WO2014196887A1 - Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты) - Google Patents

Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты) Download PDF

Info

Publication number
WO2014196887A1
WO2014196887A1 PCT/RU2013/000456 RU2013000456W WO2014196887A1 WO 2014196887 A1 WO2014196887 A1 WO 2014196887A1 RU 2013000456 W RU2013000456 W RU 2013000456W WO 2014196887 A1 WO2014196887 A1 WO 2014196887A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
modified
bacteria
combination
lipopolysaccharide
vaccine
Prior art date
Application number
PCT/RU2013/000456
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Петр Геннадьевич АПАРИН
Вячеслав Леонидович ЛЬВОВ
Станислава Ивановна ЕЛКИНА
Марина Эдуардовна ГОЛОВИНА
Владимир Алексеевич ЛЕДОВ
Анна Александровна МАРКИНА
Мария Евгеньевна ШЕХТ
Original Assignee
Aparin Petr Gennadievich
Lvov Vyacheslav Leonidovich
Elkina Stanislava Ivanovna
Golovina Marina Eduardovna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aparin Petr Gennadievich, Lvov Vyacheslav Leonidovich, Elkina Stanislava Ivanovna, Golovina Marina Eduardovna filed Critical Aparin Petr Gennadievich
Priority to EA201501165A priority Critical patent/EA031879B1/ru
Priority to PCT/RU2013/000456 priority patent/WO2014196887A1/ru
Priority to US14/895,894 priority patent/US20160120967A1/en
Priority to ES13886231T priority patent/ES2828373T3/es
Priority to KR1020167000036A priority patent/KR102125600B1/ko
Priority to EP13886231.3A priority patent/EP3006450B1/en
Publication of WO2014196887A1 publication Critical patent/WO2014196887A1/ru
Priority to US15/454,526 priority patent/US11052142B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/06—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical being a hydroxyalkyl group esterified by a fatty acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • Modified lipopolysaccharide of endotoxic bacteria (options), a combination of modified lipopolysaccharides (options) and their vaccine (options) and pharmaceutical composition (options)
  • the invention relates to clinical immunology and pharmacology, in particular, to modified lipopolysaccharides of endotoxic bacteria of the genera Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium and their combinations, and their combinations, and compositions.
  • Lipopolysaccharides are endotoxins of gram-negative bacteria and include polysaccharide (0-PS) and lipid components. This lipid component, also called lipid A, determines the endotoxic properties of lipopolysaccharides (Rietschel E.T., Kirikae T., Schade FU, Ulmer AJ, Hoist O., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke HD, Kusumoto S. et al. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology, 1993, Apr; 187 (3-5): 169-190).
  • LPS polysaccharide component of LPS, represented by the O-specific polysaccharide - O-PS, built from repeating oligosaccharide units, joins the core oligosaccharide, which, in turn, is associated with lipid A.
  • LPS which includes all three structural parts - O-PS , core and lipid A, are called S-LPS, because it is characteristic of "smooth" (smooth) forms of colonies of microorganisms.
  • O-PS in LPS is absent.
  • R-LPS low molecular weight LPS
  • microorganism as a whole, and in many cases specific antibodies to S-LPS, induced in the host organism in response to their appearance, play a key role in its protection against bacterial infection and have a high protective potential.
  • LPS as components of vaccine and therapeutic agents.
  • the endotoxic component of LPS - lipid A is a disaccharide built of two phosphorylated glucosamine residues, each of which is N- and O-acylated (at the 3- and 3 'positions) with four 3-hydroxymyristic acid (HMC) residues, which called primary. Two other residues of non-hydroxylated higher fatty acids (most often lauryl and myristic) O-acylate two of the above GMC residues, which are called secondary.
  • HMC 3-hydroxymyristic acid
  • the so-called “classic” lipid A contains six residues (four primary and two secondary) of higher fatty acids (Knirel Yu.A., Valvano M. A. Bacterial Lipopolysaccharides. Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction with Host Cells. Springer Wien New York, 2011, 440 pp.).
  • pentaacyl LPS is obtained by genetic engineering from a genetically modified recombinant bacterium Neisseria meningitis with reduced endotoxicity by blocking cell production of the hexaacyl form of LPS.
  • the obtained LPS showed a slight decrease in toxicity (according to the test for TNFa production in vitro, only a 100-fold decrease was observed).
  • the modified strain was only 7 times different from the original one in the decrease in activity in the LAL test.
  • Pharmaceutical Data a test to evaluate the pyrogenicity of the LPS preparation is not presented in the patent. The drug is positioned primarily as an adjuvant, but not as a vaccine antigen.
  • endotoxic bacteria retain a significant level of endotoxicity for experimental animals and, therefore, cannot find clinical application as components of pharmaceutical preparations.
  • the product of this enzymatic treatment is a mixture of tetraacyl derivatives of LPS (including lipid A with four fatty acid residues) with unreacted penta - and
  • hexaacyl derivatives of LPS including lipid A with five and six fatty acid residues, respectively
  • LPS hexaacyl derivatives of LPS (including lipid A with five and six fatty acid residues, respectively) of endotoxic bacteria of the Escherichia or Haemophilis or Neisseria families.
  • mutant LPSs have high residual endotoxicity and cannot be used as potential immunogens for humans.
  • modified LPS Due to the unsatisfactory safety level of the above-described modified LPS resulting from the inefficient deacylation of their lipid A, this area of research was practically at an impasse. Therefore, since the end of the last century, patents have not been received and works devoted to obtaining others have not been published. modified LPS and, in particular, modified S-LPS from topical endotoxic field strains (genetically
  • lipopolysaccharides individual di-, tri- and tetraacyl
  • modified S-LPS individually as monocomponent or their combinations as two- and three-component active substances, respectively.
  • deacylated LPS bacteria Porphyromonas gingivalis - a component of the microflora of the oral cavity.
  • penta-, tetra-, triacyl LPS of P. gingivalis are obtained and the principal possibility of using the pentaacyl and tetraacyl derivative only as immunomodulators in the corresponding
  • P. gingivalis is the causative agent of local sluggish infection of the oral cavity and the use of its LPS in vaccination as
  • Lipopolysaccharide an Unusual Pattern Recognition Receptor Ligand for the Innate Host Defense System. Acta. Odontol. Scand., 2001, 59: 131-8).
  • the triacyl derivatives of lipids A of the above bacteria turned out to be powerful inducers of the key mediator of the endotoxic reaction - TNF- ⁇ in vivo, as well as another pro-inflammatory cytokine-1L-6 (data of the patent analogue RU 2154068 C2).
  • the triacyl derivatives of lipid A induced TNF-a production even higher than Westphal LPS.
  • Modified lipids A cannot be used as a vaccine (do not contain bacterial O-PS antigens), and their use as an additional component, an adjuvant, is problematic due to the lack of data confirming their low pyrogenicity.
  • modified S-LPS endotoxic bacteria di-, tri- and tetraacyl derivatives
  • antishock activity preliminary administration of individual modified S-LPS or combinations thereof provides 80% survival of animals in endotoxic shock caused by the administration of lethal doses of endotoxin; in addition, the administration of these drugs corrects septic shock and slows the development of
  • modified S-LPS in terms of reducing pyrogenicity and enhancing immunogenicity
  • Campylobacter Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium.
  • Such bacteria should be called strains of natural, non-genetically modified, gram-negative bacteria obtained from patients with infectious diseases or other sources of the environment, producing endotoxic agonistic forms of LPS molecules, which are characterized by high toxicity and pyrogenicity in a free or associated form with a high degree
  • Low-endotoxic bacteria are either avirulent or cause sluggish, often subclinical, forms of infections on the mucous membranes, for which they are sometimes called "invisible bacteria.” LPS of low endotoxic bacteria always has structural features that determine its low endotoxicity - low degree
  • S-LPS modified lipopolysaccharide
  • the claimed lipopolysaccharide has at least 85% purification (Example 2B), it protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium and their combinations by inducing the synthesis of specific antibacterial IgG, IgA, IgM antibodies in mammals and humans (Example 2D, 3F), has anti-shock activity in septic and / or endotoxic shock, is a modulator of the reactions of the immune system of mammals, including humans ( Examples 3F, 4C), and pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity test (Example 2C).
  • S-LPS Modified lipopolysaccharide of endotoxic bacteria was obtained, including an O-specific polysaccharide consisting of one or more repeating units, a core oligosaccharide and a partially O-deacylated lipid A containing three acyl residues.
  • the claimed lipopolysaccharide has at least 80% degree of purification (Example 2B), it protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium and their combinations by anti-bacterial synthesis IgG, IgA, IgM antibodies in mammals, including humans (Examples 2D, ZS, 3F), have
  • antishock activity in septic and / or endotoxic shock is a modulator of the reactions of the immune system
  • Example 2C pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity test.
  • S-LPS Modified lipopolysaccharide of endotoxic bacteria was obtained, including an O-specific polysaccharide consisting of one or more repeating units, a core oligosaccharide and a partially O-deacylated lipid A containing four acyl residues.
  • the claimed lipopolysaccharide has at least 80% purification (Example 2B), it protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium and their combinations by synthesis specific antibacterial IgG, IgA, IgM antibodies in mammals, including humans (Example 2D), has anti-shock activity in septic and / or endotoxic shock, is a modulator of the responses of the immune system of mammals, including humans, and is pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg of weight in the test of pyrogenicity in rabbits (Example 2C).
  • S-LPS modified lipopolysaccharides
  • the claimed combination exhibits a synergistic effect in terms of enhancing immunogenicity compared to the diacyl derivative of lipopolysaccharide (Example 2D), and protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, and induction synthesis of specific antibacterial IgG, IgA, IgM antibodies in mammals, including humans (Example 2D), has anti-shock activity in septic and / or endotoxic shock, is a modulator of the reactions of the mammalian immune system melting, including humans (Example AP), and pyrogen-free for the rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in the test of pyrogenicity in rabbits (Example 2C).
  • a combination of modified lipopolysaccharides (S-LPS) of endotoxic bacteria was obtained, including diacyl and tetraacyl derivatives in any ratio.
  • the claimed combination exhibits a synergistic effect in terms of enhancing immunogenicity compared to the diacyl derivative of a lipopolysaccharide (Example 2D), and protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, and induction synthesis of specific antibacterial IgG, IgA, IgM antibodies in mammals, including humans (Example 2D), has anti-shock activity in septic and / or endotoxic shock, is a modulator of the immune system reactions mammals, including humans, and pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity
  • a combination of modified lipopolysaccharides (S-LPS) of endotoxic bacteria was obtained, including triacyl and tetraacyl derivatives in any ratio.
  • the claimed combination exhibits a synergistic effect in reducing pyrogenicity compared to the tetraacyl derivative of the lipopolysaccharide, and protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, and specific synthesis of bacterium IgG, IgA, IgM antibodies in mammals, including humans (Example 2D), have anti-shock activity in septic and / or endotoxic shock, is a modulator of the reactions of the mammalian immune system, including humans, and pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity test (Example 2C).
  • S-LPS modified lipopolysaccharides
  • the claimed combination exhibits a synergistic effect in terms of enhancing immunogenicity compared to the diacyl and triacyl derivatives of the lipopolysaccharide (Example 2D, 3F), and protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamy, Chlamydium, Chory their combinations by inducing the synthesis of specific antibacterial IgG, IgA, IgM antibodies in mammals, including humans (Examples 2D, 3F, ZS), detects antishock activity in septic and / or endotoxic shock (Example 3D), is a modulator ohm immune system reactions
  • Vaccines have been developed to prevent and / or treat infectious diseases caused by gram-negative bacteria.
  • the claimed vaccine includes a prophylactically and / or therapeutically effective amount of a modified lipopolysaccharide (S-LPS) of endotoxic bacteria - its diacyl or triacyl, or
  • the claimed vaccine protects against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium and their combinations by inducing the synthesis of specific antibacterial IgG, IgA, IgM antibodies in humans
  • Example 3D provides prophylaxis and / or correction of the course of septic and endotoxic shock.
  • the modified lipopolysaccharides in the claimed vaccine are pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity test (Example 3B).
  • the claimed vaccine may include pharmaceutically acceptable additives, which can be used as pH stabilizers or preservatives, or adjuvants, or isotonic agents, or
  • the vaccine may include
  • the vaccine including the conjugated form of the lipopolysaccharide, further comprises a protein carrier, namely diphtheria toxoid or tetanus toxoid, or
  • P. aeruginosa exoprotein A or other proteins (Example ZN, 31).
  • the claimed vaccine includes a prophylactically and / or therapeutically effective amount of a combination of modified
  • S-LPS lipopolysaccharides
  • the claimed vaccine causes protection against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella,
  • Corynobacterium and their combinations by inducing the synthesis of specific antibacterial IgG, IgA, IgM antibodies in mammals, including humans provides prophylaxis and / or correction of the course of septic and endotoxic shock (Example 3D).
  • the combination of modified lipopolysaccharides in the claimed vaccine is pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg of weight in the test
  • the claimed vaccine may include pharmaceutically acceptable additives, which can be used as pH stabilizers, or preservatives, or adjuvants, or isotonic agents, or
  • the vaccine may include
  • the vaccine including the conjugated form of lipopolysaccharides, further comprises a protein carrier, namely diphtheria toxoid or tetanus toxoid, or
  • P. aeruginosa exoprotein A or other proteins (Example 3G).
  • inventive vaccines based on both individual S-LPS and their combinations can simultaneously induce the widest spectrum of antibodies to various antigenic determinants of different domains of the LPS molecule (O-PS, upper core, lower core), which can be considered as an important factor in the effectiveness of protective
  • a pharmaceutical composition comprising an effective amount of modified endotoxic lipopolysaccharide (S-LPS) bacteria - its diacyl or triacyl, or tetraacyl derivative.
  • S-LPS modified endotoxic lipopolysaccharide
  • Example 4C the modified lipopolysaccharide included in its composition is pyrogen-free for the rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg of weight in the test
  • the claimed pharmaceutical composition may include pharmaceutically acceptable target additives, which can be used as preservatives or stabilizers, or solvents, or combinations thereof.
  • the claimed pharmaceutical composition has a wide spectrum of pharmacological activity and, in particular, exhibits an effective therapeutic antiviral effect against infection caused by influenza A H1N1 virus (Example 4B).
  • the pharmaceutical composition exhibits a tolerogenic effect for the correction of pathological
  • the claimed pharmaceutical composition is a modulator of the reactions of the immune system of mammals and humans (Example 4B, 4C); combinations included in its composition
  • modified lipopolysaccharides are pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity test (Example 2C).
  • the claimed pharmaceutical composition may include pharmaceutically acceptable target additives, which can be used as preservatives or stabilizers, or solvents, or combinations thereof.
  • the claimed pharmaceutical composition has a wide spectrum of pharmacological activity and is found, in particular,
  • the pharmaceutical composition exhibits a tolerogenic effect for the correction of pathological conditions associated with increased production of pro-inflammatory cytokines (Example 4C).
  • modified lipopolysaccharide S-LPS
  • S-LPS modified lipopolysaccharide
  • the modified lipopolysaccharide causes protection against
  • Example 2D prevention and / or correction of septic and endotoxic shock (Example 3D), is a modulator of reactions
  • Example 4C mammalian immune system, including humans (Example 4C), and pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity test (Example 3B).
  • the pharmaceutical product is intended for parenteral,
  • S-LPS modified lipopolysaccharides
  • tetraacyl derivatives for the manufacture of a pharmaceutical agent.
  • combinations of modified lipopolysaccharides cause protection against bacteria of the genus Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella,
  • the pharmaceutical product is intended for parenteral,
  • modified lipopolysaccharide S-LPS
  • S-LPS modified lipopolysaccharide
  • tetraacyl derivative as an immunostimulating carrier for the production of a vaccine against bacterial, viral, or other infections.
  • the modified lipopolysaccharide is conjugated to
  • protective antigen or hapten which preferably have a synthetic or protein, or polysaccharide nature.
  • the modified lipopolysaccharide is pyrogen-free for a rabbit at a dose of up to 100 ⁇ g / kg body weight in a rabbit pyrogenicity test (Example 2C).
  • S-LPS modified lipopolysaccharides
  • tetraacyl derivatives as an immunostimulating carrier for the production of vaccines against bacterial, viral, or other infections.
  • modified lipopolysaccharides are conjugated to
  • protective antigen or hapten which preferably have a synthetic or protein, or polysaccharide nature.
  • Figure 1 presents graphs of the production of in vivo mediator
  • the solid lines are extrapolation lines at OM174 dose values of 0.20; 2.00; 2.01; 3.40 and 28.10 (A and B) and LPS dose values
  • Westphal E. coli O 111B4: 0.002; 0.020; 0.200 and 2,000 (C).
  • Figure 2 presents the 13 C-NMR spectrum of deacylated S-LPS S. jlexneri
  • Fig. 3 shows photographs of silver stained tracks obtained by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis samples of the original Westphal LPS (A) and modified S-LPS (B) S. flexneri 2a (1 A, IB), E. coli 0:55 (2A, 2B), K. pneumoniae (3A), S. enterica sv typhi O: 901 (4A, 4B).
  • Figure 4 presents the ESI-MS mass spectrum of lipid A obtained from diacyl S-LPS S. flexneri 2a.
  • Figure 5 presents the ESI-MS mass spectrum of lipid A obtained from triacyl S-LPS S. flexneri 2a.
  • Figure 6 presents the ESI-MS mass spectrum of lipid A obtained from tetraacyl S-LPS S. flexneri 2a.
  • Figure 7 presents the C-NMR spectrum of pre-deacylated S-LPS S. enterica sv typhi 0: 901.
  • Fig presents diagrams of the production of IgG antibodies (day 15) after the primary (A) and secondary (B) immunization of mice with 2-acLPS,
  • Figure 9 presents the graphs of the production of IgG antibodies (day 15) after primary (A) and secondary (B) immunization of mice with 2-acLPS,
  • 4-acLPS 4-acLPS with a mass ratio of components 1: 1: 1, 3: 1, 1: 1 and 3: 1, respectively, and LPS Westphal S. enterica sv typhi 0: 901, at a dose of 25 ⁇ g per mouse.
  • the ordinate indicates serum dilution titer.
  • Figure 10 presents diagrams of the production of IgG antibodies (day 15) after primary (A) and secondary (B) immunization of mice with 2-acLPS and 3-acLPS K. pneumoniae, as well as combinations (2-acLPS + 3-acLPS + 4 -acLPS) with a mass ratio of components 1: 1: 1, and the drug LPS Westphal K. pneumoniae, at a dose of 25 mcg per mouse.
  • the ordinate indicates serum dilution titer.
  • Figure 1 1 presents a graph of the production of IgG antibodies (day 15) after the primary (A) and secondary (B) immunization of mice with 2-acLPS,
  • Fig presents diagrams of the production of IgG antibodies (day 15) after primary (A) and secondary (B) immunization of mice with conjugates of Vi- antigen and tetanus toxoid (CAT) with an immunostimulating carrier - a combination of (2-acLPS + 3-acLPS + 4 -acLPS) S. enterica sv typhi O: 901 with a mass ratio of components of 1: 1: 1, as well as pure Vi-antigen and CAT, at a dose of 25 ⁇ g of polysaccharide or 20 ⁇ g of protein per mouse. The ordinate indicates serum dilution titer.
  • Fig presents diagrams of the production of IgG antibodies (day 15) after the primary (A) and secondary (B) immunization of polyvalent mice
  • dysentery-typhoid-escherichiosis vaccine at a dose of 100 ⁇ g per mouse, as well as its individual components - a combination (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) in a mass ratio of 1: 1: 1, 5 ". flexneri 2a or S. sonnei, or S. enterica sv typhi O: 901, or E. coli 0:55, at a dose of 25 ⁇ g per mouse, and the serum dilution titer is indicated on the ordinate axis.
  • Fig presents graphs of survival of two groups of mice infected with a dose of LD100 virulent strain of influenza A H1 N1 virus.
  • triacyl lipid A (3-acLA) E. coli - OM-174 and LPS Westphal E. coli - O: 111B4, are presented in table. Only 10-fold differences in TNF- ⁇ induction in vivo between triacyl lipid A of E. coli OM-174 and endotoxin of commercial production LPS Westphal E. coli 0: 111 B4 were found, which indicates significant endotoxicity
