴状態となってフローセル流路表面に残るという問題も発生し得る。
　また、対物レンズを介した光学検出系でフローセル流路内の乾燥状態をモニタし、確認することもできる。具体的には残存試薬の散乱像によりこれを確認することができる。また、検出感度を向上させるために、シーケンシングに用いる４種類の蛍光色素とは励起および検出波長が異なる蛍光色素を試薬内にあらかじめ溶解させることでより確実にフローセル上における試薬から気体への置換状態をモニタすることが可能となる。また、試薬の乾燥を早めるためにフローセルを固定するヒートブロックの温度を３５から６５℃の範囲内で加熱することもできる。
　次に本発明の第３の実施例として、フローセル近傍の上流に切り替えバルブを配置することで、バイパス流路を形成し、その下流に従来の試薬送液用に配置されるシリンジポンプを用いることで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図４を用いて説明する。
　複数の試薬５０１はシッパーチューブ５０９を介して切り替えバルブ５０２に接続している。切り替えバルブ５０２は流路５０３を介してフローセル５０４に接続し、さらに下流の流路５１１に接続する。流路５１１はシリンジポンプ５０５に接続し、廃液タンク５０８へと使用済みの試薬を廃液する。ここで大気開放チューブ５２１は、異なる試薬の直接接触により発生する試薬間のコンタミを防止するための分節空気を試薬間に挟むためのものである。またシリンジポンプ５０２を用いてフローセル５０４に試薬５０１を吸引させるためには、二方弁５０７を閉じ、二方弁５０６を開放し、かつ三方弁５０９が流路５０３とフローセル５０４内流路を接続した状態で、シリンジポンプ５０５を動作させることで陰圧を発生させる。また、使用済みの試薬を廃液タンク５０８に廃棄する場合は、逆に二方弁５０６を閉じ、二方弁５０７を開放し、シリンジポンプ５０５で陽圧を発生させることで試薬の廃棄を実現することができる。ここで三方弁５０９はフローセル５０４の近傍に配置され、通常の送液用流路５０３とバイパス流路５１４を接続し、自在に切り替えを行うことができる。いま、フローセル５０４流路内に高価な試薬Ａが満たされている。また、高価な試薬Ｂが試薬Ａと分節空気を介して流路５０３中に滞留している。次にフローセル５０４内流路の試薬を試薬Ａから試薬Ｂへの置換することによりフローセル５０４内の流路底面に固定された微小反応場における化学反応を進行させることが可能となる。このときに三方弁５０９を操作して、フローセル５０４内流路とバイパス流路５１４とを接続することで、フローセル５０４上流を大気開放とすることができる。この状態で二方弁５０６および５０７を開放し、シリンジポンプ５０５を吸引することによりフローセル５０４内の試薬Ａを気体、具体的には空気で置換することが可能となる。フローセル５０４流路内を空気で置換した後、三方弁５０９を切り替えることで送液用流路５０３とフローセル５０４内流路を接続し、シリンジポンプをさらに駆動することによりフローセル５０４内流路に試薬Ｂを導入することができる。フローセル５０４底面の表面にある微小反応場の試薬Ａは完全に空気で置換されているため、試薬Ｂは試薬Ａとのコンタミネーションや試薬Ｂの濃度低下など反応に支障をもたらす要因を排除した形でフローセル５０４流路内に試薬Ｂを供給することが可能となる。特筆すべき効果は試薬Ｂの供給量をフローセル５０４流路内の溶液保持ボリュームに装置の送液誤差量を加えた分まで試薬Ｂの量を低減できるという効果である。従来法ではフローセル５０４内の試薬は層流としてふるまうため、試薬Ａと試薬Ｂの置換が円滑に進行しない。このため一般に試薬の置換には、送液誤差量×２＋フローセル５０４流路内の試薬保持ボリューム×４の試薬量（フローセル容量が１０ｕＬであるときは（６０ｕＬ＝１０×２ｕＬ＋１０×４ｕＬ）が必要であったが、本実施例では送液誤差量×２＋フローセル５０４流路内の試薬保持ボリューム×１の試薬量まで低減することができる。さらに本実施例の特徴は、実施例２で説明した従来の構成に三方弁５０９、バイパス流路５１４および防塵用のフィルタ５１０を付加しただけの簡便で安価な装置構成で試薬量の低減を達成できる。
