ES2731663T3 - Detección de CD31 desprendido derivado de plaquetas - Google Patents
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Abstract
Un fragmento de una proteína CD31 de longitud completa, que comprende al menos una parte del sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de dicha proteína CD31 de longitud completa, en donde dicho fragmento no comprende los dominios yuxtamembrana, transmembrana e intracelular de dicha proteína de longitud completa, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos y en donde dicho fragmento comprende un epítopo dentro del sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina unido específicamente por el anticuerpo MBC78.2.
Description
DESCRIPCIÓN
Detección de CD31 desprendido derivado de plaquetas.
Campo de la invención
La presente solicitud describe diversas formas solubles de CD31, incluida una nueva forma que se desprende de las plaquetas activadas y se libera en la circulación. Se describen métodos para detectar dichas formas solubles de CD31, así como métodos para detectar específicamente dicho CD31 desprendido de plaquetas y el uso de dichos métodos como herramienta de diagnóstico.
Antecedentes
CD31, también conocido como PECAM-1, es un receptor inhibidor transmembrana presente en muchos tipos de células hematopoyéticas. Se encuentra en la superficie de plaquetas, monocitos, neutrófilos, células T y B y células endoteliales.
CD31 está compuesto por un dominio extracelular (ECD) que comprende 6 dominios de tipo Ig numerados a partir del más distal de la membrana, un segmento transmembrana y una cola citoplásmica que contiene 2 motivos inhibidores basados en inmunotirosina (ITIM). Los últimos no se fosforilan en condiciones de reposo porque CD31 no posee una actividad de quinasa intrínseca.
Las moléculas CD31 en las células que interactúan se unen entre sí a través de una interacción transhomofílica del dominio 1 de tipo Ig del ECD que desencadena el clúster de la proteína a través de una interacción cis-homofílica de las secuencias yuxtamembranas del ECD, favoreciendo así la fosforilación de los ITIM intracelulares de CD31 por tirosina quinasas transportados por otros receptores de membrana asociados a clústeres.
La unión de moléculas CD31 en células interactuantes desencadena así la fosforilación de los motivos inhibidores de la tirosina intracelular y el reclutamiento y activación de las vías de señalización de las fosfatasas que contienen SH2. Dependiendo de los adaptadores de señalización asociados al receptor de membrana más cercano, esto puede conducir a la activación de cascadas de señalización (por ejemplo, GAB/ERK/MAPK, supervivencia de células endoteliales) o su inhibición (por ejemplo, JAK/STAT, activación de leucocitos y plaquetas).
Las propiedades inmunorreguladoras putativas de CD31 están respaldadas por el hecho de que la señalización de CD31 impulsa la repulsión mutua de los leucocitos de la sangre y modula el equilibrio entre las señales inhibitorias y estimulantes de las células inmunes tanto innatas como adaptativas.
Se ha informado que una forma soluble de CD31 (forma de 'variante de empalme' de CD31), producida a partir de un transcrito variante que carece del segmento transmembrana, está presente en el plasma humano y se cree que se deriva de células endoteliales (Goldberger et al., 1994; J Biol Chem 269, 17183-17191). Los CD31 solubles que comprenden los primeros dominios ECD tipo Ig pueden inmunodetectarse en fluidos corporales mediante kits disponibles comercialmente. Sin embargo, los estudios que intentaron encontrar una correlación entre los niveles plasmáticos de CD31 soluble y el riesgo de aterotrombosis u otras enfermedades autoinmunes dieron resultados contradictorios, ya que los datos mostraron una amplia gama de valores de CD31 en plasma, independientemente de los polimorfismos genéticos específicos analizados.
