WO2014202044A1 - Resistenzgen gegen rizomania - Google Patents

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WO2014202044A1
WO2014202044A1 PCT/DE2014/000310 DE2014000310W WO2014202044A1 WO 2014202044 A1 WO2014202044 A1 WO 2014202044A1 DE 2014000310 W DE2014000310 W DE 2014000310W WO 2014202044 A1 WO2014202044 A1 WO 2014202044A1
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plant
seq
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Otto TÖRJÈK
Dietrich Borchardt
Wolfgang Mechelke
Jens Christoph Lein
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Kws Saat Ag
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule which encodes a polypeptide capable of conferring resistance to a pathogen, in particular to "Beet Necrotic Yelllow Vein Virus" in a plant, in particular of the genus Beta, in which the polypeptide is expressed Furthermore, the invention relates to a polypeptide which is capable of conferring resistance to a pathogen in a plant, in particular a resistance to BNYW in a plant of the genus Beta, in which the polypeptide is expressed, and which by the nucleic acid molecule according to the invention The invention further relates to a transgenic plant, plant cell,
  • Plant organ, plant tissue, plant part or a seed of a plant which comprise the nucleic acid molecule or parts thereof, as well as methods for producing such a transgenic plant or plant cell. Furthermore, the invention also includes methods for detecting the resistance-conferring nucleic acid molecule and methods for selecting plants or plant cells which have the resistance-conferring nucleic acid molecule.
  • BNYW Beet Necrotic Yellow Vein Virus
  • RZ-1 Confirmation copy
  • the present invention has been made in light of the above-described prior art, which is an object of the present invention
  • Nucleic acid molecule and / or a polypeptide capable of conferring resistance to Rizomania in a plant Furthermore, it is an object to provide a transgenic rizomania-resistant plant and a method for their preparation.
  • a further object of the present invention is to provide methods for the use and development of molecular markers which enable efficient breeding against rizomania and the development of new resistant plant lines.
  • Embodiments of the present invention which solve the problem are based on genetic fine mapping, identification, isolation and characterization of a gene derived from the donor Beta vulgaris subsp. maritima and encodes a polypeptide or protein capable of mediating resistance to a pathogen in a plant in which the polypeptide is expressed.
  • a "plant of the genus Beta" belongs to the family of the foxtail family
  • Beta vulgaris plants of the species Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna and Beta nana.
  • a plant of the species Beta vulgaris is in particular a plant of the subspecies Beta vulgaris subsp. maritima (Lake Mangold) or Beta vulgahs subsp. vulgaris. Which includes
  • Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima sucrose beet, S.S.
  • Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris chard
  • Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva Red
  • Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa / alba (fodder beet).
  • hybridization or “hybridization” is meant a process in which a single-stranded nucleic acid molecule to a largely complementary
  • Nucleic acid strand attaches i. deals with this base pairings. Standard methods for hybridization are described, for example, in Sambrook et al. 2001 described. Preferably, it is understood that at least 60%, more preferably at least 65%, 70%, 75%, 80% or 85%, more preferably 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% or 99% of the bases of the nucleic acid molecule base pair with the largely complementary nucleic acid strand. The possibility of such attachment depends on the stringency of the hybridization conditions.
  • stringency refers to hybridization conditions High stringency is given when base pairing is difficult, low stringency when base pairing is facilitated, for example, stringency of hybridization conditions depends on salt concentration and ionic strength and temperature For example, the stringency can be increased by raising the temperature and / or lowering the salt content
  • Hybridization conditions are to be understood as those conditions in which a
  • Hybridization takes place predominantly only between homologous nucleic acid molecules.
  • hybridization conditions does not only refer to the conditions prevailing during the actual attachment of the nucleic acids, but also to the conditions prevailing in the subsequent washing steps
  • Hybridization conditions are, for example, conditions under which predominantly only those nucleic acid molecules which hybridize at least 70%, preferably at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95%
  • Stringent hybridization conditions are, for example: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C followed by multiple washes in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of about 1 hour.
  • stringent hybridization conditions are, for example: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C followed by multiple washes in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of about 1 hour.
  • Hybridization conditions may also mean: hybridization at 68 ° C in 0.25M
  • hybridization takes place under stringent conditions.
  • isolated nucleic acid molecule is one from its natural or
  • isolated polypeptide is meant a polypeptide liberated from its native environment, and the term also includes a synthetically produced polypeptide.
  • a “molecular marker” is a nucleic acid that is polymorphic in a plant
  • molecular marker also refers to nucleotide sequences that are complementary, or at least largely complementary, or homologous to genomic sequences, for example, nucleic acids used as probes or primers.
  • Markers that describe genetic polymorphisms can be prepared using well-established methods These include, for example, PCR-based sequence-specific amplification, detection of restriction fragment length polymorphisms (RFLP), detection of polynucleotide polymorphisms by means of allele specific hybridization (ASH), detection of amplified variable sequences of the plant genome, detection of self-sustained sequence replication, detection of simple sequence repeats (SSRs), detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs), or detection of amplified fragment length polymorphisms.
  • RFLP restriction fragment length polymorphisms
  • ASH allele specific hybridization
  • SSRs simple sequence repeats
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a "promoter” means an untranslated regulatory DNA sequence, typically upstream of a coding region, which includes the RNA polymerase binding site and initiates transcription of the DNA.
  • a "pathogen” means an organism that interacts with a plant
  • pathogens include, for example, animal, fungal, bacterial or viral organisms or Oomycetes.
  • pathogen infection is meant the earliest time a pathogen interacts with a plant host tissue.
  • this is transmitted by the protozoan Polymyxa betae.
  • Polymyxa forms spores that can survive in the earth for many decades.
  • the virus also survives in these spores. If these permanent spores germinate into mobile zoospores, the virus can pass through them into cells of the plant host tissue and interact there with the host (Esser 2000).
  • Plant “organs” mean, for example, leaves, stem axis, stem, roots, hypocotyl, vegetative buds, meristems, embryos, anthers, ovules or fruits.
  • Plant “parts” mean an association of several organs, e.g. a flower or seed, or part of an organ, e.g. a cross section through the shoot.
  • Herbal "tissues” are for example callus tissue, storage tissue, meristematic tissues, leaf tissue,
  • Plants are meant, for example, isolated cells with a cell wall or aggregates thereof or protoplasts.
  • resistance is to be understood broadly and covers the area of protection from a delay to the complete inhibition of the development of the disease.
  • a pathogen of importance is the Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYW) Plant cell of the invention or resistant plant of the invention is resistant to BNYW Resistance to a pathogen is equated with resistance to the disease causing this pathogen, for example, resistance to BNYW is also a resistance to Rizomania.
  • Transgenic plant refers to a plant in whose genome at least one nucleic acid has been integrated. This may be a heterologous nucleic acid. Preferably, the nucleic acid is stably integrated, which means that the integrated Nucleic acid remains stable in the plant, can be expressed and can be stably inherited to the offspring.
  • the present invention discloses a nucleic acid molecule encoding a polypeptide capable of conferring resistance to a pathogen in a plant in which the polypeptide is expressed.
  • the nucleic acid molecule comprises a
  • nucleotide sequence which is at least 60% identical to an amino acid sequence which is encoded by the nucleotide sequence according to a) or b), or f) a nucleotide sequence which comprises at least one nucleotide binding domain (NBS or NB-ARC) corresponding to Amino acid positions 168-227 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to the amino acid positions 182-241 of SEQ ID NO: 3, at least one leucine-rich domain (LRR) corresponding to
  • the nucleic acid molecule may be an isolated nucleic acid molecule. It is preferably DNA, and particularly preferably cDNA (encoding DNA).
  • the polypeptide produced by the invention is preferably DNA, and particularly preferably cDNA (encoding DNA).
  • Beta vulgaris A resistance to the viral pathogen "Beet Necrotic Yellow Vein Virus” (BNYW), which causes the plant disease Rizomania
  • BNYW Bact Necrotic Yellow Vein Virus
  • the polypeptide which is encoded by the nucleic acid molecule according to the invention mediates resistance, in particular in a plant of the genus Beta
  • the plant is preferably a plant of the species Beta vulgaris, more preferably a plant of the subspecies Beta vulgaris subsp. maritima or Beta vulgaris subsp. vulgaris, which include, for example, the cultivars sugar beet, beetroot, fodder beet, leaf mangold and stalk mangold.
  • nucleic acid molecule according to the invention, this comprises
  • Nucleic acid molecule the nucleotide sequence according to a).
  • the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 of the encoded polypeptide and / or according to SEQ ID NO: 3 of the encoded polypeptide represents the resistance protein of the RZ-3 gene.
  • This is a resistance gene / protein of the NBS-LRR type, which is characterized by certain structural motifs.
  • the general structure of such resistance proteins in plants has already been well studied (Martin et al., 2003).
  • the principle of structural design in particular the so-called LRR domain, which is considered a potential recognition domain for mostly unknown pathogenic effectors, is unpredictable.
  • identification of a BNYW resistance-conferring gene or protein alone is impossible based on the known structural motifs.
  • the identification of the RZ-3 resistance gene took place as part of a map-based cloning process that required intensive genetic mapping and fine mapping of the target region in which the RZ-3 resistance gene was initially suspected.
  • the identified resistance protein belongs to the type NBS-LRR and has a nucleotide-binding domain (NBS, also known as NB-ARC (nucleotide-binding adapter shared by APAF-1, R proteins, and CED-4)) corresponding to amino acid positions 168- 227 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to amino acid positions 182-241 of SEQ ID NO: 3, a leucine-rich domain (LRR) corresponding to amino acid positions 591-613 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to amino acid positions 605-627 of SEQ ID NO: 3 and / or at least one internal repetitive domain (IR) corresponding to amino acid positions 1013-1072 of SEQ ID NO: 2 or according to the
  • the NBS domain is defined by nucleotides 2019-2882 of SEQ ID NO: 1, the LRR domain by nucleotides 3288-3356 of SEQ ID NO: 1, and the IR domain by nucleotides 4554-4871 of SEQ ID NO: 1 coded.
  • the NB ARC domain is a central nucleotide binding domain. It is likely a functional ATPase domain, which is expected to regulate the activity of a resistance protein.
  • the NB ARC domain consists of three subdomains: NB, ARC1, and ARC2.
  • Characteristic motifs of the NB-ARC domain are APAF-1 (apoptotic protease-activating factor-1), which is presumably responsible for the hypersensitive response, hhGRExE, Walker-A or P-Ioop, Walker-B, GxP, RNBS- A to D and MHD (Ooijen et al., 2008). Some of the mentioned motifs have already been identified. In a further embodiment of the nucleic acid molecule according to the invention, this comprises
  • nucleic acid molecule the nucleotide sequence according to b).
  • the nucleotide sequence comprises the coding sequences of the DNA sequence according to SEQ ID NO: 1, which for the
  • the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence according to d).
  • This nucleotide sequence encodes a polypeptide which is a derivative of the polypeptide encoded by the nucleotide sequence of a) or b).
  • a derivative of the polypeptide is a deduced amino acid sequence which has at least one substitution, deletion or addition of one or more amino acids while retaining the functionality of the encoded polypeptide / protein.
  • the substitution of one amino acid by another amino acid with the same or equivalent or similar chemical-physical properties is called a "conservative exchange” or “semiconservative exchange”.
  • Examples of physico-chemical properties of an amino acid are, for example, the hydrophobicity or the charge.
  • the person skilled in the art knows which amino acid substitution represents a conservative or semiconservative exchange.
  • the general knowledge also allows the skilled person to recognize, identify and prove which ones
  • nucleotide sequence of this embodiment then encodes a derivative or deduced amino acid sequence if the nucleotide sequence is at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%. , 97%, 98%, 99% homologous or identical to the nucleotide sequence of a) or b).
  • nucleotide sequences which code for a derivative or for a derived amino acid sequence, either directly or indirectly (for example via amplification or replication steps) from a Starting nucleotide sequence which corresponds to the total length or at least partially corresponds to SEQ ID NO: 1 or another sequence disclosed herein.
  • the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence according to e).
  • This nucleotide sequence encodes a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%. , 99% is identical to one
  • Amino acid sequence which is encoded by the nucleotide sequence according to a) or b).
  • the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequence according to f).
  • the nucleotide sequence here encodes at least one nucleotide binding domain (NBS) corresponding to amino acid positions 168-227 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to amino acid positions 182-241 of SEQ ID NO: 3, at least one leucine rich domain (LRR) corresponding to Amino acid positions 591-613 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to the amino acid positions 605-627 of SEQ ID NO: 3 and / or at least one internal repetitive domain (IR) corresponding to
  • the nucleotide sequence encodes a polypeptide having at least one nucleotide binding domain (NBS) corresponding to amino acid positions 168-227 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to
  • Amino acid positions 182-241 of SEQ ID NO: 3 at least one leucine rich domain (LRR) corresponding to amino acid positions 591-613 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to amino acid positions 605-627 of SEQ ID NO: 3 and at least one internal repetitive A domain (IR) corresponding to amino acid positions 1013-1072 of SEQ ID NO: 2 or corresponding to amino acid positions 1027-1086 of SEQ ID NO: 3.
  • LRR leucine rich domain
  • IR internal repetitive A domain
  • these domains are present in the polypeptide sequentially from the N to the C-terminus in the order NBS-LRR-IR, wherein one or more additional amino acids may be present between domains.
  • the present invention further relates to a polypeptide which is capable of conferring resistance to a pathogen in a plant in which the polypeptide is expressed and which is encoded by the nucleic acid molecule according to the invention, wherein the pathogen is preferably BNYW and / or the plant is preferably a plant of the genus Beta, in particular a plant of the species Beta vulgaris.
