WO2014136768A1 - Ｐｒｓｖ抵抗性キュウリ植物、ならびにｐｒｓｖ抵抗性およびｚｙｍｖ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法 - Google Patents

Ｐｒｓｖ抵抗性キュウリ植物、ならびにｐｒｓｖ抵抗性およびｚｙｍｖ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法 Download PDF

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WO2014136768A1
WO2014136768A1 PCT/JP2014/055458 JP2014055458W WO2014136768A1 WO 2014136768 A1 WO2014136768 A1 WO 2014136768A1 JP 2014055458 W JP2014055458 W JP 2014055458W WO 2014136768 A1 WO2014136768 A1 WO 2014136768A1
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WO
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prsv
base sequence
resistance
zymv
resistant
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PCT/JP2014/055458
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清史 堀井
久紀 新
龍平 有本
前田　大輔
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タキイ種苗株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance

Definitions

  • the present invention relates to a PRSV resistant cucumber plant and a method for producing a cucumber plant exhibiting PRSV resistance and ZYMV resistance.
  • ZYMV zucchini yellow mosaic virus
  • PRSV papaya ringspot virus
  • Non-patent Documents 1 and 2 the ZYMV and PRSV-watermelon systems (papaya ringspot virus type W; PRSV-W) cause acute wilt when infecting cucumber plants.
  • PRSV-W the ZYMV and PRSV-watermelon systems
  • the damage is enormous, and the economic loss of the damage caused by both viruses is said to be about 5 billion yen or more per year in the cucumber plant production areas throughout the country.
  • there is a problem that no drug effective against these plant viruses has been reported. Therefore, as an alternative, it is necessary to control the aphids that are the vectors of the virus or inoculate young seedlings with attenuated viruses. (Patent Document 1 and Non-Patent Documents 3 and 4).
  • TMG-1 and Dina-1 are known as cucumber plant lines having ZYMV resistance
  • TMG-1, Dina-1 are known as cucumber plant lines having PRSV-W resistance
  • -1 and Surinam are known.
  • the ZYMV resistance of TMG-1 and Dina-1 is controlled by one recessive gene (Non-patent Document 5).
  • the ZYMV resistance genes possessed by TMG-1 and Dina-1 are present at the same locus or very close loci (Non-patent Document 6).
  • the cucumber plant ZYMV resistance gene sits within 2.2 cM between the two markers of chromosome 6 (Non-patent Document 7).
  • Non-patent Document 8 the PRSV resistance gene and the ZYMV resistance gene possessed by TMG-1 are close to each other (2.2 cM), and one AFLP marker (at 5.2 cM from the ZYMV resistance gene) ( E15 / M47-F-197) is known (Non-patent Document 8).
  • an object of the present invention is to provide a new PRSV-resistant cucumber plant and a method for producing a cucumber plant exhibiting PRSV resistance and ZYMV resistance using the same.
  • the PRSV resistant cucumber plant of the present invention has a PRSV resistant locus on chromosome 6, and the PRSV resistant locus is represented by the following (A1), (A2) or ( It has a base sequence of A3).
  • A1 Base sequence of SEQ ID NO: 1 (A2) The 25th A in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is conserved, and is a base sequence having an identity of 80% or more and a base exhibiting PRSV resistance Sequence (A3) is a nucleotide sequence in which the 25th A in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is conserved and one or several nucleotides in the nucleotide sequence are deleted, substituted, inserted and / or added, and has PRSV resistance Base sequence indicating
  • the method for producing a cucumber plant exhibiting PRSV resistance and ZYMV resistance comprises the following steps (a) and (b).
  • the PRSV-resistant cucumber plant of the present invention a cucumber plant exhibiting excellent resistance to both PRSV and ZYMV by crossing with a ZYMV-resistant cucumber plant as well as PRSV resistance. Obtainable. As a result, it is possible to greatly reduce the labor and cost associated with the reduction in yield due to the infection with PRSV and ZYMV and the elimination of the mediator, and it is possible to provide a cucumber plant suitable for consumer needs.
  • Example of this invention it is a photograph which shows the evaluation criteria of the disease severity of PRSV.
  • PRSV-resistant cucumber plant of the present invention has a PRSV-resistant locus on chromosome 6 as described above, and the PRSV-resistant locus is the following (A1), It has a base sequence of (A2) or (A3).
  • A1 Base sequence of SEQ ID NO: 1
  • A2 The 25th A in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is conserved, and is a base sequence having an identity of 80% or more and a base exhibiting PRSV resistance Sequence
  • A3 is a nucleotide sequence in which the 25th A in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is conserved and one or several nucleotides in the nucleotide sequence are deleted, substituted, inserted and / or added, and has PRSV resistance Base sequence indicating
  • the “cucumber plant” is Cucumis sativus L.
  • the variety of the cucumber plant is not particularly limited, and may be any type of cucumber such as short white wart, four-leaf, British greenhouse type, sliced type, bait alpha type, etc., but the short white wart type cucumber is preferable.
  • PRSV resistant cucumber plant of the present invention is resistant to PRSV.
  • PRSV is not particularly limited, and examples include PRSV-W (Type W) and PRSV-P (Type P).
  • PRSV resistance is also referred to as “PRSV resistance”, for example.
  • the resistance means, for example, the ability to inhibit or suppress the occurrence and progression of a disease caused by PRSV infection, and specifically, for example, the occurrence of no disease, the stop of the progression of a disease that has occurred, and the disease that has occurred Any of suppression of progression (also referred to as inhibition) or the like may be used.
  • Non-occurrence of disease, stoppage and suppression of progression for example, may be due to suppression of PRSV infection itself to cells, may be due to suppression of proliferation of PRSV in infected cells, or from infected cells to other cells It may be due to suppression of PRSV infection (also referred to as diffusion).
  • the PRSV resistance is brought about by the PRSV resistance locus on chromosome 6.
  • the PRSV resistance locus means a quantitative trait locus or gene region that provides PRSV resistance.
  • the quantitative trait locus generally means a chromosomal region involved in the expression of quantitative traits.
  • QTL can be defined using molecular markers that indicate specific loci on the chromosome. Techniques for defining QTL using the molecular markers are well known in the art.
  • the PRSV resistance locus has the base sequence (A1), (A2) or (A3) as described above.
  • the PRSV resistance locus may have any one of the base sequences (A1), (A2), and (A3).
  • the base sequence (SEQ ID NO: 1) of (A1) is shown in the following table.
  • capital bases enclosed in squares 25th, 80th, 118th, 130th, 317th
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the base sequence of (A2) is a base sequence in which the 25th A (SNP) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is conserved and the identity with the base sequence is 80% or more, and shows PRSV resistance Is an array.
  • the 25th base is preferably conserved among the five bases.
  • the 25th A may be conserved, and at least one of the other four bases may be conserved.
  • any one, any two, any three, or any four of the five bases may be stored, but it is preferable that all five bases are stored.
  • the “identity” may be in the range where the base sequence (A2) has PRSV resistance.
  • the identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the identity can be determined by alignment with the base sequence of (A1). Specifically, for example, it can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same). .
  • the 25th A (SNP) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is conserved, and one or several bases in the base sequence are deleted, substituted, inserted and / or added. It is a base sequence and is a base sequence showing PRSV resistance.
  • the 25th base is preferably conserved among the five bases.
  • the 25th A may be conserved, and at least one of the other four bases may be conserved.
  • any one, any two, any three, or any four of the five bases may be stored, but it is preferable that all five bases are stored.
  • the “one or several” may be in the range where the base sequence (A3) has PRSV resistance.
  • the number of bases such as the deletion is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1. Two or three, most preferably one or two.
  • the method for detecting the base sequence (A1), (A2) or (A3) is not particularly limited.
  • Examples of the method include a method of amplifying a target region by a nucleic acid amplification method such as PCR and analyzing the sequence of the obtained amplification product, a method of analyzing RFLP (restriction fragment length polymorphism), and the like.
  • the RFLP can be performed as follows, for example. For example, first, the base sequence is amplified on the genomic DNA of the target cucumber plant. Next, the obtained amplification product is subjected to a restriction enzyme treatment to confirm the fragment pattern.
  • the fragment pattern differs depending on the SNP described above, the presence or absence of the base sequence can be determined by the fragment pattern, based on this, the target cucumber plant, Whether it is PRSV resistant or not can be determined.
  • the enzyme used for the restriction enzyme treatment is not particularly limited, and examples thereof include MseI.
  • the method for confirming the fragment pattern is not particularly limited, and examples thereof include electrophoresis.
  • the degree of PRSV resistance is, for example, Non-Patent Document 5 (Grumet R et al., “Characterization of sources of resistance to the watermelon strain of Papaya ringspot virus in cucumber: allelism and co-segregation with other potyvirus resistances”. and Applied Genetics. 2000; 101 (3): 463-472).
  • the description of Example 1 described later can be used.
  • disease severity of 1 or less can be set as disease resistance
  • disease severity of 3 or more can be set as susceptibility.
  • PRSV-resistant cucumber plant of the present invention is a cucumber plant deposited under accession number FERM BP-11523 or its progeny line. The deposit information is shown below. Deposit Type: International Depositary Institution Name: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Biological Depositary Accession Number: FERM BP-11523 Display for identification: Takii2 Contract date: December 27, 2012
  • the features other than disease resistance, such as traits and ecological features, of the PRSV resistant cucumber plant of the present invention are not particularly limited.
  • the grass shape is relatively small in leaf and has many side branches, so it is easy to manage cultivation, and the fruit is dark green and its shape is cylindrical It can be exemplified.