Una parte de este rompecabezas se resolvió mediante la identificación previa de los inventores de una forma soluble adicional de CD31 derivada de una porción de CD31 escindida y desprendida por linfocitos activados, como se describe en el documento PCT/EP2009/058220 (documento WO2010/000756). Durante mucho tiempo se observó que CD31 se “pierde” en ciertos linfocitos circulantes y en la activación de los linfocitos y la supuesta ausencia de linfocitos CD31 aumentó en los sujetos que padecían aterotrombosis. Los inventores encontraron que la supuesta pérdida de CD31 en los linfocitos T activados/de memoria es en realidad incompleta y resulta de la escisión y el desprendimiento de CD31 entre los dominios extracelulares de tipo Ig del 5° al 6°. La porción de dominio extracelular desprendida de CD31 (denominado “CD31 desprendido derivado de linfocitos”) se libera en los fluidos corporales y se puede detectar en la circulación, donde está presente junto con la forma de variante de empalme soluble de CD31. Además, mostraron que, después de que los síntomas clínicos desaparecieran, el alto riesgo de aterotrombosis recurrente se relaciona con el aumento específico del CD31 desprendido derivado de los linfocitos y la disminución recíproca de la variante de empalme CD31 en la circulación. Esto proporcionó una posible explicación de por qué la inmunodetección del CD31 circulante total (que comprende el CD31 desprendido derivado de linfocitos y la variante de empalme) mediante kits disponibles en comercios no tenía valor diagnóstico.
Fornasa et al. (2010, Journal of Immunology, Vol. 184: 5485-5492) también describen que un CD31 extracelular de células T que comprende dominios de tipo Ig 1 a 5 se escinde y se desprende de la superficie de células T humanas tras la activación a través de su CTR.
Este hallazgo creó la oportunidad de establecer herramientas de diagnóstico que podrían distinguir las diferentes formas de CD31 soluble. Pruebas anteriores disponibles comercialmente detectaron CD31 plasmático mediante el uso de anticuerpos dirigidos a los dominios 1 a 5 de CD31, por lo que no se pudo discriminar entre la variante de
empalme soluble de CD31 (que contiene todos los 6 dominios extracelulares de tipo Ig) y la forma de CD31 desprendida derivada de linfocitos (que contiene los dominios 1 a 5 solamente). El método desarrollado por los inventores y descrito en el documento WO2010/000756 permitió la detección simultánea del quinto y del sexto dominio de tipo Ig en CD31 soluble capturado del primer dominio de tipo Ig. Este método permitió que la forma desprendida derivada de linfocitos (que consiste en los primeros 5 dominios ECD y carece del sexto dominio de tipo Ig) se cuantifique y distinga con precisión de las formas CD31 que comprenden el sexto dominio de tipo Ig (como la variante de empalme descrita).
Este hallazgo también explicó la ausencia de señalización de CD31 en los linfocitos que han desprendido CD31. La señalización de CD31 se suprime por la escisión y el desprendimiento de los primeros 5 dominios de tipo Ig del ECD. Debido a la pérdida de los dominios 1-2 de tipo “adhesivo” de Ig, el CD31 truncado no se puede unir por la membrana anclada o las formas variantes de empalme soluble de CD31, por lo que la señalización de CD31 está ausente en las células que llevan la molécula de CD31 truncada. Esta ausencia de señalización de CD31 favorece la activación de los leucocitos y conduce a patologías relacionadas con la inflamación crónica del tejido. Por lo tanto, la medida de la forma de CD31 desprendida derivada de linfocitos podría reflejar el riesgo individual de procesos patológicos inflamatorios y trombóticos.
Descripción de la invención
Los inventores ahora han identificado una forma adicional de CD31 desprendida derivada de plaquetas. Han demostrado que las plaquetas activadas escinden el CD31 extracelular entre el sexto dominio extracelular de tipo Ig y la membrana plasmática, produciendo una forma desprendida que puede ser reconocida por anticuerpos contra el sexto dominio de tipo Ig, a diferencia de la forma desprendida por los linfocitos que carecen del sexto dominio de tipo Ig. Tras la agregación plaquetaria, el dominio extracelular de CD31 desprendido derivado de plaquetas (también denominado “ectodominio desprendido derivado de plaquetas” o “CD31 desprendido derivado de plaquetas”) se libera en la circulación, donde está presente junto con el CD31 desprendido derivado de linfocitos y la variante de empalme soluble de CD31.
