WO2014169882A2

WO2014169882A2 - 具有抗肿瘤活性的苯并咪唑类化合物、制备方法及其应用

Info

Publication number: WO2014169882A2
Application number: PCT/CN2014/079859
Authority: WO
Inventors: 郎恒元; 余科; 赵荟
Original assignee: 复旦大学
Priority date: 2013-04-20
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2014-10-23
Also published as: CN103214456B; CN103214456A; WO2014169882A3

Abstract

本发明公开了式(Ⅰ)所示具有抗肿瘤活性的苯并咪唑类化合物、制备方法及其应用。其中，R¹，R²，R³，R⁴，R⁵如说明书所述，本发明的化合物及其可药用盐对与Hh信号通路持续激活相关肿瘤的癌细胞生长的抑制作用与GDC‐0449相当甚至优于GDC‐0449，从而为相关肿瘤的治疗提供新的选择。

Description

具有抗肿瘤活性的苯并咪唑类化合物、制备方法及其应用技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说是一种具有抗肿瘤活性的苯并咪唑类化合物、制备方法及其应用。

背景技术

Hedgehog基因是在 1980s早期由 Wieschaus和 Nusslein-Vollhard在果蝇中首次发现。 Hedgehog(Hh) 信号通路主要由分泌型糖蛋白配体 Hedgehog、跨膜蛋白受体 Ptched( Ptch) 、跨膜蛋白 Smoothened( Smo) 、核转录因子 Gli蛋白及下游靶基因组成。正常体内，组织 Hh 配体表达关闭， Ptch与 Smo结合抑制 Smo的活性，该通路处于关闭状态。当 Hh与 Ptch结合，解除了 Ptch对 Smo的抑制作用， Smo将信号传导至细胞质内，激活下游 Gli转录因子进而活化整个信号通路。

近年来， Hh信号通路与肿瘤的关系日益受到人们的重视。有文献表明，在正常条件下， Hedgehog ( Hh ) 信号通路在胚胎时期调控组织细胞的生长和分化。胚胎发育成熟后，该通路进入关闭状态。另有多项研究表明， Hh信号通路的异常激活与多种肿瘤密切相关，如皮肤基底细胞癌、髓母细胞瘤、肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌、胰腺癌等。因此，阻断肿瘤细胞中的 Hh信号通路将是人类治疗肿瘤的一个新的有效手段。随着研究的进行， Hh信号通路在肿瘤发生、发展过程中的作用也越来越清晰。在大量的人类肿瘤细胞中， Hh信号通路持续激活并调控下游的基因转录，从而参与肿瘤的增殖分化、细胞凋亡、血管新生和侵袭转移。因此针对 Hh信号通路的靶向抑制也成为抗癌治疗的热点。有文献记载 Hh信号通路的抑制剂主要分为 3类： Shh抑制剂、 Smo抑制剂和 Gli转录抑制剂。其中 Smo抑制剂 Cydopamine 能抑制 Smo的活性，阻止 Hh信号通路的激活，从而发挥抗肿瘤作用。近年来， Cydopamine 及其衍生物作为抗肿瘤药物的研究在国外发展迅速。有些已进入临床阶段，其中 GDC-0449 在 2012年初已被 FDA批准上市用于治疗基地细胞癌（BCC)，而 GDC-0449治疗其他多种实体瘤的研究也进入临床 II/ I期。综上所述， Hh信号通路为抗肿瘤药物的研发提供了一个很有前途的靶点。

然而，目前唯一一个上市的 Hh信号通路抑制剂 GDC-0449在应用中也存在一些问题，比如无论 GDC-0449的用量加到多大，在患者体内都无法达到更高的血药浓度，而且对于某些 Smo位点的突变， GDC-0449药效降低甚至无效。

发明内容

本发明的目的就是要提供针对 Smo靶点抑制 Hh信号通路的具有抗肿瘤活性的化合物及其药用盐，以用于制备抗肿瘤药物。

本发明的另一目的是提供上述化合物及其药用盐的制备方法。

本发明的进一步的目的是提供上述化合物在制备抗肿瘤药物上的应用。

本发明的更进一步的目的是提供一种以上述化合物及其药用盐为有效成份的药物组合物。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种式（ I ) 所示的化合物或其药学上可以接受的盐