　次に本発明の第４の実施例として、フローセル近傍の上流および下流に切り替えバルブを配置することで、バイパス流路を形成し、その下流にシリンジポンプを配置することで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図５を用いて説明する。
　本実施例は実施例２における図２で説明した装置構成に類似した構成を持つ。具体的にはバイパス流路下流に配置した圧力発生装置について実施例２ではバキュームポンプを採用しているのに対して、本実施例（図５）ではシリンジポンプ６１５を採用している。より具体的には複数の試薬６０１はシッパーチューブ６０９を介して切り替えバルブ６０２に接続している。切り替えバルブ６０２は流路６０３を介してフローセル６０４に接続し、さらに下流の流路６１１に接続する。流路６１１はシリンジポンプ６０５に接続し、廃液タンク６０８へと使用済みの試薬を廃液する。ここで大気開放チューブ６２１は、異なる試薬の直接接触により発生する試薬間のコンタミを防止するための分節空気を試薬間に挟むためのものである。ここでシリンジポンプ６０５を用いてはフローセル６０４に試薬６０１を吸引させるためには、二方弁６０７を開放し、三方弁６０６をフローセル６０４内流路に接続した状態でシリンジポンプ６０５を動作させることで陰圧を発生させる。また、使用済みの試薬を廃液タンク６０８に廃棄する場合は、逆に三方弁６０６を閉じ、二方弁６０７を開放し、シリンジポンプ３０５で陽圧を発生させることで試薬の廃棄を実現することができる。
　次に流路６０３内に分節空気を介して隣接した複数の試薬の配列状態を維持したまま、フローセル６０４内の試薬のみ廃棄し、フローセル６０４内を空気で置換する方法について以下に説明する。三方弁６０９を操作し、バイパス流路６１４とフローセル６０４内流路を接続する。同様に三方弁６０６を操作し、フローセル６０４内流路とバイパス流路６１６とを接続する。二方弁６１２を閉じた状態でシリンジポンプ６１５を吸引することでバイパス流路６１６内を陰圧にし、フローセル６０４内の試薬を選択的に吸引し、回収することができる。これによりフローセル６０４内の流路は空気で置換され、乾燥状態となる。なお、空気はフィルタ６１０を介して吸引されるため、フローセル６０４に空気中に浮遊する異物が混入することはない。次に三方弁６０９および６０６を操作し、流路６０３とフローセル６０４内流路、フローセル６０４内流路と流路６１１をそれぞれ接続する。二方弁６０７を閉じた状態でシリンジポンプ６０５を駆動することにより、流路６０３にあらかじめすでに配置されていた試薬を、乾燥状態となったフローセル６０４内流路に吸引することができる。乾燥状態となっているフローセル６０４上では表面に試薬の置換を妨げる前試薬が残存していないため、試薬の置換を効率よく行うことが可能となる。
　次に本発明の第５の実施例として、フローセル近傍の上流および下流に切り替えバルブを配置することで、バイパス流路を形成し、その上流にバキュームポンプを配置することで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図６を用いて説明する。
　本実施例は実施例２における図２で説明した装置構成に類似した構成を持つ。具体的には実施例２ではバイパス流路下流にバキュームポンプを配置しているが、本実施例ではバイパス流路上流にバキュームポンプを配置している。
　実施例２における図２で説明した装置と同様に、複数の試薬７０１はシッパーチューブ７０９を介して切り替えバルブ７０２に接続している。切り替えバルブ７０２は流路７０３を介してフローセル７０４に接続し、さらに下流の流路７１１に接続する。流路７１１はシリンジポンプ７０５に接続し、廃液タンク７０８へと使用済みの試薬を廃液する。ここで大気開放チューブ７２１は、異なる試薬の直接接触により発生する試薬間のコンタミを防止するための分節空気を試薬間に挟むためのものである。