CD31 está presente constitutivamente también en las plaquetas, donde esencialmente funciona como una molécula reguladora. De hecho, además de la inflamación, la señalización defectuosa de CD31 también promueve la activación y agregación plaquetaria y la trombosis. El hallazgo de los inventores de que CD31 de plaquetas también sufre escisión y desprendimiento tras la activación y agregación plaquetaria tiene, por lo tanto, una importancia clínica significativa.
La activación y agregación patológica de las plaquetas es responsable de la oclusión trombótica aguda de las arterias de tamaño pequeño y mediano, y las plaquetas son una fuente muy rica de mediadores inflamatorios, lo que contribuye a la amplificación y diseminación de enfermedades inflamatorias crónicas como las enfermedades ateroscleróticas y las enfermedades autoinmunes. La capacidad de discriminar entre CD31 soluble de origen linfocítico, endotelial y plaquetario permitirá, por lo tanto, seleccionar tratamientos más apropiados para estas condiciones en pacientes individuales, gracias a una comprensión más completa de los eventos celulares patológicos que subyacen en las manifestaciones clínicas de una enfermedad determinada.
La presente invención es como se define en las reivindicaciones.
La solicitud, por lo tanto, describe un fragmento de una proteína CD31 de longitud completa, comprendiendo dicho fragmento al menos una parte del sexto dominio extracelular de tipo Ig de dicha proteína CD31 de longitud completa, en donde dicho fragmento no comprende el dominio intracelular de dicha proteína de longitud completa. Dicho fragmento descrito contiene preferiblemente al menos un epítopo dentro del sexto dominio de tipo Ig. Por lo tanto, dicho fragmento puede estar unido específicamente por un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo dentro del sexto dominio de tipo Ig. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, dicho fragmento no comprende los dominios yuxtamembrana y/o transmembrana de dicha proteína CD31 de longitud completa. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, dicho fragmento tampoco comprende la secuencia de señal. En realizaciones preferidas descritas en el presente documento, dicho fragmento comprende o consiste en dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina 1 a 6 de dicha proteína CD31 de longitud completa.
Preferiblemente, dicha proteína CD31 de longitud completa descrita en el presente documento tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Por lo tanto, la solicitud describe un fragmento como se describió anteriormente, en donde
(i) dicho sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina es o corresponde a los aminoácidos 494-591 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 1;
(ii) dicho dominio yuxtamembrana es o corresponde a los aminoácidos 592-601 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 1;
(iii) dicho dominio transmembrana es o corresponde a los aminoácidos 602-620 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y/o
(iv) dicho dominio intracelular es o corresponde a los aminoácidos 621-738 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
También se describen proteínas aisladas que comprenden o consisten en los fragmentos de CD31 descritos en el presente documento.
Toda referencia a “que comprende” en el presente documento también debe entenderse como que incluye “que consiste en”.
También se describen métodos de detección de agregación plaquetaria en un sujeto, comprendiendo dicho método la detección de un ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas, por ejemplo. un fragmento de proteína CD31 como se describió anteriormente, en una muestra biológica de un sujeto.
También se describen métodos de diagnóstico, incluido el diagnóstico de trombosis, como trombosis en curso y afecciones inflamatorias, que comprenden la detección de un ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas, por ejemplo, un fragmento de proteína CD31 como se describió anteriormente, en una muestra biológica de un sujeto. Los métodos de diagnóstico de ejemplo se describen en la presente.
Una muestra biológica puede corresponder, por ejemplo, a plasma, sangre u orina. La muestra biológica corresponde preferiblemente al plasma. Más preferiblemente, la muestra biológica se obtiene de un individuo que sufre o tiene riesgo de padecer un trastorno trombótico o autoinmune.
El hallazgo de los inventores ahora hace posible distinguir las diferentes formas de CD31 soluble. En particular, ahora es posible distinguir la forma derivada de las plaquetas de la variante de empalme, ya que ambas comprenden un epítopo del sexto dominio de tipo Ig, pero el dominio intracelular solo está presente en la variante de empalme. Este es un avance significativo con respecto a los métodos conocidos previamente, ya que las formas eliminadas conocidas de CD31 no estaban unidas por anticuerpos al sexto dominio de tipo Ig.
