WO2014137141A1 - 인터루킨-８ 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

인터루킨-８ 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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WO2014137141A1
WO2014137141A1 PCT/KR2014/001776 KR2014001776W WO2014137141A1 WO 2014137141 A1 WO2014137141 A1 WO 2014137141A1 KR 2014001776 W KR2014001776 W KR 2014001776W WO 2014137141 A1 WO2014137141 A1 WO 2014137141A1
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seq
aptamer
rna
rna aptamer
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English (en)
French (fr)
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허균
김인후
이은숙
김윤희
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National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to an RNA aptamer that binds to IL-8 (interleukin-8) and its use. Specifically, the aptamer and the app to bind to IL-8 and inhibit IL-8-induced function It relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer and inflammatory diseases, including tamers.
  • IL-8 interleukin-8
  • An aptamer is a single-strand that folds into a unique 3D structure and specifically binds to a target with high binding force at low nanomolar to picomolar concentrations.
  • -strand refers to DNA or RNA oligonucleotides.
  • the aptamers are generally identified in a library of randomized sequences (> 10 15 ) in vitro by a method known as systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Since the SELEX method was developed in 1990, aptamers that target proteins, phospholipids, sugars, nucleic acids, and even human plasma and whole cells I was identified.
  • Aptamers are frequently compared to antibodies in that they specifically bind to targets and are applicable to a wide range. Compared with antibodies, aptamers can be easily produced by chemical synthesis, are stable at high temperatures, have easy access to the target, can be easily modified chemically, non-immunogenic, and nontoxic. It has the advantage as a therapeutic agent in the sense of). Nuclease-mediated degradation, on the other hand, causes aptamers to have a short half-life. This limitation may be overcome by using various chemical modifications.
  • pyrimidine nucleotides are modified or purine with 2'-fluorin (2'-F) or 2'-amine (2'-amine, 2'-NH 2 ) )
  • Nucleotide resistance of aptamers can be increased by modification of nucleotides to 2'-OMe, or by chemical changes such as 3'-inverted dT (3'-3'-dT).
  • Interleukin-8 also known as CXCL8, is the first chemokine identified.
  • IL-8 is also known as a chemoattractant of neutrophils.
  • IL-8 is a response to proinflammatory stimuli, chemical and environmental stresses, and steroid hormones. It is produced by various types of cells, such as endothelial cells, epithelial cells, and tumor cells.
  • IL-8 contains the ELR motif and Glu-Leu-Arg, a sequence important for receptor binding and essential for chemotactic activity, and also promotes angiogenesis through CXCR1 and CXCR2.
  • CXCR1 IL-8RA
  • CXCR2 IL-8RB
  • Tumor-derived IL-8 can promote proliferation, survival, migration, and invasion of cancer cells, and can activate endothelial cells to promote angiogenesis. The contribution of IL-8 to tumor progression is of great importance for the development of therapeutic agents on targets and for the treatment of cancer.
  • the inventors of the present invention while studying aptamers that can treat cancer by inhibiting the activity of IL-8, using SELEX to select aptamers that specifically bind to IL-8 in the RNA library, the aptamers It was confirmed that binding to IL-8 with a high binding force inhibits the migration and intracellular signaling of IL-8-induced neutrophils, and the invasion of cancer cells. In addition, the truncated form of the aptamer was produced to bind to IL-8 with high avidity, thereby inhibiting IL-8-induced neutrophil migration and intracellular signaling, and Ca 2+ mobilization. By this, the present invention was completed by confirming that the aptamer can be usefully used for the treatment and prevention of cancer or inflammatory diseases.
  • An object of the present invention is to provide an aptamer and its use in combination with IL-8 (interleukin-8) to inhibit the function induced by IL-8.
  • IL-8 interleukin-8
  • the present invention provides aptamers that specifically bind to IL-8.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer or inflammatory diseases comprising aptamer specifically binding to IL-8.
  • An aptamer that binds to IL-8 (interleukin-1) of the present invention is a cancer and inflammatory disease induced by IL-8 by binding to IL-8 with a high binding force and inhibiting the activity of IL-8. It can be usefully used as a prophylactic and therapeutic pharmaceutical composition.
  • 1A is a diagram showing the binding capacity of the RNA library and the RNA pool obtained through SELEX to IL-8.
  • 1B is a diagram showing the RNA obtained from the RNA pool divided into several groups according to sequence similarity.
  • FIG. 1C is a diagram showing that # 8 aptamer specifically in the RNA pool binds to His-IL-8 and does not bind to other CXC-chemokines, His-GRO- ⁇ and His-GRO- ⁇ .
  • FIGS. 2A and 2B are diagrams showing the structure of the aptamer of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing that the aptamer of the present invention inhibits the movement of neutrophils.
  • Figure 4 shows that 8A-44 (SEQ ID NO: 23) strongly binds to IL-8.
  • 5A is a diagram showing that 8A-44 (SEQ ID NO: 23) inhibits the migration of neutrophils induced by IL-8.
  • 5B is a diagram showing that 8A-44 (SEQ ID NO: 23) inhibits the activity of ERK induced by IL-8.
  • 6A and 6B show that 8A-44 (SEQ ID NO: 23) inhibits IL-8 induced invasion in HSC-3 and 686-LN-e cell lines, IL-8 induced oral cancer cell lines.
  • FIG. 7 is a diagram confirming the binding force to IL-8 of 8A-35 (SEQ ID NO: 24) and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) which is a truncated form of 8A-44 (SEQ ID NO: 23).
  • 8A is a diagram showing that 8A-44 (SEQ ID NO: 23), 8A-35 (SEQ ID NO: 24), and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) inhibit migration of neutrophils induced by IL-8.
  • 8B is a diagram showing that 8A-44 (SEQ ID NO: 23), 8A-35 (SEQ ID NO: 24), and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) inhibit the activity of ERK induced by IL-8.
  • FIG. 9 shows that 8A-44 (SEQ ID NO: 23), 8A-35 (SEQ ID NO: 24), and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) induce concentrations of Ca 2+ mobilization induced by IL-8 in neutrophil cells. It is a figure which shows suppression dependently.
  • the present invention is an RNA aptamer consisting of 30 RNA that specifically binds to IL-8 (interleukin-8), wherein the 4-30th base from the 5 'end of the aptamer consists of the base of SEQ ID NO: 22 An RNA aptamer is provided.
  • the present invention is an RNA aptamer consisting of 35 RNA specifically binding to IL-8, 7th to 30th base from the 5 'end of the aptamer, characterized in that consisting of the base of SEQ ID NO: 22 Provide RNA aptamers.
  • the present invention is an RNA aptamer consisting of 44 RNA specifically binding to IL-8, the 7th to 30th base from the 5 'end of the aptamer consists of the base of SEQ ID NO: 22, the first The 6 th to 6 th base and the 30 th through 44 th bases provide RNA aptamers, which are composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28, and base sequences complementary to 80% or more thereof.
  • RNA aptamer is a short single-stranded oligonucleotide that can form a three-dimensional structure capable of binding to a target material with high affinity and specificity, and in most cases can only specifically bind to a target protein. In addition, it can effectively inhibit its function and can be used to determine the function of the target protein.
  • Repeated in vitro screening allows the selection of specific RNA molecules, namely aptamers from any RNA library (AD Ellington and JW Szostak, Nature 346: 818-822, 1990; C. Tuerk and L.
  • RNA library can be synthesized by other biological libraries or synthetics for the selection of high affinity aptamers. Better than the library (EN Brody and L. Gold, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5-13, 2000).
  • the inventors performed SELEX using RNA libraries to select RNA aptamers that bind to IL-8 and inhibit IL-8-induced function, resulting in sequence similarity. Fifteen sequences were divided into five groups (see FIG. 1B). In addition, the selected RNA pool had a 19-fold higher binding force to IL-8 than the RNA library (see FIG. 1A), of which 8A-W (SEQ ID NO: 16) specifically binds to IL-8, It was confirmed that it does not bind to other CXC-chemokines, GRO- ⁇ and GRO- ⁇ (see FIG. 1C).
  • the present inventors produced the aptamer in its cut form using the 8A-W (SEQ ID NO: 16) as a template.
  • PCR was performed to prepare 8A-1F1R, 8A-2F1R, 8A-2F2R, and 8A-44 (SEQ ID NO: 23), followed by PCR again with 8A-44 (SEQ ID NO: 23) as a template.
  • No. 24 and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) truncated form RNA aptamers were further constructed, and their two-dimensional structure was predicted using the M fold program (see FIG. 2). ).