  • K. pneumoniae revealed significant differences in the concentration of cytokine in the serum of animals.
  • the data obtained are presented in table. 2, wherein the modified S-LPS and lipids of these bacteria were obtained according to Example 2A.
  • the content of TNF- ⁇ in the blood serum of mice was determined using the Quantikine Mouse TNF-a / TNFSF1A test system (R&D Systems, USA) by the method of solid-phase ELISA according to the standard manufacturer's method. Blood was collected from animals 90 minutes after administration. table 2
  • endotoxic shock and can be used as vaccine preparations.
  • the solution concentrated after dialysis was lyophilized and 530 mg of purified LPS was obtained, containing not more than 2 wt.% Proteins,
  • the obtained LPS is characterized by SDS-gel electrophoresis data, which demonstrate a “classical” picture with a set of correctly alternating bands, each of which corresponds to S-LPS molecules with a certain number of repeating units in the O-specific polysaccharide chain, with the most rapidly migrating (lowest) zone corresponds to R-LPS (Fig. 3A).
  • FIG. 5 and FIG. Figure 6 shows typical mass spectra of lipids A obtained from deacylated S-LPS S. fiexneri 2a.
  • the characteristics in the mass spectra are signals with m / z 871, 1053 and 1279 (excluding the m / z fractions). These major signals in each spectrum correspond, respectively, to di- (Fig. 4), tri- (Fig. 5) and tetraacyl (Fig. 6) derivatives of lipid A. It should be noted that there are no penta- and hexaacyl (with m / z 1506 and 1716
  • FIG. 2 shows a typical 13 C-NMR spectrum of deacylated S-LPS S. flexneri 2a, which completely coincides in the signal regions,
  • the preparation obtained is a deacylated S-LPS with long 0-PS chains, since there are practically no signals in the spectrum belonging to the oligosaccharide cortex.
  • the content of nucleic acids and proteins in the obtained preparations did not exceed 1 wt.%.
  • Example 2A received native S-LPS, which was subjected to alkaline treatment to obtain pre
  • deacylated S-LPS from which its individual di-, tri- and tetraacyl derivatives were further isolated. 13
  • the C-NMR spectrum of pre-deacylated S. enterica sv typhi S-LPS is shown in FIG. 7.
  • Electrophoresis data indicate that the preparations are S-LPS isolated from & enterica sv typhi O: 901, K. pneumoniae, E. coli 0:55.
  • S. flexneri 2a S. enterica sv typhi 0: 901, K. pneumoniae, E. coli 0:55, as well as the LPS obtained by the classical Westphal method from S. flexneri 2a,
  • the pyrogen-free doses of 3-acLPS administration of S. flexneri 2a and S. ente ica sv typhi 0: 901, K. pneumoniae, E. coli 0:55 were 0.2; 0.1; 0.1 and 0.1 ⁇ g / kg
  • 3-acLPS is superior to the corresponding parameters of 4-acLPS, but inferior to 2-acLPS in terms of detoxification.
  • 3-acLPS corresponds to
  • pyrogen-free drug - doses up to 0.025 mcg / kg with iv administration are pyrogen-free.
  • a comparative evaluation of the most sensitive endotoxicity reduction parameter in vivo - pyrogenicity - demonstrates the advantage of three-component combinations compared to such components as 3-acLPS and 4-acLPS. With the indicated mass ratio of the components, a synergy of their anti-pyrogenic effect is observed: mixing
  • S. jlexneri 2a and S. enterica sv typhi O: 901, K. pneumoniae, E. coli 0:55 also show a synergistic interaction of the components in terms of reducing the residual endotoxicity of 3-acLPS or 4-acLPS at any mass ratio of their constituent components.
  • the two synergistic combinations (2-acLPS + 3-acLPS) and (2-acLPS + 4-acLPS) with the content in them have the maximum synergistic antipyrogenic effect
  • 3- acLPS S. flexneri la. and S. enterica sv typhi O: 901 with a mass ratio the components in them 1: 1 exhibit low pyrogenicity (doses to rabbits are 1, 0 and 0.5 ⁇ g / kg, respectively), and combinations (2-acLPS + 4-acLPS) with a mass ratio of components in them of 3: 1 have a comparable level pyrogenicity.
  • the specific pyrogen-free dose of 3-acLPS in bicomponent combinations increases 3–5 times, and 4-acLPS up to 2 times.
  • mice of the line ⁇ 57 ⁇ 1 / 6
  • FI intraperitoneally iv
  • mice On the 15th day after immunization, animal blood sera were selected to evaluate the S-LPS levels of specific IgG antibodies by ELISA. For adsorption on microplates, LPS corresponding to O serotypes were used. To study the secondary immune response, the same groups of mice were immunized with the indicated drugs repeatedly at a dose of 25 ⁇ g per mouse one month after the initial administration. 15 days after secondary
  • the data obtained show that the diacyl derivative of S-LPS from bacteria S. flexneri 2a and S. enterica sv typhi O: 901, K. pneumoniae, E. coli 0:55 is less immunogenic than tri- and tetraacyl derivatives, and causes a low primary the immune response in laboratory animals (Fig. 8A, 9A, 1 1 A). Moreover, the highest primary immune response is caused by the diacyl derivative of K. pneumoniae (Fig. 10A). The level of secondary immune IgG response when immunizing laboratory animals 2-acLPS S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi 0: 901, and E.
  • coli 0:55 were significantly higher compared to the primary response, but at 8.0; 8.0 and 7.4 times lower compared to the secondary response to 3-acLPS and 12.0; 1 1.7 and 10.2 times lower compared to the secondary response to 4-acLPS obtained from a homologous bacterium (Fig. 8B, 9B, 11B).
  • the secondary immune IgG response to 2-acLPS of K. pneumoniae was only 2.4 times different from that of 3-acLPS (Fig. 10B).
  • the levels of IgG antibody production in the primary response to 3-acLPS of S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi O: 901 and E. coli 0:55 were, respectively, 3.0; 1, 1 and 3.4 times lower than the initial response to 4-acLPS
  • S. enterica sv typhi O: 901 and E. coli 0:55 induced a primary immune response in laboratory animals at 3.0; 1.1 and 3.4 times higher than that of 3-acLPS (Fig. 8 A, 9 A, 1 1 A).
  • the secondary immune response rate for immunization of laboratory animals with 4-acLPS was 1.4; 1.5 and 1.2 times higher compared to that of the 3-acLPS of the corresponding serotype (Fig. 8B, 9B, 1B).
  • the somewhat higher immunogenicity of the 4-acLPS antigen is apparently due to the high degree of acylation of its lipid A domain and, as a result, its pronounced ability to
  • modified S-LPS especially when compared to 2-acLPS.
  • the administered dose of the individual modified S-LPS in the composition of these combinations is only 33% by weight of the dose administered as the corresponding monocomponent. It should be noted that this three-component combination of S-LPS provides a more or less pronounced synergistic effect aimed at increasing immunogenicity, at any ratios of components in it, in particular, and at their following mass ratios: (10:45:45); (45: 10:45);
  • the highest secondary immune response to Shigella or Salmonella O-antigens is induced by combinations (2-acLPS + 3-acLPS) with a mass ratio of components 1: 1, (3-acLPS + 4-acLPS) with a mass ratio of components 3: 1 and (2-acLPS + 4-acLPS) with a mass ratio of components of 3: 1.
  • the IgG level of response was highest for a combination of (3-acLPS + 4-acLPS) with a mass ratio of components of 3: 1 S.flexneri 2a and a combination of ( 2-acLPS + 3-acLPS) with a mass ratio of components 1: 1 5 * . enterica sv typhi O: 90 ⁇ (Fig. 8B, 9B).
  • the immunogenicity of combinations of modified S-LPS is determined by the composition, amount and ratio of components in them. As the most effective can be considered
  • the immunogenicity of combinations of modified S-LPS is also determined by the structure (serotype) of the Enterobacterium O-antigen.
  • serotype the structure of the Enterobacterium O-antigen.
  • high elevations of IgG antibodies can be achieved using two-component
  • Vaccines including modified S-LPS of endotoxic bacteria and combinations thereof
  • Preparation of an unconjugated vaccine includes obtaining
  • the vaccine vaccination dose contains: an unconjugated form of modified S-LPS or a combination of unconjugated forms of modified S-LPS, in an amount of from 0.010 mg to 10 mg; phenol (preservative), not more than 0.75 mg, with the addition of sodium chloride - 4.150 mg, disubstituted sodium phosphate - 0.052 mg and monosubstituted sodium phosphate - 0.017 mg; sterile pyrogen-free water for injection, 0.5 ml (FS 42-2620-97, EP IV 2002).
  • Pyrogenicity of vaccines including 2-acLPS, 3-acLPS, a combination of (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) in a mass ratio of 1: 1: 1, S. flexneri 2a; 2-acLPS, 3-acLPS, the combination (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) in a mass ratio of 1: 1: 1, S. enterica sv typhi O: 901 was determined in comparison with the pyrogenicity of the commercial Vi-antigenic vaccine. All of these vaccine preparations show pyrogen-free at a dose of 0.050 ⁇ g / kg rabbit weight. The test results are presented in table. four.
  • Sereny test Sereny B. A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines. Acta Microbiol.,
  • mice weighing 200-250 g immunized subcutaneously with a vaccine comprising 3-acLPS or a combination (2acLPS + 3acLPS + 4acLPS) in a weight ratio of 1: 1: 1, or a combination (2-acLPS + 3-acLPS) in a weight ratio of 3: 1, S. flexneri 2a in doses 25 and 50 ⁇ g per animal, in the back twice, with an interval of 10 days.
  • control animals were injected with saline. 10 days after the last immunization, dysentery was induced in experimental and control animals
  • keratoconjunctivitis (Sereny test) by introducing a suspension of cells of the virulent strain S. flexneri 2a into the conjunctiva at a dose close to IDU (10 9 cells) and at a dose close to 2 IDU (2x10 9 cells) in 30 ⁇ l of sterile saline. All animals in the control group infected with a dose of 2x10 9 cells, and 90% of animals in the control group infected with a dose of 10 9 cells developed dysenteric keratoconjunctivitis (Table 5).
  • Immunization with a vaccine comprising the combination (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. flexneri 2a in a mass ratio of 1: 1: 1, at a dose of 25 ⁇ g,
  • mice of the (CBAXC57B1 / 6) line of mice was immunized with a dose gradient vaccine that included 3-acLPS S. enterica sv typhi 0: 901, as well as a vaccine that included the combination (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. enterica sv typhi 0: 901 in a mass ratio of 1: 1: 1.
  • Phys. solution After 12-14 days, both groups of animals were infected with virulent strain of typhoid fever S.
  • a vaccine comprising a combination of (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. enterica sv typhi O: 901 in
  • endotoxin E. coli 0:55 Sigma-Aldrich, USA
  • the control group of mice was injected with / b 0.5 ml of saline according to the same scheme.
  • the survival of the animals was evaluated within 3 days after the administration of endotoxin (table. 7).
  • the vaccine including a combination of modified S-LPS S. sonnei, had a more pronounced antishock activity than the similar E. coli vaccine 0:55.
  • the modeling of septic shock was carried out using the method of puncture and ligation of the cecum (CLP model).
  • CLP model The experimental and control groups of mice were euthanized under general anesthesia, the peritoneum was opened, and the cecum and appendix were removed.
  • the cecum was ligated in the area adjacent to the appendix and was pierced through it 2 times with a needle with a diameter of 22G.
  • the contents of the cecum were squeezed out through the openings for seeding Table 7
  • the intestinal contents of the peritoneal cavity then the organs were returned back to the peritoneum and the abdominal cavity was sutured.
  • a dysenteric vaccine comprising the combination (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. flexneri 2a in a weight ratio of 1: 1: 1, and the vaccine, Table 8
  • the volunteers were monitored by a doctor for 5 days. On the first day of observation, they underwent a medical examination 2, 4, 6, and 24 hours after drug administration.
  • TNF-a, IL- ⁇ , IL-6 constitute a triad of pro-inflammatory cytokines - the main mediators of sepsis (Casey LC, Balk RA, Bone RC Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome. Ann. Intern. Intern. . Med., 1993; 119: 771-78.). Intravenous administration of Westphal E.
  • coli LPS at a dose of 0.06-0.2 ng / kg causes a rise in the level of circulating TNF- ⁇ and IL-6 by 2-100 times (Taudorf S., Krabbe KS, Berg RMG, Pedersen BK , Moller K. Human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin. Clin. Vaccine Immunol., 2007; 14 (3): 250-55), whereas in an experiment when immunizing volunteers with a vaccine that includes a combination of modified S -LPS S. jlexneri 2a and typhoid vaccine, including a combination
  • the immune response of the volunteers was investigated after subcutaneous immunization with vaccines comprising modified S-LPS and a combination of modified S-LPS S. flexneri 2a, as well as a vaccine comprising a combination of modified S-LPS S. enterica sv typhi O: 901, at a dose of 50 ⁇ g of antigen contained in 0.5 ml of phenol-phosphate buffer as a solvent, by a single administration to groups of subjects, 20 adult volunteers, in the upper third of the shoulder.
  • Secondary immunization was carried out similarly, 30 days after the primary immunization. Blood serum for research was taken from subjects before vaccination and 30 days after primary and secondary vaccination, respectively.
  • the main classes of specific anti-LPS S. fiexneri 2a and S. enterica sv typhi 0: 901 antibodies were determined using the ELISA method using isotype-specific anti-IgA, anti-IgG and anti-IgM antibodies conjugated with HRP.
  • the immunogenicity of the vaccine was evaluated by the increase of 4-fold or more increases in the level of LPS-specific antibodies in immune sera - seroconversions compared to background sera.
  • Immunogenicity of vaccines including modified S-LPS S. fiexneri 2a and combinations of modified S-LPS S. flexneri 2a and S. enterica sv typhi
  • Immunogenicity of vaccines including modified S-LPS S. flexneri 2a and combinations of modified S-LPS S. flexneri 2a and S. enterica sv typhi
  • modified S-LPS S. enterica sv typhi 0: 901 was observed in 70 and 75% of volunteers, respectively, the maximum detection rate of 4-fold or more seroconversion of IgG antibodies in vaccinated patients was 80% after primary immunization.
  • modified S-LPS S.flexneri 2a and 3-acLPS S.flexneri 2a were insignificant and caused, after secondary immunization, 10 and 15% of 4-fold or more seroconversions, respectively.
  • modified S-LPS S. enterica sv typhi O: 901 was significant and accounted for 55%) after primary and 60% after secondary immunization.
  • a vaccine comprising 2-acLPS of S. flexneri 2a in the form of elevations of IgA and IgG antibodies to LPS of S. flexneri 2a.
  • partially oxidized modified S-LPS can be conjugated to vaccine antigens by any of the known methods.
  • the conjugation method with a polysaccharide antigen - capsular Vi antigen or protein antigen - tetanus toxoid (CAT) using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (CDI).
  • CAT polysaccharide antigen - capsular Vi antigen or protein antigen - tetanus toxoid
  • CDI 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • Conjugation of a partially oxidized combination of modified S-LPS S. enterica sv typhi O: 901 with Vi antigen or CAT was carried out in a 0.2 M sodium chloride solution in the presence of CDI for 4-18 hours, maintaining a pH value of 5.6 using pH- stat.
  • the conjugates were purified on a Sepharose CL-6B column from unconjugated starting biopolymers and low molecular weight impurities using a 0.2 M sodium chloride solution as eluent. Fractions containing conjugates and eluting near the idle column volume were pooled for subsequent
  • the vaccine conjugate of the combination of modified S-LPS S. enterica sv typhi 0: 901 with the Vi antigen contained May 50. % serologically active Vi antigen as determined by ELISA.
  • the vaccine conjugate of this combination with CAT contained May 40. % protein determined by the Bradford method (Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, v. 72, pp. 248-54) .
  • One vaccination dose of a conjugate vaccine contains: a conjugate of a combination of modified S-LPS, from 0.010 to 0.200 mg; phenol
  • mice The immune response of mice to the conjugates of the polysaccharide Vi antigen and protein CAT with an immunostimulating carrier, a combination of (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. enterica sv typhi O: 901, in a mass ratio of components of 1: 1: 1, was studied.
  • mice of the line (CBAXC57B1 / 6) FI b / w immunized
  • animal peripheral blood was determined by ELISA by a 5.8-fold increase in the number of IgG antibodies compared to the response to pure Vi antigen (Fig. 12 A).
  • a conjugate of a CAT protein antigen with an immunostimulating carrier a combination of modified S-LPS S. enterica sv typhi O: 901 and pure CAT, was also administered to groups of mice of the (CBAXC57B1 / 6) FI mouse at a dose of 20 ⁇ g protein per mouse.
  • the conjugate induced a humoral immune response after a single injection, and a 15-fold increase in the number of IgG antibodies was determined in serum of animal peripheral blood on day 15 in comparison with the response to pure CAT (Fig. 12A).
  • mice were immunized with the indicated preparations repeatedly at a dose of 100 or 25 ⁇ g per mouse one month after the initial administration.
  • animal blood sera were selected.
  • a multivalent vaccine induced an immune response after primary and secondary immunization.
  • the multivalent vaccine increased the titer of IgG antibodies to all its individual components - typhoid S. enterica sv typhi O: 901, to dysenteric Flexner S. flexneri 2a, to dysenteric Sonne S.sonnei and to escherichiotic E. coli O: 55 to levels comparable to the level of response when administered separately
  • a multivalent dysentery-broth typhoid-escherichiosis vaccine simultaneously induces an immune response in mice to
  • S-LPS modified antigens derived from 4 types of bacteria belonging to three different families of endotoxic bacteria.
  • composition comprising modified S-LPS and combinations thereof
  • a pharmaceutical composition (pharmaceutical agent)
  • Preparation of a pharmaceutical composition includes the preparation of modified S-LPS and combinations thereof according to Examples 2A and 2B followed by sterile filling into solution ampoules or syringes, containing an active substance and pharmaceutically acceptable target additives, which may be used as preservatives, stabilizers, solvents, or combinations thereof.
  • Therapeutic dose includes the preparation of modified S-LPS and combinations thereof according to Examples 2A and 2B followed by sterile filling into solution ampoules or syringes, containing an active substance and pharmaceutically acceptable target additives, which may be used as preservatives, stabilizers, solvents, or combinations thereof.
  • the pharmaceutical composition contains: a combination (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) in a mass ratio of components 1: 1: 1 of Salmonella S. enterica sv typhi 0: 901, from 0.010 to 50,000 mg; phenol (preservative), not more than 0.75 mg with the addition of sodium chloride - 4.150 mg; - 0.052 mg and monosubstituted sodium phosphate - 0.017 mg; sterile pyrogen-free water for injection, 0.5 ml (FS 42-2620-97, EP IV 2002).
  • Animal survival
  • the obtained experimental data indicate that the claimed pharmaceutical composition has a modulating response of the immune system action.
  • mice of the line CBAxC57Bl / 6) FI were immunized with ip pharmaceutical compositions comprising 2-acLPS S. enterica sv typhi 0: 901 or 3-acLPS S. enterica sv typhi 0: 901, or a combination (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) in a mass ratio of 1: 1: 1 S.
  • enterica sv typhi 0: 901 in doses of 50, 100 and 200 ⁇ g / mouse, respectively (equivalent doses of 2.5; 5 and 10 mg / kg) in 0.5 ml of 0.9% sodium chloride solution (saline solution) 72 hours before the introduction of standard endotoxin LPS E. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, USA) at a dose of 2 mg / mouse, equivalent to a dose of 100 mg / kg, equal to LD100.
  • a group of control mice was injected i.p. 0.5 ml nat. solution according to the same scheme.
  • TNF- ⁇ The content of TNF- ⁇ in the blood sera of mice was determined using the Quantikine Mouse TNF-a / TNFSF1A test system (R&D Systems, USA) by the method of solid-phase ELISA according to the standard manufacturer's method. Blood was collected from animals 90 minutes after the induction of endotoxic shock. The results of the study are presented in table. 13.
  • Preliminary administration to the mice of the claimed pharmaceutical compositions provided a decrease in macrophage production of TNF- ⁇ in vivo to a level below 500 pg / ml, while in the control group this level was more than 900 pg / ml (table 13).
  • Dose-dependent suppression of TNF-a production during immunization with the claimed pharmaceutical compositions indicates their tolerogenic effect, which can be used to correct various pathological conditions associated with overproduction of pro-inflammatory cytokines.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Впервые получены индивидуальные (без примеси пента- и гексаацильных производных) ди-, три- и тетраацильные S-LPS эндотоксичных бактерий, а также их комбинации и исследованы их иммунобиологические, физико-химические и химико-фармацевтические свойства. Впервые показана возможность их клинического применения непосредственно в виде вакцин или фармацевтических композиций, содержащих модифицированные S-LPS по отдельности в качестве монокомпонентной или их комбинации в качестве двух- и трехкомпонентной активной субстанции соответственно. Модифицированные S-LPS и их комбинации обладают высокой степенью безопасности и обнаруживают низкую пирогенность и высокую иммуногенность. Разработанные на их основе вакцины и фармацевтические композиции демонстрируют противошоковую активность, высокую эффективность и специфичность, широкий спектр действия, а также хорошие химико-фармацевтические параметры.

