WO2014182028A1 - 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물 - Google Patents

육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물 Download PDF

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손기철
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Definitions

  • the present invention provides a composition for treating diabetes, including a hypoglycemic agent and Yukmijihwangtang extract.
  • Diabetes mellitus is a metabolic disease, such as insufficient insulin secretion or normal functioning. It is characterized by high blood sugar, which increases the concentration of glucose in the blood, and causes various symptoms and signs due to high blood sugar, and releases glucose from urine. Show symptoms. Diabetes and its complications, along with cancer and renal circulatory disease, are serious diseases worldwide with high mortality rates, according to a report from the American Diabetes Association.
  • Diabetes Patients with diabetes are more likely to develop complications such as eye disease, kidney disease, and heart disease than healthy healthy people. In mild hyperglycemia, it is most often found when hyperglycemia is maintained for a long time and many complications begin in the body because most patients do not feel symptomatic or ambiguous. Diagnosis is often done by blood tests, when blood glucose levels are measured above 126 mg / dL after an 8-hour fast, or when blood glucose is 200 mg / dL or more after 2 hours of an oral glucose load test, or when blood sugar is measured regardless of a meal. Diabetes can also be diagnosed if it is 200 mg / dL or more.
  • Diabetes is divided into insulin dependent diabetes and insulin independent diabetes.
  • Insulin dependent diabetes is called type 1 diabetes and insulin independent diabetes is called type 2 diabetes.
  • Insulin-dependent diabetes mellitus is characterized by severe destruction of the insulin secreting pancreatic beta cells, leading to a decrease in insulin and hyperglycemia.
  • type 1 diabetes insulin treatment is required, and in type 2 diabetes, additional drugs are administered based on lifestyle correction.
  • Eating hypoglycemic agents are largely divided into insulin secretion accelerators and insulin sensitivity improving agents.
  • insulin sensitivity improving agents have little hypoglycemia when taken, and biguanide-based drugs, metformin, are mainly used.
  • metformin biguanide-based drugs
  • metformin when metformin is administered alone, there is a problem of causing side effects such as diabetic liver damage, kidney damage, hyperlipidemia, immunosuppression, and eye damage. Therefore, there is a high demand for a method of administering metformin without high side effects without side effects. There is a situation.
  • Yukjijihwangtang is a typical prescription that is frequently used for kidney disease in Oriental medicine, a complex prescription consisting of a total of six natural products, including Sukjihwang, medicinal herbs, cornus, Bokryeong, Mokpipi, Taxa and the like.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned prior art needs, and an object of the present invention is to provide a composition for treating diabetes using Yumijihwangtang extract.
  • the present invention provides a composition for treating diabetes, including a hypoglycemic agent and Yukjijihwangtang extract.
  • the hypoglycemic agent is characterized in that metformin (metformin).
  • the yukjijihwangtang extract is characterized in that it comprises Sookjihwang, medicinal herbs, cornus, Bokryeong, Mokpipi, and taxa.
  • hypoglycemic agent and the extract of Yumijihwangtang is characterized in that it is formulated by mixing in advance, or formulated separately.
  • hypoglycemic agent and Yukmijihwangtang extract is characterized in that it is administered parenterally, orally, locoregionally, or percutaneously.
  • the yumijihwangtang extract administration is characterized in that it begins between 30 minutes to 4 hours after the administration of the hypoglycemic agent.
  • composition for treating diabetes comprising the extract of Yumijihwangtang provided as an active ingredient in the present invention is administered in combination with a hypoglycemic agent, thereby increasing the efficiency of diabetes treatment and at the same time reducing the side effects of the hypoglycemic agent alone administration.
  • 1 is a view showing the composition of Yumijihwangtang.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Cmax, Tmax, AUC, t1 / 2, and MRTinf for the group treated with metformin alone and the group administered with Yumijihwangtang within 5 minutes after metformin administration.
  • Figure 3 is a view showing the results of observation of the weight change for metformin alone administration group, and Yumijihwangtang only six days after repeated oral administration, and the group administration of Yukmijihwangtang within 5 minutes after the metformin for the remaining 8 days.
  • Figure 4 shows the results of observing the change in the metformin concentration in the blood for the metformin alone administration group, and Yukmijihwangtang only after repeated oral administration for 6 days, and the administration of Yukmijihwangtang within 5 minutes after the metformin for the remaining 8 days to be.
  • Example 5 is a schematic view showing the experimental method and experimental group design of Example 3.
  • 6 is a view showing the results of changes in body weight and weight gain in each group.
  • Figure 7 is a diagram showing the results of anti-diabetic evaluation by the combination of Yumijihwangtang.
  • Figure 8 shows the results of observation of histopathological changes of pancreas, numerical changes of insulin immune-responsive cells and numerical changes of glucagon-immunoreactive cells by co-administration of Yumijihwangtang.
  • Figure 9 is a diagram showing the change in liver weight, AST and ALT change value, histopathological change degree by co-administration of Yumijihwangtang.
  • Figure 10 is a diagram showing the results of observation of histopathological changes of liver by Yumijihwangtang combined administration.
  • FIG. 11 is a view showing the results of observing changes in kidney weight, changes in blood creatinine and BUN content, changes in degenerative glomeruli and tubules in order to confirm the renal protective effect.
  • FIG. 13 is a view showing the results of observing changes in total cholesterol, triglycerides, LDL and HDL in the blood to confirm the anti-hyperlipidemic effect.
  • FIG. 14 is a view showing the results of observing the change in the thymus weight, spleen weight, total thickness of the thyroid cortex and lobule, spleen thickness, the number of white water quality per unit area, the average diameter.
  • 15 is a view showing the results of histopathological changes of the thymus gland.
  • 16 is a view showing the results of histopathological changes of the spleen.
  • Figure 17 shows the cataract visual and quantitative image scores criteria.
  • 18 is a diagram illustrating the results of cataract visual and quantitative image scores according to each group.
  • 19 is a view showing the results of observing the lens and retina, which varies with each group.
  • 20 is a diagram showing the results of observing the change in lipid peroxidation index MDA, GSH content, catalase and SOD activity in kidney tissues to confirm the effect of antioxidant antioxidant protection.
  • the present inventors came to pay attention to herbal medicines to develop a composition that can alleviate various side effects that occur when administering a hypoglycemic agent for the treatment of diabetes mellitus, and can further increase the hypoglycemic effect, and excellent blood sugar for yukmijihwangtang in herbal medicine
  • the present invention was completed by confirming that there is a lowering effect and a side effect reducing effect.
  • an object of the present invention is to provide a composition for treating diabetes, including a hypoglycemic agent and Yumijihwangtang extract:
  • 'yukmijihwangtang extract' used in the present invention means an extract extracted from six medicines.
  • the eight medicinal herbs include six medicinal herbs of Sukji Hwang, Chinese medicine, Cornus, Bokryeong, Bark skin, and Taxa.
  • hypoglycemic agent and the extract of Yukmijihwangtang may be formulated by mixing in advance, or may be formulated separately.
  • the administration period of the yumijihwangtang extract may be performed within 30 minutes to 4 hours after the administration of the hypoglycemic agent, preferably 1 hour to 3 hours, and most preferably 1 hour 30 minutes to 2 hours 30 It may be performed within minutes, and may be administered when 2 hours after administration of the hypoglycemic agent as in the embodiment of the present invention, but is not limited thereto.
  • hypoglycemic agent used in the present invention is characterized in that metformin (metformin), but is not limited thereto.
  • the hypoglycemic agent and the extract of Yukmijihwangtang may be administered parenterally, orally, locoregionally, or transdermally.
  • the yumijihwangtang extract is preferably administered orally, but may be appropriately selected by those skilled in the art according to the condition and weight of the patient, the severity, and the duration of the patient.
  • 'individual' means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, and cow It means a mammal such as.
  • the present invention may provide a composition for treating diabetes, comprising the extract of Yumijihwangtang.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include physiological saline, polyethylene glycol, ethanol, vegetable oil, isopropyl myristate, and the like, but is not limited thereto.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the drug form, the route of administration, and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Preferably, however, it is administered at 0.001 to 300 mg / kg body weight per day, more preferably 0.01 to 200 mg / kg body weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like by various routes.
  • the method of administration is not limited and may be administered, for example, by oral, rectal, or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural, or intra cerbroventricular injection.
  • composition for treating diabetes comprising the extract of Yumijihwangtang of the present invention can increase blood sugar enhancing effect and alleviate various side effects caused by conventionally lowering a blood sugar lowering agent.
  • the absorption and excretion of the hypoglycemic agent according to the co-administration of Yukmijihwang-tang, that is, the effect on pharmacokinetics, and the like are selected, and the concomitant dosing method that does not affect the pharmacokinetics is selected. Evaluate the synergistic effect on the efficacy of the drug.
  • the hypoglycemic agent used in the present example was selected and used Metformin (Wako, Osaka, Japan), Yukmijihwangtang (hereinafter referred to as YMJHT) was purchased from Korea In Farm, and the composition is as shown in FIG.
  • male SD rats (SLC, Japan) were selected and used as experimental animals.
  • Single oral dose of 500mg / kg metformin was administered orally 100mg / kg of yumijihwangtang within 5 minutes, 30 minutes before administration, 30 minutes after administration, 1, 2, 3, 4, 6, 8 and 24 hours after
  • the concentration of metformin in blood was measured, and noncompartmental pharmacokinetics data (Cmax, Tmax, AUC, t1 / 2 and MRT) were calculated and compared with metformin alone.
  • a total of 10 rats were divided into two groups (Metformin 500 mg / kg administration group and Metformin + YMJHT 100 mg / kg administration group).
  • YMJHT 100 mg / kg was dissolved in sterile distilled water and administered once orally at the same dose.
  • sterile distilled water of the same dose was administered orally instead of YMJHT.
  • Tubes treated with 50 IU of heparin (Sigma, MO, USA) were treated with approximately 0.5 ml of whole blood from the orbital venous layer 30 min before drug administration, 30 min after administration, 1, 2, 3, 4, 6, 8 and 24 hours.
  • the sample was collected using and centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes immediately after harvesting to separate plasma.
  • the separated plasma was stored at -70 ° C until LC / MS / MS analysis. Analytical methods for each group are shown in Table 1 below.
  • metformin was detected in the blood from 30 minutes after administration, and continuously up to 24 hours after administration.
  • metformin + yukmijihwang-tang group showed no significant decrease in serum metformin concentration at 2 and 3 hours after administration and an increase in no significant serum metformin concentration at 6, 8 and 24 hours after administration.
  • no significant change in blood metformin concentration was recognized (FIG. 2).
  • Tmax The change in Tmax is shown in Table 2 below. Metformin + Yumijihwangtang-treated group had a Tmax of 0.90 ⁇ 0.22 hr in metformin, indicating a -18.18% insignificant decrease compared to 1.10 ⁇ 0.55 hr in metformin alone.