  • the present inventors also found that the migration of neutrophils was concentration-dependently by treatment of 8A-W (SEQ ID NO: 16), 8A-1F1R, and 8A-44 (SEQ ID NO: 23) in the cleaved aptamer obtained above. Although reduced, it was confirmed that it is not affected by 8A-2F2R or 8A-2F1R (see Fig. 3).
  • 8A-44 (SEQ ID NO: 23) inhibits the migration of IL-8 induced neutrophils concentration-dependently compared to the control (see FIG. 5A), and inhibits IL-8 induced ERK activity at high concentrations. (See FIG. 5B).
  • 8A-44 SEQ ID NO: 23
  • 8A-35 SEQ ID NO: 24
  • 8A-30 SEQ ID NO: 25
  • the aptamers of the present invention bind to human IL-8 and significantly inhibit the intracellular signaling pathways induced by IL-8, thereby providing a pharmaceutical for the prevention and treatment of IL-8 induced cancer and inflammatory diseases. It has been confirmed that the composition can be usefully used.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of cancer or inflammatory diseases comprising the aptamer.
  • the aptamer of the present invention is most preferably to inhibit IL-8-induced function by binding to IL-8, but is not limited thereto.
  • the structure of the aptamer is preferably composed of one main stem (loop) structure (loop), it is possible to use both if it contains the sequence of the aptamer of the present invention.
  • the aptamers are also 2'-fluoro-pyrimidine-modified (2'-Fluoro-) using 2'-F-dCTP and 2'-F-dUTP in place of CTP and UTP in order to have RNaseA resistance.
  • a pyrimidine-modified) RNA library was used to perform SELEX, but not limited thereto. Any method well known in the art may be used as long as it is a method for making RNaseA resistance.
  • the aptamer may include, but is not limited to, one or more variations selected from the following groups:
  • the -OH group at the 2 'carbon position of the sugar structure in the nucleotide is -Me (methyl), -OMe, -NH2, -F (fluorine), -O-2-methoxyethyl-O-propyl, -O-2-methylthio Modification by substitution with ethyl (methylthioethyl), -O-3-aminopropyl, -O-3-dimethylaminopropyl, -ON-methylacetamido or -O-dimethylamidooxyethyl;
  • Internucleotide linkages include modifications to phosphorothioate, borano phosphophate or methyl phosphonate linkages.
  • the present invention provides an aptamer-complex in which the RNA aptamer of the present invention and a macromolecular material having biocompatibility are conjugated, but are not limited thereto.
  • the macromolecular material is preferably polyethylene glycol (PEG), diacylglycerol (DAG) or monoclonal antibody (monoclonal antibody), but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer or inflammatory disease comprising the RNA aptamer fmf of the present invention.
  • the cancer is preferably oral cancer and skin cancer induced by IL-8 overexpression, according to a preferred embodiment of the present invention is more preferably oral cancer, but is not limited thereto.
  • the inflammatory diseases include dermatitis, atopic dermatitis, conjunctivitis, periodontitis, rhinitis, otitis media, sore throat, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastritis, Crohn's disease, colitis, hemorrhoids, gout, ankylosing spondylitis, rheumatic fever, lupus, fibromyalgia, Psoriatic arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, periarthritis, tendinitis, hay salt, peritonitis, myositis, hepatitis, cystitis, nephritis, sjogren's syndrome, multiple sclerosis, and acute and chronic inflammatory diseases are preferred.
  • dermatitis atopic dermatitis, conjunctivitis, periodontitis, rhinitis, otitis media, sore throat, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastriti
  • composition containing the RNA aptamer of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above components.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, lactose , Mannitol, malt, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, opiodry, sodium starch glycolate, lead carnauba, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate , Sucrose, dextrose, sorbitol, talc and the like can be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in various oral and parenteral formulations during actual clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used It can be prepared using.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid form preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose ( Sucrose), lactose (Lactose) or gelatin can be prepared by mixing.
  • lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents, water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally according to a desired method, and when administered parenterally, external skin or intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection injection method It is preferred to select and administered by a suitable method, including intralesional administration if necessary for local immunosuppressive treatment. Dosage varies depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of disease.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers for neuroprotection.
  • RNA aptamers for human IL-8 SELEX was performed using 2'-F-dCTP and 2'-F-dUTP, respectively, in place of CTP and UTP.
  • DNA library (N40, 40 random nucleotide sequences): 5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN40CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3 ',
  • 5'-primer SEQ ID NO: 1: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3 ', and
  • 3'-primer SEQ ID NO: 2: 5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3.
  • the 2'-fluoro-pyrimidine-modified RNA library containing the extended 40 random nucleotides, the starting material for SELEX, is a Durascrib T7 transcription kit. According to the manufacturer's instructions of the manufacturer of the DuraScribe T7 Transcription Kit, Epicenter Biotechnologise, Madison, WI, USA, the PCR result product was produced by in vitro transcription process. The transcriptional reaction was performed with 0.2 ug double-stranded DNA template with T7 promoter, 5 mM ATP, 5 mM GTP, 5 mM 2'-F-dCTP, 5 mM 2'-F-dUTP, 10 mM DTT and 1 ul durasque.
  • a 20 ul DuraScribe T7 reaction buffer containing a DuraScribe T7 enzyme mix was reacted overnight at 37 ° C. Then, the mixture was treated with DNase I (Epicenter Biotechnology) at 37 ° C. for 15 minutes, followed by electrophoresis of RNA isolated from 8% acrylamide / 7 M urea gel. Phenol / chloroform extraction, ethanol precipitation and elution buffer [500 mM ammonium acetate, 1 mM EDTA, 0.2% (w / v), dode It was eluted again with sodium dodecyl sulfate (SDS), pH 0.7].
  • DNase I Epicenter Biotechnology
  • the library RNA pool or RNA pool for each SELEX cycle is bound to 200 ul to remove RNA binding to His-GRO- ⁇ , His-GRO- ⁇ , or magnetic beads.
  • 200 nM recombinant human His-GRO- ⁇ or His-GRO- ⁇ protein in binding buffer [30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2, 2 mM DTT, and 1% BSA]
  • binding buffer [30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2, 2 mM DTT, and 1% BSA]
  • 10 ul MagneHis Ni particles Promega, Madison, WI, USA with pre-shaking for 30 minutes at room temperature.
  • RNA-IL-8 protein feldan
  • the reacquired RNA was amplified via RT-PCR and transcribed in vitro to generate an RNA pool for performing the next SELEX.
  • the concentration of His-IL-8 was reduced by 2-fold every 5 times for more stringent conditions, and after 15 successive runs, the selected RNA was amplified by RT-PCR.
  • the amplified PCR product was cloned into pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and transformed with E. coli (DH5 ⁇ ).
  • IL-8-specific RNAs were obtained (SEQ ID NOs: 11-21), and IL-8-specific binding measurement of the obtained RNA pool was performed to perform SELEX. It was confirmed that the binding force was about 19 times higher than the previous RNA library (FIG. 1A), and as shown in FIG. 1B, the obtained RNA was divided into several groups according to sequence similarity (FIG. 1B).
  • Example ⁇ 1-1> has a specific high binding force with IL-8
  • radiolabeled RNA binding assay was performed.
  • RNA was dephosphorylated by treatment with 20 U CIAP (TaKaRa, Tokyo, Japan) at 37 ° C. for 30 minutes, and the dephosphorylated RNA was purified by phenol / chloroform extraction and ethanol elution. Purified RNA was treated with 10 U T4 polynucleotide kinase at 37 ° C. for 30 minutes and phosphorylated with 32 P-labeled ⁇ -ATP (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). I was.
  • # 8 aptamer specifically binds to His-IL-8 and does not bind to other CXC-chemokines, His-GRO- ⁇ and His-GRO- ⁇ . It was confirmed (FIG. 1C). Therefore, the # 8 aptamer of the present invention was named 8A-W (SEQ ID NO: 16).
  • IL-8 8A-W (SEQ ID NO: 16) was sequentially truncated from the 5 'and 3' ends. To this end, by combining the primers of the following 1F (SEQ ID NO: 3), 1R (SEQ ID NO: 4), 2F (SEQ ID NO: 5) and 2R (SEQ ID NO: 6) by performing a PCR by a method well known in the art four kinds of Truncated PCR products were obtained [8A-1F1R, 8A-2F2R, 8A-2F1R, 8A-44 (8A-1F2R, SEQ ID NO: 23)].
  • the product 8A cut out from the above 8A-44 (8A-1F2R), SEQ ID NO: 23 using primers 35F (SEQ ID NO: 7) / 35R (SEQ ID NO: 8) and 30F (SEQ ID NO: 9) / 30R (SEQ ID NO: 10) -35 (SEQ ID NO: 24), and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) were additionally obtained.