Description

Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
Область техники
Изобретения относятся к клинической иммунологии и фармакологии, в частности, к модифицированным липополисахаридам эндотоксичных бактерий родов Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинациям, а также к включающим их вакцинам и фармацевтическим композициям.
Предшествующий уровень техники
Липополисахариды (LPS) являются эндотоксинами грам-отрицательных бактерий и включают полисахаридный (0-PS) и липидный компоненты. Этот липидный компонент, также называемый липидом А, и определяет эндотоксические свойства липополисахаридов (Rietschel Е.Т., Kirikae Т., Schade F.U., Ulmer A.J., Hoist О., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke H.D., Kusumoto S. et al. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology, 1993, Apr; 187(3-5):169-190).
Полисахаридный компонент LPS, представленный О-специфическим полисахаридом - O-PS, построенным из повторяющихся олигосахаридньгх звеньев, присоединяется к олигосахариду кора, который, в свою очередь, связан с липидом A. LPS, в состав которых входят все три структурные части - O-PS, кор и липид А, называют S-LPS, т. к. он характерен для «гладких» (smooth) форм колоний микроорганизмов.
У некоторых бактерий, в том числе патогенных, O-PS в составе LPS отсутствует. Эти микроорганизмы, которые зачастую образуют
«шероховатые» (rough) колонии, продуцируют низкокомолекулярные LPS, так называемые R-LPS, в которых присутствует только олигосахарид кора, присоединенный к липиду А.
В настоящее время доказано, что O-PS, в силу уникальности своего строения, определяют иммуноспецифичность S-LPS и, как следствие, всего
микроорганизма в целом, причем во многих случаях специфические антитела к S-LPS, индуцируемые в организме хозяина в ответ на их появление, играют ключевую роль в его защите от бактериальной инфекции и обладают высоким протективным потенциалом.
Однако хорошо известно, что, помимо способности к активации адаптивного иммунитета, LPS даже в минимальных дозах весьма эндотоксичны, а в ответ на появление их в ощутимых количествах в макроорганизме может
возникнуть состояние эндотоксического шока, что препятствует
использованию LPS в качестве компонентов вакцинных и терапевтических препаратов.
Эндотоксический компонент LPS - липид А представляет собой, как правило, дисахарид, построенный из двух фосфорилированных остатков глюкозамина, каждый из которых N- и О-ацилирован (в положениях 3- и 3') четырьмя остатками 3-гидроксимиристиновой кислоты (ГМК), которые называют первичными. Два других остатка негидроксилированных высших жирных кислот (чаще всего лауриловой и миристиновой) О-ацилируют два из вышеуказанных остатков ГМК, которые называют вторичными. Таким образом, так называемый «классический» липид А содержит шесть остатков (четыре первичных и два вторичных) высших жирных кислот (Knirel Yu.A., Valvano М. A. Bacterial Lipopolysaccharides. Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction with Host Cells. Springer Wien New York, 2011, 440 pp.).
Известно, что LPS грам-отрицательных микроорганизмов, содержащие не «классический» липид А с шестью остатками высших жирных кислот, а модифицированный тем или иным способом липид А с меньшим их
количеством, обладают сниженным уровнем эндотоксичности. Очевидно, что снижение эндотоксичности S-LPS до клинически приемлемого уровня при сохранении их способности к индукции
специфических протективных антител к полисахаридным эпитопам
открывает принципиальную возможность использования
низкоэндотоксичных модифицированных S-LPS эндотоксичных бактерий - возбудителей актуальных инфекций, в качестве профилактических вакцин и лекарственных препаратов.
Исследования в направлении трансформации эндотоксичных LPS,
содержащих «классический» липид А, в низкоэндотоксичные производные, проводимые с помощью методов химической, ферментативной и
генетической детоксификации, начались уже более 20 лет тому назад.
Так, согласно патенту US 4, 912, 094, методом контролируемого щелочного гидролиза LPS, приводящим к селективному удалению β- гидроксимиристиновой кислоты, присоединённой сложноэфирной связью к восстанавливающему концу глюкозамина в положении 3, получены
пентаацильные производные R-LPS (включающие липид А с пятью
остатками жирных кислот) эндотоксичных бактерий -Salmonella enterica sv minnesota и Escherichia coli. При этом данные по снижению эндотоксичности модифицированных R-LPS весьма ограничены; в тесте токсичности для куриных эмбрионов отмечено снижение токсичности примерно лишь в 50 раз. Фармацевтические тесты оценки снижения токсичности R-LPS
(побочные реакции, пирогенность) не применялись.
Согласно патенту US 6, 482, 807 , методом генной инженерии получен пентаацильный LPS из генетически модифицированной рекомбинантной бактерии Neisseria meningitis со сниженной эндотоксичностью, посредством блокировки продукции клеткой гексаацильной формы LPS. Однако
полученный LPS демонстрировал незначительное снижение токсичности (по данным теста на продукцию TNFa in vitro наблюдалось только 100-кратное её снижение). Модифицированный штамм лишь в 7 раз отличался от исходного по снижению активности в LAL-тесте. Данные фармацевтического теста по оценке пирогенности препарата LPS в патенте не представлены. Препарат позиционирован в первую очередь как адъювант, но не как вакцинный антиген.
В настоящее время очевидно, что пентаацильные производные LPS
эндотоксичных бактерий сохраняют существенный уровень эндотоксичности для экспериментальных животных и, следовательно, не могут найти клинического применения в качестве компонентов фармацевтических препаратов.
Согласно патенту US 4, 929, 604, методом избирательного ферментативного гидролиза вторичных жирных кислот липидного компонента LPS
эндотоксичных бактерий под действием ацилоксиацилгидролаз получены их производные, содержащие, в основном, первичные остатки 3- гидроксимиристиновой кислоты. Однако удаление вторичных жирных кислот происходит неполно, и даже при максимальной длительности обработки ферментом удаляется до 80 - 90% вторичных жирных кислот. Таким образом, продуктом указанной ферментативной обработки является смесь тетраацильных производных LPS (включающих липид А с четырьмя остатками жирных кислот) с не вступившими в реакцию пента - и
гексаацильными производными LPS (включающими липид А с пятью и шестью остатками жирных кислот соответственно) эндотоксичных бактерий семейств Escherichia или Haemophilis, или Neisseria. При этом были
исследованы иммунобиологические свойства не тетраацильных производных S-LPS как таковых, а, соответственно, вышеуказанной смеси их с пента- и гексаацильными производными. Результаты исследований оказались неудовлетворительными: отмечено лишь 20-кратное снижение активности смеси модифицированных LPS в LAL-тесте по сравнению с исходным LPS. Снижение уровня пирогенности в тесте на кроликах, оцениваемое по индексу термального ответа, является незначительным (лишь в 2,5 - 3 раза). Оценка снижения кожного сенсибилизируещего действия максимально деацилированного LPS в реакции Шварцмана указана в тексте патента противоречиво (от 10- до 100- кратного снижения).
Смесь пента- и тетрааацильных производных R-LPS и S-LPS эндотоксичных бактерий Н. influenzae и В. pertussis получена также из генетически
модифицированных штаммов путём трансформации их ферментных систем (US 7,005,129 В1 ; WO 2006065139 А2). Однако полученные смеси
мутантных LPS обладают высокой остаточной эндотоксичностью и не могут быть использованы в качестве потенциальных иммуногенов для человека.
Таким образом, описанные в патентах методы энзиматической обработки LPS, приводящие к получению смеси тетра-, пента- и гексаацильных производных LPS эндотоксичных бактерий, не приводят к существенному снижению эндотоксичности LPS, что препятствует их клиническому применению в качестве компонента фармацевтических препаратов.
Уровень техники свидетельствует о том, что препараты модифицированных LPS из эндотоксичных бактерий, представляющие собой пентаацильные производные, либо комбинацию тетра- , пента- и гексаацильных
производных, ни в коей мере не отвечают критериям клинической
безопасности. По-видимому, по этой же причине авторами вышеуказанных патентов даже не проводились стандартные исследования иммуногенности препаратов в качестве кандидатных вакцин. Препараты модифицированных LPS рассматривались инвенторами, прежде всего, в качестве
иммуностимуляторов, поэтому изучение иммуногенности препаратов и оценка иммунного ответа по отношению к О-антигенному домену LPS также не проводились.
В связи с неудовлетворительным уровнем безопасности вышеописанных модифицированных LPS, образующихся в результате неэффективного деацилирования их липида А, данное направление исследований оказалось практически в тупике. Поэтому с конца прошлого века не были получены патенты и не опубликованы работы, посвященные получению других модифицированных LPS и, в частности, модифицированных S-LPS из актуальных эндотоксичных полевых штаммов (генетически
немодифицированных) бактерий и применению их в качестве потенциальных вакцинных препаратов для введения человеку. Таким образом, из поля зрения исследователей выпала сама принципиальная возможность
использования ди-, три- и тетраацильных производных S-LPS эндотоксичных бактерий в качестве вакцин. Эта область никогда ранее не становилась предметом целенаправленного практического интереса вакцинологов.
Исследования и, соответственно, патентование в области конструирования клинически применимых вакцинных препаратов трансформировались в иную парадигму, а именно использование элементов расщепления S-LPS - 0-PS, фрагмента O-PS-κορ с диглюкозамиными остатками или липидом А
полностью деацилированным гидразином в качестве специфических антигенов для конъюгации с белковыми носителями (US 7, 553, 490; Konadu Е., Shiloach J., Bryla D.A., Robbins J.B., Szu S.C. Synthesis, characterization and immunological properties in mice of conjugates composed of detoxified
lipopolysaccharide of Salmonella paratyphi A bound to tetanus toxoid with emphasis on the role of O-acetyls. Infect. Immun., 1996, July, 64(7): 2709-15; Pavliakova D., Moncrief J.S., Lyerly D.M., Schiffman G., Bryla D.A., Robbins J.B., Schneerson R. Clostridium difficile recombinant toxin A repeating units as a carrier protein for conjugate vaccines: studies of pneumococcal type 14,
Escherichia coli Kl and Shigella flexneri type 2a polysaccharides in mice. Infect. Immun., 2000, Apr., 68(4):2161-6).
Таким образом, из предшествующего уровня техники никоим образом не вытекают перспективы получения заявляемых модифицированных
липополисахаридов - индивидуальных ди- , три- и тетраацильных
производных S-LPS эндотоксичных бактерий и клинического применения их непосредственно в виде вакцинных препаратов, содержащих
модифицированные S-LPS по отдельности в качестве монокомпонентной или их комбинаций в качестве двух- и трёхкомпонентной активной субстанции соответственно.
Косвенное отношение к заявляемым объектам имеют сведения о
деацилированных LPS бактерии Porphyromonas gingivalis - компонента микрофлоры полости рта. Согласно патенту US 7, 622, 128, получены пента- , тетра-, триацильные LPS P. gingivalis и представлена принципиальная возможность использования пентаацильного и тетраацильного производного лишь в качестве иммуномодуляторов в составе соответствующих
композиций. При этом отсутствуют какие-либо данные, характеризующие их уровень безопасности и возможности их клинического использования.
P. gingivalis продуцирует LPS с весьма низкой эндотоксичностью и
пирогенностью (с 1000-кратным снижением способности к активации провоспалительных цитокинов и со 100-кратным снижением токсичности на галактозаминовой модели по сравнению с ЛПС из эндотоксичной бактерии Е. coli ), что объясняется, в первую очередь, особенностями структуры липида А.
P. gingivalis является возбудителем местной вялотекущей инфекции ротовой полости и использование её LPS в вакцинопрофилактике в качестве
протективного антигена при данной инфекции требует разработки
специальных подходов (Darveau R.P., Cunningham M.D., Bailey Т., Seachord С, Ratcliffe К., Bainbridge В., Dietsch М., Page R.C., Aruffo A. Ability of bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion. Infect. Immun., 1995, Apr.,
63(4):1311-7; Bainbridge B. and Darveau R. P. Porphyromonas gingivalis
Lipopolysaccharide: an Unusual Pattern Recognition Receptor Ligand for the Innate Host Defense System. Acta. Odontol. Scand., 2001, 59:131-8).
Показано, что по меньшей мере половина высших жирных кислот в липиде А LPS P. gingivalis имеют необычно разветвленную структуру и обнаруживают в своем составе нечетное число атомов углерода, что резко отличает данный LPS от LPS эндотоксичных бактерий, содержащих «классический» липид А. Ближайшими аналогами заявляемых объектов в части модифицированных S- LPS эндотоксичных бактерий являются, исключительно по формальным соображениям, технические решения по патенту US 4, 912, 094 и
WO 9514026 А1.
В необоснованно широких патентных формулах указанных документов общей структурной формулой охарактеризована большая группа
модифицированных S-LPS, R-LPS и модифицированных липидов А эндотоксичных бактерий, в то время как реально получены и исследованы в части иммунобиологических свойств в первом случае - только
пентаацильные производные R-LPS и липидов A S. enterica sv minnesota и Е. coli, а во втором - триацильные и тетраацильные производные только липидов А Е. coli, Haemophilis influenzae и Pseudomonas aeruginosa.
Если данные по патенту US 4, 912, 094 интерпретированы выше, то
содержащаяся в документе WO 9514026 А1 информация подлежит
подробному обсуждению.
Триацильные производные липидов А вышеуказанных бактерий оказались мощными индукторами ключевого медиатора эндотоксической реакции - TNF-α in vivo, а также другого про-воспалительного цитокина-1Ь-6 (данные патента-аналога RU 2154068 С2). В культуре PMN in vitro триацильные производные липида А индуцировали продукцию TNF-a даже более высокую по сравнению с LPS Westphal.
В этой связи заключение в документе WO 9514026 А1 и патентах-аналогах о низкой эндотоксичности препаратов модифицированных липидов А на основании их низкой активности в LAL- тесте (1000-кратное снижение) является необоснованным. Оценка эндотоксичности LPS только на
основании проведенного in vitro теста LAL, основанного на гелеобразующей активности белка Limulus, без учета результатов тестов in vivo, отражающих продукцию про-воспалительных цитокинов (концентрация в сыворотки крови, пирогенность, побочные реакции), является неполной. В указанных документах отсутствуют данные об уровне пирогенности и, следовательно, безопасности полученных препаратов.
Последующие публикации авторов указанных документов свидетельствуют о том, что три- и тетраацильные липиды А разрабатывались как компоненты противораковых иммунопрепаратов, обладающих существенной остаточной эндотоксичностью и уровнем безопасности, не приемлемым для
традиционных вакцинных препаратов (Brandenburg К., Lindner В., Schramm A., Koch М.Н J., Bauer J., Merkli A., Zbaeren С, Davies J.G., Seydel U.
Physicochemical characteristics of triacyl lipid A partial structure ОМ- 174 in relation to biological activity. Eur. J. Biochem., 2000, v. 267, pp. 3370-7).
Модифицированные липиды А не могут быть использованы в качестве вакцины (не содержат O-PS антигенов бактерий), а использование их в качестве дополнительного компонента - адъюванта, проблематично в силу отсутствия данных, подтверждающих их низкую пирогенность.
Совершенно неожиданными в свете вышеизложенного оказались результаты сравнительного исследования индукции in vivo провоспалительного
цитокина и медиатора эндотоксической реакции TNFa, вызываемой
триацильным липидом А из E.coli ОМ- 174 и, соответственно, ди- , три- и тетраацильными S-LPS эндотоксичных бактерий, проведенные авторами настоящего документа и представленные в Примере 1.
В отличие от модифицированных липидов А, соответствующие
модифицированные S-LPS эндотоксичных бактерий оказались слабыми индукторами медиаторов эндотоксического шока и обнаружили низкую пирогенность и эндотоксичность для лабораторных животных и человека. Эти оригинальные результаты вносят определенные коррективы в
общепринятые представления о вкладе полисахаридной составляющей в иммунобиологические свойства S-LPS, а также позволяют установить корреляцию между глубиной модификации S-LPS эндотоксичных бактерий и оптимальным соотношением уровней их безопасности и иммуногенности, открывающем перспективы их клинического применения. Раскрытие изобретений
Задачами заявляемых изобретений являются:
(i) получение индивидуальных (без примеси пента- и гексаацильных
производных) модифицированных S-LPS эндотоксичных бактерий (ди-, три- и тетраацильных производных) и их комбинаций;
(ii) разработка на основе указанных объектов вакцин и фармацевтических композиций, содержащих модифицированные S-LPS по отдельности в качестве монокомпонентной или их комбинаций в качестве двух- и
трёхкомпонентной активной субстанции соответственно.
Техническими результатами, обеспечиваемыми заявляемыми изобретениями, являются:
(a) высокая степень безопасности (при парентеральном введении
добровольцам индивидуальных модифицированных S-LPS или их
комбинаций в разовых дозах до 200 мкг отсутствуют эндотоксические реакции - озноб, лихорадка, тахикардия, повышение артериального
давления);
(b) низкая пирогенность (1000 - 10000-кратное снижение пирогенной дозы индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций в тесте пирогенности на кроликах по сравнению с классическим LPS Westphal;
слабые, до 37, 6 °С, температурные реакции добровольцев при
парентеральном введении указанных препаратов в разовых дозах до 200 мкг);
(c) противошоковая активность (предварительное введение индивидуальных модифицированных S-LPS или их комбинаций обеспечивает 80%-ную выживаемость животных при эндотоксическом шоке, вызванном введением летальных доз эндотоксина; кроме того, введение указанных препаратов обусловливает коррекцию септического шока и замедляет развитие
перитонита на 18-30 часов);
(d) высокая эффективность и специфичность (иммунизация добровольцев и экспериментальных животных индивидуальными модифицированными S- LPS или их комбинациями обусловливает продукцию высоких уровней LPS- специфических и О-антиген-специфических IgG, IgA, IgM; четырёхкратную сероконверсию антител и прямую защиту животных на моделях
экспериментальных инфекций);
(e) широкий спектр действия (разработка комбинированных поливалентных вакцин, включающих индивидуальные модифицированные S-LPS или их комбинации, на основе двух или нескольких серотипов);
(f) синергетический эффект, обнаруживаемый комбинациями
модифицированных S-LPS в части снижения пирогенности и усиления иммуногенности;
(g) хорошие химико-фармацевтические характеристики как индивидуальных модифицированных S-LPS, так и их комбинаций (термостабильность, длительный срок хранения, резистентность к воздействию факторов внешней среды).
Впервые получены индивидуальные (без примеси пента- и гексаацильных производных) ди-, три- и тетраацильные S-LPS эндотоксичных бактерий, а также их комбинации и исследованы их иммунобиологические, физико- химические и химико-фармацевтические свойства.
Для уточнения объёма притязаний в части источников получения заявляемых объектов следует определиться с понятием «эндотоксичные бактерии» родов Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria,
Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium.
Такими бактериями следует называть штаммы природных, генетически не модифицированных, грам-отрицательных бактерий, полученные от больных инфекционными заболеваниями или иных источников внешней среды, продуцирующие эндотоксичные агонистические формы молекул LPS, которые характеризуются высокой токсичностью и пирогенностью в свободном или ассоциированном с клеткой виде, высокой степенью
ацилирования липида А (пента- или гексаацилированным). Течение
инфекционного процесса, вызванного эндотоксичным штаммом бактерии - активным продуцентом эндотоксичного LPS, отягощено выраженными температурными реакциями, лихорадкой и другими проявлениями синдрома системной воспалительной реакции (SIRS).
С другой стороны, низкоэндотоксичные грам-отрицательные бактерии природного происхождения обладают в 100 - 1000 раз меньшей
эндотоксичностью. Так, для достижения сравнимых уровней активации рецепторов эпителиальных клеток, PMN,TNF- a, IL-6, необходимо в 100 - 1000 раз больше клеток низкоэндотоксичных бактерий {Helicobacter pylori, P.gingivalis, Treponema pallidum) по сравнению с количеством клеток эндотоксичных бактерий (Е. coli) (Darveau R.P., Cunningham M.D., Bailey Т., Seachord С, Ratcliffe К., Bainbridge В., Dietsch М., Page R.C., Aruffo A. Ability of bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion. Infect. Immun., 1995, Apr.,
63(4):1311-7).
Низкоэндотоксичные бактерии либо являются авирулентными, либо вызывают вялотекущие, часто субклинические, формы инфекций на слизистых, за что их иногда называют «бактерии - невидимки». LPS низкоэндотоксичных бактерий всегда имеет структурные особенности, обусловливающие его низкую эндотоксичность-низкая степень
ацилирования липида А (три- или тетраацилирование),
дефосфорилированные формы липида А, уникальная структура жирных кислот (Alexander С, Rietschel Е.Т. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. J. Endotoxin Res., 2001, v.7, pp. 167-202.,).
Получен модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более повторяющихся звеньев, олигосахарид кора и
полностью О-деацилированный липид А, содержащий два ацильных остатка.
Заявленный липополисахарид обладает не менее 85%-ной степенью очистки (Пример 2В), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих и человека (Пример 2D, 3F), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4С), и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Получен модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более повторяющихся звеньев, олигосахарид кора и частично О-деацилированный липид А, содержащий три ацильных остатка.
Заявленный липополисахарид обладает не менее 80%-ной степенью очистки (Пример 2В), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры 2D, ЗС, 3F), обладает
противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке (Пример 3D), является модулятором реакций иммунной системы
млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4С), и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Получен модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более повторяющихся звеньев, олигосахарид кора и частично О-деацилированный липид А, содержащий четыре ацильных остатка.
Заявленный липополисахарид обладает не менее 80%-ной степенью очистки (Пример 2В), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека, и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая диацильные и триацильные
производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части усиления иммуногенности по сравнению диацильным производным липополисахарида (Пример 2D), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека (Пример ЗС), и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая диацильные и тетраацильные производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части усиления иммуногенности по сравнению диацильным производным липополисахарида (Пример 2D), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека, и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая триацильные и тетраацильные производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части снижения пирогенности по сравнению с тетраацильным производным липополисахарида, вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Пример 2D), обладает противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке, является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека, и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Получена комбинация модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающая диацильные, триацильные и
тетраацильные производные в любых соотношениях. Заявленная комбинация обнаруживает синергетический эффект в части усиления иммуногенности по сравнению диацильным и триацильным производным липополисахарида (Пример 2D, 3F), вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры 2D, 3F, ЗС), обнаруживает противошоковую активность при септическом и/или эндотоксическом шоке (Пример 3D), является модулятором реакций иммунной системы
млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4В, 4С), и апирогенна для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С). Разработаны вакцины для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, вызываемых грам-отрицательными бактериями.
Заявленная вакцина включает профилактически и/или терапевтически эффективное количество модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или
тетраацильного производного. Заявленная вакцина вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека
(Примеры ЗС, 3F), обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического и эндотоксического шока (Пример 3D). Модифицированные липополисахариды в заявленной вакцине являются апирогенными для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример ЗВ).
Заявленная вакцина может включать фармацевтически приемлемые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН или консерванты, или адъюванты, или изотонизирующие агенты, или их
комбинации (Пример ЗА). Кроме того, вакцина может включать
модифицированный липополисахарид как в неконъюгированной, так и в конъюгированной форме. При этом вакцина, включающая конъюгированную форму липополисахарида, дополнительно содержит белковый носитель, а именно дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин, или
экзопротеин А P. aeruginosa, или другие белки (Пример ЗН, 31).
Заявленная вакцина включает профилактически и/или терапевтически эффективное количество комбинации модифицированных
липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и тетраацильных производных, или диацильных,
триацильных и тетраацильных производных. Заявленная вакцина вызывает защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella,
Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya,
Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры ЗС, 3F), обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического и эндотоксического шока (Пример 3D). Комбинация модифицированных липополисахаридов в заявленной вакцине является апирогенной для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте
пирогенности на кроликах (Пример ЗВ).
Заявленная вакцина может включать фармацевтически приемлемые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН, или консерванты, или адъюванты, или изотонизирующие агенты или их
комбинации (Пример ЗА). Кроме того, вакцина может включать
модифицированные липополисахариды как в неконъюгированной, так и в конъюгированной форме. При этом вакцина, включающая конъюгированную форму липополисахаридов, дополнительно содержит белковый носитель, а именно дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин, или
экзопротеин А P. aeruginosa, или другие белки (Пример 3G).
Следует отметить, что заявляемые вакцины на основе как индивидуальных S-LPS, так и их комбинаций, одновременно могут индуцировать наиболее широкий спектр антител к различным антигенным детерминантам различных доменов молекулы LPS (O-PS, верхний кор, нижний кор), что может рассматриваться как важный фактор эффективности протективного
иммунитета.
Кроме того, показана возможность создания комбинированных вакцин, в которых каждый из вариантов моновакцины содержит антиген, специфичный в отношении наиболее эпидемически значимого вида грам-отрицательных бактерий (Пример 31).
Разработана фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или тетраацильного производного. Заявленная фармацевтическая композиция является
модулятором реакций иммунной системы млекопитающих и человека
(Пример 4С); включённый в её состав модифицированный липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте
пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Заявленная фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты или стабилизаторы, или растворители, или их комбинации. Заявленная фармацевтическая композиция обладает широким спектром фармакологической активности и обнаруживает, в частности, эффективное лечебное противовирусное действие против инфекции, вызываемой вирусом гриппа A H1N1 (Пример 4В). Кроме того, фармацевтическая композиция обнаруживает толерогенный эффект для коррекции патологических
состояний, связанных с повышенной продукцией про-воспалительных цитокинов (Пример 4С).
Разработана фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество комбинации модифицированных липополисахаридов
эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и
тетраацильных производных, или диацильных, триацильных и
тетраацильных производных. Заявленная фармацевтическая композиция является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих и человека (Пример 4В, 4С); включённые в её состав комбинации
модифицированных липополисахаридов являются апирогенными для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Заявленная фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты или стабилизаторы, или растворители, или их комбинации. Заявленная фармацевтическая композиция обладает широким спектром фармакологической активности и обнаруживает, в частности,
эффективное лечебное противовирусное действие против инфекции, вызываемой вирусом гриппа A H1N1 (Пример 4В). Кроме того,
фармацевтическая композиция обнаруживает толерогенный эффект для коррекции патологических состояний, связанных с повышенной продукцией про-воспалительных цитокинов (Пример 4С).
Следует также отметить, что несомненным преимуществом заявленных препаратов (вакцин и фармкомпозиций) по сравнению с препаратами- аналогами иных классов являются их хорошие химико-фармацевтические характеристики: термостабильность, широко известная для молекул LPS, обусловливающая возможность длительного срока их хранения,
относительная резистентность к воздействию факторов внешней среды.
Заявлено также применение модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или
тетраацильного производного для производства фармацевтического средства. При этом модифицированный липополисахарид вызывает защиту от
бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих и человека (Пример 2D, ЗС), обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического и эндотоксического шока (Пример 3D), является модулятором реакций
иммунной системы млекопитающих, включая человека (Пример 4С), и апирогенен для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример ЗВ).
Фармацевтическое средство предназначено для парентерального,
перорального, ректального, интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного введения млекопитающим, включая человека. Заявлено применение комбинаций модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и
тетраацильных производных, или диацильных, триацильных и
тетраацильных производных для производства фармацевтического средства. При этом комбинации модифицированных липополисахаридов вызывают защиту от бактерий рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella,
Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya,
Corynobacterium и их комбинаций путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека (Примеры 2D, 3F), обнаруживают противошоковую активность при септическом и/или эндотоксическом шоке (Примеры 3D), являются модуляторами реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека (Примеры 3F, 4В, 4С), и апирогенны для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2 С).
Фармацевтическое средство предназначено для парентерального,
перорального, ректального, интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного введения млекопитающим, включая человека.
Заявлено применение модифицированного липополисахарида (S-LPS) эндотоксичных бактерий - его диацильного или триацильного, или
тетраацильного производного в качестве иммуностимулирующего носителя для производства вакцины против бактериальных, вирусных, или иных инфекций.
При этом модифицированный липополисахарид конъюгирован с
протективным антигеном или гаптеном, которые предпочтительно имеют синтетическую или белковую, или полисахаридную природу. Модифицированный липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Заявлено применение комбинаций модифицированных липополисахаридов (S-LPS) эндотоксичных бактерий - диацильных и триацильных производных или диацильных и тетраацильных производных, или триацильных и тетраацильных производных, или диацильных, триацильных и
тетраацильных производных в качестве иммуностимулирующего носителя для производства вакцины против бактериальных, вирусных, или иных инфекций.
При этом модифицированные липополисахариды конъюгированы с
протективным антигеном или гаптеном, которые предпочтительно имеют синтетическую или белковую, или полисахаридную природу.
Комбинации модифицированных липополисахаридов являются
апирогенными для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах (Пример 2С).
Краткое описание чертежей
Изобретения иллюстрируются следующими фигурами.
На Фиг.1 представлены графики продукции in vivo медиатора
эндотоксической реакции TNF- а и провоспалительного цитокина IL-6 в сыворотке крови после внутривенного введения мышам триацильного липида А Е. coli - ОМ174 (А и В) и LPS Westphal Е. coli 0:111В4 (С), по данным патента RU 2154068. При этом на оси ординат представлены значения концентраций TNF- а (в пг/мл) и значения концентраций IL-6 (в нг/мл). На оси абсцисс (А и В) указаны значения доз введения мышам препарата ОМ174 (в мг/кг). На оси абсцисс (С) указаны значения доз введения мышам LPS (в мг/мл; положительный контроль) и физраствора
(0,85% - ный раствор NaCl; отрицательный контроль).
Сплошные линии представляют собой линии экстраполяции при значениях доз ОМ174 : 0,20; 2,00; 2,01; 3,40 и 28,10 (А и В) и значениях доз LPS
Westphal Е. coli О:111В4 : 0,002; 0,020; 0,200 и 2,000 (С).
На Фиг.2 представлен 13С-ЯМР-спектр деацилированного S-LPS S. jlexneri
2а.
На Фиг.З представлены фотографии окрашенных серебром треков, полученных в результате SDS-электрофореза в полиакриламидном геле образцов исходного LPS Westphal (А) и модифицированного S-LPS (В) S. flexneri 2a (1 A, IB), E. coli 0:55 (2A, 2B), K. pneumoniae (ЗА, 3B), S. enterica sv typhi O:901 (4A, 4B).
На Фиг.4 представлен ESI-MS масс-спектр липида А, полученного из диацильного S-LPS S. flexneri 2a.
На Фиг.5 представлен ESI-MS масс-спектр липида А, полученного из триацильного S-LPS S. flexneri 2a.
На Фиг.6 представлен ESI-MS масс-спектр липида А, полученного из тетраацильного S-LPS S. flexneri 2a.
1
На Фиг.7 представлен С-ЯМР-спектр предварительно деацилированного S-LPS S. enterica sv typhi 0:901.
На Фиг.8 представлены диаграммы продукции IgG антител (15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS,
3- acLPS и 4-acLPS S. flexneri 2a, а также их комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS +
4- acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, 3: 1, 1 : 1 и З: 1 соответственно, и препаратом LPS Westphal S. flexneri 2a, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.9 представлены диаграммы продукции IgG антител (15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS,
3- acLPS и 4-acLPS S. enterica sv typhi 0:901, а также их комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS +
4- acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , 3: 1 , 1 : 1 и З: 1 соответственно, и препаратом LPS Westphal S. enterica sv typhi 0:901, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.10 представлены диаграммы продукции IgG антител ( 15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS и 3-acLPS К. pneumoniae , а также комбинации (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , и препаратом LPS Westphal К. pneumoniae, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.1 1 представлены диаграммы продукции IgG антител ( 15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей препаратами 2-acLPS,
3- acLPS и 4-acLPS Е. coli 0:55, а также их комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS +
4- acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, 3: 1, 1 : 1 и З: 1 соответственно, и препаратом LPS Westphal Е. coli 0: 55, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.12 представлены диаграммы продукции IgG антител ( 15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей коньюгатами Vi- антигена и столбнячного анатоксина (CAT) с иммуностимулирующим носителем - комбинацией (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 при массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, а также чистых Vi- антигена и CAT, в дозе 25 мкг полисахарида или 20 мкг белка на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.13 представлены диаграммы продукции IgG антител (15 день) после первичной (А) и вторичной (В) иммунизации мышей поливалентной
дизентерийно-брюшнотифозно-эшерихиозной вакциной в дозе 100 мкг на мышь, а также отдельными её компонетами - комбинацией (2-acLPS + 3- acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , 5". flexneri 2а или S. sonnei, или S. enterica sv typhi О:901, или Е. coli 0:55, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.14 представлены графики выживаемости двух групп мышей, инфицированных дозой LD100 вирулентного штамма вируса гриппа A H1 N1.
Лучшие варианты осуществления изобретений
Пример 1.
Индукция in vivo медиатора эндотоксической реакции TNF- а после внутривенного (в/в) введения мышам модифицированных S-LPS и модифицированных липидов А эндотоксичных бактерий
Согласно данным патента RU 2154068, триацильные и тетраацильные липиды А Е. coli, Н. influenzae и P. aeruginosa являются мощными
индукторами медиатора эндотоксической реакции-TNF-a. Так,
экстраполированные из графиков Фиг. 1 (А, В, С) данные относительно продукции in vivo TNF-a в сыворотке после в/в введения мышам
триацильного липида A (3-acLA) Е. coli - ОМ- 174 и LPS Westphal Е. coli - О:111В4, представлены в табл. ЬОбнаружены всего лишь 10-кратные отличия по индукции TNF-α in vivo между триацильным липидом А Е. coli ОМ- 174 и эндотоксином коммерческого производства LPS Westphal Е. coli 0:111 В4, что свидетельствует о существенной эндотоксичности
триацильного липида А Е. coli, исключающей его использование как в качестве вакцины, так и в качестве вакцинного компонента (адъюванта). Таблица 1
Продукция in vivo медиатора эндотоксической реакции TNF- а в сыворотке крови после в/в введения мышам триацильного липида А Е. coli - ОМ 174 и LPS Westphal Е. coli 0: 1 11В4 , по данным патента RU 2154068
Figure imgf000026_0001
Сравнительное исследование индукции in vivo медиатора эндотоксической реакции TNF-α после в/в введения мышам диацильных S-LPS (2-acLPS), триацильных S-LPS (3-acLPS), тетраацильных S-LPS (4-acLPS) и,
соответственно, диацильных липидов A (2-acLA), триацильных липидов А (3-acLA), тетраацильных липидов A (4-acLA), полученных из актуальных энтеробактерий S.flexneri 2а, S. enterica sv typhi 0:901 , Е. coli 0:55,
К. pneumoniae, выявило существенные различия в концентрации цитокина в сыворотке животных. Полученные данные представлены в табл. 2, при этом модифицированные S-LPS и липиды указанных бактерий получали согласно Примеру 2А. Содержание TNF-α в сыворотках крови мышей определяли с помощью тест системы Quantikine Mouse TNF-а/ TNFSF1A (R&D Systems, USA) методом твердофазного ИФА согласно стандартной методике производителя. Кровь у животных забирали через 90 минут после введения. Таблица 2
Концентрация TNF-α (в пг/мл) в сыворотке через 2 часа после в/в введения мышам препаратов модифицированных S-LPS и модифицированных
Figure imgf000027_0001
Представленные в табл.2 данные свидетельствуют, что, в отличие от модифицированных липидов А, соответствующие модифицированные S-LPS энтеробактерий являются слабыми индукторами TNF-α - медиатора
эндотоксического шока и могут быть использованы в качестве вакцинных препаратов.
Пример 2
Получение и характеристика индивидуальных модифицированных S-LPS эндотоксичных бактерий и их комбинаций
А. Получение индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций Культуру бактерий S. flexneri 2а получали путём глубинного
культивирования в жидкой питательной среде. Отделение бактериальных клеток от жидкой фазы осуществляли с помощью проточной центрифуги. Полученные влажные клетки промывали сначала физраствором, далее водой, а затем лиофилизовали.
20 г сухих бактериальных клеток подвергали экстракции методом Вестфаля (Westphal О., Luderitz О. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bakterien. Angew. Chemie., 1954, vol. 66, pp.407- 17) горячим 45%-ным водным фенолом при 68-70°С; из водного слоя после
последовательных диализа и лиофилизации получали 960 мг неочищенного LPS, который растворяли в 0,05 М трис-буфере, рН = 7,2, содержащем 0,01 мас.% СаС12 и MgCl2, добавляли RNA-азу и DNA-азу в количествах 100 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно, и через 16 часов перемешивания при 37°С реакционную смесь обрабатывали протеиназой К (20 мкг/мл) в течение 2-х часов при температуре 55°С. Полученный раствор подвергали диализу с использованием установки для ультрафильтрации Владисарт с пределом прохождения мембраны 50 kDa.
Сконцентрированный после диализа раствор лиофилизировали и получали 530 мг очищенного LPS, содержащего не более 2-х мас.% белков,
определяемых методом Бредфорда (Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, vol. 72, pp. 248-54), и не более 2-х мас.% нуклеиновых кислот, определяемых методом Спирина (Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, 1958, т. 23, ΝΩ 4, с. 656).
Полученный LPS охарактеризован данными SDS-гель электрофореза, которые демонстрируют «классическую» картину с набором правильно чередующихся полос, каждая из которых соответствует молекулам S-LPS с определенным количеством повторяющихся звеньев в О-специфической полисахаридной цепи, причем наиболее быстро мигрирующая (самая нижняя) зона соответствует R-LPS (Фиг.З 1А).
LPS, выделенный из сухих бактериальных клеток S. flexneri 2а, растворяли в водном гидроксиде аммония, полученный раствор перемешивали на магнитной мешалке и охлажденную до 5-10°С реакционную смесь
нейтрализовали 10%-ной соляной кислотой; полученный раствор выливали при перемешивании в 8-10 кратный объем этилового спирта, выпавший осадок отделяли центрифугированием, затем процедуру высаживания повторяли еще два раза, полученный осадок растворяли в спирте, после чего полученный раствор лиофилизировали. В результате получали чистый частично деацилированный S-LPS, что подтверждалось данными
электрофореза (Фиг.З; 1 А). Варьируя условия щелочной деградации LPS S. flexneri 2а, в частности, температуру и продолжительность реакции омыления, а также концентрацию гидроксида аммония, получали частично деацилированные S-LPS, содержащие в липидном компоненте два или три, или четыре остатка высшей жирной кислоты (ди-, три- и тетраацильные производные - 2-acLPS, 3-acLPS и 4-acLPS).
В. Структура, состав и физико-химические свойства индивидуальных модифицированных S-LPS
Данные о жирнокислотном составе были получены, исходя из анализа липида А каждого из S-LPS, которые были выделены из каждого S-LPS с помощью мягкого гидролиза (1 %-ная АсОН, 100 град., 1 час). На Фиг. 4, Фиг. 5 и Фиг. 6 представлены типичные масс-спектры липидов А, полученных из деацилированных S-LPS S. fiexneri 2а. Характеристическими в масс-спектрах являются сигналы с m/z 871, 1053 и 1279 (без учёта долей m/z). Эти мажорные в каждом спектре сигналы отвечают, соответственно, ди- (Фиг.4), три- (Фиг.5) и тетраацильным (Фиг.6) производным липида А. Необходимо отметить полное отсутствие в масс-спектрах деацилированных липидов А сигналов пента- и гексаацильных (с m/z 1506 и 1716
соответственно) производных, интенсивность которых в спектрах липида А исходных S-LPS была очень высока.
Для оценки соотношения мажорного и минорного/минорных компонентов в полученных препаратах деацилированных S-LPS измеряли интенсивность соответствующих сигналов в масс-спектрах, причем учитывалась
интенсивность пиков, соответствующих не только моно-, но и
дифосфорилированным производным. Так, в случае диацильного S-LPS содержание основного вещества составляло 91 мас.%, в случае триацильного - 85 мас.%, а в случае тетраацильного - 88 мас.%. Масс-спектроскопию высокого разрешения с ионизацией электрораспылением и регистрацией ионов с помощью ион-циклотронного резонанса выполняли на спектрометре Bruker Daltonics модели Apex II с магнитом 7 (Tesla).
Анализ LPS и полученных из него частично деацилированных S-LPS проводили также с помощью 13С-ЯМР. 13С-ЯМР-спектроскопию выполняли на спектрометре Bruker модели DRX-500 с программным обеспечением XWINNMR и импульсными последовательностями от производителя.