  • Metformin + Yumijihwangtang-treated group showed 23.24 ⁇ 46.69 ⁇ g / ml of metformin in blood, showing a slight decrease of -9.99% compared to 25.82 ⁇ 3.08 ⁇ g / ml of metformin alone.
  • metformin AUC 0-t and AUC 0-inf were 156.57 ⁇ 27.06 and 200.00 ⁇ 29.04hr ⁇ ⁇ g / ml in the metformin + yukmijihwang-tang group, respectively, and 147.63 ⁇ 24.37 and 177.06 ⁇ 35.17hr ⁇ ⁇ g / ml in the metformin alone group.
  • AUC 0-t and AUC 0-inf showed no significant increase of 6.05 and 12.96%, respectively.
  • metformin + yukmijihwang-tang group the blood t 1/2 of metformin was 9.23 ⁇ 3.23hr, which was 14.36% insignificant increase compared to 10.56 ⁇ 1.73hr in the metformin alone group.
  • the metformin blood MRT inf was 14.44 ⁇ 2.65hr, a 27.25% increase compared to 11.35 ⁇ 5.18hr in the metformin alone group.
  • Example 1 when Yumijihwang-tang was orally administered with metformin within 5 minutes, no significant change in blood concentration and pharmacokinetic parameters of metformin was observed compared to metformin alone. Therefore, it was observed that Yumijihwangtang had no effect on the absorption and excretion of metformin when administered in a single combination within 5 minutes.
  • Example 2 to evaluate the interaction between Yukmijihwangtang and metformin more clearly than Example 1, after 6-day repeated battle of Yukmijihwangtang was evaluated the effect on the pharmacokinetics of metformin, and Yumijihwangtang with metformin and 5 minutes Within 8 days of repeated combination oral administration, the effects of metformin on pharmacokinetics were also assessed using Male SD rats (SLC, Japan).
  • Example 2 100 mg / kg of Yumijihwangtang was administered orally once daily for 6 days, followed by oral administration of 500 mg / kg of metformin for 8 days, 30 minutes before the first and last 8 doses of metformin, 30 minutes after administration, 1 After 2, 3, 4, 6, 8 and 24 hours, blood was collected and the concentration of metformin in blood was measured, and noncompartmental pharmacokinetics data (Cmax, Tmax, AUC, t1 / 2 and MRT) were calculated, respectively, with metformin alone. Comparative analysis.
  • YMJHT Yukmijihwang-tang, purchase from Korea INS Pharm. (Hwasoon, Korea)
  • AUC 0-t The total area under the plasma concentration-time curve from time zero to time measured
  • AUC 0-inf The total area under the plasma concentration-time curve from time zero to time infinity
  • metformin In the metformin alone or metformin + yukmijihwangtang group, metformin was detected in the blood 30 minutes after the first dose of metformin, and detected up to 24 hours after dosing, from 30 minutes before the last 8 doses to 24 hours after Was observed.
  • metformin + Yumijihwangtang-administered group that had been treated with Yumji-Jiangtang and metformin once or repeatedly for 8 days showed an increase in the overall blood metformin concentration compared to the metformin-only group, especially 0.5 to 3 hours after the first dose of metformin.
  • the metformin + Yumijihwangtang administration group showed 30 minutes after administration, 1, 2, 3, 4, 6, 8 and 24 hours after the administration of metformin compared to metformin alone. 56.70, 70.30, 62.93, 51.86, 27.13, 19.44, 26.25 and 21.90%, respectively.
  • Metformin concentrations were -12.14, 23.56, 40.15, 58.33, 41.76, 33.17, 78.15, -4.40 and 16.33%, respectively, compared to metformin alone.
  • metformin + Yumijihwangtang-administered group showed a blood Tmax of 0.90 ⁇ 0.22hr, which is the same as 0.90 ⁇ 0.00hr of metformin alone-administered group.
  • metformin + Yumijihwangtang-administered group had a blood Tmax of 2.38 ⁇ 2.50hr, compared with 3.00 ⁇ 1.00hr of metformin alone. A slight insignificant decrease of% was shown.
  • the metformin + Yumijihwangtang-administered group had a Cmax of 34.80 ⁇ 9.04 ⁇ g / ml and 20.20 ⁇ 3.42 ⁇ g / ml of the metformin alone-administered group.
  • the blood Cmax of metformin was 66.75 ⁇ 30.74 ⁇ g / ml in the metformin + hexamijitan-tang-administered group even after 8 times oral administration of metformin after combating Yumijihwang-tang. , compared with 42.20 ⁇ 10.57 ⁇ g / ml of metformin alone group, 58.18% (p ⁇ 0.05).
  • metformin + Yumijihwangtang-administered group metformin AUC 0-t and AUC 0-inf were 175.50 ⁇ 18.37 and 213.16 ⁇ 32.84hr ⁇ ⁇ g / ml, respectively.
  • metformin + yumijihwangtang-administered group showed a significant decrease of -16.25% in metformin MRT inf of 11.71 ⁇ 2.80hr compared to 13.99 ⁇ 4.80hr of metformin alone.
  • the blood MRT inf of 11.44 ⁇ 6.02hr was 11.44 ⁇ 6.02hr, which was -9.22% compared to 12.61 ⁇ 5.86hr of the metformin alone group. No decrease was shown.
  • Example 2 unlike the results of Example 1, after the first oral administration of metformin after combating Yumijihwangtang, metformin + Yumijihwangtang administration group showed a significant (p ⁇ 0.01 or p) level of metformin concentration in blood compared to metformin alone administration group. ⁇ 0.05) Significant increases were observed from 30 minutes post dose to 3 hours post dose, with significant (p ⁇ 0.05) increases in Cmax (72.28%), AUC 0-t (39.04%) and AUC 0-inf (33.27%).
  • metformin + YMJH the group of metformin + YMYJT was given a significant (p ⁇ 0.05) increase in blood metformin concentration at 30 minutes and 1 hour after administration, which was significant (p ⁇ 0.05). Significance was not recognized with an increase in Cmax (58.18%), but marked increases in AUC 0-t (25.13%) and AUC 0-inf (22.58%), respectively.
  • Example 3 in order to examine the effect of the combination administration of Yumijihwang-tang and metformin on the anti-diabetic effect, streptozotocin (STZ) -induced diabetic rats, a typical Type I diabetic experimental animal model, were evaluated.
  • mice were used as Sprague-Dawley (SD), Slc: SD rats (6 week old female, SLC, Shizuoka, Japan), and the experimental method is briefly shown in FIG. 5 (a), and the experimental group design is shown in FIG. 5 (b). ).
  • STZ was dissolved in 50mM Citrate buffer (pH 6.0) to induce diabetes by a single intraperitoneal administration at a dose of 60 mg / kg / 5ml.
  • citrate buffer was administered by the same route instead of STZ.
  • 400, 200, or 100 mg / kg of Yumijihwangtang was administered in combination with 500 mg / kg of metformin once daily for 28 days, and in each single group, the same dose was administered when Yumijihwangtang or metformin was administered.
  • Only sterile distilled water was administered, and in the medium control group, only sterile distilled water was administered twice at 2 hour intervals, respectively.
  • Hepatoprotective effect changes in liver weight, blood AST and ALT content, histopathological findings of liver-(Liver degeneration rate: ratio of degenerated hepatocytes in hepatic parenchyma mm 2 , liver cells: observed in hepatic parenchyma mm 2 Number of liver cells).
  • Kidney protection renal weight, changes in blood BUN and creatinine, histopathologic findings of the kidneys-degeneration tubules and glomeruli
  • antihyperlipidemic effect changes in blood triglyceride, total cholesterol, LDL, HDL content
  • Eye protection effect cataract gross and image quantitative evaluation, ocular histopathological change-ocular lens injury score, retinal thickness, thickness of retinal plexus layer and nucleus layer, numerical changes of blood vessels in the retina
  • Blood glucose was measured after 21 days of STZ administration and 28 days after the end of candidate drug administration to clarify the incidence of diabetes and diabetic complications, and the difference was calculated.
  • the weight was measured and then the ratio of body weight, i.e. relative weight, was calculated respectively.
  • the weight gain during the diabetic induction period was -86.18% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin
  • the 500 mg / kg combination group showed 45.45, 12.99, 35.06, 9.09, 45.45 and 45.45% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the weight gain during 28 days of administration was -125.32% in the STZ control group compared to the normal media control group, metformin 500mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg combination group showed 193.31, 209.97, 202.28, 370.23 and 375.36% change compared to STZ control group, respectively.
  • the amount of change was also significantly decreased in all the administration groups compared to the STZ control group, and especially in the group of Yumijihwang-tang 200 and 400 mg / kg and metformin, the blood glucose level after the end of the administration (p ⁇ 0.01 or p ⁇ 0.05) was significantly higher than that of the metformin alone group. And a decrease in the amount of blood glucose change during the administration period was observed (FIG. 7 (a)).
  • the blood glucose levels after 21 days of STZ administration were changed by 216.05% in the STZ control group, compared with the normal medium control group, metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg
  • the / kg combination group showed changes of 1.68, -0.34, -1.30, -0.04 and 0.08%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the change in blood glucose levels after 21 days from STZ administration of 28 days of candidate substance showed 2581.25% change in STZ control group compared to normal media control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, 100 Yumijihwangtang , 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg combination group showed -59.39, -39.39, -60.47, -83.40 and -99.86% change compared to STZ control group, respectively.
  • pancreatic absolute weight showed -9.92% change in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg Concomitant groups showed 7.95, -2.49, 7.21, 9.65 and 12.07% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the relative weight of the pancreas relative to the weight of the last sacrifice day was 78.77% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400 mg / kg alone, Yumijihwangtang 100, 200 and 400 mg /
  • the combination of kg and metformin 500 mg / kg showed changes of -7.49, -13.34, -8.21, -18.10 and -14.70% compared to the STZ control group, respectively.
  • pancreatic islets per unit area was -75.57% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg /
  • the kg combination group showed 120.93, 93.02, 100.00, 172.09 and 253.49% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • pancreatic islets The mean diameter of pancreatic islets was -74.49% in the STZ control group compared to the normal media control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg
  • the / kg combination group showed a change of 97.80, 92.73, 101.55, 168.70 and 212.28%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the number of insulin-responsive cells in pancreatic islet was -94.63% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg And metformin 500mg / kg combination group showed 202.99, 158.58, 175.00, 320.52 and 541.12% change compared to STZ control group, respectively.
  • the number of glucagon-immunoreactive cells in pancreatic islets was significantly increased compared to the normal medium control group, and the number of (mm 2 ) glucagon-immunoreactive cells per unit area was significantly increased (p ⁇ 0.01) compared to the normal medium control group. All the groups showed significant decreases in the number of (p ⁇ 0.01) glucagon-immunoreactive cells compared to the STZ control group, especially in the Yumijihwangtang 200 and 400 mg / kg and metformin combination groups, respectively (p ⁇ 0.01). 0.01) A decrease in the number of glucagon immune response cells per unit area was observed (Fig. 7 (c), Fig. 8).