  • the polypeptide particularly preferably has an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or according to SEQ ID NO: 3.
  • the polypeptide may be an isolated polypeptide.
  • the present invention relates to a vector which comprises the nucleic acid molecule according to the invention.
  • the vector may be a plasmid, a cosmid, phage or expression vector, transformation vector, shuttle vector or cloning vector, double or single stranded, linear or circular, or can transform a prokaryotic or eukaryotic host either by integration into its genome or extrachromosomally.
  • the nucleic acid molecule according to the invention is operatively linked in an expression vector with one or more regulatory sequences which permit transcription and optionally expression in a prokaryotic or eukaryotic host cell.
  • that stands are examples of the nucleic acid molecule according to the invention.
  • Suitable promoters may be promoters which are constitutively induced (for example: 35S promoter from the cauliflower mosaic virus (Odell et al., 1985), particularly those promoters which are pathogen-inducible (for example: PR1 promoter from parsley (Rushton et al., 1996).
  • Particularly suitable pathogen-inducible promoters are synthetic or chimeric promoters, which are not naturally occurring, composed of several elements and contain a minimal promoter and at least one cis-regulatory element upstream of the minimal promoter Chimeric promoters are designed according to the desired requirements and are induced or repressed by different factors Examples of such promoters can be found in WO 00/29592, WO 2007/147395 and WO 2013/091612 suitable terminator is, for example, the nos terminator (Depicker et al. , 1982).
  • the present invention also provides a method comprising introducing a described vector into a host cell.
  • the vector can be introduced, for example, by conjugation, mobilization, biolistic transformation, Agrobacterium-mediated transformation, transfection, transduction, vacuum infiltration or electroporation.
  • conjugation, mobilization, biolistic transformation, Agrobacterium-mediated transformation, transfection, transduction, vacuum infiltration or electroporation Such methods as well as methods for the preparation of described vectors are familiar to the person skilled in the art (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention relates to a host cell comprising the nucleic acid molecule of the invention or the vector of the present invention.
  • a host cell according to the invention may be a prokaryotic (e.g., bacterial) or eukaryotic cell (e.g., a plant cell or a yeast cell).
  • the host cell is an Agrobacterium such as Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes or a plant cell comprising the nucleic acid molecule of the invention or the vector of the present invention. Numerous methods, such as conjugation or electroporation, with which he knows the inventive
  • Nucleic acid molecule or the vector of the present invention in an Agrobacterium as well as methods such as various transformation methods (biolistic Transformation, Agrobacterium-mediated transformation), with which he
  • Nucleic acid molecule according to the invention or the vector of the present invention can be introduced into a plant cell (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention relates to a transgenic plant cell comprising the nucleic acid molecule of the invention as a transgene or the vector of the present invention.
  • a transgenic plant cell is for example a plant cell, which is transformed with the nucleic acid molecule according to the invention or with the vector of the present invention, preferably stable.
  • Embodiment of the transgenic plant cell the nucleic acid molecule with one or more regulatory sequences that allow transcription and optionally expression in the plant cell, operatively linked.
  • the nucleic acid molecule according to the invention and the regulatory sequence (s) then constitutes the transgene.
  • Such regulatory sequences are, for example, a promoter or a terminator.
  • a transgenic plant cell of the present invention in particular a cell of a plant of the genus Beta, opposite to a
  • Pathogen in particular BNYW, a higher resistance than a corresponding non-transformed plant cell (the plant cell without the transgene).
  • the level of resistance to, for example, BNYW can be qualitatively assessed in plants of the genus Beta
  • Boniturnoten be set (Boniturnotenschemata for plant of the genus Beta are known from the prior art, for example, for sugar beet
  • the present invention also relates to a method for producing a transgenic plant cell of the present invention, which comprises a step of
  • nucleic acid molecule or vector of the present invention into a plant cell.
  • Transforming take place, preferably by stable transformation.
  • the appropriate techniques for incorporation such as biolistic transformation, Agrobacterium-mediated
  • Transformation or electroporation are known to those skilled in the art (Sambrook et al., 2001).
  • the present invention relates to a transgenic plant or a part thereof, comprising a transgenic plant cell described above.
  • a part may be a cell, a tissue, an organ or an association of several cells, tissues, or organs.
  • An association of several organs is eg a flower or a seed.
  • the invention relates to a seed of the Transgenic plant, wherein the seed comprises the nucleic acid molecule of the invention as a transgene.
  • a transgenic plant of the present invention in particular a plant of the genus Beta, exhibits a higher resistance to a pathogen, in particular BNYW, than a corresponding non-transformed plant (plant without the transgene).
  • the level of resistance to, for example, BNYW can be determined qualitatively in plants of the genus Beta by determining credit score (Boniturnotenschemata-for plant of the genus Beta are known from the prior art, for example, for sugar beets Mechelke (1997)). Higher resistance is reflected in at least two improvement in resistance by at least one credit score
  • the invention provides a method of producing a transgenic plant comprising a step of
  • nucleic acid molecule or vector of the present invention into a plant cell and optionally a step of selecting a transgenic plant cell. Furthermore, such a method of producing a transgenic plant is characterized by a subsequent step involving the regeneration of the transgenic plant from the transgenic plant cell produced in the first step. Regeneration methods are known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a method for mediating or increasing a resistance to a pathogen, in particular BNYW, in a plant, preferably a plant of the genus Beta, which comprises a step of transforming a plant cell with the nucleic acid molecule according to the invention or the vector of the present invention.
  • This method preferably leads to an improvement in the resistance by at least one credit score, particularly preferably to an improvement in the resistance by at least two, three or more bonus notes.
  • Boniturnotenschemata for plant of the genus beta are known from the prior art, for example, for sugar beets Mechelke (1997).
  • the present invention relates to a regulatory sequence of a promoter which comprises the expression of a gene comprising the invention
  • Nucleic acid molecule comprises, controlled, characterized in that the regulatory sequence is capable of expression of a heterologous DNA sequence due to a
  • the regulatory sequence comprises a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 of the nucleotides 1-1403.
  • the heterologous DNA sequence is a nucleotide sequence which codes for a component of plant pathogen defense (for example: resistance genes (R genes) or genes which are involved in enzymes involved in signal transfer, such as kinases or phosphatases and encode G protein) or which encodes a pathogenic effector (so-called.
  • the present invention covers a recombinant DNA molecule comprising the regulatory sequence described above.
  • the recombinant DNA molecule is operably linked to a heterologous DNA sequence.
  • the present invention relates to a host cell which has the regulatory sequence described above or with the said
  • Plant tissue or plant cell comprising the regulatory sequence or the recombinant DNA molecule as a transgene.
  • the invention provides a method of producing a transgenic plant cell comprising a step of introducing the regulatory sequence of the invention or the recombinant DNA molecule and optionally a step of selecting a transgenic plant cell.
  • the invention provides a method of producing a transgenic plant comprising a step of introducing the regulatory sequence of the invention or the recombinant DNA molecule into a plant cell and optionally a step of selecting a transgenic plant cell.
  • such a method of producing a transgenic plant is characterized by a subsequent step involving the regeneration of the transgenic plant from the transgenic plant cell produced in the first step.
  • the identification of the RZ-3 resistance gene took place in the course of a map-based cloning process.
  • the process included, for example, the steps of: genetic fine mapping, physical mapping, construction of a very large cleavage population of over 8,000 F2-cleaving offspring, recombinant screen, marker development in the target region, comparative BAC sequencing in resistant and sensitive genotypes, bioinformatic analyzes, protein predictions and comparison of the proteins.
  • Such lengthy development work is always very costly and it is uncertain if it actually succeeds in identifying the gene.
  • markers of good diagnostic value were developed for the RZ-3 genome segment in fine mapping, which proved to be particularly difficult since the Target region is repetitive over wide areas.
  • markers of good diagnostic value were developed for the RZ-3 genome segment in fine mapping, which proved to be particularly difficult since the Target region is repetitive over wide areas.
  • the development of a few diagnostic markers was possible, which in some cases only functioned as PSQ markers using a specific marker technique, such as pyrosequences, or were nullallic.
  • extensive analysis using these markers has limited the RZ-3 locus to a genomic region of 0.67 cM. This corresponds to a physical length of about 340,000 bp.
  • Resistance gene sequence indicates that the gene presumably encodes an NB-ARC-LRR protein. It is believed that this insertion of the retrotransposon destroys the function of the gene in susceptible ss genotypes because it separates the internal repeat domain (IR) from the other two domains (NB-ARC and LRR).
  • IR internal repeat domain
  • FIG. 4 shows the physical map of the RZ-3 target region with the developed markers.
  • Genotype data from eight narrow recombinant lines, as well as the statistical analysis of their progeny is shown in FIG.
  • the present invention relates to a method of identifying a nucleic acid molecule encoding a protein capable of mediating resistance to the pathogen BNYW in a plant of the genus Beta in which the protein is expressed.
  • the method comprises detecting the absence of an insertion in the coding nucleotide sequence of the nucleic acid molecule.
  • the method comprises detecting the absence of an insertion, especially one
  • the retrotransposon may be about 500 bp, about 1000 bp, about 2000 bp, about 4000 bp, about 8000 bp, or more than about 8000 bp.
  • the nucleic acid molecule is the nucleic acid molecule of the invention as described above and encodes the resistance-conferring RZ-3 gene or a functional homolog of RZ-3.
  • the plant of the genus Beta is Beta vulgaris subsp. maritima or Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (sugar beet).
  • the person skilled in the art knows which methods are suitable for detecting the absence of the insertion.
  • those skilled in the art can develop molecular markers which can detect the presence or presence of
  • the present invention includes such markers as well as their use for detecting the presence or absence of the insertion for the selection of resistant, in particular BNYW-resistant, plants, in particular Beta vulgaris subsp.
  • such markers describe loci at the insertion sites of the retrotransposon.
  • Insertion sites my transition sites between genomic DNA and retrotransposon on 5 'and / or 3' side of the insertion. Transition sites are to be broadly defined and marker loci may be less than 1000 nucleotides, preferably less than 800 or 600 nucleotides, more preferably less than 400, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20 or 10 nucleotides upstream or downstream of an insertion site the DNA are removed.
  • the method may also comprise the detection of at least one polymorphism according to Figure 1, 2 and / or 3, preferably of at least two or three polymorphisms according to Figure 1, 2 and / or 3, more preferably of at least four, five or more polymorphisms according to according to Figure 1, 2 and / or 3 in the coding nucleotide sequence of the invention
  • This detection preferably takes place using at least one molecular marker per polymorphism, in particular per diagnositive polymorphism.
  • the skilled worker is aware of which marker techniques for the detection of a corresponding polymorphism.
  • the present invention covers molecular markers which describe or detect a polymorphism according to FIGS. 1, 2 and / or 3, as well as the use of a molecular marker for detecting a polymorphism according to FIGS. 1, 2 and / or 3.
  • the method of identification also includes methods of selecting a plant having resistance to BNYW.
  • the method of selection comprises a final step of selecting a resistant plant.
  • the present invention relates to a method for selecting a plant having resistance to BNYW.
  • the method of selection comprises the use of a molecular marker on a DNA sequence according to SEQ ID NO: 4 and / or on a DNA sequence according to SEQ ID NO: 5 and a final step of selecting a resistant plant.
  • Sequence information markers are developed and used.
  • Sequence information as well as the identified polymorphisms that allow discrimination between resistant RR and susceptible ss alleles of the disclosed gene, allow for marker development directly in the gene, which is particularly important with respect to the development of optimized elite lineages without linkage drag Relief for the
  • resistant gene gel in cis- or trans-genetic approaches disclosed here opens up the possibility of developing new resistant varieties of the genus Beta, which have a higher resistance on the basis of the dose effect or in which a resistance break occurs by stacking the disclosed gene with other resistance genes be avoided and the resistance expression can be optimized. Furthermore, modifications of the gene by means of tilling or targeted engineering for the development of new resistance allele are conceivable.
  • the present invention relates to the use in a plant of the identified resistant RZ3 gene allele in a genetic or molecular stack with other genetic elements which can confer agronomically beneficial properties.
  • the economic value of crops can be significantly increased by:
  • the yield may be increased or new crops developed for a plant which previously were inaccessible to the cultivation of this plant due, among other things, to biotic factors such as high pathogen pressure or abiotic factors such as drought.
  • An agronomically advantageous property is for example a tolerance to a herbicide such as glyphosate, glufosinate or ALS inhibitors.
  • an agronomically advantageous property is an additional pathogen resistance, wherein pathogens may be, for example, insects, viruses, nematodes, bacteria or fungi.
  • pathogens may be, for example, insects, viruses, nematodes, bacteria or fungi.
  • pathogens may be, for example, insects, viruses, nematodes, bacteria or fungi.
  • pathogens may be, for example, insects, viruses, nematodes, bacteria or fungi.
  • pathogens may be, for example, insects, viruses, nematodes, bacteria or fungi.
  • pathogens may be, for example, insects, viruses, nematodes, bacteria or fungi.
  • a broad pathogen defense for a plant can be achieved, since genetic elements complement one another can have.
  • the expert is known as genetic elements, for example, numerous resistance genes.
  • Another example of an agronomically advantageous property is a cooling or freezing tolerance. Plants that have this property could already be sown earlier in
  • nucleic acid To generate nucleic acid encoding an auto-activated resistance protein to produce resistance to pathogens in plants.
  • This nucleic acid then has only a limited portion of an NBS-LRR resistance gene such as the RZ3 gene extending from the 5 'end of the coding region of the NBS-LRR resistance gene downstream to the beginning of the NBS domain of the NBS-LRR. Resistance gene, wherein the NBS-LRR resistance gene is not a TIR-NBS-LRR resistance gene.