其中， F^ F^R⁴独立地为 H，卤素， Cl-6 直链、支链烧基，环垸基或者卤素取代的 C1-6 直链或支链垸基； Y= C或 N； R⁵为：

杂原子为氮或氧、杂原子数量为一个或两个、未取代或以垸基、羟基或氨基取代的 4-8元杂环，，

；其中， ^独立地为 C1-4直链垸基，支链烧基或环垸基； R⁷、 R⁸独立地为 H， Cl-6 直链烧基，环垸基，氨基或羟基取代垸基，垸基氨基取代垸基 R °NR，或垸氧基取代垸基 R"0R; 其中， R⁹、 R¹⁽⁾可以独立地为 H、 Cl-6 直链烧基，支链垸基，环垸基或 R⁹、 R^1Q闭合成环； R¹¹为 C1-4直链垸基，支链垸基或环垸基。

优选地， R⁵为杂原子为氮或氧、杂原子数量为一个或两个、未取代或以垸基、羟基取代的 4， 6， 8元单杂环。

较优选地 R⁵为

更优选地，本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐选自以下化合物之一:

最优选地，本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐，选自以下化合物之

I

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1-8 。

本发明的化合物的制备方法中，最终产物是按下述步骤制备：

a.化合物 1在溶剂中（CH₂C1₂， THF等）与醋酸酐反应制得化合物 2; b.化合物 2与双 (频哪醇合）二硼反应制得化合物 3;

c.化合物 3与 2-溴吡啶反应制得化合物 4;

d.化合物 4在浓硫酸中硝化反应制得化合物 5；

e. 还原化合物 5制得化合物 6;

f . 把化合物 6脱保护去掉乙酰基制得化合物 7a

g.垸基化 7a得到化合物 7;

h. 然后反应 7或者 7a与已取代的芳基羧酸得到所要的化合物具体可参照下述反应式（ II ) 进行：

目标化合物

( II ) ，

其中， ^ ，^，^ ^和丫的定义同前。

另一方面，本发明提供所述化合物或其可药物接受的盐用于制备抗肿瘤药物。所述肿瘤为与 Hh信号通路持续激活相关的肿瘤。更具体地说，所述肿瘤为：皮肤基底细胞癌、髓母细胞瘤、肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌或胰腺癌等。

再一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明所述的化合物或其可药物接受的盐作为有效成份，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

本发明提供的药物组合，含有上述化合物或其在制药学上许可的盐、制药学上许可的载体或以该类化合物作为活性成分的混以要用赋形剂或稀释剂的组合。

所述的本发明的用于治疗肿瘤的药物组合中药学上可以接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如水等；赋形剂剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶等；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙等；吸收剂如季铵化合物; 表面活性剂如十六垸醇；吸附载体如高岭土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、镁等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可能组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酊剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等，优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。

本发明药物组合的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的化合物及其可药用盐对与 Hh信号通路持续激活相关肿瘤的癌细胞生长的抑制作用与 GDC-0449相当甚至优于 GDC-0449, 从而为相关肿瘤的治疗提供新的选择。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂未标明来源、规格的均为市售分析纯或化学纯。

所述的化合物经核磁共振谱、质谱确证其结构。实施例 1

I - :1 化合物 1 (10 g) 溶于二氯甲垸，加入醋酸酐（5.93 g)，体系加热到 40 °C 反应 2 小时。体系降至室温， NaHC03水溶液洗两次，有机相旋干得化合物 2 (11 g, 收率 92%)。

化合物 2(11 g) ，醋酸钾（8.8 g) 溶于二氧六环，加入双联硼（20.5 g)。体系氮气置换反应 15 分钟，加入 Pd (dppf) CI2 (1 g) ，加热至 8CTC反应过夜（12小时）。降温，旋干过柱（PE/EA=2/1) 得到化合物 3 (8g, 收率 61%)。

化合物 3(2.1 g) ，碳酸铯（4g) 溶于二氧六环，加入 2-溴吡啶（1.27g)。体系氮气置换反应 15 分钟，加入 Pd (dppf) CI2 (0.2 g) ，加热至 8CTC 反应过夜（12小时）。旋干过柱（PE/EA=1/1) 得到化合物 4 (1.2g, 收率 61%)。