  • 35F (SEQ ID NO: 7): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGGGCTTATCATTCCATTTAGT-3 ',
  • 35R (SEQ ID NO: 8): 5'-GGTTATCATAACACTAAATGGAATGATAAGCCC-3 ',
  • 8A-W (SEQ ID NO: 16) consists of four stems / loops, and 8A-1F1R and 8A-44 (8A-1F2R, S) are templates 8A-W (SEQ ID NO: 16) The longest major stem / ring of the remains.
  • 8A-2F1R and 8A-2F2R showed completely different forms than the template 8A-W, so the longest major stem / ring structure of 8A-W (SEQ ID NO: 16) was important for binding to IL-8. Predicted part.
  • Example 2 8A-44 (SEQ ID NO: 23) Inhibits Neutrophil Migration and ERK Phosphorylation Induced by IL-8
  • Neutrophils were isolated from whole human blood by the density gradient method using histopaque (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA).
  • venous blood was carefully stacked on the same amount of histopaque solution and centrifuged at 1,500 rpm for 30 minutes at room temperature before neutrophil membrane (white membrane between erythrocytes and histopaque) was collected. Hypotonic lysis was performed to remove red blood cells from the neutrophil membrane. First, gently pipetting by adding 30 ml of distilled water, and then adding PBS to the neutrophil membrane to a final amount of 10 ml. After 1 minute, 10 ml 4% NaCl was added to the solution, mixed well, and centrifuged at 1,200 rpm for 7 minutes at room temperature. To obtain neutrophils, the cells were washed with RPMI1640 medium (Welljin, Daegu, Korea) and cultured on plates using RPMI1640 medium added with 10% FBS.
  • RPMI1640 medium Welljin, Daegu, Korea
  • Neutrophil migration assay was performed to confirm whether the aptamer specifically binding to IL-8 prepared by the method of ⁇ Example 1> inhibited the function of IL-8.
  • RNA aptamer and 100 ng / ml IL-8 (R & D system) obtained in Example 1 were added to serum-free RPMI 1640 medium at room temperature for 30 minutes, followed by stirring and pretreatment.
  • Neutrophils cultured by the method of 2-1> were collected and suspended in serum-free RPMI 1640 medium.
  • the IL-8 RNA aptamer mixture was placed at the bottom of each well and 2 ⁇ 10 6 cells were placed in the transwell insert. After incubation at 37 ° C. for 2 hours, the insertion portion was removed from the chamber, and each reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour by adding WST-1 (Takara) to the lower wells.
  • Neutrophil migration was assessed by measuring the light absorbance of formazan in the sample at 450 nm using a microplate reader.
  • IL-8-induced neutrophil migration as shown in FIG. 3 was concentration-dependent by treatment with 8A-W (SEQ ID NO: 16), 8A-1F1R, or 8A-1F2R (8A-44, SEQ ID NO: 23). It was reduced to, but was not affected by 8A-2F2R or 8A-2F1R. Based on the above results, aptamers specifically binding to IL-8 having a sequence of 21-66 nucleotides (8A-44, SEQ ID NO: 23) are sufficient to bind IL-8 and inhibit IL-8 activity. Confirmed.
  • Example ⁇ 2-2> to confirm the binding capacity of 8A-44 (8A-1F2R, SEQ ID NO: 23) to IL-8 composed of 44 mer of 21-66 nucleotide sequences sufficient to bind IL-8 , A complementary sequence of 8A-44 (SEQ ID NO: 23) (8A-44COM, SEQ ID NO: 26)) as a negative control, and ProteOn XPR36 assay (Bio) using surface plasmon resonance (SPR) technology Adhesion to IL-8 was measured via Rad Laboreary, Hukulles, CA, USA.
  • the assay was used with minor changes to existing methods.
  • the His-labeled IL-8 protein was added to 1 uM in 10 mM sodium acetate buffer (pH 8.0) and flow rate was fixed on the GLM sensor chip by the amine coupling principle. Spilled at 30 ul / ml for 5 minutes. After chip inactivation with 1 M ethanolamine, PBST running buffer [10 mM sodium phosphate (pH 7.4), 150 mM NaCl, and 0.005% Tween 20] Each diluted 8A-44 (SEQ ID NO: 23) aptamer was flowed vertically for 1 minute at a flow rate of 100 ul / ml at concentrations of 20, 10, 5, 2, 1, and 0 nM.
  • 8A-44 (SEQ ID NO: 23) aptamers inhibit IL-8-induced neutrophil migration was confirmed using the same method as in Example ⁇ 2-2>, and 8A-44 (SEQ ID NO: 23) in neutrophils Western blots were performed to see if they inhibited ERK phosphorylation.
  • RNA-IL-8 mixture is added to 2 x 10 6 cells / ml of neutrophils and phosphorylated for 2 minutes and 30 seconds at room temperature. The phosphorylation reaction was stopped by addition of SDS sample buffer and the mixture was anti-phospho-p44 / 42 MAPK (p-ERK1 / 2), p44 / 42 MAPK.
  • 8A-44 SEQ ID NO: 23
  • human oral cancer cell lines HSC-3 and 686-LN-e were cultured under the condition of 37 ° C. and 5% CO 2 by adding 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) to DMEM medium (Welljin). It was. In-chip verification was also performed in a 6.5 mm transwell chamber with a 8.0 um pore filter (Costa). The inner filter was preprocessed with a 1 mg / ml cold growth factor-reduced Matrigel matrix (BD Biosciences, Franklin Lake, NJ, USA) and then overnight at 37 ° C. Left to solidify.
  • FBS Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA
  • 8A-44 (SEQ ID NO: 23) contained a sufficient sequence to specifically bind to IL-8 and inhibit its function, thereby binding minimal to inhibit its function by binding to IL-8. Oligonucleotides were identified. For this purpose 8A-35 (35mer, SEQ ID NO: 24) and 8A-30 (30mer, SEQ ID NO: 25), truncated forms of 8A-44 (SEQ ID NO: 23) were used. 8A-35 (SEQ ID NO: 24) is a form in which 9 nucleotides are cleaved from the 3 'end of 8A-44 (SEQ ID NO: 23), and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) is 5 to 8A-35 (SEQ ID NO: 24).
  • the k a value of 8A-35 was 1.71 ⁇ 10 6 M ⁇ 1 s ⁇ 1 , similar to 8A-44 (SEQ ID NO: 23), but k d
  • the value represents 7.92 ⁇ 10 ⁇ 5 s ⁇ 1 , which is about 300-fold reduction compared to 8A-44 (SEQ ID NO: 23), indicating that 8A-35 (SEQ ID NO: 24) strongly binds IL-8 with a K D value of 46.3 pM. Indicates.
  • k a and k d values of 8A-30 represent 4.31 ⁇ 10 6 M ⁇ 1 s ⁇ 1 and 5.79 ⁇ 10 ⁇ 2 s ⁇ 1 , respectively, and have a K D value of 13.5 nM, This showed a slight change compared to 8A-44 (SEQ ID NO: 23).
  • Example 5 8A-44 (SEQ ID NO: 23), 8A-35 (SEQ ID NO: 24), and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) show the neutrophil migration, ERK and Akt signal activity, and Ca 2+ Mobilization suppression
  • Cell line to which Pura-2 AM was added was Locke's solution without Ca 2+ [154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl 2 , 5 mM HEPES (pH 7.3) at a density of 8 ⁇ 10 5 cells, 10 mM glucose, and 0.2 mM EGTA] were resuspended and pretreated with a mixture of IL-8 (20 ng / ml) and aptamers (2, 20 nM). Changes in fluorescence ration (340/380 nm) were identified with dual excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm and emission wavelengths of 500 nm.
  • IL-8-induced neutrophil migration inhibition of 8A-35 (SEQ ID NO: 24) and 8A-30 (SEQ ID NO: 25) was found to be at the same concentration as 8A-44 (SEQ ID NO: 23). It was dependent.
  • FIG. 8B the inhibitory ability of IL-8-induced ERK and Akt signaling was also inhibited concentration-dependently by 8A-35 (SEQ ID NO: 25) and 8A-30 (SEQ ID NO: 26).
  • RNA aptamer of the present invention 100 mg of RNA aptamer of the present invention
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • RNA aptamer of the present invention 100 mg of RNA aptamer of the present invention
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • Injection solution containing 100 nM RNA aptamer of the present invention as an active ingredient was prepared by the following method.
  • the components of the injection solution are as follows.