  • the number of glucagon-immunoreactive cells in the pancreatic islet was 425.52% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg
  • the metformin 500 mg / kg combination group showed changes of -27.78, -25.42, -27.95, -49.20 and -59.21% compared to the STZ control group, respectively.
  • Absolute weight of liver showed 39.44% change in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and 400mg / kg Yumijihwangtang alone administration group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -14.38, -13.09, -13.35, -14.67 and -19.32% change compared to the STZ control group, respectively.
  • Liver relative weight was 178.56% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and 400mg / kg Yumijihwangtang alone administration group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and 500mg / kg metformin combination
  • the administration group showed -27.69, -23.57, -26.88, -37.07 and -39.40% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the blood AST content of the STZ control group was 984.69% higher than that of the normal media control group, and metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed changes of -32.82, -49.11, -39.47, -55.83 and -72.05% compared to the STZ control group, respectively.
  • the blood ALT content of the STZ control group showed a change of 1024.30% compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -32.72, -48.32, -37.57, -58.71 and -71.49% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • Hepatic degeneration rate was decreased, and the number of hepatocytes (mm2) per unit area (mm ⁇ 2) increased significantly in the group of Yumji Hwangtang 200 and 400 mg / kg and metformin alone (p ⁇ 0.01 or p ⁇ 0.05), respectively. (FIG. 9, FIG. 10).
  • the liver degeneration rate was 1254.52% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone administration group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg were used together.
  • the administration group showed -29.61, -39.62, -41.08, -57.33 and -74.07% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the average number of hepatocytes per unit area was -65.89% in the STZ control group compared to the normal media control group, and metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin
  • the 500 mg / kg concomitant group showed 60.58, 72.73, 79.34, 108.20 and 125.24% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the absolute weight of kidney showed 68.13% change in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and 400g / kg Yumijihwangtang alone administration group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and 500mg / kg metformin combination.
  • the administration group showed -21.29, -15.59, -19.32, -22.70 and -30.65% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • Relative weight of the STZ control group showed 233.64% change compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -32.41, -25.10, -30.97, -42.54 and -47.48% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the blood BUN content of the STZ control group was 395.51% higher than that of the normal medium control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -31.69, -34.80, -34.28, -54.85 and -71.93% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the serum creatinine content of the STZ control group was 177.36% higher than that of the normal media control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -31.29, -35.37, -39.46, -46.26 and -55.78% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the STZ control group showed renal degeneration characterized by significant capillary dilated glomerular atrophy and tubular phobia compared to the normal medium control group, resulting in a significant (p ⁇ 0.01) increase in the number of degeneration glomeruli and tubules compared to the normal medium control group.
  • significant decreases in the number of (p ⁇ 0.01) degenerative glomeruli and tubules were observed, respectively, compared with the STZ control group.
  • (p ⁇ 0.01) Decreased numbers of degenerative glomeruli and tubules (FIG. 11, FIG. 12).
  • the number of denatured glomeruli was 3656.25% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the combined administration group showed -36.94, -33.11, -37.10, -68.72 and -84.86% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the number of denatured tubules showed a change of 1119.61% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the combination group showed changes of -29.90, -33.12, -29.42, -64.95 and -76.85% compared to the STZ control group, respectively.
  • the total cholesterol content in the blood was changed to 219.96% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg.
  • the combined administration group showed -30.57, -29.82, -34.29, -41.96 and -53.29% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the triglyceride content in blood was 1986.40% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -29.72, -38.81, -37.65, -58.69 and -73.91% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the blood LDL content of the STZ control group was 206.52% higher than that of the normal medium control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone administration group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -29.08, -29.79, -29.08, -39.72, and -46.10% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the blood HDL content was -63.95% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the combination group showed 27.12, 38.42, 31.64, 61.58 and 73.45% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the thymus gland weight showed -87.02% change in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg Concomitant group showed 73.03, 71.99, 95.85, 204.36 and 292.53% change compared to STZ control group, respectively.
  • the thymus gland weight was -74.77% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg Concomitant groups showed changes of 50.71, 54.74, 71.34, 128.44 and 202.85%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the absolute weight of the spleen was -65.19% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the combination group showed 31.35, 39.59, 35.61, 77.26, and 83.89% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the relative weight of the spleen was -31.01% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone administration group, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg Concomitant groups showed changes of 12.17, 23.77, 16.43, 32.29 and 39.79%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the total thickness of thymus lobules was -73.92% in the STZ control group compared to the normal media control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg /
  • the kg combination group showed changes of 78.00, 76.79, 91.26, 161.12 and 200.76%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the thyroid cortex thickness was -86.28% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg Concomitant administration groups showed changes of 198.88, 211.98, 208.55, 340.10 and 468.63%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the STZ control showed atrophic changes due to the reduction of splenic white water lymphocytes compared to the normal media control, showing a significant (p ⁇ 0.01) decrease in spleen thickness, number of (100 mm 2 ) white water quality per unit area, and mean diameter, but not all Significant (p ⁇ 0.01) spleen thickness, number of white medulla per unit area, and average diameter increase were observed in the administration group compared to STZ control group, especially metformin alone administration group in Yumijihwangtang 200 and 400mg / kg and metformin combination group, respectively.
  • the significant (p ⁇ 0.01) spleen thickness the number of white water quality per unit area and the increase in the average diameter in comparison (Fig. 14 (c), Fig. 16).
  • the total thickness of the spleen was -48.50% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the combination group showed 36.43, 39.29, 36.67, 58.01 and 67.40% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the number of (100mm 2 ) white water quality per unit area was -71.18% in the STZ control group compared to the normal media control group, metformin 500mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone administration group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg
  • the combination of / kg and metformin 500mg / kg showed changes of 76.53, 77.55, 78.57, 132.65 and 159.18% compared to the STZ control group, respectively.
  • the mean diameter of the white medulla was -71.96% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg
  • the / kg combination group showed changes of 101.18, 106.90, 101.75, 179.71 and 238.87% compared to the STZ control group, respectively.
  • the histopathological atrophy was recognized in the STZ control group with significant reduction of thymus and spleen weight, but STZ-induced immunosuppression was significantly suppressed by all candidates alone or in combination at 2 hour intervals.
  • the combination of Yumijihwang-tang 400 and 200mg / kg group was significantly increased (p ⁇ 0.01 or p ⁇ 0.05) immune activity effect compared to metformin alone group, respectively. This result is judged to be a direct evidence that the combined effect of yumji huangtang on the effect of metformin on diabetic immunosuppression is markedly increased.
  • Cataract gross scores showed a change of 800.00% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500 mg / kg and yumijihwangtang 400 mg / kg alone, Yumijihwangtang 100, 200 and 400 mg /
  • the combination of kg and metformin 500 mg / kg showed changes of -38.89, -30.56, -33.33, -58.33 and -66.67% compared to the STZ control group, respectively.
  • Cataract quantitative image scores were 553.91% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the combination group showed -40.56, -34.60, -37.61, -55.13 and -64.25% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the lens damage score was 950.00% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and Yukmijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the administration group showed -33.33, -38.10, -47.62, -61.90 and -71.43% changes compared to the STZ control group, respectively.
  • the thickness of the lens injuries was 253.66% in the STZ control group compared to the normal media control group, and metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg /
  • the kg combination group showed changes of -46.34, -44.95, -51.69, -64.34 and -71.62% compared to the STZ control group, respectively.
  • the total thickness of the retina was -54.17% in the STZ control group compared to the normal medium control group, and metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg
  • the combination group showed 33.45, 30.69, 33.87, 56.12 and 74.15% change compared to the STZ control group, respectively.
  • the frozen layer thickness in the retina was -56.07% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg
  • the / kg combination group showed changes of 32.03, 31.87, 34.48, 67.42 and 106.97%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the thickness of the nuclear retinal layer in the retina was -57.66% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg
  • the / kg combination group showed changes of 44.29, 54.06, 49.21, 77.16 and 104.14%, respectively, compared to the STZ control group.
  • the number of blood vessels present in the inner boundary membrane was 741.67% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg And metformin 500mg / kg combination group showed -44.55, -41.58, -43.56, -59.41 and -70.30% change compared to STZ control group, respectively.
  • the MDA content which is an indicator of lipid peroxidation in renal tissue, was changed 151.18% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and yumijihwangtang 400mg / kg alone group, yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg And metformin 500mg / kg combination group showed -32.56, -32.89, -36.16, -43.58 and -51.38% change compared with STZ control group, respectively.
  • GSH content an endogenous antioxidant in kidney tissue, was -73.41% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone group, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg And metformin 500mg / kg combination group showed 64.65, 70.70, 68.15, 101.59 and 125.80% change compared to STZ control group, respectively.
  • catalase an antioxidant defense enzyme in renal tissue
  • the activity of catalase, an antioxidant defense enzyme in renal tissue was -60.27% in the STZ control group compared to the normal medium control group, metformin 500mg / kg and Yumijihwangtang 400mg / kg alone, Yumijihwangtang 100, 200 and 400mg / kg and metformin 500mg / kg combination group showed 48.59, 47.38, 51.84, 71.36 and 91.80% change compared to STZ control group, respectively.
  • the combination of Yumijihwangtang 200 or 400 mg / kg 2 hour intervals significantly increases the effective effects of metformin on diabetic and diabetic liver damage, kidney damage, hyperlipidemia, immunosuppression and eye damage through the activity of antioxidant defense system. It became.
  • the concomitant administration of Yumijihwangtang of 200 mg / kg or more at 2 hour intervals significantly increases the hypoglycemic effect of metformin and prevents various diabetic complications by activating the antioxidant defense system without affecting the bioavailability of metformin. It was judged to reduce, it was confirmed that the composition for treating diabetes, including the hypoglycemic agent of the present invention and Yukmijihwangtang extract has an excellent effect in the treatment of diabetes.

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Abstract

본 발명은 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈당강하제를 개체에 투여하고, 상기 개체에 육미지황탕 추출물을 투여하여, 혈당강하제의 혈당강하 효과를 현저히 증가시키는 동시에, 다양한 당뇨병성 합병증인 당뇨 및 당뇨병성 간손상, 신장손상, 고지혈증 면역 억제 및 안구손상 등을 예방 및 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

Description

육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물
본 발명은 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나, 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러증상 및 징후를 일으키고, 소변에서 포도당을 배출하는 증상등을 보인다. 당뇨병 및 그의 합병증은 암, 신장순환기 질환과 더불어 전세계적으로 높은 사망률을 나타내는 심각한 질환으로, 미국의 당뇨병 협회의 보고에 따르면, 현재에도 당뇨병 사망률은 지속적으로 증가하고 있다고 한다.