化合物 4 (10 g) 溶于浓硫酸（10 ml), 降温至 5 °C，分批加入硝酸钾（15 g)，点 TLC板至原料反应完全。体系打入冰水中， 15% NaOH水溶液调 PH至 7，有固体缓慢析出，抽滤，固体干燥得化合物 5 (8 g, 收率 92%)。

化合物 5(2g) 溶于 EtOH/H20=5/1 (60 ml), 加入氯化铵 (1.8g), 醋酸 (5 ml), 体系加热至 60°C，铁粉分批加入（1.9 g)。保持 6CTC反应 1小时。降温，乙酸乙酯萃取，旋干过柱（PE/EA=1/1) 得到化合物 6(1.2g, 收率 67%)。

化合物 6 (3 g) in 溶于 15%NaOH，加热至 70°C，点 TLC板至原料反应完全。降温，有固体析，过滤，固体干燥得红色固体化合物 7(1.5 g, 收率 60%)。

化合物 7 (500, mg), 2-氯 -4-甲砜基苯甲酸（1 g) 溶于多聚磷酸，加热至 60°C反应 5 小时，点 TLC板至原料反应完全。体系打入冰水中， 15% NaOH水溶液调 PH至 7, 有固体缓慢析出，抽滤，固体干燥得灰色固体状化合物 I -1 (510 mg, 收率 54%)。 MR CDC1₃ δ: 3.12 (s, 3 H), 7.36 (m, 1 H), 7.54-7.89 (m, 5 H), 8.02 (s, 1 H) , 8.37-8.47 (dd, 1 H), 8.73 (s, 1 H) , 11.64 (s, 1 H)； LC-MS: m/z = 417.8 (M+l) 实施例 2

5-氯 -2-(6-(4-甲基哌嗪 -1-基)吡啶 -3-基） -6- (吡啶 -2-基)苯并咪唑（1-2) 的合成：

化合物 1 (10 g) 溶于二氯甲垸，加入醋酸酐（5.93 g).，体系加热到 40 °C 反应 2 小时。体系降至室温， NaHC03水溶液洗两次，有机相旋干得化合物 2 (11 g, 92%)。

化合物 2(11 g) ，醋酸钾（8.8 g) 溶于二氧六环，加入双联硼（20.5 g)。体系氮气置换反应 15 分钟，加入 Pd(dppf)CI2(1 g)，加热至 8CTC反应过夜。降温，旋干过柱（PE/EA =2/1) 得到化合物 3 (8g, 61%)。

化合物 3(2.1 g) ，碳酸铯（4g) 溶于二氧六环，加入 2-溴吡啶（1.27g)。体系氮气置换反应 15 分钟，加入 Pd(dppf)CI2 (0.2 g)，加热至 8CTC 反应过夜。旋干过柱（PE/EA =1/1) 得到化合物 4 (1.2 g, 61%)。

化合物 4 (10 g) 溶于浓硫酸（10 ml), 降温至 5 °C，分批加入硝酸钾（15 g)，点 TLC板至原料反应完全。体系打入冰水中， 15% NaOH水溶液调 PH至 7，有固体缓慢析出，抽滤，固体干燥得化合物 5 (8 g, 92%)„

化合物 5(2g) 溶于 EtOH/H20=5/1 (60 ml), 加入氯化铵 (1.8g), 醋酸 (5 ml), 体系加热至 60°C，铁粉分批加入（1.9 g)„ 保持 6CTC反应 1小时。降温，乙酸乙酯萃取，旋干过柱（PE/EA =1/1) 得到化合物 6 (1.2 g, 67%)。

化合物 6 (3 g) in 溶于 15%NaOH，加热至 70°C，点 TLC板至原料反应完全。降温，有固体析出，过滤，固体干燥得红色固体化合物 7 (1.5 g, 60%)。

化合物 7 (5 g) 溶于二氯甲垸（200 ml),加入 6-氯烟酸 (3.6 g)， HOBT (4 g)， Et3N (5.7 g)， EDCI (5.2 g)，室温搅拌过夜。体系打入水中，二氯甲垸萃取，浓缩过柱 (PE/EA =1/1-EA) 得到化合物 8 (5.2 g, 63%) 。

化合物 8 (2 g) 溶液醋酸，体系加热至 100°C，点 TLC板至原料反应完全。体系降温，打入水中， 15% NaOH水溶液调 PH至 7，有固体缓慢析出，抽滤，固体干燥得化合物 9 (1.5 g, 79%) 。