  • RNA aptamer of the present invention 5 ⁇ g (100 nM) of RNA aptamer of the present invention

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Abstract

본 발명은 IL-8에 결합하는 RNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 SELEX를 이용하여 RNA 라이브러리에서 IL-8에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하였고, 상기 앱타머가 IL-8에 높은 결합력으로 결합하여 IL-8-유도된 호중구의 이동 및 세포 내 신호전달, 및 암세포의 침입을 억제함을 확인하였다. 또한 상기 앱타머의 절단된 형태(truncated form)를 제작하여, 상기 앱타머의 절단된 형태가 IL-8에 높은 결합력으로 결합하여 IL-8-유도된 호중구의 이동 및 세포 내 신호전달, 및 Ca2+ 가동화(mobilization)을 억제함을 확인하였다. 따라서 본 발명의 IL-8에 결합하는 앱타머가 암 또는 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

인터루킨-８ 앱타머 및 이의 용도
본 발명은 IL-8(interleukin-8)에 결합하는 RNA 앱타머(aptamer) 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 IL-8에 결합하여 IL-8로 유도되는 기능을 억제하는 앱타머 및 상기 앱타머를 포함하는 암 및 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
앱타머(aptamer)란, 독특한 3D 구조로 접히고(fold), 낮은 나노몰(nanomolar) 내지 피코몰(picomolar)의 농도에서 높은 결합력으로 표적(target)에 특이적으로 결합하는 단일-가닥(single-strand) DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 말한다. 상기 앱타머는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)로 알려진 방법에 의해서 시험관 내에서(in vitro) 무작위 서열(randomized sequence)(>1015)의 라이브러리(library) 중에서 일반적으로 동정된다. 1990년도에 SELEX 방법이 개발된 이후, 단백질, 인지질(phospholipid), 당(sugar), 핵산(nucleic acid), 및 심지어 사람의 혈장(plasma) 및 전체 세포(whole cell) 등을 표적으로 하는 앱타머가 동정되었다.
앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고, 넓은 범위에 적용가능하다는 점에 있어서 자주 항체와 비교된다. 항체와 비교했을 때, 앱타머는 화학적 합성으로 쉽게 생산할 수 있고, 높은 온도에서 안정적이며, 표적에 접근이 용이하고, 화학적으로 쉽게 변형이 가능하며, 비-면역성(non-immunogenic), 및 무독성(nontoxic)이라는 점에서 치료상의 제제(therapeutic agent)로 이점을 갖는다. 반면 뉴클라아제-매개 분해(nuclease-mediated degradation)는 앱타머가 짧은 반감기(half-life)를 갖게한다. 이런 제한은 다양한 화학적 변형을 이용하여 극복할 수 있을 것이다. 예를 들어, 피리미딘(pyrimidine) 뉴클레오티드를 2'-플루오린(2'-fluorin, 2'-F) 또는 2'-아민(2'-amine, 2'-NH2)으로 변형 또는 푸린(purine) 뉴클레오티드에 2'-OMe로의 변형, 또는 3'-역 dT(3'-inverted dT, 3'-3'-dT)과 같은 화학적 변화에 의해서 앱타머의 뉴클라아제 저항성을 증가시킬 수 있다.
인터루킨-8(interleukin-8, IL-8)은 CXCL8이라고도 알려져 있고, 동정된 첫 번째 케모카인(chemokine)이다. 또한, IL-8은 호중구(neutrophil)의 화학주성인자(chemoattractant)로 알려져 있다. IL-8은 염증전 자극(proinflammatory stimuli), 화학적(chemical) 및 환경적(enviromental) 스트레스(stress), 및 스테로이드 호르몬(steroid hormone)에 의한 반응으로 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage), 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 및 종양세포(tumor cell)와 같은 다양한 형태의 세포에 의해 생산된다. IL-8은 ELR 모티프와, 수용체 결합에 중요하고 화학주성활성(chemotactic activity)에 필수적인 서열인 Glu-Leu-Arg을 포함하며, 또한 CXCR1 및 CXCR2를 통하여 혈관형성(angiogenesis)을 촉진한다. CXCR1(IL-8RA) 및 CXCR2(IL-8RB)는 G 단백질-연결된 수용체로 IL-8에 높은 결합력으로 결합하며, 세포 내로 IL-8로 시작되는 신호를 전달한다. 또한, IL-8은 암의 발달에 있어서 중요한 다른 생물학적 활성을 갖는다. 종양-유래된 IL-8은 암세포의 확산(proliferation), 생존(survival), 이동(migration), 및 침입(invasion)을 촉진할 수 있고, 혈관생성을 촉진하기 위해 내피세포를 활성화시킬 수 있다. 종양 진행(tumor progression)에 있어서 IL-8의 기여는 표적에 대한 치료상의 제제의 발전 및 암 치료를 위하여 매우 중요하다.
이에 본 발명자들은, IL-8의 활성을 억제하여 암을 치료할 수 있는 앱타머를 연구하던 중, SELEX를 이용하여 RNA 라이브러리에서 IL-8에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하였고, 상기 앱타머가 IL-8에 높은 결합력으로 결합하여 IL-8-유도된 호중구의 이동 및 세포 내 신호전달, 및 암세포의 침입을 억제함을 확인하였다. 또한 상기 앱타머의 절단된 형태(truncated form)을 제작하여, IL-8에 높은 결합력으로 결합하여 IL-8-유도된 호중구의 이동 및 세포 내 신호전달, 및 Ca2+ 가동화(mobilization)을 억제함으로써, 상기 앱타머를 암 또는 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 IL-8(interleukin-8)과 결합하여 IL-8로 유도되는 기능을 억제하는 앱타머(aptamer) 및 그 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 IL-8과 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-8과 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함하는 암 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 IL-8(interleukin-1)에 결합하는 앱타머(aptamer)는, IL-8에 높은 결합력으로 결합하여 IL-8의 활성을 억제함으로써, IL-8에 의해 유도되는 암 및 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1A는 RNA 라이브러리와 SELEX를 통해 수득된 RNA 풀(pool)의 IL-8에 대한 결합력을 나타내는 도이다.
도 1B는 RNA 풀에서 수득된 RNA를 서열 유사성에 따라 몇 개의 군으로 나눈 것을 나타내는 도이다.
도 1C는 RNA 풀 중 #8 앱타머가 특이적으로 His-IL-8에 결합하고, 다른 CXC-케모카인(chemokine)인 His-GRO-α 및 His-GRO-β에는 결합하지 않음을 나타내는 도이다.
도 2A 및 2B는 본 발명의 앱타머의 구조를 예상한 도이다.
도 3은 본 발명의 앱타머가 호중구의 이동을 억제함을 나타내는 도이다.
도 4는 8A-44(서열번호 23)가 IL-8에 강하게 결합함을 나타내는 도이다.
도 5A는 8A-44(서열번호 23)가 IL-8에 의해 유도된 호중구의 이동을 억제함을 나타내는 도이다.
도 5B는 8A-44(서열번호 23)가 IL-8에 의해 유도된 ERK의 활성을 억제함을 나타내는 도이다.
도 6A 및 6B는 8A-44(서열번호 23)가 IL-8 유도된 구강암 세포주인 HSC-3 및 686-LN-e 세포주에서 IL-8에 의해 유도된 침입을 억제함을 나타내는 도이다.
도 7은 8A-44(서열번호 23)의 절단된 형태인 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)의 IL-8에 대한 결합력을 확인한 도이다.
도 8A는 8A-44(서열번호 23), 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)가 IL-8에 의해 유도된 호중구의 이동을 억제함을 나타내는 도이다.
도 8B는 8A-44(서열번호 23), 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)가 IL-8에 의해 유도된 ERK의 활성을 억제함을 나타내는 도이다.
도 9는 호중구 세포에서 8A-44(서열번호 23), 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)가 IL-8에 의해 유도된 Ca2+ 가동화(mobilization)를 농도-의존적으로 억제함을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 IL-8(interleukin-8)에 특이적으로 결합하는 30개의 RNA로 이루어진 RNA 앱타머로서, 상기 앱타머의 5'말단으로부터 4번째 내지 30번째 염기는 서열번호 22의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-8에 특이적으로 결합하는 35개의 RNA로 이루어진 RNA 앱타머로서, 상기 앱타머의 5'말단으로부터 7번째 내지 30번째 염기는 서열번호 22의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 IL-8에 특이적으로 결합하는 44개의 RNA로 이루어진 RNA 앱타머로서, 상기 앱타머의 5'말단으로부터 7번째 내지 30번째 염기는 서열번호 22의 염기로 이루어지고, 1번째 내지 6번째 염기 및 30번째 내지 44번째 염기는 각각 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열, 및 이와 80% 이상 상보적인 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머를 제공한다.