건강한 정상인에 비해 당뇨병에 걸린 환자는 안질환, 신장질환, 심장질환 등의 합병증에 걸릴 가능성이 높아지게 된다. 약한 고혈당에서는 대부분의 환자들이 증상을 느끼지 못하거나 모호하여 당뇨병이라고 생각하기 어렵기 때문에, 고혈당 상태가 오랜 기간 유지되며 신체에서 여러 합병증이 발생하기 시작할 때 발견되는 것이 대부분이다. 진단은 혈액검사를 통해 이루어지는 경우가 많고, 8시간 금식 후에 혈당을 측정할때 126mg/dL 이상이거나, 경구 당부하 검사 2시간 후 혈당이 200mg/dL 이상인 경우, 또는 식사와 무관하게 측정한 혈당이 200mg/dL 이상일 경우에도 당뇨병으로 진단할 수 있다.
현재 인슐린 치료에 의해 당뇨병의 급성증상 또는 치명적인 증상이 경감하고 있으나, 장기간에 걸쳐 나타나는 증상에 대해서는 뚜렷한 효과를 나타내지 못하고 있다. 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병과 인슐린 비의존형 당뇨병으로 구분된다. 인슐린 의존형 당뇨병은 제1형 당뇨병으로 불리며 인슐린 비의존형 당뇨병은 제2형 당뇨병으로 불린다. 인슐린 의존형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장의 베타 세포가 심하게 파괴되어 인슐린의 감소 및 hyperglycemia로 되는 특징을 가지고 있다.
제1형 당뇨병의 경우에는 인슐린 치료가 필요하고, 제2형 당뇨병의 경우 생활습관 교정을 기본으로 하여 추가로 약물을 투여한다. 먹는 혈당강하제는 크게 인슐린 분비 촉진제와 인슐린 감수성 개선제로 나뉘는데, 그 중 인슐린 감수성 개선제는 복용시 저혈당이 거의 없는 것이 특징이며, biguanide 계열 약물인 메트포르민(metformin)이 주로 사용되고 있다. 다만, metformin을 단독 투여할 경우, 당뇨병성 간손상, 신장손상, 고지혈증, 면역억제, 안구 손상 등의 부작용을 일으키는 문제가 있어, 약효가 뛰어난 metformin을 부작용 없이 투약할 수 있는 방법에 대한 요구가 높아지고 있는 실정이다.
한편, 육미지황탕은 한의학에서 신장 질환에 빈번히 사용되고 있는 대표적인 처방으로, 총 6종의 천연물로 구성된 복합처방으로, 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 택사 등이 포함된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 육미지황탕 추출물를 이용하여 당뇨병 치료용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 혈당강하제는 메트포르민(metformin)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 육미지황탕 추출물은 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 및 택사를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예로, 상기 육미지황탕 추출물 투여는 상기 혈당강하제 투여 후 30분 내지 4시간 사이에 시작되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공하는 육미지황탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물은, 혈당강하제와 병용 투여되는 것으로, 당뇨병 치료의 효율을 높이는 동시에 혈당강하제의 단독 투여시의 부작용을 경감시키는 효과가 있다.
도 1은 육미지황탕의 조성을 나타낸 도면이다.
도 2는 메트포르민 단독 투여군과, 메트포르민 투여 후 육미지황탕을 5분 이내에 투여한 군에 대하여 Cmax, Tmax, AUC, t1/2, 및 MRTinf 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 메트포르민 단독 투여군과, 육미지황탕만을 6일 동안 반복 경구 투여한 뒤, 나머지 8일 동안 메트포르민을 투여 후 5분 이내에 육미지황탕을 투여한 군에 대한 체중 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 메트포르민 단독 투여군과, 육미지황탕만을 6일 동안 반복 경구 투여한 뒤, 나머지 8일 동안 메트포르민을 투여 후 5분 이내에 육미지황탕을 투여한 군에 대한 혈중 metformin 농도 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 3의 실험 방법 및 실험군 디자인을 나타낸 모식도이다.
도 6은 각 군에 따른 체중 및 증체량의 변화의 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 육미지황탕 병용투여에 의한 항당뇨 평가 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 육미지황탕 병용투여에 의한 췌장의 조직병리학적 변화, 인슐린 면역반응 세포의 수적 변화 및 글루카곤 면역반응 세포의 수적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 육미지황탕 병용투여에 의한 간중량의 변화와 AST 및 ALT 변화값, 조직병리학적 변화 정도를 나타낸 도면이다.
도 10은 육미지황탕 병용 투여에 의한 간의 조직병리학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 신장 보호 효과를 확인하기 위해, 신장 중량의 변화, 혈중 creatinine 및 BUN 함량의 변화, 변성 사구체 및 세뇨관의 수적변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 신장의 조직병리학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 항고지혈증 효과를 확인하기 위해서, 혈중 총 cholesterol, triglyceride, LDL 및 HDL의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 면역활성 효과를 확인하기 위해, 가슴샘 중량, 비장 중량, 가슴샘 피질 및 소엽 전체 두께, 비장 두께, 단위면적당 백색 수질의 수, 평균 직경의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 가슴샘의 조직병리학적 변화를 살펴본 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 비장의 조직병리학적 변화를 살펴본 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 백내장 육안 및 quantitative image scores 기준을 나타낸 도면이다.
도 18은 각 군에 따른 백내장 육안 및 quantitative image scores 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 각 군에 따라 달라지는 수정체 및 망막을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 신장 항산화 방어 효과를 확인하기 위해, 신장 조직내 지질과산화 지표인 MDA의 변화, GSH 함량의 변화, catalase 및 SOD 활성을 관찰하여 나타낸 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 당뇨병의 치료를 위해 혈당강하제를 투여할 경우 나타나는 여러가지 부작용들을 완화시킬 수 있으면서도, 혈당 강하 효과를 보다 증가시킬 수 있는 조성물을 개발하고자, 한약재에 주목하게 되었고, 한약재 중 육미지황탕에 뛰어난 혈당 강하 효과와 부작용 경감 효과가 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다:
본 발명에서 쓰는 용어 ‘육미지황탕 추출물’은 6개의 약재로부터 추출한 추출물을 의미하는 것이다. 상기 8개의 약재는 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 및 택사의 6개의 약재를 포함하는 것이다.
본 발명의 일구현예로, 상기 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 될 수 있다.
상기 육미지황탕 추출물의 투여 기간은 상기 혈당강하제의 투여 후 30분 내지 4시간 이내에 수행될 수 있고, 바람직하게는 1시간 내지 3시간 이내에 수행되어야 하며, 가장 바람직하게는 1시간 30분 내지 2시간 30분 이내에 수행될 수 있고, 본 발명의 실시예와 같이 혈당강하제의 투여 후 2시간이 지났을 때 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 혈당강하제는 메트포르민(metformin)인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 혈당강하제 및 육미지황탕 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 상기 육미지황탕 추출물은 경구 투여되는 것이 바람직하나, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 및 기간등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에서 ‘개체’ 란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유동물을 의미한다.
또한, 본 발명은 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 300 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/체중kg으로 투여한다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물은 혈당 강화 효과를 증대시킬 수 있는 동시에, 기존에 혈당강하제를 단독투여하였을 경우에 야기되었던 여러 가지 부작용들을 완화시킬 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 실시예에서는 육미지황탕의 병용 투여에 따른 혈당강하제의 흡수 및 배설, 즉 약동력학에 미치는 영향 등을 확인하고, 약동력학에 영향을 미치지 않는 병용 투여방법을 선택하여, 육미지황탕의 병용이 혈당강하제의 약효에 미치는 상승 효과를 평가 한다. 육미지황탕의 병용 투여에 따른 혈당강하제의 약동력학에 미치는 영향을 평가하기 위해, 육미지황탕의 혈당강하제 투여 후 5분 이내 단회 경구 병용투여(실시예 1), 육미지황탕 6일 반복 경구 전투여 및 5분 이내 8일 반복 병용 경구투여(실시예 2), 및 2시간 간격의 병용투여(실시예 3) 실험을 통해 확인하였다. 육미지황탕의 병용이 혈당강하제의 약효에 미치는 영향을 streptozotocin 투여로 유발된 Type I 당뇨병 랫트를 이용하여 확인하였다.
본 실시예에서 사용하는 혈당강하제는 Metformin(Wako, Osaka, Japan)을 선택하여 사용하였으며, 육미지황탕(이하 YMJHT으로 표기)은 한국인스팜으로부터 구매하여 사용하였으며, 조성은 도 1과 같다.
실시예 1. Metformin의 약물동력 (pharmacokinetics)에 미치는 육미지황탕의 영향 평가: 5분 이내 단회 경구 병용투여
1.1. 실험 동물 준비
본 실시예에서는 실험 동물로 Male SD 랫트 (SLC, Japan)를 선택하여 사용하였다. metformin 500mg/kg을 단회 경구 투여한 다음 5분 이내에 육미지황탕 100mg/kg을 단회 경구투여하고, 투여 전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간 후 채혈하여, 혈중 metformin의 농도를 측정하고, noncompartmental pharmacokinetics data (Cmax, Tmax, AUC, t1/2및 MRT)를 산출하여, metformin 단독 투여군과 비교 분석하였다. 총 10마리의 쥐를 대상으로 2개의 군(Metformin 500mg/kg 단독 투여군 및 Metformin+YMJHT 100mg/kg 투여군)으로 나누어 실험하였다.
1.2. 투여 및 체혈방법
500mg/kg의 metformin을 멸균 증류수에 용해 시켜, 5ml/kg으로 단회 경구 투여하였으며, metformin 투여 5분 이내에 YMJHT 100mg/kg을 멸균 증류수에 용해시켜, 동일한 용량으로 단회 경구 투여하였다. 한편 metformin 단독 투여군에서는 YMJHT 대신 동일한 용량의 멸균 증류수만 단회 경구투여하였다 .
약물 투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간에 안와 정맥층으로부터 약 0.5ml의 전혈을 50IU의 heparin (Sigma, MO, USA)이 처리된 tube를 이용하여 채취하였고, 채취 직후 13,000rpm에 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장은 -70℃에 LC/MS/MS 분석 전까지 보관하였다. 각 군에 대한 분석 방법은 하기 표 1과 같다.
표 1
Metformin 혈중 농도 분석 분리한 plasma에서 Carbamazepine (Sigma, MO, USA)을 internal standard로 사용하여, LC/MS/MS 방법으로 각각 측정함Chromatographic 분석은 Agilent 1100 Series HPLC (Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하였으며, column effluent는 API 2000 triple-quadruple mass-spectometric detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석함
HPLC 조건 Column : Shiseido CAPCELL PAKTMC18MG-II (2.0×150mm,5um) (Shiseido,Tokyo,Japan)Column Oven: not usedMobile phase : 40% distilled water (10mM NH4OAC, 0.1% formic acid) / 60% acetonitrileFlow rate : 0.20ml/minInjection Volume: 2.0μl
LC/MS/MS Ion source: Turbo Ion Spray (375℃)Polarity: PositiveThe multiple reaction monitoring (MRM): Carbamazepine (IS): m/z 237>194 (Retention time: 2.5 min), metformin: 130>71 (Retention time: 1.3 min)Standard Curve: Analyst 1.4.1, Linear (1/x2,noIterate)
1.3. 결과확인
투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간 후의 혈중 metformin 농도 (μg/ml), 및 약물동력학적 지표인 Cmax, Tmax, AUC, t1/2 및 MRT (noncompartmental pharmacokinetics data analyzer program; PK solutions 2.0; Summit, CO, USA)를 살펴보았다. Cmax, Tmax, AUC, t1/2, 및 MRTinf의 변화는 도 2에 정리하여 나타내었다.