またシリンジポンプ７０７を用いてフローセル７０４に試薬７０１を吸引させるためには、二方弁７０７を閉じ、三方弁７０６を操作してフローセル７０４内流路と流路７１１を接続詞、同様に三方弁７０９を操作して流路７０３とフローセル７０４内流路を接続し、シリンジポンプ７０５を動作させることで陰圧を発生させる。また、使用済みの試薬を廃液タンク７０８に廃棄する場合は、逆に三方弁７０６を閉じ、二方弁７０７を開放し、シリンジポンプ７０５で陽圧を発生させることで試薬の廃棄を実現することができる。ここで三方弁７０９はフローセル７０４の近傍に配置され、通常の送液用流路７０３とバイパス流路７１４を接続し、自在に切り替えを行うことができる。同様に三方弁７０６はフローセル７０４の近傍に配置され、通常のフローセル７０４内流路と送液用流路７１１あるいはバイパス流路７１６との接続を操作することができる。いま、フローセル７０４流路内に高価な試薬Ａが満たされている。また、高価な試薬Ｂが試薬Ａと分節空気を介して流路７０３中に滞留している。次にフローセル７０４内流路の試薬を試薬Ａから試薬Ｂへの置換することによりフローセル７０４内の流路底面に固定された微小反応場における化学反応を進行させることが可能となる。このときに三方弁７０９を操作して、フローセル７０４内流路とバイパス流路７１４とを接続することで、フローセル７０４上流を大気開放とすることができる。同様に三方弁７０６を操作し、フローセル７０４内流路とバイパス流路７１６を接続する。このバキュームポンプ７６０を駆動させることによりフローセル７０４内の試薬Ａを気体、具体的には空気で置換することが可能となる。フローセル７０４流路内を空気で置換した後、三方便７０９、７０６を切り替えることで送液用流路７０３とフローセル７０４内流路および流路７１１とフローセル７０４内流路を接続し、シリンジポンプ７０５をさらに駆動することによりフローセル７０４内流路に試薬Ｂを導入することができる。フローセル７０４底面の表面にある微小反応場の試薬Ａは完全に空気で置換されているため、試薬Ｂは試薬Ａとのコンタミネーションや試薬Ｂの濃度低下など反応に支障をもたらす要因を排除した形でフローセル７０４流路内に試薬Ｂを供給することが可能となる。特筆すべき効果は試薬Ｂの供給量をフローセル７０４流路内の溶液保持ボリュームに装置の送液誤差量を加えた分まで試薬Ｂの量を低減できるという効果である。従来法ではフローセル７０４内の試薬は層流としてふるまうため、試薬Ａと試薬Ｂの置換が円滑に進行しない。このため一般に試薬の置換には、送液誤差量×２＋フローセル７０４流路内の試薬保持ボリューム×４の試薬量（フローセル容量が１０ｕＬであるときは（６０ｕＬ＝１０×２ｕＬ＋１０×４ｕＬ）が必要であったが、本実施例では送液誤差量×２＋フローセル７０４流路内の試薬保持ボリューム×１の試薬量まで低減することができる。
　次に本発明の第６の実施例として、フローセル近傍の上流および下流に切り替えバルブを配置することで、バイパス流路を形成し、その上流にシリンジポンプを配置することで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図７を用いて説明する。
　本実施例は実施例２における図２で説明した装置構成に類似した構成を持つ。具体的には実施例２ではバイパス流路下流にバキュームポンプを配置しているが、本実施例ではバイパス流路上流にシリンジポンプを配置している。本実施例を用いることで、フローセル８０４内流路の試薬を選択的に空気で置換し、流路８０３に配置した試薬をフローセル８０４内流路に送液することで、フローセル８０４流路内においてより少ない試薬量で試薬置換を行うことが可能となる。
　次に本発明の第７の実施例として、フローセル近傍の上流および下流に切り替えバルブを配置することで、バイパス流路を形成し、その上流にバキュームポンプを配置することで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図８を用いて説明する。
　本実施例は実施例３における図４で説明した装置構成に類似した構成を持つ。具体的には実施例３では上流のバイパス流路に圧力発生機構を配置していないが、本実施例ではフローセル９０４近傍に三方弁９０９と二方弁９０６を配置する。また、三方弁９０９に接続するバイパス流路９１２、およびバイパス流路９１２の上流にバキュームポンプ９１０を配置する。これにより積極的にフローセル９０４内流路の試薬を気体で置換できる構成を実現している。