  • the PRSV-resistant cucumber plant of the present invention may further have ZYMV resistance.
  • the PRSV resistant cucumber plant of the present invention since it has resistance to both diseases, it may be referred to as “PRSV resistant / ZYMV resistant cucumber plant”.
  • the PRSV resistant / ZYMV resistant cucumber plant can prevent damage due to both diseases and has high commercial value.
  • the PRSV resistant / ZYMV resistant cucumber plant can be obtained by crossing the PRSV resistant cucumber plant and the ZYMV resistant cucumber plant, as will be described later. Details of this manufacturing method will be described later.
  • PRSV resistant cucumber plant of the present invention by crossing with a ZYMV resistant cucumber plant as a parent, an F1 variety of cucumber plants having both PRSV resistance and ZYMV resistance can be obtained. it can.
  • a PRSV-resistant cucumber plant of the present invention used as a parent is, for example, the selection of a cucumber plant having the base sequence of (A1), (A2) or (A3) as described above, or PRSV Can be obtained by selecting a resistant individual.
  • the PRSV-resistant cucumber plant used as a parent is preferably a cucumber plant or a progeny line identified by the accession number.
  • ZYMV resistance is also referred to as “ZYMV resistance”, for example.
  • the resistance means, for example, the ability to inhibit or suppress the occurrence and progression of diseases caused by infection with ZYMV. Specifically, for example, the occurrence of diseases, the stop of progression of diseases that have occurred, and the diseases that have occurred Any of suppression of progression (also referred to as inhibition) or the like may be used.
  • Non-occurrence of disease, stoppage and suppression of progression for example, may be due to suppression of ZYMV infection itself to cells, may be due to suppression of proliferation of ZYMV in infected cells, or other cells from infected cells It may be due to suppression of ZYMV infection (also referred to as diffusion).
  • the ZYMV resistance is brought about by the ZYMV resistance locus.
  • the ZYMV resistance locus is preferably located on, for example, chromosome 6.
  • the ZYMV resistance locus means a quantitative trait locus or gene region that provides ZYMV resistance.
  • the ZYMV resistance locus is, for example, a locus having the following base sequence (B1), (B2) or (B3) (hereinafter referred to as type I), and the following (C1), (C2) or (C3 ) (Hereinafter referred to as type II).
  • the ZYMV resistant gene is not particularly limited, and may be either the I type or the II type.
  • C1 Base sequence of SEQ ID NO: 3
  • C2 The 93rd A in the base sequence of SEQ ID NO: 3 is conserved, and is a base sequence having 80% or more identity with the base sequence, and shows ZYMV resistance Sequence
  • C3 is a nucleotide sequence in which the 93rd A in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is conserved and one or several bases in the nucleotide sequence are deleted, substituted, inserted and / or added, and has ZYMV resistance Base sequence indicating
  • the base sequence (SEQ ID NO: 2) of (B1) is shown in the following table.
  • capital bases (93rd and 307th) enclosed in squares are SNPs involved in ZYMV resistance.
  • the base sequence of (B2) is a base sequence in which the 93rd A and the 307th A in the base sequence of SEQ ID NO: 2 are conserved and the identity with the base sequence is 80% or more, and has ZYMV resistance. It is the base sequence shown. It is preferable that the two bases are all conserved.
  • the “identity” may be in the range where the base sequence (B2) has ZYMV resistance.
  • the identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the identity can be determined by alignment with the base sequence (B1).
  • the 93rd A and the 307th A in the base sequence of SEQ ID NO: 2 are conserved, and one or several bases in the base sequence are deleted, substituted, inserted and / or added. This is a base sequence that exhibits ZYMV resistance. It is preferable that the two bases are all conserved. “One or several” may be in the range where the base sequence of (B3) has ZYMV resistance.
  • the number of bases such as the deletion is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1. Two or three, most preferably one or two.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 3) of the above (C1) is shown in the following table.
  • the capital base (93rd) enclosed in a square is the SNP involved in ZYMV resistance.
  • the base sequence of (C2) is a base sequence in which the 93rd A (SNP) in the base sequence of SEQ ID NO: 3 is conserved and the identity with the base sequence is 80% or more, and shows ZYMV resistance Is an array.
  • the “identity” may be in the range where the base sequence (C2) has ZYMV resistance.
  • the identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the identity can be determined by alignment with the base sequence (C1).
  • the 93rd A (SNP) in the base sequence of SEQ ID NO: 3 was conserved, and one or several bases in the base sequence were deleted, substituted, inserted and / or added. It is a base sequence and is a base sequence showing ZYMV resistance. “One or several” may be in the range where the base sequence of (C3) has ZYMV resistance.
  • the number of bases such as the deletion is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 9, further preferably 1 to 5, particularly preferably 1. Two or three, most preferably one or two.
  • the detection of the type I base sequence of (B1), (B2) or (B3) or the type II base sequence of (C1), (C2) or (C3) is not particularly limited, and the PRSV described above is used. This can be performed in the same manner as the method for detecting the base sequence of the resistance locus.
  • the RFLP can be performed as follows, for example. For example, first, the base sequence of type I or type II is amplified on the genomic DNA of the target cucumber plant. Next, the obtained amplification product is subjected to a restriction enzyme treatment to confirm the fragment pattern.
  • the fragment pattern differs depending on the SNP described above, the presence or absence of the base sequence of the type I or type II can be determined according to the fragment pattern, based on this, It can be determined whether or not the target cucumber plant is ZYMV resistant.
  • the type I and type II can also be classified.
  • the enzyme used for the restriction enzyme treatment is not particularly limited, and examples thereof include MnllI.
  • the method for confirming the fragment pattern is not particularly limited, and examples thereof include electrophoresis as described above.
  • the PRSV-resistant locus and the ZYMV-resistant locus are preferably heterozygotes.
  • the degree of the ZYMV resistance is, for example, Non-Patent Document 5 (Grumet R et al., “Characterization of sources of resistance to the watermelon strain of Papaya ringspot virus in Cucumber: allelism and co-segregation with other potyvirus resistances” and Applied Genetics. 2000; 101 (3): 463-472).
  • the description in Example 2 described later can be used.
  • disease severity of 1 or less can be set as disease resistance
  • disease severity of 3 or more can be set as susceptibility.
  • the degree of the ZYMV resistance is, for example, other than this, the plant resistance evaluation screening criteria at the time of variety registration (http://www.hinsyu.maff.go.jp/info/sinsakijun/botanical_taxon.html#C p35 ) And the like.
  • the “plant body” may mean either a plant individual indicating the whole plant or a part of the plant individual.
  • the plant individual part include organs, tissues, cells, vegetative propagation bodies, and the like.
  • the organ include petals, corolla, flowers, leaves, seeds, fruits, stems, roots and the like.
  • the tissue is, for example, a part of the organ.
  • the plant part may be, for example, one kind of organ, tissue and / or cell, or two or more kinds of organ, tissue and / or cell.
  • the method for producing a PRSV resistant / ZYMV resistant cucumber plant of the present invention includes the following steps (a) and (b). (A) crossing the PRSV-resistant cucumber plant of the present invention with a ZYMV-resistant cucumber plant, (B) A step of selecting a cucumber plant having PRSV resistance and ZYMV resistance from the cucumber plant obtained from the step (a) or its progeny line
  • the production method of the present invention is characterized in that the PRSV-resistant cucumber plant of the present invention is used as a parent, and other processes and conditions are not limited at all.
  • the PRSV-resistant cucumber plant used as the first parent may be the PRSV-resistant cucumber plant of the present invention.
  • the PRSV resistant cucumber plant is preferably, for example, a cucumber plant deposited under the accession number FERM BP-11523 as described above or a progeny line thereof.
  • the PRSV-resistant cucumber plant may be prepared by, for example, selecting from the test cucumber plant (also referred to as a candidate cucumber plant) by the following step (x), for example, prior to the step (a). .
  • (X) A step of selecting the PRSV-resistant cucumber plant of the present invention.
  • the selection of the PRSV-resistant cucumber plant in the step (x) can be performed, for example, by the following steps (x1) and (x2).
  • (X1) a detection step of detecting the presence or absence of the PRSV resistance locus on the chromosome of the test cucumber plant.
  • (X2) The test cucumber plant is converted into a PRSV resistance cucumber plant by the presence of the PRSV resistance locus. Selection process to select as
  • the selection of the PRSV-resistant cucumber plant in the step (x) can be performed by, for example, the presence or absence of the base sequence of the PRSV locus as described above. That is, in the step (x1), for example, the presence or absence of the PRSV resistance gene locus is detected based on the presence or absence of the base sequence. As a result, in the step (x2), one having the base sequence can be selected from the test cucumber plants as the PRSV-resistant cucumber plant.
  • the chromosome that detects the presence or absence of the PRSV resistance locus is the sixth chromosome.
  • the cucumber plant used as the other parent is not particularly limited as long as it has ZYMV resistance.
  • the ZYMV resistant cucumber plant used for crossing may be, for example, a known cucumber plant resistant to ZYMV, or using a ZYMV resistant cucumber plant selected by the presence or absence of natural disease or inoculation with a pathogen.
  • the selection method is not limited at all.
  • a ZYMV-resistant cucumber plant having the ZYMV-resistant gene locus on chromosome 6 can be used.
  • the method for selecting the ZYMV-resistant cucumber plant is not particularly limited, and can be selected based on the presence or absence of the type I base sequence or the type II base sequence, for example.
