WO2014125455A1 - Un anticorps monoclonal contre le recepteur cd5 a multiples applications en medecine et en recherche anti-cancereuse - Google Patents

Un anticorps monoclonal contre le recepteur cd5 a multiples applications en medecine et en recherche anti-cancereuse Download PDF

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WO2014125455A1
WO2014125455A1 PCT/IB2014/059059 IB2014059059W WO2014125455A1 WO 2014125455 A1 WO2014125455 A1 WO 2014125455A1 IB 2014059059 W IB2014059059 W IB 2014059059W WO 2014125455 A1 WO2014125455 A1 WO 2014125455A1
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WO
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antibody
peptide
cells
sample
ligands
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Application number
PCT/IB2014/059059
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Hélène Gary
Ali Dalloul
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Universite Paris Sud Xi
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • G01N33/57426—Specifically defined cancers leukemia
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the present invention relates to the field of the development of new medical diagnostic tools, in particular for the diagnosis of cancers such as chronic lymphocytic leukemia.
  • Chronic lymphocytic leukemia also known as CLL, is a cancerous disease characterized by monoclonal lymphoid proliferation, responsible for medullary, blood, sometimes ganglionic infiltration, consisting of mature lymphocytes of normal morphology and phenotype B.
  • Chronic lymphoid leukemias represent the most common form of leukemia in adults in the West (Gary-Gouy et al, 2007, J Immunol, 179: 4335-4344). It is not found in the child.
  • Chronic evolution, LLC remains today an incurable disease, but slow progress for a large majority of patients.
  • CLL mainly affects individuals over the age of 50, and the majority of them are male. The incidence of CLL is currently estimated at 3.5 new cases per year per 100,000 people in the United States.
  • the occurrence of CLL is detected in a blood count, which demonstrates hyperlymphocytosis.
  • the diagnosis of hyperlymphocytosis is at least indicative to suspect the occurrence of an LLC.
  • an immunophenotyping test is commonly performed, which makes it possible to calculate a score value (called “Matutes” score, ranging from 0 to 5 according to the expression or not of various antigens). According to this test, a score value greater than or equal to 4 is indicative of the occurrence of an LLC.
  • a so-called "Matutes” score consists in putting in contact a sample, previously taken from an individual to be tested, with a combination of five antibodies, respectively anti-CD5, anti -CD22, anti-CD23, anti-FMC7 and anti-IgS, (Matutes et al., 1994, Leukemia, 8: 1640-45; Matutes et al., 1994, Leuk Lymphoma, 14 Suppl 1: 57-61). Then a score is established on a scale of 0 (no CLL or atypical) to 5 (probable CLL) depending on the positive character of the labeled lymphocytes, which score makes it possible to distinguish CLL from other types of leukemia.
  • the Matutes score makes it possible to distinguish CLL from hairy cell leukemia (HCL), variants of these tricholeukemias (HCL-variants), other atypical forms such as SLVL (or Splenic Lymphoma with Villous Lymphocytes), prolymphocytic leukemias (or PLL), follicular lymphomas, lymphoplasmacytic lymphomas, mantle lymphomas (or MCL), or LCL (Large Cell Lymphoma) type lymphomas.
  • HCL hairy cell leukemia
  • HCL-variants variants of these tricholeukemias
  • other atypical forms such as SLVL (or Splenic Lymphoma with Villous Lymphocytes), prolymphocytic leukemias (or PLL), follicular lymphomas, lymphoplasmacytic lymphomas, mantle lymphomas (or MCL), or LCL (Large Cell Lymphoma) type lymphomas.
  • the Matutes test is insufficiently sensitive and does not allow to diagnose early forms of CLL, let alone pre-CLS, and in particular asymptomatic forms preceding the first clinical signs of the disease.
  • the etiological treatment of CLL is based on oral or injection chemotherapy.
  • intensive therapy may be offered in the form of intensive chemotherapy followed by bone marrow transplantation.
  • the bone marrow transplant can be a autograft or an allograft.
  • the chemotherapy treatments used in the intensive treatment of CLL are chlorambucil, fludarabine and a combination of Cyclophosphamide, (H) adriamycin, Oncovin (vincristine) and Prednisolone (therapeutic combination also called CHOP).
  • Cyclophosphamide H
  • Oncovin vincristine
  • Prednisolone therapeutic combination also called CHOP.
  • Modern first-line therapies routinely use fludarabine alone, or combined with other chemotherapy (cyclophosfamide) or immunotherapy (anti-CD20 / Rituximab)
  • CLL treatments may also include the treatment of autoimmune complications and infectious complications.
  • the CD5 antigen has been proposed in the state of the art as one of the major diagnostic markers for chronic lymphocytic leukemia, or CLL (Boumsell et al., 1980, J. Exp Med., 152: 229-234).
  • the CD5 antigen (or "Differentiation Cluster 5") is a co-receptor of the antigen receptor present as a marker on the surface of T cells as well as a sub-population of B lymphocytes.
  • CD5 T cell antigen receptor
  • B cells can be separated into different subgroups, called B-1a, B-1b, and B-2.
  • B-2 lymphocytes are the most conventional; they are produced in the bone marrow during adult life, and unless otherwise stated will be mentioned only as B lymphocytes. Although these B cells do not express, unlike T or B-la, the marker CD5 in a constitutive way, they can however express it after activation of these lymphocytes, in particular by T-dependent antigens.
  • B-1a and B-1b lymphocytes are generally referred to as "fetal" lymphocytes, and localized in pleural cavities and / or peritoneum. Fila lymphocytes exhibit very particular properties, such as self-renewing abilities, as well as production of large quantities of IgM, IgG3 and IgA poly-reactive antibodies (Tarakhovsky, A., 1997). J. Exp Med 185, 981-984).
  • the subgroup B-1a expresses CD5 constitutively, while the other subgroups B-1b and B2 do not express it at all.
  • the CD5 marker also plays a modulation role in IgM-mediated activation, by physically interacting with the cell antigen associated receptor.
  • B or BCR
  • CD5 Overexpression of CD5 in B lymphocytes has also been shown to play a role in tolerance to self antigens. By modulating the activation threshold, CD5 thus prevents the cell death induced by this activation and maintains the tolerance of the anergic B cells in vivo (Hippen et al., 2000, J. Exp Med., 191: 883-890). Similarly, following the activation of a lymphocyte by the antigen, the activation of CD5 in turn prevents an excessive immune response generating autoimmunity.
  • the CD5 marker is therefore a particular subject of study in the areas of autoimmune and / or proliferative disease diagnosis ( Pers et al, 1999, Int J Mol Med., 3 (3): 239-45).
  • CD5 associated with the antigen receptor signaling pathway BCR or TCR
  • BCR or TCR antigen receptor signaling pathway
  • the active form of the CD5 receptor is induced by phosphorylation of the intracellular region of CD5.
  • the intracellular portion of CD5 is thus capable of recruiting other effector proteins, particularly other kinases, and thus modulating the signaling pathway of the receptor to the antigen.
  • the CD5 marker is a monomeric, approximately 67 kDa transmembrane protein having an extracellular region, a transmembrane region and an intracellular region.
  • This protein belongs to a family of proteins expressed by cells of the immune system. However, the structural study of this protein is limited by its transmembrane nature as well as its sensitivity to denaturation (Brown & Lacey, 2010, J Immunol, 185 (10), 6068-6074).
  • the CD5 protein of sequence SEQ ID No. 2, comprises a total of 495 amino acids. It further comprises a signal sequence, or signal peptide, of 24 amino acids at the N-terminus of the protein.
  • the transmembrane region extends from amino acid 380 to about 402 and directly follows the C-terminal portion of the third SRCR domain.
  • the intracellular region extends from amino acid 403 to the C-terminus of the protein.
  • This region consists of a cytoplasmic tail susceptible to to be post-translationally modified, as part of the antigen receptor signaling pathway (TCR and BCR), at its intracellular regulatory domain. Some of these changes will thus lead to the activation of CD5.
  • the activation step of CD5, which necessarily and directly results from the activation of the receptor to the antigen, should be distinguished from the additional steps of phosphorylation or even dephosphorylation of CD5, which will modulate the antigen receptor signaling.
  • the sequence of the CD5 protein considered by the invention is preferably that defined according to SEQ ID No. 2. It should be noted, however, that in the literature, the CD5 sequence considered may omit the first 24 amino acids constituting the N-terminal signal sequence, or signal peptide. Unless indicated otherwise, the numbering of the amino acids considered here refers to the numbering defined by this sequence SEQ JD No. 2, and which therefore comprises the N-terminal signal sequence. Of course, natural polymorphisms and variants of CD5 are also considered. In particular, the CD5 sequences referenced in Carnero-Montoro et al.
  • the present invention provides ligands, particularly antibodies, specifically binding to the activated form of the CD5 antigen of SEQ ID NO: 2, which is phosphorylated on the tyrosine residue at position 453, as well as methods of detection, diagnosis and prognosis using said ligands.
  • a monoclonal antibody directed against a peptide comprising the following sequence of formula (I):
  • y is an integer consisting of 0 or 1
  • z is an integer consisting of 0 or 1
  • Nt consists of a peptide of 1 to 100 amino acids in length
  • - Ct consists of a peptide of 1 to 100 amino acids in length.
  • X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , ⁇ , X 7 , X 8 and X 9 each represent, independently of each other, an amino acid residue.
  • the present invention also relates to methods and kits for detection of activated CD5 using a monoclonal antibody as defined above.
  • an activated CD5 detection kit comprising the same antibody, as well as another antibody recognizing the non-active form of the CD5 receptor.
  • said monoclonal antibody is combined with one or more other antibodies, in particular one or more other antibodies selected from anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS and / or anti- ⁇ chains. or ⁇ .
  • said monoclonal antibody may be combined with one or more other ligands, particularly one or more other antibodies.
  • the invention also relates to methods for determining the occurrence of chronic lymphocytic leukemia in which the monoclonal antibody as defined above is used.
  • the invention particularly relates to in vitro methods for the detection of activated CD5, as well as to determining the occurrence of chronic lymphocytic leukemia, comprising the following steps:
  • Figure 1 expression of CD5 phosphorylated on tyrosine 453, after immunofluorescence staining and flow cytometric analysis of CLL cells, purified B cells of human peripheral blood from a healthy donor and mantle cell lymphoma cells.
  • the CD19 surface marking is indicated on the ordinate for all series except line 3.
  • Line 1 CD5 labeling (abscissa); line 2: CD23 labeling (abscissa); lane 3: labeling Kappa chains ⁇ (abscissa) and Lambda ⁇ membrane IgM (ordinate);
  • line 4 intracellular labeling isotypic control, after fixation and permeabilization of cells;
  • line 5 intracellular labeling with PCD5 antibody coupled to Alexa 488, after fixation and permeabilization of the cells.
  • FIG. 4a shows the presence of PCD5 after immunoprecipitation by an anti-PCD5 antibody, on western blot and by anti-CD5 or antiphosphotyrosine.
  • Figure 4b compares the presence of PCD5 and CD5 on both total lysate and after immunoprecipitation.
  • Figure 3 ELISA titration of an anti-PCD5 IgG polyclonal (pAb) and monoclonal (mAb) antibody against the native synthetic peptide and the same phosphorylated peptide.
  • the initial concentrations of monoclonal and polyclonal antibodies are respectively 10 and 130 ⁇ g / mL.
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • chronic lymphocytic leukemia is a cancerous disease characterized by a monoclonal lymphoid proliferation as defined above.
  • LLC-B chronic lymphocytic leukemia
  • CD5 antigen having the tyrosine residue at position 453 in phosphorylated form may also be referred to as "PCD5".
  • a "ligand” encompasses any type of molecule binding to a target molecule, and notably includes antibodies, nucleic aptamers and protein aptamers, in particular antibodies.
  • the Applicant has developed a method for obtaining antibody-type ligands specifically binding to the activated form of the CD5 antigen phosphorylated on the tyrosine residue at position 453.
  • ligands in particular antibodies, directed against a small peptide of 13 amino acids in length and phosphorylated on the tyrosine residue at the 8-position of said peptide, are capable of binding specifically, in situ, on the intracytoplasmic region of the activated form of CD5 antigen which is indicative of the occurrence of CLL.
  • the monoclonal antibody thus obtained has particular properties of specificity with respect to the tyrosine phosphorylated motif DNEY 453 (P03H 2 ), and over the entire peptide domain of the CD5 surrounding this tyrosine, of sequence SEQ ID No. l.
  • This phosphorylated unit which comprises a DNEY 453 sequence, comprising the Y453 residue, is a consensus site corresponding to the autophosphorylation motif of Src family tyrosine kinase proteins (Gary-Gouy et al., 2002, J Immunol, 168, 232-239). ).
  • the consensus sequence of this autophosphorylation motif corresponds in particular to a D (D / N) XpY motif, potentially recognized by other proteins such as the proto-oncogene Cbl (Lupher et al., 1997, J. Biol Chem., 272 (52)). ): 33140-4). Indeed, in 1997, Lupher et al.
  • DNEY 416 motif of Src kinase was phosphorylated, it corresponded to the D (D / N) xpY type sequence of the protein tyrosine binding PTB domain of the Cbl protein.
  • DNEY could be a binding motif to Src kinase.
  • This phosphorylated CD5 sequence serves as a tyrosine anchoring site for effector or intermediate proteins, and potentially kinases (including proteins of the family of src kinases via their SH2 domain for Src Homology -2 domain) that are undetermined. which phosphorylates CD5 on one or more tyrosines, and in particular the functionally critical tyrosine, Y453.
  • an antibody directed against a short-length peptide i.e., normally a peptide comprising one or more linear-type epitopes, has the ability to recognize an intra-cytoplasmic region. a protein of several hundred amino acids in length, which is therefore likely to comprise essentially conformational epitopes.
  • the Applicant's work makes it possible to target even more specifically, among lympho-proliferative syndromes, the diagnosis or prognosis of chronic lymphoid leukemia type B (LLC or B-LLC).
  • LLC chronic lymphoid leukemia type B
  • CLL-leukemic B cells have been selected by permanent interactions with a self-antigen.
  • these leukemic cells must necessarily have escaped this negative selection process. It is likely that the encounter of BCR with a self antigen involves the phosphorylation of CD5 on tyrosines; therefore, LLC type B cells expressing a self-reactive repertoire, should also express the CD5 marker in a particular and phosphorylated form.
  • LLC type B cells express on their surface the CD5 marker in its active form, as defined in the present description.
  • MBL (or "monoclonal B lymphocytosis") is usually asymptomatic, characterized as an early form of CLL (or LLC-like), but not requiring any special treatment. However, it requires monitoring to determine its evolution (Marti et al, 2005, Br J Haematology, 130, 325-332). There is currently no single criterion for distinguishing MBL or LLC type B cells. However, the World Health Organization (WHO) proposes a threshold of 5x10 9 cells per liter of monoclonal B cells in order to appreciate the difference between these two pathologies (Kern et al, 2012, Br J Haematol, 157 (1) , 86-96).
  • WHO World Health Organization
  • the present invention also encompasses the use of an antibody according to the invention as a tool for monitoring the evolution of monoclonal lymphocyte proliferations (of the MBL type) towards a pathological stage. LLC type (or LLC-hke).
  • antibodies that recognize tyrosine phosphorylated proteins such as anti-PY705-STAT3, (Santa Cruz Biotechnology, reference sc-8059), anti-PY1054-1055-Tyk2 (Cell Signaling reference 9321 ), or anti-PY694-STAT5 (Cell Signaling, reference 9351).
  • the present invention relates to a monoclonal antibody directed against a peptide comprising the following sequence of formula (I):
  • y is an integer consisting of 0 or 1
  • z is an integer consisting of 0 or 1
  • Nt consists of a peptide of 1 to 100 amino acids in length
  • - Ct consists of a peptide of 1 to 100 amino acids in length
  • X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , ⁇ , X 7 , X 8 and X 9 each represent, independently of each other, an amino acid.