1.3.1. 혈중 metformin 농도 관찰
Metformin 또는 metformin + 육미지황탕 투여군에서는 각각 투여 30분 후부터 혈중에서 metformin 이 검출되기 시작하여, 투여후 24시간까지 지속적으로 검출되었다. 또한 metformin 단독 투여군과 비교하여 metformin + 육미지황탕 투여군에서는 투여 후 2시간 및 3시간에 인정된 유의성 없는 혈중 metformin 농도 감소와 투여 후 6, 8 및 24시간 후 인정된 유의성 없는 혈중 metformin 농도의 증가가 인정되었으나, 유의성 있는 혈중 metformin 농도의 변화는 인정되지 않았다 (도 2).
Metformin + 육미지황탕 투여군에서는 투여 후 30분, 투여 후 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간의 혈중 metformin 농도가 metformin 단독 투여군에 비해 각각 -9.24, -6.96, -20.68, -19.27, -11.45, 21.00, 29.48 및 44.69%의 변화를 나타내었다.
1.3.2. Tmax의 변화
Tmax의 변화 값을 하기 표 2에 나타내었다. Metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin 의 혈중 Tmax가 0.90 ±0.22hr로 관찰되어, metformin 단독 투여군의 1.10±0.55hr에 비해 -18.18%의 유의성 없는 경미한 감소를 나타내었다
1.3.3. Cmax의 변화
Metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin 의 혈중 Cmax가 23.24± 46.69μg/ml로, metformin 단독 투여군의 25.82±3.08μg/ml에 비해 -9.99%의 유의성 없는 경미한 감소를 나타내었다
1.3.4. AUC의 변화
Metformin + 육미지황탕 투여군에서는 혈중 metformin AUC0-t 및 AUC0-inf 가 각각 156.57±27.06 및 200.00±29.04hr·μg/ml로, metformin 단독 투여군의 147.63±24.37 및 177.06±35.17hr·μg/ml에 비해 AUC0-t 및 AUC0-inf 가 각각 6.05 및 12.96%의 유의성 없는 증가를 나타내었다
1.3.5. t 1/2 의 변화
Metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin의 혈중 t1/2가 9.23±3.23hr 로, metformin 단독 투여군의 10.56±1.73hr에 비해 14.36%의 유의성 없는 증가를 나타내었다.
1.3.6. MRTinf의 변화
Metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin의 혈중 MRTinf가 14.44±2.65hr 로, metformin 단독 투여군의 11.35±5.18hr에 비해 27.25%의 유의성 없는 증가를 나타내었다 .
상기 실시예 1에서 육미지황탕을 metformin과 5분이내에 단회 병용 경구투여한 결과, metformin 단독 투여군에 비해 유의성 있는 metformin의 혈중 농도 및 pharmacokinetic parameter의 변화는 관찰되지 않았다. 따라서 육미지황탕은 5분이내 단회 병용투여시 metformin의 흡수 및 배설에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
실시예 2. Metformin의 약물동력(pharmacokinetics)에 미치는 육미지황탕의 영향 평가: 육미지황탕 6일 반복 경구 투여 후, 5분 이내 8일 반복 병용(육미지황탕+메트포르민) 경구투여
본 실시예 2에서는 실시예 1보다 명확한 육미지황탕과 메트포르민의 상호작용을 평가하기 위해 육미지황탕을 6일간 반복 전투여한 다음 metformin의 약물동력에 미치는 영향을 평가하였으며, 이와 함께 육미지황탕을 metformin과 5분 이내 8일간 반복 병용 경구투여하고, metformin의 약물동력에 미치는 영향 역시 Male SD 랫트 (SLC, Japan)를 이용하여 평가하였다. 본 실시예 2에서는 육미지황탕 100mg/kg을 매일 1회씩 6일간 반복 경구 투여한 다음, metformin 500mg/kg을 8일간 경구투여하고, metformin 초회 및 마지막 8회 투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간 후 채혈하여, 혈중 metformin의 농도를 측정하고, noncompartmental pharmacokinetics data (Cmax, Tmax, AUC, t1/2 및 MRT)를 산출하여, metformin 단독 투여군과 각각 비교 분석하였다.
2.1. 투여 및 체혈방법
100mg/kg의 육미지황탕을 멸균 증류수에 용해 시켜, 5ml/kg의 용량으로 매일 1회씩 14일간 반복 경구 투여하였으며, 육미지황탕 투여시작 6일 후부터 500mg/kg의 metformin (Wako, Osaka, Japan)을 멸균 증류수에 용해 시켜, 5ml/kg의 용량으로 매일 1회씩 8일간 반복 경구 투여하였다. 육미지황탕 전 투여 후 병용 투여군에서는 metformin 투여 후 5분 이내에 육미지황탕 100mg/kg 경구 투여하였고, metformin 단독 투여군에서는 육미지황탕 전 투여기간 및 병용 투여기간 동안 육미지황탕 대신 동일한 용량의 멸균 증류수만을 투여하였다.
Metformin 초회 및 마지막 8회 투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간에 각각 안와 정맥층으로부터 약 0.5ml의 전혈을 50IU의 heparin (Sigma, MO, USA)이 처리된 tube를 이용하여 채취하였고, 채취 직후 13,000rpm에 10분간 원심분리하여, 혈장을 분리하였다. 분리한 혈장은 -70℃ 에 LC-MS/MS 분석 전까지 보관하였다. 각 군에 대한 분석 방법은 상기 표 1과 같다.
2.2. 결과확인
Metformin 초회 및 마지막 8회 투여전 30분, 투여 후 30분, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간 후의 혈중 metformin 농도 (μg/ml), 및 약물동력학적 지표인 Cmax, Tmax, AUC, t1/2 및 MRT (noncompartmental pharmacokinetics data analyzer program; PK solutions 2.0; Summit, CO, USA)를 살펴보았다. Cmax, Tmax, AUC, t1/2, 및 MRTinf의 변화는 하기 표 2(초회 투여 후) 및 표 3(8회 투여 후)에 정리하여 나타내었다.
표 2
Parameters Metformin (500mg/kg)
Without YMJHT co-administration (Distill water) With YMJHT co-administration (100mg/kg)
Tmax (hrs) 0.900.22 0.900.22
Cmax (g/ml) 20.203.42 34.809.04*
AUC0-t(hrg/ml) 126.2224.71 175.5018.37*
AUC0-inf(hrg/ml) 159.9426.47 213.1632.84*
t1/2(hr) 10.723.37 9.971.28
MRTinf(hr) 13.994.80 11.712.80
Values are expressed as mean ± SD of five rats
표 3
Parameters Metformin (500mg/kg)
Without YMJHT co-administration (Distill water) With YMJHT co-administration (100mg/kg)
Tmax (hrs) 3.001.00 2.382.50
Cmax (g/ml) 42.2010.57 66.7530.74*
AUC0-t(hrg/ml) 425.14225.60 531.99181.63
AUC0-inf(hrg/ml) 499.36211.07 612.11155.90
t1/2(hr) 9.634.95 8.594.09
MRTinf(hr) 12.615.86 11.446.02
Values are expressed as mean ± SD of five rats except for YMJHT + metformin repeated treated rats, in which one rat was died after 7th metformin treatment, unfortunately by bad gastric gavages
YMJHT = Yukmijihwang-tang, purchase from Korea INS Pharm. (Hwasoon, Korea)
Cmax: The peak plasma concentration
Tmax: Time to reach Cmax
AUC0-t: The total area under the plasma concentration-time curve from time zero to time measured
AUC0-inf: The total area under the plasma concentration-time curve from time zero to time infinity
t1/2: half life
MRTinf: mean residence to time infinity
* p<0.05 as compared with metformin single treated rats by MW test
2.2.1. 체중의 변화
Metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin 단독 투여군과 비교하여, 의미 있는 체중 및 증체량의 변화는 실험 전기간 동안 인정되지 않았다(도 3).
2.2.2. 혈중 metformin 농도 관찰
Metformin 단독 또는 metformin + 육미지황탕 투여군에서 metformin 초회 투여 후 각각 투여 30분 후부터 혈중에서 metformin이 검출되기 시작하여, 투여후 24시간까지 검출되었고, 마지막 8회 투여 후 투여전 30분부터 투여후 24시간까지 관찰되었다. 또한 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 단회 및 8일 반복 경구투여한 metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin 단독 투여군과 비교하여, 전반적인 혈중 metformin 농도의 증가를 나타내었으며, 특히 metformin 초회 투여 후 0.5 ~ 3시간에 걸쳐 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 metformin의 함량이 증가가 관찰되었고, 마지막 8회 투여 후에도 0.5 및 1시간에서 각각 유의성 있는 (p<0.05) 혈중 metformin 농도의 증가가 인정되었다 (도 4).
육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 초회 경구투여 후, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 투여 후 30분, 투여 후 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간의 혈중 metformin 농도가 metformin 단독 투여군에 비해 각각 56.70, 70.30, 62.93, 51.86, 27.13, 19.44, 26.25 및 21.90%의 변화를 나타내었다.
육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 8회 반복 병용 경구투여 후, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 투여 전 30분, 투여 후 30분, 투여 후 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간의 혈중 metformin 농도가 metformin 단독 투여군에 비해 각각 -12.14, 23.56, 40.15, 58.33, 41.76, 33.17, 78.15, -4.40 및 16.33%의 변화를 나타내었다.
2.2.3. Tmax의 변화
표 2 및 표 3과 같이, 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 초회 경구투여 후, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin의 혈중 Tmax가 0.90±0.22hr로 관찰되어, metformin 단독 투여군의 0.90±0.00hr와 동일하게 관찰되었으며, 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 8회 반복 병용 경구투여 후는, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin의 혈중 Tmax가 2.38±2.50hr로, metformin 단독 투여군의 3.00±1.00hr에 비해 -20.83%의 경미한 유의성 없는 감소를 나타내었다.
2.2.4. Cmax의 변화
표 2 및 표 3과 같이,육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 초회 경구투여 후, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin의 혈중 Cmax가 34.80±9.04μg/ml로, metformin 단독 투여군의 20.20±3.42μg/ml 에 비해 72.28%의 유의성 있는 (p<0.05) 증가를 나타내었으며, 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 8회 반복 병용 경구투여 후에도 metformin + 육미지황탕 투여군에서 metformin의 혈중 Cmax가 66.75±30.74μg/ml로, metformin 단독 투여군의 42.20±10.57μg/ml에 비해 58.18%의 유의성 있는 (p<0.05) 증가를 나타내었다.