化合物 9 (500 mg) 溶于 N-甲基吡咯垸酮 (10 ml)，加入 N-甲基哌嗪（ 147 mg)， DIEA

(114 mg), 体系加热至 13CTC反应过夜。降温，打入水中，乙酸乙酯萃取，旋干过柱

(MeOH/DCM =1/10)得到红色固体状化合物 I - 2 (204 mg，收率 34%) 。 HNMR CDCI₃ δ:

2.304 (s, 3 H), 2.445-2.456 (d, 4 H), 3.569-3.579 (d, 4 H), 6.491-6.514 (d, 1 H), 7.264-7.607 (m, 4 H), 7.733-7.775 (m, 1 H), 7.943-7.965 (d, 1 H), 8.635-8.646 (d, 1 H), 8.75-8.756 (d, 1 H); LC-MS: mlz =405.9 (M+1) 实施例 3

5-氯 -2-(6- (2,6-二甲基吗啉基)吡啶 -3-基） -6- (吡啶 -2-基)苯并咪唑（1-3) 的合成： ■■w^ ( -i) ¾¾ i*(¾- -¾¾d)-9- -£- ^m - ) -9)-z-n-

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S86.0/M0ZN3/X3d Ζ8869Ϊ/ 0Ζ OAV 本发明的具有式（I ) 结构的化合物及其药学上可接受的盐，在抗肿瘤方面有明显的效用，现通过以下药理实验说明：

MTS细胞增殖实验

1. 试验材料

1.1 化合物及溶媒

受试样品

前述实施例所制备的式（ I ) 系列化合物 I -1， I -2， I -3， I -4， I -5， I -6； I -7， I -8„ 阳性对照品： GDC-0449从上海翰香香料有限公司购买。

DMSO作为本实验的溶媒，购自 Sigma公司，货号： D8418。

1.2 细胞株

本实验使用二种类型细胞株， 1 ) 人胰腺癌细胞株 PANC-1来源于中科院细胞库。 2 ) 人慢性髓系白血病细胞株 K562来源于中科院细胞库。

1.3试剂

MTS检测细胞增殖试剂粉末，购自 Promega公司，货号： Gllll。 PMS购自 sigma公司，货号： P9625。细胞培养基 RPM l640和 DMEM购自 Gibco公司。胎牛血清购自 HyClone公司，货号： SV30087 02

2. 试验方法

2.1 药物处理剂量及配制方法

空白溶媒组成： DMSO

受试品式（ I )系列化合物及阳性对照品 GDC-0449配制方法:称取适量样品，加入适量 DMSO 使药物储存浓度为 20 mmol/L, 涡旋混合均匀。根据药物在 DMSO中的溶解度及 DMSO在细胞培养中的安全浓度（DMSO在 1%以下），设置以下药物处理浓度： 60μηηοΙΑ、 20 mol/L、 6.67 mol/L、 2.22 mol/L、 0.74 mol/L、 0.25 mol/L、 0.082 mol/L、 0.027 mol/L 。

2.2 细胞培养

人胰腺癌细胞株 PANC-1培养于 DMEM完全培养基（含有 10%的胎牛血清， 100U/ ml 青霉素, lOO g/ ml 链霉素）。人慢性髓系白血病细胞株 K562 (悬浮细胞）培养于 RPMI-1640完全培养基（含有 10%的胎牛血清, 100U/ ml 青霉素 ,100 _{y g}/ ml 链霉素）。

2.3 MTS法检测 HB系列化合物对体外培养癌细胞生长的抑制作用

将处于对数生长期的 PANC-1细胞，用 0.25%的胰蛋白酶消化，制成细胞悬液， 5X10³/孔加入 96孔细胞培养板内（150 μ ί/孔），三复孔，置于 37°C、 5%C02孵箱内培养次日贴壁后，按照实验设计每孔加入 50ul系列浓度的受试化合物或对照的培液，并设置细胞对照组（仅含细胞和培养基而不含药物的孔）、空白对照组（仅含培养基而不含细胞的）。 K562 悬浮细胞直接计数， 1X10⁴/孔加入 96孔细胞培养板内，其他处理与 PANC-1相同。 PANC-1和 K562给药后均培养 3天，培养完成后，采用 MTS方法检测细胞增殖情况并计算细胞相对于细胞对照组的细胞活力。