  • the monoclonal antibody defined above specifically recognizes the active form of the CD5 antigen which is phosphorylated on the tyrosine residue located at position 453 of the CD5 amino acid sequence of SEQ ID N 2.
  • the monoclonal antibody of the invention which specifically binds to the phosphorylated CD5 antigen on the tyrosine residue at position 453 ("PCD5"), can be designated as "anti-human” antibody.
  • PCD5 ".
  • the term "monoclonal antibody” means antibodies recognizing the same epitope and derived from the same plasmocyte line. These antibodies are generally produced from rodent plasma cells, such as the mouse, the rat or the rabbit.
  • active form or “activated form” of CD5 is meant a CD5 state resulting directly and necessarily from the activation of the antigen receptor (TCR or BCR), and which is phosphorylated on the tyrosine residue at position 453 of CD5.
  • TCR antigen receptor
  • the present invention relates to a monoclonal antibody directed against a peptide comprising, or alternatively consisting of, the following sequence of formula (I):
  • y is an integer consisting of 0 or 1
  • z is an integer consisting of 0 or 1
  • Nt consists of a peptide of 1 to 100 amino acids in length
  • - Ct consists of a peptide of 1 to 100 amino acids in length
  • X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , ⁇ , X 7 , X 8 and X 9 each represent, independently of each other, an amino acid residue.
  • Nt peptide of 1 to 100 amino acids in length encompasses peptides of 1, 2, 3, 4,
  • a Ct peptide of 1 to 100 amino acids in length comprises peptides of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 , 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 and 100 amino acids in length.
  • the Nt peptide is 10 amino acids in length or less, which includes 4 amino acids in length.
  • the Ct peptide is 10 amino acids in length or less, which includes 5 amino acids in length.
  • an amino acid is chosen from the following amino acids: A (Alanine), G (Glycine), V (Valine), L (Leucine), I (Isoleucine, M (Methionine), P (Proline ), W (Tryptophan), F (Phenylalanine), M (Methionine), H (Histidine), S (Serine), T (Threonine), C (Cysteine), N (Asparagine), Q (Glutamine), Y (Tyrosine) ), D (Aspartic Acid), E (Glutamic Acid), K (Lysine) and R (Arginine).
  • amino acids X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 , X 7 , X 5 and X may be identical or different.
  • Cysteine and methionine also include so-called "non-natural" amino acids such as Selenocysteines and Selenomethionines.
  • said monoclonal antibody is directed against a peptide of formula (I), wherein:
  • X 1 and X 4 are non-polar amino acids selected from A, G, V, L, I,
  • X 2 and X 5 are polar amino acids chosen from S and T,
  • X3 and X are basic amino acids chosen from H, K and R,
  • - X7 and Xg are pralines.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody directed against a peptide or a protein comprising, and preferably consisting of, the sequence SEQ ID No. 1 phosphorylated on tyrosine:
  • the term "antibody” will be understood to mean in particular monoclonal antibodies or fragments (for example the F (ab) ' 2 , F (ab)) fragments or any peptide comprising a domain of the initial antibody which recognizes the peptide of formula (I), including any peptide comprising a domain of the initial antibody recognizing the tyrosine phosphorylated peptide of sequence SEQ ID No. 1.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas according to the dehydrated technique by KOHLER and MILSTEIN (1975).
  • the present invention therefore also relates to monoclonal antibodies directed against a peptide of formula (I), including monoclonal antibodies directed against a tyrosine phosphorylated peptide of sequence SEQ ID No. 1, said monoclonal antibodies being produced according to the trioma technique or still the hybridoma technique described by KOZBOR et al. (1983).
  • the invention also relates to Fv (ScFv) single chain antibody fragments specifically binding to a peptide of formula (I), including a tyrosine phosphorylated peptide of sequence SEQ ID No. 1, and produced according to US Pat. technique described in US Patent No. 4,946,778 or by MARTINEAU et al. (1998).
  • the monoclonal antibodies according to the invention also include antibody fragments obtained using phage libraries as described by RIDDER et al. (1995) or humanized antibodies as described by REINMANN et al. (1997) and LEGER et al. (1997).
  • a monoclonal antibody according to the invention may further comprise an isotopic or non-isotopic detectable marker, for example a fluorescent marker, or else be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • an isotopic or non-isotopic detectable marker for example a fluorescent marker, or else be coupled to a molecule such as biotin, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the monoclonal antibodies are chosen from:
  • An antibody according to the invention may in particular be of IgG isotype, such as IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3, IgA or IgM.
  • an antibody is chosen from IgA-3 kappa isotype antibodies and an IgM-kappa isotype antibody as a function of their specificity with respect to the immunizing phosphorylated peptide.
  • an antibody according to the invention may be a mouse antibody.
  • Such an antibody can be obtained by the methods described in (Bismuth G,
  • a monoclonal antibody according to the invention can be produced from a hybridoma derived from the cell fusion of B cells from the spleen of immunized Balb / c mice is carried out with SP2 / 0 myeloma.
  • This phosphorylated pattern of 13 amino acids is unique to the human CD5 protein.
  • the monoclonal antibody according to the invention is specific for the active form of the CD5 or PCD5 receptor.
  • this active form of the CD5 receptor is expressed on the surface of T lymphocytes and B lymphocytes and normal Bcl-a lymphocytes after activation and B lymphocytes of the LLC type.
  • the sequence of the CD5 protein under consideration may advantageously be that defined according to SEQ ID No. 2.
  • the known natural polymorphisms of CD5 are also considered. As seen above, for example, the CD5 sequences referenced in Carnero-Montoro et al. (Carnero-Montoro et al., Evolutionary and functional evidence for positive selection at the CD5 human immune receptor gene, 2012, Mol Biol Evol., 29 (2): 811-23).
  • the antibody of the invention makes it possible to recognize the human and murine forms of CD5 because of a strong sequence homology of the cytoplasmic domain of the human and murine CD5 forms.
  • the antibody of the invention specifically recognizes the active form of CD5 or PCD5, for example the form of CD5 which is activated following the commitment of the TCR or the BCR, in particular BCR.
  • this activated form corresponds to the form of CD5 phosphorylated on its intracellular regulatory domain following the commitment of the BCR.
  • an antibody according to the invention is capable of discriminating the active form of CD5 (also called "PCD5") from the non-active form.
  • the antibody of the invention specifically recognizes the DNEY motif of CD5, in its phosphorylated form on Y453 as well as the Peptide sequence of CD5 encompassing this DNEY motif, in particular the intracellular CD5 regulatory domain.
  • intracellular CD5 regulatory domain is meant the intracellular region of CD5 between amino acid 446 and amino acid 458, and comprising a DNEY motif.
  • a monoclonal antibody according to the invention does not cross-react with a peptide of SEQ ID No. 1 or the non-phosphorylated tyrosine form of a peptide of formula (I), in particular with a peptide of SEQ ID No. ° l.
  • a monoclonal antibody according to the invention does not cross-react with an isolated phosphorylated tyrosine.
  • a monoclonal antibody according to the invention does not cross-react with the non-activated form of the CD5 receptor.
  • a monoclonal antibody according to the invention does not cross-react with an isolated phosphorylated tyrosine, or the non-activated form of the CD 5 receptor.
  • a monoclonal antibody according to the invention does not cross-react with:
  • cross-reaction is meant the ability of an antibody to detectably bind to an isolated phosphorylated tyrosine, or to a peptide distinct from a peptide of formula (I), in particular to a peptide distinct from the peptide of SEQ. ID NO: 1 phosphorylated on tyrosine.
  • Those skilled in the art are thus perfectly capable of determining a detection threshold to establish the presence or absence of a cross-reaction according to the method employed.
  • a detection method will be considered among a group comprising ELISA techniques, western blots, immunoprecipitation, immunofluorescence, immunohistochemistry, flow cytometry, mass cytometry, electron microscopy, protein chips or "protein arrays", or as defined by Examples 4 and 5.
  • the monoclonal antibody according to the invention can therefore be used by ELISA, Western-blot, immunoprecipitation, immunofluorescence, immunohistochemistry, flow cytometry, mass cytometry, electron microscopy and protein-array chips.
  • An antibody according to the invention is thus particularly advantageous for use in immunohistochemistry or in flow cytometry.
  • the antibody may be combined covalently or non-covalently with a detectable molecule.
  • detectable molecule are well known to those skilled in the art.
  • an example of a detectable molecule is illustrated in Example 2.
  • an antibody coupled to a detectable molecule selected from the following group: (i) a radioactive molecule, (ii) a fluorescent molecule, (iii) a luminescent molecule, (iv) a receptor molecule selectively recognized by a ligand and (v) a metal tag.
  • an antibody coupled to a radioactive molecule such as a natural or radioactive heavy isotope, a luminescent molecule such as a chromophore, a luminophore, a fluorophore, a calorimetric agent, a magnetic substance, an electrochemical marker, or luminescent, a spin marker, gold or silver particles, or enzymes or substrates.
  • a radioactive molecule such as a natural or radioactive heavy isotope
  • a luminescent molecule such as a chromophore, a luminophore, a fluorophore, a calorimetric agent, a magnetic substance, an electrochemical marker, or luminescent, a spin marker, gold or silver particles, or enzymes or substrates.
  • Fluorophores can advantageously be used, as well as lanthanide complexes and metal labels, especially Europium and Terbium, fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), dichlorotriazinylamine, rhodamine, eosin, coumarin, methyl-coumarines , pyrene, Malachite green, Cy ® or Alexa ® fluorophores (Invitrogen) such as Cy ® 3, Cy ® 5, Alexa Fluor ® 488, Lucifer Yellow, Cascade Blue, Texas Red, dansyl chloride , phycoerythrin, luciferin, GFP and its variants, boron-dipyromethene (BODIPY), and others known in the prior art such as those described in Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 6th Edition ; The Synthegen catalog (Houston, Tex.), Lakowicz, Principles of Fluor
  • the anti-PCD5 antibodies of the invention advantageously make it possible to distinguish the inactive forms of CD5 from the activated forms.
  • the phenomenon of activation of the CD5 receptor can thus be induced, in a non-limiting manner, on normal cells or Daudi B cells, after stimulation with anti-IgM and, optionally, by bridging these latter with the BCR.
  • This new tool advantageously makes it possible to analyze the intensity and the kinetics of the phenomenon of phosphorylation of CD5 in so-called "normal” cells, with respect to a population of "test” cells, in particular leukemic B cells.
  • the anti-PCD5 antibody makes it possible to determine the percentage of CD5 + PCD5 + cells at a given time.
  • the results of the Applicant reinforce the idea that the BCR complex is stimulated in vivo, and permanently, in all LLC type cells, regardless of their mutational IgV status.
  • the invention thus also relates to an in vitro method for detection of activated CD5 (also called "PCD5") in a sample comprising the following steps:
  • the sample is selected from the group consisting of (i) a whole blood sample, (ii) a purified peripheral mononuclear and polymorphonuclear cell suspension from a whole blood sample, (iii) a cell suspension peripheral blood mononuclear cells (PBMC) purified from a whole blood sample, (iv) a purified T lymphocyte cell suspension from a whole blood sample, and (v) a purified B lymphocyte cell suspension from from a whole blood sample.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the detection method as defined above may comprise a step of bringing said sample into contact with one or more additional ligands, in particular antibodies, preferably with one or more specific antibodies of a type. particular cell capable of being contained in said sample, the said additional ligand or antibody (s) being chosen from the following group: (i) ligands or antibodies recognizing a marker or antigen specific to B lymphocytes present in an individual with monoclonal B lymphocytosis, (ii) ligands or antibodies recognizing a marker or antigen specific for B cell lymphocytes (iii) ligands or antibodies recognizing a marker or antigen specific for B cells, (iv) ligands or antibodies recognizing a T-cell specific marker or antigen; (v) ligands or antibodies recognizing a B cell-specific marker or antigen present in an CLL-affected individual; and (vi) ligands or antibodies recognizing a marker or antigen specific for B cells present in an individual with MCL.
  • additional ligands in particular
  • the detection step as defined above can be carried out by a technique chosen from the following group: ELISA, Western-blot, immunoprecipitation, immunocyto-chemistry, immunocytofluorescence, flow cytometry, mass cytometry, electron microscopy, protein chip or "protein array”.
  • Example 4 shows that the labeling with an anti-PCD5 antibody according to the invention is not found on any (0%) CD5 + B lymphocytes from all the "healthy" individuals tested, whereas the Anti-PCD5 antibody binds to B cells of patients affected by CLL. It should therefore be recognized that the detection method according to the invention has characteristics of sensitivity and specificity required to make a diagnosis of the occurrence of an LLC in an individual. This result is compatible with the in vitro data described in Example 3.
  • Example 4 shows that the anti-PCD5 antibodies according to the invention make it possible to distinguish certain pathological forms associated with lymphocytes expressing the CD5 marker on their surface. Particularly considered are the pathological forms associated with B cells, and even more particularly lymphocyte proliferative syndromes associated with B cells. As seen previously, chronic lymphoid leukemias have an activation on their surface of the CD5 marker: these B cells of type LLC thus have a CD5 + PCD5 + profile.
  • this double labeling concerns 100% of the LLC type B cells extracted from diagnosed patients, as well as a majority of B cells extracted from three MBL patients. This labeling of B cells of the LLC type does not appear to be dependent on the IgV mutational status.
  • the invention therefore also relates to a method for diagnosis and prognosis of Chronic Lymphocytic Leukemia.
  • a Matutes score of 4 or 5 is established for only 87% of CLL cases.
  • 13% of CLLs have a score of 0, 1, 2 or 3, and therefore do not allow to be identified by this method alone.
  • the method described above thus advantageously makes it possible to detect LLC type B cells among other populations for which CD5 is also a surface marker, and / or for which it is likely to be in its activated form.
  • the method described by the invention can therefore advantageously complement or even replace the currently used, which requires the establishment of a Matutes score of 4 or 5.
  • Example 4 demonstrates that the activation profile of LLC type B cells (PCD5 +) is distinct from that observed for Mantle Lymphoma type B cells, or MCL (PCD 5-).
  • the present invention also relates to an in vitro method for determining the occurrence of chronic lymphocytic leukemia in an individual, said method comprising the following steps:
  • said method also includes a step of contacting the sample with at least one ligand specifically binding to an antigen selected from CD5, CD22, CD23, FMC7, IgS antigens.
  • immunoglobulin ⁇ chain and immunoglobulin ⁇ chain As the ligand, an antibody selected from the following antibodies is preferably used: anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS, and / or anti ⁇ or ⁇ chains.
  • a method as defined above may include a step of achieving a score of Matutes.
  • the anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7 and / or anti-IgS antibodies may be used according to the conventionally defined protocols for carrying out such a score.
  • These protocols and antibodies are known to those skilled in the art, and already presented, for example, in (Matutes et al., 1994, Leukemia, 8: 1640-45, Matutes et al., 1994, Leuk Lymphoma, 14 Suppl 1: 57-61).
  • anti-CD5 antibody UCH-T2 clone
  • anti-CD22 anti-CD23
  • anti-FMC7 anti-IgS antibodies
  • Dako Anti-CD5 / CD23 / CD22 / FMC7 / anti ⁇ or ⁇ chains directly coupled to fluorochromes routinely used in flow cytometry can be marketed by the companies Becton Dickinson and Beckman Coulter Immunotech.
  • the method defined above is thus particularly advantageous in the context of samples for which the Matutes score of ⁇ sample is equal to or less than 3.
  • a method according to the invention thus makes it possible to distinguish CLL from tricholeukemias (HCL or Hairy Cell Leukemia), variants of these tricholeukemias (HCL-variants), other atypical forms such as SLVL (or Splenic Lymphoma with Villous Lymphocytes). ), prolymphocytic leukemias (or PLL), follicular lymphomas, lymphoplasmacytic lymphomas, mantle lymphomas (or MCL), or LCL (Large Cell Lymphoma) type lymphomas.
  • MBL monoclonal B lymphocytosis
  • a method of the invention can thus also be used as a tool for monitoring the evolution of monoclonal lymphocyte proliferations (of the MBL type) towards a pathological stage of the LLC type.