  • the ZYMV resistant known cucumber plants include, for example, V road, V arch and slice (Takii seedlings), Kyutaro and Green Sky (Kurume Wild Seed Breeding Society), Daibo I and Daibo II (Tokiwa Research Institute), Toyosaka V10 Toyomi No. 1 and Toyomi No. 2 (Saitama Wild Seed Breeding Association), TMG-1, Dina-1 and the like.
  • the method of crossing the PRSV-resistant cucumber plant and the ZYMV-resistant cucumber plant is not particularly limited, and a known method can be adopted.
  • the target for selecting PRSV resistance and ZYMV resistance may be, for example, a cucumber plant obtained from the step (a) or a progeny line obtained from the cucumber plant. .
  • the target may be, for example, an F1 cucumber plant obtained by crossing in the step (a) or a progeny line.
  • the progeny line may be, for example, a progeny progeny or a backcross progeny of the F1 cucumber plant obtained by crossing in the step (a), or by crossing the F1 cucumber plant with another cucumber plant.
  • the obtained cucumber plant may be sufficient.
  • step (b) selection of a PRSV resistant / ZYMV resistant cucumber plant can be performed, for example, by directly or indirectly confirming PRSV resistance and ZYMV resistance.
  • the direct confirmation is performed on the obtained cucumber plant of F1 or its progeny line by, for example, PRSV resistance and ZYMV resistance, and the disease severity (resistance score) as described above.
  • PRSV and ZYMV are inoculated, for example, to the F1 cucumber plant or its progeny line, and resistance to each disease is evaluated by the disease severity (resistance score). This can be confirmed.
  • the F1 cucumber plant or its progeny line showing the disease severity (PRSV resistance score) of 1 or less and the disease severity (ZYMV resistance score) of 1 or less of ZYMV is PRSV. It can be selected as a resistant / ZYMV resistant cucumber plant.
  • the selection by the indirect confirmation can be performed by, for example, the following steps (b1) and (b2).
  • B1) A detection step of detecting the presence or absence of the PRSV resistance locus and the ZYMV resistance locus on the chromosome of the cucumber plant or progeny line obtained from the step (a)
  • B2) the PRSV resistance gene A selection step of selecting a cucumber plant obtained by the step (a) or a progeny line thereof as a cucumber plant having PRSV resistance and ZYMV resistance due to the presence of a locus and a ZYMV resistance locus
  • the selection of the PRSV resistant cucumber plant in the step (b) is, for example, similar to the method described in the step (x), and can be performed by detecting the presence or absence of the PRSV resistant locus.
  • the chromosome for detecting the presence or absence of the PRSV resistance locus is preferably chromosome 6.
  • the production method of the present invention it is preferable to further grow the PRSV resistant / ZYMV resistant cucumber plant selected in the step (b).
  • the cucumber plant or its progeny line in which both the PRSV resistance and the ZYMV resistance are confirmed can be selected as a PRSV resistance / ZYMV resistant cucumber plant.
  • the PRSV resistant / ZYMV resistant cucumber plant preferably has, for example, the PRSV resistant locus and the ZYMV resistant locus in a heterozygote.
  • Example 1 A novel PRSV resistant cucumber plant was analyzed for the PRSV resistant locus.
  • PRSV-resistant cucumber plant a cucumber plant deposited under the deposit number FERM BP-11523 was used. Hereinafter, this PRSV resistant cucumber plant is referred to as a deposited line.
  • the cucumber plant of the deposited line was crossed with the cucumber plant of the PRSV-susceptible line “Hokushin (Takii seedling)” to obtain 104 F2 segregated populations (inbred progeny). Then, an inoculation test of PRSV was performed on the 104 individuals of the F2 isolated population as shown below.
  • the PRSV inoculation test was performed according to the method described in Non-Patent Document 5. First, after adding 10 times (volume) ice-cooled 0.02 mol / L sodium phosphate buffer (pH 7.0) to young leaves of PRSV-infected cucumbers collected in a field in Miyazaki Prefecture as an inoculum source The filtrate obtained by grinding and filtering with gauze was used. Then, a pot seedling having a diameter of 9 cm was filled with commercially available seedling culture soil (Takii seedling culture medium, Takii seedling), seeded with the F2 seed, and germinated with the soil temperature kept at 28 ° C. The seedlings with the cotyledons fully developed were subjected to PRSV inoculation.
  • the inoculum was inoculated by applying it with a cotton swab. After the inoculation, the seedlings were managed in a greenhouse under conditions of a maximum temperature of 35 ° C., a minimum temperature of 25 ° C., and a day length of 13 hours, and the disease severity was investigated 14 days after the inoculation.
  • FIG. 1 shows photographs of leaves corresponding to each disease severity.
  • Disease severity 0 Resistance Disease-free disease severity 1 Resistance: Minor vein penetration is seen in the lower leaves,
  • Disease severity 2 Moderate resistance young leaves and no growth symptoms near the growth point, but the lower leaves have clear shrinkage, mosaic symptoms and vein vascularization 3
  • Disease susceptibility Disease severity 4 in which the whole plant body is seen to be shrunken and veins transparent
  • Susceptibility Vigorous defoliation and vein permeability are found throughout the plant
  • PRSV susceptible individuals were designated as PRSV susceptible strains.
  • F3 segregated population (inbred progeny) was obtained from individuals of the PRSV susceptible strain.
  • PRSV inoculation test was performed on 10 individuals of the F3 segregating population per PRSV-susceptible strain in the same manner as described above.
  • all the 10 individuals in each strain of the F3 segregating population are PRSV-susceptible, or PRSV-resistant (severity 1 or less) and PRSV-susceptibility (severity 3 or more) individuals.
  • the ratio was about 1: 3.
  • all F3 segregation populations (inbred progeny) obtained from individuals of the PRSV resistant strain were all PRSV resistant (morbidity of 1 or less). From the above results, it was found that the PRSV resistance trait is inherited with single factor recessiveness.
  • Example 2 The ZYMV resistance locus was analyzed for known ZYMV resistance cucumber plants.
  • F2 segregated populations of F1 variety “Shakit (Takii seedling)” and F1 variety “V load (Takii seedling)”, which are cucumber plants of known ZYMV resistance lines, respectively, It used for the inoculation method described below.
  • the inoculation test of ZYMV was performed according to the method described in Non-Patent Document 5. First, after adding 10 times (volume) ice-cooled 0.02 mol / L sodium phosphate buffer (pH 7.0) to young leaves of ZYMV-infected cucumbers collected in a field in Shiga as an inoculum. The filtrate obtained by grinding and filtering with gauze was used. Then, a pot seedling having a diameter of 9 cm was filled with commercially available seedling culture soil (Takii seedling culture medium, Takii seedling), seeded with the F2 seed, and germinated with the soil temperature kept at 28 ° C. The seedlings with the cotyledons fully developed were subjected to ZYMV inoculation.
  • the inoculum was inoculated by applying with a cotton swab. After inoculation, the seedlings were managed in a greenhouse under conditions of a maximum temperature of 35 ° C., a minimum temperature of 25 ° C., and a day length of 13 hours, and the disease severity was investigated 7 days after the inoculation.
  • the individual of the Shakit self breeding progeny individual and the individual of the V load self breeding progeny were obtained one by one from the individuals of the disease severity 0 showing ZYMV resistance.
  • the individual of the Shakit self-breeding progeny was referred to as “type I resistant individual”, and the individual of the V load self-breeding progeny was referred to as “type II resistant individual”.
  • ZYMV susceptible individuals were designated as ZYMV susceptible strains.
  • F3 segregated population (inbred progeny) was obtained from individuals of the ZYMV susceptible strain. Then, an inoculation test of ZYMV was performed on 10 individuals of the F3 segregated population per line of the ZYMV susceptible line in the same manner as described above. As a result, 10 individuals in each lineage of the F3 segregated population are all susceptible to ZYMV, or the ratio of individuals with ZYMV resistance (morbidity of 1 or less) to those with ZYMV susceptibility (morbidity of 3 or more). However, it was about 1: 3. In addition, all F3 segregation populations (inbred progeny) obtained from individuals of the ZYMV resistant strain were all ZYMV resistant (onset of disease 1 or less). From the above results, it was found that the ZYMV-resistant trait was inherited with single factor recession for both type I resistance and type II resistance.
  • sequencing was performed for the region around 200 kbp around two SSR (simple repetitive sequence) markers on chromosome 6.
  • the cucumber plant of the PRSV resistant line is located at the 25th (A), 80th (T), 118th (T), 130th (C) and 317th (G) of the region shown in SEQ ID NO: 1. Specific SNPs were detected.
  • PCR was performed on 104 individuals of the F2 segregated population obtained in Example 1, and the sequence of the obtained amplification products was analyzed.
  • the PCR uses a forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 and a reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 6, and the PCR program is 94 ° C: 1 minute, 94 ° C: 30 seconds, 58 ° C: 30 Second, 72 ° C .: 1 minute, 72 ° C .: 5 minutes, 30 cycles.
  • Forward primer SEQ ID NO: 5
  • Reverse primer SEQ ID NO: 6
  • the primer set can amplify the base sequence of SEQ ID NO: 4 corresponding to the full length of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the part surrounded by a square indicates the position of the SNP to be detected.