상기 "RNA 앱타머"는 짧은 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로 높은 친화도와 특이성으로 표적 물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있으며, 대부분의 경우에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다. 반복된 생체 외 선별과정은 임의의 RNA 라이브러리로부터 특이적인 RNA 분자, 즉 앱타머의 선별이 가능하도록 하는데 (A.D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346: 818-822, 1990; C. Tuerk and L. Gold, Science 249: 505-510, 1990) RNA 라이브러리의 사이즈가 크고(1014-1015) 생체 외 효소 작용에 의해 RNA 분자를 생성하기 쉽기 때문에 RNA 라이브러리는 고 친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리보다 우수하다(E. N. Brody and L. Gold, Rev. Mol. Biotechnol. 74: 5-13, 2000).
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 IL-8에 결합하고 IL-8로 유도되는 기능을 억제하는 RNA 앱타머를 선별하기 위하여 RNA 라이브러리를 이용하여 SELEX를 수행하였고, 그 결과 서열 유사성에 따라 5개의 군으로 나뉘는 15개의 서열을 선별하였다(도 1B 참조). 또한 상기 선별된 RNA 풀은 RNA 라이브러리에 비하여 IL-8에 대한 결합력이 19배 정도 높았으며(도 1A 참조), 그 중 8A-W(서열번호 16)가 IL-8에 특이적으로 결합하며, 다른 CXC-케모카인인 GRO-α 및 GRO-β에는 결합하지 않는 것을 확인하였다(도 1C 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 8A-W(서열번호 16)를 주형으로 이의 잘라진 형태의 앱타머를 제작하였다. PCR을 수행하여 8A-1F1R, 8A-2F1R, 8A-2F2R, 8A-44(서열번호 23)를 제작한 후, 8A-44(서열번호 23)를 주형으로 다시 PCR을 수행하여 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)의 절단된 형태(truncated form) RNA 앱타머를 추가적으로 제작하였으며, 이의 2차원 구조를 M 폴드 프로그램(M fold program)을 이용하여 예상하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 수득된 절단된 형태의 앱타머 중 8A-W(서열번호 16), 8A-1F1R 및 8A-44(서열번호 23) 처리에 의해 호중구(neutrophil)의 이동이 농도-의존적으로 감소하였으나, 8A-2F2R 또는 8A-2F1R에 의해서는 영향을 받지 않음을 확인하였다(도 3 참조).
아울러, 상기 결과에서 8A-44(서열번호 23)가 IL-8에 결합하기 충분하고, IL-8의 기능을 억제하는 것을 확인하였다. 8A-44(서열번호 23)는 대조군과 비교하여 IL-8에 높은 결합력으로 결합하였지만, 반면에 빠른 속도로 분리되는 것을 확인하였다(도 4 및 표 1 참조).
또한, 본 발명자들은 8A-44(서열번호 23)가 대조군과 비교하여 농도-의존적으로 IL-8 유도된 호중구의 이동을 억제하고(도 5A 참조), 높은 농도에서 IL-8 유도된 ERK 활성도 억제하는 것을 확인하였다(도 5B 참조).
또한, IL-8에 의해 유도된 구강암 세포주의 침입이 8A-44(서열번호 23)의 농도-의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 6 참조). 상기 결과는 8A-44(서열번호 23)가 정제된 IL-8 및 자연적으로 분비된 세포-유래 IL-8에 결합할 수 있고, 이의 기능을 억제함을 나타낸다.
또한, 절단된 형태인 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)의 IL-8에 대한 결합력을 확인한 결과, 8A-44(서열번호 23)와 비교하였을 때, 8A-35(서열번호 24)는 더욱 강한 결합력으로 IL-8에 결합하였으나, 8A-30(서열번호 25)는 조금 약한 결합력을 나타내었다(도 7 및 표 2 참조).
또한, 8A-44(서열번호 23) 및 이의 절단된 형태인 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)이 IL-8의 기능을 억제함으로써, 호중구에서의 이동, ERK 및 Akt 신호활성, 및 Ca2+ 가동화(mobilization)를 농도-의존적으로 억제함을 확인하였다(도 8A, 8B 및 도 9 참조).
따라서, 본 발명의 앱타머들은 인간 IL-8에 결합하여 IL-8에 의해 유도된 세포 내 신호전달 경로를 유의적으로 억제함으로써, IL-8 유도되는 암 및 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 암 또는 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 앱타머는 IL-8에 결합하여 IL-8로 유도되는 기능을 억제하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 앱타머의 구조는 하나의 주요 줄기(main stem) 및 고리(loop) 구조로 구성되어 있는 것이 바람직하나, 본 발명의 앱타머의 서열을 포함하고 있다면 모두 사용가능하다.
또한, 상기 앱타머는 RNaseA 저항성을 갖도록 하기 위하여, CTP 및 UTP를 대신하여 2'-F-dCTP 및 2'-F-dUTP를 사용하여 2'-플루오르-피리미딘-변형된(2'-Fluoro-pyrimidine-modified) RNA 라이브러리를 SELEX에 수행하는데 사용하였으나 이에 한정하지 않으며, RNaseA 저항성을 갖게 하기 위한 방법이라면 당업계에 널리 알려진 방법은 모두 사용가능하다.
또한, 상기 앱타머는 하기의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
뉴클레오티드 내 당구조의 2' 탄소위치에서 -OH기가 -Me(메틸), -OMe, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸-O-프로필, -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형;
뉴클레오티드 내 당구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 및
뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노 포스페이트(borano phosphophate) 또는 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형을 포함한다.
아울러, 본 발명은 본발명의 RNA 앱타머와 생체 적합성(biocompatibility)을 가지는 거대 고분자 물질이 접합된 앱타머-복합체를 제공하나 이에 한정하지 않고. 상기 거대 고분자 물질은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 디아실글리세롤(DAG) 또는 단클론항체(monoclonal antibody)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명은 본 발명의 RNA 앱타머fmf 포함하는 암 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 IL-8 과발현으로 유도되는 구강암 및 피부암인 것이 바람직하고, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 구강암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
아울러, 상기 염증성 질환은 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 RNA 앱타머를 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 RNA 앱타머에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하고, 국부적 면역억제 치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 신경보호를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 시험관 내에서 IL-8에 대한 RNA 앱타머의 선별, 복제 및 서열확인
<1-1> SELEX를 이용한 RNA 앱타머 선별
사람 IL-8에 대한 RNaseA-저항성(RNaseA-resistant) RNA 앱타머를 수득하기 위하여, CTP 및 UTP를 대신해 2'-F-dCTP 및 2'-F-dUTP를 각각 사용하여 SELEX를 수행하였다.
구체적으로, 고정된 링커부위(linker region), T7 프로모터(promoter) 및 제한효소위치(restriction enzyme site)가 옆에 배치된, 40개의 무작위 단일-가닥 DNA 라이브러리(randomized single-stranded DNA library)를 같은몰(equimolar)의 dNTP 혼합체(mix)와 혼합하고, 0.25 uM의 5'- 및 3'- 프라이머를 각각 첨가한 후, 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 10회(10 cycle) 수행하여 이중-가닥(double-stranded) DNA로 전환하였다. 상기 5'- 및 3'- 프라이머는 하기의 서열로 바이오니아(대전, 대한민국)에서 합성되었다.
DNA 라이브러리(N40, 40 무작위 뉴클레오티드 서열): 5'-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCCN40CATAACCCAGAGGTCGATGGATCCCCCC-3',
5'-프라이머(서열번호 1): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3', 및
3'-프라이머(서열번호 2): 5'-GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3.