  • a pathological threshold which may be about 5x10 9 cells per liter of monoclonal B cells, or 5000 cells B / mm 3 .
  • a pathological threshold may be about 5x10 9 cells per liter of monoclonal B cells, or 5000 cells B / mm 3 .
  • special cases, or "borders” can also be established for values above or below this threshold.
  • the methods defined by the invention can also be associated with other methods of detection, diagnosis or prognosis, such as immunophenotyping, the detection of leukocytosis, the establishment of a myelogram, electrophoresis of proteins, cytogenetic analysis (in particular by in situ hybridization or FISH method), mutational profile analysis by gene sequencing of immunoglobulins (we will speak of "non-mutated” or “hypermuted” profile) or measuring the expression of the ZAP70 protein (in particular by flow cytometry).
  • immunophenotyping the detection of leukocytosis
  • the establishment of a myelogram the establishment of a myelogram
  • electrophoresis of proteins in particular by in situ hybridization or FISH method
  • mutational profile analysis by gene sequencing of immunoglobulins (we will speak of "non-mutated” or “hypermuted” profile) or measuring the expression of the ZAP70 protein (in particular by flow cytometry).
  • the method according to the invention will advantageously complement or confirm the establishment of an unfavorable prognosis.
  • the present invention also relates to a kit for detecting the presence of activated CD ("PCD5"), or activated lymphocytes, necessarily comprising the anti-PCD5 antibody of the invention, as well as one or more ligands recognizing another cell marker.
  • a ligand directed against one of the markers of the kit may be an antibody, a nucleic aptamer, a protein aptamer or any other known ligand of said marker.
  • this ligand is an antibody.
  • T lymphocytes T lymphocytes
  • B lymphocytes B-1a lymphocytes
  • the CD5 surface marker such as: HCL-type lymphocytes, or Hairy Cell Leukemia , variants of these tricholeukemias (HCL-variants), other atypical forms such as SLVL (or Splenic Lymphoma wiih Villous Lymphocytes), prolymphocytic leukemias (or PLL), follicular lymphomas, lymphoplasmacytic lymphomas, mantle lymphomas ( or MCL), or LCL (Large Cell Lymphoma) type lymphomas.
  • HCL-type lymphocytes or Hairy Cell Leukemia , variants of these tricholeukemias (HCL-variants), other atypical forms such as SLVL (or Splenic Lymphoma wiih Villous Lymphocytes), prolymphocytic leukemias (or PLL), follicular lymphomas, lymphoplasmacytic lymphomas, mantle lymphomas ( or MCL), or LCL (Large Cell Lymphoma)
  • the invention therefore relates to a detection kit for
  • Activated CD5 comprising:
  • said activated CD5 detection kit comprises:
  • an anti-PCD5 antibody as defined in the present description b) an anti-CD5 ligand.
  • a detection kit can thus be used in the context of, or in addition to, establishing a Matute score, and / or any method described by the invention.
  • the invention may therefore relate to an activated lymphocyte detection kit comprising one or more ligands chosen from the following group: anti-CD5 ligands, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS , anti ⁇ or ⁇ chains.
  • this ligand is an anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS and / or anti ⁇ or ⁇ chain antibody.
  • said kit may also include:
  • the invention relates to a detection kit which may comprise: a) an anti-PCD5 antibody as defined above,
  • kits as defined above may also comprise a ligand, in particular an antibody, directed against one of the following markers: an anti-CD2, anti-CD19, anti-CD27, anti-CD38, anti ligand -HLA-DR, anti-IgM, anti-phosphoprotein.
  • the phosphoproteins in particular may be P-CD5, P-Lyn, P-p38MAP Kinase and P-STAT3.
  • kits as defined above may also comprise a ligand, in particular an antibody, directed against one of the following markers: an anti-CD2, anti-CD19, anti-CD27, anti-CD40, anti-CD17 ligand.
  • the kit may therefore also comprise a ligand, in particular an antibody, directed against phosphotyrosines or phosphoproteins, and most particularly P-CD5, P-Lyn, P-p38MAP Kinase and P-STAT3.
  • a ligand in particular an antibody, directed against phosphotyrosines or phosphoproteins, and most particularly P-CD5, P-Lyn, P-p38MAP Kinase and P-STAT3.
  • the kit may therefore also comprise a ligand, in particular an antibody, chosen from the following group: anti-P-CD5, anti-P-Lyn, anti-P38MAP Kinase, anti-P-STAT3.
  • a ligand in particular an antibody, chosen from the following group: anti-P-CD5, anti-P-Lyn, anti-P38MAP Kinase, anti-P-STAT3.
  • an anti-P-STAT3 mouse monoclonal antibody may be an anti-PY705-STAT3 (clone B-7, Ref sc-8059, "Mouse monoclonal anti-human P-STAT3"), marketed by Santa Cruz Biotech ® .
  • an anti-P-Lyn antibody may be an anti-PY507 or an anti-PY396 (Ref AJ1451c, Ref AJ1451b), marketed by Abgent.
  • a rabbit anti-P-p38MAP Kinase polyclonal antibody may be an anti-P-T180 / Y182-p38MAPK (Ref AF869) marketed by R & D Systems ® .
  • the kit may also comprise a ligand, in particular an antibody, directed against the non-phosphorylated forms of these phosphoproteins.
  • activated CD5 detection kit or activated lymphocytes
  • activated lymphocytes can be used in the context of the methods defined by the invention, such as for example a protein chip or "protein array”.
  • CD5 peptides which were used for the immunization of the mice and for the two monoclonal antibody screening ELISA tests were synthesized and phosphorylated by the company EUROGENTEC.
  • Carrier protein KLH (coupling with 5 mg of peptide)
  • the peptide corresponding to the human CD5 region and comprising Tyrosine 453 is synthesized, then phosphorylated and coupled to the KLH cargo protein before immunization of mice.
  • the cell fusion of B cells from the spleen of Balb / c immunized mice is performed with SP2 / 0 myeloma (Shulman et al., 1978, Nature, 276, 269-270).
  • the selection of hybri domes is carried out according to the established protocol (Bismuth G, Gouy H et al, 1990, Mol Immunol, 27: 1127-36). Six hundred hybridoma culture supernatants were screened by two ELISA tests from the phosphorylated and native peptides.
  • Hybridomas were cloned using Poisson's limited dilution cloning method. The supernatants of the clones were again tested by ELISA against the 2 peptides of 13 amino acids cited above, phosphorylated and native for verification. The class of mouse monoclonal antibodies and subclass identity were determined from the Rapid Mouse Antibody Isotyping kit - Kappa & Lambda - Mouse kit (Thermo Scientific, Perbio Sciences France SAS).
  • Two monoclonal antibodies were selected: an IgG3 Kappa antibody and an IgM Kappa antibody.
  • the supernatant of a hybridoma culture (IgG3k) is precipitated by ammonium sulfate.
  • a procedure for purifying IgG antibodies by Melon TM Gel column centrifugation is applied to the dialyzed sample according to the manufacturer's instructions, and using a Melon TM Gel IgG Spin Purification kit (Thermo).
  • the purified monoclonal antibody of the invention and the purified monoclonal antibody are provided.
  • IgG3, K Isotype Control are both labeled with the fluorophore Alexa Fluor 488 (Alexa Fluorine 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit from Molecular Probes,
  • Anti-PCD5 antibodies are obtained according to the protocol described in Examples 1 and 2. Daudi B cells (2x10 6 ) transfected with an empty vector pNT (see Gary-Gouy H et al, Blood 2002), or containing the entire cDNA sequence of human CD5 (SEQ ID No. 2) are stimulated, or not, with rabbit anti-IgM F (ab) '2 solution at 2 ⁇ g / mL (Jackson Immunosearch, Baltimore, reference 309-006-043) for 5 minutes, then labeled with an anti-CD5 antibody UCH-T2 coupled to a fluorochrome (Santa Cruz Biotechnology®, CD5 (UCH-T2), reference sc-1180).
  • the cells are then fixed in neutral Dulbecco PBS buffer containing 4% w / v Paraformaldehyde for 30 minutes at ambient temperature and permeabilized in Dulbecco's neutral PBS buffer containing 0.5% Triton XI 00 for 4 minutes at room temperature.
  • the reaction is blocked by a solution of PBS containing 5% bovine albumin for 30 minutes.
  • the slides are then labeled (i) with either an anti-CD5 rabbit antibody (Santa Cruz Biotechnology, CD5 (H300) reference sc-20920) and an Alexa594-coupled anti-rabbit antibody (Invitrogen TM) (ii) either with unlabeled anti-PCD5 mouse antibody and Alexa488-conjugated anti-mouse antibody ((Invitrogen TM) (iii) either with a purified isotype IgG3 mouse kappa isotype control antibody (BD Pharmingen, reference 550341) and an anti-mouse antibody coupled with Alexa488 (Invitrogen TM).
  • an anti-CD5 rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology, CD5 (H300) reference sc-20920
  • Alexa594-coupled anti-rabbit antibody Invitrogen TM
  • unlabeled anti-PCD5 mouse antibody and Alexa488-conjugated anti-mouse antibody (Invitrogen TM) (iii)
  • the plates are mounted in Vectashield® (Vector Laboratories) medium comprising DAPI for staining of the nucleus. Snapshots are taken at x40 magnification. Images are acquired with a Zeiss Axio2 microscope and Axio software (Cari Zeiss, Oberkochem Germany).
  • the experiment demonstrates the staining with fluorochrome DAPI of the nucleus of all the cells.
  • the cells are labeled and express the CD5 protein on their surface. Only cells that have been stimulated have staining at their periphery associated with the anti-PCD5 antibody that recognizes the active form of the CD5 marker.
  • MBL monoclonal B lymphocytosis
  • MCL Mantle Lymphoma
  • CLL Certytic Leukemia
  • the cells from these patients were collected after informed consent and signed in accordance with the Declaration of Helsinki and the ethical laws of the Faculty of Medicine of the University of Nancy.
  • B cells from these donor groups were separated from a Rosettesep TM enrichment cocktail according to the protocol established by the manufacturer (Stem Cell Technologies, Vancouver Canada). The purity of the preparations obtained is greater than 97%.
  • the LLC group consists of 10 men and 8 women, aged 47 to 82, and a Binet de A (9 patients), B (4 patients) and C (4 patients) clinic.
  • Binet's stage is a classification system commonly used for assessing the severity of chronic lymphocytic leukemia.
  • Table 1 Representative Patients Included in the Study, Diagnosed as LLC, MBL
  • FIG. 1 for the FACS study, the B cells extracted from the blood of a healthy adult ("control" group), the B cells from a representative CLL patient (patient 12, see Table 1) are considered in particular (FIG. , and an MCL patient (patient 27), all positive for the slGLK chain, are labeled on their surface with anti-CD19 monoclonal antibodies (Beckman-Coulter catalog no .: FM1285U), anti-CD5 (IoTest® CD5-FITC Beckman Coulter reference A08932) and anti-CD23 (Dako, clone MHM6, Ref 7062) as well as anti-IgK, anti-Ig polyclonal antibodies (Dako, catalog no: FR481) and then permeabilized and labeled intracellularly by an isotype control IgG3 kappa mouse (BD Pharmingen, reference 550341) coupled with Alexa 488 and anti-PCD5-Alexa488 antibody.
  • IgG3 kappa mouse
  • the FACS experiment is performed on a flow cytometer (FACSCalibur TM Beckton Dickinson).
  • the cells in Dulbecco PBS are fixed and permeabilized according to the Beckton Dickinson CytoFix / CytoPerm TM fixation-permeabilization kit protocol (reference 554714).
  • the summary table 2 compares, from the B cells extracted from controls and from CLL, MBL or MCL patients, the percentages of CD5 + B lymphocytes present in the sample, as well as lymphocytes presenting the double CD5 + labeling PCD5 +. These values are obtained from a FACS analysis of all the samples extracted from the patients described in Table 1.
  • chronic lymphocytic leukemia-type B cells do exhibit a characteristic double CD5 + PCD5 + labeling, which is found neither in "healthy” B cells nor in MCL-type B cells.
  • MBL-type B cells also exhibit this double labeling. This property is consistent with the evolutionary properties of certain forms of MBL towards the LLC, and thus validates the use of the antibody of the invention as a prognostic tool.
  • Table 2 effect of labeling with PCD5 antibody of B-cell samples extracted from patients suffering from pathologies of the type LLC, MBL and MCL. The results (%) are related to the total number of labeled cells. The results illustrated correspond to those obtained by the FACS method.
  • CD19 + CD23 + CD5 + (LLC) leukemic cells express phosphorylated CD5 ( 1st column), whereas CD5 + cells (10% of B cells) of a healthy donor remain negative in PCD5 (2nd column) and CD19 + B cells CD23-CD5 + from another form of haematological malignancies, or mantle cell lymphoma (MCL 3rd column).
  • Samples extracted from patients with monoclonal B (or MBL) lymphocytosis also show a CD5 + PCD5 + count for three patients tested, which may be correlated with the progressive nature of this disease to CLL.
  • the anti-PCD5 antibody thus makes it possible to distinguish chronic lymphoid leukemias from other types of lympho-proliferative diseases, and in particular from mantle lymphomas.
  • Daudi B cells (2x10 6 ) transfected with an empty vector pNT (see Gary-Gouy H et al, Blood 2002), or containing the entire cDNA sequence of human CD5, are stimulated or not with a solution of Rabbit IgM F (ab) '2 at 2 ⁇ g / mL (Jackson Immunosearch, Baltimore, reference 309-006-043)). The cells are then lysed in lysis buffer at 4 ° C.
  • Nonidet TM P-40 detergent 1% Nonidet TM P-40 detergent.
  • the lysates are immunoprecipitated with 1 ⁇ g of monoclonal antibody UCH-T2 anti-CD5 (Santa Cruz) or anti-PCD5 monoclonal antibody IgG3 type in the presence of protein G-Sepharose beads (Sigma-Aldrich®).
  • the proteins are separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, electro-transferred to a PVDF membrane (Amersham, GE), and hybridized in parallel with an anti-CD5 UCH-T2 mAb, or recombinant anti- (PY) -phosphotyrosine 4G10 mAb (Upstate Cell Signaling).
  • the disclosure uses a peroxidase-coupled goat anti-mouse antibody (Bio-Rad Laboratories) with ECL detection (Amersham).
  • Figure 2 shows that anti-PCD5 antibodies specifically recognize the activated form of CD5: only cells transfected with the CD5 vector and stimulated by anti-IgM are positive, whereas non-activated cells do not contain PCD5.
  • Figure 2 further shows that the anti-PCD5 antibody of the invention can be advantageously used as a tool to specifically immunoprecipitate the activated form of the CD5 receptor.
  • the antibodies of the invention specifically recognize the phosphorylated form of the peptide.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un anticorps monoclonal reconnaissant l'antigène CD5 sous sa forme activée. Elle se rapporte également à l'utilisation de cet anticorps dans des méthodes de détection, de pronostic et/ou de diagnostic en médecine, et en particulier en recherche anti- cancéreuse. Les propriétés particulières de cet anticorps permettent en particulier son utilisation pour la détection des leucémies lymphoïdes chroniques.

Description

UN ANTICORPS MONOCLONAL CONTRE LE RECEPTEUR CD5 A MULTIPLES APPLICATIONS EN MEDECINE ET EN RECHERCHE ANTI-CANCEREUSE
Domaine de l'invention
La présente invention se rapporte au domaine de la mise au point de nouveaux outils de diagnostic médical, en particulier pour le diagnostic de cancers telle que la leucémie lymphoïde chronique.
Art antérieur
La leucémie lymphoïde chronique, aussi appelée LLC, est une maladie cancéreuse caractérisée par une prolifération lymphoïde monoclonale, responsable d'une infiltration médullaire, sanguine, parfois ganglionnaire, constituée de lymphocytes matures de morphologie normale et de phénotype B. Les leucémies lymphoïdes chroniques représentent la forme de leucémie la plus courante chez l'adulte en occident (Gary-Gouy et al, 2007, J Immunol, 179:4335-4344). Elle ne se rencontre pas chez l'enfant. D'évolution chronique, la LLC reste aujourd'hui une maladie incurable, mais de progression lente pour une large majorité des patients. La LLC affecte principalement les individus âgés de plus de 50 ans, et en majorité de sexe masculin. L'incidence de la LLC est évaluée aujourd'hui à 3,5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes aux Etats-Unis.