  • the invention also includes the use of the resistant RZ3 gene gene identified by a method as described above for combination with a preceding one
  • SEQ ID NO: 1 genomic DNA sequence of the resistance gene RZ-3. The sequence
  • SEQ ID NO: 2 predicted protein sequence of the resistance protein RZ-3_1
  • SEQ ID NO: 3 predicted protein sequence of the resistance protein RZ-3_2
  • SEQ ID NO: 4 upstream of RZ-3 (SEQ ID NO: 1) contiguous chromosomal
  • SEQ ID NO: 7 target sequence in the RZ3 gene of the RNAi construct in the vector pZFN-C48-
  • Fig. 1 A-1 Nucleotide sequence comparison between genomic consensus sequence
  • RZ-3 gene in ss genotypes (SEQ ID NO: 6) and the RZ-3 gene of the RR genotypes (SEQ ID NO: 1). Diagnostic polymorphisms are highlighted in gray and highlighted in bold. Underlined are those polymorphisms which are not diagnostic. The potential transcription start points in the gene are indicated by arrows. They lead to two polypeptide variants RZ-3_1 and RZ-3_2. The location of the retrotransposon is marked with a black triangle on the top.
  • Figure 2 A-L Amino acid sequence comparison of the predicted polypeptide from RR genotypes (RZ-3_1, SEQ ID NO: 2) and polypeptides from 22 different ss genotypes. Diagnostic polymorphisms are highlighted in gray and highlighted in bold.
  • Figure 3 A-L Amino acid sequence comparison of the predicted polypeptide from RR genotypes (RZ-3_2; SEQ ID NO: 3) and polypeptides from 22 different ss genotypes. Diagnostic polymorphisms are highlighted in gray and highlighted in bold.
  • Fig. 4 Physical map of the RZ-3 target region.
  • five genes were annotated ("2" (DUF565), "3" (hypothetical protein), "4" (NBS-LRR candidate gene), "5" (retrotransposon) and “6” (ankyrin repeat)).
  • the NBS-LRR candidate gene ("4") contains a retrotransposon insertion ("5") in the sensitive reference sequence.
  • a gene segment (“9") was partially selected from the domain area "10" as the target sequence for the gene silencing of the resistant RZ-3 gene.
  • Figure 5 Marker analysis of the closest recombinants in the RZ-3 target region (small letters in the bold-framed area are silico-generated marker data).
  • the eight recombinant lines were phenotyped and genotyped with a total of 1051 offspring.
  • the offspring were determined from the marker data in the NBS-LRR candidate gene or the cleavage gene
  • the corresponding ELISA values are shown.
  • a cleavage or non-cleavage of offspring was checked for significance using T-test and Wilcoxon statistic.
  • the candidate gene could be clearly narrowed between the markers s3e5800s01 and s3e5873s01.
  • Figure 6 Transformation vector pZFN-C48 RNAi: d35S promoter; C48s: C48 sequence sense orientation; AtAAP6 intron2: Arabidopsis thaliana amino acid permease 6 intron; C48 as: C48 sequence antisense orientation; Nos-T: nos terminator; LB flanking site: Left border flanking site; ZFN site: Zinc-finger nuclease recognition site (complementary); Pnos: Nos promoter; NPT: coding sequence; neomycin phosphotransferase (npt) genes; pAG7: pAG7 terminator;
  • Bvpal3'UTR 3 'untranslated region of the Beta vulgaris Pal gene; LB: Left border; aadA: coding sequence; aminoglycoside-3 "adenylyltransferases (AAD); pVS1 -REP: pVS1 replication origin; ColE1 ori: ColE1 replication origin; RB: right border.
  • AAD aminoglycoside-3 "adenylyltransferases
  • pVS1 -REP pVS1 replication origin
  • ColE1 ori ColE1 replication origin
  • RB right border.
  • RZ-3 resistance also known as C48 resistance or C48
  • mapping and fine mapping maps on chromosome 3 between 57, 1, and 57.8 cM (internal reference map), that is, at a genetic distance between two flanking markers of 0.0714 cM in the genetic map.
  • a total of 8004 plants from the cross S504 (sensitive genotype) x T74 (resistant genotype) were examined.
  • Parallel to the C48 QTL mapping new informative markers were developed after each mapping step and used to restrict the C48 target region.
  • the fine mapping coordinates were additionally confirmed with the analysis of the progeny of informative recombinants.
  • Informative recombinant BC2S1 or BC2S2 plants were intensively analyzed with 90-180 offspring. These offspring were genotyped individually and phenotyped in parallel. Using statistical methods (t-test, power analysis), the phenotypes of the informative recombinants (homozygous resistant -RR / heterozygous-Rs / homozygous susceptible-ss) were detected and thus conclusions were drawn on the genotype of the informative recombinants. If the
  • the gene Distinguish homozygous classes of offspring (RR versus ss) in resistance, the gene is in the heterozygous range (Rs) of the parent plant; otherwise in the homozygous area (RR or ss) of the parent plant.
  • a physical map was generated for a rizomania-sensitive genotype by projecting markers and their genetic locations onto the chromosome sequences. With the restriction of the C48 QTL region, new informative markers were developed based on the reference sequence and additional comparative sequencing in resistant genotypes (next generation sequencing and sequencing).
  • the region identified by the fine mapping comprises a sequence length of 37996 base pairs (positions of flanking SNP markers) in the sensitive reference sequence.
  • the collinearity between the genetic and the physical map in the target area is consistent (order of 12 markers in the target area).
  • a BAC library has been developed for a selected RZ-3 (C48) resistant genotype. This BAC bank was screened with the applied markers in C48 QTL area. Several BAC clones were found for the target region identified above. Of these, three different length BAC clones were selected for sequencing, which completely covered the target region. The BAC clones were sequenced and the resulting sequence reads were used to perform a "de novo" assembly: Among the resulting resistant sequence contigs, the largest sequence was 1 10909 bp (34537 reads) and completely encompassed the target region.
  • the NB-ARC-LRR candidate gene was sequenced in two steps.
  • the retrotransposon insertion site was verified in a genotype set with a total of 92 resistant and sensitive genotypes. This analysis showed that all resistant genotypes had no retrotransposon insertion. Of the sensitive genotypes, the insertion could be detected in more than 90% of the cases. Thus, the evidence of insertion seems to be coupled with the susceptible genotype. However, because of the contradictions found (about 10% of the remaining susceptible genotypes without insertion), sequencing was extended in the second step for the entire gene before the promoter site insertion site (SEQ ID NO: 1). In total, 31 selected resistant and susceptible genotypes including the conflicting genotypes were sequenced and compared.
  • Primer combinations developed.
  • the first and the second primer combinations are able to detect the insertion, since one primer each of the two primer pairs in the
  • Retrotransposon sit (left or right flank of the retrotransposon) and the second primer binds directly before or after the retrotransposon.
  • a third primer pair detects the absence of the retrotransposon, in that the primers find a binding site before and after the retrotransposon.
  • a PCR product under standard conditions can only arise if the retrotransposon is missing, otherwise with the retrotransposon the PCR product would be too large and thus no amplicon would arise in this way.
  • RNA interference In addition to the above-described_Verility of the gene by means of narrow recombinants was also a further demonstration of the resistance effect of the gene by means of RNA interference.
  • a resistant standard sugar beet genotype was transformed with a DNA construct, which encodes a double-stranded hairpin RNA. This dsRNA was able to effect post-transcriptional gene silencing, which would reduce or eliminate the effect of the resistant RZ-3 gene allele, thus rendering the previously resistant
  • a defined target sequence range of the resistant 434 base pair RZ3 gene gel (SEQ ID NO: 7; Figure 4) was selected, amplified by PCR, and into the vector in both the sense and antisense directions pZFN suitable for the synthesis of hairpin structures (Figure 6).
  • This vector has a double CaMV 35S promoter, a multiple cloning site, an AtAAP6 gene intron coding for an amino acid permease in Arabidopsis thaliana, another multiple cloning site, and a nos terminator.
  • the transformation of the sugar beets with the provided vector was carried out according to the protocol of Lindsey & Gallois (1990) using the antibiotic kanamycin as a selection marker.
  • transgenic shoots After several selection steps, the successful transformation on transgenic shoots was checked by PCR by detecting the presence of the nptll gene, the AAP6 intron and the two t-DNA border sequences (LB / RB) and the absence of vir. Positive shoots were clonally propagated in vitro on every 30 shoots, rooted and transferred to soil in the greenhouse. About 2 weeks later, the transgenic sugar beet plants were piked into Rizomania contaminated soil, where they were cultured for 8 to 10 weeks. As a control, untransformed plants of the same resistant standard genetic transformation background were used under the same conditions.

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Abstract

Durch die vorliegende Erfindung wird ein neues Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber einem Pathogen, insbesondere "Beet Necrotic Yellow Vein Virus" in einer Pflanze, insbesondere einer Pflanze der Gattung Beta, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln, sowie ein bevorzugtes Nukleinsäuremolekül, welches das RZ-3-Gen von Beta maritima kodiert, Derivate und Homologe davon bereitgestellt. Weitere Aspekte der Erfindung schließen Vektoren, transgene Pflanzenzellen, transgene Pflanzen, Verfahren zur deren Herstellung und Verfahren zur Identifizierung eines Resistenz-vermittelnden Nukleinsäuremoleküls mit ein.

Description

RESISTENZGEN GEGEN RIZOMANIA
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber einem Pathogen, insbesondere gegenüber„Beet Necrotic Yelllow Vein Virus" in einer Pflanze, insbesondere der Gattung Beta, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Polypeptid, welches in der Lage ist eine Resistenz gegenüber einem Pathogen in einer Pflanze, insbesondere eine Resistenz gegenüber BNYW in einer Pflanze der Gattung Beta, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln und welches durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodiert wird. Die Erfindung betrifft weiterhin eine transgene Pflanze, Pflanzenzelle,
Pflanzenorgan, Pflanzengewebe, Pflanzenteil oder einen Samen einer Pflanze, welche das Nukleinsäuremolekül oder Teile davon umfassen sowie Verfahren zur Herstellung einer solchen transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle. Ferner schließt die Erfindung auch Verfahren zum Nachweis des Resistenz-vermittelnden Nukleinsäuremoleküls sowie Verfahren zur Selektion von Pflanzen oder Pflanzenzellen, welche das Resistenz-vermittelnde Nukleinsäuremolekül aufweisen.
Hintergrund der Erfindung
Die Rizomania ist die wirtschaftlich bedeutendste Zuckerrübenkrankheit weltweit, die
Ertragsverluste von 50 % und mehr verursachen kann. Die Krankheit, die auch
„Wurzelbärtigkeit" genannt wird, wird durch das„Beet Necrotic Yellow Vein Virus" (BNYW) hervorgerufen und durch den bodenbürtigen Protozoen Polymyxa betae übertragen. Eine BNYW-Infektion äußert sich in einer gesteigert Proliferation der dünnen Wurzeln und
Seitenwurzeln und in der Ausbildung eines stark verkleinerten Wurzelkörpers mit reduzierten Zuckergehalt. Infizierte Pflanzen zeigen eine verminderte Wasseraufnahme und sind somit empfindlicher gegenüber Trockenstress. Wenn sich die Infektion auf die Gesamtpflanze ausweitet, kommt es zur Gelbfärbung der Blattvenen, zu nekrotischen Läsionen und gelben Flecken auf den Blättern. Da eine kurative Bekämpfung der Krankheit wie bei anderen viralen Krankheiten nicht möglich ist, kann ein Schaden nur über den Anbau von resistenten Sorten verhindert werden. Derzeit sind im Wesentlichen drei Majorgene gegen die Rizomania untersucht: RZ-1 (auch als„Holly" bezeichnet), RZ-2 und RZ-3. Darüber hinaus werden weitere, aber weniger bedeutende Rizomania-Resistenzgene in der Literatur beschrieben. Dabei ist das
|Bestätigungskopie| Resistenzgen RZ-1 bereits in den meisten Zuchtlinien (Saateiter oder/und Pollenspender Elternkomponenten) inkorporiert. Es zeigte sich jedoch, dass in stark infizierten Regionen oder in Regionen mit diversen BNYW-Pathotypen (bspw. Sohi & aleki, 2004) die Resistenz, welche durch RZ-1 vermittelt wird, nicht ausreicht. Aus diesem Grund wurde schon vor geraumer Zeit vorgeschlagen RZ-1 mit beispielsweise RZ-2 oder RZ-3 zu kombinieren. RZ-2 und RZ-3 stammen aus Beta vulgaris subsp. mar/'i/'ma-Quellen (WB42, WB41 ) und kartieren genetisch in der gleichen Region auf Chromosom 3 des Zuckerrübengenoms, während RZ-1 südlich von RZ-2 und RZ-3 aber ebenfalls auf Chromosom 3 kartiert. Schölten et al. (1999) bestimmte einen Abstand von 20-25 cM zwischen den RZ-Majorgenen RZ-1 und RZ-2. Gidner et al. (2005) findet einen kleineren Abstand von 5 cM zwischen RZ-1 und RZ-2 und schließt nicht aus, dass RZ-2 und RZ-3 auf dem gleichen Lokus kartieren. Schmidlin et al. (2008) hatte mittels Expressionsanalyse in infizierten Rüben unterschiedlich induzierte Gene identifiziert, welche aber nicht RZ-2 oder RZ-3 entsprachen. In der Studie von Larson et al. (2008) wurden mit der MALDI-TOF-MS Methode einige BNYW induzierte Proteine in der Zuckerrübe detektiert, die Proteine, welche durch RZ-1 , RZ-2 oder RZ-3 kodiert werden, konnten die Wissenschaftler jedoch nicht identifizieren. Zudem ist die Sequenzregion, insbesondere um diese Resistenzgene herum, repetitiv, was die Entwicklung von diagnostischen Marker besonders schwierig macht. So sind bis jetzt weder hochauflösende Markerkarten noch verifizierte Kandidatengene für die genannten Rizomania-Resistenzgene öffentlich verfügbar. Außerdem ist bislang der funktionelle Hintergrund dieser RZ-Resistenzgene, d. h. die genetische Struktur, völlig unbekannt.