  • the individual showing PRSV susceptibility is 25th G, 80th C, 118th C, 130th G, 317th A, It was confirmed that it has a susceptibility locus instead of the PRSV resistance locus represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It was found that the PRSV susceptibility loci were homozygous or heterozygous for the PRSV susceptibility locus. From these results, it was found that a cucumber plant of a PRSV resistant line could be selected by 5 SNPs in the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the compatibility of the 93rd and 307th SNPs with the ZYMV resistant trait in the base sequence of SEQ ID NO: 4 was confirmed for the F2 isolated population.
  • the individuals exhibiting ZYMV resistance in the type I population have the above-mentioned type I ZYMV resistance locus in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 wherein the 93rd is an ANP and the 307th is an ANP.
  • the ZYMV resistance gene locus showing this SNP is homozygous for the individual exhibiting the above-mentioned type I ZYMV resistance.
  • an individual exhibiting ZYMV resistance in the type II population is the SNP of A at position 93 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and has the type II ZYMV resistance locus. That is, it had the type II ZYMV resistance locus represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the ZYMV resistance gene locus showing this SNP was homozygous in the individual exhibiting type II ZYMV resistance.
  • the ZYMV susceptibility individual is a ZYMV resistant gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in which the 93rd position is G and the 307th position is G.
  • the cucumber plant of the ZYMV resistant line could be selected by two SNPs in the base sequence of SEQ ID NO: 2 or one SNP in the base sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the PRSV-resistant cucumber plant (Accession No. FERM BP-11523) of the deposited line shown in Example 1 and the cucumber plant “Natsuzumi (Takii seedling)” having excellent agricultural characteristics such as taste and grass shape were crossed.
  • F1 first hybrid
  • 400 F2 progeny progeny
  • F1 first hybrid
  • F2 progeny progeny
  • the sequence was analyzed in the same manner as in Example 3, and individuals having the PRSV resistance locus were selected. These were planted in the field as individuals with PRSV resistance, and individuals with excellent agricultural characters were selected by visual inspection. Then, this procedure was repeated four times to obtain an individual having PRSV resistance and excellent agricultural characteristics. This is referred to as line A cucumber plant.
  • Example 2 type I ZYMV-resistant cucumber plant
  • the cucumber plant “Natsubayashi (Takii seedling)” having excellent agricultural characteristics such as taste and grass shape are crossed.
  • F1 hybrid first generation
  • F2 self-bred progeny
  • the sequence was analyzed in the same manner as in Example 3, and individuals having the ZYMV resistance were selected. These were planted in the field as individuals with ZYMV resistance, and individuals with excellent agricultural characteristics were selected by visual inspection. Then, this procedure was repeated four times to obtain an individual having ZYMV resistance and excellent agricultural characteristics. This is referred to as line B cucumber plant.
  • the cucumber plant of line A having PRSV resistance and excellent agricultural characteristics is the first parent
  • the plant of line B having type I ZYMV resistance and excellent agricultural characteristics is Two parents were crossed to obtain line AB, which is 12 individuals of F1 (first hybrid).
  • the PRSV inoculation test and the ZYMV inoculation test were performed on the 12 individuals of the strain AB, which was F1, in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • a cucumber variety having PRSV resistance and ZYMV resistance can be obtained by crossing the PRSV-resistant cucumber plant of the present invention with the ZYMV-resistant cucumber plant. For this reason, according to the PRSV resistant cucumber plant of the present invention, economic and labor losses such as a decrease in yield and an increase in the use of agricultural chemicals due to infection with PRSV and ZYMV can be greatly reduced.

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Abstract

　ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物およびその製造方法を提供する。　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、第６染色体上に、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、配列番号１の塩基配列を有する。本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑することによって、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物の品種が得られる。このため、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの感染による収量低下および農薬使用の増加などの経済的ならびに労力的な損失を、大きく軽減できる。

Description

ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物、ならびにＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法
　本発明は、ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物、ならびに、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法に関する。
　キュウリ植物の栽培において、ウイルスによる病害は、世界的に深刻な問題となっている。特に、ポチウイルスの一種であるズッキーニ黄斑モザイクウイルス（zucchini　yellow　mosaic　virus；ＺＹＭＶ）およびパパイヤ輪点ウイルス（papaya　ringspot　virus；ＰＲＳＶ）による被害は、甚大である。
　具体的に、ＺＹＭＶおよびＰＲＳＶ－スイカ系（papaya　ringspot　virus　type　W；ＰＲＳＶ－Ｗ）は、キュウリ植物に感染すると、急性萎凋症を引き起こす（非特許文献１および２）。このようにウイルスに感染したキュウリ植物は、枯死するため、被害は甚大であり、前記両ウイルスによる被害の経済的損失は、全国のキュウリ植物の産地で、年間約５０億円以上ともいわれている。そして、一般的に、これらの植物ウイルスに対して有効な薬剤は、報告されていないという問題がある。したがって、代替手段として、ウイルスの媒介主であるアブラムシを駆除したり、弱毒化したウイルスを幼苗に接種する必要があるため、その防除に、多大な労力および経費を費やしているのが現状である（特許文献１ならびに非特許文献３および４）。
　このような問題から、ウイルス抵抗性を備えるキュウリ植物の系統の探索、および、ウイルス抵抗性遺伝子の解析が進められている。
　現在、ＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物の系統としては、例えば、ＴＭＧ－１およびＤｉｎａ－１が知られており、一方、ＰＲＳＶ－Ｗ抵抗性を備えるキュウリ植物の系統としては、ＴＭＧ－１、Ｄｉｎａ－１およびＳｕｒｉｎａｍが知られている。ＴＭＧ－１およびＤｉｎａ－１が備えるＺＹＭＶ抵抗性は、１つの劣性遺伝子によって支配されているという報告がある（非特許文献５）。また、ＴＭＧ－１およびＤｉｎａ－１が有するＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、同じ遺伝子座または非常に近接した遺伝子座に存在するといわれている（非特許文献６）。キュウリ植物のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、第６染色体の２つのマーカーの間の２．２ｃＭ内に座乗していることが知られている（非特許文献７）。さらに、ＴＭＧ－１が有するＰＲＳＶ抵抗性遺伝子およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、互いに近接（２．２ｃＭ）していること、および、前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子から５．２ｃＭの位置に、１つのＡＦＬＰマーカー（Ｅ１５／Ｍ４７－Ｆ－１９７）があることが知られている（非特許文献８）。
　中でも、日本においては、ＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物の品種の育成が、鋭意に進められ、栽培に供されている。しかしながら、前記両ウイルスに対して十分な抵抗性を備える品種は、報告されていない。また、前記両ウイルスによる被害は、高温期において特に大きくなるため、地球温暖化の影響によって、被害が大きくなる可能性が高い。このため、前記両ウイルスのうち一方だけでなく、両方のウイルスに対して、十分な抵抗性を備える品種の育成が必要である。
　一方、抵抗性を付与する方法として、遺伝子組換え技術を利用することも考えられる。しかしながら、消費者からすると、遺伝子組換えされた食物の安全性に対する不安感は依然として高い。したがって、遺伝子組換え技術を用いずに、前記両ウイルスに対する抵抗性を備える品種が提供されることが、強く求められている。
特開２００４－２８３１６４号公報