Le plus fréquemment, la survenue d'une LLC est détectée lors d'une analyse de numération de la formule sanguine, qui met en évidence une hyperlymphocytose. Dans la majorité des cas, le diagnostic d'une hyperlymphocytose est au moins indicatif pour suspecter la survenue d'une LLC.
Toutefois, le diagnostic de survenue d'une LLC doit impérativement être confirmé par la réalisation d'au moins un, et de préférence plusieurs, tests de diagnostic complémentaires.
Pour obtenir une confirmation de la survenue d'une LLC, on pratique couramment un test d'immunophénotypage, lequel permet de calculer une valeur de score (dit score de « Matutes », allant de 0 à 5 selon l'expression ou non de divers antigènes). Selon ce test, une valeur de score supérieure ou égale à 4 est indicative de la survenue d'une LLC.
Plus précisément, l'établissement d'un score dit de « Matutes », consiste à mettre en contact un échantillon, préalablement prélevé à partir d'un individu à tester, avec une combinaison de cinq anticorps, respectivement des anticorps anti-CD5, anti-CD22, anti- CD23, anti-FMC7 et anti-IgS, (Matutes et al, 1994, Leukemia, 8: 1640-45 ; Matutes et al., 1994, Leuk Lymphoma, 14 Suppl 1 :57-61). Puis un score est établi sur une échelle de 0 (pas de LLC ou atypique) à 5 (LLC probable) en fonction du caractère positif des lymphocytes marqués, lequel score permet de distinguer la LLC d'autres types de leucémies.
On précise que le score de Matutes permet de distinguer la LLC des tricholeucémies (HCL ou Hairy Cell Leukemia), des variantes de ces tricholeucémies (HCL- variants), des autres formes atypiques telles que les SLVL (ou Splenic Lymphoma with Villous Lymphocytes), des leucémies prolymphocytiques (ou PLL), des lymphomes folliculaires, les lymphomes lymphoplasmacytiques, des lymphomes du manteau (ou MCL), ou encore des lymphomes de type LCL (Large Cell Lymphoma).
De manière générale le principe de ce test d'immunophénotypage est basé sur l'utilisation de la combinaison des cinq anticorps différents précités. Une valeur de score de 4 ou 5 permet de conclure à la présence probable d'une LLC. Des études ont pu établir que 87 % des LLCs présentaient une valeur de score de Matutes de 4 ou 5. Inversement, seulement 0,4 % des LLCs diagnostiquées présentaient une valeur de score de Matutes de 0 ou 1.
Bien que le test de Matutes soit aujourd'hui le test de diagnostic de LLC le plus pertinent qui soit disponible pour les praticiens cliniciens, sa spécificité et sa sensibilité ne sont pas optimales. Il est important de noter qu'une valeur de score de Matutes intermédiaire, de 2 ou 3, ne permet pas actuellement de conclure de façon appréciable à la présence d'une LLC au regard d'autres types de leucémies, et notamment de cellules B de type CD5+.
L'insuffisance de fiabilité des tests de diagnostic de LLC actuellement disponibles, y compris le test de Matutes qui est celui qui est le plus souvent mis en œuvre, est de nature à conduire à des erreurs dans le choix de stratégies thérapeutiques appropriées. Dans certaines situations, un résultat faussement négatif peut conduire à différer un traitement thérapeutique approprié et ainsi à réduire la durée de vie d'un patient. A l'inverse, un résultat faussement positif peut conduire à l'application de traitements chimio-thérapeutiques provoquant des effets indésirables susceptibles d'être significativement délétères pour la santé générale du patient diagnostiqué par erreur comme étant affecté d'une LLC.
Egalement, le test de Matutes est insuffisamment sensible et ne permet pas de diagnostiquer des formes précoces de LLC, ni a fortiori des états pré-LLCs, et en particulier des formes asymptomatiques précédant les premiers signes cliniques de la maladie.
Pour confirmer la survenue d'une LLC, on peut réaliser des tests complémentaires tels qu'une électrophorèse des protéines sériques dont les résultats peuvent montrer (i) l'existence d'une hypo-gammaglobulinémie et/ou (ii) la présence d'un composant monoclonal, le plus souvent d'isotype IgM. Concernant l'évaluation pronostique de l'évolution de la LLC, deux classifications sont actuellement couramment proposées, respectivement (i) la classification de Binet, notamment en Europe et (ii) la classification de Rai, notamment aux Etats-Unis.
Il n'y a pas d'indication aujourd'hui à traiter des patients affectés d'une LLC et classés au stade A de la classification de Binet. En revanche, les patients classés au stade B ou C de la classification de Binet doivent être traités.
En général, le traitement étiologique d'une LLC repose sur la chimiothérapie par voie orale ou par injection. Pour les individus ayant un mauvais pronostic, il peut être proposé un traitement intensif sous la forme d'une chimiothérapie intensive suivie d'une greffe de moelle osseuse. La greffe de moelle osseuse peut être une auto-greffe ou une allo-greffe.
Les traitements chimiothérapeutiques utilisés dans le traitement intensif de la LLC sont le chlorambucil, la fludarabine ainsi qu'une combinaison de Cyclophosphamide, d'(H)adriamycine, d'Oncovin (vincristine) et de Prednisolone (combinaison thérapeutique aussi appelée CHOP). Les traitements de première ligne modernes, utilisent systématiquement la fludarabine seule, ou associée à une autre chimiothérapie (cyclophosfamide) ou immunothérapie (anti-CD20/ Rituximab)
Les traitements de la LLC peuvent aussi inclure le traitement des complications auto-immunes et des complications infectieuses.
De manière générale, il existe un besoin (i) pour un diagnostic amélioré et (ii) pour de nouveaux traitements de la LLC.
L'antigène CD5 a été proposé dans l'état de la technique comme l'un des marqueurs majeurs de diagnostic de la leucémie lymphoïde chronique, ou LLC (Boumsell et al, 1980, J Exp Med., 152: 229-234).
L'antigène CD5 (ou « Cluster de Différenciation 5 ») est un corécepteur du récepteur de l'antigène présent comme marqueur à la surface des lymphocytes T ainsi que d'une sous-population de lymphocytes B.
La plupart des cellules T immatures et matures expriment ce marqueur à leur surface, de façon constitutive, y compris les cellules T précurseurs. L'expression du CD5 augmente au fur et à mesure de la différenciation T. Son expression varie dans le même sens que celle du TCR/CD3. Il est ainsi connu que ce marqueur CD5 va s'associer physiquement avec le récepteur à l'antigène des cellules T, ou TCR, au niveau de la membrane et moduler la réponse médiée par le récepteur TCR ; en son absence les cellules T immatures présentent par le biais de leur TCR une plus grande réponse à la stimulation in vitro. Ainsi, le marqueur CD5 est depuis longtemps connu pour agir comme régulateur négatif de la transduction du signal médiée par le TCR (Tarakhovsk et al, 1996, Science, 269, 535-537
Les lymphocytes B peuvent être séparés en différents sous-groupes, appelés B-la, B-lb et B-2. Les lymphocytes B-2 sont les plus conventionnels ; ils sont produits au niveau de la moelle osseuse au cours de la vie adulte, et sauf mention contraire seront cités uniquement en tant que lymphocytes B. Bien que ces lymphocytes B n'expriment pas, contrairement aux lymphocytes T ou B-la, le marqueur CD5 de manière constitutive, ils peuvent en revanche l'exprimer après activation de ces lymphocytes, notamment par des antigènes T-dépendants.
Les lymphocytes B-la et B-lb sont généralement désignés comme lymphocytes « fœtaux », et localisés au niveau des cavités pleurales et/ou du péritoine. Les lymphocytes fila présentent des propriétés toutes particulières, telles que des capacités d'auto- renouvèlement, ainsi que de production de larges quantités d'anticorps poly-réactifs de type IgM, d'IgG3 et d'IgA (Tarakhovsky, A., 1997, J. Exp. Med. 185, 981-984). Ainsi, le sous- groupe B-la exprime CD5 de façon constitutive, tandis que les autres sous-groupes B-lb et B2 ne 1 ' expriment pas du tout.
Il a ainsi été montré en particulier que, dans les sous-populations lymphocytaires Bl-a, le marqueur CD5 exerce également un rôle de modulation dans l'activation médiée par les IgM, en interagissant physiquement avec le récepteur associé à l'antigène des cellules B (ou BCR).
II a également été montré que la surexpression de CD5 dans les lymphocytes B joue un rôle dans la tolérance aux antigènes du soi. En modulant le seuil d'activation, CD5 empêche donc la mort cellulaire induite par cette activation et maintient la tolérance des lymphocytes B anergiques in vivo (Hippen et al, 2000, J Exp Med., 191 :883-890). De même, à la suite de l'activation d'un lymphocyte par l'antigène, l'activation de CD5 prévient en retour une réponse immune excessive génératrice d'auto-immunité.
En raison de ses propriétés antiprolifératives et de régulation négative de la voie de signalisation médiée par les TCR et BCR, le marqueur CD5 constitue donc un sujet d'étude particulier dans les domaines du diagnostic des maladies auto-immunes et/ou lympho- prolifératives (Pers et al, 1999, Int J Mol Med., 3(3):239-45).
Toutefois les mécanismes précis à l'origine de l'activation du récepteur CD5, en particulier l'activation de CD5 associée à la voie de signalisation du récepteur à l'antigène (BCR ou TCR), sont méconnus. Comme vu précédemment, et bien que l'expression du récepteur CD5 à la surface de ces lymphocytes, constitutive ou induite, soit une condition nécessaire à sa fonction, il convient de souligner qu'elle n'est pas suffisante. Il a ainsi été proposé que le marqueur CD5 puisse alterner lui-même entre une forme non-active, ou inactivée, et une forme active ou activée (Gringhuis et al, 1998, Mol Cell Biol, 18(3): 1725-1735). Le passage d'une forme à l'autre a ainsi été attribué à une série de cascades de signalisation induites par la voie de signalisation du récepteur à l'antigène, notamment en raison de l'interaction physique entre ce récepteur à l'antigène et le marqueur CD5 lui-même. Cette activation est induite par l'action séquentielle de plusieurs tyrosine kinases et phosphatases.
En particulier, il a été proposé que la forme active du récepteur CD5 soit induite par la phosphorylation de la région intracellulaire de CD5. Sous sa forme active, la partie intracellulaire de CD5 est ainsi capable de recruter d'autres protéines effectrices, en particulier d'autres kinases, et donc de moduler la voie de signalisation du récepteur à l'antigène.
Il a ainsi été montré que la capacité à modifier post-traductionnellement le marqueur CD5 dans sa partie intracellulaire, est un paramètre critique pour réguler à la fois la voie de signalisation du récepteur à l'antigène et la genèse d'un phénomène de tolérance des lymphocytes T et B (Xianghuai et al, 2002, J Immunol, 168:5612-5620).
Du point de vue de sa structure, le marqueur CD5 est une protéine transmembranaire de 67 kDa environ, de forme monomérique, présentant une région extracellulaire, une région transmembranaire et une région intracellulaire.
Cette protéine appartient à une famille de protéines exprimées par les cellules du système immunitaire. Toutefois, l'étude structurale de cette protéine est limitée par son caractère transmembranaire ainsi que sa sensibilité à la dénaturation (Brown & Lacey, 2010, J Immunol, 185(10), 6068-6074).
La protéine CD5, de séquence SEQ ID N°2, comprend au total 495 acides aminés. Elle comprend en outre une séquence signal, ou peptide signal, de 24 acides aminés à l'extrémité N-terminale de la protéine.
La région extracellulaire, ou partie N-terminale de la CD5, s'étend chez l'homme de l'acide aminé 1 à 379 environ. Elle est caractérisée par la présence de trois domaines conservés, riches en cystéine (SRCR ou Scavenger Receptor Cysteine-Rich domain), et la structure cristallographique d'un de ces domaines a été élucidée (Rodamilans et al, 2007, J Biol Chem, 282(17): 12669-77).
La région transmembranaire s'étend de l'acide aminé 380 à 402 environ et fait directement suite à la partie C-terminale du troisième domaine SRCR.
La région intracellulaire s'étend de l'acide aminé 403 et jusqu'à l'extrémité C- terminale de la protéine. Cette région est constituée d'une queue cytoplasmique susceptible d'être modifiée post-traductionnellement, dans le cadre de la voie de signalisation du récepteur à l'antigène (TCR et BCR), au niveau de son domaine régulateur intracellulaire. Certaines de ces modifications vont ainsi conduire à l'activation de CD5. En particulier, plusieurs sites potentiels de phosphorylation sur thréonine (Vilà et al, 2001, J Immunol., 166(1): 396-402) et sur tyrosine ont été mis en évidence dans la littérature (Dennehy et al, 2001, International Immunology, 13(2), 149-156 ; Gary-Gouy et al, 2000, Journal of Biological Chemistry, 275, 548-556 ; Gary-Gouy ét al, 2002, J Immunol, 168, 232-239).
Il est important de souligner que le rôle particulier de cette région intracellulaire dans le phénomène d'activation de CD5 reste aujourd'hui méconnu. Bien que plusieurs formes phosphorylées de CD5 aient été rapportées, le profil particulier de phosphorylation correspondant à l'étape d'activation de CD5 elle-même n'a pas été identifié.
En particulier, il convient de distinguer l'étape d'activation de CD5, qui résulte nécessairement et directement de l'activation du récepteur à l'antigène, des étapes supplémentaires de phosphorylation, voire de déphosphorylation de CD5, qui vont moduler la voie de signalisation du récepteur à l'antigène.
Comme déjà précisé précédemment, il existe un besoin pour des outils et des méthodes destinés au diagnostic ou au pronostic de maladies auto-immunes et/ou lymphoprolifératives, qui soient alternatifs ou améliorés par rapport aux outils et aux méthodes connus.
Résumé de l'invention
La séquence de la protéine CD5 considérée par l'invention est préférentiellement celle définie selon la SEQ JD N°2. Il convient toutefois de noter que, dans la littérature, la séquence de CD5 considérée peut omettre les 24 premiers acides aminés constituant la séquence signal N-terminale, ou peptide signal. Sauf indication contraire, la numérotation des acides aminés considérés se réfère ici à la numérotation définie par cette séquence SEQ JD N°2, et qui comprend donc la séquence signal N-terminale. Naturellement sont également considérés les polymorphismes et variants naturels de CD5. En particulier, on considérera les séquences de CD5 référencées dans Carnero-Montoro et al. (Carnero-Montoro et al., Evolutionary and functional évidence for positive sélection at the human CD5 immune receptor gene, 2012, Mol Biol Evol, 29(2): 811-23). L'homme de l'art pourra alors déduire la séquence peptidique correspondante en se reportant à la séquence SEQ ID N°2 de CD5 comme référence (Réf. UNIPROT : P06127). La présente invention fournit des ligands, en particulier des anticorps, se liant spécifiquement à la forme activée de l'antigène CD5 de SEQ ID N°2, qui est phosphorylée sur le résidu tyrosine en position 453, ainsi que des méthodes de détection, de diagnostic et de pronostic mettant en œuvre lesdits ligands.
Selon l'invention, il est fourni un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide comprenant la séquence de formule (I) suivante :
NH2-[Nt]y XiX2X3X4DNEY(P03H2)X5X6X7X8X9- [Ct]z -COOH (I) dans lequel :
- y est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- z est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- Nt consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés en longueur,
- Ct consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés en longueur.
- Xi, X2, X3, X4, X5, Χβ, X7, X8 et X9. représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un résidu d'acide aminé.
La présente invention concerne aussi des méthodes et des kits de détection de CD5 activé mettant en œuvre un anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus.