Съемку спектров проводили в D20 (99 : 95 %) с ацетоном в качестве
стандарта (31,5 ррт). Сопоставление 13С-ЯМР-спектров исходного и частично деацилированных S-LPS показало их полную идентичность, за исключением уширенного сигнала, соответствующего метиленовым
остаткам высших жирных кислот липида А в области 30-34 м.д.,
интегральная интенсивность которого существенно уменьшается в спектрах S-LPS, полученных в результате щелочной деградации. Кроме того, 13
сравнительный анализ полученных ' С-ЯМР-спектров свидетельствует о том, что в процессе модификации (деацилирования) LPS не происходит
изменений первичной структуры повторяющегося звена 0-PS.
На Фиг. 2 представлен типичный 13 С-ЯМР-спектр деацилированного S-LPS S. flexneri 2а, который полностью совпадает в областях сигналов,
принадлежащих полисахаридному компоненту, со спектром 0-PS,
выделенного из соответствующего не модифицированного S-LPS. Полное совпадение полученных спектральных данных с литературными (Andrei V. Perepelov, Vyacheslav L. L'vov, Bin Liu, Sof'ya N. Senchenkova, Maria E.
Shekht, Alexander S. Shashkov, Lu Feng, Petr G. Aparin, Lei Wang, Yuriy A. Knirel. A similarity in the O-acetylation pattern of the O-antigens of Shigella flexneri types la, lb, 2a. Carbohydr. Res., 2009, vol. 344, pp.687-92)
свидетельствует о том, что полученный препарат представляет собой деацилированный S-LPS с длинными 0-PS цепями, так как в спектре практически отсутствуют сигналы, принадлежащие олигосахаридному кору. Содержание нуклеиновых кислот и белков в полученных препаратах не превышало 1 мас.%.
Из сухих бактериальных клеток S. enterica sv typhi или Е. coli 0:55
описанным выше способом (Пример 2А) получали нативный S-LPS, который подвергали щелочной обработке для получения предварительно
деацилированного S-LPS, из которого далее выделяли индивидуальные его ди-, три- и тетраацильные производные. 13 С-ЯМР-спектр предварительно деацилированного S-LPS S. enterica sv typhi представлен на Фиг. 7.
Индивидуальные ди-, три- и тетраацильные S-LPS из бактерии К. pneumoniae получали аналогичным способом из коммерческого образца S-LPS бактерии К. pneumoniae (Sigma L4288). Данные элекрофореза (Фиг.З, 2А - 4В) свидетельствуют о том, что препараты являются S-LPS, выделенными из & enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55.
Для исследования иммунобиологических свойств комбинаций
деацилированных S-LPS эндотоксичных бактерий предварительно получали их лиофилизированные субстанции. Субстанцию двухкомпонентной
комбинации готовили путём растворения в апирогенной воде необходимых массовых долей 2-acLPS и 3-acLPS; 2-acLPS и 4-acLPS; 3-acLPS и 4-acLPS, после чего полученный раствор лиофилизовали. Аналогично готовили субстанцию трехкомпонентной комбинации, содержащей 2-acLPS, 3-acLPS и 4-acLPS в массовом соотношении 1 : 1 : 1.
С. Пирогенность индивидуальных модифицированных S-LPS и их
комбинаций
Низкий и клинически приемлемый уровень эндотоксичности препаратов индивидуальных деацилированных S-LPS эндотоксичных бактерий и их комбинаций подтвержден специальными исследованиями их пирогенности in vivo на экспериментальных животных и клиническими исследованиями пирогенности и безопасности.
Пирогенность препаратов индивидуальных модифицированных S-LPS - 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS и их комбинаций - (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) бактерий
S.flexneri 2a, S. enterica sv typhi 0:901, K. pneumoniae, E. coli 0:55, а также LPS, полученного классическим методом Westphal из S. flexneri 2a,
определяли в сравнении с коммерческой Vi-антигенной вакциной. Тест проводился на кроликах породы Шиншилла массой 2,80 - 3,05 кг в
соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи (European
Pharmacopoeia.7-th Edition, July 2010, pp. 162-163) и Технического регламента ВОЗ для Vi-полисахаридной вакцины (Requirements for Vi-polysaccharide typhoid vaccine.WHO Technical Report Series No.840, 1994, Annex 1). После в/в введения каждого препарата трижды измеряли ректальную температуру кроликов с интервалом в 1 час. Апирогенным считали препарат, для которого суммарное повышение температуры не превышало 1 , 15 С. Полученные данные представлены в табл.3.
2-acLPS S.flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55 является весьма апирогенным препаратом. В тесте пирогенности на кроликах апирогенные дозы его введения составили 34, 21, 37 и 14 мкг/кг
соответственно. По параметру пирогенности диацильное производное S-LPS существенно превышает требования Комитета экспертов ВОЗ для
полисахаридной Hib - вакцины (Recommendations for the production and control Haemophilis influenzae type b conjugate vaccines. WHO Technical Report Series, No.897, 2000). 3-acLPS также является апирогенным препаратом.
Апирогенные дозы введения 3-acLPS S.flexneri 2а и S. ente ica sv typhi 0:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55 составили 0,2; 0,1; 0,1 и 0,1 мкг/кг,
соответственно. Таким образом, по снижению эндотоксичности 3-acLPS превосходит соответствующие параметры 4-acLPS, однако уступает 2-acLPS по степени детоксикации.
Таблица 3
Сравнительная оценка пирогенности индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций бактерий S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi О:901,
Figure imgf000033_0001
4-acLPS S. flexneri 2a 0,025 Апирогенен
4-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 0,025 Апирогенен
(2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS)
S. flexneri 2a в массовом 0,6 Апирогенен соотношении 1 : 1 : 1
(2-acLPS +3-acLPS +4-acLPS)
S. enterica sv typhi O:901 в 0,4 Апирогенен массовом соотношении 1 : 1 : 1
(2-acLPS +3-acLPS +4-acLPS)
K. pneumoniae в массовом 0,5 Апирогенен соотношении 1 : 1 : 1
(2-acLPS +3-acLPS +4-acLPS)
E. coli 0:55 в массовом 0,4 Апирогенен соотношении 1 : 1 :1
(3-acLPS+4-acLPS)
S. flexneri 2a в массовом 0,05 Апирогенен соотношении 3 : 1
(3-acLPS + 4-acLPS)
S. enterica sv typhi O:901 в 0,05 Апирогенен массовом соотношении 3: 1
(2-acLPS + 3-acLPS)
S. flexneri 2a в массовом 0,5 Апирогенен соотношении 1 : 1
(2-acLPS + 3-acLPS)
S. enterica sv typhi O:901 в 0,5 Апирогенен массовом соотношении 1 : 1
(2-acLPS + 4-acLPS)
S. flexneri 2a в массовом 0,55 Апирогенен соотношении 3: 1
(2-acLPS + 4-acLPS)
S. enterica sv typhi O:901 в 0,05 Апирогенен массовом соотношении 3: 1
LPS Westphal S. flexneri 2a 0,0001 Апирогенен
Вместе с тем, по параметру пирогенности 3-acLPS соответствует
требованиям Комитета экспертов ВОЗ для полисахаридной Vi- вакцины. 4- acLPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901 является умеренно
апирогенным препаратом - дозы до 0,025 мкг/кг при в/в его введении являются апирогенными. Трёхкомпонентные комбинации индивидуальных деацилированных S-LPS - (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) бактерий S. jlexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901, К. pneumoniae, E. coli 0:55, при массовом соотношении компонентов в них 1 : 1 : 1, обнаружили низкую пирогенность в тесте пирогенности на кроликах. Дозы указанных комбинаций до 0,6 мкг/кг веса кролика при в/в их введении являются апирогенными. Сравнительная оценка наиболее чувствительного параметра снижения эндотоксичности in vivo - пирогенности - демонстрирует преимущество трёхкомпонентных комбинаций по сравнению с такими входящими в них компонентами, как 3-acLPS и 4-acLPS. При указанном массовом соотношении компонентов наблюдается синергизм их антипирогенного действия: смешение
слабопирогенного 2-acLPS с более пирогенными 3-acLPS и 4-acLPS
аттенуирует остаточную эндотоксичность последних примерно в 3-5 раз и приводит к повышению апирогенной дозы в составе комбинаций, в
частности 4-acLPS, до 8 раз. Следует отметить, что данная трёхкомпонентная комбинация обеспечивает более или менее выраженный синергетический апирогенный эффект при любых соотношениях входящих в неё компонентов, в частности, и при следующих их массовых соотношениях: (45:45: 10);
(45:10:45); (10:45:45).
Двухкомпонентные комбинации индивидуальных деацилированных S-LPS - (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) и (3-acLPS + 4-acLPS) бактерий
S. jlexneri 2a и S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli 0:55 также обнаруживают синергетическое взаимодействие компонентов в части снижения остаточной эндотоксичности 3-acLPS или 4-acLPS при любом массовом соотношении входящих в них компонентов. Однако максимальным синергетическим антипирогенным эффектом обладают двухкомпонентные комбинации (2-acLPS + 3-acLPS) и (2-acLPS + 4-acLPS) с содержанием в них
2- acLPS не менее Уг от общей массы (табл. 3), что позволяет признать их наиболее перспективными в части безопасности. Так, комбинации (2-acLPS+
3- acLPS) S. flexneri la. и S. enterica sv typhi O:901 с массовым соотношением компонентов в них 1 : 1 обнаруживают низкую пирогенность (дозы введения кроликам составляют 1 ,0 и 0,5 мкг/кг соответственно), а комбинации (2- acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов в них 3 : 1 обладают сравнимым уровнем пирогенности. Удельная апирогенная доза 3-acLPS в двухкомпонентных комбинациях возрастает в 3 - 5 раз, a 4-acLPS -до 2-х раз. D. Иммуногенность индивидуальных модифицированных S-LPS и их комбинаций
Группы мышей линии (СВАХС57В1/6) FI внутрибрюшинно (в/б)
иммунизировали препаратами индивидуальных модифицированных S-LPS - 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS и их комбинаций - (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 :1:1, (3-acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 3:2, (2-acLPS + 3-acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 : 1, (2-acLPS + 4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 3: 1 бактерий S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55, а также LPS, полученного классическим методом Westphal из
вышеуказанных бактерий, в дозе 25 мкг на мышь.
На 15 день после иммунизации проводили отбор сывороток крови животных для оценки уровней S-LPS специфических IgG антител методом ELISA. Для адсорбции на микроплейтах использовали LPS, соответствующих О- серотипов. Для изучения вторичного иммунного ответа, те же группы мышей иммунизировали указанными препаратами повторно в дозе 25 мкг на мышь через месяц после первичного введения. На 15 день после вторичной
иммунизации проводили повторный отбор сывороток крови.
Полученные данные показывают, что диацильное производное S-LPS из бактерий S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901, К. pneumoniae, Е. coli 0:55 менее иммуногенно, чем три- и тетраацильные производные, и вызывает низкий первичный иммунный ответ у лабораторных животных (Фиг. 8А, 9А, 1 1 А). При этом наиболее высокий первичный иммунный ответ вызывает диацильное производное К. pneumoniae (Фиг. 10А). Уровень вторичного иммунного IgG ответа при иммунизации лабораторных животных 2-acLPS S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi 0:901 и E. coli 0:55 был существенно выше по сравнению с первичным ответом, однако в 8,0; 8,0 и 7,4 раза ниже по сравнению со вторичным ответом на 3-acLPS и в 12,0; 1 1,7 и 10,2 раз ниже по сравнению со вторичным ответом на 4-acLPS, полученные из гомологичной бактерии (Фиг. 8В, 9В, 11В). При этом вторичный иммунный IgG ответ на 2- acLPS К. pneumoniae лишь в 2,4 раза отличался от такового на 3-acLPS (Фиг. 10В).
Уровни продукции IgG антител при первичном ответе на 3-acLPS S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55 были, соответственно, в 3,0; 1 , 1 и 3,4 раза ниже по сравнению с первичным ответом на 4-acLPS
соответствующего серотипа (Фиг. 8 А, 9А, 1 1 А). Вторичный иммунный ответ при иммунизации лабораторных животных 3-acLPS S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55 был высоким (титр антител превышал 1600, 4000, 1800), но при этом несущественно ниже по сравнению с ответом на 4-acLPS соответствующего серотипа (Фиг. 8В, 9В, 1 IB). 4-acLPS S.flexneri 2а,
S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55 индуцировал первичный иммунный ответ у лабораторных животных в 3,0; 1,1 и 3,4 раза более высокий по сравнению с таковым 3-acLPS (Фиг. 8 А, 9 А, 1 1 А). Уровень вторичного иммунного ответа при иммунизации лабораторных животных 4-acLPS был в 1,4; 1,5 и 1,2 раза выше по сравнению с таковым 3-acLPS соответствующего серотипа (Фиг. 8В, 9В, 1В). Несколько более высокая иммуногенность 4- acLPS антигена обусловлена, по-видимому, высокой степенью ацилирования его липид А домена и, вследствие чего, выраженной способностью к
образованию им агрегатных структур по сравнению с другими
модифицированными S-LPS, особенно в сравнении с 2-acLPS.
Комбинации индивидуальных модифицированых S-LPS эндотоксичных бактерий демонстрируют высокий иммуногенный потенциал, несмотря на существенную модификацию канонической структуры их липид А домена. Так, трёхкомпонентная комбинация (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) при массовом соотношении компонентов в ней 1 : 1 : 1 , индуцировала первичный иммунный ответ к О-антигену S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi, К. pneumoniae, Е. coli 0:55, уровень которого был весьма высоким и
достоверно не отличался от уровня ответа на классический LPS Westphal, полученный из соответствующего бактериального штамма (Фиг. 8А, 9А, 1 1 А). Таким образом, иммуногенные потенциалы низкоэндотоксичного комбинированного модифицированного S-LPS иммуногена и эндотоксичного и пирогенного LPS, полученного по методу Westphal, были определены приблизительно равными, что свидетельствует о том, что в составе
комбинации находятся особые, высокоиммуногенные, с разной степенью ацилирования, ассоциаты из модифицированных S-LPS, которые и
обеспечивают синергетический эффект в части усиления её иммуногенных свойств.
Так, трёхкомпонентные комбинации (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) из бактерий S. flexneri 2а, S. enterica sv typhi 0:901, К. pneumoniae и E. coli 0:55 с массовым соотношением компонентов в них 1 : 1 : 1 , индуцировали при иммунизации лабораторных животных вторичный IgG иммунный ответ, который был в 32,0; 33,6; 8,0 и 32,0 раза выше по сравнению с ответом на 2- acLPS; в 4,0; 4,2; 3,3 и 4,3 раза выше по сравнению с ответом на 3-acLPS и в 2,7; 2,8; - и 3,1 раза выше по сравнению с ответом на 4-acLPS (Фиг. 8В, 9В, 11В). При этом вводимая доза индивидуального модифицированного S-LPS в составе данных комбинаций составляет лишь 33 % по весу от дозы, вводимой в качестве соответствующего монокомпонента. Следует отметить, что данная трёхкомпонентная комбинация S-LPS обеспечивает более или менее выраженный синергетический эффект, направленный на повышение иммуногенности, при любых соотношениях компонентов в ней, в частности, и при следующих их массовых соотношениях: (10:45:45); (45: 10:45);
(45:45:10).
Двухкомпонентные комбинации индивидуальных модифицированных S-LPS - (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) и (3-acLPS + 4-acLPS) бактерий S.flexneri 2a и S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli 0:55 также обнаруживают синергетическое взаимодействие компонентов в части усиления иммуногенности при любом массовом соотношении входящих в них компонентов. При этом наиболее высокий вторичный иммунный ответ к О-антигенам шигелл или сальмонелл индуцируют комбинации (2-acLPS + 3- acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1 , (3-acLPS + 4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 3: 1 и (2-acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 3: 1. Так, уровень IgG ответа был наиболее высоким на комбинацию (3-acLPS + 4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 3: 1 S.flexneri 2а и комбинацию (2-acLPS + 3-acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1 5*. enterica sv typhi О:90\ (Фиг. 8B, 9В).
Следует отметить, что трёхкомпонентные комбинации обеспечивают более выраженный синергетический эффект по сравнению с двухкомпонентными. Так, при сравнительном исследовании иммуногенности трёхкомпонентных комбинаций из бактерий S.flexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901 с массовым соотношением компонентов 1 : 1 : 1 и двухкомпонентных, низкопирогенных, гомологичных по О-антигену комбинаций (2-acLPS + 3-acLPS), (3-acLPS + 4- acLPS) и (2-acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1, 3: 1 и 3: 1 соответственно, установлены несколько более высокие уровни IgG ответа после иммунизации трёхкомпонентными комбинациями (Фиг. 8А, 9А).
Таким образом, иммуногенность комбинаций модифицированных S-LPS детерминирована составом, количеством и соотношением компонентов в них. В качестве наиболее эффективных могут рассматриваться
трёхкомпонентные комбинации. Вместе с тем, иммуногенность комбинаций модифицированных S-LPS определяется также и структурой (серотипом) О- антигена энтеробактерии. Для ряда серотипов высокие подъемы IgG антител могут быть достигнуты и при использовании двухкомпонентных
низкопирогенных комбинаций модифицированных S-LPS. Пример 3
Вакцины, включающие модифицированные S-LPS эндотоксичных бактерий и их комбинации
A. Применение модифицированных S-LPS и их комбинаций для
производства неконъюгированной вакцины (фармацевтического средства) Приготовление неконъюгированной вакцины включает получение
индивидуальных ди-,три- и тетраацильных производных S-LPS и их
комбинаций согласно Примерам 2А, 2В с последующим стерильным розливом в ампулы или шприцы раствора, содержащего активную
субстанцию и фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН, консерванты, адъюванты, изотонизирующие агенты или их комбинации. Прививочная доза вакцины содержит: неконъюгированную форму модифицированного S-LPS или комбинацию неконъюгированных форм модифицированных S-LPS, в количестве от 0,010 мг до 10 мг; фенол (консервант), не более 0,75 мг, с добавлением натрия хлорида - 4,150 мг, натрия фосфата двузамещенного - 0,052 мг и натрия фосфата однозамещенного - 0,017 мг; воду апирогенную стерильную для инъекций, 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).
B. Пирогенность неконъюгированной вакцины
Пирогенность вакцин, включающих 2-acLPS, З-acLPS, комбинацию (2-acLPS +3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1, S. flexneri 2а ; 2-acLPS, 3- acLPS , комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении 1:1:1, S. enterica sv typhi О:901 определяли в сравнении с пирогенностью коммерческой Vi-антигенной вакцины. Все указанные вакцинные препараты обнаруживают апирогенность в дозе 0,050 мкг/кг веса кролика. Результаты тестов представлены в табл. 4.
C. Протективные свойства неконъюгированной вакцины
Оценку протективных свойств вакцин, включающих комбинации
модифицированных S-LPS, проводили на экспериментальных моделях Таблица 4
Пирогенность неконъюгированных вакцин, включающих модифицированные S-LPS и комбинации модифицированных S-LPS бактерий S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901 в дозе 0,050 мкг/кг веса кролика
Figure imgf000041_0001
дизентерийной инфекции (тест Sereny; Sereny В. A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines. Acta Microbiol.,
Acad.Sci. Hung., 1962, v.9, pp. 55-60) и брюшнотифозной инфекции (тест активной защиты мышей).
Для изучения формирования протективного шигеллезного мукозального иммунитета у морских свинок, опытных животных массой 200-250 г иммунизировали подкожно вакциной, включающей 3-acLPS или комбинацию (2acLPS+3acLPS+4acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS) в массовом соотношении 3: 1, S. flexneri 2а в дозах 25 и 50 мкг на животное, в область спины двукратно, с интервалом в 10 дней. Контрольным животным вместо вакцинного препарата вводили физиологический раствор. Через 10 дней после последней иммунизации у опытных и контрольных животных вызывали дизентерийный
кератоконъюнктивит (тест Sereny) путём введения в конъюнктиву глаза суспензии клеток вирулентного штамма S. flexneri 2а в дозе, близкой к ИДюо (109 клеток), и в дозе, близкой к 2ИДюо (2x109 клеток), в 30 мкл стерильного физиологического раствора. У всех животных контрольной группы, инфицированных дозой 2x109 клеток, и у 90% животных контрольной группы, инфицированных дозой 109 клеток, развился дизентерийный кератоконъюнктивит (табл. 5).
Иммунизация вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4- acLPS) S. flexneri 2a в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , в дозе 25 мкг,
обеспечивала защиту глаз у 75% опытных животных при заражении их дозой в 109 клеток; при заражении же дозой в 2х109 клеток, уровень защиты глаз животных составлял 60% . Иммунизация же вакциной в дозе 50 мкг обеспечивала защиту глаз у 70% опытных животных при заражении их дозой в 109 клеток; при заражении дозой в 2х109, уровень защиты глаз животных составлял 60%).
Уровни защиты глаз от экспериментальной дизентерийной инфекции при иммунизации морских свинок вакцинами, включающими 3-acLPS или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS) в массовом соотношении 3: 1 , бактерии S. flexneri 2а также варьировали от 55 до 75 %.
Таким образом, при подкожной иммунизации животных вакциной, включающей 3-acLPS или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+-4acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 , или комбинацию (2-acLPS+3-acLPS) в Таблица 5
Протективный мукозальный иммунитет у морских свинок после системной иммунизации их вакцинами, включающими модифицированный S-LPS и комбинации моди ици ованных S-LPS бакте ии S. exneri 2а
Figure imgf000043_0001
массовом соотношении 3: 1, S. flexneri 2а, регистрировался выраженный мукозальный противодизентерийный иммунитет. Для изучения протективного брюшнотифозного иммунитета опытную группу мышей линии (СВАХС57В1/6) F1 в/б иммунизировали градиентом доз вакцины, включающей 3-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 , а также вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi 0:901 в массовом соотношении 1 : 1 : 1. Контрольной группе животных вводили физ. раствор. Через 12-14 дней обе группы животных в/б заражали вирулентным штаммом брюшного тифа S. enterica sv typhi Ту2 N24446 1000 м.к. в дозе 80 LD50 B стерильном физ. растворе, содержащем 5 мас.% муцина III типа (Sigma, USA) согласно прописи Joo (Joo I., Pusztai Z., Juhasz V.P. Mouse-protective ability of the international reference preparations of typhoid vaccine. Z. Immun. Forsch. exp. Ther., 1968, v.135, pp.365-72). Выживаемость животных в обеих группах регистрировали в течение 3-5 дней.
Как следует из табл. 6, тест активной защиты мышей выявил существенную протективную эффективность заявляемых вакцин. Так, вакцина, включающая комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 в