愛媛県農業試験場・生産環境室、「愛媛県の夏秋キュウリから検出されるウイルスの種類」、研究成果報告、１９９６年 岩崎真人、外２名、「接木キュウリ萎凋株から分離されたパパイヤ輪点ウイルス－ｔｙｐｅ　Ｗ（ＰＲＳＶ－Ｗ）」、日本植物病理学会報、１９９２年、ｐ．６１９ You　BJ　et　al.,　"Engineered　Mild　Strains　of　Papaya　ringspot　virus　for　Broader　Cross　Protection　in　Cucurbits"　Phytopathology.　2005　May;95(5):533-40 庄司俊彦、「キュウリ急性萎凋症の発生とその防除対策」、植物防疫、２００２年、第５６巻、第５号、ｐ．１９４－１９７ Grumet　R　et　al.,　"Characterization　of　sources　of　resistance　to　the　watermelon　strain　of　Papaya　ringspot　virus　in　cucumber:　allelism　and　co-segregation　with　other　potyvirus　resistances"　Theoretical　and　Applied　Genetics.　2000;101(3):463-472 Kabelka　E　et　al.,　"Multiple　alleles　for　zucchini　yellow　mosaic　virus　resistance　at　the　zym　locus　in　cucumber"　Theoretical　and　Applied　Genetics.　1997,　95(5):997-1104 井村喜之、「キュウリのズッキーニ黄斑モザイクウイルス抵抗性遺伝子のマッピング」、日本植物病理学会報、２０１１年、ｐ．２３９－２４０ Park　YH　et　al.,　"A　genetic　map　of　cucumber　composed　of　RAPDs,　RFLPs,　AFLPs,　and　loci　conditioning　resistance　to　papaya　ringspot　and　zucchini　yellow　mosaic　viruses"　Genome.　2000　Dec;43(6):1003-1010
　そこで、本発明は、新たなＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物、ならびに、それを用いたＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、第６染色体上にＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有することを特徴とする。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列
（Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法は、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（ａ）前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑する工程
（ｂ）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またその後代系統から、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を選抜する工程
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、ＰＲＳＶ抵抗性はもちろんのこと、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物と交雑することによって、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの両方に対して優れた抵抗性を示すキュウリ植物を得ることができる。これにより、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの感染による収量低下および媒介主の駆除等に伴う労力およびコスト軽減が大きく図れ、また、消費者ニーズに適したキュウリ植物の提供が可能となる。
本発明の実施例において、ＰＲＳＶの発病度の評価基準を示す写真である。
（１）ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、前述のように、第６染色体上にＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有することを特徴とする。
（Ａ１）配列番号１の塩基配列
（Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
　本発明において、「キュウリ植物」は、Cucumis　sativus　L.である。
　前記キュウリ植物の品種は、特に制限されず、例えば、短形白イボ、四葉、英国温室型、スライス型、ベイトアルファ型等、どのタイプのキュウリでも良いが、短形白イボ型キュウリが好ましい。
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、ＰＲＳＶに抵抗性を示す。ＰＲＳＶは、特に制限されず、ＰＲＳＶ－Ｗ（Type　W）、ＰＲＳＶ－Ｐ（Type　P）があげられる。
　本発明において、「ＰＲＳＶ抵抗性」は、例えば、「ＰＲＳＶ耐性」ともいう。前記抵抗性は、例えば、ＰＲＳＶの感染による病害の発生および進行に対する阻害能または抑制能を意味し、具体的に、例えば、病害の未発生、発生した病害の進行の停止、および、発生した病害の進行の抑制（阻害ともいう）等のいずれでもよい。病害の未発生、進行の停止および抑制は、例えば、細胞へのＰＲＳＶの感染自体の抑制によるものでもよいし、感染細胞におけるＰＲＳＶの増殖の抑制によるものでもよいし、感染した細胞から他の細胞へのＰＲＳＶの感染（拡散ともいう）の抑制等によるものでもよい。
　本発明において、前記ＰＲＳＶ抵抗性は、第６染色体上の前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座によってもたらされる。
　ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座とは、ＰＲＳＶ抵抗性を供与する量的形質遺伝子座または遺伝子領域を意味する。前記量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｔｒａｉｔｓ　Ｌｏｃｉ；ＱＴＬ）は、一般に、量的形質の発現に関与する染色体領域を意味する。ＱＴＬは、染色体上の特定の座を示す分子マーカーを使用して規定できる。前記分子マーカーを使用してＱＴＬを規定する技術は、当該技術分野において周知である。
　本発明において、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座は、前述のように、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有する。本発明において、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座は、前記（Ａ１）、（Ａ２）および（Ａ３）のいずれの塩基配列を有してもよい。
　前記（Ａ１）の塩基配列（配列番号１）を、下記表に示す。下記塩基配列において、四角で囲んだ大文字の塩基（２５番目、８０番目、１１８番目、１３０番目、３１７番目）が、ＰＲＳＶ抵抗性に関与する一塩基多型（ＳＮＰ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前記（Ａ２）の塩基配列は、配列番号１の塩基配列における２５番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記（Ａ２）の塩基配列は、前記５カ所の塩基のうち、２５番目の塩基が保存されていることが好ましい。また、前記（Ａ２）の塩基配列は、例えば、２５番目のＡが保存され、且つ、その他の４カ所の塩基のうち少なくとも一つの塩基が保存されていてもよい。前記５カ所の塩基は、例えば、いずれか１カ所、いずれか２カ所、いずれか３カ所、いずれか４カ所が保存されてもよいが、５カ所全てが保存されていることが好ましい。「同一性」は、前記（Ａ２）の塩基配列がＰＲＳＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記同一性は、８５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、前記（Ａ１）の塩基配列とのアラインメントにより求めることができ、具体的には、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　前記（Ａ３）の塩基配列は、配列番号１の塩基配列における２５番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記（Ａ３）の塩基配列は、前記５カ所の塩基のうち、２５番目の塩基が保存されていることが好ましい。また、前記（Ａ３）の塩基配列は、例えば、２５番目のＡが保存され、且つ、その他の４カ所の塩基のうち少なくとも一つの塩基が保存されていてもよい。前記５カ所の塩基は、例えば、いずれか１カ所、いずれか２カ所、いずれか３カ所、いずれか４カ所が保存されてもよいが、５カ所全てが保存されていることが好ましい。「１もしくは数個」は、前記（Ａ３）の塩基配列がＰＲＳＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記欠失等の塩基の数は、例えば、１～２０個、好ましくは、１～１０個、より好ましくは、１～９個、さらに好ましくは、１～５個、特に好ましくは、１個、２個または３個、最も好ましくは、１個または２個である。
　前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列の検出方法は、特に制限されない。前記方法としては、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法により目的の領域を増幅し、得られた増幅産物の配列を解析する方法や、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）の解析方法等があげられる。前記ＲＦＬＰは、例えば、以下のように行える。例えば、まず、対象となるキュウリ植物のゲノムＤＮＡに対して、前記塩基配列の増幅を行う。つぎに、得られた増幅産物に対して制限酵素処理を行い、その断片パターンを確認する。ＰＲＳＶ抵抗性とＰＲＳＶ罹病性とでは、前述したＳＮＰに依存して前記断片パターンが異なるため、前記断片パターンによって、前記塩基配列の有無を判断でき、これに基づいて、対象となるキュウリ植物が、ＰＲＳＶ抵抗性か否かを判断できる。前記制限酵素処理に使用する酵素は、特に制限されず、例えば、ＭｓeＩ等があげられる。また、前記断片パターンの確認方法は、特に制限されず、例えば、電気泳動があげられる。
　前記ＰＲＳＶ抵抗性の程度は、例えば、前記非特許文献５（Grumet　R　et　al.,　“Characterization　of　sources　of　resistance　to　the　watermelon　strain　of　Papaya　ringspot　virus　in　cucumber:　allelism　and　co-segregation　with　other　potyvirus　resistances”　Theoretical　and　Applied　Genetics.　2000;101(3):463-472）に記載の方法に準じて、発病度により表わすことができる。この方法による前記発病度の算出は、後述する実施例１の記載を援用でき、例えば、発病度１以下を耐病性、発病度３以上を罹病性と設定することができる。
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、一例として、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３で寄託されたキュウリ植物またはその後代系統があげられる。寄託の情報を以下に示す。
寄託の種類：国際寄託
寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター
受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３
識別のための表示：Ｔａｋｉｉ２
受託日：２０１２年１２月２７日
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物について、病害抵抗性以外の特徴、例えば、形質的、生態的特徴等は、特に限定されない。具体例として、短形白イボキュウリの場合、例えば、草姿は、比較的に葉が小さく、側枝の発生も多いため、栽培管理がしやすく、また、果実は濃緑色で、その形は円筒形であることが例示できる。
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性を有してもよい。この場合、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、前記両病害に対する抵抗性を有することから、「ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物」と示す場合もある。前記ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物は、前記両病害による被害を防ぐことが可能であり、商品価値が高い。前記ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物は、後述するように、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物との交雑により得ることができる。なお、この製造方法の詳細は、後述する。
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、前述のように、親として、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物と交雑することにより、ＰＲＳＶ抵抗性とＺＹＭＶ抵抗性とを兼ね備えるＦ１品種のキュウリ植物を得ることができる。このような、親として使用する本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、前述のような、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有するキュウリ植物の選択、または、ＰＲＳＶを接種して抵抗性のある個体を選択することにより得ることができる。また、親として使用する前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、中でも、前記受託番号で特定されるキュウリ植物またはその後代系統が好ましい。
　本発明において、「ＺＹＭＶ抵抗性」は、例えば、「ＺＹＭＶ耐性」ともいう。前記抵抗性は、例えば、ＺＹＭＶの感染による病害の発生および進行に対する阻害能または抑制能を意味し、具体的に、例えば、病害の未発生、発生した病害の進行の停止、および、発生した病害の進行の抑制（阻害ともいう）等のいずれでもよい。病害の未発生、進行の停止および抑制は、例えば、細胞へのＺＹＭＶの感染自体の抑制によるものでもよいし、感染細胞におけるＺＹＭＶの増殖の抑制によるものでもよいし、感染した細胞から他の細胞へのＺＹＭＶの感染（拡散ともいう）の抑制等によるものでもよい。