Por lo tanto, la solicitud describe, además, métodos para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 en una muestra biológica, por ejemplo, un fragmento de proteína CD31 como se describió anteriormente, entre formas solubles de CD31, en donde dichas formas solubles incluyen una variante de empalme soluble de dicha proteína CD31, cuyos métodos comprenden las etapas de:
a) proporcionar un primer anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, cuyo anticuerpo está opcionalmente marcado con una marca detectable;
b) proporcionar un segundo anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, anticuerpo que está opcionalmente marcado con una marca detectable;
c) opcionalmente, proporcionar un ligando de detección marcado que se une específicamente a una región que está presente tanto en dicho ectodominio desprendido como en dicha variante de empalme;
d) medir la señal obtenida de dicha marca detectable, opcionalmente mediante citometría de flujo;
en donde dicho ligando de detección, cuando está presente, se une a una región dentro del 1°, 2°, 3°, 4°, 5° o 6° dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31;
en donde dicho primer anticuerpo discriminante se une al sexto dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31; y en donde dicho segundo anticuerpo discriminante se une al dominio intracelular de dicho CD31.
También se describen métodos para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 en una muestra biológica, por ejemplo, un fragmento de proteína CD31 como se describió con anterioridad, opcionalmente entre formas solubles de CD31, en donde dichas formas solubles incluyen una variante de empalme soluble de dicha proteína CD31 y, opcionalmente, ectodominios desprendidos adicionales, cuyos métodos comprenden las etapas de:
a) proporcionar un anticuerpo de captura opcionalmente inmovilizado en un soporte sólido, en donde dicho anticuerpo de captura se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente tanto en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas como en dicha variante de empalme;
b) proporcionar un primer anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, cuyo anticuerpo está opcionalmente marcado con una marca detectable;
c) proporcionar un segundo anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de
plaquetas, anticuerpo que está opcionalmente marcado con una marca detectable;
d) opcionalmente, proporcionar un ligando de detección marcado que se une específicamente a una región que está presente tanto en dicho ectodominio desprendido como en dicha variante de empalme; poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica que probablemente contenga dichas formas solubles de dicha proteína transmembrana;
e) medir la señal obtenida de dicha marca detectable, opcionalmente mediante citometría de flujo;
en donde dicho anticuerpo de captura y dicho ligando de detección, cuando están presentes, se unen a una región dentro del 1°, 2°, 3°, 4°, 5° o 6° dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31;
y en donde dicho primer anticuerpo discriminante se une al dominio intracelular de dicho CD31.
La solicitud también describe un método para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 como se describe en el presente documento, un ectodominio desprendido derivado de linfocitos de una proteína CD31 y una variante de empalme soluble de dicha proteína CD31 en una muestra biológica, método que comprende:
a) proporcionar un anticuerpo de captura opcionalmente inmovilizado en un soporte sólido, en donde dicho anticuerpo de captura se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos y en dicha variante de empalme;
b) proporcionar un primer anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos;
c) proporcionar un segundo anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y de dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos;
d) proporcionar un tercer anticuerpo discriminante se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos y en dicha variante de empalme; en donde dichos anticuerpos discriminantes están marcados con una marca detectable, opcionalmente una marca fluorescente;
e) poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica que probablemente contenga dichas formas solubles de dicha proteína transmembrana;
f) medir la señal obtenida de la marca asociada con cada anticuerpo discriminante, opcionalmente mediante citometría de flujo; y
g) comparar la señal obtenida para cada anticuerpo discriminante;
en donde el anticuerpo de captura y el tercer anticuerpo discriminante se unen dentro de la región definida por los dominios extracelulares 1°, 2°, 3°, 4° y 5° de dicho CD31, el primer anticuerpo discriminante se une dentro del 6° dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31 y el segundo anticuerpo discriminante se une al dominio intracelular de dicho CD31.