Für eine nachhaltige Züchtung gegen Rizomania, die der Gefahr von Resistenz-brechenden BNYW-Isolaten entgegen wirken soll, ist es notwendig, ständig neue Resistenzgene zu identifizieren und diese in die Genpools der Kulturpflanzen wie Zuckerrüben zu integrieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Stands der Technik gemacht, wobei es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein
Nukleinsäuremolekül und/oder ein Polypeptid bereitzustellen, welches in der Lage ist, Resistenz gegenüber Rizomania in einer Pflanze zu vermitteln. Weiterhin ist es Aufgabe eine transgene Rizomania-resistente Pflanze sowie eine Methode zu deren Herstellung bereitzustellen.
Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung Methoden zur Nutzung und Entwicklung molekulare Marker bereitzustellen, welche eine effiziente Züchtung gegen Rizomania und die Entwicklung neuer resistenter Pflanzenlinien ermöglichen. Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung, welche die Aufgabe lösen, basieren auf der genetischen Feinkartierung, Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung eines Gens, das aus dem Donor Beta vulgaris subsp. maritima stammt und für ein Polypeptid bzw. Protein kodiert, das in der Lage ist, Resistenz gegenüber einem Pathogen in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln.
Einige der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe werden nachfolgend zunächst näher erläutert:
Der Begriff„etwa" im Zusammenhang mit der Angabe einer Länge einer Nukleotidsequenz bedeutet eine Abweichung um +/- 200 Basenpaaren, bevorzugt um +/- 100 Basenpaaren und besonders bevorzugt um +/- 50 Basenpaaren.
Eine„Pflanze der Gattung Beta" gehört zu der Familie der Fuchsschwanzgewächse
(Amaranthaceae). Zu diesen Pflanzen zählen Pflanzen der Spezies Beta macrocarpa, Beta vulgaris, Beta lomatogona, Beta macrorhiza, Beta corolliflora, Beta trigyna und Beta nana. Eine Pflanze der Spezies Beta vulgaris ist insbesondere eine Pflanze der Subspezies Beta vulgaris subsp. maritima (See-Mangold) oder Beta vulgahs subsp. vulgaris. Hierzu zählen
beispielsweise Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (Zuckerrübe i.e.S.), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. vulgaris (Mangold), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. conditiva (Rote
Rübe/Bete), Beta vulgaris ssp. vulgaris var. crassa/alba (Futterrübe).
Unter„Hybridisieren" oder„Hybridisierung" wird ein Vorgang verstanden, bei dem sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül an einen weitestgehend komplementären
Nukleinsäurestrang anlagert, d.h. mit diesem Basenpaarungen eingeht. Standardverfahren zur Hybridisierung sind beispielsweise in Sambrook et al. 2001 beschrieben. Vorzugsweise wird darunter verstanden, dass mindestens 60%, weiter bevorzugt mindestens 65%, 70%, 75%, 80% oder 85%, besonders bevorzugt 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% der Basen des Nukleinsäuremoleküls eine Basenpaarung mit dem weitestgehend komplementären Nukleinsäurestrang eingehen. Die Möglichkeit einer solchen Anlagerung hängt von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Der Begriff„Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. Hohe Stringenz ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert ist, niedrige Stringenz, wenn eine Basenpaarung erleichtert ist. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen hängt beispielsweise von der Salzkonzentration bzw. lonenstärke und der Temperatur ab. Generell kann die Stringenz durch eine Erhöhung der Temperatur und/oder eine Erniedrigung des Salzgehaltes erhöht werden. Unter„stringenten
Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine
Hybridisierung überwiegend nur zwischen homologen Nukleinsäuremolekülen stattfindet. Der Begriff„Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich dabei nicht nur auf die bei der eigentlichen Anlagerung der Nukleinsäuren herrschenden Bedingungen, sondern auch auf die bei den anschließenden Waschschritten herrschenden Bedingungen. Stringente
Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Bedingungen, unter denen überwiegend nur solche Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95%
Sequenzidentität aufweisen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 65 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Der hier verwendete Begriff "stringente
Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68 °C in 0,25 M
Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA und 1 % BSA für 16 Stunden und
anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 x SSC und 0, 1 % SDS bei 68 °C. Bevorzugt findet eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen statt.
Unter einem„isolierten Nukleinsäuremolekül" wird ein aus seiner natürlichen bzw.
ursprünglichen Umgebung herausgelöstes Nukleinsäuremolekül verstanden. Der Begriff umfasst auch ein synthetisch hergestelltes Nukleinsäuremolekül. Unter einem„isolierten Polypeptid" wird ein aus seiner natürlichen bzw. ursprünglichen Umgebung herausgelöstes Polypeptid verstanden. Der Begriff umfasst auch ein synthetisch hergestelltes Polypeptid.
Ein„molekularer Marker" ist eine Nukleinsäure, die polymorph ist in einer pflanzlichen
Population. Dadurch ist ein solcher Marker in der Lage verschiedene allelische Zustände (Allele) zu detektieren und zu unterscheiden. Genutzt werden hierfür bekannte analytische Verfahren wie beispielsweise RFLP, AFLP, SNP, SSR oder KASP. Der Begriff„molekularer Marker" bezieht sich auch auf Nukleotidsequenzen, welche komplementär oder zumindest weitestgehend komplementär oder homolog sind zu genomischen Sequenzen, zum Beispiel Nukleinsäuren welche als Sonden oder Primer eingesetzt werden. Marker, die genetische Polymorphismen beschreiben sind, können unter Verwendung gut etablierter Methoden nachgewiesen werden. Dies sind z.B. eine PCR-basierte Sequenz-spezifische Amplifikation, eine Detektion von ,Restriction Fragment Length Polymorphisms' (RFLP), eine Detektion von Polynukleotid-Polymorphismen mittels .Allele Specific Hybridization' (ASH), eine Detektion von amplifizierten Variable Sequences' des Pflanzengenoms, eine Detektion einer 'Self-Sustained Sequence Replication', eine Detektion von 'Simple Sequence Repeats' (SSRs), eine Detektion von .Single Nucleotide Polymorphisms' (SNPs), oder eine Detektion von .Amplified Fragment Length Polymorphisms' (AFLPs). Ferner sind auch die Methoden zur Detektion von 'Expressed Sequence Tags' (ESTs) und SSR-Marker abgeleitet von EST-Sequenzen und .Randomly Amplified Polymorphie DNA' (RAPD) bekannt. Ein "Promotor" meint eine nicht-translatierte regulatorische DNA-Sequenz, typischerweise stromaufwärts einer kodierenden Region, welche die Bindestelle für die RNA-Polymerase beinhaltet und die Transkription der DNA initiiert.
Ein "Pathogen" meint einen Organismus, der in Interaktionen mit einer Pflanze zu
Krankheitssymptomen an einem oder mehreren Organen bei der Pflanze führt. Zu diesen Pathogenen zählen beispielsweise tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Organismen oder Oomyceten.
Unter einer "Pathogeninfektion" ist der früheste Zeitpunkt zu verstehen, zu dem ein Pathogen mit einem pflanzlichen Wirtsgewebe interagiert. Beispielsweise im Fall des viralen Pathogens BNYW wird dieser durch den Protozoen Polymyxa betae übertragen. Polymyxa bildet Sporen, die in der Erde über viele Jahrzehnte überdauern können. In diesen Sporen überdauert auch der Virus. Wenn diese Dauersporen zu mobilen Zoosporen auskeimen, kann der Virus über diese in Zellen des pflanzlichen Wirtsgewebes gelangen und dort mit dem Wirt interagieren (Esser 2000).
Pflanzliche "Organe" meinen beispielsweise Blätter, Sprossachse, Stamm, Wurzeln, Hypocotyl, vegetative Knospen, Meristeme, Embryos, Antheren, Ovula oder Früchte. Pflanzliche "Teile" meinen einen Zusammenschluss mehrerer Organe, z.B. eine Blüte oder ein Samen, oder einen Teil eines Organs, z.B. eine Querschnitt durch den Spross. Pflanzliche "Gewebe" sind zum Beispiel Kallusgewebe, Speichergewebe, meristematische Gewebe, Blattgewebe,
Sprossgewebe, Wurzelgewebe, Pflanzentumorgewebe oder reproduktives Gewebe. Unter pflanzlichen "Zellen" sind beispielsweise isolierte Zellen mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen.
Der Begriff„Resistenz" ist breit zu verstehen und deckt den Bereich des Schutzes von einer Verzögerung bis zur kompletten Hemmung der Entwicklung der Krankheit ab. Ein Beispiel für einen Pathogen von Bedeutung ist der Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYW). Vorzugsweise erreicht eine resistente Pflanzenzelle der Erfindung oder resistente Pflanze der Erfindung eine Resistenz gegen BNYW. Eine Resistenz gegenüber einem Pathogen ist gleichzusetzen mit einer Resistenz gegenüber der Krankheit, welche dieser Pathogen verursacht, beispielsweise ist eine Resistenz gegenüber BNYW auch eine Resistenz gegenüber Rizomania.
"Transgene Pflanze" bezieht sich auf einen Pflanze, in dessen Genom mindestens eine Nukleinsäure integriert wurde. Dabei kann es sich um eine heterologe Nukleinsäure handeln. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure stabil integriert, was bedeutet, dass die integrierte Nukleinsäure in der Pflanze stabil erhalten bleibt, exprimiert werden kann und auch stabil an die Nachkommen vererbt werden kann.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber einem Pathogen in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln. Das Nukleinsäuremolekül umfasst eine
Nukleotidsequenz, welche ausgewählt ist aus a) einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 kodiert, b) einer Nukleotidsequenz, die die kodierende Sequenz der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst, c) einer Nukleotidsequenz, die mit der komplementären Sequenz zu der
Nukleotidsequenz nach a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, d) einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches sich durch Substitution, Deletion und/oder Addition von einer oder mehrerer Aminosäuren der
Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird, von einem Polypeptid, das durch die Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird, ableitet, e) einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches eine
Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 60% identisch ist zu einer Aminosäuresequenz, welche durch die Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird, oder f) einer Nukleotidsequenz, welche mindestens eine Nukleotid-bindende Domäne (NBS bzw. NB-ARC) entsprechend den Aminosäurepositionen 168-227 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 182-241 der SEQ ID NO: 3, mindestens eine Leuzin-reiche Domäne (LRR) entsprechend den
Aminosäurepositionen 591-613 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 605-627 der SEQ ID NO: 3 und/oder mindestens eine interne repetitive Domäne (IR) entsprechend den Aminosäurepositionen 1013-1072 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 1027-1086 der SEQ ID NO: 3 kodiert. Bei dem Nukleinsäuremolekül kann es sich um ein isoliertes Nukleinsäuremolekül handeln. Bevorzugt handelt es sich um DNA, und besonders bevorzugt um cDNA (kodierende DNA). Vorzugsweise vermittelt das Polypeptid, welches durch das erfindungsgemäße
Nukleinsäuremolekül kodiert wird, eine Resistenz gegenüber dem viralen Pathogen„Beet Necrotic Yellow Vein Virus" (BNYW), welcher die Pflanzenkrankheit Rizomania verursacht. Weiterhin vermittelt das Polypeptid, welches durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodiert wird, insbesondere in einer Pflanze der Gattung Beta eine Resistenz gegenüber einem Pathogen. Bevorzugt handelt es sich bei der Pflanze um eine Pflanze der Spezies Beta vulgaris, besonders bevorzugt um eine Pflanze der Subspezies Beta vulgaris subsp. maritima oder Beta vulgaris subsp. vulgaris; hierzu zählen beispielsweise die Kulturarten Zuckerrübe, Rote Bete, Futterrübe, Blattmangold und Stielmangold.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls umfasst das
Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz nach a). Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 des kodierten Polypeptids und/oder gemäß SEQ ID NO: 3 des kodierten Polypeptids stellt das Resistenzprotein des RZ-3-Gens dar. Es handelt sich hierbei um ein Resistenzgen/- protein des Typs NBS-LRR, das durch bestimmte Strukturmotive charakterisiert ist. Die allgemeine Struktur von solchen Resistenzproteinen in Pflanzen ist bereits gut untersucht (Martin et al. 2003). Jedoch ist das Prinzip der strukturellen Ausgestaltung insbesondere der sog. LRR-Domäne, welche als potentielle Erkennungsdomäne für zumeist unbekannte pathogene Effektoren gilt, nicht vorhersagbar. Demzufolge ist die Identifizierung eines BNYW- Resistenz-vermittelnden Gens bzw. Proteins allein auf Grundlage der bekannten Strukturmotive unmöglich. Die Identifizierung des RZ-3-Resistenzgens fand im Zuge eines Map-based- Cloning-Prozesses statt, der eine intensive genetische Kartierung und Feinkartierung der Zielregion, in welcher das RZ-3-Resistenzgen zunächst vermutet wurde, erforderte. Die
Entwicklungsarbeiten werden weiter unten genauer beschreiben.