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性を有する場合、ＺＹＭＶ抵抗性は、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座によってもたらされる。本発明において、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座は、例えば、第６染色体上に座乗することが好ましい。
　ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座とは、ＺＹＭＶ抵抗性を供与する量的形質遺伝子座または遺伝子領域を意味する。
　前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座は、例えば、下記（Ｂ１）、（Ｂ２）または（Ｂ３）の塩基配列を有する遺伝子座（以下、Ｉ型という）、および、下記（Ｃ１）、（Ｃ２）または（Ｃ３）の塩基配列を有する遺伝子座（以下、II型という）があげられる。本発明のＰＲＳＶ抵抗性植物において、前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子は、特に制限されず、前記Ｉ型および前記II型のいずれであってもよい。
（Ｂ１）配列番号２の塩基配列
（Ｂ２）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｂ３）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｃ１）配列番号３の塩基配列
（Ｃ２）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
（Ｃ３）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
　前記（Ｂ１）の塩基配列（配列番号２）を、下記表に示す。下記塩基配列において、四角で囲んだ大文字の塩基（９３番目、３０７番目）が、ＺＹＭＶ抵抗性に関与するＳＮＰである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記（Ｂ２）の塩基配列は、配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記２カ所の塩基は、２カ所全てが保存されていることが好ましい。「同一性」は、前記（Ｂ２）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記同一性は、８５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、前記（Ｂ１）の塩基配列とのアラインメントにより求めることができる。
　前記（Ｂ３）の塩基配列は、配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。前記２カ所の塩基は、２カ所全てが保存されていることが好ましい。「１もしくは数個」は、前記（Ｂ３）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記欠失等の塩基の数は、例えば、１～２０個、好ましくは、１～１０個、より好ましくは、１～９個、さらに好ましくは、１～５個、特に好ましくは、１個、２個または３個、最も好ましくは、１個または２個である。
　前記（Ｃ１）の塩基配列（配列番号３）を、下記表に示す。下記塩基配列において、四角で囲んだ大文字の塩基（９３番目）が、ＺＹＭＶ抵抗性に関与するＳＮＰである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　前記（Ｃ２）の塩基配列は、配列番号３の塩基配列における９３番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。「同一性」は、前記（Ｃ２）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記同一性は、８５％以上が好ましく、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは、９９％以上である。前記同一性は、前記（Ｃ１）の塩基配列とのアラインメントにより求めることができる。
　前記（Ｃ３）の塩基配列は、配列番号３の塩基配列における９３番目のＡ（ＳＮＰ）が保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列である。「１もしくは数個」は、前記（Ｃ３）の塩基配列がＺＹＭＶ抵抗性を有する範囲であればよい。前記欠失等の塩基の数は、例えば、１～２０個、好ましくは、１～１０個、より好ましくは、１～９個、さらに好ましくは、１～５個、特に好ましくは、１個、２個または３個、最も好ましくは、１個または２個である。
　前記（Ｂ１）、（Ｂ２）もしくは（Ｂ３）のＩ型の塩基配列、または前記（Ｃ１）、（Ｃ２）もしくは（Ｃ３）のII型の塩基配列の検出は、特に制限されず、前述したＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の塩基配列の検出方法と同様にして行える。具体例として、前記ＲＦＬＰは、例えば、以下のように行える。例えば、まず、対象となるキュウリ植物のゲノムＤＮＡに対して、前記I型または前記II型の塩基配列の増幅を行う。つぎに、得られた増幅産物に対して制限酵素処理を行い、その断片パターンを確認する。ＺＹＭＶ抵抗性とＺＹＭＶ罹病性とでは、前述したＳＮＰに依存して前記断片パターンが異なるため、前記断片パターンによって、前記Ｉ型または前記II型の塩基配列の有無を判断でき、これに基づいて、対象となるキュウリ植物が、ＺＹＭＶ抵抗性か否かを判断できる。また、前記Ｉ型の塩基配列と、前記II型の塩基配列との間においても、断片パターンが異なるため、Ｉ型とII型についても分類できる。前記制限酵素処理に使用する酵素は、特に制限されず、例えば、ＭｎｌＩがあげられる。また、前記断片パターンの確認方法は、特に制限されず、前述のように、例えば、電気泳動があげられる。
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物において、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座とＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座とは、ヘテロ接合体であることが好ましい。
　前記ＺＹＭＶ抵抗性の程度は、例えば、前記非特許文献５（Grumet　R　et　al.,　“Characterization　of　sources　of　resistance　to　the　watermelon　strain　of　Papaya　ringspot　virus　in　cucumber:　allelism　and　co-segregation　with　other　potyvirus　resistances”　Theoretical　and　Applied　Genetics.　2000;101(3):463-472）に記載の方法に準じて、発病度により表わすことができる。この方法による前記発病度の算出は、後述する実施例２の記載を援用でき、例えば、発病度１以下を耐病性、発病度３以上を罹病性と設定することができる。
　前記ＺＹＭＶ抵抗性の程度は、例えば、この他にも、品種登録時の植物抵抗性評価審査基準（http://www.hinsyu.maff.go.jp/info/sinsakijun/botanical_taxon.html#C　p35）等により、評価することもできる。
　本発明において、「植物体」は、植物全体を示す植物個体および前記植物個体の部分のいずれの意味であってもよい。前記植物個体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記植物体の部分は、例えば、一種類の器官、組織および／または細胞でもよいし、二種類以上の器官、組織および／または細胞でもよい。
（２）ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の製造方法
　つぎに、本発明のＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物（ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物）の製造方法について説明する。なお、以下の方法は、例示であって、本発明は、これらの方法に制限されない。本発明において、製造方法は、例えば、育成方法ということもできる。
　本発明のＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の製造方法は、前述のように、下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（ａ）前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またその後代系統から、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を選抜する工程
　本発明の製造方法は、前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を親として使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
　前記（ａ）工程において、第一の親として使用するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物であればよい。前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、前述のような受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３で寄託されたキュウリ植物またはその後代系統が好ましい。また、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、前記（ａ）工程に先立って、例えば、被検キュウリ植物（候補キュウリ植物ともいう）から、下記（ｘ）工程により選抜して準備してもよい。
（ｘ）前記本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を選抜する工程
　前記（ｘ）工程における前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜は、例えば、下記（ｘ１）工程および（ｘ２）工程により行うことができる。
（ｘ１）被検キュウリ植物の染色体上における、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する検出工程
（ｘ２）前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の存在により、前記被検キュウリ植物を、ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物として選抜する選抜工程
　前記（ｘ）工程における前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜は、例えば、前述のような前記ＰＲＳＶ遺伝子座の塩基配列の有無によって行える。すなわち、前記（ｘ１）工程において、例えば、前記塩基配列の有無によって前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する。これによって、前記（ｘ２）工程において、前記被検キュウリ植物から、前記塩基配列を有するものを、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物として選抜できる。
　前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する染色体は、第６染色体である。
　また、前記（ａ）工程において、他方の親として使用するキュウリ植物は、ＺＹＭＶ抵抗性を有していればよく、特に制限されない。交雑に使用する前記ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物は、例えば、ＺＹＭＶ抵抗性の公知キュウリ植物を使用してもよいし、自然発病の有無または病原体の接種により選抜したＺＹＭＶ抵抗性のキュウリ植物を使用してもよく、選抜方法は、何ら制限されない。具体例としては、例えば、第６染色体上に、前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有するＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物を使用できる。前記ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の選抜方法は、特に制限されず、例えば、前記Ｉ型の塩基配列または前記II型の塩基配列の有無によって選抜できる。
　前記ＺＹＭＶ抵抗性の公知キュウリ植物としては、例えば、Ｖロード、Ｖアーチおよびスライス（タキイ種苗）、きゅう太郎およびグリーンスカイ(久留米原種育成会)、大望Ｉおよび大望II（ときわ研究所）、豊栄Ｖ１０、豊美１号および豊美２号（埼玉原種育成会）、ＴＭＧ－１、Ｄｉｎａ－１等があげられる。
　前記（ａ）工程において、前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と前記ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物との交雑方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
　前記（ｂ）工程において、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を選抜する対象は、例えば、前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物でもよいし、さらに、そのキュウリ植物から得られた後代系統でもよい。具体的に、前記対象は、例えば、前記（a）工程の交雑によって得られたＦ１のキュウリ植物でもよいし、その後代系統でもよい。前記後代系統は、例えば、前記（a）工程の交雑によって得られたＦ１のキュウリ植物の自殖後代または戻し交雑後代でもよいし、前記Ｆ１のキュウリ植物と別のキュウリ植物とを交雑することによって得られたキュウリ植物であってもよい。
　前記（ｂ）工程において、ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の選抜は、例えば、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を、直接的または間接的に確認することにより行うことができる。