SELEX를 위한 시작물질(starting material)인 늘어난 상기 40개의 무작위 뉴클레오티드를 포함하는 2'-플루오르-피리미딘-변형된 RNA 라이브러리(2'-fluoro-pyrimidine-modified RNA library)는 두라스크리브 T7 전사 키트[DuraScribe T7 Transcription Kit, 에피센터 바이오테크놀로지(Epicentre Biotechnologise), 매디슨, WI, 미국)의 제조사의 설명서(manufacturer's instructions)에 따라, 상기 PCR 결과 산물을 시험관 내에서 전사과정을 통해 제작하였다. 상기 전사반응은 T7 프로모터를 갖는 0.2 ug의 이중-가닥 DNA 주형, 5 mM ATP, 5 mM GTP, 5mM 2'-F-dCTP, 5 mM 2'-F-dUTP, 10 mM DTT 및 1 ul 두라스크리브 T7 효소 혼합체(DuraScribe T7 enzyme mix)를 포함하는 20 ul 두라스크리브 T7 반응 용액(DuraScribe T7 reaction buffer)을 37℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그리고나서, 상기 혼합체에 DNase I(에피센터 바이오테크놀로지)을 37℃에서 15분 동안 처리한 후, 8% 아크릴아마이드(acrylamide)/7 M 우레아(urea) 겔(gel)에서 전기영동으로 분리된 RNA를 페놀(phenol)/클로로포름(chloroform) 추출(extraction), 에탄올 침전(precipitation) 및 용출 완충액(elution buffer)[500 mM 초산 암모늄(ammonium acetate), 1 mM EDTA, 0.2%(w/v), 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS), pH0.7]으로 용출하여 재수득하였다. 각각의 SELEX 회(cycle)을 위한 라이브러리 RNA 풀(pool) 또는 RNA 풀은 His-GRO-α, His-GRO-β, 또는 자성 비드(magnetic bead)에 결합하는 RNA를 제거하기 위하여, 200 ul 결합 완충액(binding buffer)[30 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 및 1% BSA]에 200 nM 재조합 사람 His-GRO-α 또는 His-GRO-β 단백질 및 10 ul MagneHis Ni 입자(particles)(프로메가, 매디슨, WI, 미국)와 함께 실온에서 30분 동안 교반하여(shaking) 전처리하였다. 전처리된 RNA 풀은 100 nM His-IL-8 단백질[펠단(feldan)]과 결합 측정법(binding assay)을 수행하기 위하여, 실온에서 30분간 교반 반응시켰고, 이때 생성된 RNA-IL-8 복합체는 비드와 침전물을 형성한다. 상기 형성된 침전물은 결합 완충액으로 4번 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 200 ug/ml 단백질 가수분해효소 K(proteinase K)를 처리하여, IL-8 단백질에 결합한 RNA를 용출하였다. 상기 재수득된 RNA는 RT-PCR을 통해 증폭되고, 다음 SELEX를 수행하기 위한 RNA 풀을 생성하기 위하여 시험관 내에서 전사되었다. His-IL-8의 농도는 보다 엄격한 조건을 위해 매 5회마다 2배씩 감소하였고, 15회를 이어서 수행한 후, 선택된 RNA는 RT-PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물은 pcDNA3(인비트로젠, 칼스배드, CA, 미국)에 복제한 후, 대장균(DH5α)으로 형질전환하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 15개의 IL-8-특이적 RNA를 수득하였고(서열번호 11 내지 21), 상기 수득된 RNA 풀의 IL-8-특이적 결합 측정결과, SELEX를 수행하기 전의 RNA 라이브러리에 비해서 약 19배 정도 높은 결합력을 나타내는 것을 확인하였고(도 1A), 또한, 도 1B에 나타난 바와 같이 상기 수득된 RNA는 서열 유사성에 따라서 몇 개의 군으로 나뉘었다(도 1B).
<1-2> 방사선 표지된 RNA 결합 측정법을 이용한 IL-8과 결합력 확인
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 앱타머가 IL-8과 특이적으로 높은 결합력을 갖는지 확인하기 위하여, 방사선 표지된 RNA 결합 측정법을 수행하였다.
구체적으로, 1 ug RNA를 20 U CIAP[타카라(TaKaRa), 도쿄, 일본]와 함께 37℃에서 30분간 처리하여 탈인산화 시키고, 상기 탈인산화된 RNA는 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 용출로 정제하였다. 정제된 RNA를 10 U T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(T4 polynucleotide kinase)로 37℃에서 30분간 처리하여, 32P-표지된 γ-ATP[펄킨엘머(PerkinElmer), 월섬(Waltham), MA, USA]로 인산화시켰다. 그 후, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 결합 측정법을 수행하는데, 이때, 50 nM 라이브러리 및 IL-8-특이적 RNA(표지되지 않은 것:표지된 것 = 10:1)를 25 nM His-GRO-α, His-GRO-β, 또는 His-IL-8 단백질 및 10 ul 자성 Ni 입자를 포함하는 200 ul 결합 완충액으로 수행하였다. 단백질 가수분해효소 K로 용출된, IL-8 결합하는 RNA는 β-신틸레이션 계수기(scintillation counter, 베크만, 콜터, CA, 미국)를 사용하여 분당계수율(counter per minute, cpm)을 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 1C에 나타난 바와 같이, #8 앱타머가 특이적으로 His-IL-8에 결합하고, 다른 CXC-케모카인(chemokine)인 His-GRO-α 및 His-GRO-β에는 결합하지 않음을 확인하였다(도 1C). 따라서, 본 발명의 상기 #8 앱타머를 8A-W(서열번호 16)로 명명하였다.
<1-3> IL-8에 특이적으로 결합하는 앱타머의 잘라진 형태(truncated form) 제작
IL-8에 결합하여 이의 기능을 억제하는 최소 서열을 확인하기 위하여, IL-8 8A-W(서열번호 16)를 5'말단 및 3'말단에서부터 연속적으로 잘라내고자 하였다(serially truncate). 이를 위하여, 하기 1F(서열번호 3), 1R(서열번호 4), 2F(서열번호 5) 및 2R(서열번호 6)의 프라이머를 조합하여 당업계에 널리 알려진 방법으로 PCR을 수행하여 4 종류의 잘라진 PCR 산물을 수득하였다[8A-1F1R, 8A-2F2R, 8A-2F1R, 8A-44(8A-1F2R, 서열번호 23)]. 또한 프라이머 35F(서열번호 7)/35R(서열번호 8) 및 30F(서열번호 9)/30R(서열번호 10)을 사용하여 상기 8A-44(8A-1F2R), 서열번호23)으로부터 잘라진 산물 8A-35(서열번호 24), 및 8A-30(서열번호 25)을 추가적으로 수득하였다.
이때, 하기의 프라이머가 PCR에 사용되었다:
1F(서열번호 3): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGGGCTTATCATTCCATTTAGTG-3',
1R(서열번호 4): 5'-GGGTTATGTCTGATGGGAAG-3',
2F(서열번호 5): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTCCATTTAGTGTTATGATAACC-3',
2R(서열번호 6): 5'-TGATGGGAAGGTTATCATAAC-3',
35F(서열번호 7): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGGGCTTATCATTCCATTTAGT-3',
35R(서열번호 8): 5'-GGTTATCATAACACTAAATGGAATGATAAGCCC-3',
30F(서열번호 9): 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTATCATTCCATTTAGTGTTA-3', 및
30R(서열번호 10): 5'-TTATCATAACACTAAATGGAATGATAACC-3'.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 전체 서열의 RNA 및 이의 잘라진 RNA의 2차원 구조(secondary structure)는 M 폴드 프로그램(M fold program, http://mfold.rna.albany.edu/?=mfold)을 이용하여 예상하였다. 8A-W(서열번호 16)는 4개의 줄기(stem)/고리(loop)로 구성되어 있고, 8A-1F1R 및 8A-44(8A-1F2R, ㅅ)는 주형인 8A-W(서열번호 16)의 가장 긴 주요 줄기/고리 부분이 남아있는 형태였다. 그러나, 8A-2F1R 및 8A-2F2R의 경우 주형인 8A-W와 전혀 다른 형태를 나타내었고, 따라서, 8A-W(서열번호 16)의 가장 긴 주요 줄기/고리 구조가 IL-8에 결합하는데 주요한 부분이라고 예측하였다.
<실시예 2> 8A-44(서열번호 23)가 IL-8로 유도된 호중구 이동(migration) 및 ERK 인산화 억제
<2-1> 사람 혈액에서 호중구의 분리
히스토파케(Histopaque, 시그마 알드리치, 세인트루이스, MO, 미국)를 이용한 밀도 기울기 분리법(density gradient method)으로 전체 사람 혈액에서 호중구를 분리하였다.
구체적으로, 정맥혈(venous blood)을 같은 양의 히스토파케 용액 위에 조심스럽게 쌓아 올리고, 실온에서 1,500 rpm에서 30분 동안 원심분리 후, 호중구 막(적혈구 및 히스토파케 사이의 흰 막)을 모았다. 호중구 막에서 적혈구를 제거하기 위하여, 저삼투압의 용해(hypotonic lysis)가 수행되었다. 우선, 30 ml의 증류수를 첨가하여 부드럽게 피펫팅(pipetting)한 후, 상기 호중구 막에 최종 양이 10 ml이 되도록 PBS를 첨가하였다. 1분 후, 상기 용액에 10 ml 4% NaCl을 첨가하여 잘 섞고, 실온에서 1,200 rpm으로 7분간 원심분리를 수행하였다. 호중구를 수득하기 위해, RPMI1640 배지(웰진, 대구, 대한민국)로 세척하고, 10% FBS가 첨가된 RPMI1640 배지를 이용하여 플레이트에 배양하였다.