　次に本発明の第８の実施例として、フローセル近傍の上流および下流に切り替えバルブを配置することで、バイパス流路を形成し、その下流にバキュームポンプを配置することで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図９を用いて説明する。
　本実施例は実施例２における図２で説明した装置構成に類似した構成を持つ。具体的には実施例２では試薬２０１に対してシッパーチューブ２０９を浸し、切り替えバルブ３０９を駆動することにより流路３０３に吸引する試薬の種類を決定している。本実施例ではこれに代わってノズル１０２１により試薬を吸引・送液する方法を採用している。
　より具体的には試薬カートリッジ１００１は複数の試薬１００２を保持できる構造となっている。試薬カートリッジ１００１はその円周方向に複数の試薬１００２を配置し、モーターにより円周方向に回転することができる。ノズル１０２１はモーターによりＺ方向に駆動することができる。したがってノズル１０２１は複数の異なる試薬１００２にアクセスでき、流路下流のシリンジポンプ１００５を介して任意の試薬１００２を流路１０２２に吸引・送液することが可能である。異なる組成の試薬１０２１を吸引する場合はノズル１０２１外壁に付着した試薬１００２を異なる試薬１００２へと持ち込んでしまうコンタミネーションの発生が懸念される。このため、複数の洗浄槽１０２３、１０２４を試薬カートリッジ１００１に配置し、ノズル１０２１を洗浄槽に複数回浸すことにより、異なる試薬１００２に対する前試薬の持ち込み量を０．１％以下にすることが可能である。結果として試薬１００２間のコンタミネーションは分析性能に影響を与えない濃度まで低減することができる。また、送液中における流路１０２２内の異なる試薬１００２間の接触を回避するために分節空気を試薬の間に挟むことができる。より具体的にはノズル１０２１を空中に保持した状態で、任意の量の空気を吸い込み、その後異なる試薬１００２を吸引する。これにより、実施例２と同様の送液機能を、本実施例の構成で実現することができる。
　さらに実施例２における図２で説明した装置と同様に、ノズル１０２１以降の流路１０２２はフローセル１００４内流路に接続する。フローセル１００４内流路はさらに下流の流路１０２１に接続する。流路１０２１はシリンジポンプ１００５に接続し、廃液タンク１００８へと使用済みの試薬１００２を廃液することができる。シリンジポンプ１００５を用いてフローセル１００４に試薬１００２を吸引するためには、ノズル１０２１を試薬１００２内に接触させ、かつ三方弁１００９を駆動させることで、流路１０２２とフローセル１００４内流路を接続し、さらに三方弁１００６を駆動することでフローセル１００４内流路と流路１０２１を接続し、かつ二方弁１００７を閉じた状態にする。この状態でシリンジポンプ１００５を動作させることで陰圧を発生することで試薬１００２を吸引することができる。また、使用済みの試薬１００２を廃液タンク１００８に廃棄する場合は、逆に三方弁１００６を閉じ、二方弁１００７を開放した状態で、シリンジポンプ１００５で陽圧を発生させることで使用済みの試薬１００２の廃棄を実現することができる。
　流路１０２２に分節空気を介して送液・配列させた複数の試薬の状態に変更を加えず、フローセル１００４内流路にある試薬のみを選択的に回収・廃棄するためには以下の方法を用いる。すなわちフローセル１００４内の試薬は分節空気により隣接する試薬と仕切られている。フローセル１００４内流路に試薬が滞留しているときには、試薬の両端に隣接した分節空気はそれぞれ流路の分岐点である三方弁１００９および三方弁１００６に滞留している。上記の状態で三方弁１００９を駆動してバイパス流路１０１４とフローセル１００４内流路とを接続し、さらに三方弁１００６を駆動してバイパス流路１０１３とフローセル１００４内流路とを接続する。