Dans certains modes de réalisation, un kit de détection de CD5 activé comprenant ce même anticorps, ainsi qu'un autre anticorps reconnaissant la forme non active du récepteur CD5.
Dans certains modes de réalisation, ledit anticorps monoclonal est combiné à un ou plusieurs autres anticorps, en particulier un ou plusieurs autres anticorps choisis parmi les anticorps anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS et/ou anti chaînes κ ou λ.
Dans certains modes de réalisation, ledit anticorps monoclonal peut être combiné à un ou plusieurs autres ligands, en particulier un ou plusieurs autres anticorps.
L'invention est aussi relative à des méthodes de détermination de l'occurrence d'une leucémie lymphoïde chronique dans lesquelles est utilisé l'anticorps monoclonal tel que défini ci-dessus.
L'invention a notamment trait à des méthodes in vitro de détection de CD5 activé, ainsi que de détermination de la survenue d'une leucémie lymphoïde chronique comprenant les étapes suivantes:
a) mise en contact d'un échantillon avec l'anticorps monoclonal défini ci-dessus, b) détection ou quantification des complexes formés entre ledit anticorps monoclonal et des cellules exprimant un CD5 activé éventuellement présentes dans ledit échantillon. Description des figures
Figure 1 : expression de CD5 phosphorylé sur tyrosine 453, après marquage en immunofluorescence et analyse en cytométrie en flux de cellules de LLC, de cellules B purifiées du sang périphérique humain d'un donneur sain et de cellules de Lymphome du manteau. Le marquage de surface CD19 est indiqué en ordonnée pour toutes les séries sauf la ligne 3. Ligne 1 : marquage de CD5 (abscisse) ; ligne 2 : marquage de CD23 (abscisse) ; ligne 3 : marquage des chaînes Kappa κ (abscisse) et Lambda λ des IgM membranaires (ordonnée) ; ligne 4 : marquage intracellulaire contrôle isotypique, après fixation et perméabilisation des cellules ; ligne 5 : marquage intracellulaire avec l'anticorps PCD5 couplé à Alexa 488, après fixation et perméabilisation des cellules.
Figure 2 ; mise en évidence par immunoprécipitation et sur lysat total de la sélectivité de l 'anticorps anti-PCD5 pour la forme activée du récepteur CD5. La figure 4a met en évidence la présence de PCD5 après immunoprécipitation par un anticorps anti-PCD5, sur western blot et par anti-CD5 ou antiphosphotyrosine. La figure 4b compare la présence de PCD5 et de CD5 à la fois sur lysat total et après immunoprécipitation.
Figure 3 ; Titration par méthode ELISA d'un anticorps polyclonal (pAb) et monoclonal (mAb) d'IgG anti-PCD5 contre le peptide synthétique natif et le même peptide phosphorylé. Les concentrations initiales d'anticorps monoclonal et polyclonal sont respectivement de 10 et 130 μg/mL.
Description détaillée
II est fourni selon l'invention de nouveaux outils et de nouvelles méthodes pour le diagnostic de la leucémie lymphoïde chronique (LLC, ou CLL).
On entend par « leucémie lymphoïde chronique », une maladie cancéreuse caractérisée par une prolifération lymphoïde monoclonale telle que définie précédemment.
Avantageusement on considère les formes typiques de la leucémie lymphoïde chronique, dites LLC de type B (LLC-B), mais également les formes atypiques.
Il est montré selon l'invention que la présence d'une forme activée de l'antigène CD5 à la surface des lymphocytes, laquelle forme activée de CD5 possède le résidu tyrosine en position 453 à l'état phosphorylé, est indicative de la survenue d'une LLC. La demanderesse a montré que la tyrosine 453 de CD5, comprise dans ce motif DNEY sous sa forme phosphorylée, est nécessaire et suffisante pour induire la forme active du récepteur CD 5.
Aux fins de la présente description, un antigène CD5 possédant le résidu tyrosine en position 453 sous forme phosphorylée peut être aussi désigné « PCD5 ».
Compte-tenu de la présence d'une séquence signal de 24 acides aminés à l'extrémité N-terminale de la protéine CD5, de séquence SEQ ID N"2, le résidu tyrosine en position 453 (ou Y453), peut également être cité dans la littérature en position 429 (ou Y429).
Les travaux de la demanderesse ont ainsi permis la mise au point de ligands se liant spécifiquement à l'antigène CD5 phosphorylé sur le résidu tyrosine en position 453 (« PCD5 »), l'utilisation de ces ligands pour la détection de l'antigène CD5 sous forme activée, et pour le diagnostic d'une LLC chez un individu ou pour le pronostic d'une LLC affectant un individu.
Au sens de l'invention, un « ligand » englobe tout type de molécule se liant à une molécule cible, et englobe notamment les anticorps, les aptamères nucléiques et les aptamères protéiques, en particulier les anticorps.
La demanderesse a en particulier mis au point un procédé d'obtention de ligands de type anticorps se liant spécifiquement à la forme activée de l'antigène CD5 phosphorylé sur le résidu tyrosine en position 453.
De manière surprenante, la demanderesse a montré que des ligands, en particulier des anticorps, dirigés contre un petit peptide de 13 acides aminés de longueur et phosphorylé sur le résidu tyrosine en position 8 dudit peptide, sont capables de se lier spécifiquement, in situ, sur la région intra-cytoplasmique de la forme activée de l'antigène CD5 qui est indicative de la survenue d'une LLC.
De façon surprenante, l'anticorps monoclonal ainsi obtenu présente des propriétés particulières de spécificité à l'égard du motif phosphorylé sur tyrosine DNEY453(P03H2), et sur tout le domaine peptidique du CD5 entourant cette tyrosine, de séquence SEQ ID N°l.
Ce motif phosphorylé qui comprend une séquence DNEY453, comprenant le résidu Y453, est un site consensus correspondant au motif d'autophosphorylation des protéines tyrosines kinases de la famille Src (Gary-Gouy et al, 2002, J Immunol, 168, 232-239). La séquence consensus de ce motif d'autophosphorylation correspond notamment à un motif D(D/N)XpY, potentiellement reconnu par d'autres protéines comme le proto-oncogène Cbl (Lupher et al, 1997, J Biol Chem., 272(52):33140-4). En effet, en 1997, Lupher et al. ont montré que lorsque le motif DNEY416 de Src kinase était phosphorylé, il correspondait à la séquence de type D(D/N)xpY du domaine PTB « protein tyrosine binding » de la protéine Cbl. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, ces données suggèrent que DNEY pourrait être un motif de liaison à une Src kinase. Cette séquence phosphorylée du CD5 fait office de site d'ancrage sur tyrosine pour des protéines effectrices ou intermédiaires, et potentiellement des kinases (notamment des protéines tyrosine kinases de la famille des src kinases via leur domaine SH2 pour Src Homology -2 domain) indéterminées, qui phosphorylent le CD5 sur une ou plusieurs tyrosines, et en particulier la tyrosine critique sur le plan fonctionnel, Y453.
L'homme de l'art, désirant obtenir un anticorps dirigé contre un motif phosphorylé, et à plus forte raison une protéine phosphorylée, se serait attendu à ce que l'anticorps ainsi obtenu ne présente pas de spécificité particulière, ou au mieux une spécificité faible, à l'égard de l'environnement chimique, en particulier les enchaînements d'acides aminés localisés à proximité dudit motif.
C'est également de manière surprenante qu'un anticorps dirigé contre un peptide de faible longueur, c'est-à-dire normalement un peptide comprenant un ou plusieurs épitopes de type linéaire, possède l'aptitude à reconnaître une région intra-cytoplasmique d'une protéine de plusieurs centaines d'acides aminés de longueur, laquelle est donc susceptible de comprendre essentiellement des épitopes conformationnels.
La mise en évidence d'une relation entre (i) la présence de l'antigène CD5 phosphorylé sur le résidu tyrosine en position 453 (« PCD5 ») exprimé par les lymphocytes d'un individu et (ii) la survenue d'une LLC chez cet individu, d'une part, et, d'autre part, les propriétés particulières et inattendues de spécificité de l'anticorps anti-CD5 activé obtenu par la demanderesse, ont permis la mise au point de kits ou de méthodes ayant trait à la détermination de l'état d'activation du récepteur CD5, en particulier dans le cadre du diagnostic des maladies auto-immunes et des syndromes lympho-prolifératifs, et le cas échéant dans le pronostic d'évolution de ces pathologies.
Les travaux de la Demanderesse permettent de cibler encore plus spécifiquement, parmi les syndromes lympho-prolifératifs, le diagnostic ou le pronostic des leucémies lymphoïdes chroniques de type B (LLC ou B-LLC).
L'expression de CD5 a initialement conduit à l'hypothèse selon laquelle cette malignité (« malignancy ») aurait pour origine la population de cellules B de type B-la ; toutefois, il découle des observations précédentes que la LLC puisse également avoir pour origine l'activation des lymphocytes B, dans la mesure où l'expression de CD5 est elle-même induite par la stimulation BCR.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, la Demanderesse est également d'avis que les cellules B leucémiques de type LLC ont été sélectionnées par des interactions permanentes avec un antigène du soi. Ainsi, alors que des cellules B auto-réactives normales auraient été vraisemblablement supprimées au cours du processus développemental, ces cellules leucémiques doivent nécessairement avoir échappé à ce processus de sélection négative. Il est vraisemblable que la rencontre du BCR avec un antigène du soi implique la phosphorylation de CD5 sur tyrosines ; en conséquence, les cellules B de type LLC exprimant un répertoire auto-réactif, devraient également exprimer le marqueur CD5 sous une forme particulière et phosphorylée.
En particulier, les résultats de la Demanderesse indiquent que les pathologies de type LLC présentent toutes un mécanisme commun d'initiation de la malignité.
Il est montré selon l'invention que les cellules B de type LLC expriment à leur surface le marqueur CD5 sous sa forme active, telle que définie dans la présente description.
La MBL (ou « lymphocytose B monoclonale ») est généralement asymptomatique, caractérisée comme une forme précoce de la LLC (ou LLC-like), mais ne nécessitant pas de traitement particulier. Elle nécessite toutefois un suivi afin d'en déterminer l'évolutivité (Marti et al, 2005, Br J Haematology, 130, 325-332). Il n'existe pas actuellement de critère unique permettant de distinguer les cellules B de type MBL ou LLC. Toutefois l'organisation mondiale de la santé (OMS), propose un seuil de 5x109 cellules par litre de cellules B monoclonales afin d'apprécier la différence entre ces deux pathologies (Kern et al, 2012, Br J Haematol, 157(1), 86-96).
Dans la suite de la description, et pour un souci de clarté, on distinguera volontairement les cellules B de type MBL et de type LLC. Toutefois, et compte-tenu des similitudes entre ces deux pathologies, la présente invention englobe également l'utilisation d'un anticorps selon l'invention comme outil de suivi de l'évolution des proliférations lymphocytaires monoclonales (de type MBL) vers un stade pathologique de type LLC (ou LLC-hke).
Certes, de très nombreux exemples d'anticorps monoclonaux ont déjà été rapportés dans la littérature. Il convient toutefois de noter qu'aucun de ces anticorps n'est dirigé contre le peptide bien spécifique défini ci-dessus.
Par ailleurs des anticorps monoclonaux anti-résidus phospho-tyrosines ont été rapportés. Toutefois, il convient également de noter que ces anticorps anti-phosphotyrosines, sauf exception, ne présentent aucune autre spécificité particulière, et sont donc susceptibles de reconnaître toute tyrosine phosphorylée, quelle que soit la nature de son environnement chimique/peptidique.
On citera en particulier les anticorps monoclonaux anti-phosphotyrosine de souris PY20 commercialisé par la société Abcam® (référence : abl0321) ou 4G10 commercialisé par la société Millipore™ (référence 05-777) capables de reconnaître les tyrosines phosphorylées au sein d'une protéine. Il convient toutefois de noter que ces anticorps ne renseignent pas sur la position de ou des tyrosine(s) phosphorylée(s) dans la protéine d'intérêt et impliquée(s) dans tel ou tel mécanisme cellulaire.
D'autres anticorps monoclonaux plus spécifiques ont également été rapportés. On citera par exemple l'anticorps monoclonal anti V-Src pTyr416 commercialisé par la société Antibodies-online GmbH (référence : ABIN204748). Ce dernier anticorps semble en effet capable de reconnaître la forme phosphorylée de la protéine Src parmi les formes non- phosphorylées.
De manière générale, les anticorps monoclonaux contre des phospho-tyrosines particulières sont moins fréquemment rapportés, principalement en raison des risques élevés de réaction croisée de ces anticorps avec des molécules dites « carrier » (telles que la KLH), ou des phospho-tyrosines isolées (Glenney et al, 1988, Journal of Immunological Methods, 109, 277-285). Certains anticorps anti-phosphoprotéines sont cependant très utilisés en recherche. Citons à titre d'exemples des anticorps qui reconnaissent des protéines phosphorylées sur tyrosine, comme l'anti-PY705-STAT3, (Santa Cruz Biotechnology, référence sc-8059), I'anti-PY1054-1055-Tyk2 (Cell Signaling référence 9321), ou l'anti- PY694-STAT5 (Cell Signaling, référence 9351).
La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide comprenant la séquence de formule (I) suivante :
NH2-[Nt]y XiX2X3X4DNEY(P03H2)X5X6X7X8X9- [Ct]z -COOH (I) dans laquelle :
- y est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- z est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- Nt consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés en longueur,
- Ct consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés en longueur, et
- Xi, X2, X3, X4, X5, Χβ, X7, X8 et X9. représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un acide aminé. Comme cela est montré dans les exemples, l'anticorps monoclonal défini ci-dessus reconnaît spécifiquement la forme active de l'antigène CD5 qui est phosphorylée sur le résidu tyrosine localisé en position 453 de la séquence d'acides aminés de CD5 de SEQ ID N°2.
Dans un souci de simplification, on nommera pour la suite l'anticorps monoclonal de l'invention, lequel se lie spécifiquement à l'antigène CD5 phosphorylé sur le résidu tyrosine en position 453 (« PCD5 »), peut être désigné anticorps « anti-PCD5 ».
On entend par « anticorps monoclonal » des anticorps reconnaissant le même épitope et issus d'une même lignée de plasmocyte. Ces anticorps sont généralement produits à partir de plasmocytes de rongeurs, tels que la souris, le rat ou le lapin.
On entend par "forme active" ou "forme activée" de CD5, un état de CD5 résultant directement et nécessairement de l'activation du récepteur à l'antigène (TCR ou BCR), et qui est phosphorylée sur le résidu tyrosine en position 453 de CD5.
Anticorps anti-CD5 activé
La présente invention est relative à un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide comprenant, ou alternativement consistant en, la séquence de formule (I) suivante :
NH2-[Nt]y XiX2X3X4DNEY(P03H2)X5X6X7X8X9- [Ct]z -COOH (I) dans laquelle :
- y est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- z est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- Nt consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés de longueur,
- Ct consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés de longueur, et
- Xi, X2, X3, X4, X5, Χβ, X7, X8 et X9. représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un résidu d'acide aminé.
Un peptide Nt de 1 à 100 acides aminés de longueur englobe des peptides de 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 et 100 acides aminés de longueur.
Un peptide Ct de 1 à 100 acides aminés de longueur comprend des peptides de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 et 100 acides aminés de longueur.
Dans certains modes de réalisation, le peptide Nt est de 10 acides aminés de longueur ou moins, ce qui englobe 4 acides aminés de longueur.
Dans certains modes de réalisation, le peptide Ct est de 10 acides aminés de longueur ou moins, ce qui englobe 5 acides aminés de longueur.
Au sens de l'invention, un acide aminé est choisi parmi les acides aminés suivants: A (Alanine), G (Glycine), V (Valine), L (Leucine), I (Isoleucine, M (Méthionine), P (Proline), W (Tryptophane), F (Phénylalanine), M (Méthionine), H (Histidine), S (Sérine), T (Thréonine), C (Cystéine), N (Asparagine), Q (Glutamine), Y (Tyrosine), D (Acide Aspartique), E (Acide Glutamique), K (Lysine) et R (Arginine).