细胞相对活力％= (加药组细胞吸光值 -空白对照组平均吸光值） I (细胞对照组平均吸光值- 空白对照组平均吸光值 ) X 100%

3.试验结果

HB系列化合物对体外培养癌细胞生长的抑制作用

加药 3天后， MTS法检测本发明系列化合物对 PANC-1和 K562细胞生长的抑制作用。结果显示其中几个化合物的抑制作用与 GDC-0449相当甚至优于 GDC-0449, IC50结果见表 1。表 1: 本发明化合物对癌细胞生长的抑制作用（IC50: Mean i SD )

RT-PCR Glil mRNA检测

1. 试验材料

1.1 化合物及溶媒

受试样品

式（ I ) 系列化合物（ 1 -1、 1 -2、 1 -3、 1 -4、 1 -5、 1 -6、 1 -7, 1 -8 ); 阳性对照品： GDC-0449

DMSO作为本实验的溶媒。

1.2 细胞株

本实验使用一种类型细胞株，人慢性髓系白血病细胞株 K562。

1.3试剂及仪器

试齐^ SuperfecTRI RNA提取试剂，购自上海普飞生物技术有限公司，货号： 3101-100。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自 FERMENTAS公司，货号： K1622„ FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)试齐 lj，购自罗氏公司，货号： 04913914001。

仪器： Bio-Rad公司 M」 Mini 48-Well Personal Thermal Cycler PCR仪，型号： PTC-1148; Bio-Rad 公司 iQ5实时荧光定量 PCR仪，型号： iQ5。

2. 试验方法

将 K562细胞加入 12孔板内， 2X10⁵个细胞 /孔。按照实验设计每孔加预设好浓度的受试化合物和阳性对照品（30、 10、 3.3 μΜ )，两副孔。 24 h后， SuperfecTRI RNA提取试剂按照标准实验方案提取总 RNA, 并使用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将 mRNA逆转录成 cDNA。然后，使用 FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)试剂按照标准实验方案在 iQ5 实时 PCR 检测系统上进行 qPCR 实验。引物序列如下： Glil 上游引物： AGCGTGAGCCTGAATCTGTG，下游弓 I物： CAGCATGTACTGGGCTTTGAA； GADPH 上游弓 I物： TTCACCACCATGGAGAAGGC, 下游引物： GGCATGGACTGTGGTCATGA。所有数值采用 2^{A al}— ^{A Ct2} 法进行相对定量分析。

3. 试验结果

式（ I ) 系列化合物对 Glil mRNA表达水平的影响

加药 24h后，提取 RNA， RT-PCR检测 HB系列化合物对 Glil mRNA表达水平的影响。结果表明，在 30、 10、 3.3 μΜ处理 24 h的条件下， I -1和 I -2有与 GDC-0449相同的抑制效果，结果见表 2。表 2:本发明化合物对 Glil mRNA表达水平的影响

Claims

权利要求书学上可以接受的盐，

其中， F^ F^R⁴独立地为 H，卤素， C1-6 直链、支链烧基，环垸基或者卤素取代的 C1-6 直链或支链垸基； Y= C或 N； R⁵为：

杂原子为氮或氧、杂原子数量为一个或两个、未取代或以垸基、羟基或氨基取代的 4-8元杂环，

或一一；其中， ^独立地为 C1-4直链垸基，支链烧基或环垸基； R⁷、 R⁸独立地为 H， Cl-6 直链烧基，环垸基，氨基或羟基取代垸基，垸基氨基取代垸基 R °NR，或垸氧基取代垸基 R"0R; 其中， R⁹、 R¹⁽⁾可以独立地为 H、 Cl-6 直链烧基，支链垸基，环垸基或 R⁹、 R^1Q闭合成环； R¹¹为 C1-4直链垸基，支链垸基或环垸基。

2、根据权利要求 1 所述的式（ I ) 所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于 R⁵ 为杂原子为氮或氧、杂原子数量为一个或两个、未取代或以垸基、羟基取代的 4， 6， 8元单杂环。

3、根据权利要求 2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于， R⁵为

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N -N -OH

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4、根据权利要求 1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于为以下化合物之-