この状態でバイパス流路１０１３の下流に配置したバキュームポンプ１０１１を駆動することで、流路１０２２にすでにあらかじめ吸引・送液されている複数の試薬１００２の配列状態に変更を加えず、フローセル１００４内試薬のみを選択的に吸引・回収ことができる。回収された試薬は廃液タンク１０１２に廃棄される。なお、フローセル１００４内流路はいったん完全に気体で置換される。その後、三方弁１００９を駆動して流路１０２２とフローセル１００４内流路とを再度接続し、さらに三方弁１００６を駆動して流路１０２１とフローセル１００４内流路とを再度接続する。かつ二方弁１００７を閉じた状態でシリンジポンプ１００５を駆動することによりフローセル１００４内流路に新たな試薬を導入することができる。フローセル１００４底面の表面にある微小反応場は完全に空気で置換されているため、新たな試薬は前試薬とのコンタミネーションあるいは新たな試薬の濃度低下など反応に支障をもたらす要因を排除した形でフローセル１００４流路内に新たな試薬を供給することが可能となる。特筆すべき効果は新たな試薬の供給量をフローセル１００４流路内の溶液保持ボリュームに装置の送液誤差量を加えた分まであらたな試薬の量を低減できるという効果である。従来法ではフローセル１００４内の試薬は層流としてふるまうため、古い試薬と新たな試薬の置換が円滑に進行しない。このため一般に試薬の置換には、送液誤差量×２＋フローセル１００４流路内の試薬保持ボリューム×４の試薬量（フローセル容量が１０ｕＬであるときは（６０ｕＬ＝１０×２ｕＬ＋１０×４ｕＬ）が必要であったが、本実施例では送液誤差量×２＋フローセル１００４流路内の試薬保持ボリューム×１の試薬量まで低減することができる。
　本実施例を生化学自動分析装置、免疫自動分析装置に適用することも可能である。特に免疫自動分析装置は、生体サンプル中の抗原を、抗原・抗体反応を利用して検出するものである。例えば、小型の反応容器中で蛍光分子あるいは錯体などの標識をつけた固体をサンプル中の抗原と反応させ、マイクロメートルオーダーの磁性粒子懸濁液を加えて混合し、反応物を粒子表面に保持する。次に前記反応液を検出用の流路に吸引し、流路途中に設けたフローセルに磁石を近接し、フローセル内面の検出位置の粒子を洗い流して下流側の廃液タンクに排出する。フローセル内の試薬を置換する場合、試薬間に分節空気を吸引し、前後の試薬が相互に混合しないようにしている。現状の免疫自動分析装置においてもフローセル内の試薬置換にはフローセル容量の３倍以上の試薬量を必要としているが、本実施例で説明したバイパス流路を設け、フローセル内の試薬を選択的に置換することにより試薬量を低減することができる。
　次に本発明の第９の実施例として、ノズルを用いたダイレクトインジェクション方式によりフローセルに直接試薬を注入し、フローセル近傍の下流に切り替えバルブを配置し、バイパス流路を形成し、その下流にバキュームポンプを配置することで試薬置換効率を向上させる装置および方法について図１０を用いて説明する。
　試薬カートリッジ１３０１は複数の試薬１３０２を保持できる構造となっている。試薬カートリッジ１３０１はその円周方向に複数の試薬１３０２を配置し、モーターにより円周方向に回転することができる。本実施例ではダイレクトインジェクション方式を採用する。ダイレクトインジェクション方式とは、ノズル１３２１を直接フローセル１３０４の試薬注入口１３１０に挿入することで試薬１３０２をフローセル１３０４流路内に注入する方式のことである。ノズル１３２１はモーターにより上下方向に駆動することができる。また、ノズル１３２１は回転機構１３１４により水平方向に移動することができる。この上下および回転運動により、ノズル１３２１は試薬カートリッジ１３０１の試薬１３０２とフローセル１３０４の注入口１３１０の間を移動することで、任意の試薬１３０２をフローセル１３０３の注入口１３１０に注入することができる。また、異なる組成の試薬１３０２を吸引する場合はノズル１３２１外壁に付着した試薬１３０２を異なる試薬１３０２へと持ち込んでしまうコンタミネーションの発生が懸念される。このため、複数の洗浄槽１３２３、１３２４を試薬カートリッジ１３０１に配置し、ノズル１３２１を洗浄槽に複数回浸すことにより、異なる試薬１３０２に対する前試薬の持ち込み量を０．１％以下にすることが可能である。結果として試薬１３０２間のコンタミネーションは分析性能に影響を与えない濃度まで低減することができる。