Les acides aminés Xi, X2, X3, X4, X5, X6, X7, Xs et X peuvent être identiques ou différents. Par Cystéine et Méthionine, on englobe également les acides aminés dits "non- naturels" tels que les Sélénocystéines et Sélénométhionines.
Dans certains modes de réalisation, ledit anticorps monoclonal est dirigé contre un peptide de formule (I), dans laquelle :
- Xi et X4 sont des acides aminés non polaires choisis parmi A, G, V, L, I,
- X2 et X5 sont des acides aminés polaires choisis parmi S et T,
- Χβ est choisi parmi N et Q,
- X3 et X sont des acides aminés basiques choisis parmi H, K et R,
- X7 et Xg sont des pralines.
L'invention est aussi relative à un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide ou une protéine comprenant, et de préférence consistant en, la séquence SEQ ID N° 1 phosphorylée sur tyrosine:
- ASHVDNEY(P03H2)SQPPR -
Par "anticorps" au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F(ab)'2, F(ab)) ou encore tout peptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le peptide de formule (I), y compris tout peptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le peptide phosphorylé sur tyrosine de séquence SEQ ID N°l . Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique déente par KOHLER et MILSTEIN (1975).
La présente invention concerne donc également des anticorps monoclonaux dirigés contre un peptide de formule (I), y compris des anticorps monoclonaux dirigés contre un peptide phosphorylé sur tyrosine de séquence SEQ ID N°l, lesdits anticorps monoclonaux étant produits selon la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) se liant spécifiquement à un peptide de formule (I), y compris à un peptide phosphorylé sur tyrosine de séquence SEQ JD N° 1, et produits selon la technique décrite dans le brevet US N°4,946,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps monoclonaux selon l'invention englobent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que décrites par RIDDER et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels que décrits par REINMANN et al. (1997) et LEGER et al. (1997).
Un anticorps monoclonal selon l'invention peut comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Notamment, les anticorps monoclonaux sont choisis parmi :
(i) des anticorps monoclonaux produits par des cellules issues de la fusion cellulaire entre (a) des cellules B d'un mammifère non humain immunisé à l'encontre d'un peptide formule (I), y compris un peptide phosphorylé sur tyrosine de séquence SEQ ID N° 1, et (b) des cellules d'une lignée cellulaire productrice d'anticorps, telle que des cellules d'un myélome ;
(ii) des anticorps monoclonaux produits par des cellules transfectées ou transformées avec un ADN codant une immunoglobuline, ledit ADN étant préalablement isolé à partir de l'ADN d'une cellule B d'un mammifère non humain immunisé à l'encontre d'un peptide formule (I), y compris un peptide phosphorylé sur tyrosine de séquence SEQ ID N° 1 ;
(iii) les fragments Fab ou F(ab)'2 préparés à partir des anticorps monoclonaux (i) et (ii) ci- dessus ;
(iv) des fragments ScFv se liant spécifiquement à un peptide formule (I), y compris un peptide phosphorylé sur tyrosine de séquence SEQ ID N° 1.
Un anticorps selon l'invention peut être notamment d'isotype IgG, tels que les IgGl, IgG2a, IgG2b et IgG3, IgA ou IgM. Selon un mode préféré de réalisation, un anticorps est choisi parmi les anticorps d'isotype IgG-3 kappa et un anticorps d'isotype IgM-kappa en fonction de leur spécificité vis à vis du peptide phosphorylé immunisant.
Selon un mode préféré de réalisation, un anticorps selon l'invention peut être un anticorps de souris.
Un tel anticorps peut être obtenu par les méthodes décrites dans (Bismuth G,
Gouy H, et al, 1990, Mol Immunol. 27: 1127-36) et telles que précisées dans l'exemple 1.
Ainsi un anticorps monoclonal selon l'invention peut être produit à partir d'un hybridome issu de la fusion cellulaire des cellules B issues de la rate de souris immunisées Balb/c est réalisée avec le myélome SP2/0.
Ce motif phosphorylé de 13 acides aminés est propre à la protéine CD5 humaine.
Avantageusement, l'anticorps monoclonal selon l'invention est spécifique de la forme active du récepteur CD5 ou PCD5. De façon préférentielle, cette forme active du récepteur CD5 est exprimée à la surface des lymphocytes T et des lymphocytes B et des lymphocytes Bl-a normaux après activation et des lymphocytes B de type LLC.
La séquence de la protéine CD5 considérée peut être avantageusement celle définie selon la SEQ JD N°2. Sont également considérés les polymorphismes naturels connus de CD5. Comme vu précédemment, on considérera par exemple les séquences de CD5 référencées dans Carnero-Montoro et al. (Carnero-Montoro et al., Evolutionary and functional évidence for positive sélection at the human CD5 immune receptor gene, 2012, Mol Biol Evol., 29(2):811-23).
Avantageusement, et de façon non limitative, l'anticorps de l'invention permet de reconnaître les formes humaines et murines du CD5 en raison d'une forte homologie de séquence du domaine cytoplasmique des formes humaines et murines de CD5.
Ainsi, l'anticorps de l'invention reconnaît spécifiquement la forme active de CD5 ou PCD5, par exemple la forme de CD5 qui est activée suite à l'engagement du TCR ou du BCR, en particulier du BCR. Avantageusement, cette forme activée correspond à la forme de CD5 phosphorylée sur son domaine régulateur intracellulaire suite à l'engagement du BCR.
Selon un mode de réalisation, un anticorps selon l'invention est capable de discriminer la forme active de CD5 (aussi appelée « PCD5 ») de la forme non-active.
Selon un mode préféré de réalisation, l'anticorps de l'invention reconnaît spécifiquement le motif DNEY de CD5, dans sa forme phosphorylée sur Y453 ainsi que la séquence peptidique de CD5 englobant ce motif DNEY, en particulier le domaine régulateur intracellulaire de CD5.
Par "domaine régulateur intracellulaire de CD5" on entend la région intracellulaire de CD5 comprise entre l'acide aminé 446 et l'acide aminé 458, et comprenant un motif DNEY.
Avantageusement, un anticorps monoclonal selon l'invention ne présente pas de réaction croisée avec un peptide de SEQ ID N°l ou la forme non phosphorylée sur tyrosine d'un peptide de formule (I), en particulier avec un peptide de SEQ ID N°l.
Avantageusement, un anticorps monoclonal selon l'invention ne présente pas de réaction croisée avec une tyrosine phosphorylée isolée.
Avantageusement un anticorps monoclonal selon l'invention ne présente pas de réaction croisée avec la forme non-activée du récepteur CD5.
Avantageusement, un anticorps monoclonal selon l'invention ne présente pas de réaction croisée avec une tyrosine phosphorylée isolée, ou de la forme non-activée du récepteur CD 5.
Encore plus avantageusement un anticorps monoclonal selon l'invention ne présente pas de réaction croisée avec :
a) Un peptide comprenant, ou consistant, en la forme non-activée du récepteur
CD5,
b) un peptide de séquence SEQ ID N° 1,
c) une tyrosine phosphorylée isolée ou faisant partie d'un peptide tel que défini dans a).
Par « réaction croisée » on entend la capacité d'un anticorps à se lier de manière détectable à une tyrosine isolée phosphorylée, ou à un peptide distinct d'un peptide de formule (I), en particulier à un peptide distinct du peptide de SEQ ID N°l phosphorylé sur tyrosine. L'homme de l'art est ainsi parfaitement capable de déterminer un seuil de détection pour établir la présence, ou non, d'une réaction croisée selon la méthode employée. On considérera en particulier, et de façon non-limitative, une méthode de détection parmi un groupe comprenant les techniques ELIS A, les western-blots, l'immunoprécipitation, rimmunofluorescence, l'immunohistochimie, la cytométrie en flux, la cytométrie de masse, la microscopie électronique, les puces à protéines ou « protein arrays », ou encore telle que définie par les exemples 4 et 5.
Avantageusement l'anticorps monoclonal selon l'invention peut donc être utilisé par ELISA, Western-blot, immunoprécipitation, immunofluorescence, immunohistochimie, cytométrie en flux, cytométrie de masse, microscopie électronique et puces à protéines ou « protein array ».
Un anticorps selon l'invention est ainsi particulièrement avantageux pour une utilisation en immunohistochimie ou en cytométrie en flux.
Selon un mode particulier de réalisation, l'anticorps peut être combiné de manière covalente ou non covalente à une molécule détectable. De tels exemples de molécule détectable sont bien connus de l'homme de l'Art. En particulier, un exemple de molécule détectable est illustré dans l'exemple 2.
On citera en particulier, et de façon non limitative, un anticorps couplé à une molécule détectable, choisie parmi le groupe suivant : (i) une molécule radioactive, (ii) une molécule fluorescente, (iii) une molécule luminescente, (iv) une molécule récepteur sélectivement reconnue par un ligand et (v) une étiquette métallique.
En particulier on considérera un anticorps couplé à une molécule radioactive telle qu'un isotope lourd naturel ou radioactif, une molécule luminescente telle qu'un chromophore, un luminophore, un fluorophore, un agent calorimétrique, une substance magnétique, un marqueur électro-chemi-luminescent, un marqueur de spin, des particules d'or ou d'argent, ou encore des enzymes ou substrats.
Des fluorophores peuvent avantageusement être utilisés, ainsi que des complexes de lanthanides et des étiquettes métalliques, notamment Europium et Terbium, la fluoresceine, la fluoresceine isothiocyanate (FITC), la dichlorotriazinylamine, la rhodamine, l'éosine, la coumarine, les méthyl-coumarines, le pyrène, le vert de Malachite, les fluorophores de type Cy® ou Alexa® (Invitrogen) tels que le Cy®3, Cy®5, Alexa Fluor® 488, Lucifer Yellow, Cascade Blue, Texas Red, le chlorule de dansyle, la phycoerythrine, la luciferine, la GFP et ses variants, le bore-dipyromethene (BODIPY), et d'autres connus dans l'art antérieur tels que ceux décrits dans Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugène, Oreg.) 6th Edition; The Synthegen catalog (Houston, Tex.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Plénum Press New York (1999). Méthodes de détection, de diagnostic et de pronostic
Comme le montre notamment l'exemple 3, les anticorps anti-PCD5 de l'invention permettent avantageusement de distinguer les formes inactives de CD5 des formes activées. In vitro, le phénomène d'activation du récepteur CD5 peut ainsi être induit, de façon non limitative, sur des cellules normales ou des cellules B Daudi, après stimulation par des anti-IgM et, optionnellement, pontage de ces dernières au BCR.
Ce nouvel outil permet avantageusement d'analyser l'intensité et la cinétique du phénomène de phosphorylation de CD5 dans les cellules dites « normales », par rapport à une population de cellules « test », notamment de cellules B leucémiques. L'anticorps anti-PCD5 permet en particulier de déterminer le pourcentage de cellules CD5+ PCD5+ à un temps donné. Comme vu précédemment, les résultats de la Demanderesse renforcent l'idée que le complexe BCR est stimulé in vivo, et de façon permanente, dans toutes les cellules de type LLC, indépendamment de leur statut mutationnel IgV.
L'invention concerne donc également une méthode in vitro de détection de CD5 activé (aussi appelé « PCD5 ») dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) mise en contact d'un échantillon à tester avec un anticorps monoclonal anti-
PCD5 tel que défini dans la présente description,
b) détection ou quantification des complexes formés entre ledit anticorps monoclonal et des cellules exprimant un CD5 activé (« PCD5 ») éventuellement présentes dans ledit échantillon.
Préférentiellement, l'échantillon est choisi dans le groupe consistant en (i) un échantillon de sang total, (ii) une suspension de cellules mononucléaires et polymorphonucléaires périphériques purifiées à partir d'un échantillon de sang total, (iii) une suspension de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) purifiées à partir d'un échantillon de sang total, (iv) une suspension de cellules lymphocytaires T purifiées à partir d'un échantillon de sang total, et (v) une suspension de cellules lymphocytaires B purifiées à partir d'un échantillon de sang total.
Dans des modes de réalisation particuliers, la méthode de détection telle que définie ci-dessus peut comprendre une étape de mise en contact dudit échantillon avec un ou plusieurs ligands additionnels, en particulier des anticorps, préférentiellement avec un ou plusieurs anticorps spécifiques d'un type cellulaire particulier susceptible d'être contenu dans ledit échantillon, le(s)dit(s) ligand ou anticorps additionnel(s) étant choisi(s) parmi le groupe suivant : (i) des ligands ou anticorps reconnaissant un marqueur ou antigène spécifique des lymphocytes B présents chez un individu affecté d'une lymphocytose B monoclonale, (ii) des ligands ou anticorps reconnaissant un marqueur ou antigène spécifique des lymphocytes Bl (iii) des ligands ou anticorps reconnaissant un marqueur ou antigène spécifique des lymphocytes B2, (iv) des ligands ou anticorps reconnaissant un marqueur ou antigène spécifique des lymphocytes T, (v) des ligands ou anticorps reconnaissant un marqueur ou antigène spécifique des lymphocytes B présents chez un individu affecté d'une LLC, et (vi) des ligands ou anticorps reconnaissant un marqueur ou antigène spécifique des lymphocytes B présents chez un individu affecté d'une MCL.
Avantageusement, l'étape de détection telle que définie précédemment peut être réalisée par une technique choisie dans le groupe suivant : ELISA, Western-blot, immunoprécipitation, immunocyto-chimie, immunocyto-fluorescence, cytométrie en flux, cytométrie de masse, microscopie électronique, puce à protéines ou « protein array ».
De façon remarquable, l'exemple 4 montre que le marquage par un anticorps anti- PCD5 selon l'invention n'est retrouvé sur aucun (0 %) des lymphocytes B CD5+ issus de la totalité des individus « sains » testés, alors que l'anticorps anti-PCD5 se lie aux cellules B des patients affectés d'une LLC. Il convient donc de reconnaître que la méthode de détection selon l'invention présente des caractéristiques de sensibilité et de spécificité requises pour réaliser un diagnostic de la survenue d'une LLC chez un individu. Ce résultat est compatible avec les données in vitro décrites dans l'exemple 3.
En outre, l'exemple 4 montre que les anticorps anti-PCD5 selon l'invention permettent de distinguer certaines formes pathologiques associées aux lymphocytes exprimant le marqueur CD5 à leur surface. Sont ici tout particulièrement considérées les formes pathologiques associées aux cellules B, et encore plus particulièrement les syndromes lympho- prolifératifs associés aux cellules B. Comme vu précédemment, les leucémies lymphoïdes chroniques présentent une activation à leur surface du marqueur CD5 : ces cellules B de type LLC présentent donc un profil CD5+ PCD5+.
On montre en particulier que ce double marquage concerne 100 % des cellules B de type LLC extraites de patients diagnostiqués, ainsi qu'une majorité de cellules B extraites de trois patients MBL. Ce marquage des cellules B de type LLC n' apparaît pas dépendant du statut mutationnel IgV.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne donc également une méthode de diagnostic et de pronostic de la Leucémie Lymphoïde Chronique. A titre de comparaison, et comme décrit précédemment, un score de Matutes de 4 ou 5 n'est établi que pour seulement 87 % des cas de LLC. En d'autres termes, prêt de 13 % des LLC présentent un score de 0, 1, 2 ou 3, et ne permettent donc pas d'être identifiés par cette seule méthode.
La méthode décrite ci-dessus permet donc avantageusement de détecter des cellules B de type LLC parmi d'autres populations pour lesquelles CD5 est également un marqueur de surface, et/ou pour lesquels il est susceptible d'être sous sa forme activée. La méthode décrite par l'invention peut donc avantageusement compléter voire se substituer à celle actuellement employée, qui requiert l'établissement d'un score de Matutes de 4 ou 5.
En particulier l'exemple 4 démontre que le profil d'activation des cellules B de type LLC (PCD5+) est distinct de celui observé pour les cellules B de type Lymphome de Manteau, ou MCL (PCD 5-).