<2-2> 호중구 이동 측정(migration assay)
<실시예 1>의 방법으로 제조된 IL-8에 특이적으로 결합하는 앱타머가 IL-8의 기능을 억제하는지 확인하기 위해서 호중구 이동 측정법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 수득한 다양한 농도의 RNA 앱타머 및 100 ng/ml IL-8(R&D 시스템)을 실온에서 30분간 무혈청 RPMI 1640 배지에 첨가하여 교반하며 전처리하였고, 상기 <2-1>의 방법으로 배양한 호중구를 모아서 무혈청 RPMI 1640 배지에 현탁하였다. 각각 웰의 아래 부분에 상기 IL-8 RNA 앱타머 혼합물을 넣고, 2 × 106 세포를 트랜스웰 삽입(transwell insert) 부분에 두었다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 삽입 부분을 챔버(chamber)에서 제거하고, 각각 아래 웰에 WST-1(다카라)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 호중구의 이동은 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 샘플 내 포마잔(formazan)의 빛 흡수력(absorbance)을 측정함으로써 평가하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 IL-8-유도된 호중구 이동이 8A-W(서열번호 16), 8A-1F1R, 또는 8A-1F2R(8A-44, 서열번호 23) 처리에 의해서 농도-의존적으로 감소하였으나, 8A-2F2R 또는 8A-2F1R에 의해서는 영향을 받지 않음을 확인하였다. 상기 결과를 바탕으로 21 - 66 뉴클레오티드의 서열(8A-44, 서열번호 23)을 갖는 IL-8에 특이적으로 결합하는 앱타머가 IL-8에 결합하기 충분하고, IL-8 활성을 억제한다는 것을 확인하였다.
<2-3> IL-8에 대하여 8A-44(서열번호 23) 앱타머의 결합력 확인
상기 실시예 <2-2>의 결과에서 IL-8에 결합하기 충분한 21 - 66 뉴클레오티드 서열의 44머로 구성된 8A-44(8A-1F2R, 서열번호 23)의 IL-8에 대한 결합력을 확인하기 위하여, 음성대조군으로 8A-44(서열번호 23)의 상보적인 서열(8A-44COM, 서열번호 26))을 사용하였고, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 기술을 사용하는 ProteOn XPR36 검정법(바이오래드 라보래터리, 허쿨레스, CA, 미국)을 통해 IL-8에 대한 결합력을 측정하였다.
구체적으로, 상기 검정법은 기존의 방법에 조금 변화를 주어 사용되었다. 10 mM 아세트산 나트륨 완충액(sodium acetate buffer, pH 8.0)에 His-표지된 IL-8 단백질을 1 uM이 되도록 첨가하고, 아민 결합(amine coupling) 원리에 의해 GLM 센서 칩(sensor chip) 위에 고정되도록 유속 30 ul/ml로 5분 동안 흘려주었다. 1 M 에탄올아민(ethanolamine)으로 칩 표면이 불활성화된 후, PBST 러닝완충액(running buffer)[10 mM 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.4), 150 mM NaCl, 및 0.005% 트윈(Tween) 20]으로 희석된 각각의 8A-44(서열번호 23) 앱타머를 20, 10, 5, 2, 1, 및 0 nM의 농도로 100 ul/ml의 유속으로 1분 동안 수직으로 흘려주었다. 분리(dissociation)는 10분 동안 관찰하였고, 앱타머를 흘려주기 전에 재생기(regenerator)로 12.5 mM NaHO를 흘려주었다. 모든 상호결합 센서그램(sensorgrams)은 ProteOn 매니저 소프트웨어를 이용하여 수집, 가공 및 분석하였고, 채널 참조(channel reference)[인터스팟(interspot)]- 및 이중 참조(double reference)[0 nM, 빈칸(blank)]- 빠진(subtracted) 센서그램은 간단하게 1:1 랑뮈에 모델(Langmuir model)에 맞춰졌고, 결합(association, k a ) 및 분리(dissociation, k d ) 상수(constant)는 군으로 된 파라미터(parameters)에 맞춰졌다. 해리 평형상수(equilibrium dissociation constants, K D )는 하기의 <수학식 1>에 의해 계산되었다. 모든 센서그램의 R최대(Rmax)는 200 공명단위(resonance units, RUs) 미만이고, 반면에 계산된 각 앱타머의 χ2 값은 약 5 RU이다.
그 결과, 도 4 및 표 1에 나타난 바와 같이, IL-8에 대한 8A-44(서열번호 23)의 K D 값이 5.15 nM로 높은 결합력을 보였으나, 높은 k d 값(2.73 × 10-2s-1) 때문에 결합된 8A-44(서열번호 23)는 빠른 속도로 분리되었다. 대조군인 8A-44COM(서열변호8A0-44(서열번호 26)은 IL-8에 결합하지 않았다(결과는 나타내지 않음).
표 1
파라메터 k a k d K D
단위 1/Ms 1/s M
8A-44 5.30 × 106 2.73 × 10-2 5.15 × 10-9
<2-4> 8A-44(서열번호 23) 앱타머의, IL-8 유도된 호중구의 이동 및 ERK 인산화 억제 효과 확인
8A-44(서열번호 23) 앱타머가 IL-8로 유도된 호중구 이동을 억제하는지 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법을 사용하여 확인하였고, 또한 8A-44(서열번호 23)가 호중구에서 ERK 인산화를 억제하는지 확인하기 위하여 웨스턴 블랏(western blot)을 수행하였다.
구체적으로, 1 내지 1000 nM의 8A-44(서열번호 23)와 100 ng/ml IL-8을 전처리하고, 호중구는 상기 실시예 <2-2>의 호중구 준비 방법에 따라 준비한다. 2 × 106 cells/ml의 호중구에 RNA-IL-8 혼합물을 첨가하고, 실온에서 2분 30초간 인산화 반응을 시킨다. 상기 인산화 반응은 SDS 샘플 완충액(sample buffer)를 첨가하여 반응을 멈추고, 상기 혼합물은 항-인산-p44/42 MAPK(anti-phospho-p44/42)(p-ERK1/2), p44/42 MAPK(ERK1/2), 인산-Akt, Akt(셀 시그날링 테크놀로지, 댄버, MA, 미국), 및 β-액틴(β-actin) 항체(산타크루즈 바이오테크놀러지, 산타크루즈, CA, 미국)를 이용하여 당업계에 잘 알려진 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, IL-8에 의해 유도된 호중구의 이동이 8A-44(서열번호 23) 처리에 의해 농도-의존적으로 유의적인 감소를 보였으나, 대조군인 8A-44COM(서열번호 26)은 아무런 영향을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 또한, 도 5B에 나타난 바와 같이, 8A-44(서열번호 23)가 8A-44COM(서열번호 26)과는 대조적으로 높은 농도에서 IL-8에 의해 유도된 ERK 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 8A-44(서열번호 23)가 인간 IL-8에 특이적으로 결합하여 IL-8에 의해 유도되는 세포 내 신호전달(intracellular signaling)을 억제함을 나타낸다.
<실시예 3> 8A-44(서열번호 23) 앱타머의 암 세포-유래 IL-8에 의해 유도된 구강 세포주의 침입(invasion) 억제
공지된 바에 의하면 침윤성 구강암(invasive oral cancer) 환자에게서 IL-8의 수준이 증가하는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 8A-44(서열번호 23)가 IL-8을 억제함으로써, IL-8에 의해 유도된 구강암 세포의 침입을 억제할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 인간 구강암 세포주 HSC-3 및 686-LN-e는 DMEM 배지(웰진)에 10% FBS(서모 피셔 사이언디픽, 월섬, 미국)를 첨가하여, 37℃, 5% CO2의 조건하에 배양하였다. 또한, 칩입 검증법은 8.0 um 구멍 필터(pore filter)(코스타)를 갖는 6.5 mm 트랜스웰 챔버에서 수행하였다. 안쪽의 필터는 1 mg/ml 차가운 성장 인자-감소된 매트리겔 매트릭스(ice-cold growth factor-reduced Matrigel matrix, BD 바이오사이언스, 프랭클린 레이크, NJ, 미국)으로 미리 가공하였고, 그리고나서 37℃에서 하룻밤 동안 두어 고체화하였다. 0.1, 1 및 5 uM 농도의 8A-44(서열번호 23) 앱타머 또는 1000 ng/ml IL-8 중화항체(neutralizing antibody)를 구강암 세포주(HSC-3 및 686-LN-e)에서 얻은 배지(conditioned media)와 함께 실온에서 섞어주며 30분간 전처리하였고, 구강암 세포주에 트립신 처리하여 세포주만 수득한 후, 무혈청 DMEM에 재현탁하였다. 상기 배지 안의 8A-44(서열번호 23) 앱타머는 각 웰의 아랫부분에 두었고, 각각의 트랜스웰 삽입부분(Transwell insert)에 1 × 105 cells을 분주하였다. 37℃에서 24시간 동안 반응한 후, Diff-Quick 용액(시스맥스, 고베, 일본)으로 삽입부분을 고정하고 염색하였다. 염색된 세포들은 위상차 현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)으로 촬영하였으며, 5군데의 현미경 시야(microscope field) 세포 수를 세었다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, HSC-3 및 686-LN-e 세포주의 배지-유도된 침입이 8A-44(서열번호 23) 앱타머의 농도 의존적으로 유의적인 감소를 보였고, 반면에 8A-44COM(서열번호 26)은 어떠한 영향도 미치지 않았다. 상기 결과는 8A-44(서열번호 23) 앱타머가 정제된 IL-8 및 자연적으로 분비된 세포-유래된 IL-8에 결합할 수 있으며, 이의 기능을 억제함을 나타낸다.