2.2.5. AUC의 변화
육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 초회 경구투여 후, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 혈중 metformin AUC0-t 및 AUC0-inf가 각각 175.50±18.37 및 213.16±32.84hr·μg/ml로, metformin 단독 투여군의 126.22±24.71 및 159.94±26.47hr·μg/ml 에 비해 각각 39.04 및 33.27%의 유의성 있는 (p<0.05) 증가를 나타내었으며, 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 8회 반복 병용 경구투여 후에도, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 혈중 metformin 의 AUC0-t 및 AUC0-inf 가 각각 531.99±181.63 및 612.11±155.90hr·μg/ml 로 관찰되어, metformin 단독 투여군의 425.14±225.60 및 499.36±211.07hr·μg/ml 에 비해 각각 25.13 및 22.58%의 유의성 없는 증가를 나타내었다(표 2 및 표 3).
2.2.6. t 1/2 의 변화
육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 초회 경구투여 후, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin의 혈중 t1/2가 9.97±1.28hr 로, metformin 단독 투여군의 10.72±3.37hr에 비해 -6.95%의 유의성 없는 경미한 감소를 나타내었으며, 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 8회 반복 병용 경구투여 후에도 metformin + 육미지황탕 투여군에서 metformin의 혈중 t1/2가 8.59±4.09hr 로, metformin 단독 투여군의 9.63±4.95hr에 비해 -10.75%의 유의성 없는 감소를 나타내었다 (표 2 및 표 3).
2.2.7. MRT inf 의 변화
육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 초회 경구투여 후, metformin + 육미지황탕 투여군에서는 metformin의 혈중 MRTinf가 11.71±2.80hr 로, metformin 단독 투여군의 13.99±4.80hr에 비해 -16.25%의 유의성 없는 감소를 나타내었으며, 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 8회 반복 병용 경구투여 후에도 metformin + 육미지황탕 투여군에서 metformin의 혈중 MRTinf가 11.44±6.02hr 로, metformin 단독 투여군의 12.61±5.86hr에 비해 -9.22%의 의미 없는 감소를 나타내었다.
본 실시예 2의 결과, 실시예 1의 결과와 달리, 육미지황탕을 전투여한 다음 metformin을 초회 경구투여 후, metformin+육미지황탕 투여군에서는 metformin단독 투여군에 비해 혈중 metformin 농도의 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 현저한 증가가 투여 30분 후부터 투여 후 3시간까지 인정되어, 유의성 있는 (p<0.05) Cmax (72.28%), AUC0-t(39.04%) 및 AUC0-inf (33.27%)의 증가가 각각 인정되었고, 8회 반복 투여 후에도 metformin+육미지황탕 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 혈중 metformin농도의 증가를 투여 후 30분 및 1시간에 나타내어, 유의성 있는 (p<0.05) Cmax (58.18%)의 증가와 함께 유의성은 인정되지 않았으나, 현저한 AUC0-t (25.13%) 및 AUC0-inf (22.58%)의 증가를 각각 나타내었다.
따라서 육미지황탕의 반복 전투여 및 5분 이내의 육미지황탕과 metformin의 반복 병용 투여는 metformin의 흡수를 현저히 증가시켜, 경구 생체이용율의 증가를 초래하는 것으로 관찰되었으므로, 당뇨의 효과적인 치료 방법을 제공하기 위해서는, metformin의 경구투여 Tmax 이상, 즉 2시간 정도의 간격으로 병용 투여한 다음 metformin의 약물동력학에 미치는 영향을 평가해야 할 것으로 판단된다.
실시예 3. 육미지황탕과 metformin의 병용투여실험: 육미지황탕이 Streptozotocin (STZ) 유발 Type I 당뇨병 랫트에서 metformin의 효과에 미치는 영향
실시예 1과 실시예 2의 결과를 종합할 때, 5분 이내 육미지황탕과 metformin을 단회 경구 병용 투여시, 육미지황탕은 metformin의 흡수와 배설 즉, 경구 생체이용률에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었고, 육미지황탕 반복 전 투여 및 metformin과 5분 이내 반복 경구투여 시 현저한 metformin의 흡수 증가에 따른 생체 이용률의 증가가 각각 인정되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 실시예 3에서는 육미지황탕 및 metformin의 병용투여가 항당뇨 효과에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 대표적인 Type I 당뇨병 실험동물 모델인 streptozotocin (STZ) 유발 당뇨병 랫트를 이용하여 평가하였다. 실험 동물은 Sprague-Dawley (SD), Slc:SD rats (6 주령 암컷, SLC, Shizuoka, Japan)으로 사용하였고, 실험 방법을 도 5(a)에 간략히 도시하였으며, 실험 군 디자인을 도 5(b)에 나타내었다.
105마리의 SD 랫트를 입수하여, STZ 투여 21일 후 체중 (125 ~ 180g) 및 혈당 (257 ~ 358 mg/dl)이 일정한 랫트만 선정하여, 군 당 8마리씩 본 실험에 사용하였으며, 별도의 8마리의 정상 매체 대조군 (체중: 200 ~ 262g; 혈당: 88 ~ 100mg/dl) 역시 준비하였다.
STZ를 50mM Citrate buffer (pH 6.0)에 용해시켜, 60mg/kg/5ml의 용량으로 단회 복강투여 하여 당뇨병을 유발하였으며, 정상 매체 대조군에서는 STZ 대신 동일용량의 citrate buffer만 동일한 경로로 투여하였다. STZ 투여 22일후부터, 400, 200 또는 100mg/kg의 육미지황탕을 metformin 500 mg/kg과 2시간 간격으로 매일 1회씩 28일간 각각 병용 투여하였으며, 각 단독 투여군에서는 육미지황탕 또는 metformin 투여시 동일 용량의 멸균증류수만 투여하였고, 매체 대조군에서는 매체인 멸균증류수만 각각 2시간 간격으로 2회 투여하였다.
관찰 항목
항당뇨, 간 및 신장 보호, 항고지혈증, 면역활성 및 안구 보호 효과로 구분하여 관찰.
(1) 체중의 변화: 당뇨 유발기간 및 28일간의 후보물질 투여기간 동안의 증체량
(2) 항당뇨 효과: 혈당의 변화, 췌장 조직의 형태학적 변화 - 췌장섬의 수 및 직경의 변화, insulin 및 glucagon 면역반응세포의 수적변화
(3) 간 보호 효과: 간 중량, 혈중 AST 및 ALT 함량의 변화, 간의 조직병리학적 소견 - (간 변성율: 간 실질 mm2에서 변성 간세포가 차지하는 비율, 간 세포 수: 간 실질 mm2에서 관찰되는 간세포의 수).
(4) 신장 보호 효과: 신장 중량, 혈중 BUN 및 creatinine의 변화, 신장의 조직병리학적 소견 - 변성 세뇨관 및 사구체 수
(5) 항고지혈증 효과: 혈중 triglyceride, 총 cholesterol, LDL, HDL 함량의 변화
(6) 면역활성 효과: 가슴샘 및 비장 중량과 조직병리학적 소견 - 비장 두께, 백색수질의 수 및 직경 변화, 가슴샘 소엽 두께 및 피질 두께의 변화
(7) 안구 보호 효과: 백내장 육안 및 image 정량평가, 안구 조직병리학적 변화 - 안구 수정체손상 score, 망막 두께, 망막 속얼기층 및 속핵층의 두께, 망막에 존재하는 혈관의 수적 변화
(8) 신장의 항산화방어 시스템의 변화: 신장 지질과산화 (lipid peroxidation, nM of malondialdehyde (MDA)/g protein), 내인성 항산화제 - glutathione (GSH) 함량 (nM/g protein), 항산화 효소 - catalase 및 superoxide dismutase (SOD) 활성의 변화 (U/mg protein)
혈당은 당뇨 및 당뇨 합병증 유발 정도를 명확히 하기 위해, STZ 투여 21일 후와 28일 간의 후보물질 투여 종료 후 각각 측정하여, 그 차이를 산출하였으며, 장기 중량 역시 체중에 따른 차이를 최소화하기 위하여, 절대 중량을 측정한 다음 체중에 대한 비율 즉, 상대 중량을 각각 산출하였다
3.1. 체중 및 증체량의 변화
STZ 투여 21일후 매체 대조군에 비해 체중 감소가 일정한 실험동물만 선별하여 사용하였으므로, STZ 대조군에서는 STZ 투여 21일후부터 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중의 감소가 관찰되기 시작하였으며, 3주간의 유발 및 28일간의 투여기간 동안의 증체량 역시 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 각각 나타내었다. 한편 metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군과 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 투여 시작 7 또는 21일 후부터 인정되기 시작하였고, 투여기간 동안의 증체량 역시 모든 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 각각 나타내었다. 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 체중의 증가가 투여 시작 21일부터 인정되기 시작하였으며, metformin 500mg/kg 투여군에 비해 투여기간 동안의 증체량 역시 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 각각 나타내었다(도 6).
당뇨병 유발기간 동안의 증체량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -86.18%의 변화를 나타내었고, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 45.45, 12.99, 35.06, 9.09, 45.45 및 45.45%의 변화를 나타내었다.
28일간의 실험물질 투여기간 동안의 증체량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -125.32%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 193.31, 209.97, 202.28, 370.23 및 375.36%의 변화를 나타내었다.
본 결과를 살펴볼때, STZ 투여후 현저한 체중의 감소가 인정되었으나, STZ 투여에 의한 체중의 감소가 모든 metformin 및 육미지황탕의 투여에 의해 현저히 억제되었으며, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 2시간 간격의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중 및 증체량의 증가가 인정되었다. 이러한 결과는 육미지황탕의 병용 투여에 의해 metformin의 항당뇨 및 당뇨병성 합병증에 대한 효과가 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
3.2. 항당뇨 효과
3.2.1. 혈당의 변화
STZ 투여 21일 후, 모든 STZ 투여군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈당의 증가가 인정되었으며, STZ 대조군에서는 투여 28일 후에도 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내어, 투여 28일 동안의 혈당 변화량 역시 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었다. 한편 metformin 및 육미지황탕 단독 투여군과 모든 세용량의 육미지황탕과 metformin 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈당의 감소가 투여 종료 후 인정되었으며, 투여기간 동안의 혈당의 변화량 역시 모든 투여군에서 STZ 대조군에 비해 현저한 감소가 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 투여 종료 후 혈당 및 투여기간 동안의 혈당 변화량의 감소가 인정되었다(도 7(a)).
STZ 투여 21일 후의 혈당은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 216.05%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 1.68, -0.34, -1.30, -0.04 및 0.08%의 변화를 나타내었다.
28일의 후보물질 투여 후 혈당은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 442.93%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -27.25, -18.84, -29.33, -39.53 및 -47.26%의 변화를 나타내었다.