La présente invention concerne aussi une méthode in vitro de détermination de la survenue d'une leucémie lymphoïde chronique chez un individu, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) mise en contact d'un échantillon préalablement collecté chez ledit individu avec un anticorps anti-PCD5 tel que défini dans la présente description, b) détection ou quantification des complexes formés entre ledit anticorps et des cellules exprimant un CD5 activé qui sont éventuellement présentes dans ledit échantillon, la détection dudit complexe étant indicative de la survenue d'une leucémie lymphoïde chronique chez ledit individu.
Dans certains modes de réalisation de la méthode ci-dessus, ladite méthode comprend aussi une étape de mise en contact de l'échantillon avec au moins un ligand se liant spécifiquement à un antigène choisi parmi les antigènes CD5, CD22, CD23, FMC7, IgS, chaîne κ d'immunoglobuline et chaîne λ d'immunoglobuline. Comme ligand, on utilise de préférence un anticorps choisi parmi les anticorps suivants: anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS, et/ou anti chaînes κ ou λ.
Avantageusement, une méthode telle que définie ci-dessus peut inclure une étape de réalisation d'un score de Matutes.
Dans ce mode de réalisation particulier, on pourra utiliser les anticorps anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7 et/ou anti-IgS selon les protocoles classiquement définis pour la réalisation d'un tel score. Ces protocoles et anticorps sont connus de l'homme de l'Art, et déjà présentés, par exemple, dans (Matutes et al, 1994, Leukemia, 8: 1640-45 ; Matutes et al., 1994, Leuk Lymphoma, 14 Suppl 1:57-61).
On citera en particulier l'anticorps anti-CD5 (clone UCH-T2), les anticorps anti- CD22, anti-CD23, anti-FMC7 et anti-IgS commercialisés par la société Dako. Les anti- CD5/CD23/CD22/FMC7/anti chaînes κ ou λ directement couplés à des fluorochromes utilisés en routine en cytométrie de flux peuvent être commercialisés par les sociétés Becton Dickinson et Beckman Coulter Immunotech.
Selon un mode de réalisation, la méthode définie précédemment est ainsi particulièrement avantageuse dans le cadre d'échantillons pour lesquels le score de Matutes de Γ échantillon est égal ou inférieur à 3.
Avantageusement, une méthode selon l'invention permet donc de distinguer la LLC des tricholeucémies (HCL ou Hairy Cell Leukemia), des variantes de ces tricholeucémies (HCL-variants), des autres formes atypiques telles que les SLVL (ou Splenic Lymphoma with Villous Lymphocytes), des leucémies prolymphocytiques (ou PLL), des lymphomes folliculaires, les lymphomes lymphoplasmacytiques, des lymphomes du manteau (ou MCL), ou encore des lymphomes de type LCL (Large Cell Lymphoma).
Comme vu précédemment, il convient par ailleurs de noter que les cellules B de type lymphocytose monoclonale B (ou MBL) constituent une forme particulière de lymphocytose, ne nécessitant pas de traitement mais susceptible d'évoluer vers des cas de LLC.
Selon un mode alternatif de réalisation, une méthode de l'invention peut ainsi également être employée comme outil de suivi de l'évolution des proliférations lymphocytaires monoclonales (de type MBL) vers un stade pathologique de type LLC.
Il conviendra alors, afin de préciser ces formes intermédiaires de la LLC, de compléter ce diagnostic par d'autres analyses, telles qu'une numérotation des lymphocytes B présents dans le sang.
Comme vu précédemment, une telle numérotation peut se traduire par l'établissement d'un seuil pathologique, qui peut être d'environ 5xl09 cellules par litre de cellules B monoclonales, ou encore de 5000 cellules B / mm3. Naturellement, des cas particuliers, ou « frontières », peuvent également être établis pour des valeurs supérieures ou inférieures à ce seuil.
Une telle sélection, ainsi que l'établissement d'un seuil pathologique, sont parfaitement dans les connaissances de l'homme de l'art. De manière générale, les méthodes définies par l'invention peuvent également être associées à d'autres méthodes de détection, de diagnostic ou de pronostic, telles qu'un immunophénotypage, la mise en évidence d'une hyperleucocytose, l'établissement d'un myélogramme, l'électrophorèse des protides, l'analyse cytogénétique (notamment par hybridation in situ ou méthode FISH), l'analyse du profil mutationnel par séquençage des gènes des immunoglobulines (on parlera alors de profil « non muté » ou « hypermuté »), ou encore la mesure de l'expression de la protéine ZAP70 (notamment par cytométrie en flux).
En particulier il convient de noter que l'observation conjointe de certaines délétions chromosomiques, d'un profil non muté et de la présence de ZAP70 sont indicateurs d'un pronostic défavorable de LLC. L'interprétation de ces données fait également partie des connaissances générales de l'homme de l'Art, qui peut être un biologiste spécialisé dans les maladies du sang.
Ainsi la méthode selon l'invention viendra avantageusement compléter ou confirmer l'établissement d'un pronostic défavorable.
Kits de détection
La présente invention concerne aussi un kit de détection de la présence de CD 5 activé (« PCD5 »), ou de lymphocytes activés, comprenant nécessairement l'anticorps anti- PCD5 de l'invention, ainsi qu'un ou plusieurs ligands reconnaissant un autre marqueur cellulaire. Le cas échéant, un ligand dirigé contre un des marqueurs du kit peut être un anticorps, un aptamère nucléique, un aptamère protéique ou encore tout autre ligand connu dudit marqueur. De préférence, ce ligand est un anticorps.
En particulier sont considérés tous les types cellulaires pour lesquels le marqueur de surface CD5 peut être exprimé, et donc pour lesquels peut être envisagée son activation.
De façon non exhaustive et non limitative, on citera parmi les types cellulaires envisagés, les lymphocytes T, les lymphocytes B et les lymphocytes B-la.
De façon non limitative, peuvent être également considérés dans ce kit les marqueurs de tous les types cellulaires exprimant physiologiquement ou non, de façon constitutive ou induite, le marqueur de surface CD5, tels que : les lymphocytes B de type HCL, ou Hairy Cell Leukemia, des variantes de ces tricholeucémies (HCL-variants), des autres formes atypiques telles que les SLVL (ou Splenic Lymphoma wiih Villous Lymphocytes) , des leucémies prolymphocytiques (ou PLL), des lymphomes folliculaires, des lymphomes lymphoplasmacytiques, des lymphomes du manteau (ou MCL), ou encore des lymphomes de type LCL {Large Cell Lymphoma). Enfin, les proliférations B monoclonales (Monoclonal B cell lymphocytosis, MBL) fréquentes chez le sujet âgé (>2 % de la population) et dont une fraction évolue vers la LLC, sont également considérées. Une telle sélection de marqueurs relève des connaissances générales de l'homme de l'Art.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne donc un kit de détection de
CD5 activé comprenant :
a) un anticorps anti-PCD5 tel que défini dans la présente description, et b) un ligand dirigé contre une cellule exprimant le récepteur CD5, ledit ligand étant distinct de l'anticorps anti-PCD5 utilisé à l'étape a).
Selon un mode particulier de réalisation, ledit kit de détection de CD5 activé comprend :
a) un anticorps anti-PCD5 tel que défini dans la présente description, b) un ligand anti-CD5.
Un kit de détection peut ainsi être utilisé dans le cadre, ou en complément, de l'établissement d'un score de Matutes, et/ou de toute méthode décrite par l'invention.
Selon ce mode de réalisation, l'invention peut donc concerner un kit de détection de lymphocyte activé comprenant un ou plusieurs ligands choisis parmi le groupe suivant: ligands anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS, anti chaînes κ ou λ. De façon préférée, ce ligand est un anticorps anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS et/ou anti chaînes κ ou λ.
Selon un mode particulier de réalisation du kit de détection de lymphocytes activés, ledit kit peut aussi inclure:
a) un anticorps anti-PCD5 tel que défini précédemment,
b) un ligand anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, et/ou anti-IgS.
Avantageusement, l'invention concerne un kit de détection qui peut comprendre : a) un anticorps anti-PCD5 tel que défini précédemment,
b) un ligand anti-CD5,
c) un ligand anti-CD22,
d) un ligand anti-CD23,
e) un ligand anti-FMC7,
f) un ligand anti-IgS. Dans certaines variantes du kit, un kit tel que défini précédemment peut comprendre en outre un ligand, en particulier un anticorps, dirigé contre un des marqueurs suivants : un ligand anti-CD2, anti-CD19, anti-CD27, anti-CD38, anti-HLA-DR, anti-IgM, anti-phosphoprotéine. Les phosphoprotéines considérées peuvent notamment être des P-CD5, des P-Lyn, P-p38MAP Kinase et P-STAT3.
Dans certaines autres variantes, un kit tel que défini précédemment peut comprendre en outre un ligand, en particulier un anticorps, dirigé contre un des marqueurs suivants : un ligand anti-CD2, anti-CD19, anti-CD27, anti-CD40, anti-CD80, anti-CD86, anti- CD38, anti-HLA-DR, anti-IgM, anti-phosphotyrosine, anti-phosphoprotéine.
Selon un mode particulier de réalisation, le kit peut donc également comprendre un ligand, en particulier un anticorps, dirigé contre des phosphotyrosines ou des phosphoprotéines, et tout particulièrement P-CD5, P-Lyn, P-p38MAP Kinase et P-STAT3.
Selon un mode préféré de réalisation, le kit peut donc également comprendre un ligand, en particulier un anticorps, choisi dans le groupe suivant : anti P-CD5, anti P-Lyn, anti P-p38MAP Kinase, anti P-STAT3.
Selon un mode de réalisation, un anticorps monoclonal de souris anti-P-STAT3 peut être un anti-PY705-STAT3 (clone B-7, Réf. sc-8059, « Mouse Monoclonal anti-human P-STAT3 »), commercialisé par Santa Cruz Biotech®.
Selon un mode de réalisation, un anticorps anti P-Lyn peut être un anti-PY507 ou un anti-PY396 (Réf. AJ1451c; Réf. AJ1451b), commercialisés par Abgent.
Selon un mode de réalisation, un anticorps polyclonal de lapin anti-P-p38MAP Kinase peut être un anti-P-T180/Y182-p38MAPK (Réf. AF869) commercialisé par R&D Systems®.
Selon un autre mode de réalisation, le kit peut également comprendre un ligand, en particulier un anticorps, dirigé contre les formes non phosphorylées de ces phosphoprotéines.
Naturellement, un kit de détection de CD5 activé, ou encore de lymphocytes activés, peut être utilisé dans le cadre des méthodes définies par l'invention, telles que par exemple une puce à protéines ou « protein array ».
La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, par les exemples suivants. EXEMPLES
Exemple 1 ;
Obtention d'un anticorps monoclonal anti-PCD5.
Les peptides de CD5 qui ont été utilisés pour l'immunisation des souris et pour les deux tests ELISA de criblage des anticorps monoclonaux ont été synthétisés et phosphorylés à façon par la Société EUROGENTEC.
1) peptide synthétique pour la détection ELISA
Séquence : H2N - ASHVDNEYSQPPR - CONH2
Poids Moléculaire : 1499,57 g/mol
2) peptide synthétique phosphorylé pour la détection ELISA
Peptide No : EP091263 correspondant à EPO 81741 pY453
Séquence : H2N - ASHVDNEY(P03H2)SQPPR - CONH2
Poids Moléculaire : 1578,57 g/mol
3) peptide synthétique phosphorylé couplé à KLH pour immunisation Conjugaison du peptide à une protéine porteuse « carrier »
Protéine porteuse : KLH (couplage avec 5 mg de peptide)
Réactif de couplage : glutaraldéhyde
Rendement de couplage : 55 %
Le peptide correspondant à la région de CD5 humain et comprenant la Tyrosine 453 est synthétisé, puis phosphorylé et couplé à la protéine cargo KLH avant immunisation de souris. La fusion cellulaire des cellules B issues de la rate des souris immunisées Balb/c est réalisée avec le myélome SP2/0 (Shulman et al., 1978, Nature, 276, 269 -270). La sélection des hybri dômes est réalisée selon le protocole établi (Bismuth G, Gouy H et al, 1990, Mol ImmunoL, 27: 1127-36). Six cent surnageants de culture d'hybridome ont été criblés par deux tests ELISA à partir des peptides phosphorylés et natifs.
Les hybridomes ont été clonés en utilisant la méthode statistique de Poisson de clonage par dilution limitée. Les surnageants des clones ont été de nouveau testés par ELISA contre les 2 peptides de 13 acides aminés cités plus-haut, phosphorylé et natif pour vérification. La classe d'anticorps monoclonaux de souris et l'identité de la sous-classe ont été déterminées à partir du kit "Rapid Mouse Antibody Isotyping kit - Kappa & Lambda - Mouse" (Thermo Scientific, Perbio Sciences France SAS).
Deux anticorps monoclonaux ont été sélectionnés: un anticorps IgG3 Kappa et un anticorps de type IgM Kappa.
Exemple 2;
Purification et marquage d'un anticorps monoclonal anti-PCD5 et Isotype contrôle IgG3k par un fluorophore.
Le surnageant d'une culture d'hybridome (IgG3k) est précipité par le sulfate d'ammonium. Une procédure de purification d'anticorps de type IgG par centrifugation sur colonne Melon™ Gel est appliquée sur l'échantillon dialysé selon les instructions du fabricant, et en utilisant un kit de type Melon™ Gel IgG Spin Purification kit (Thermo
Scientific, Perbio Sciences France SAS).
L'anticorps monoclonal purifié de l'invention et l'anticorps monoclonal purifié
IgG3, K Isotype Control (BD Pharmingen) sont marqués tous deux par le fluorophore Alexa Fluor 488 (Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit de Molecular Probes,
Invitrogen référence A-20181) ou bien marqués par la Biotine
(Thermofisher/Perbioscience/Pierce), avec le E2 link microsulfo-NHS-biotinylation kit
(référence 21217) en suivant les instructions du fabricant. Exemple 3 ;
Evaluation par analyse microscopique de la spécificité de l 'anticorps anti-PCD5 pour la forme activée de CD5.
Objectif de l'étude : mise en évidence de la spécificité de l'anticorps anti-PCD5 pour la forme activée de CD5, par rapport à la forme inactive (i.e. non-activée par la voie de signalisation du récepteur BCR).
A. Matériel & Méthodes
Les anticorps anti-PCD5 sont obtenus selon le protocole décrit en exemples 1 et 2. Des cellules B Daudi (2x106) transfectées avec un vecteur vide pNT (voir Gary- Gouy H et al, Blood 2002), ou contenant la séquence entière cDNA du CD5 humain (SEQ ID N°2) sont stimulées, ou non, avec une solution d'anti-IgM F(ab)'2 de lapin à 2 μg/mL (Jackson Immunosearch, Baltimore, référence 309-006-043) pendant 5 minutes, puis marquées par un anticorps anti-CD5 UCH-T2 couplé à un fluorochrome (Santa-Cruz Biotechnology®, CD5 (UCH-T2), référence sc-1180). Les cellules sont ensuite fixées en tampon neutre PBS Dulbecco contenant 4 % w/v Paraformaldéhyde pendant 30 minutes à température ambiante et perméabilisées en tampon neutre PBS Dulbecco contenant 0,5 % de Triton XI 00 pendant 4 minutes à température ambiante. La réaction est bloquée par une solution de PBS contenant 5 % d'albumine bovine pendant 30 minutes. Les lames sont ensuite marquées (i) soit avec un anticorps de lapin anti-CD5 (Santa-Cruz Biotechnology, CD5 (H300) référence sc-20920) et un anticorps anti-lapin couplé à Alexa594 (Invitrogen™) (ii) soit avec un anticorps de souris anti-PCD5 non marqué et un anticorps anti-souris couplé à Alexa488 ((Invitrogen™) (iii) soit avec un anticorps purifié contrôle isotype IgG3 kappa de souris (BD Pharmingen, référence 550341) et un anticorps anti-souris couplé à Alexa488 (Invitrogen™).