Además, se describe un método para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 como se describe en el presente documento, un ectodominio desprendido derivado de linfocitos de una proteína CD31 y una variante de empalme soluble de dicha proteína CD31 en una muestra biológica, método que comprende:
a) proporcionar un primer soporte unido a un primer anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos, en ectodominios desprendidos derivados de plaquetas, y en dicha variante de empalme,
b) proporcionar un segundo soporte unido a un segundo anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de los linfocitos;
c) proporcionar un tercer soporte unido a un tercer anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región presente en dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicho ectodominio desprendido derivado de los linfocitos;
en donde todos los anticuerpos mencionados están marcados con una marca detectable, opcionalmente una marca fluorescente;
d) poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica;
e) para cada soporte, medir la señal obtenida con dicha marca, opcionalmente mediante citometría de flujo; y opcionalmente
f) comparar la señal obtenida para cada soporte;
en donde dicho primer anticuerpo se une dentro de la región definida por los dominios extracelulares 1°, 2°, 3°, 4° y 5° de dicho CD31;
y en donde dicho segundo anticuerpo se une al sexto dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31;
y en donde dicho tercer anticuerpo se une al dominio intracelular.
Dicho soporte puede ser una perla, por ejemplo, una perla citométrica.
También se describe un método para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 como se describe en el presente documento, un ectodominio desprendido derivado de linfocitos de una proteína CD31 y una variante de empalme soluble de dicha proteína CD31 en una muestra biológica, método que comprende:
a) proporcionar un primer soporte vinculado a un primer anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos, en ectodominios desprendidos derivados de plaquetas, y en dicha variante de empalme,
b) proporcionar un segundo soporte unido a un segundo anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de los linfocitos;
c) proporcionar un tercer soporte unido a un tercer anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región presente en dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos;
d) opcionalmente, proporcionar un ligando de detección marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos, en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, y en dicha variante de empalme;
en donde en realizaciones en las que no se usa un ligando de detección, dichos anticuerpos primero, segundo y tercero están marcados con una marca detectable;
e) poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica;
f) para cada soporte, medir la señal obtenida con dicha marca mediante citometría de flujo; y opcionalmente
g) comparar la señal obtenida para cada soporte;
en donde dicho primer anticuerpo y dicho ligando de detección se unen dentro de la región definida por los dominios extracelulares 1°, 2°, 3°, 4° y 5° de dicho CD31;
y en donde dicho segundo anticuerpo se une al sexto dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31;
y en donde dicho tercer anticuerpo se une al dominio intracelular.
Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender, además, la etapa de calcular el porcentaje y/o la cantidad de formas solubles totales que corresponden a ectodominio desprendido derivado de plaquetas, y/o la etapa de calcular la relación de ectodominio desprendido derivado de plaquetas a formas solubles, y/o la etapa de calcular el porcentaje y/o la cantidad de variante de empalme que corresponde al ectodominio desprendido derivado de plaquetas, y/o la etapa de calcular la relación de ectodominio desprendido derivado de las plaquetas a la variante de empalme, y/o la etapa de calcular el porcentaje y/o la cantidad de formas solubles totales que corresponde al total de ectodominios desprendidos (derivados de plaquetas y linfocitos), y/o la etapa de calcular la relación de ectodominios desprendidos totales a dichas formas solubles, y/o la etapa de calcular el porcentaje y/o la cantidad de formas solubles totales que corresponde a dicha variante de empalme, y/o la etapa de calcular la relación de variante de empalme a formas solubles.
También se describe un método para monitorear la respuesta de un paciente a un fármaco, que comprende las etapas de:
a) detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas, tal como un CD31 como se define aquí de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en una muestra biológica de dicho paciente antes y después del inicio de un tratamiento de dicho paciente con dicho fármaco;
b) comparar los niveles de dicho ectodominio detectado en la etapa (a); y, opcionalmente,
c) correlacionar una diferencia en los niveles de dicho ectodominio desprendido derivado de las plaquetas con la efectividad del fármaco para tratar a dicho paciente.
También se describe un kit de diagnóstico que comprende:
a) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos, en ectodominios desprendidos derivados de plaquetas, y en dicha variante de empalme,
b) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos;
c) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región presente en dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos.