STZ 투여 21일 후부터 28일의 후보물질 투여 후 혈당의 변화량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 2581.25%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -59.39, -39.39, -60.47, -83.40 및 -99.86%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 볼 때, STZ 투여 21일 후 및 약물 투여 28일 후 최종 부검시 모든 STZ 투여 랫트에서 현저한 혈당의 증가가 인정되었으나, STZ 투여에 의한 혈당의 증가가 모든 metformin 및 육미지황탕의 투여에 의해 현저히 억제되었으며, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈당의 감소가 인정되었다. 이러한 결과를 통해 육미지황탕의 병용 투여에 의해 metformin의 혈당 강하 효과가 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
3.2.2. 췌장 중량의 변화
육미지황탕 단독 투여군에 국한된 유의성 있는 (p<0.05) 감소를 제외하고, 모든 STZ 처리군에서 정상 매체 대조군에서 비해 의미 있는 췌장 절대 중량의 변화는 인정되지 않았으나, 정상 매체 대조군에 비해 체중 감소에 따른 이차적인 췌장 상대 중량의 유의성 있는 (p<0.01) 증가가 모든 STZ 유발 당뇨병군에서 각각 인정되었다. 한편 육미지황탕 단독 처리군, 육미지황탕 200및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 췌장 상대 중량의 감소가 각각 인정되었으나, 모든 육미지황탕 및 metformin 병용 투여군에서는 metformin 500mg/kg 단독 투여군에 비해 유의성 있는 췌장 중량의 변화는 인정되지 않았다 (도 7(b)).
췌장 절대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -9.92%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 7.95, -2.49, 7.21, 9.65 및 12.07%의 변화를 나타내었다.
최종 희생일의 체중에 대한 췌장 상대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 78.77%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -7.49, -13.34, -8.21, -18.10 및 -14.70%의 변화를 나타내었다.
3.2.3. 췌장의 조직병리학적 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 췌장섬의 위축과 함께 수적 감소를 나타내어, 췌장 실질 100mm2당 췌장섬의 수가 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었으며, 평균 췌장섬의 직경 역시 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. 한편 모든 metformin 및 육미지황탕 단독 투여군, metformin과 육미지황탕 병용 투여군에서는
STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 췌장섬 수 및 평균 직경의 증가를 각각 나타내었으며, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 췌장섬 수 및 평균 직경의 증가가 인정되었다 (도 7(c)).
단위 면적당 췌장섬의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -75.57%를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 120.93, 93.02, 100.00, 172.09 및 253.49%의 변화를 나타내었다.
췌장섬의 평균 직경은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -74.49%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 97.80, 92.73, 101.55, 168.70 및 212.28%의 변화를 나타내었다.
3.2.4. Insulin 면역반응세포의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 췌장섬내 insulin 면역반응세포의 현저한 수적 감소를 나타내어, 단위 면적당 (mm2) insulin 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었으나, 모든 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) insulin 면역반응세포의 수적 증가를 각각 나타내었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 단위 면적당 insulin 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었다 (도 7(c), 도 8).
췌장섬내 insulin 면역반응세포의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -94.63%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 202.99, 158.58, 175.00, 320.52 및 541.12%의 변화를 나타내었다.
3.2.5. Glucagon 면역반응세포의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 췌장섬내 glucagon 면역반응세포의 현저한 수적 증가를 나타내어, 단위 면적당 (mm2) glucagon 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었으나, 모든 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) glucagon 면역반응세포의 수적 감소를 각각 나타내었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 단위 면적당 glucagon 면역반응세포의 수적 감소가 인정되었다 (도 7(c), 도 8).
췌장섬내 glucagon 면역반응세포의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 425.52%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -27.78, -25.42, -27.95, -49.20 및 -59.21%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 살펴볼 때, 췌장섬의 수적 감소와 함께 평균 직경의 감소 즉, 위축소견이 STZ 대조군에서 인정되었고, 췌장섬내 insulin 면역반응세포의 수적 감소와 함께 glucagon 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었으나, 모든 metformin 또는 육미지황탕 투여에 의해 이러한 췌장의 형태학적 변화, insulin 및 glucagon 면역반응세포의 수적 변화가 현저히 억제되었으며, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 췌장 섬의 수 및 직경, 췌장섬내 insulin 면역반응세포의 수적 증가와 함께 glucagon 면역반응세포의 수적 감소가 각각 인정되었다. 이러한 결과는 육미지황탕의 병용 투여에 의해 metformin의 항당뇨 효과, 특히 췌장섬에서 insulin 생산세포에 대한 보호 효과가 현저히 증가되는 직접적인 증거로 판단된다.
3.3. 간 보호 효과
3.3.1. 간 중량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었으나, 모든 약물 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 절대 및 상대 중량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 상대 중량의 감소가 인정되었다(도 9).
간 절대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 39.44%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -14.38, -13.09, -13.35, -14.67 및 -19.32%의 변화를 나타내었다.
간 상대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 178.56%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -27.69, -23.57, -26.88, -37.07 및 -39.40%의 변화를 나타내었다.
3.3.2. 혈중 AST함량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가가 인정되었으나, 모든 metformin 또는 육미지황탕 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 AST 및 ALT 함량의 감소가 인정되었다(도 9).
혈중 AST 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 984.69%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -32.82, -49.11, -39.47, -55.83 및 -72.05%의 변화를 나타내었다.
혈중 ALT 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 1024.30%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -32.72, -48.32, -37.57, -58.71 및 -71.49%의 변화를 나타내었다.
3.3.3. 간의 조직병리학적 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 간 세포 위축 및 괴사를 특징으로하는 손상이 관찰되어, 간 변성율의 유의성 있는 (p<0.01) 증가 및 단위면적당 (mm2) 간세포 수의 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 각각 나타내었다. 한편 모든 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 간 변성율의 감소와 단위면적당 간세포 수의 증가가 각각 인정되었고, 특히 모든 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 변성율의 감소를 나타내었으며, 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 단위면적당 (mm2) 간세포 수의 증가를 나타내었다 (도 9, 도 10).
간 변성율은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 1254.52%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -29.61, -39.62, -41.08, -57.33 및 -74.07%의 변화를 나타내었다.
단위 면적당 평균 간세포의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -65.89%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 60.58, 72.73, 79.34, 108.20 및 125.24%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 볼 때, 모든 STZ 투여군에서는 현저한 간 중량, 혈중 AST 및 ALT 함량의 증가와 함께 현저한 간세포의 변성과 이와 관련된 단위 면적당 간세포의 수적 감소가 인정되었으나, 모든 후보 물질 투여에 의해 STZ 유발 간 변성 소견이 현저히 억제되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 간 보호효과의 증가가 인정되었다. 이러한 결과는 육미지황탕의 병용 투여에 의해 metformin의 간 보호 효과가 현저히 증가되는 직접적인 증거로 판단된다.
3.4. 신장 보호 효과
3.4.1. 신장 중량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 신장 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었으나, 모든 약물 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 신장 중량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 400 mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 신장 절대 및 상대 중량의 감소가 인정되었으며, 육미지황탕 200mg/kg과 metformin 병용 투여군에서도 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.05) 신장 상대 중량의 감소가, 유의성 없는 신장 절대 중량의 감소와 함께 인정되었다 (도 11).
신장 절대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 68.13%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -21.29, -15.59, -19.32, -22.70 및 -30.65%의 변화를 나타내었다.
신장 상대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 233.64%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -32.41, -25.10, -30.97, -42.54 및 -47.48%의 변화를 나타내었다.
3.4.2. 혈중 creatinine 및 BUN 함량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 creatinine 및 BUN 함량의 증가가 인정되었으나, 모든 metformin 또는 육미지황탕 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 creatinine 및 BUN 함량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 creatinine 및 BUN 함량의 감소가 인정되었다 (도 11).
혈중 BUN 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 395.51%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -31.69, -34.80, -34.28, -54.85 및 -71.93%의 변화를 나타내었다.
혈중 creatinine 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 177.36%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -31.29, -35.37, -39.46, -46.26 및 -55.78%의 변화를 나타내었다.
3.4.3. 신장의 조직병리학적 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 모세혈관 확장성 사구체 위축과 세뇨관의 공포화를 특징으로 하는 신장 변성을 나타내어, 변성 사구체 및 세뇨관의 수가 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었으나, 모든 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 변성 사구체 및 세뇨관의 수의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 변성 사구체 및 세뇨관의 수적 감소를 나타내었다 (도 11, 도 12).
변성 사구체의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 3656.25%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -36.94, -33.11, -37.10, -68.72 및 -84.86%의 변화를 나타내었다.
변성 세뇨관의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 1119.61%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -29.90, -33.12, -29.42, -64.95 및 -76.85%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 볼 때, STZ 대조군에서는 신장 중량, 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가와 함께 모세혈관 확장성 사구체 위축과 공포 변성 세뇨관의 수적 증가가 인정되었으나, 모든 metformin 또는 육미지황탕 투여에 의해 STZ 유발 신장 변성 소견이 현저히 억제되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 신장 보호효과의 증가가 인정되었다. 이러한 결과는 육미지황탕의 병용 투여에 의해 metformin의 신장 보호 효과가 현저히 증가되는 직접적인 증거로 판단된다.
3.5. 항고지혈증 효과
3.5.1. 혈중 총 cholesterol 및 triglyceride 함량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 총 cholesterol 및 triglyceride 함량의 증가가 인정되었으나, 모든 metformin 또는 육미지황탕 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 총 cholesterol 및 triglyceride 함량의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 총 cholesterol 및 triglyceride 함량의 감소가 인정되었다 (도 13).
혈중 총 cholesterol 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 219.96%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -30.57, -29.82, -34.29, -41.96 및 -53.29%의 변화를 나타내었다.
혈중 triglyceride 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 1986.40%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -29.72, -38.81, -37.65, -58.69 및 -73.91%의 변화를 나타내었다.
3.5.2. 혈중 총 LDL 및 HDL 함량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 LDL 함량의 증가와 HDL 함량의 감소가 각각 인정되었으나, 모든 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 LDL 함량의 감소와 HDL 함량의 증가가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 LDL 함량의 감소와 HDL 함량의 증가가 인정되었으며, 육미지황탕 200mg/kg과 metformin 병용 투여군에서도 metformin 단독 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 혈중 HDL 함량의 증가가 유의성은 인정되지 않았으나, 현저한 LDL 함량의 감소와 함께 인정되었다 (도 13).
혈중 LDL 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 206.52%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -29.08, -29.79, -29.08, -39.72 및 -46.10%의 변화를 나타내었다.
혈중 HDL 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -63.95%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 27.12, 38.42, 31.64, 61.58 및 73.45%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 볼 때, STZ 대조군에서는 현저한 혈중 triglyceride, total cholesterol 및 LDL 함량의 증가와 함께 혈중 HDL 함량의 감소가 인정되었으나, 모든 metformin 또는 육미지황탕 투여에 의해 STZ 유발 고지혈증 소견이 현저히 억제되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 혈중 triglyceride, total cholesterol 및 LDL 함량의 감소와 함께 혈중 HDL 함량의 증가가 인정되었다. 이러한 결과는 육미지황탕의 병용 투여에 의해 metformin의 당뇨병성 고지혈증에 대한 효과가 현저히 증가되는 직접적인 증거로 판단된다.