　さらに二方弁１３２３の開閉を操作することでノズル１３２１による試薬１３０２の吸引・吐出を行うことができる。また、シリンジポンプ１３０５はポンプ１３０９が駆動してシステム水を継続的に循環させる流路１３２２に接続している。システム水を用いることによりノズル流路内を純水で満たすことができるため、弾性体である気体によるダンパの影響を排除し、高い吸引精度、吸引再現性を達成することができる。また、ノズル内部の洗浄を簡便に行うことが可能となり、試薬１３０２吸引時に発生する可能性があるコンタミを防止することができる。フローセル１３０４流路内に挿入された試薬１３０２は、試薬コストに応じて流路１３１６あるいは流路１３０７に廃棄される。試薬１３０２が高価な場合、三方弁１３０６を操作してフローセル内流路１３０４と流路１３１６を接続する。この状態でバキュームポンプ１３１１を駆動することによりフローセル１３０４内流路を満たしている試薬１３０２を空気で選択的に置換することが可能となる。また、安価な試薬である場合、三方弁１３０６を用いてフローセル１３０４内流路と流路１３０７を接続する。この場合ノズル１３２１より安価な試薬を注入口１３１０より注入し、フローセル１３０４内流路における試薬置換を達成することができる。なお、ノズル１３２１の吐出速度は高々１０ｕＬ/ｓｅｃ度であるのに対して、バキュームポンプ１３１１の液体および気体吸引速度は約４０００ｕＬ/ｓｅｃである。したがってノズル１３２１と比較してバキュームポンプ１３１６を介した試薬置換のほうが高速であり、かつフローセル１３０４表面を液滴などの残留物なく、さらに完全に乾燥させることができるため、より高い試薬置換効率を達成することが可能となる。つまり、バキュームポンプ１３１６を用いることにより、試薬消費量、特に高価な試薬の消費量を低減することが可能となる。
　本実施例の特に有効な点は、フローセル１３０４流路より上流の流路に付着する微量サンプルのコンタミを回避できる点である。従来チューブなどの流路を介してサンプルＤＮＡをフローセル１３０４上に送液し、増幅反応をフローセル１３０４上で行う場合、サンプルＤＮＡが流路壁面内に吸着してしまう問題があった。これが次の新規計測を行う場合にコンタミとしてフローセル１３０４流路内に送液され、増幅されてしまい、深刻なノイズとなる。これを計測毎の流路洗浄によって除去するためのプロトコルが開発されてきたが、本問題は依然として深刻な問題として計測者を悩ましている。このコンタミの問題について、従来の切り替えバルブを用いる方式であると、フローセルまでの流路が少なくとも３００ｍｍ以上と長くなる。また、シッパーチューブをサンプルＤＮＡ溶液内に計測時間中に挿入する必要があるが、これを消耗品として計測毎の交換が困難であるため、コンタミの原因ともなっている。本実施例ではノズル１３２１近傍の短い流路系のみを介してサンプルを送液するため、コンタミを極めて少なく抑えることが可能となる。またサンプルＤＮＡおよび試薬吸引後には直ちにそれらをシステム水で排出するノズル内洗動作も加わるため、コンタミを極めて少なく保つことができる。また、洗浄についてもノズル１３２１近傍の流路に限定して行えばよいため、前サンプルの残存により発生する増幅ノイズを低減することが可能となる。また、従来の流路が樹脂製のチューブであるのに対して、ノズルは金属製であるため、計測終了後のメンテナンス時の洗浄において、より強度の高い洗浄、例えばより強いアルカリ洗浄などを適用することができる。
　次に本発明の第１０の実施例としてフローセル近傍の上流および下流に切り替えバルブを配置し、フローセル流路と試薬を循環することができるバイパス流路を形成し、かつ下流にシリンジポンプを配置することで試薬置換効率を向上し、試薬を再利用できる装置および方法について図１１、１２Ａ、１２Ｂを用いて説明する。