массовом соотношении 1 : 1 : 1, обладает протективной активностью,
сравнимой в тесте на мышах с вакцинным препаратом TYPHIM-Vi, и соответствует требованиям количественной стандартизации протективной активности брюшнотифозных вакцин.
D. Противошоковая активность неконъюгированной вакцины
Защиту животных от эндотоксического шока осуществляли посредством профилактической иммунизации опытных групп мышей линии
(CBAXC57B 1/6)F1 в/б вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3- acLPS+4-acLPS) S. sonnei в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , и вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) Е. coli 0:55 в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , в дозах 50, 100 и 200 мкг/ мышь (эквивалентным дозам 2,5; 5 и 10 мг/кг соответственно), в 0,5 мл 0,9%- ного раствора хлорида натрия за 72 часа до индукции эндотоксического шока. Эндотоксический шок индуцировали в/б введением стандартного Таблица 6
Сравнительная характеристика протективных свойств вакцин, включающих модифицированный S-LPS или комбинацию модифицированных S-LPS
Figure imgf000045_0001
эндотоксина E. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, USA) в дозе 2 мг/мышь (100 мг/кг), составляющей приблизительно 4 LD100. Контрольной группе мышей вводили в/б 0,5 мл физ.раствора по той же схеме. Выживаемость животных оценивали в течение 3-х дней после введения эндотоксина (табл. 7).
Из табл. 7 следует, что заявляемые вакцины, несмотря на сниженнную эндотоксичность, оказались эффективными профилактическими
препаратами, обеспечивающими в дозах 100 и 200 мкг/мышь 80%-ную и 40- 60%-ную соответственно, выживаемость экспериментальных животных на фоне массивной (4 LD100) эндотоксической нагрузки и корректирующими, таким образом, патогенетический механизм эндотоксического шока. При этом вакцина, включающая комбинацию модифицированных S-LPS S. sonnei, обладала более выраженной противошоковой активностью, чем аналогичная вакцина Е. coli 0:55.
Защиту животных от септического шока осуществляли посредством
профилактической иммунизации опытных групп мышей линии
(CBAXC57B 1/6)F1 в/б вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3- acLPS+4-acLPS) S. sonnei в массовом соотношении 1 : 1 : 1, и вакциной, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) Escherichia coli 0: 55 в массовом соотношении 1:1:1, в дозах 10 и 50 мкг/ мышь (эквивалентным дозам 0,5 и 2,5 мг/кг соответственно) два раза, с интервалом в 30 дней, до моделирования септического шока. Моделирование шока проводили через 18 дней после вторичной иммунизации. Контрольную группу составляли интактные прооперированные животные (табл. 8).
Моделирование септического шока (экспериментального перитонита) проводили с помощью метода прокола и перевязки слепой кишки (CLP- модель). Опытные и контрольные группы мышей усыпляли под общей анестезией, вскрывали брюшину и извлекали слепую кишку и аппендикс. Слепую кишку перевязывали в прилегающей к аппендиксу области и прокалывали её насквозь 2 раза иглой диаметром 22G. Содержимое слепой кишки выдавливали через образовавшиеся отверстия для обсеменения Таблица 7
Выживаемость мышей линии (CBAxC57Bl/6)Fl, иммунизированных вакцинами, включающими комбинации модифицированных S-LPS S. sonnei и Escherichia coli 0:55, при индукции у них эндотоксического шока в/б введением 4 LD 100 LPS E.coli 0:55
Figure imgf000047_0001
содержимым кишечника перитонеальной полости, затем возвращали органы обратно в брюшину и зашивали брюшную полость.
Из табл. 8 следует, что иммунизация животных заявляемыми вакцинами в дозе 10 мкг/мышь оказалась более эффективной, обеспечивая задержку развития у них экспериментального перитонита (на 30 и 18 часов по
сравнению с контролем) и увеличение выживаемости на фоне сепсиса (на 36 и 24 часа по сравнению с контролем).
Е. Безопасность неконъюгированной вакцины
Дизентерийную вакцину, включающую комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4- acLPS) S. flexneri 2a в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 , и вакцину, Таблица 8
Коррекция септического шока у мышей, иммунизированных вакцинами, включающими комбинации модифицированных S-LPS S. sonnei и Е. coli 0:55, при проведении CLP-операции, на 8-е сутки после первичной
Figure imgf000048_0001
включающую комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1, в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, и препарат сравнения - вакцину брюшнотифозную Vi-антигенную «Вианвак», в дозе 25 мкг, вводили однократно подкожно трем группам по 20 взрослых добровольцев, в верхнюю треть плеча. В течение первых трех суток после иммунизации определяли температурные реакции на введение указанных препаратов, общие побочные и местные реакции. Вакцина, включающая комбинацию модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а, показала высокий уровень безопасности для взрослых добровольцев. Температурные реакции в диапазоне 37,1 -37,5°С были выявлены лишь у 5% добровольцев, более высокие температурные и общие побочные реакции отсутствовали; местная реакция (болезненность в месте инъекции) была зафиксирована только у одного добровольца (табл. 9). Температурные реакции в диапазоне 37,1 - 37,5°С при введении вакцины, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi 0:901 или вакцины брюшнотифозной Vi- антигенной «Вианвак», были выявлены лишь у 10 % добровольцев (Табл. 9). Таблица 9.
Безопасность вакцин, включающих комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901, при иммунизации взрослых
Figure imgf000049_0001
Для оценки безопасности заявленных вакцин при их парентеральном (подкожном) введении человеку также изучали продукцию про- воспалительных цитокинов. Вакцины, включающие комбинации
модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901, в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, вводили добровольцам однократно подкожно в наружную поверхность верхней трети плеча.
После иммунизации добровольцы находились под наблюдением врача на протяжении 5 дней. В первые сутки наблюдения они проходили медицинское обследование через 2, 4, 6 и 24 часа после введения препаратов. Для
изучении цитокинового статуса у добровольцев брали кровь из вены до введения заявляемых вакцин (0 часов) и через 2, 4 и 6 часов после введения. Согласно литературным данным, TNF-a, IL-Ιβ, IL-6 составляют триаду провоспалительных цитокинов - основных медиаторов сепсиса (Casey L.C., Balk R.A., Bone R.C. Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome. Ann. Intern. Med., 1993; 119: 771-78.). В/в введение LPS Westphal E. coli в дозе 0,06 - 0,2 нг/кг вызывает подъём уровня циркулирующих TNF-α и IL-6 в 2-100 раз (Taudorf S., Krabbe K.S., Berg R.M.G., Pedersen B.K., Moller К. Human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin. Clin. Vaccine Immunol., 2007; 14(3): 250-55), тогда как в эксперименте при иммунизации добровольцев вакциной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а и вакциной брюшнотифозной, включающей комбинацию
модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, в дозе 50 мкг
(эквивалентной дозе 0,8-1 мкг/кг), концентрации провоспалительных цитокинов были низкими и достоверно не отличались от таковых в
сыворотках, взятых у добровольцев перед введением вакцин (табл. 10). При этом концентрация TNF- а несколько возрастала через 2 часа, IL-6-через 4 часа после введения заявляемых вакцин, а концентрация IL- 1 β практически не менялась и оставалась на базальном уровне. Таблица 10
Профили провоспалительных цитокинов в сыворотки крови добровольцев при иммунизации вакциной дизентерийной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. jlexneri 2а и вакциной брюшнотифозной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi
0:901
Figure imgf000051_0001
F. Иммуногенность неконъюгированной вакцины
Иммунный ответ добровольцев исследовали после подкожной иммунизации их вакцинами, включающими модифицированный S-LPS и комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2а , а также вакциной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, путём однократного введения группам испытуемых, по 20 взрослых добровольцев, в верхнюю треть плеча. Вторичную иммунизацию проводили аналогично, по истечении 30 дней после первичной иммунизации. Сыворотки крови для исследований брали у испытуемых до вакцинации и через 30 дней после первичной и вторичной вакцинации соответственно.
Основные классы специфических анти-LPS S. fiexneri 2а и S. enterica sv typhi 0:901 антител определяли с помощью метода ELISA, используя изотип- специфические анти-lgA, анти-lgG и анти-lgM антитела, конъюгированные с ПХ. Иммуногенность вакцины оценивали по приросту 4-х кратных и более повышений уровня LPS-специфических антител в иммунных сыворотках - сероконверсий по сравнению с фоновыми сыворотками.
Таблица 1 1
Иммуногенность вакцин, включающих модифицированныцй S-LPS S. fiexneri 2а и комбинации модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi
Figure imgf000052_0001
Таблица 12
Иммуногенность вакцин, включающих модифицированные S-LPS S.flexneri 2а и комбинации модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi
Figure imgf000053_0001
Установлено, что высокие уровни специфических IgA-антител как по частоте выявления, так и по конечному титру наблюдались после первичной и вторичной иммунизации добровольцев вакцинами, включающими
комбинации модифицированных S-LPS S. flexneri 2а и S. enterica sv typhi О:901 (табл. 1 1, 12).
Частота выявления 4-х кратного и более прироста титра IgA анти-LPS антител после иммунизации вакциной, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2a, составила 80% после первичной и вторичной иммунизации, максимальная же частота выявления 4-х кратных Ig сероконверсий IgG антител в 70% зафиксирована после вторичной
иммунизации.
4-х кратный и более прирост титра IgA анти-LPS антител после первичной и вторичной иммунизации вакциной, включающей комбинацию
модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi 0:901, отмечен у 70 и 75% добровольцев соответственно, максимальная же частота выявления 4-х кратных и более сероконверсий IgG антител у привитых составила 80% после первичной иммунизации.
4-х кратный и более прирост титра специфических IgA антител после первичной и вторичной иммунизации вакциной, включающей 3-acLPS S. flexneri 2а, отмечен у 40 и 40% добровольцев соответственно. Частота 4-х кратных и более сероконверсий IgG антител у привитых составила 40 и 40% после первичной и вторичной иммунизации 3-acLPS S.flexneri2a
соответственно.
Нарастание уровня LPS-специфических IgM-антител у добровольцев, иммунизированных вакцинами, включающими как комбинацию
модифицированных S-LPS S.flexneri 2а, так и 3-acLPS S.flexneri 2а, было незначительным и обусловило после вторичной иммунизации 10 и 15% 4-х кратных и более сероконверсий, соответственно.
Нарастание частоты сероконверсий IgM-антител у добровольцев,
иммунизированных вакциной, включающей комбинацию
модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, было существенным и составило 55%) после первичной и 60% после вторичной иммунизации.
Зарегистрирован вторичный иммунный ответ у добровольцев,
иммунизарованных вакциной, включающей 2-acLPS S.flexneri 2а, в виде подъемов IgA и IgG антител к LPS S. flexneri 2а.
Таким образом, результаты клинических исследований свидетельствуют о высокой иммуногенности для человека дизентерийной вакцины, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. flexneri 2a, и брюшнотифозной вакцины, включающей комбинацию модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901. Специфические антитела представлены наиболее важными для мукозального иммунитета классами IgA- и IgG- антител.
G. Применение комбинаций модифицированных S-LPS в качестве
иммуностимулирующего носителя для производства конъюгированной вакцины (фармацевтического средства)
Комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) с массовым соотношением компонентов 1 : 1 : 1 получали из бактерии S. enterica sv typhi 0:901 согласно Примерам 2 А и 2В. Для генерирования в модифицированных S-LPS
активных функциональных группировок, полученная комбинация была подвергнута парциальному периодатному окислению с последующим окислением образовавшихся альдегидных групп в карбоксильные. Далее частично окисленные модифицированные S-LPS могут конъюгировать с вакцинными антигенами по любому из известных методов. В настоящем исследовании был использован метод конъюгации с полисахаридным антигеном - капсульным Vi-антигеном или белковым антигеном - столбнячным анатоксином (CAT) с использованием 1-этил-3-(3- диметиламинопропил) карбодиимида (КДИ).
Конъюгацию частично окисленной комбинации модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901 с Vi-антигеном или CAT проводили в 0,2М растворе хлористого натрия в присутствии КДИ в течение 4- 18 часов, поддерживая значение рН 5,6 с помощью рН-стата. Конъюгаты очищали на колонке с Сефарозой CL-6B от неконъюгированных исходных биополимеров и низкомолекулярных примесей, используюя в качестве элюента 0,2М раствор хлористого натрия. Фракции, содержащие конъюгаты и элюирующиеся вблизи холостого объема колонки, объединяли для последующего
стерильного розлива в ампулы с добавлением фармацевтически приемлемых целевых добавок, в качестве которых использовались стабилизаторы рН или консерванты, или адъюванты, или изотонизирующие агенты или их комбинации.
Вакцинный конъюгат комбинации модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi 0:901 с Vi-антигеном содержал 50 мае. % серологически активного Vi- антигена, определяемого методом ELISA.
Вакцинный же конъюгат данной комбинации с CAT содержал 40 мае. % белка, определяемого методом Бредфорда (Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, v. 72, pp.248-54). Одна прививочная доза конъюгированной вакцины содержит: коньюгат комбинации модифицированных S-LPS, от 0,010 до 0,200 мг; фенол
(консервант), не более 0,75 мг, с добавлением натрия хлорида - 4,150 мг, натрия фосфата двузамещенного -0,052 мг и натрия фосфата
однозамещенного - 0,017 мг; воду апирогенную, стерильную, для инъекций, 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).
Н. Иммуногенность конъюгированных вакцин
Изучали иммунный ответ мышей на конъюгаты полисахаридного Vi- антигена и белкового CAT с иммуностимулирующим носителем - комбинацией (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1.
Группы мышей линии (СВАХС57В1/6) FI в/б иммунизировали
вышеуказанным конъюгатом Vi- антигена и чистым Vi- антигеном в дозе 25 мкг полисахарида на мышь. Конъюгат индуцировал гуморальный иммунный ответ и на 15 сутки после однократного его введения в сыворотках
периферической крови животных методом ELISA определяли 5,8 - кратное увеличение количества IgG антител по сравнению с ответом на чистый Vi- антиген (Фиг.12 А).
Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей
иммунизировали указанными вакцинами повторно в дозе 25 мкг
полисахарида на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки после повторной иммунизации конъюгатом зарегистрировано 8,2-кратное увеличение количества IgG анти- Vi антител (Фиг.12В).
Конъюгат белкового антигена CAT с иммуностимулирующим носителем - комбинацией модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901 и чистый CAT также вводили группам мышей линии (СВАХС57В1/6) FI в/б в дозе 20 мкг белка на мышь. Конъюгат индуцировал гуморальный иммунный ответ после однократного введения и на 15 сутки в сыворотках периферической крови животных определяли 3-х кратное увеличение количества IgG антител по сравнению с ответом на чистый CAT (Фиг.12А).
Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей
иммунизировали вакцинами повторно в дозе 20 мкг белка на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки вторичного ответа после повторной иммунизации конъюгатом зарегистрировано 6,4 -кратное увеличение количества IgG анти- CAT антител (Фиг.12В).
Следует отметить, что уровни О-специфических антител к
иммуностимулирующему носителю - комбинации модифицированных S-LPS S. enterica sv typhi О:901, индуцированные конъюгатом с CAT, также повышались: при первичном ответе -в 3,2 раза, а при вторичном - в 1,5 раза (Фиг.12А и В). Таким образом, при введении конъюгата S-LPS с белковым антигеном, наблюдалось дополнительное повышение иммунного ответа как на белковый антиген, так и на носитель.
I. Поливалентная дизентерийно-брюшнотифозная-эшерихиозная вакцина Для получении субстанции поливалентной вакцины против шигеллеза
Флекснера и Зонне, брюшного тифа и энтерогеморрагической эшерихиозной инфекции Е. coli 0:55, растворяли в апирогенной воде равные весовые доли субстанций комбинации (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в соотношении компонентов 1 : 1 : 1 серотипов S.flexneri 2а, S. sonnei, S. enterica sv typhi O:901 и E. coli 0:55, полученные согласно Примерам 2 А и 2B. Финальную форму вакцины готовили в соответствии с Примером ЗА. Иммуногенность поливалентной дизентерийно-брюшнотифозно- эшерихиозной вакцины определяли в тестах на мышах линии
(СВАХС57В1/6) FI, которых иммунизировали в/б поливалентной вакциной в дозе 100 мкг на мышь. Компоненты поливалентной вакцины-комбинации (2- acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в соотношении 1 : 1 : 1 S. flexneri 2а или S. sonnei, или S. enterica sv typhi О:901 , или E.coli 0:55 также вводили отдельно различным группам мышей в дозе 25 мкг на мышь. На 15 сутки проводили отбор сывороток крови животных. Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей иммунизировали указанными препаратами повторно в дозе 100 или 25 мкг на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки после вторичной иммунизации проводили отбор сывороток крови животных. Поливалентная вакцина индуцировала иммунный ответ после первичной и вторичной иммунизации. При этом поливалентная вакцина повышала титр IgG антител на все отдельные её компоненты- брюшнотифозный S. enterica sv typhi О:901, на дизентерийный Флекснер S. flexneri 2а, на дизентерийный Зонне S.sonnei и на ешерихиозный Е. coli О:55 до уровней, сравнимых с уровнем ответа при отдельном введении
соотвествующего компонента в дозе 25 мкг (Фиг.13 А, В).
Таким образом, поливалентная дизентерийно-бр шнотифозно-эшерихиозная вакцина одновременно индуцирует иммунный ответ у мышей на
модифицированные S-LPS антигены, полученные из 4-х видов бактерий, относящихся к трем различным семействам эндотоксичных бактерий.
Пример 4
Фармацевтическая композиция, включающая модифицированные S-LPS и их комбинации
А. Применение модифицированных S-LPS и их комбинаций для
производства фармацевтической композиции (фармацевтического средства) Приготовление фармацевтической композиции включает получение модифицированных S-LPS и их комбинаций согласно Примерам 2А и 2В с последующим стерильным розливом в ампулы или шприцы раствора, содержащего активную субстанцию и фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты, стабилизаторы, растворители или их комбинации. Лечебная доза
фармацевтической композиции содержит: комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4- acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 сальмонелл S. enterica sv typhi 0:901, от 0,010 до 50,000 мг; фенол (консервант), не более 0,75 мг с добавлением натрия хлорида - 4,150 мг; - 0,052 мг и натрия фосфата однозамещенного - 0,017 мг; воду апирогенную стерильную для инъекций, 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).
B. Противовирусное действие фармацевтической композиции
Противовирусное действие фармацевтической композиции, включающей комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении
компонентов 1 : 1 : 1 из сальмонелл S. enterica sv typhi О:901, изучали на белых мышах. Опытные и контрольные группы самцов весом 18-20 г (по 10 животных в группе) инфицировали дозой LD100 вирулентного штамма гриппа A H1N1, после чего осуществляли лечение опытных групп путём ежедневного в/б введения животным препарата, включающего комбинацию (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении компонентов 1 : 1 : 1 S. enterica sv typhi О:901, в дозе 100 мкг на животное. Контрольным группам мышей аналогично вводили физ. раствор. Выживаемость животных
определяли в течение двух недель после инфицирования. В контрольной группе мышей выживаемость составила 0 %, в опытной группе -40% (Фиг. 14). При этом средние показатели продолжительности жизни опытных групп мышей статистически достоверно (р > 0,001) были выше контрольных. Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявленная фармацевтическая композиция обладает модулирующим реакции иммунной системы действием.
C. Толерогенное действие фармацевтической композиции
Опытные группы мышей линии (CBAxC57Bl/6)FI иммунизировали в/б фармацевтическими композициями, включающими 2-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 или 3-acLPS S. enterica sv typhi 0:901 , или комбинацию (2- acLPS+3-acLPS+4-acLPS) в массовом соотношении 1 : 1 : 1 S. enterica sv typhi 0:901 , в дозах 50, 100 и 200 мкг/ мышь соответственно (эквивалентным дозам 2,5; 5 и 10 мг/кг) в 0,5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (физ. раствора) за 72 часа до введения стандартного эндотоксина LPS Е. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США) в дозе 2 мг/мышь, эквивалентной дозе 100 мг/кг, равной LD100. Группе контрольных мышей вводили в/б 0,5 мл физ. раствора по той же схеме.
Содержание TNF-α в сыворотках крови мышей определяли с помощью тест системы Quantikine Mouse TNF-a/ TNFSF1A (R&D Systems, USA) методом твердофазного ИФА согласно стандартной методике производителя. Кровь у животных забирали через 90 минут после индукции эндотоксического шока. Результаты исследования представлены в табл. 13.
Таблица 13
Продукция TNF-a у мышей после предварительного введения заявляемых фармацевтических композиций, проведенного за 72 часа до индукции эндотоксического шока
Figure imgf000060_0001
Предварительное введение мышам заявляемых фармацевтических композиций обеспечивало снижение продукции макрофагами TNF-α in vivo до уровня ниже 500 пг/мл, в то время как в контрольной группе такой уровень составлял более 900 пг/мл (таблица 13). Дозо-зависимое подавление продукции TNF-a при иммунизации заявляемыми фармацевтическими композициями свидетельствует об их толерогенном действии, которое может быть использовано для коррекции различных патологических состояний, ассоциированных с гиперпродукцией про-воспалительных цитокинов.