　前記（ｂ）工程において、前記直接的な確認は、得られた前記Ｆ１のキュウリ植物またはその後代系統について、例えば、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を、前述のような発病度（抵抗性スコア）によって評価することで行える。具体的には、例えば、前記Ｆ１のキュウリ植物またはその後代系統に対して、例えば、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶを、それぞれ接種して、各病害に対する抵抗性を、前記発病度（抵抗性スコア）によって評価することで確認できる。この場合、例えば、１以下のＰＲＳＶによる発病度（ＰＲＳＶ抵抗性スコア）を示し、且つ、１以下のＺＹＭＶによる発病度（ＺＹＭＶ抵抗性スコア）を示す前記Ｆ１のキュウリ植物またはその後代系統を、ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物として選抜できる。
　また、前記（ｂ）工程において、前記間接的な確認による選抜は、例えば、下記（ｂ１）および（ｂ２）工程によって行うことができる。
（ｂ１）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またはその後代系統について、染色体上における、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する検出工程
（ｂ２）前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の存在により、前記（ａ）工程により得られたキュウリ植物またはその後代系統を、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物として選抜する選抜工程
　前記（ｂ）工程におけるＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選別は、例えば、前記（ｘ）工程において説明した方法と同様であり、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無の検出によって行うことができる。前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の有無を検出する染色体は、第６染色体が好ましい。
　本発明の製造方法は、前記（ｂ）工程において選抜されたＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物を、さらに育成することが好ましい。
　このように、前記ＰＲＳＶ抵抗性および前記ＺＹＭＶ抵抗性の両方が確認された前記キュウリ植物またはその後代系統を、ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物として選抜できる。
　前記ＰＲＳＶ抵抗性／ＺＹＭＶ抵抗性のキュウリ植物は、例えば、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座と前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座とを、ヘテロ接合体で有することが好ましい。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
　新規なＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物について、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座の解析を行った。
　ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３で寄託されたキュウリ植物を使用した。以下、このＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を寄託系統という。
　前記寄託系統のキュウリ植物と、ＰＲＳＶ罹病性系統のキュウリ植物「北進（タキイ種苗）」とを交雑することによって、１０４個体のＦ２分離集団（自殖後代）を得た。そして、Ｆ２分離集団の前記１０４個体に対して、以下に示すように、ＰＲＳＶの接種試験を行った。
　ＰＲＳＶの接種試験は、前記非特許文献５に記載の方法に準じて行った。まず、接種源として、宮崎県内の圃場で採取したＰＲＳＶ感染キュウリの若い葉に、１０倍量（体積）の氷冷した０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した後、これを磨砕し、ガーゼでろ過して得られたろ液を用いた。そして、直径９ｃｍのポット苗に、市販の育苗用培土（タキイ育苗培土、タキイ種苗）をつめ、前記Ｆ２の種子を播種し、地温を２８℃に保って発芽させた。子葉が完全に展開した状態の苗を、ＰＲＳＶ接種に供試した。前記子葉に、カーボランダムを軽くふりかけた後、前記接種源を、綿棒で塗布することにより接種した。接種後、前記苗を、最高気温３５℃、最低気温２５℃、日長１３時間の条件で温室内にて管理し、接種から１４日後に、発病度の調査を行った。
　発病度は、前記非特許文献５に記載の方法に準じ、抵抗性を以下のように判定した。図１に、各発病度に該当する葉の写真を示す。
発病度０
　　抵抗性：無病徴
発病度１
　　抵抗性：下位葉に軽微な葉脈透過が見られる、
発病度２
　　中程度抵抗性：若い葉と生長点付近は無病徴であるが、下位葉に、明瞭な縮葉、モザイク症状および葉脈透化が見られる
発病度３
　　罹病性：植物体全体に、縮葉および葉脈透化が見られる
発病度４
　　罹病性：植物体全体に、激しい縮葉および葉脈透化が見られる
　前記Ｆ２分離集団において、ＰＲＳＶ接種の結果、ＰＲＳＶ抵抗性を示す発病度１以下の個体は２５個体、罹病性を示す発病度３以上の個体は７９個体であった。中程度抵抗性を示す個体はなかった。すなわち、ＰＲＳＶ抵抗性の個体数とＰＲＳＶ罹病性の個体数との比は、約１：３であった。ＰＲＳＶ罹病性の個体を、ＰＲＳＶ罹病性系統とした。
　つぎに、前記ＰＲＳＶ罹病性系統の個体から、Ｆ３分離集団（自殖後代）を得た。そして、ＰＲＳＶ罹病性系統の１系統あたり前記Ｆ３分離集団の１０個体に対して、前述と同様に、ＰＲＳＶの接種試験を行った。その結果、前記Ｆ３分離集団の各系統の１０個体は、全てＰＲＳＶ罹病性であるか、または、ＰＲＳＶ抵抗性（発病度１以下）の個体とＰＲＳＶ罹病性（発病度３以上）の個体との比が、約１：３であった。なお、前記ＰＲＳＶ抵抗性系統の個体から得た、Ｆ３分離集団（自殖後代）は、全てＰＲＳＶ抵抗性（発病度１以下）であった。以上の結果により、ＰＲＳＶ抵抗性形質は、単因子劣性で遺伝することが判明した。
［実施例２］
　公知のＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物について、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の解析を行った。
　まず、既知のＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物である、Ｆ１品種「シャキット（タキイ種苗）」、およびＦ１品種「Ｖロード（タキイ種苗）」の自殖後代(Ｆ２分離集団)５０個体を、それぞれ、以下に記載する接種方法に供した。
　ＺＹＭＶの接種試験は、前記非特許文献５に記載の方法に準じて行った。まず、接種源として、滋賀県内の圃場で採取したＺＹＭＶ感染キュウリの若い葉に、１０倍量（体積）の氷冷した０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加した後、これを磨砕し、ガーゼでろ過して得られたろ液を用いた。そして、直径９ｃｍのポット苗に、市販の育苗用培土（タキイ育苗培土、タキイ種苗）をつめ、前記Ｆ２の種子を播種し、地温を２８℃に保って発芽させた。子葉が完全に展開した状態の苗を、ＺＹＭＶ接種に供試した。前記子葉にカーボランダムを軽くふりかけた後、前記接種源を、綿棒で塗布することにより接種した。接種後、前記苗を、最高気温３５℃、最低気温２５℃、日長１３時間の条件で温室内にて管理し、接種から７日後に、発病度の調査を行った。
　そして、前記接種試験により、ＺＹＭＶ抵抗性を示す発病度０の個体の中から、シャキット自殖後代の個体とＶロード自殖後代の個体とを、それぞれ１個体ずつ得た。以下、シャキット自殖後代の個体を、「Ｉ型抵抗性個体」、Ｖロード自殖後代の個体を、「II型抵抗性個体」とした。
　つぎに、ＺＹＭＶ罹病性系統のキュウリ植物「北進（タキイ種苗）」と、前記Ｉ型抵抗性個体またはII型抵抗性個体とを、それぞれ交雑することによって、１００個体のＦ２分離集団（自殖後代）を、２集団（以下、それぞれ、Ｉ型集団、II型集団という）、すなわち合計２００個体を得た。そして、前記Ｆ２分離集団の前記２００個体に対して、再度、ＺＹＭＶの接種試験を行った。
　その前記Ｆ２分離集団のうち前記I型集団において、ＺＹＭＶ接種の結果、ＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）の個体は２３個体、罹病性（発病度４）の個体は７７個体であった。一方、前記II型集団において、ＺＹＭＶ接種の結果、ＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）の個体は２７個体、罹病性（発病度４）の個体は７３個体であった。すなわち、ＺＹＭＶ抵抗性の個体数とＺＹＭＶ罹病性の個体数との比は、Ｉ型集団およびII型集団のいずれにおいても、約１：３であった。ＺＹＭＶ罹病性の個体を、ＺＹＭＶ罹病性系統とした。
　つぎに、前記ＺＹＭＶ罹病性系統の個体から、Ｆ３分離集団（自殖後代）を得た。そして、前記ＺＹＭＶ罹病性系統の１系統あたり前記Ｆ３分離集団の１０個体に対して、前述と同様に、ＺＹＭＶの接種試験を行った。その結果、Ｆ３分離集団の各系統の１０個体は、全てＺＹＭＶ罹病性であるか、または、ＺＹＭＶ抵抗性（発病度１以下）の個体とＺＹＭＶ罹病性（発病度３以上）の個体との比が、約１：３であった。なお、前記ＺＹＭＶ抵抗性系統の個体から得た、Ｆ３分離集団（自殖後代）は、全てＺＹＭＶ抵抗性（発病度１以下）であった。以上の結果により、ＺＹＭＶ抵抗性形質は、Ｉ型抵抗性およびＩＩ型抵抗性ともに、単因子劣性で遺伝することが判明した。
［実施例３］
　ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座の特定を行った。
（１）ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座
　前記実施例１で得られた前記Ｆ２分離集団のＰＲＳＶ抵抗性系統のキュウリ植物５個体、および実施例２で得られた前記Ｆ２分離集団のＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物５個体について、第６染色体上の２つのＳＳＲ（単純反復配列）マーカーの周辺領域約２００ｋｂｐについて、シーケンスを行った。その結果、前記ＰＲＳＶ抵抗性系統のキュウリ植物は、配列番号１で示す領域の２５番目（Ａ）、８０番目（Ｔ）、１１８番目（Ｔ）、１３０番目（Ｃ）および３１７番目（Ｇ）に、特異的なＳＮＰが検出された。
　そこで、実施例１で得られた前記Ｆ２分離集団の１０４個体について、ＰＣＲを行い、得られた増幅産物のシーケンスを解析した。前記ＰＣＲには、配列番号５の塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号６の塩基配列からなるリバースプライマーを使用し、ＰＣＲプログラムは、９４℃：１分、９４℃：３０秒、５８℃：３０秒、７２℃：１分、７２℃：５分、３０サイクルに設定した。
フォワードプライマー（配列番号５）
　　AGCAATTTCAAGGAGCAAGC
リバースプライマー（配列番号６）
　　CTCTCCAATCCAGCAACAT
　前記プライマーセットは、配列番号１、配列番号２および配列番号３の全長に対応する下記配列番号４の塩基配列を増幅できる。なお、下記配列において、四角で囲んだ部位は、検出目的のＳＮＰの位置を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　そして、前記Ｆ２分離集団について、前記配列番号４の塩基配列における２５番目、８０番目、１１８番目、１３０番目および３１７番目のＳＮＰとＰＲＳＶ抵抗性形質との適合性を確認した。その結果、ＰＲＳＶ抵抗性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、２５番目はＡ、８０番目はＴ、１１８番目はＴ、１３０番目はＣ、３１７番目はＧのＳＮＰであり、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有することが確認された。つまり、前記配列番号１の塩基配列で表わされる前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有していた。そして、前記ＰＲＳＶ抵抗性を示す個体は、このＳＮＰを示すＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、ホモ接合体であることがわかった。これに対して、ＰＲＳＶ罹病性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、２５番目はＧ、８０番目はＣ、１１８番目はＣ、１３０番目はＧ、３１７番目はＡであり、前記配列番号１の塩基配列で表わされるＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座ではなく、罹病性遺伝子座を有することが確認された。そして、前記ＰＲＳＶ罹病性を示す個体は、前記ＰＲＳＶ罹病性遺伝子座が、ホモ接合体またはヘテロ接合体であることがわかった。これらの結果から、前記配列番号１の塩基配列における５カ所のＳＮＰにより、ＰＲＳＶ抵抗性系統のキュウリ植物を選抜できることがわかった。
（２）ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座
　前記実施例２で得られた前記Ｆ２分離集団である、Ｉ型集団の１００個体、およびII型集団の１００個体について、前記（１）と同様にして、ＰＣＲを行い、得られた増幅産物のシーケンスを解析した。
　そして、前記Ｆ２分離集団について、前記配列番号４の塩基配列における９３番目および３０７番目のＳＮＰとＺＹＭＶ抵抗性形質との適合性を確認した。その結果、Ｉ型集団におけるＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、９３番目はＡ、３０７番目はＡのＳＮＰであり、前記Ｉ型のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有することが確認された。つまり、前記配列番号２の塩基配列で表わされる前記Ｉ型のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有していた。そして、前記Ｉ型のＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、このＳＮＰを示すＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、ホモ接合体であることがわかった。また、II型集団におけるＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、９３番目はＡのＳＮＰであり、前記II型のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有することが確認された。つまり、前記配列番号３の塩基配列で表わされる前記II型のＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有していた。そして、前記II型のＺＹＭＶ抵抗性を示す個体は、このＳＮＰを示すＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、ホモ接合体であることがわかった。これに対して、ＺＹＭＶ罹病性を示す個体は、前記配列番号４の塩基配列において、９３番目はＧ、３０７番目はＧであり、前記配列番号２または３の塩基配列で表わされるＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座ではなく、罹病性遺伝子座を有することが確認された。そして、前記ＺＹＭＶ罹病性を示す個体は、前記ＺＹＭＶ罹病性遺伝子座が、ホモ接合体またはヘテロ接合体であることがわかった。これらの結果から、前記配列番号２の塩基配列における２カ所のＳＮＰまたは前記配列番号３の塩基配列における１カ所のＳＮＰにより、ＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物を選抜できることがわかった。