También se describe un kit de diagnóstico que comprende:
a) una perla unida a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el 1°, 2°, 3°, 4° o 5° dominio extracelular de tipo Ig de CD31;
b) un primer anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31; y
c) un segundo anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el 1°, 2°, 3°, 4° o 5° dominio extracelular de tipo Ig de CD31;
d) un tercer anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el dominio intracelular o el dominio yuxtamembrana de dicho CD3l.
CD31 (PECAM-1)
El CD31 de longitud completa consiste en una molécula de cadena única que comprende 6 dominios extracelulares similares a Ig, un segmento transmembrana corto y una cola citoplásmica que contiene dos motivos inhibidores basados en Inmunotirosina (ITIM). La secuencia de CD31 humano de longitud completa se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO.: 1). La estructura de CD31 se muestra en la Tabla 1 de abajo.
Tabla 1: Estructura del dominio de CD31 humano
La referencia en el presente documento a los diversos dominios de CD31 puede referirse a las ubicaciones de dominio como se definió anteriormente o dichas ubicaciones /-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos.
La preferentemente en el presente documento a “al menos una parte del sexto dominio de tipo Ig puede ser todo o una parte del sexto dominio de tipo Ig que comienza en el residuo 494 y termina en el residuo 591, 590, 589, 588, 587, 586, 585, 584, 583, 582, 581, 580, 579, 578, 577, 576, 575, 574, 573, 572, 571, 570, 569, 568, 567, 566, 565, 564, 563, 562, 561, 560, 559, 558, 557, 556, 555, 554, 553, 552, 551, 550, 549, 548, 547, 546, 545, 544, 543, 542, 541, 540, 539, 538, 537, 536, 535, 534, 533, 532, 531, 530, 529, 528, 527, 526, 525, 524, 523, 522, 521, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 501, 500, 499, 498,497, 496 o 495 de CD31 humano, como se menciona en la Tabla 1. Por ejemplo, la proteína descrita en el presente documento puede comprender una parte del sexto dominio de tipo Ig que comprende al menos la secuencia de aminoácidos que comienza en el residuo 494 y termina en el residuo 590, 589, 588, 587, 586, 585, 584, 583, 582, 581, 580, 579, 578, 577, 576, 575, 574, 573, 572, 571, 570, 569, 568, 567, 566, 565, 564, 563, 562, 561, 560, 559, 558, 557, 556, 554, 553, 552, 551, 550, 549, 548, 547, 546, 545, 544, 543, 542, 541, 540, 539, 538, 537, 536, 535, 534, 533, 532, 531, 530, 529, 528, 527, 526, 525, 524, 523, 522, 521, 520, 519, 518, 517, 516, 515, 514, 513, 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, 505, 504, 503, 502, 501, 500, 499, 498, 497, 496 o 495 de CD31 humano.
Como se usa en el presente documento, el término “CD31” se refiere a la molécula también denominada antígeno CD31 o PECAM-1. La proteína puede ser de cualquier origen, preferiblemente de origen mamífero, y lo más preferiblemente de origen humano. En humanos, el gen que codifica CD31 se encuentra en el locus 17q23. La secuencia de longitud completa de CD31 humano se muestra en la Figura 2 y en la SEQ ID NO: 1.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “ectodominio desprendido derivado de plaquetas”, “CD31 desprendido derivado de plaquetas”, “forma desprendida derivada de plaquetas”, “CD31 desprendido derivado de plaquetas”, “CD31 soluble derivado de plaquetas” y “forma soluble derivada de plaquetas”, y similares se refieren a una molécula de CD31 que comprende los dominios 1 a 5 de tipo Ig y la totalidad o parte del dominio 6 de tipo Ig, pero no comprende el dominio intracelular, como se describió anteriormente. Esta molécula se escinde de plaquetas activadas.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “ectodominio desprendido derivado de linfocitos”, “CD31 desprendido derivado de linfocitos”, “forma desprendida derivada de linfocitos”, “CD31 desprendido derivado de linfocitos”, “CD31 soluble derivado de linfocitos” y “forma soluble derivada de linfocitos”, y similares se refieren a una molécula de CD31 que comprende los dominios 1,2, 3, 4 y 5 de tipo Ig, pero no comprende el dominio 6 de tipo Ig o los dominios yuxtamembrana, transmembrana o intracelular, como se describe en el documento PCT/EP2009/058220 (documento WO 2010/000756). Esta molécula se escinde de los linfocitos T activados.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “variante de empalme soluble”, “variante de empalme”, “variante de empalme de CD31” y similares se refieren a una molécula de CD31 que no comprende el dominio transmembrana, como se describe en Goldberger et al. (1994); J Biol Chem 269, 17183-17191. Dicha molécula comprende el dominio intracelular y todos o la mayoría de los dominios de tipo Ig 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esta molécula se secreta a partir de células endoteliales.