Das identifizierte Resistenzprotein gehört zum Typ NBS-LRR und weist eine Nukleotid- bindende Domäne (NBS, auch bekannt unter NB-ARC (nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1 , R proteins, and CED-4)) entsprechend den Aminosäurepositionen 168-227 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 182-241 der SEQ ID NO: 3, eine Leuzin-reiche Domäne (LRR) entsprechend den Aminosäurepositionen 591 -613 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 605-627 der SEQ ID NO: 3 und/oder mindestens eine interne repetitive Domäne (IR; Internal Repeat-Domäne) entsprechend den Aminosäurepositionen 1013-1072 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den
Aminosäurepositionen 1027-1086 der SEQ ID NO: 3 auf. Die NBS-Domäne wird durch die Nukleotide 2019-2882 der SEQ ID NO: 1 , die LRR-Domäne durch die Nukleotide 3288-3356 der SEQ ID NO: 1 und die IR-Domäne durch die Nukleotide 4554-4871 der SEQ ID NO: 1 kodiert. Die NB-ARC-Domäne ist eine zentrale Nukleotid-bindende Domäne. Sie ist wahrscheinlich eine funktionelle ATPase-Domäne, welche voraussichtlich die Aktivität eines Resistenzproteins reguliert. Die NB-ARC-Domäne besteht aus drei Subdomänen: NB, ARC1 und ARC2. Charakteristische Motive der NB-ARC-Domäne sind APAF-1 (apoptotic protease- activating factor-1 ), welche mutmaßlich für die hypersensitive Reaktion verantwortlich ist, hhGRExE, Walker-A- oder P-Ioop, Walker-B, GxP, RNBS-A bis D und MHD (Ooijen et al., 2008). Einige der genannten Motive konnten bereits identifiziert werden. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls umfasst das
Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz nach b). Die Nukleotidsequenz umfasst die kodierenden Sequenzen der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , welche für die
Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 und 3 kodieren.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls umfasst das Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz nach d). Diese Nukleotidsequenz kodiert ein Polypeptid, das ein Derivat des Polypeptids darstellt, welches von der Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird. Ein Derivat des Polypeptids stellt eine abgeleitete Aminosäuresequenz dar, welche mindestens eine Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehrerer Aminosäuren aufweist, wobei die Funktionalität des kodierten Polypeptids/Proteins erhalten bleibt. Bei der Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit gleichen oder äquivalenten oder ähnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften spricht man von einem „konservativen Austausch" oder„semikonservativen Austausch". Beispiele für physikalischchemische Eigenschaften einer Aminosäure sind beispielsweise die Hydrophobie oder die Ladung. Dem Fachmann ist bekannt, welche Aminosäuresubstitution einen konservativen oder semikonservativen Austausch darstellt. Das allgemeine Fachwissen erlaubt es darüber hinaus, dass der Fachmann erkennen, identifizieren und nachweisen kann, welche
Aminosäuredeletionen und -additionen für die Funktionalität des Resistenzproteins RZ-3 unschädlich sind und an welchen Positionen diese möglich sind. Dem Fachmann ist bewusst, dass im Falle des vorliegenden NBS-LRR-Proteins für Modifikationen der Aminosäuresequenz (Substitutionen, Deletionen oder Additionen von einer oder mehrerer Aminosäuren) insbesondere die Funktionalität der oben definierten konservierten Domänen erhalten bleiben muss und dass daher in diesen Domänen nur begrenzt vorstehende Modifikationen möglich sind. Die Nukleotidsequenz dieser Ausführungsform kodiert dann für ein Derivat bzw. für eine abgeleitete Aminosäuresequenz, wenn die Nukleotidsequenz zu mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% homolog oder identisch ist zu der Nukleotidsequenz nach a) oder b) ist. Vorzugsweise können solche Nukleotidsequenzen, welche für ein Derivat bzw. für eine abgeleitete Aminosäuresequenz kodieren, entweder direkt oder indirekt (beispielsweise via Amplifikations- oder Replikationsschritte) aus einer Ausgangsnukleotidsequenz, welche über die Gesamtlänge oder zumindest teilweise der SEQ ID NO: 1 oder einer anderen hier offenbarten Sequenz entspricht, erzeugt werden.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls umfasst das Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz nach e). Diese Nukleotidsequenz kodiert für ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% identisch ist zu einer
Aminosäuresequenz, welche durch die Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls umfasst das Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz nach f). Die Nukleotidsequenz kodiert hierbei mindestens eine Nukleotid-bindende Domäne (NBS) entsprechend den Aminosäurepositionen 168-227 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 182-241 der SEQ ID NO: 3, mindestens eine Leuzin-reiche Domäne (LRR) entsprechend den Aminosäurepositionen 591 -613 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 605-627 der SEQ ID NO: 3 und/oder mindestens eine interne repetitive Domäne (IR) entsprechend den
Aminosäurepositionen 1013-1072 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den
Aminosäurepositionen 1027-1086 der SEQ ID NO: 3. Bevorzugt kodiert die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid, das mindestens eine Nukleotid-bindende Domäne (NBS) entsprechend den Aminosäurepositionen 168-227 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den
Aminosäurepositionen 182-241 der SEQ ID NO: 3, mindestens eine Leuzin-reiche Domäne (LRR) entsprechend den Aminosäurepositionen 591 -613 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 605-627 der SEQ ID NO: 3 und mindestens eine interne repetitive Domäne (IR) entsprechend den Aminosäurepositionen 1013-1072 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 1027-1086 der SEQ ID NO: 3 umfasst. Besonders bevorzugt liegen diese Domänen in dem Polypeptid sequentiell vom N- zum C-Terminus in der Reihenfolge NBS - LRR - IR vor, wobei zwischen Domänen jeweils ein oder mehrere weitere Aminosäuren anwesend sein können.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin auch ein Polypeptid, welches in der Lage ist eine Resistenz gegenüber einem Pathogen in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln und welches durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodiert wird, wobei der Pathogen vorzugsweise BNYW ist und/oder die Pflanze vorzugsweise eine Pflanze der Gattung Beta, insbesondere eine Pflanze der Spezies Beta vulgaris, ist. Besonders bevorzugt weist das Polypeptid eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder gemäß SEQ ID NO: 3 auf. Bei dem Polypeptid kann es sich um ein isoliertes Polypeptid handeln.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, welcher das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül umfasst. Bei dem Vektor kann es sich um ein Plasmid, ein Cosmid, eine Phage oder einen Expressionsvektor, einen Transformationsvektor, Shuttle- Vektor oder Klonierungsvektor handelt, er kann doppel- oder einzelsträngig, linear oder zirkulär sein oder kann einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt entweder durch Integration in dessen Genom oder extrachromosomal transformieren. Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül in einem Expressionsvektor mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen, welche die Transkription und optional die Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle erlauben, operativ verknüpft. Beispielsweise steht das
Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder eines Terminators. Geeignete Promotoren können Promotoren sein, welche konstitutiv induziert werden (Bsp.: 35S-Promoter aus dem„Cauliflower mosaic virus" (Odell et al. 1985), besonders geeignet sind solche Promotoren, welche pathogen-induzierbar sind (Bsp.: PR1 -Promotor aus Petersilie (Rushton et al., 1996). Besonders geeignete Pathogen-induzierbare Promotoren sind synthetische bzw. chimäre Promotoren, welche in der Natur nicht vorkommen, aus mehreren Elementen zusammengesetzt sind und einen Minimalpromotor beinhalten sowie stromaufwärts des Minimalpromotors mindestens ein cis-regulatorisches Element aufweisen, welches als Bindungsstelle für spezielle Transkriptionsfaktoren dient. Chimäre Promotoren werden den gewünschten Anforderungen nach konzipiert und werden durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert. Beispiele für solche Promotoren finden sich in WO 00/29592, WO 2007/147395 und WO 2013/091612. Ein geeigneter Terminator ist beispielsweise der nos- Terminator (Depicker et al. , 1982).
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Vektoren, stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren bereit, das die Einbringung eines beschriebenen Vektors in eine Wirtszelle umfasst. Der Vektor kann beispielsweise durch Konjugation, Mobilisation, biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation, Transfektion, Transduktion, Vakuuminfiltration oder Elektroporation eingebracht werden. Solche Verfahren ebenso wie Verfahren zur Präparation von beschriebenen Vektoren sind dem Fachmann geläufig (Sambrook et al. 2001 ).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine Wirtszelle im Sinne der Erfindung kann eine prokaryotische (z.B. bakteriell) oder eukaryotische Zelle (z.B. eine pflanzliche Zelle oder eine Hefezelle) sein. Vorzugsweise ist die Wirtszelle ein Agrobakterium wie Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes oder eine Pflanzenzelle, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfassen. Dem Fachmann sind sowohl zahlreiche Methoden wie Konjugation oder Elektroporation bekannt, mit denen er das erfindungsgemäße
Nukleinsäuremolekül oder den Vektor der vorliegenden Erfindung in ein Agrobakterium einbringen kann, als auch Methoden wie diverse Transformationsverfahren (biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte Transformation), mit denen er das
erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder den Vektor der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle einbringen kann (Sambrook et al. 2001 ).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanzenzelle, welche das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül als Transgen oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Eine solche transgene Pflanzenzelle ist beispielsweise eine Pflanzenzelle, welche mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder mit dem Vektor der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise stabil, transformiert ist. In einer bevorzugten
Ausgestaltung der transgenen Pflanzenzelle ist, das Nukleinsäuremolekül mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen, welche die Transkription und optional die Expression in der Pflanzenzelle erlauben, operativ verknüpft. Das Gesamtkonstrukt aus dem
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül und der/den regulatorischen Sequenzen stellt dann das Transgen dar. Solche regulatorische Sequenzen sind beispielsweise ein Promoter oder ein Terminator. Dem Fachmann sind zahlreiche in Pflanzen anwendbare, funktionelle Promotoren und Terminatoren bekannt. Bevorzugt zeigt eine transgene Pflanzenzelle der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine Zelle einer Pflanze der Gattung Beta, gegenüber einem
Pathogen, insbesondere BNYW, eine höhere Resistenz als eine korrespondierende nicht- transformierte Pflanzenzelle (die Pflanzenzelle ohne das Transgen). Das Level der Resistenz beispielsweise gegenüber BNYW kann in Pflanzen der Gattung Beta qualitativ durch
Bestimmung von Boniturnoten festgelegt werden (Boniturnotenschemata für Pflanze der Gattung Beta sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise für Zuckerrüben
Mechelke (1997)). Eine höhere Resistenz zeigt sich in einer Verbesserung der Resistenz um mindestens eine Boniturnote, um mindestens zwei Boniturnoten, um mindestens drei oder mehr Boniturnoten. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle der vorliegenden Erfindung, welches einen Schritt des
Einbringens des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in eine pflanzliche Zelle umfasst. Beispielsweise kann das Einbringen durch
Transformieren stattfinden, vorzugsweise durch stabiles Transformieren. Die geeigneten Techniken zur Einbringung wie biolistische Transformation, Agrobakterium-vermittelte
Transformation oder Elektroporation sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al. 2001 ).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze oder einen Teil davon, umfassend eine vorstehend beschriebene transgene Pflanzenzelle. Ein Teil kann dabei eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ oder ein Zusammenschluss von mehreren Zellen, Geweben, oder Organen sein. Ein Zusammenschluss von mehreren Organen ist z.B. eine Blüte oder ein Samen. In einer besonderen Ausgestaltung betrifft die Erfindung einen Samen von der transgenen Pflanze, wobei der Samen das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül als Transgen umfasst. Bevorzugt zeigt eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine Pflanze der Gattung Beta, gegenüber einem Pathogen, insbesondere BNYW, eine höhere Resistenz als eine korrespondierende nicht-transformierte Pflanze (Pflanze ohne das Transgen). Das Level der Resistenz beispielsweise gegenüber BNYW kann in Pflanzen der Gattung Beta qualitativ durch Bestimmung von Boniturnoten festgelegt werden (Boniturnotenschemata-für Pflanze der Gattung Beta sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise für Zuckerrüben Mechelke (1997)). Eine höhere Resistenz zeigt sich in einer Verbesserung der Resistenz um mindestens eine Boniturnote, um mindestens zwei
Boniturnoten, um mindestens drei oder mehr Boniturnoten. Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, welches einen Schritt des
Einbringens des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in eine pflanzliche Zelle und optional einen Schritt der Selektion einer transgenen Pflanzenzelle umfasst. Weiterhin ist ein solches Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze durch einen anschließenden Schritt gekennzeichnet, der die Regenerierung der transgenen Pflanze aus der im ersten Schritt erzeugten transgenen Pflanzenzelle einschließt. Methoden zur Regeneration sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Vermittlung oder Erhöhung einer Resistenz gegenüber einem Pathogen, insbesondere BNYW, in einer Pflanze, bevorzugt einer Pflanze der Gattung Beta, welche einen Schritt des Transformierens einer Pflanzenzellen mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder dem Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Bevorzugt führt dieses Verfahren zu einer Verbesserung der Resistenz um mindestens eine Boniturnote, besonders bevorzugt zu einer Verbesserung der Resistenz um mindestens zwei, drei oder mehr Boniturnoten. Boniturnotenschemata für Pflanze der Gattung Beta sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise für Zuckerrüben Mechelke (1997).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine regulatorische Sequenz eines Promotors, welche die Expression eines Gens, das das erfindungsgemäße
Nukleinsäuremolekül umfasst, kontrolliert, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Sequenz in der Lage ist, die Expression einer heterologen DNA-Sequenz infolge einer
Pathogeninfektion zu vermitteln oder zu modulieren, und die regulatorische Sequenz ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 von den Nukleotiden 1 - 1403 umfasst. Vorzugsweise ist die heterologe DNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz, welche für eine Komponente der pflanzlichen Pathogenabwehr kodiert (Bsp.: Resistenzgene (R-Gene) oder Gene, welche für am Signaltransfer beteiligte Enzyme wie Kinasen oder Phosphatasen sowie für G-Protein kodieren) oder welche für einen pathogenen Effektor kodiert (sog.