［実施例４］
　ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を作成した。
　前記実施例１に示す前記寄託系統のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３）と、食味および草姿等の農業形質の優れるキュウリ植物「夏すずみ（タキイ種苗）」とを交雑して、Ｆ１（雑種第一代）を得た。そして、前記Ｆ１を自殖させることによって、４００個体のＦ２（自殖後代）を得た。前記Ｆ２について、前記実施例３と同様にして、シーケンスを解析し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有する個体を選択した。そして、これらを、ＰＲＳＶ抵抗性を備えた個体として圃場に定植し、目視にて農業形質の優れる個体を選抜した。そして、この手順を４回繰り返して、ＰＲＳＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる個体を得た。これを、系統Ａのキュウリ植物という。
　他方、前記実施例２で得られた前記Ｉ型個体（Ｉ型ＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物）と、食味および草姿等の農業形質の優れるキュウリ植物「夏ばやし（タキイ種苗）」とを交雑して、Ｆ１（雑種第一代）を得た。そして、前記Ｆ１を自殖させることによって、３９８個体のＦ２（自殖後代）を得た。前記Ｆ２について、前記実施例３と同様にして、シーケンスを解析し、前記ＺＹＭＶ抵抗性を有する個体を選択した。そして、これらを、ＺＹＭＶ抵抗性を備えた個体として圃場に定植し、目視にて、農業形質の優れる個体を選抜した。そして、この手順を４回繰り返して、ＺＹＭＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる個体を得た。これを、系統Ｂのキュウリ植物という。
　そして、ＰＲＳＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる前記系統Ａのキュウリ植物を、第一の親とし、Ｉ型ＺＹＭＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる前記系統Ｂの植物を、第二の親とし、これらを交雑して、１２個体のＦ１（雑種第一代）である系統ＡＢを得た。前記Ｆ１である前記系統ＡＢの１２個体に対して、前記実施例１および２と同様に、ＰＲＳＶの接種試験およびＺＹＭＶの接種試験を行った。また、対比のために、前記I型個体、前記II型個体、既報のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物である「Ｓｕｒｉｎａｍ（North　Carolina　State　University　Cucumber　Gene　Stock　Collection;　NCG-086)、既報のＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物である「ＴＭＧ１（North　Carolina　State　University　Cucumber　Gene　Stock　Collection;　NCG-085）」、および、両ウイルスに罹病性のキュウリ植物「北進（タキイ種苗）」、それぞれ５個体に対しても、同様に接種試験を行った。
　前記接種試験の結果を下記表５に示す。Ｆ１である前記系統ＡＢの１２個体は、全て、完全なＰＲＳＶ抵抗性（発病度０）およびＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）であり、また、生育開始から生育後期まで、その抵抗性が維持できることが確認できた。すなわち、ＰＲＳＶ遺伝子座およびＺＹＭＶ遺伝子座は、ともに劣性で遺伝するにもかかわらず、これらの遺伝子座をヘテロ接合体で有する前記１２個体が、完全なＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　つぎに、前記Ｉ型ＺＹＭＶ抵抗性系統のキュウリ植物に代えて、前記実施例２で得られた、II型ＺＹＭＶ抵抗性を備え、かつ、農業形質の優れる前記系統Ｃを使用する以外は、同様の実験を行った。
　前記接種試験の結果を前記表５にあわせて示す。Ｆ１である前記系統ＡＣの８個体も、ＰＲＳＶ抵抗性（発病度１）およびＺＹＭＶ抵抗性（発病度０）が確認できた。すなわち、前記Ｉ型個体と同様に、ＰＲＳＶ遺伝子座およびＺＹＭＶII型遺伝子座をヘテロ接合体で有する前記８個体が、育種利用に十分なＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えることが判明した。
　さらに、比較のため、ＰＲＳＶ抵抗性である前記系統Ａに代えて、既報のＰＲＳＶ抵抗性系統「Ｓｕｒｉｎａｍ」を使用する以外は、同様の実験を行った。その結果を前記表５にあわせて示す。「Ｓｕｒｉｎａｍ」とＩ型ＺＹＭＶ抵抗性キュウリとのＦ１、および、「Ｓｕｒｉｎａｍ」とII型ＺＹＭＶ抵抗性キュウリとのＦ１は、ＰＲＳＶに対しては中程度抵抗性以上（発病度１、２）を示したものの、ＺＹＭＶに対しては罹病性（発病度３）を示した。この結果より、ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座およびＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座（Ｉ型、ＩＩ型）をヘテロで有するにも関わらず、両ウイルス抵抗性となるのは、前記配列番号１の塩基配列をＰＲＳＶ抵抗遺伝子座として有するキュウリ植物（例えば、寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３由来のキュウリ植物）であることが判明した。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０１３年３月４日に出願された日本出願特願２０１３－０４２３６５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　以上のように、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑することによって、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリの品種が得られる。このため、本発明のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物によれば、ＰＲＳＶおよびＺＹＭＶの感染による収量低下および農薬使用の増加などの経済的ならびに労力的な損失を、大きく軽減できる。
[規則26に基づく補充 14.04.2014]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (15)

  1. 第６染色体上にＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座を有し、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有することを特徴とするＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
    （Ａ１）配列番号１の塩基配列
    （Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
  2. 前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３で特定されるキュウリ植物またはその後代系統である、請求項１記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
  3. 前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、植物体またはその部分である、請求項１または２記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
  4. 前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が種子である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
  5. 前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、さらに、ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座によって供与されるＺＹＭＶ抵抗性を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
  6. 第６染色体上に、前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座および前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
  7. 前記ＰＲＳＶ抵抗性遺伝子座および前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、ヘテロ接合体である、請求項５または６記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
  8. 前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ｂ１）、（Ｂ２）または（Ｂ３）の塩基配列を有する、請求項５から７のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
    （Ｂ１）配列番号２の塩基配列
    （Ｂ２）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ｂ３）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
  9. 前記ＺＹＭＶ抵抗性遺伝子座が、下記（Ｃ１）、（Ｃ２）または（Ｃ３）の塩基配列を有する、請求項５から７のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物。
    （Ｃ１）配列番号３の塩基配列
    （Ｃ２）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ｃ３）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
  10. 下記（ａ）および（ｂ）工程を含むことを特徴とするＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を示すキュウリ植物の製造方法。
    （ａ）請求項１から４いずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物と、ＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物とを交雑する工程、
    （ｂ）前記（ａ）工程より得られたキュウリ植物またその後代系統から、ＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性を備えるキュウリ植物を選抜する工程
  11. 前記（ａ）工程に先立って、下記（ｘ）工程を有する、請求項１０記載のＰＲＳＶ抵抗性およびＺＹＭＶ抵抗性キュウリ植物の製造方法。
    （ｘ）請求項１から４のいずれか一項に記載のＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物を選抜する工程
  12. 前記（ｘ）工程における前記選抜が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜である、請求項１１記載の製造方法。
    （Ａ１）配列番号１の塩基配列
    （Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
  13. 前記（ｂ）工程における前記選抜が、下記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列を有するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
    （Ａ１）配列番号１の塩基配列
    （Ａ２）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ａ３）配列番号１の塩基配列における２５番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＰＲＳＶ抵抗性を示す塩基配列
  14. 前記（ｂ）工程における前記選抜が、前記（Ａ１）、（Ａ２）または（Ａ３）の塩基配列と、下記（Ｂ１）、（Ｂ２）もしくは（Ｂ３）の塩基配列または下記（Ｃ１）、（Ｃ２）もしくは（Ｃ３）の塩基配列とを有するＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物の選抜である、請求項１３記載の製造方法。
    （Ｂ１）配列番号２の塩基配列
    （Ｂ２）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ｂ３）配列番号２の塩基配列における９３番目のＡおよび３０７番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ｃ１）配列番号３の塩基配列
    （Ｃ２）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
    （Ｃ３）配列番号３の塩基配列における９３番目のＡが保存され、前記塩基配列における１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列であり、ＺＹＭＶ抵抗性を示す塩基配列
  15. 前記（ａ）工程の前記ＰＲＳＶ抵抗性キュウリ植物が、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５２３で特定されるキュウリ植物またはその後代系統である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
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