Les plaques sont montées dans un milieu Vectashield® (Vector Laboratories) comprenant du DAPI pour la coloration du noyau. Les clichés sont pris à un grossissement x40. Les images sont acquises avec un microscope Zeiss Axio2 et le logiciel Axio (Cari Zeiss, Oberkochem Germany).
B. Résultats
L'expérience met en évidence la coloration par le fluorochrome DAPI du noyau de toutes les cellules. Les cellules sont marquées et expriment la protéine CD5 à leur surface. Seules les cellules qui ont été stimulées présentent une coloration à leur périphérie associée à l'anticorps anti-PCD5 qui reconnaît la forme active du marqueur CD5.
Ce résultat met donc en évidence la spécificité particulière de l'anticorps de l'invention pour la forme active.
L'analyse par immunofluorescence des cellules B du sang d'un sujet sain (avec un pontage de l'IgM de surface, qui induit leur activation) et de cellules pathologiques issues d'un patient souffrant de LLC, est également réalisée après marquage par l'anticorps anti- PCD5 de l'invention. Cette analyse confirme le résultat précédent et permet de l'étendre aux cellules B caractéristiques de la LLC. Exemple 4 ;
Etude de l 'activation du récepteur CD5 sur des cellules de LLC, de cellules B purifiées du sang périphérique humain d'un donneur sain et de cellules de Lymphome du manteau.
Objectif de l'étude : mise en évidence de la capacité de l'anticorps anti-PCD5 à marquer spécifiquement certaines populations pathologiques de lymphocytes B.
A. Matériel & Méthodes
1. Sélection des patients
On considère ici 3 patients MBL (Lymphocytose monoclonale B), 4 patients MCL (Lymphome du manteau) et 23 patients LLC (Leucémie lymphoïde chronique). Les cellules issues de ces patients ont été collectées après consentement éclairé et signé conformément à la déclaration d'Helsinki et les lois éthiques de la faculté de médecine de l'université de Nancy. Les cellules B issues de ces groupes de donneurs ont été séparées à partir d'un cocktail d'enrichissement Rosettesep™ selon le protocole établi par le fabricant (Stem Cell technologies, Vancouver Canada). La pureté des préparations obtenues est supérieure à 97 %.
Les cellules extraites des patients du groupe « témoin » (patients 1 à 6) utilisées pour cette étude sont décrites dans Gary-Gouy et al (Gary-Gouy et al. 2007, J Immunol., 179 : 4333-4344). En outre, les cellules de 6 patients LLC issus de cette étude sont également incluses dans l'analyse, ce qui porte le nombre total de patients à 23. Ces cellules sont décongelées et, sauf indication contraire, maintenues pendant une nuit dans un incubateur ( 5 % CO2 et à 37 °C) avant de procéder à leur analyse. Les caractéristiques des patients participant à l'étude (hormis les 6 patients LLC issus de l'étude mentionnée ci-dessus, ainsi que des témoins) sont résumées dans le tableau 1.
Le groupe LLC comprend 10 hommes et 8 femmes, de 47 à 82 ans, et à un stage de Binet de A (9 patients), B (4 patients) et C (4 patients). Comme vu précédemment, le stage de Binet est un système de classification communément utilisé pour l'évaluation de la gravité d'une leucémie lymphoïde chronique.
Les caractéristiques cliniques des patients spécifiquement inclus dans cette étude et constituant ces groupes sont récapitulées dans le tableau 1. Tableau 1 : patients représentatifs inclus dans l'étude, diagnostiqués LLC, MBL
Figure imgf000031_0001
LLC = leucémie lymphoïde chronique
MBL = lymphocytose monoclonale B (inférieur ou égal à 6000 cellules B / MCL = lymphome du manteau
Statut mutationnel : UM (non muté), M (muté), NR (non renseigné) 2. Marquage des cellules et FACS
Les statistiques du tableau 1 sont obtenues à partir de l'ensemble des patients considérés dans l'étude.
On considère en particulier (figure 1) pour l'étude par FACS les cellules B extraites du sang d'un adulte sain (groupe « témoin »), les cellules B issues d'un patient LLC représentatif (patient 12, voir tableau 1), et un patient MCL (patient 27), toutes positives pour la chaîne slgLK, sont marquées à leur surface par des anticorps monoclonaux anti-CD19 (Beckman-Coulter catalog no : FM1285U), anti-CD5 (IoTest® CD5-FITC Beckman Coulter référence A08932) et anti-CD23 (Dako, clone MHM6, Ref 7062) ainsi que des anticorps polyclonaux anti-IgK, anti-Ig (Dako, catalog no : FR481) puis perméabilisées et marquées intra-cellulairement par un contrôle isotype IgG3 kappa de souris (BD Pharmingen, référence 550341) couplé à Alexa 488 et l'anticorps anti-PCD5-Alexa488. L'expérience de FACS est réalisée sur un cytomètre en flux (FACSCalibur™ Beckton Dickinson). Les cellules en Dulbecco PBS sont fixées et perméabilisées selon le protocole du kit de fixation- perméabilisation Beckton Dickinson CytoFix/ CytoPerm™ (référence 554714).
B. Résultats
Le tableau 2 récapitulatif compare, à partir des cellules B extraites de témoins et de patients LLC, MBL ou MCL, les pourcentages de lymphocytes B CD5+ présents dans l'échantillon, ainsi que de lymphocytes présentant le double marquage CD5+ PCD5+. Ces valeurs sont obtenues à partir d'une analyse par FACS de l'ensemble des échantillons extraits des patients décrits dans le tableau 1.
On observe donc que les cellules B de type leucémie lymphoïde chronique présentent bien un double marquage CD5+PCD5+ caractéristique, qu'on ne retrouve ni dans les cellules B « saines », ni dans les cellules B de type MCL.
On note également que la majorité des cellules B de type MBL présentent aussi ce double marquage. Cette propriété est cohérente avec les propriétés évolutives de certaines formes de MBL vers la LLC, et valide donc l'utilisation de l'anticorps de l'invention comme outil de pronostic. Tableau 2 : effet du marquage par l'anticorps PCD5 d'échantillons de cellules B extraits de patients souffrant des pathologies de type LLC, MBL et MCL. Les résultats (%) sont rapportés au nombre total de cellules marquées. Les résultats illustrés correspondent à ceux obtenus par la méthode FACS.
Figure imgf000033_0001
Comme le montre la figure 1, toutes les cellules leucémiques CD19+CD23+CD5+ (LLC) expriment un CD5 phosphorylé (lère colonne), alors que les cellules CD5+ (10 % des cellules B) d'un donneur sain restent négatives en PCD5 (2eme colonne) ainsi que les cellules B CD19+CD23-CD5+ provenant d'une autre forme d'hémopathie maligne, le lymphome du manteau ou MCL (3eme colonne).
Les échantillons extraits de patients atteints de lymphocytose monoclonale B (ou MBL) présentent également un taux de CD5+PCD5+ pour trois malades testés, qui peut être corrélé avec le caractère évolutif de cette maladie vers la LLC.
L'anticorps anti-PCD5 permet donc bien de distinguer les leucémies lymphoïdes chroniques d'autres types de maladies lympho-prolifératives, et en particulier des lymphomes du manteau.
Exemple 5 ;
Evaluation de la spécificité d'un anticorps anti-PCD5 pour la forme activée du récepteur CD5, par rapport à la forme inactive, par immunoprécipitation. Objectif de l'étude : mise en évidence par immunoprécipitation de la sélectivité de l'anticorps anti-PCD5 pour la forme activée du récepteur CD5, et comparaison avec un anticorps anti-phosphotyrosine ainsi qu'un anticorps anti-CD5.
A. Matériel & Méthodes
Western Blots
(a) Des cellules B Daudi (2x106) transfectées avec un vecteur vide pNT (voir Gary-Gouy H et al, Blood 2002), ou contenant la séquence entière cDNA du CD5 humain sont stimulées ou non par une solution d'anti-IgM F(ab)'2 de lapin à 2 μg/mL (Jackson Immunosearch, Baltimore, référence 309-006-043)). Les cellules sont ensuite lysées en tampon de lyse à 4 °C pendant 30 mn (20 mM Tris-Hcl, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 U/ml aprotinin, 1 mM PMSF, 1 mM sodium orthovanadate) contenant 1 % de détergent Nonidet™ P-40. Les lysats sont immunoprécipités avec 1 μg d'anticorps monoclonal UCH- T2 anti-CD5 (Santa Cruz) ou d'anticorps monoclonal anti-PCD5 de type IgG3 en présence de billes de protéine G-Sepharose (Sigma-Aldrich®). Les protéines sont séparées par une électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide, électro-transférées sur une membrane de PVDF (Amersham, GE), et hybridées en parallèle par un anti-CD5 UCH-T2 mAb, ou anti-(PY)- phosphotyrosine recombinant 4G10 mAb (Upstate Cell Signaling). La révélétion utilise un anticorps de chèvre anti-souris couplé à la péroxydase (Bio-Rad Laboratories) avec une détection ECL (Amersham).
(b) Le lysat total de cellules B Daudi est extrait comme précédemment et analysé par western blot avec un anticorps anti-PCD5 révélé par un anticorps de chèvre anti-souris couplé à la péroxydase comme précédemment.
B. Résultats
La figure 2 montre que les anticorps anti-PCD5 reconnaissent spécifiquement la forme activée de CD5 : seules les cellules transfectées avec le vecteur CD5 et stimulées par les anti-IgM sont positives, alors que les cellules non activées ne contiennent pas PCD5.
La figure 2 montre en outre que l'anticorps anti-PCD5 de l'invention peut être avantageusement utilisé comme outil pour immunoprécipiter spécifiquement la forme activée du récepteur CD5. Exemple 6 ;
Quantification d'un anticorps monoclonal et polyclonal anti-PCD5 parELISA. Objectif de l'étude : mise en évidence par dosage ELISA de la spécificité in vitro des anticorps de l'invention pour la forme activée de CD5.
A. Matériel & Méthodes
Des dilutions en séries de l'anticorps monoclonal IgG3 anti-PCD5 ont été testées avec les peptides synthétiques sous leur forme phosphorylée et non phosphorylée, tels que décrits dans l'exemple 1, à 100 ng par puits. Après saturation des puits à la BSA et incubation avec les anticorps dilués, la réaction est révélée par un anticorps anti-lapin IgG-HRP ou antisouris IgG-HRP. La réaction est développée par ajout du substrat ABTS SIGMA (Sigma- Aldrich® référence A 3219). Les quantités initiales d'anticorps monoclonal et polyclonal étaient de 10 et 130 μg/mL respectivement.
B. Résultats
Comme le montre la figure 3, les anticorps de l'invention reconnaissent spécifiquement la forme phosphorylée du peptide.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide de formule (I) suivante : NH2-[Nt]y XiX2X3X4DNEY(P03H2)X5X6X7X8X9- [Ct]z -COOH (I) dans lequel :
- y est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- z est un nombre entier consistant en 0 ou 1,
- Nt consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés en longueur,
- Ct consiste en un peptide de 1 à 100 acides aminés en longueur,
- Xi, X2, X3, X4, X5, Χβ, X7, X8 et X9. représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un résidu d'acide aminé.
2. Un anticorps selon la revendication précédente, dans lequel:
- Xi, X4 sont des acides aminés non polaires choisis parmi A, G, V, L, I,
- X2, X5 sont des acides aminés polaires choisis parmi S et T,
- X6 est choisi parmi N et Q,
- X3, X sont des acides aminés basiques choisis parmi H, K et R,
- X7, Xg sont des pralines.
3. Un anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes dirigé contre un peptide ou une protéine comprenant, ou consistant en, la séquence SEQ ID N° 1 phosphorylée sur tyrosine:
- ASHVDNEY(P03H2)SQPPR -
4. Un anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, ne présentant pas de réaction croisée avec :
a) un peptide comprenant, ou consistant, en la forme non-activée du récepteur CD 5,
b) un peptide de séquence SEQ K) N°l,
c) une tyrosine phosphorylée isolée ou faisant partie d'un peptide tel que défini dans a),
5. Un anticorps selon l'une des revendications précédentes combiné de manière covalente ou non covalente à une molécule détectable.
6. Une méthode in vitro de détection de CD5 activé dans un échantillon comprenant les étapes suivantes :
a) mise en contact d'un échantillon à tester avec l'anticorps défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, b) détection ou quantification des complexes formés entre ledit anticorps monoclonal et des cellules exprimant un CD5 activé éventuellement présentes dans ledit échantillon
7. Une méthode in vitro de détermination de la survenue d'une leucémie lymphoïde chronique chez un individu comprenant les étapes suivantes:
a) mise en contact d'un échantillon préalablement collecté chez ledit individu avec l'anticorps défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,
b) détection ou quantification des complexes formés entre ledit anticorps et des cellules exprimant un CD5 activé éventuellement présentes dans ledit échantillon, la détection dudit complexe étant indicative de la survenue d'une leucémie lymphoïde chronique chez ledit individu.
8. Une méthode selon la revendication précédente comprenant une étape de mise en contact de l'échantillon avec au moins un ligand choisi parmi la liste suivante: anti-CD5, anti-CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS, anti chaînes κ ou λ.
9. Une méthode selon l'une des revendications précédentes comprenant en outre une étape de réalisation d'un score de Matutes.
10. Une méthode selon la revendication précédente comprenant l'utilisation d'un kit selon l'une des revendications 15 à 18.
11. Une méthode selon l'une des revendications précédentes comprenant une étape de mise en contact d'un échantillon avec un ou plusieurs ligands additionnels spécifiques d'un type cellulaire particulier susceptibles d'être contenus dans l'échantillon et choisi parmi le groupe suivant : (i) des ligands reconnaissant un marqueur spécifique des lymphocytes B présents chez un individu affecté d'une lymphocytose B monoclonale, (ii) des ligands reconnaissant un marqueur spécifique des lymphocytes Bl (iii) des ligands reconnaissant un marqueur spécifique des lymphocytes B2, (iv) des ligands reconnaissant un marqueur spécifique des lymphocytes T, (v) des ligands reconnaissant un marqueur spécifique des lymphocytes B présents chez un individu affecté d'une LLC, et (vi) des ligands reconnaissant un marqueur spécifique des lymphocytes B présents chez un individu affecté d'une MCL.
12. Une méthode selon l'une des revendications précédentes dans laquelle le score de Matutes de l'échantillon est égal ou inférieur à 3.
13. Une méthode selon l'une des revendications précédentes où l'échantillon est choisi dans le groupe consistant en (i) un échantillon de sang total, (ii) une suspension de cellules mononucléaires périphériques et polymorphonucléaires purifiées à partir d'un échantillon de sang total, (iii) une suspension de cellules mononucléaires du sang périphériques purifiées à partir d'un échantillon total de sang, (iv) une suspension de cellules lymphocytaires T purifiées à partir d'un échantillon total de sang, (v) une suspension de cellules lymphocytaires B purifiées à partir d'un échantillon total de sang.
14. Une méthode selon l'une des revendications précédentes où l'étape de détection est réalisée par une technique choisie parmi le groupe suivant : cytométrie de masse, cytométrie en flux, immunocyto-chimie, immunocyto-fluorescence, immunoprécipitation, western-blot, microscopie électronique, cytométrie de masse, puce à protéines.
15. Un kit de détection de CD 5 activé comprenant :
a) un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, b) un ligand anti-CD5.
16. Un kit de détection de lymphocyte activé selon la revendication précédente comprenant en outre un ou plusieurs ligands choisis parmi le groupe suivant: ligands anti- CD22, anti-CD23, anti-FMC7, anti-IgS, anti chaînes κ ou λ.
17. Un kit selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un ou plusieurs ligands choisis parmi le groupe suivant: anti-CD2, anti-CD19, anti-CD27, anti- CD40, anti-CD80, anti-CD86, anti-CD38, anti-HLA-DR, anti-IgM, anti-phosphotyrosine, anti-phosphoprotéine.
18. Un kit selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un ou plusieurs ligands anti-phosphoprotéine choisis parmi le groupe suivant : P-CD5, P-Lyn, P- p38MAP Kinase, P-STAT3.
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