La secuencia de CD31 de tipo salvaje humano se muestra como SEQ ID NO.: 1. Sin embargo, la solicitud también describe variantes alélicas de la misma, y los homólogos de la misma en otras especies.
Las proteínas variantes pueden ser variantes naturales, como variantes de empalme, alelos e isoformas, o pueden producirse por medios recombinantes. Las variaciones en la secuencia de aminoácidos pueden introducirse mediante sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína que produce un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Opcionalmente, la variación es por sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos con cualquier otro aminoácido en la proteína. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas. Preferiblemente, las sustituciones son sustituciones conservativas, en las que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido con propiedades químicas y/o estructurales similares. Adicional o alternativamente, la variación puede ser por adición o eliminación de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos dentro de la proteína.
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas. Preferiblemente, las sustituciones son sustituciones conservativas, en las que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido con propiedades químicas y/o estructurales similares. Las sustituciones conservativas de ejemplo se enumeran a continuación.
Ala (A) val; leu; ile
Arg (R) lys; gin; asn
Asn (N) gin; his; lys
Asp (D) glu
Cys (C) ser
Gin (Q) asn
Glu (E) asp
Gly (G) pro; ala
His (H) asn; Gin; lys; arg
He (I) leu; val; met; ala
norleucina leu
Leu (L) norleucina; ile; met; ala; phe
Lys (K) arg; Gin; asn
Met (M) leu; phe; ile
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr
Pro (P) ala
Ser (S) thr
Thr (T) ser
Trp (W) tyr; phe
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina
Las proteínas variantes pueden incluir proteínas que tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia polipeptídica descrita en el presente documento. Preferiblemente, una proteína variante tendrá al menos aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptido de longitud completa o un fragmento de una secuencia polipeptídica como se describe en el presente documento. La identidad de la secuencia de aminoácidos se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia variante que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar las sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. La identidad de la secuencia se puede determinar sobre la longitud total de la secuencia variante, la longitud total de la secuencia de referencia o ambas. Las secuencias de ácidos nucleicos variantes pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos descrita en el presente documento. Preferiblemente, una secuencia de ácidos nucleicos variante tendrá al menos aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa o un fragmento de una secuencia de ácidos nucleicos como se describe en el presente documento. La identidad de secuencia de ácidos nucleicos se define como el porcentaje de ácidos nucleicos en la secuencia variante que son idénticos a los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerando cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La identidad de la secuencia se puede determinar sobre la longitud total de la secuencia variante, la longitud total de la secuencia de referencia o ambas.
Los métodos para el alineamiento de secuencias y la determinación de la identidad de secuencias son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el uso de programas informáticos disponibles públicamente como BioPerl, BLAST, BLAST-2, CS-BLAST, FASTA, ALIGN, ALIGN-2, LALIGN, Jaligner, matcher o el software Megalign (DNASTAR) y los algoritmos de alineación, como los algoritmos Needleman-Wunsch y Smith-Waterman.
Por ejemplo, el porcentaje de identidad se puede calcular realizando una alineación global por pares basada en el algoritmo de alineación Needleman-Wunsch para encontrar la alineación óptima (incluidas las brechas) de dos secuencias a lo largo de toda su longitud, por ejemplo, usando Needle y usando la matriz BLOSUM62 (para secuencias de aminoácidos) o la matriz de DNAfull (para secuencias de ácidos nucleicos) con una penalización de apertura de brecha de 10 y una penalización de extensión de brecha de 0,5.