Avirulenzgene (avr)). Weiterhin erfasst die vorliegende Erfindung ein rekombinantes DNA- Molekül, welches die vorstehend beschriebene regulatorische Sequenz umfasst. Vorzugsweise ist das rekombinante DNA-Molekül mit einer heterologen DNA-Sequenz operativ verknüpft.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Wirtszelle, welche mit der vorstehend beschriebenen regulatorischen Sequenz oder mit dem genannten
rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist sowie auf eine transgene Pflanze,
Pflanzengewebe oder Pflanzenzelle, welche die regulatorische Sequenz oder das rekombinante DNA-Molekül als Transgen umfasst. Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, welche einen Schritt des Einbringens der regulatorischen Sequenz der Erfindung oder des rekombinanten DNA-Molekül und optional einen Schritt der Selektion einer transgenen Pflanzenzelle umfasst. Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, welche einen Schritt des Einbringens der regulatorischen Sequenz der Erfindung oder des rekombinanten DNA-Molekül in eine pflanzliche Zelle und optional einen Schritt der Selektion einer transgenen Pflanzenzelle umfasst. Weiterhin ist ein solches Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze durch einen anschließenden Schritt gekennzeichnet, der die Regenerierung der transgenen Pflanze aus der im ersten Schritt erzeugten transgenen Pflanzenzelle einschließt.
Wie bereits oben ausgeführt, fand die Identifizierung des RZ-3-Resistenzgens im Zuge eines Map-based-Cloning-Prozesses statt. Der durchgeführte Prozess umfasste beispielsweise die Schritte: Genetische Feinkartierung, physikalische Kartierung, Aufbau einer sehr großen spaltenden Population von über 8000 F2-spaltenden Nachkommen, Rekombinanten-Screen, Markerentwicklung in der Zielregion, vergleichende BAC Sequenzierung in resistenten und sensitiven Genotypen, bioinformatische Analysen, Proteinvorhersagen und Vergleich der Proteine. Solche langwierigen Entwicklungsarbeiten sind immer überaus kostspielig und es ist ungewiss, ob es tatsächlich gelingt das Gen zu identifizieren. Nach Integration des RZ-3-Lokus aus Beta vulgaris subsp. maritima in einer Pflanze der Gattung Beta, nämlich in Zuckerrübe (Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima) wurden für die Verfolgung des RZ-3- Genomsegments in der Feinkartierung Marker mit guten diagnostischem Wert entwickelt, was sich als besonders schwierig herausstellte, da die Zielregion über weite Bereiche hin repetitiv ist. Überraschenderweise gelang dennoch die Entwicklung von einigen wenigen diagnostischen Markern, welche teilweise auch nur mit einer bestimmten Markertechnik wie Pyrosequenzen also als PSQ-Marker funktionierten oder nullallelisch waren. Trotz dieser technischen Schwierigkeiten konnte durch umfangreiche Analyse unter Verwendung dieser Marker eine Eingrenzung des RZ-3-Lokus auf eine genomische Region von 0,67 cM erreicht werden. Dies entspricht einer physikalischen Länge von etwa 340.000 bp. Trotz intensiver Weiterentwicklungen war es nur noch beschränkt möglich, die Beta vulgaris subsp. mar/f/ma-lntrogression um das Gen herum Marker-gestützt weiter zu reduzieren und Kandidatengene für das RZ-3-Gen zu identifizieren. Eine weitere Verkürzung der Introgression ist jedoch aus züchterischer Sicht in jedem Fall wünschenswert, um potentiell vorhandenen „Linkage Drag", eng gekoppelt zu dem RZ-3-Gen, zu eliminieren. In mehreren Schritten mittels Feinkartierung und unter Einbindung von Sequenzinformation aus physikalischen Karten konnte schließlich eine Zielregion auf nur noch etwa 0,07 cM eingeengt werden. Dies wurde jedoch nur dadurch möglich, dass insgesamt 8004 Pflanzen untersucht wurden, darunter informative rekombinante BC2S1 oder BC2S2 Pflanzen, welche intensiv mit jeweils 90-180 Nachkommen analysiert wurden. Dieses war notwendig, da die Resistenzausprägung aus unbekannten Gründen nicht immer eindeutig war. Diese Nachkommen wurden einzelpflanzenweise genotypisiert und parallel phänotypisiert. Mittels statistischer Verfahren (t-Test, Poweranalyse) wurden die Phänotypen der informativen Rekombinanten (homozygot resistent - RR;
heterozygot resistent - Rs; homozygot anfällig - ss) nachgewiesen und damit Rückschlüsse auf den Genotyp der informativen Rekombinanten gezogen.
In der relativ kleinen Zielregion von etwa 38.000 bp konnten in dem anfälligen Genotyp zehn Gene annotiert werden. Für diese Zielregion wurden aus einer resistenten BAC Bibliothek überlappende Klone mit Hilfe von neuen Markern, welche spezifisch den Zielbereich
beschreiben, 'identifiziert und schließlich sequenziert. Wegen der Repetivität der Zielregion zeigte die Sequenz des anfälligen Genotyps zahlreiche kleine Abschnitte mit unbekanntem Sequenzinhalt. Aus diesem Grund war die Assemblierung der RR- und ss-Sequenzen besonders anspruchsvoll. Es konnte dennoch ein putatives Resistenzgen identifiziert werden. Dieses enthielt in nahezu allen ss-Genotypen ein Retrotransposon mit einer Länge von ca. 8000 bp zwischen der LRR-Domäne und der IR-Domäne, was in RR-Genotypen nicht detektiert werden konnte. Eine Aminosäuresequenz, vorhergesagt aus der putativen
Resistenzgensequenz, zeigt, dass das Gen mutmaßlich für ein NB-ARC-LRR-Protein kodiert. Es kann vermutet werden, dass diese Insertion des Retrotransposons die Funktion des Gens in anfälligen ss-Genotypen zerstört, denn sie trennt die Internal Repeat-Domäne (IR) von den beiden anderen Domänen (NB-ARC und LRR).
Der Vergleich des NBS-LRR-Gens in ss-Genotypen mit demjenigen in RR-Genotypen zeigte ferner. diagnostische Polymorphismen, welche den Figuren 1 , 2 und 3 entnommen werden können. Basierend auf diesen Polymorphismen im NBS-LRR Gen wurden Marker entwickelt und in einem breiten Set von nahezu 100 ss-und RR-Genotypen getestet. Die Markermuster aber auch die vergleichende Sequenzierung im Zielgen haben bestätigt, dass die Insertion nahezu immer mit der Sensitivität gekoppelt ist. Es fanden sich jedoch wenige ss-Genotypen, die die Retrotransposon-Insertion nicht aufwiesen und dennoch anfällig waren. Diese ss- Genotypen konnten jedoch eindeutig mittels Marker, welche die diagnostischen
Polymorphismen gemäß Figuren 1 , 2 und/oder 3 beschreiben, von den RR-Genotypen unterschieden werden.
In der analysierten Population wurden Rekombinaten in der Zielregion identifiziert, die eine Rekombination zwischen dem NBS-LRR-Gen und dem stromabwärts gelegenen, benachbarten annotierten putativen Gen, das für ein Ankyrin repeat Protein kodieren könnte, zeigen. Im Falle von zwei Pflanzen sind die Rekombinationen zwischen dem NBS-LRR-Gen und dem
stromaufwärts gelegenen, benachbarten annotierten putativen Gen, das für ein DUF565 Protein (Protein mit unbekannter Funktion) kodieren könnte, zu finden. Durch die Resistenzanalyse der Nachkommenschaft von allen diesen rekombinanten Pflanzen (Ein-Gen-Entfernung
stromaufwärts und stromabwärts des NBS-LRR-Gens) konnte ganz eindeutig bewiesen werden, dass das Gen zwischen dem Ankyrin repeat Gen und dem DUF565-Gen, nämlich das hier charakterisierte NBS-LRR-Gen für die Resistenz im RR-Genotypen verantwortlich ist. Figur 4 zeigt die physikalische Karte der RZ-3-Zielregion mit den entwickelten Markern. Die
Genotypdaten von acht engen rekombinanten Linien, sowie die statistische Analyse deren Nachkommenschaft ist in der Figur 5 dargestellt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Protein kodiert, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber dem Pathogen BNYW in einer Pflanze der Gattung Beta, in welcher das Protein exprimiert wird, zu vermitteln. Das Verfahren umfasst das Nachweisen der Abwesenheit einer Insertion in der kodierenden Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls. Bevorzugt umfasst das Verfahren das Nachweisen der Abwesenheit einer Insertion, insbesondere eines
Retrotransposons, in der kodierenden Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls. Das Retrotransposon kann beispielsweise etwa 500 bp, etwa 1000 bp, etwa 2000 bp, etwa 4000 bp, etwa 8000 bp oder mehr als etwa 8000 bp lang sein. In einer besonderen Ausgestaltung des Verfahrens ist das Nukleinsäuremolekül das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül wie oben beschrieben und kodiert das Resistenz-vermittelnde RZ-3-Gen oder ein funktionelles Homolog von RZ-3. Vorzugsweise handelt es sich bei der Pflanze der Gattung Beta um Beta vulgaris subsp. maritima oder Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (Zuckerrübe). Dem Fachmann ist bekannt, welche Methoden geeignet sind, die Abwesenheit der Insertion nachzuweisen. Beispielsweise kann der Fachmann in Kenntnis der hier offenbarten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle molekulare Marker entwickeln, welche die Anwesenheit oder die
Abwesenheit einer Insertion in oben beschriebener Region im NBS-LRR-Gen nachweisen (exemplarisches Vorgehen siehe Beispiele). Die vorliegende Erfindung schließt solche Marker sowie deren Verwendung zum Nachweis der An- oder Abwesenheit der Insertion zur Selektion resistenter, inbesondere BNYW-resistenter, Pflanzen, insbesondere Beta vulgaris subsp.
maritima oder Beta vulgaris subsp. vulgaris var. altissima (Zuckerrübe) mit ein. Vorzugsweise beschreiben solche Marker Loki an den Insertionsstellen des Retrotransposons.
Insertionsstellen meinen Übergangstellen zwischen genomischer DNA und Retrotransposon auf 5'- und/oder 3'-Seite der Insertion. Übergangsstellen sind breit zu definieren und Markerloki können weniger als 1000 Nukleotide, bevorzugt weniger als 800 oder 600 Nukleotide, besonders bevorzugt weniger als 400, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20 oder 10 Nukleotide stromaufwärts oder stromabwärts von einer Insertionsstelle auf der DNA entfernt liegen.
Alternativ oder ergänzend zu dem Schritt des Nachweises der An- oder Abwesenheit einer Insertion in der kodierenden Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls, kann das Verfahren auch das Nachweisen von mindestens einem Polymorphismus gemäß Figur 1 , 2 und/oder 3, bevorzugt von mindestens zwei oder drei Polymorphismen gemäß gemäß Figur 1 , 2 und/oder 3, besonders bevorzugt von mindestens vier, fünf oder mehr Polymorphismen gemäß gemäß Figur 1 , 2 und/oder 3 in der kodierenden Nukleotidsequenz des erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung von molekularen Markern, welche die
Polymorphismen, insbesondere diagnostische Polymorphismen, erkennen, umfassen.
Bevorzugt findet dieser Nachweis unter Verwendung von mindestens einem molekularen Marker pro Polymorphismus, insbesondere pro diagnosistischen Polymorphismus, statt. Dem Fachmann ist bekannt, welche Markertechniken zum Nachweis eines entsprechenden
Polymorphismus anzuwenden sind, und wie man molekulare Marker dafür konstruiert
(Literatur). Weiterhin erfasst die vorliegende Erfindung molekulare Marker, welche einen Polymorphismus gemäß Figur 1 , 2 und/oder 3 beschreiben bzw. detektieren, wie auch die Verwendung eines molekularen Markers zur Detektion eines Polymorphismus gemäß Figur 1 , 2 und/oder 3. Weiterhin stellen die vorstehenden Identifikationsverfahren auch Verfahren zur Selektion einer Pflanze, welche eine Resistenz gegenüber BNYW aufweist, dar. Das Verfahren zur Selektion umfasst einen abschließenden Schritt des Selektierens einer resistenten Pflanze.
Ferner konnte auch gezeigt werden, dass in der untersuchte RR Genotypen stromaufwärts zu RZ-3 (SEQ ID NO: 1 ) angrenzende genomische DNA-Sequenzabschnitt gemäß SEQ ID NO: 4 und stromabwärts zu RZ-3 (SEQ ID NO: 1 ) angrenzende genomische DNA-Sequenzabschnitt gemäß SEQ ID NO: 5 aufwies, welche eng-gekoppelt mit dem RZ-3-Gen sind und sich deshalb herausragend eignen als DNA-Regionen zur Entwicklung von diagnostischen Markern für RZ-3. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Selektion einer Pflanze, welche eine Resistenz gegenüber BNYW aufweist. Das Verfahren zur Selektion umfasst die Verwendung eines molekularen Markers auf einer DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 und/oder auf einer DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 5 und einen abschließenden Schritt des Selektierens einer resistenten Pflanze. Dem Fachmann ist bekannt, wie er auf Grundlage der offenbarten
Sequenzinformationen Marker entwickelt und einsetzt.