<실시예 4> 절단 돌연변이(truncated mutation) 8A-30(서열번호 24) 및 8A-35(서열번호 25) 앱타머의 IL-8에 대한 결합력 확인
상기 결과에 의해서 8A-44(서열번호 23)는 IL-8과 특이적으로 결합하여 이의 기능을 억제하기에 충분한 서열이 포함되었음을 확인하였고, 이에 IL-8과 결합하여 이의 기능을 억제하는 최소한의 올리고뉴클레오티드를 확인하였다. 이를 위하여 8A-44(서열번호 23)의 절단된 형태인 8A-35(35머, 서열번호 24) 및 8A-30(30머, 서열번호 25)가 사용되었다. 8A-35(서열번호 24)는 8A-44(서열번호 23)의 3' 말단에서부터 9개의 뉴클레오티드가 절단된 형태고, 8A-30(서열번호 25)는 8A-35(서열번호 24)에서 5' 말단에서부터 3개 및 3' 말단에서부터 2개의 뉴클레오티드가 절단된 형태이며, 상기 두 앱타머 모두 주요 줄기(stem)/고리(loop) 구조는 보존되어 있다. 상기 두 앱타머를 이용하여 실시예 <2-3>의 방법을 사용하여, IL-8에 높은 결합력으로 결합하는지 확인하였다.
그 결과, 도 7및 표 2에 나타난 바와 같이, 8A-35(서열번호 24)의 k a 값은 8A-44(서열번호 23)와 비슷하게 1.71 × 106M-1s-1이었으나, k d 값은 8A-44(서열번호 23)와 비교하여 약 300배 감소한 7.92 × 10-5s-1을 나타내어, 8A-35(서열번호 24)가 IL-8에 K D 값 46.3 pM으로 강하게 결합함을 나타낸다. 또한, 8A-30(서열번호 25)의 k a 및 k d 값은 각각 4.31 × 106M-1s-1 및 5.79 × 10-2s-1을 나타내어, 13.5 nM의 K D 값을 갖고, 이는 8A-44(서열번호 23)와 비교했을 때, 약간의 변화를 나타내었다.
표 2
파라메터 k a k d K D
단위 1/Ms 1/s M
8A-35 1.71 × 106 7.92 × 10-5 4.63 × 10-9
8A-30 4.31 × 106 5.79 × 10-2 1.35 × 10-8
<실시예 5> 8A-44(서열번호 23), 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)가 호중구의 이동, ERK 및 Akt 신호 활성, 및 Ca 2+ 가동화(mobilization) 억제
상기 절단된 형태의 앱타머들이 IL-8 억제효과를 유지하는지 확인하기 위하여, ×상기 실시예 <2-2> 및 <2-4>의 방법을 이용하여 IL-8로 유도된 호중구의 이동 및 ERK 활성 억제를 확인하였고, 또한 호중구에서 Ca2+ 가동화(mobilization)를 억제하는지 확인하였다.
구체적으로, 형광 Ca2+ 지표(indicator)와 함께 배양된 호중구에 있어서 Ca2+ 가동화의 측정은 분광형광 광도계(spectrofluorophotometer, RF-5301PC; 시마즈, 교토, 일본)를 사용하였다. 바로 분리된 호중구를 무혈청 RPMI 1640 배지에 4 uM 푸라-2(fura-2) AM를 첨가하여 37℃에서 40분간 교반 반응시키고, 3번 세척한 후, 무혈청 RPMI 1640 배지에 재현탁 하였다. 2-푸라 AM을 반응시키는 동안, IL-8 및 본 발명의 앱타머[CTL, 8A-44(서열번호 23), 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)]는 상온에서 30분간 전처리하였다. 푸라-2 AM이 첨가된 세포주는 8 × 105 cells의 밀도로 Ca2+가 없는 록케 용액(Locke's solution)[154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5 mM HEPES(pH 7.3), 10 mM 글루코스, 및 0.2 mM EGTA]에 재현탁되어, IL-8(20 ng/ml) 및 앱타머(2, 20nM)의 혼합체와 전처리하였다. 형광비율(fluorescence ration)의 변화(340/380 nm)는 340 nm 및 380 nm의 이중의 흥분파장(dual excitation wavelength) 및 500 nm의 방출파장(emission wavelength)으로 확인되었다.
그 결과, 도 8A에 나타난 바와 같이, 8A-35(서열번호 24) 및 8A-30(서열번호 25)의 IL-8-유도된 호중구 이동억제는 8A-44(서열번호 23)와 같이 농도-의존적이었다. 또한, 도 8B에 나타난 바와 같이, IL-8-유도된 ERK 및 Akt 신호전달의 억제능력 또한 농도-의존적으로 8A-35(서열번호 25) 및 8A-30(서열번호 26)에 의해서 억제되었다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 8A-44(서열번호 24), 8A-35(서열번호 25) 및 8A-30(서열번호 26)을 처리하였을 때, 농도-의존적으로 IL-8-유도된 세포 내 Ca2+ 가동화가 감소하고, 특히 8A-35(서열번호 26)는 낮은 농도인 20 nM에서도 완전하게 Ca2+ 가동화를 차단하였다. 상기 결과는 8A-44(서열번호 24), 8A-35(서열번호 25) 및 8A-30(서열번호 26)이 인간 IL-8에 결합하여 IL-8-유도된 세포 내 신호전달 경로(pathway)를 효과적으로 억제함을 나타낸다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 RNA 앱타머 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 RNA 앱타머 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 RNA 앱타머 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
본 발명의 RNA 앱타머 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
본 발명의 RNA 앱타머 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<제조예 2> 주사액제의 제조방법
본 발명의 RNA 앱타머 100 nM을 유효성분으로 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘 또는 5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘ㆍ염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
본 발명의 RNA 앱타머 5 ㎍(100nM)
5‘-클로로-3,2’-디하이드록시찰콘, 또는
5‘-클로로-2,3’-디하이드록시찰콘ㆍ염산염 1 g
염화나트륨 0.6 g
아스코르브산 0.1 g
증류수 정량

Claims (12)

  1. IL-8(interleukin-8)에 특이적으로 결합하는 30개의 RNA로 이루어진 RNA 앱타머로서, 상기 앱타머의 5'말단으로부터 4번째 내지 30번째 염기는 서열번호 22의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
  2. IL-8에 특이적으로 결합하는 35개의 RNA로 이루어진 RNA 앱타머로서, 상기 앱타머의 5'말단으로부터 7번째 내지 30번째 염기는 서열번호 22의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
  3. IL-8에 특이적으로 결합하는 44개의 RNA로 이루어진 RNA 앱타머로서, 상기 앱타머의 5'말단으로부터 7번째 내지 30번째 염기는 서열번호 22의 염기로 이루어지고, 1번째 내지 6번째 염기 및 30번째 내지 44번째 염기는 각각 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열, 및 이와 80% 이상 상보적인 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
  4. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 IL-8에 결합하여 IL-8로 유도되는 기능을 억제하는 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
  5. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 하나의 주요 줄기(main stem) 및 하나의 고리(loop) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
  6. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 RNaseA 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머.
  7. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 하기의 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 앱타머:
    뉴클레오티드 내 당구조의 2' 탄소위치에서 -OH기가 -Me(메틸), -OMe, -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸-O-프로필, -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형;
    뉴클레오티드 내 당구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 및
    뉴클레오티드간 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노 포스페이트(borano phosphophate) 또는 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 선택되는 어느 한 항에 따른 RNA 앱타머와 생체 적합성(biocompatibility)을 가지는 거대 고분자 물질이 접합된 앱타머-복합체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 거대 고분자 물질은 폴리에틸렌글리콜(PEG),디아실글리세롤(DAG) 또는 단클론항체(monoclonal antibody)인 것을 특징으로 하는 앱타머-복합체.
  10. 제 1항 내지 제 3항의 앱타머를 포함하는 암 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 암은 IL-8 과발현으로 유도되는 구강암 및 피부암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 아토피, 건선, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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