3.6. 면역활성 효과
3.6.1. 가슴샘 중량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 가슴샘 절대 및 상대 중량의 감소가 인정되었으나, 모든 metformin 및 육미지황탕 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 가슴샘 중량의 증가가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 가슴샘의 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었다 (도 14(a)).
가슴샘 절대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -87.02%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 73.03, 71.99, 95.85, 204.36 및 292.53%의 변화를 나타내었다.
가슴샘 상대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -74.77%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 50.71, 54.74, 71.34, 128.44 및 202.85%의 변화를 나타내었다.
3.6.2. 비장 중량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 절대 및 상대 중량의 감소가 인정되었으나, 모든 metformin 및 육미지황탕 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 현저한 비장 상대 및 절대 중량의 증가가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 비장 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었다 (도 14(a)).
비장 절대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -65.19%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 31.35, 39.59, 35.61, 77.26 및 83.89%의 변화를 나타내었다.
비장 상대 중량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -31.01%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 12.17, 23.77, 16.43, 32.29 및 39.79%의 변화를 나타내었다.
3.6.3. 가슴샘의 조직병리학적 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 가슴샘 위축에 의한, 가슴샘 피질 및 소엽 전체 두께의 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었으나, 모든 metformin 및 육미지황탕 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 가슴샘 피질 및 소엽 전체 두께의 증가가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 가슴샘 피질 및 소엽 전체 두께의 증가를 나타내었다 (도 14(b), 도 15).
가슴샘 소엽 전체 두께는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -73.92%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 78.00, 76.79, 91.26, 161.12 및 200.76%의 변화를 나타내었다.
가슴샘 피질 두께는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -86.28%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 198.88, 211.98, 208.55, 340.10 및 468.63%의 변화를 나타내었다.
3.6.4. 비장의 조직병리학적 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 비장 백색 수질 임파구 감소에 의한 위축 변화를 나타내어, 비장 두께, 단위 면적당 (100mm2) 백색 수질의 수 및 평균 직경의 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었으나, 모든 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 두께, 단위 면적당 백색 수질의 수 및 평균 직경의 증가가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 비장 두께, 단위 면적당 백색 수질의 수 및 평균 직경의 증가를 나타내었다 (도 14(c), 도 16).
비장 전체 두께는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -48.50%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 36.43, 39.29, 36.67, 58.01 및 67.40%의 변화를 나타내었다.
단위 면적당 (100mm2) 백색 수질의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -71.18%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 76.53, 77.55, 78.57, 132.65 및 159.18%의 변화를 나타내었다.
백색수질의 평균 직경은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -71.96%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 101.18, 106.90, 101.75, 179.71 및 238.87%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 종합해 볼 때, STZ 대조군에서는 현저한 가슴샘 및 비장 중량의 감소와 함께, 조직병리학적 위축이 인정되었으나, 모든 후보물질 단독 또는 2시간 간격의 병용 투여에 의해 STZ 유발 면역억제 소견이 현저히 억제되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 면역활성 효과의 증가가 각각 인정되었다. 이러한 결과는 육미지황탕의 병용 투여에 의해 metformin의 당뇨병성 면역억제에 대한 효과가 현저히 증가되는 직접적인 증거로 판단된다.
3.7. 안구보호 효과
3.7.1. 백내장 score의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 백내장 육안 및 quantitative image scores의 증가가 인정되었으나, 모든 metformin 및 육미지황탕 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 백내장 육안 및 quantitative image scores의 감소가 각각 인정되었고(도 17(a)), 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 백내장 육안 및 quantitative image scores의 감소를 나타내었다 (도 18(a), 도 19).
백내장 육안 scores(도 17(b))는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 800.00%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -38.89, -30.56, -33.33, -58.33 및 -66.67%의 변화를 나타내었다.
백내장 quantitative image scores는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 553.91%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -40.56, -34.60, -37.61, -55.13 및 -64.25%의 변화를 나타내었다.
3.7.2. 수정체의 조직병리학적 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 수정체 섬유의 불균질화에 의한 eosinophilic 변성 부위의 증가가 인정되어, 수정체의 조직학적 손상 score 및 변성 부위의 두께의 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 각각 나타내었으나, 모든 후보물질 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 수정체의 조직학적 손상 score 및 변성 부위의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 수정체의 조직학적 손상 score 및 변성 부위의 두께의 감소를 나타내었다 (도 18(b), 도 19).
수정체 손상 score 는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 950.00%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -33.33, -38.10, -47.62, -61.90 및 -71.43%의 변화를 나타내었다.
수정체 손상부위의 두께는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 253.66%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -46.34, -44.95, -51.69, -64.34 및 -71.62%의 변화를 나타내었다.
3.7.3. 망막의 조직병리학적 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 현저한 망막 구성 세포 감소에 의한 망막 전체 두께, 속얼기층 및 속핵층의 두께의 유의성 있는 (p<0.01) 감소가 인정되었으며, 망막에 존재하는 혈관의 유의성 있는 (p<0.01) 수적 증가가 인정되었다. 한편 모든 metformin 및 육미지황탕 투여군에서는 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 망막 전체 두께, 속얼기층 및 속핵층의 두께의 증가가 인정되었으며, 망막에 존재하는 혈관의 유의성 있는 (p<0.01) 수적 감소 역시 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 망막 전체 두께, 속얼기층 및 속핵층의 두께의 증가와 망막내 혈관의 수적 감소를 나타내었다 (도 18(c), 도 19).
망막 전체 두께는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -54.17%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 33.45, 30.69, 33.87, 56.12 및 74.15%의 변화를 나타내었다.
망막 속 얼기층 두께는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -56.07%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 32.03, 31.87, 34.48, 67.42 및 106.97%의 변화를 나타내었다.
망막 속 핵층의 두께는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -57.66%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 44.29, 54.06, 49.21, 77.16 및 104.14%의 변화를 나타내었다.
속경계막 내에 존재하는 혈관의 수는 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 741.67%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -44.55, -41.58, -43.56, -59.41 및 -70.30%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 볼 때, 백내장 및 수정체 손상의 증가와 함께 망막 두께, 망막의 속얼기층 및 속핵층의 두께의 감소, 속 한계막의 혈관 증식 등 전형적인 당뇨병성 안구 손상이 STZ 대조군에서 인정되었으나, 모든 metformin 및 육미지황탕 단독 또는 2시간 간격의 병용 투여에 의해 STZ 유발 안구손상이 현저히 억제되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 안구 보호 효과의 증가가 각각 인정되었다. 따라서 육미지황탕의 2시간 간격 병용 투여는 metformin의 당뇨병성 안구손상에 대한 효과를 현저히 증가시키는 것으로 판단된다.
3.8. 신장 항산화 방어 시스템의 변화
3.8.1. 신장 지질과산화의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 신장 지질 과산화, MDA 함량의 증가가 인정되었으나, 모든 metformin 또는 육미지황탕 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 신장 지질과산화의 감소가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 신장 지질과산화의 감소가 인정되었다 (도 20).
신장 조직내 지질과산화 지표인 MDA 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 151.18%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 -32.56, -32.89, -36.16, -43.58 및 -51.38%의 변화를 나타내었다.
3.8.2. 신장 내인성 항산화제 GSH 함량의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 신장 조직내 GSH 함량의 감소가 인정되었으나, 모든 약물 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) GSH 함량의 증가가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.05) 신장 조직내 GSH 함량의 증가가 인정되었다 (도 20).
신장 조직내 내인성 항산화제인 GSH 함량은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -73.41%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 64.65, 70.70, 68.15, 101.59 및 125.80%의 변화를 나타내었다.
3.8.3. 신장 조직내 catalase 및 SOD 활성의 변화
STZ 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 신장 조직내 항산화 방어 효소인 catalase 및 SOD 활성의 감소가 각각 인정되었으나, 모든 후보 물질 투여군에서 STZ 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) catalase 및 SOD 활성의 증가가 각각 인정되었고, 특히 육미지황탕 200 및 400mg/kg과 metformin 병용 투여군에서는 각각 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 신장 조직내 catalase 및 SOD 활성의 증가가 인정되었다 (도 20).
신장 조직내 항산화 방어 효소인 catalase의 활성은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -60.27%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 48.59, 47.38, 51.84, 71.36 및 91.80%의 변화를 나타내었다.
신장 조직내 항산화 방어 효소인 SOD의 활성은 STZ 대조군의 경우, 정상 매체 대조군에 비해 -55.92%의 변화를 나타내었으며, metformin 500mg/kg 및 육미지황탕 400mg/kg 단독 투여군, 육미지황탕 100, 200 및 400mg/kg과 metformin 500mg/kg 병용 투여군에서는 각각 STZ 대조군에 비해 51.47, 55.08, 58.96, 86.90 및 97.86%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 볼때, STZ 투여에 의해, 지질 과산화에 의해 신장 조직내 MDA 함량의 증가와 GSH 함량의 감소가 SOD 및 CAT 활성의 감소와 함께 초래되었다. 한편 이러한 MDA 함량의 증가와 GSH 함량의 감소, SOD 및 CAT 활성의 감소가 모든 metformin 및 육미지황탕 단독 또는 2시간 간격의 병용 투여에 의해 현저히 억제되었고, 특히 육미지황탕 400 및 200mg/kg의 병용 투여군에서는 metformin 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 항산화 효과의 증가가 각각 인정되었다. 따라서 육미지황탕 200m 또는 400mg/kg의 2시간 간격 병용 투여는 metformin의 항산화 효과를 현저히 증가시키는 것으로 판단된다.
따라서, 육미지황탕 200 또는 400mg/kg의 2시간 간격 병용투여는 metformin 의 당뇨 및 당뇨병성 간손상, 신장손상, 고지혈증, 면역억제 및 안구손상에 대한 유효한 효과를 항산화 방어시스템의 활성을 통해 현저히 증가시키는 것으로 되었다. 즉, 200mg/kg 이상의 육미지황탕의 2시간 간격의 병용 투여는 metformin의 생체 이용률에 영향을 미치지 않으면서, 항산화 방어 시스템의 활성에 의해, metformin의 혈당강하 효과를 현저히 증가시키고, 다양한 당뇨병성 합병증을 감소시키는 것으로 판단되어, 본 발명의 혈당강하제와 육미지황탕 추출물을 포함하는 당뇨 치료용 조성물이 당뇨 치료에 있어 우수한 효과를 가진다는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (5)

  1. 메트포르민(metformin) 및 육미지황탕 추출물을 모두 포함하는 당뇨병 치료용 복합 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 육미지황탕 추출물은 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피, 및 택사를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 메트포르민 및 육미지황탕 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 메트포르민 및 육미지황탕 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 육미지황탕 추출물 투여는 상기 메트포르민의 투여 후 30분 내지 4시간 사이에 시작되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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