Durch die vorliegende Erfindung können ferner folgende Vorteile für die Züchtung und die Entwicklung neuer resistenter Pflanzenlinien der Gattung Beta erzielt werden:
Sequenzinformationen sowie die identifizierten Polymorphismen, welche eine Unterscheidung zwischen resistenten RR- und anfälligen ss-Allelen des offenbarten Gens erlauben, machen die Marker-Entwicklung direkt im Gen möglich, was insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung von optimierten Elitelinien ohne„Linkage Drag" eine bedeutende Erleichterung für den
Pflanzenzüchter darstellt. Außerdem kann die Kenntnis über die sequentielle Struktur zur Identifizierung von weiteren Resistenzgenen, insbesondere gegen Rizomania, welche beispielsweise teilweise homolog sind, verwendet werden.
Die hier offenbarte Nutzung des resistenten Genallels in eis- oder trans-genetische Ansätzen eröffnet die Möglichkeit neue resistente Sorten der Gattung Beta zu entwickeln, welche eine anhand des Dosiseffekts eine höhere Resistenz aufweisen oder in welchen durch das Stacking des offenbarten Gens mit anderen Resistenzgenen ein Resistenzbruch vermieden werden und die Resistenzausprägung optimiert werden kann. Ferner sind Modifikationen des Gens mittels Tilling oder gezieltem Engineering zur Entwicklung neuer Resistenzallele denkbar.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des identifizierten resistenten RZ3- Genallels in einem genetischen oder molekularen Stack mit anderen genetischen Elementen, welche agronomisch vorteilhafte Eigenschaften vermitteln können, in einer Pflanze. Hierdurch kann der ökonomische Wert von Kulturpflanzen deutlich gesteigert werden, indem
beispielsweise die Ertragsleistung gesteigert wird oder neue Anbauflächen für eine Pflanze erschlossen werden, die zuvor unter Anderem aufgrund biotischen Faktoren wie starkem Pathogendruck oder abiotischen Faktoren wie Trockenheit dem Anbau dieser Pflanze nicht zugänglich waren. Eine agronomisch vorteilhafte Eigenschaft ist beispielsweise eine Toleranz gegenüber einem Herbizid wie Glyphosat, Glufosinat oder ALS-Inhibitoren. Dem Fachmann sind aus dem Stand der Technik zahlreiche weitere Herbizide und deren Anwendbarkeit bekannt. Er kann auf den Stand der Technik zurückgreifen, um Kenntnis zu erlangen, welche genetischen Elemente in welcher Art und Weise zu verwenden sind, um eine entsprechende Toleranz in Pflanzen zu implementieren. Ein weiteres Beispiel für eine agronomisch vorteilhafte Eigenschaft ist eine zusätzliche Pathogenresistenz, wobei Pathogene beispielsweise Insekten, Viren, Nematoden, Bakterien oder Fungi sein können. Durch Kombination unterschiedlicher Pathogenresistenzen oleranzen kann beispielsweise eine breite Pathogenabwehr für eine Pflanze erreicht werden, da genetische Elemente untereinander ergänzende Wirkungen aufweisen können. Hierfür sind dem Fachmann als genetische Elemente beispielsweise zahlreiche Resistenzgene bekannt. Ein weiteres Beispiel für eine agronomisch vorteilhafte Eigenschaft ist eine Kühle- oder Frosttoleranz. Pflanzen, welche diese Eigenschaft aufweisen, könnten früher im Jahr bereits ausgesät werden oder könnten länger zum Beispiel auch über Frostperioden im Feld verbleiben, was beispielsweise zu gesteigerten Erträgen führen kann. Auch hier kann der Fachmann auf den Stand der Technik zurückgreifen, um geeignete genetische Elemente zu finden. Weitere Beispiele für agronomisch vorteilhafte Eigenschaften sind Wassernutzungseffizienz, Stickstoffnutzungseffizienz sowie Ertrag. Genetische Elemente, welche eingesetzt werden können, um solche Eigenschaften zu vermitteln, könnten im Stand der Technik gefunden werden.
Dem Fachmann sind weiterhin zahlreichen Modifikationen zur Pathogenabwehr bekannt. Neben den häufig beschriebenen Familien der R-Gene könnten der Avr/R-Ansatz, die Avr-Gen- Komplementierung (WO 2013/127379), die Autoaktivierung eines R-Gens (WO 2006/128444), der HIGS (host induced gene silencing)-Ansatz (z.B. WO2013/050024) oder der VIGS (virus induced gene silencing)-Ansatz vorteilhaft eingesetzt werden. Insbesondere die Autoaktivierung eines R-Gens könnte für die vorliegende Erfindung von Bedeutung sein. Hierfür ist eine
Nukleinsäure zu erstellen, die für ein autoaktiviertes Resistenzprotein zur Erzeugung einer Resistenz gegenüber Pathogenen bei Pflanzen kodiert. Diese Nukleinsäure weist dann nur einen begrenzten Teil eines NBS-LRR-Resistenzgens wie das RZ3-Gen aufweist, der sich vom 5'-Ende des kodierenden Bereichs des NBS-LRR-Resistenzgens stromabwärts bis zum Beginn der NBS-Domäne des NBS-LRR-Resistenzgens erstreckt, wobei das NBS-LRR-Resistenzgen kein TIR-NBS-LRR-Resistenzgen ist.
Ferner schließt die Erfindung auch die Verwendung des resistenten RZ3-Genallels, identifiziert mit einem oben beschriebenen Verfahren, zur Kombination mit einer vorstehenden
Modifikationen oder mit einem vorstehend beschriebenen genetischen Element, welches eine oder mehrere agronomisch vorteilhafte Eigenschaften in einer Pflanze vermitteln kann.
Ausgestaltungen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die angehängten Figuren und Sequenzen beschrieben:
Sequenzen:
SEQ ID NO: 1 genomische DNA-Sequenz des Resistenzgens RZ-3. Die Sequenz
umfasst von Nukleotid 1 bis 1403 die regulatorische Region des
Promotors
SEQ ID NO: 2 vorhergesagte Proteinsequenz des Resistenzproteins RZ-3_1 SEQ ID NO: 3 vorhergesagte Proteinsequenz des Resistenzproteins RZ-3_2
SEQ ID NO: 4 stromaufwärts zu RZ-3 (SEQ ID NO: 1 ) angrenzende chromosomale
Region
SEQ ID NO: 5 stromabwärts zu RZ-3 (SEQ ID NO: 1 ) angrenzende chromosomale
Region
SEQ ID NO: 6 Consensus-Sequenz der genomischen Sequenz des RZ-3-Gens in ss
Genotypen
SEQ ID NO: 7 Zielsequenz im RZ3-Gen des RNAi-Konstrukts im Vektor pZFN-C48-
RNAi.
Figuren:
Fig. 1 A-l: Nukleotidsequenzvergleich zwischen Consensus-Sequenz der genomischen
Sequenz des RZ-3-Gens in ss Genotypen (SEQ ID NO: 6) und dem RZ-3-Gen der RR- Genotypen (SEQ ID NO: 1 ). Diagnostische Polymorphismen sind grau hinterlegt und fett gedruckt hervorgehoben. Unterstrichen sind solche Polymorphismen, welche nicht diagnostisch sind. Die potentiellen Transkriptionsstartpunkte in dem gen sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Sie führen zu zwei Polypeptid-Varianten RZ-3_1 und RZ-3_2. Die Stelle des Retrotransposons ist mit einem schwarzen Dreieck auf der Spitze gekennzeichnet.
Fig. 2 A-L: Aminosäuresequenzvergleich des vorhergesagten Polypeptids aus den RR- Genotypen (RZ-3_1 ; SEQ ID NO: 2) und Polypeptiden aus 22 unterschiedlichen ss-Genotypen. Diagnostische Polymorphismen sind grau hinterlegt und fett gedruckt hervorgehoben.
Unterstrichen sind solche Polymorphismen, welche nicht diagnostisch sind.
Fig. 3 A-L: Aminosäuresequenzvergleich des vorhergesagten Polypeptids aus den RR- Genotypen (RZ-3_2; SEQ ID NO: 3) und Polypeptiden aus 22 unterschiedlichen ss-Genotypen. Diagnostische Polymorphismen sind grau hinterlegt und fett gedruckt hervorgehoben.
Unterstrichen sind solche Polymorphismen, welche nicht diagnostisch sind.
Fig. 4: Physikalische Karte der RZ-3-Zielregion. In der dargestellten Zielregion des sensitiven Referenzgenotyps wurden fünf Gene annotiert („2" (DUF565),„3" (hypothetisches Protein),„4" (NBS-LRR Kandidatengen),„5" (Retrotransposon) und„6" (Ankyrin-Repeat)). Das NBS-LRR Kandidatengen („4") beinhaltet in der sensitiven Referenz-Sequenz eine Retrotransposon- Insertion („5"). Dieses Retrotransposon fehlt vollständig in der resistenten Sequenz, so dass in dem resistenten Genotyp nur noch vier Gene annotiert werden können („2",„3",„4" und "6"). Die Positionen der engsten Rekombinationen (Rekombinanten: 1 1 1T_3515/ ZR1 1007_03075 mit Ziffer„7" und 1 1 1 PB3645/ZR08093_05621 mit Ziffer„8") sind oberhalb dargestellt. Mit deren Hilfe konnte die kürzere Zielregion„1 " eingrenzt werden. Die hierfür entwickelten Marker aus der Rekombinanten-Analyse sind als schwarze Striche im unteren Teil der Figur
wiedergegeben. Zur Validierung des Gens im RNAi-Ansatz wurde für das Gene silencing des resistenten RZ-3-Genallels ein Gensegment („9") teilweise aus dem Domainbereich„10" als Zielsequenz ausgewählt.
Fig. 5: Markeranalyse der engsten Rekombinanten in der RZ-3 Zielregion (kleine Buchstaben im fett-gerahmten Bereich sind in silico generierte Markerdaten). Die acht rekombinanten Linien wurden mit insgesamt 1051 Nachkommen phänotypisiert und genotypisiert. Die Nachkommen wurden anhand der Markerdaten im NBS-LRR Kandidatengen bzw. der spaltenden
flankierenden Region im Falle, dass das NBS-LRR Kandidatengen homozygot RR bzw. ss ist, in 3 Gruppen eingeteilt (RR-resistent homozygot, Rs - hetrozygot, ss-sensitiv homozygot). Daneben sind die entsprechenden ELISA-Werte wiedergegeben. Eine Spaltung oder NichtSpaltung der Nachkommen wurde mit T-test und Wilcoxon Statistik nach Signifikanz überprüft. Anhand der Ergebnisse konnte das Kandidatengen ganz eindeutig zwischen den Markern s3e5800s01 und s3e5873s01 eingegrenzt werden.
Fig. 6: Transformationsvektor pZFN-C48-RNAi: d35S-promoter; C48 s: C48 sequence sense orientation; AtAAP6 intron2: Arabidopsis thaliana amino acid permease 6 intron; C48 as: C48 sequence antisense orientation; Nos-T: nos Terminator; LB flanking site: Left border flanking site; ZFN site: Zinc-finger nuclease recognition site (complementary); Pnos: Nos promoter; NPT: coding sequence; neomycin phosphotransferase (npt) gene; pAG7: pAG7 terminator;
Bvpal3'UTR: 3' untranslated region of the Beta vulgaris Pal gene; LB: Left border; aadA: coding sequence; aminoglycoside-3"-adenylyltransferases (AAD); pVS1 -REP: pVS1 replication origin; ColE1 ori: ColE1 replication origin; RB: right border. Examples:
Kartierung und Feinkartierung des RZ-3-Gens / Genetische-Physikalische Karte
Die RZ-3-Resistenz (auch als C48-Resistenz oder C48 bezeichnet) wurde in mehreren
Schritten mittels Kartierung und Feinkartierung auf dem Chromosom 3 zwischen 57, 1 und 57,8 cM (interne Referenzkarte) kartiert, also auf einer genetische Distanz zwischen zwei flankierenden Markern von 0,0714 cM in der genetischen Karte. Für die Kartierung wurden insgesamt 8004 Pflanzen aus der Kreuzung S504 (sensitiver Genotyp) x T74 (resistenter Genotyp) untersucht. Parallel zu der C48 QTL Kartierung wurden nach jedem Kartierungsschritt zielorientiert neue informative Marker entwickelt und für die Einschränkung der C48 Zielregion eingesetzt.
Die Feinkartierungskoordinaten wurden zusätzlich mit der Analyse der Nachkommen der informativen Rekombinanten bestätigt. Informative rekombinante BC2S1 oder BC2S2 Pflanzen wurden dazu intensiv mit jeweils 90-180 Nachkommen analysiert. Diese Nachkommen wurden einzelpflanzenweise genotypisiert und parallel phänotypisiert. Mittels statistischer Verfahren (t- Test, Poweranalyse) wurden die Phänotypen der informativen Rekombinanten (homozygot resistent-RR / heterozygot-Rs / homozygot anfällig-ss) nachgewiesen und damit Rückschlüsse auf den Genotyp der informativen Rekombinanten gezogen. Sofern sich die
Homozygotenklassen der Nachkommen (RR versus ss) in der Resistenz unterscheiden, liegt das Gen im heterozygoten Bereich (Rs) der Elternpflanze; andernfalls im homozygoten Bereich (RR oder ss) der Elternpflanze.
Eine physikalische Karte wurde generiert für einen Rizomania-sensitiven Genotyp, indem Marker und deren genetische Positionen auf die Chromosomsequenzen projiziert worden sind. Mit der Einschränkung der C48 QTL-Region wurden anhand der Referenz-Sequenz und zusätzlichen vergleichenden Sequenzierungen in resistenten Genotypen (Next Generation Sequenzierung und Sanger Sequenzierung) neue informative Marker entwickelt.
Die durch die Feinkartierung identifizierte Region umfasst eine Sequenzlänge von 37996 Basenpaaren (Positionen flankierender SNP-Marker) in der sensitiven Referenz-Sequenz. Die Kollinearität zwischen den genetischen und der Physikalischen Karte in dem Zielbereich ist widerspruchsfrei (Reihenfolge von 12 Markern im Zielbereich).