Claims

Формула изобретения
1. Модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более одного повторяющихся звеньев, олигосахарид кора, а также полностью О-деацилированный липид А, содержащий два ацильных остатка.
2. Модифицированный липополисахарид по п.1 , представляющий собой липополисахарид эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
3. Модифицированный липополисахарид по п.1 или п.2, обладающий не менее 85%-ной степенью очистки.
4. Модифицированный липополисахарид по п.1 или п.2, вызывающий защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria,
Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
5. Модифицированный липополисахарид по п.1 или п.2, обладающий противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке.
6. Модифицированный липополисахарид по п.1 или п.2, являющийся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
7. Модифицированный липополисахарид по п.1 или п.2, апирогенный для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
8. Модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более одного повторяющихся звеньев, олигосахарид кора, а также частично О-деацилированный липид А, содержащий три
ацильных остатка.
9. Модифицированный липополисахарид по п. 8, представляющий собой липополисахарид эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacteriam и их комбинации.
10. Модифицированный липополисахарид по п. 8 или п. 9, обладающий не менее 80% -ной степенью очистки.
11. Модифицированный липополисахарид по п. 8 или п. 9,
вызывающий защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических
антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
12. Модифицированный липополисахарид по п. 8 или п. 9,
обладающий противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке.
13. Модифицированный липополисахарид по любому из пп. 8 - 10, являющийся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
14. Модифицированный липополисахарид по п. 8 или п. 9,
апирогенный для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
15. Модифицированный липополисахарид (S-LPS) эндотоксичных бактерий, включающий О-специфический полисахарид, состоящий из одного или более одного повторяющихся звеньев, олигосахарид кора, а также частично О-деацилированный липид А, содержащий четыре ацильных остатка.
16. Модифицированный липополисахарид по п. 15, представляющий собой липополисахарид эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
17. Модифицированный липополисахарид по п. 15 или п. 16,
обладающий не менее 80% -ной степенью очистки.
18. Модифицированный липополисахарид по п. 15 или п. 16,
вызывающий защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических
антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
19. Модифицированный липополисахарид по п. 15 или п. 16,
обладающий противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке.
20. Модифицированный липополисахарид по п. 15 или п. 16,
являющийся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
21. Модифицированный липополисахарид по п. 15 или п. 16,
апирогенный для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
22. Комбинация модифицированных липополисахаридов, включающая модифицированный липополисахарид по п. 1 и модифицированный липополисахарид по п. 8.
23. Комбинация по п. 22, включающая модифицированные
липополисахариды в любых соотношениях.
24. Комбинация по п. 22 или п. 23, в которой модифицированные липополисахариды представляют собой липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
25. Комбинация по п. 24, вызывающая защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella,
Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
26. Комбинация по п. 24, обладающая противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке.
27. Комбинация по п. 24, являющаяся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
28. Комбинация по п. 24, апирогенная для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
29. Комбинация модифицированных липополисахаридов, включающая модифицированный липополисахарид по п. 1 и модифицированный липополисахарид по п. 15.
30. Комбинация по п. 29, включающая модифицированные
липополисахариды в любых соотношениях.
31. Комбинация по п. 29 или п. 30, в которой модифицированные липополисахариды представляют собой липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
32. Комбинация по п. 31 , вызывающая защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella,
Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
33. Комбинация по п. 31, обладающая противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке.
34. Комбинация по п. 31, являющаяся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
35. Комбинация по п. 31, апирогенная для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
36. Комбинация модифицированных липополисахаридов, включающая модифицированный липополисахарид по п. 8 и модифицированный липополисахарид по п. 15.
37. Комбинация по п. 36, включающая модифицированные
липополисахариды в любых соотношениях.
38. Комбинация по п. 36 или п. 37, в которой модифицированные липополисахариды представляют собой липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
39. Комбинация по п. 38, вызывающая защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella,
Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
40. Комбинация по п. 38, обладающая противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке.
41. Комбинация по п. 38, являющаяся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
42. Комбинация по п. 38, апирогенная для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
43. Комбинация модифицированных липополисахаридов, включающая модифицированный липополисахарид по п. 1, модифицированный
липополисахарид по п. 8 и модифицированный липополисахарид по п. 15.
44. Комбинация по п. 43, включающая модифицированные
липополисахариды в любых соотношениях.
45. Комбинация по п. 43 или п. 44, в которой модифицированные липополисахариды представляют собой липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
46. Комбинация по п. 45, вызывающая защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella,
Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
47. Комбинация по п. 45, обладающая противошоковой активностью при септическом и/или эндотоксическом шоке.
48. Комбинация по п. 45, являющаяся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
49. Комбинация по п. 45, апирогенная для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
50. Вакцина, включающая эффективное количество модифицированного липополисахарида по п. 1 или п. 8, или п. 15.
51. Вакцина по п. 50, в которой модифицированный липополисахарид представляет собой липополисахарид эндотоксичных бактерий,
выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
52. Вакцина по п. 50 или п. 51 , в которой модифицированный
липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
53. Вакцина по п. 50 или п. 51, включающая фармацевтически
приемлемые добавки.
54. Вакцина по п. 53, в которой фармацевтически приемлемые добавки выбраны из группы, включающей стабилизаторы рН, консерванты, адъюванты, изотонизирующие агенты и их комбинации.
55. Вакцина по п. 50 или п. 51, или п. 54, в которой
модифицированный липополисахарид содержится в неконъюгированной форме.
56. Вакцина по п. 53, включающая в качестве фармацевтически приемлемой добавки белковый носитель.
57. Вакцина по п. 56, в которой белковый носитель выбран из группы, включающей дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и
экзопротеин A Pseudomonas aeruginosa.
58. Вакцина по п. 56 или п. 57, в которой модифицированный
липополисахарид содержится в конъюгированной форме.
59. Вакцина по п. 50 или п. 51, вызывающая защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
60. Вакцина по п. 50 или п. 51, обеспечивающая профилактику и/или коррекцию течения септического шока.
61. Вакцина по п. 50 или п. 51, обеспечивающая профилактику и/или коррекцию течения эндотоксического шока.
62. Вакцина, включающая эффективное количество комбинации модифицированных липополисахаридов по п. 22 или по п. 29, или по п. 36, или по п. 43.
63. Вакцина по п. 62, в которой модифицированные липополисахариды представляют собой липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
64. Вакцина по п. 62 или п. 63, в которой комбинация
модифицированных липополисахаридов является апирогенной для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
65. Вакцина по п. 62 или п. 63, включающая фармацевтически приемлемые добавки.
66. Вакцина по п. 65, в которой фармацевтически приемлемые добавки выбраны из группы, включающей стабилизаторы рН, консерванты, адъюванты, изотонизирующие агенты и их комбинации.
67. Вакцина по п. 62 или п. 63, или п. 66, в которой
модифицированные липополисахариды содержатся в неконъюгированной форме.
68. Вакцина по п. 65, включающая в качестве фармацевтически приемлемой добавки белковый носитель.
69. Вакцина по п. 68, в которой белковый носитель выбран из группы, включающей дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин и
экзопротеин A Pseudomonas aeruginosa.
70. Вакцина по п. 68 или п. 69, в которой модифицированные
липополисахариды содержатся в конъюгированной форме.
71. Вакцина по п. 62 или п. 63, вызывающая защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
72. Вакцина по п. 62 или п. 63, обеспечивающая профилактику и/или коррекцию течения септического шока.
73. Вакцина по п. 62 или п. 63, обеспечивающая профилактику и/или коррекцию течения эндотоксического шока.
74. Фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество модифицированного липополисахарида по п. 1 или п. 8 , или п. 15.
75. Фармацевтическая композиция по п. 74, в которой
модифицированный липополисахарид представляет собой
липополисахарид эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
76. Фармацевтическая композиция по п. 74 или п.75, в которой модифицированный липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
77. Фармацевтическая композиция по п. 74 или п. 75, включающая фармацевтически приемлемые целевые добавки.
78. Фармацевтическая композиция по п. 77, в которой целевые добавки выбраны из группы, включающей консерванты, стабилизаторы,
растворители и их комбинации.
79. Фармацевтическая композиция по п. 74 или п. 75, являющаяся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
80. Фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество комбинации модифицированных липополисахаридов по п. 22 или п. 29, или п. 36, или п. 43.
81. Фармацевтическая композиция по п. 80, в которой
модифицированные липополисахариды представляют собой
липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
82. Фармацевтическая композиция по п. 80 или п. 81, в которой комбинация модифицированных липополисахаридов является
апирогенной для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
83. Фармацевтическая композиция по п. 80 или п. 81, включающая фармацевтически приемлемые целевые добавки.
84. Фармацевтическая композиция по п. 83, в которой целевые добавки выбраны из группы, включающей консерванты, стабилизаторы,
растворители и их комбинации.
85. Фармацевтическая композиция по п. 80 или п. 81, являющаяся модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
86. Применение модифицированного липополисахарида по п. 1 или п. 8, или п. 15 для производства фармацевтического средства.
87. Применение по п. 86, где модифицированный липополисахарид представляет собой липополисахарид эндотоксичных бактерий,
выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
88. Применение по п. 86 или п. 87, где модифицированный
липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
89. Применение по п. 86 или п. 87, где модифицированный
липополисахарид вызывает защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза
специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
90. Применение по п. 86 или п. 87, где модифицированный
липополисахарид обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического шока.
91. Применение по п. 86 или п. 87, где модифицированный
липополисахарид обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения эндотоксического шока.
92. Применение по п. 86 или п. 87, где модифицированный
липополисахарид является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
93. Применение по п. 86, где фармацевтическое средство предназначено для парентерального, перорального, ректального, интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного введения млекопитающим, включая человека.
94. Применение комбинации модифицированных липополисахаридов по п. 22 или п. 29, или п. 36, или п. 43 для производства
фармацевтического средства.
95. Применение по п. 94, где модифицированные липополисахариды представляют собой липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
96. Применение по п. 94 или п. 95, где комбинация модифицированных липополисахаридов является апирогенной для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
97. Применение по п. 94 или п. 95, где комбинация модифицированных липополисахаридов вызывает защиту от бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации, путём индукции синтеза
специфических антибактериальных IgG, IgA, IgM антител в организме млекопитающих, включая человека.
98. Применение по п. 94 или п. 95, где комбинация модифицированных липополисахаридов обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения септического шока.
99. Применение по п. 94 или п. 95, где комбинация модифицированных липополисахаридов обеспечивает профилактику и/или коррекцию течения эндотоксического шока.
100. Применение по п. 94 или п. 95, где комбинация
модифицированных липополисахаридов является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
101. Применение по п. 94, где фармацевтическое средство
предназначено для парентерального, перорального, ректального,
интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного введения млекопитающим, включая человека.
102. Применение модифицированного липополисахарида по п. 1 или п. 8, или п. 15 в качестве иммуностимулирующего носителя для производства вакцины.
103. Применение по п. 102, где модифицированный липополисахарид представляет собой липополисахарид эндотоксичных бактерий,
выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
104. Применение по п. 102 или п. 103, где модифицированный
липополисахарид является апирогенным для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
105. Применение по п. 102 или п. 103, где модифицированный
липополисахарид конъюгирован с протективным антигеном или гаптеном.
106. Применение по п. 105, где протективный антиген выбран из группы, включающей синтетические, белковые и полисахаридные антигены.
107. Применение по п. 105, где гаптен выбран из группы, включающей синтетические, белковые и полисахаридные гаптены.
108. Применение по п. 102, где вакцина выбрана из группы,
включающей вакцину для профилактики бактериальных инфекций и вакцину для профилактики вирусных инфекций.
109. Применение комбинации модифицированных липополисахаридов по п. 22 или п. 29, или п. 36, или п. 43 в качестве
иммуностимулирующего носителя для производства вакцины.
ПО. Применение по п. 109, где модифицированные липополисахариды представляют собой липополисахариды эндотоксичных бактерий, выбранных из группы, включающей бактерии рода Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio,
Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium и их комбинации.
111. Применение по п. 109 или п. 110, где комбинации
модифицированных липополисахаридов являются апирогенными для кролика в дозе до 100 мкг/кг веса в тесте пирогенности на кроликах.
112. Применение по п. 109 или п. 110, где модифицированные
липополисахариды конъюгированы с протективным антигеном или гаптеном.
ИЗ. Применение по п. 1 12, где протективный антиген выбран из группы, включающей синтетические, белковые и полисахаридные антигены.
114. Применение по п. 1 12, где гаптен выбран из группы, включающей синтетические, белковые и полисахаридные гаптены.
115. Применение по п. 109, где вакцина выбрана из группы,
включающей вакцину для профилактики бактериальных инфекций и вакцину для профилактики вирусных инфекций.
PCT/RU2013/000456 2013-06-04 2013-06-04 Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты) WO2014196887A1 (ru)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201501165A EA031879B1 (ru) 2013-06-04 2013-06-04 Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
PCT/RU2013/000456 WO2014196887A1 (ru) 2013-06-04 2013-06-04 Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
US14/895,894 US20160120967A1 (en) 2013-06-04 2013-06-04 Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants)
ES13886231T ES2828373T3 (es) 2013-06-04 2013-06-04 Lipopolisacárido modificado (variantes) de bacterias endotóxicas, combinación de lipopolisacáridos modificados (variantes) y una vacuna (variantes), que los contiene, y una composición farmacéutica (variantes)
KR1020167000036A KR102125600B1 (ko) 2013-06-04 2013-06-04 개질된 내독성 세균 지질다당류(변형체), 개질된 지질다당류들(변형체들)의 조합물, 및 이를 함유한 백신(변형체) 및 약제 조성물(변형체)
EP13886231.3A EP3006450B1 (en) 2013-06-04 2013-06-04 Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants)
US15/454,526 US11052142B2 (en) 2013-06-04 2017-03-09 Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2013/000456 WO2014196887A1 (ru) 2013-06-04 2013-06-04 Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/895,894 A-371-Of-International US20160120967A1 (en) 2013-06-04 2013-06-04 Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants)
US15/454,526 Continuation-In-Part US11052142B2 (en) 2013-06-04 2017-03-09 Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014196887A1 true WO2014196887A1 (ru) 2014-12-11