　本実施例は実施例８における図９で説明した装置構成に類似した構成を持つ。図１１で示されるように本実施例に特徴的な点は、フローセル１１０６内流路に対して試薬を循環できるバイパス流路を形成している点である。この循環バイパス流路は流路１１２２、１１１８、１１２３から構成される。この循環バイパス流路はいったんフローセル１１０６内で反応が完了した試薬を選択的に廃棄するのみならず再利用するために使用される。
　より具体的な動作について図１２Ａ，１２Ｂを用いて説明する。図１２Ａ（ａ）において灰色で示される試薬はフローセル１２５１内流路で微小反応場に対する反応を完了する。このとき試薬内に含有される反応成分、具体的には４種類の蛍光ヌクレオチド、塩基伸長を促進する酵素であるポリメラーゼ、あるいは増幅反応に必要となるポリメラーゼ、プライマ、ヌクレオチドなどの濃度は初期状態の９９％以上を反応後も保持している。いま三方弁１２２１はフローセル１２５１内流路および流路１２２８を接続し、三方弁１２２２は流路１２２８と１２２９とを接続している。また、二方弁１２１１は閉じた状態である。次に図１２Ａ（ｂ）でシリンジポンプ１２１２を吸引する。すると発生した陰圧により、試薬は流路１２２９内へと移動する。次に図１２Ａ（ｃ）において三方弁１２２２を操作し、流路１２２９と流路１２２６を接続する。また、三方弁１２２３を操作し、流路１２２５と流路１２２６とを接続する。流路１２２５は大気開放されており、したがって流路１２２５を介して空気の流入が可能である。この状態でシリンジポンプ１２１３を押し込むことで陽圧を発生させ、試薬を流路１２２６へと送液することが可能となる。次に図１２Ｂ（ｄ）において三方弁１２２３を操作し、流路１２２６と流路１２２７を接続する。同様に三方弁１２２４を介して、流路１２２７とフローセル１２５１内流路とが接続している。さらに三方弁１２２１を操作し、フローセル１２５１内流路と流路１２５２とを接続する。また、二方弁１２１０を閉じる。この状態でシリンジポンプ１２１２を吸引することにより、試薬をふたたびフローセル１２５１内流路に送液することができる。（ｂ）～（ｃ）に示されるように、いったん試薬を流路１２２６に迂回させている間は、通常の流路を介して反応を滞りなく進めることができる。再度流路１２２６に滞留させた試薬を使用する場合には図１２Ｂ（ｄ）の手続きを踏み、試薬を再利用することが可能となる。この再利用は原理的に基質濃度がある基準以下に低減するまで繰り返すことが可能である。この方法を用いることにより、試薬の消費量を低減することが可能となる。
　最終的に試薬を廃棄する場合には、図１２Ｂ（ｅ）に示されるように三方弁１２２４を操作し、従来の送液流路１２５３とフローセル１２５１内流路とを接続する。さらにフローセル１２５１内流路と流路１２５２とを接続した状態でシリンジポンプ１２１２を吸引する。これにより試薬を流路１２５２へと吸引し、同様に黒色で示される新規試薬をフローセル１２５１内流路に導入することが可能となる。
１０１、２０４、２１０、３０４、４０１、５０４、６０４、７５４、８０４、９０４、１００４、１１０６、１２５１、１３０４　　フローセル
１０２　　微小反応場
１０３　　ヒートブロック
１０４　　ペルチェ素子
１０５　　熱伝導シート
１０６　　ヒートシンク
１０７　　ＸＹステージ
１３０　　対物レンズ
１１２、１００１、１１０１、１３０１　　試薬カートリッジ
１１３　　フィン
１１６、２０２，３０２、５０２、６０２、７０２、８０２、９０２　　切り替えバルブ
１１７、２０３、２１１、３０３、３１１、５０３、５１１、６０３、６１４、６１１、６１６、７０３、７１４、７１６、７１１、８０３、８１４、８１１、９０３、９１２、９１１、１０２２、１０１４、１０２１、１０１３、１１２４、１１１６、１１１８、１１２５、１１２１、１３２２、１３０７、１２２６、１２２７、１２２８、１２２９、１２２９、１２５２、１２５３　　流路
１２６，２０５、３０５、５０５、６０５、６１５、７０５、８０５、８１０、９０５、１００５、１２１２、１２１３　　シリンジポンプ
１２１、１２２　　　　、３０６、３０９、５０９、６０６、６０９、７０６、７０９、８０６、８０９、９０６、９０９、１００６、１００９、１１０６、１１０７、１１０９、１１１６、１２２１、１２２２、１２２３、１２２４　　三方弁