Identifizierung und Sequenzierung von resistenten BAC Klonen Eine BAC Bibliothek ist entwickelt worden für einen ausgewählten RZ-3 (C48) resistenten Genotyp. Diese BAC Bank wurde mit den angewandten Markern in C48 QTL Bereich durchgemustert. Mehrere BAC Klone wurden für die oben identifizierte Zielregion gefunden. Davon wurden drei unterschiedlich lange BAC-Klone für Sequenzierung ausgewählt, welche vollständig die Zielregion erfassten. Die BAC Klone wurden sequenziert und anhand der entstandenen sequence-reads wurde eine„de novo" Assemblierung durchgeführt. Unter den entstandenen resistenten Sequenzcontigs hatte die grösste Sequenz eine Länge von 1 10909 bp (34537 reads) und umfasste komplett die Zielregion.
Vergleich der sensitiven und resistenten Sequenzen - Sequenzauswertung
Die Kollinearität der beiden ss- und RR-Sequenzen wurde mit der Anwendung von
unterschiedlichen Software-tools verglichen. Für die beiden resistenten und sensitiven
Sequenzen wurde eine Genannotation mit den Softwares Maker und Pedant durchgeführt. Die Genannotation auf beiden Sequenzen zeigte die gleiche Abfolge von putativen Genen.
Überraschenderweise konnte jedoch ein markanter Unterschied in einem dieser Gene festgestellt werden, nämlich in dem Gen der vorliegenden Erfindung (RZ-3). In dem sensitiven Genotyp konnte in diesem identifizierten NBS-LRR-Gen ein Retrotransposon annotiert werden. Die Insertion des Retrotransposon passierte im Gen zwischen den beiden Domänen der LRR- Domäne und der IR-Domäne. Der resistente Genotyp weist diese Insertion nicht auf und ist in SEQ ID NO: 1 wiedergegeben. Weiterhin wurden anschließend die vorhergesagten
Polypeptidsequenzen verglichen und ausgewertet (teilweise dargstellt in siehe Fig. 2 und 3).
Vergleichende Sequenzierung des NB-ARC-LRR-Kandidatengens
Das NB-ARC-LRR-Kandidatengen wurde in zwei Schritten vergleichend sequenziert. Die Retrotransposon-Insertionsstelle wurde in einem Genotypset mit insgesamt 92 resistenten und sensitiven Genotypen verifiziert. Diese Analyse zeigte, dass alle resistenten Genotypen keine Retrotransposoninsertion hatten. Von den sensitiven Genotypen konnte die Insertion in mehr als 90% der Fälle nachgewiesen werden. Damit scheint der Nachweis der Insertion gekoppelt zu sein mit dem anfälligen Genotyp. Wegen der gefundenen Wiedersprüche (etwa 10% der verbleibenden anfälligen Genotypen ohne Insertion) wurde die Sequenzierung jedoch in dem zweiten Schritt für das gesamte Gen vor der Insertionsstelle mit Promotorbereich ausgeweitet (SEQ ID NO: 1 ). Insgesamt wurden 31 ausgewählten resistente und anfällige Genotypen inklusive der widersprüchlichen Genotypen sequenziert und verglichen. Im Ergebnis waren alle resistenten Genotypen, die auf sieben unterschiedliche Resistenzquellen zurückzuführen sind, 100 % identisch für die verglichenen ca. 4100 Basenpaare. Außerdem wurden vollständig diagnostische Polymorphismen in der Nukleotidsequenz gefunden, von denen mehrere zu Aminosäuresubstitutionen in der Protein-Sequenz führen (siehe Figur 1 , 2 und3). Einige diese Substitutionen besonders in den Domänenbereichen könnten den Funktionsverlust des identifizierten Resistenzproteins in den ss-Genotypen verursachen. Ferner wurden ebenfalls im Promotorbereich drei mit der Resistenz vollständig gekoppelte (Linkage diseqilibrium = 1 ) INDELs gefunden (Fig 1). Diese INDELs sind auch als potenzielle Kandidaten für den
Funktionsverlust zu betrachten.
Verifizierung des Gens mittels engen Rekombinanten
In der analysierten Population mit 8004 Pflanzen wurden 16 Rekombinaten in der Zielregion identifiziert (feinkartierter Bereich mit 37996 Basenpaaren). Von diesen 16 Genotypen enthielten 9 Pflanzen die Rekombination zwischen dem NB-ARC-LRR-Protein und dem benachbarten Ankyrin repeat-Protein auf der rechte Seite. Im Falle von zwei Pflanzen sind die Rekombinationen zwischen dem NB-ARC-LRR- Protein und dem links benachbarten DUF565 Protein (Protein mit unbekannter Funktion). Durch die Analyse der Nachkommenschaft von allen diesen rekombinanten Pflanzen (ein Gen Entfernung links und rechts) konnte ganz eindeutig bewiesen werden, dass das Gen zwischen DUF565 und das Ankyrin repeat Protein liegt, nämlich dass nur das NB-ARC Protein für die Resistenz verantwortlich ist.
Exemplarischer Nachweis der Abwesenheit der Transposoninsertion
Für den Nachweis der Retrotransposon-Insertion wurden 3 spezielle dominante
Primerkombinationen entwickelt. Die erste und die zweite Primerkombinationen sind in der Lage die Insertion zu detektieren, da jeweils ein Primer von den beiden Primerpaaren in dem
Retrotransposon sitzen (linke oder rechte Flanke des Retrotransposons) und der zweite Primer bindet direkt vor oder nach dem Retrotransposon. Ein drittes Primerpaar detektiert das Fehlen des Retrotransposons, dadurch, dass die Primer vor und nach dem Retrotransposon eine Bindungsstelle finden. Ein PCR-Produkt unter Standardbedingungen kann nur dann entstehen, wenn das Retrotransposon fehlt, ansonsten mit dem Retrotransposon wäre das PCR Produkt zu groß und so würde auf diese Weise kein Amplikon entstehen.
Verifizierung des Gens mittels RNAi-Ansatz
Neben der oben beschriebenen_Verifizierung des Gens mittels engen Rekombinanten erfolgte auch ein weiterer Nachweis der Resistenzwirkung des Gens mittels RNA-Interferenz. Hierfür wurde ein resistenter Standard-Zuckerrübengenotyp mit einem DNA-Konstrukt transformiert, welches eine doppelsträngige hairpin-RNA kodiert. Diese dsRNA war in der Lage post- transskriptional ein Gene Silencing zu bewirken, welches das resistente RZ-3-Genallel in seiner Wirkung vermindern oder ausschalten würde, wodurch der zuvor resistente
Zuckerrübengenotyp sensitiv gegenüber Rizomania werden sollte.
Zur Bereitstellung eines geeigneten DNA-Konstrukts wurde ein definierter Zielsequenzbereich des resistenten RZ3-Genallels von 434 Basenpaaren Länge (SEQ. ID NO: 7; Figur 4) ausgewählt, durch PCR amplifiziert und sowohl in sense- als auch in antisense-Richtung in den Vektor pZFN kloniert, der zur Synthese von hairpin-Strukturen geeignet ist (Fig. 6). Dieser Vektor weist einen doppelten CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, ein Intron aus dem Gen AtAAP6, das in Arabidopsis thaliana für eine Aminosäurepermease kodiert, eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen nos-Terminator auf. Die Transformation der Zuckerrüben mit dem bereitgestellten Vektor erfolgte nach dem Protokoll von Lindsey & Gallois (1990) unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin als Selektionsmarker. Nach mehreren Selektionsschritten wurde die erfolgreiche Transformation an transgenen Sprosse über PCR mittels Nachweis der Anwesenheit des nptll-Gen, des AAP6-lntron und der beiden t-DNA- Bordersequenzen (LB/RB) und der Abwesenheit von vir überprüft. Positive Sprosse wurden in- vitro auf jeweils 30 Sprosse klonal vermehrt, bewurzelt und im Gewächshaus in Erde überführt. Etwa 2 Wochen später wurden die transgenen Zuckerrübenpflanzen in Rizomania- kontaminierte Erde pikiert, in welcher sie für 8 bis 10 Wochen kultiviert wurden. Als Kontrolle wurden unter denselben Bedingungen nicht transformierte Pflanzen desselben resistenten genetischen Standard-Transformationshintergrunds herangezogen. Zum Nachweis der Ausprägung der Rizomania wurden die Wurzeln der Zuckerrübenpflanzen geerntet und mittels ELISA-Test der BNYW-Befall quantifiziert, wobei ein niedriger ELISA-Wert eine Resistenz und ein hoher Wert eine Sensitivität anzeigt (Mechelke 1997, Clark & Adams 1977). Der ELISA- Wert der transformierten Zuckerrüben war mit einem Mittelwert von 3,55 signifikant höher als der ELISA-Wert der weiterhin resistenten Kontrolle mit einem Mittelwert von 1 ,27 und vergleichbar mit dem sensitiven Standard D108_ss (Tabelle 1 ). Danach zeigten die Ergebnisse des ELI SA-Tests, dass durch das spezifische Gene-Silencing des resistenten RZ-3-Allels im Transformationshintergrund eine zuvor resistente Pflanze sensitiv gegenüber BNYW wurde. Folglich konnte das Gen der vorliegenden Erfindung eindeutig als das Resistenzgen RZ3 verifiziert werden. Tabelle 1 : Ergebnisse des ELISA-Tests nach statistischer Analysen (D108_ss = sensitiver Standard; 6921_RR = resistenter Transformationshintergrund; 6921_RNAi = resistenter Transformationshintergrund mit dsRNA gerichtet gegen RZ3-Gen).
D108 ss 6921 RR 6921 RNAi n 6 25 64
Mittelwert 3,98 1 ,27 3,55
Standardfehler 0,02 0,25 0, 1 1
Standardabweichung 0,06 1 ,24 0,87
T-Test (Signifikanzlevel): p < 0,0001
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PROMOTORS.

Claims

Ansprüche:
1. Nukleinsäuremolekül, welches ein Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber einem Pathogen in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül eine
Nukleotidsequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus a) einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 kodiert, b) einer Nukleotidsequenz, die die kodierende Sequenz der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst, c) einer Nukleotidsequenz, die mit der komplementären Sequenz zu der Nukleotidsequenz nach a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, d) einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches sich durch Substitution, Deletion und/oder Addition von einer oder mehrerer Aminosäuren der Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird, von einem Polypeptid, das durch die Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird, ableitet, e) einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches eine
Aminosäuresequenz aufweist, die zu mindestens 60% identisch ist zu einer Aminosäuresequenz, welche durch die Nukleotidsequenz nach a) oder b) kodiert wird, oder f) einer Nukleotidsequenz, welche mindestens eine Nukleotid-bindende Domäne (NBS) entsprechend den Aminosäurepositionen 168-227 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 182-241 der SEQ ID NO: 3, mindestens eine Leuzin-reiche Domäne (LRR) entsprechend den Aminosäurepositionen 591 -613 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 605-627 der SEQ ID NO: 3 und/oder mindestens eine interne repetitive Domäne (IR) entsprechend den Aminosäurepositionen 1013- 1072 der SEQ ID NO: 2 oder entsprechend den Aminosäurepositionen 1027-
1086 der SEQ ID NO: 3 kodiert.
2. Vektor, welcher das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfasst.
3. Wirtzelle, welche das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder den Vektor nach Anspruch 2 umfasst.
4. Polypeptid, welches in der Lage ist eine Resistenz gegenüber einem Pathogen in einer Pflanze, in welcher das Polypeptid exprimiert wird, zu vermitteln und welches durch das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 kodiert wird.
5. Transgene Pflanzenzelle, welche das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 als
Transgen oder den Vektor nach Anspruch 2 umfasst.
6. Transgene Pflanze oder ein Teil davon, umfassend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 5.
7. Samen von der Pflanze nach Anspruch 6, wobei der Samen das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 als Transgen umfasst.
8. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen Schritt des Einbringens des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder des Vektors nach Anspruch 2 in die Pflanzenzelle umfasst.
9. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst a) Einbringen des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder des Vektors nach Anspruch 2 in eine pflanzliche Zelle und b) Regenerierung der transgenen Pflanze aus der transgenen Pflanzenzelle aus Schritt a).
10. Regulatorische Sequenz eines Promotors, welche die Expression eines Gens, das das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül umfasst, kontrolliert, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Sequenz in der Lage ist, die Expression einer heterologen DNA- Sequenz infolge einer Pathogeninfektion zu vermitteln oder zu modulieren, und die regulatorische Sequenz ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 von den Nukleotiden 1 -1403 umfasst.
1 1 . Rekombinantes DNA-Molekül, welches die regulatorische Sequenz nach Anspruch 10 umfasst.
12. Wirtzelle, welche mit der regulatorischen Sequenz nach Anspruch 10 oder mit dem
rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1 1 transformiert ist.
13. Transgene Pflanze, Pflanzengewebe oder Pflanzenzelle, welche die regulatorische Sequenz nach Anspruch 10 oder das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 1 1 als Transgen umfasst.
14. Verfahren zur Identifikation eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein Protein kodiert, das in der Lage ist, eine Resistenz gegenüber dem Pathogen BNYW in einer Pflanze der Gattung Beta, in welcher das Protein exprimiert wird, zu vermitteln, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren den nachfolgenden Schritt umfasst i. Nachweisen der Abwesenheit einer Insertion in der kodierenden
Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder ii. Nachweisen von mindestens einem Polymorphismus gemäß Figur 1 , 2 und/oder 3 in der kodierenden Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 unter Verwendung von molekularen Markern, welche den Polymorphismus erkennen.
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