Family

ID=52008417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2013/000456 WO2014196887A1 (ru) 2013-06-04 2013-06-04 Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20160120967A1 (ru)
EP (1) EP3006450B1 (ru)
KR (1) KR102125600B1 (ru)
EA (1) EA031879B1 (ru)
ES (1) ES2828373T3 (ru)
WO (1) WO2014196887A1 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2614123C1 (ru) * 2015-10-01 2017-03-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России Способ получения комплексного шигеллезного препарата
WO2017129752A1 (en) * 2016-01-28 2017-08-03 De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws, Ministerie Van Volksgezondheid, Welzijn En Sport Modified tetra-acylated neisserial lps
US10881684B2 (en) * 2016-06-27 2021-01-05 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Army Artificial invaplex formulated with deacylated lipopolysaccharide
EP4149443A4 (en) * 2020-05-11 2024-05-29 Revir, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING VIRUS INFECTIONS

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4912094A (en) 1988-06-29 1990-03-27 Ribi Immunochem Research, Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US4929604A (en) 1986-05-28 1990-05-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Lipopolysaccharides of reduced toxicity and the production thereof
WO1995014026A1 (en) 1993-11-17 1995-05-26 Laboratoires Om S.A. Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
US6482807B1 (en) 1998-11-03 2002-11-19 De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur LPS with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria
US20050271675A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-08 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Methods for preparing immunogenic conjugates
US7005129B1 (en) 1995-12-01 2006-02-28 University Of Iowa Research Foundation Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria
WO2006065139A2 (en) 2004-12-17 2006-06-22 Nvi Nederlands Vaccininstituut Deacylation of lps in gram negative bacteria
US7553490B2 (en) 1998-07-20 2009-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vaccines against Escherichia coli O157 infection
US7622128B2 (en) 2005-12-13 2009-11-24 University Of Washington Porphyromonas gingivalis 1435/1449 LPS as an immune modulator
WO2012154072A1 (ru) * 2011-05-06 2012-11-15 Aparin Petr Gennadievich Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4929604A (en) 1986-05-28 1990-05-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Lipopolysaccharides of reduced toxicity and the production thereof
US4912094A (en) 1988-06-29 1990-03-27 Ribi Immunochem Research, Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
WO1995014026A1 (en) 1993-11-17 1995-05-26 Laboratoires Om S.A. Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
RU2154068C2 (ru) 1993-11-17 2000-08-10 Лаборатуар Ом С.А. Глюкозаминовые дисахариды, способ их получения, фармацевтическая композиция
US7005129B1 (en) 1995-12-01 2006-02-28 University Of Iowa Research Foundation Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria
US7553490B2 (en) 1998-07-20 2009-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vaccines against Escherichia coli O157 infection
US6482807B1 (en) 1998-11-03 2002-11-19 De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur LPS with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria
US20050271675A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-08 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Methods for preparing immunogenic conjugates
WO2006065139A2 (en) 2004-12-17 2006-06-22 Nvi Nederlands Vaccininstituut Deacylation of lps in gram negative bacteria
US7622128B2 (en) 2005-12-13 2009-11-24 University Of Washington Porphyromonas gingivalis 1435/1449 LPS as an immune modulator
WO2012154072A1 (ru) * 2011-05-06 2012-11-15 Aparin Petr Gennadievich Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"European Pharmacopoeia", July 2010, pages: 162 - 163
"Requirements for Vi-polysaccharide typhoid vaccine", WHO TECHNICAL REPORT SERIES NO.840, 1994
ALEXANDER C.; RIETSCHEL E.T.: "Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity", J. ENDOTOXIN RES., vol. 7, 2001, pages 167 - 202
ANDREI V. PEREPELOV; VYACHESLAV L. L'VOV; BIN LIU; SOF YA N. SENCHENKOVA; MARIA E. SHEKHT; ALEXANDER S. SHASHKOV; LU FENG; PETR G.: "A similarity in the 0-acetylation pattern of the Oantigens of Shžgellaflexnerž types la, lb, 2a", CARBOHYDR. RES., vol. 344, 2009, pages 687 - 92
BAINBRIDGE B.; DARVEAU R. P.: "Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide: an Unusual Pattern Recognition Receptor Ligand for the Innate Host Defense System", ACTA. ODONTOL. SCAND., vol. 59, 2001, pages 131 - 8, XP009171723, DOI: doi:10.1080/000163501750266710
BRADFORD M.M.: "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", ANAL. BIOCHEM., vol. 72, 1976, pages 248 - 54, XP025650297, DOI: doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3
BRANDENBURG K.; LINDNER B.; SCHROMM A.; KOCH M.H.J.; BAUER J.; MERKLI A.; ZBAEREN C.; DAVIES J.G.; SEYDEL U.: "Physicochemical characteristics of triacyl lipid A partial structure OM-174 in relation to biological activity", EUR. J. BIOCHEM., vol. 267, 2000, pages 3370 - 7
CASEY L.C.; BALK R.A.; BONE R.C.: "Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome", ANN. INTERN. MED., vol. 119, 1993, pages 771 - 78, XP008026477
DARVEAU R. P.; CUNNINGHAM M.D.; BAILEY T.; SEACHORD C.; RATCLIFFE K.; BAINBRIDGE B.; DIETSCH M.; PAGE R.C.; ARUFFO A.: "Ability of bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion", INFECT. IMMUN., vol. 63, no. 4, April 1995 (1995-04-01), pages 1311 - 7
JOO I.; PUSZTAI Z.; JUHASZ V.P.: "Mouseprotective ability of the international reference preparations of typhoid vaccine", Z. IMMUN. FORSCH. EXP. THER., vol. 135, 1968, pages 365 - 72
KNIREL YU.A.; VALVANO M. A.: "Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction with Host Cells", 2011, SPRINGER WIEN NEW YORK, article "Bacterial Lipopolysaccharides", pages: 440
KONADU E.; SHILOACH J.; BRYLA D.A.; ROBBINS J.B.; SZU S.C: "Synthesis, characterization and immunological properties in mice of conjugates composed of detoxified lipopolysaccharide of Salmonella paratyphi A bound to tetanus toxoid with emphasis on the role of O-acetyls", INFECT. IMMUN., vol. 4, no. 7, 6 July 1996 (1996-07-06), pages 2709 - 15
PAVLIAKOVA D.; MONCRIEF J.S.; LYERLY D.M.; SCHIFFMAN G.; BRYLA D.A.; ROBBINS J.B.; SCHNEERSON R.: "Clostridium difficile recombinant toxin A repeating units as a carrier protein for conjugate vaccines: studies of pneumococcal type 14, Escherichia coli K1 and Shigella flexneri type 2a polysaccharides in mice", INFECT. IMMUN., vol. 68, no. 4, April 2000 (2000-04-01), pages 2161 - 6, XP002144779, DOI: doi:10.1128/IAI.68.4.2161-2166.2000
RIETSCHEL E.T.; KIRIKAE T.; SCHADE F.U.; ULMER A.J.; HOLST O.; BRADE H.; SCHMIDT G.; MAMAT U.; GRIMMECKE H.D.; KUSUMOTO S. ET AL.: "The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity", IMMUNOBIOLOGY, vol. 187, no. 3-5, April 1993 (1993-04-01), pages 169 - 190
SERENY B: "A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines", ACTA MICROBIOL., ACAD.SCI. HUNG., vol. 9, 1962, pages 55 - 60
SIMIN REZANIA ET AL: "EXTRACTION PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF LIPOPOLYSACCHARIDE FROM ESCHERICHIA COLI AND SALMONELLA TYPHI", AVICENNA JOURNAL MED BIOTECH, vol. 3, no. 1, 2011, pages 3 - 9, XP055284863 *
SPIRIN A.S.: "Spectrophotometric determination of the total amount of nucleic acids", BIOCHEMISTRY, vol. 23, no. 4, 1958, pages 656
TAUDORF S.; KRABBE K.S.; BERG R.M.G.; PEDERSEN B.K.; MOLLER K.: "Human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin", CLIN. VACCINE IMMUNOL., vol. 14, no. 3, 2007, pages 250 - 55
WESTPHAL 0.; LUDERITZ O: "Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bakterien", ANGEW. CHEMIE., vol. 66, 1954, pages 407 - 17
WHO TECHNICAL REPORT SERIES, NO.897, 2000

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2614123C1 (ru) * 2015-10-01 2017-03-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России Способ получения комплексного шигеллезного препарата
WO2017129752A1 (en) * 2016-01-28 2017-08-03 De Staat Der Nederlanden, Vert. Door De Minister Van Vws, Ministerie Van Volksgezondheid, Welzijn En Sport Modified tetra-acylated neisserial lps
CN109071586A (zh) * 2016-01-28 2018-12-21 由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国 经修饰的四酰化奈瑟球菌lps
JP2019503423A (ja) * 2016-01-28 2019-02-07 デ スタート デル ネーデルランデン， ヴェルト． ドール デ ミニステル ヴァン ヴイダブリューエス ミニステリー ヴァン ボルクスゲツォントヘイト， ベルジーン エン シュポルトＤｅ Ｓｔａａｔ Ｄｅｒ Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｅｎ， Ｖｅｒｔ． Ｄｏｏｒ Ｄｅ Ｍｉｎｉｓｔｅｒ Ｖａｎ Ｖｗｓ Ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｅ Ｖａｎ Ｖｏｌｋｓｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ， Ｗｅｌｚｉｊｎ Ｅｎ Ｓｐｏｒｔ 改変されたテトラアシル化ナイセリアｌｐｓ
AU2017211975B2 (en) * 2016-01-28 2021-03-25 Intravacc B.V. Modified tetra-acylated neisserial LPS
JP7031933B2 (ja) 2016-01-28 2022-03-08 イントラヴァック ビー．ブイ． 改変されたテトラアシル化ナイセリアｌｐｓ
US11389520B2 (en) 2016-01-28 2022-07-19 Intravacc B.V. Modified tetra-acylated neisserial LPS
CN109071586B (zh) * 2016-01-28 2022-10-28 由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国 经修饰的四酰化奈瑟球菌lps
US10881684B2 (en) * 2016-06-27 2021-01-05 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Army Artificial invaplex formulated with deacylated lipopolysaccharide
EP4149443A4 (en) * 2020-05-11 2024-05-29 Revir, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING VIRUS INFECTIONS

Also Published As

Publication number Publication date
KR102125600B1 (ko) 2020-06-23
EP3006450A1 (en) 2016-04-13
EA201501165A1 (ru) 2016-04-29
EA201501165A8 (ru) 2019-01-31
EP3006450A4 (en) 2017-02-22
EA031879B1 (ru) 2019-03-29
EP3006450B1 (en) 2020-07-29
ES2828373T3 (es) 2021-05-26
KR20160029060A (ko) 2016-03-14
US20160120967A1 (en) 2016-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4460575A (en) Vaccinal complex containing a specific antigen and vaccine containing it
EP2674169B1 (en) Polysaccharide immunogens from Clostridium difficile
US20140378669A1 (en) Methods for conjugation of oligosaccharides or polysaccharides to protein carriers through oxime linkages via 3-deoxy-d-manno-octulsonic acid
Ledov et al. Highly homogenous tri-acylated S-LPS acts as a novel clinically applicable vaccine against Shigella flexneri 2a infection
US20070031447A1 (en) Method of isolating biologically active fraction containing clinically acceptable native S-lipopolysaccharides obtained from bacteria producing endotoxic lipopolysaccharides
WO2014196887A1 (ru) Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
EP1747262B1 (en) Conserved inner core lipopolysaccharide epitopes as multi-species vaccine candidates
US11052142B2 (en) Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants)
ES2686875T3 (es) Exopolisacárido de la bacteria Shigella sonnei, método para producirlo, vacuna y composición farmacéutica que lo contienen
JPH07503238A (ja) コレラ予防用の無毒化ｌｐｓ−コレラ毒素結合ワクチン
US20160136285A1 (en) An isolated immunogenic bacterial antigen and its use in the prevention and treatment of infections caused by gram-negative bacteria
US8951538B2 (en) Exopolysaccharide of Shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and phamaceutical composition containing same
Šourek et al. New trends in the use of Al (OH) 3-conjugated endotoxins and their subunits from the S-and R-forms of Shigella dysenteriae serovar 1 for model vaccination purposes
KR20050021357A (ko) 내독소 리포폴리사카라이드를 생산하는 세균으로 부터얻어지는 임상적으로 허용가능한 천연에스-리포폴리사카라이드를 포함하는 생물학적으로 활성인프랙션을 분리하는 방법
WO2009033269A1 (en) Novel polysaccharide immunogens from alloiococcus otitidis and synthesis of a glycoconjugate vaccine thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13886231

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14895894

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201501165

Country of ref document: EA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20167000036

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013886231

Country of ref document: EP