１２５、２０６、２０７、３０７、５０６、５０７、６０７、６１２、７０７、８０７、８１２、９０７、１００７、１１１０、１１１１、１２１０、１２１１　　二方弁
１２７、２０８、３０８、５０８、６０８、６２１、７０８、７６１、８０８、８１１、９０８、１００８、１０１２、１１１４、１１１５、１２１４、１２１５、１３０８、１３１２　　廃液タンク
１２９、１５９　　マイクロフォトセンサ
１２８、１５８　　液受けトレイ
１３２、１３３　　ＬＥＤ
１３４、１３５、１３７　　ダイクロイックミラー
１３６　　エミッションフィルタ
１３８、１４０　　集光レンズ
１３９、１４１　　ＣＭＯＳカメラ
１５２、１５３、３１４、３１５、５１４　　バイパス流路
１５６、３１６、７６０、９１０、１０１１、１３１１　　バキュームポンプ
２０１、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２３０、２２６、３０１、４０２、４０５、４０６、５０１　　試薬
２０９、３２１、５０９、６０９、７０９、８０９、９０９　　シッパーチューブ
２１０、３１０、５２１　　大気開放チューブ
１５１、３１３、５１０　　フィルタ
２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、４０３、４０４　　分節空気
２２２、２２３、２２４　　流体部
１３１０　　注入口

Claims (15)

  1. 　試料の分析に用いるフローセルと、試料を含む試料容器と、試薬を含む試薬容器と、試料及び試薬を流路を介してフローセルへ送液する圧力発生機構を備え、
    　フローセルの上流側の流路上に大気開放部を有することを特徴とする、分析装置。
  2. 　請求項１において、
    　フローセルの下流側には流路を分岐する分岐部が設けられ、前記分岐部により分岐された流路の一方には前記圧力発生機構が備えられ、他方には第２の圧力発生機構を備えている、分析装置。
  3. 　請求項２において、
    　前記圧力発生機構はシリンジであり、前記第２の圧力発生機構はポンプである、分析装置。
  4. 　請求項２において、
    　前記圧力発生機構、および前記第２の圧力発生機構は共に、シリンジである、分析装置。
  5. 　請求項１において、
    　前記圧力発生機構はシリンジである、分析装置。
  6. 　請求項１において、
    　前記大気開放部は前記フローセルの近傍に設けられている、分析装置。
  7. 　請求項２において、
    　前記分岐部は前記フローセルの近傍に設けられている、分析装置。
  8. 　試料の分析に用いるフローセルと、
    　試料を含む試料容器と、
    　試薬を含む試薬容器と、
    　試料及び試薬を流路を介してフローセルへ送液する圧力発生機構と、
    　フローセルの上流側の流路上に、試料及び試薬が流れる流路とは別の流路が合流する合流部と、
    　前記別の流路上に設けられた、第２の圧力発生機構を備える分析装置。
  9. 　請求項６において、
    　前記第２の圧力発生機構は、ポンプである、分析装置。
  10. 　請求項６において、
    　前記第２の圧力発生機構は、シリンジである、分析装置。
  11. 　請求項６において、
    　フローセルの下流側には流路を分岐する分岐部が設けられ、前記分岐部により分岐された流路の一方には前記圧力発生機構が備えられ、他方には第３の圧力発生機構を備えている、分析装置。
  12. 　請求項９において、
    　前記第２の圧力発生機構は、ポンプである、分析装置。
  13. 　請求項９において、
    　前記第２の圧力発生機構は、シリンジである、分析装置。
  14. 　請求項１１において、
    　前記分岐部は前記フローセルの近傍に設けられている、分析装置。
  15. 　請求項８において、
    　前記合流部は前記フローセルの近傍に設けられている、分析装置。
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