También se incluyen fragmentos de proteínas y proteínas variantes descritas en el presente documento. Dichos fragmentos pueden truncarse en el término N o en el término C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad enzimática. Preferiblemente, dichos fragmentos tienen al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más aminoácidos de longitud, y/o no más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 aminoácidos de longitud
También se incluyen fragmentos de las secuencias de ácidos nucleicos y variantes descritas en el presente documento. Dichos fragmentos pueden truncarse en el extremo 3' o 5', o pueden carecer de bases internas, por ejemplo, cuando se comparan con una secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa. Preferiblemente, dichos fragmentos tienen al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 o más bases de longitud, y/o no más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 bases de longitud.
El término “fragmento” de una secuencia de referencia se refiere a una cadena de nucleótidos o aminoácidos contiguos que es más corta que la secuencia de referencia. Los fragmentos de CD31 pueden tener una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más aminoácidos y/o no más de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 aminoácidos Anticuerpos
Los métodos descritos usan anticuerpos que se unen a las diversas formas de CD31, como se describió anteriormente. El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada.
La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones naturales, que pueden estar presentes en cantidades menores. Por lo tanto, el modificador 'monoclonal' indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos. En determinadas realizaciones, tal anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a un objetivo, en donde la secuencia polipeptídica de unión a la diana se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana de una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que una secuencia de unión a la diana seleccionada puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a la diana alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. Contrariamente a las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra distintos determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas porque típicamente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas.
A menos que se indique lo contrario, la expresión 'anticuerpo multivalente' denota un anticuerpo que comprende tres o más sitios de unión a antígeno. En determinada realización, el anticuerpo multivalente está diseñado para tener los tres o más sitios de unión al antígeno y, en general, no es un anticuerpo de IgM o IgA de secuencia nativa.
Los 'fragmentos de anticuerpo' comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
'Fv' es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En una realización, una especie Fv de dos cadenas consiste en un dímero de un dominio variable pesado y uno de cadena liviana en asociación estrecha, no covalente. En una especie Fv de una sola cadena (scFv), un dominio variable de cadena liviana y de cadena liviana se pueden unir covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible, de modo que las cadenas liviana y pesada se puedan asociar en una estructura “dimérica” análoga a la de una especie Fv de cadena doble. Es en esta configuración que los tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL.
En conjunto, las seis HVR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad más baja que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y liviana y también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CHI) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio CHI de cadena pesada, que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en la que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
La expresión “región hipervariable”, “HVR” o “HV”, cuando se usa aquí, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). En los anticuerpos nativos, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3, en particular, desempeña un papel único al conferir especificidad fina a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al, Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Fluman Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélidos naturales que consisten solo en una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de una cadena liviana. Véase, por ejemplo, Flamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).
Los residuos 'marco' o 'FR' son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos HVR como se definen aquí.
La expresión “región Fc” en el presente documento se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluidas las regiones Fc de secuencia nativa y las regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana generalmente se define para extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el término carboxilo del mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración EU) de la región Fc se puede eliminar, por ejemplo, durante la producción o la purificación del anticuerpo, o mediante ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos de K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 eliminados, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
Una “región Fc funcional” posee una “función efectora” de una región Fc de secuencia nativa. Las “funciones efectoras” de ejemplo incluyen la unión a Clq; CDC; unión al receptor Fc; ADCC; fagocitosis; regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede evaluar utilizando varios ensayos como se describe, por ejemplo, en las definiciones de este documento.
Una “región Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgGI humana de secuencia nativa (alotipos no A y A); secuencia Fc de lgG2 humana de secuencia nativa; secuencia Fc de lgG3 humana de secuencia nativa; y la región Fc de lgG4 humana de secuencia nativa, así como sus variantes naturales.
Una “región Fc variante” comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una o más sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y, con preferencia, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido original. La región Fc variante en el presente documento tendrá, con preferencia, al menos aproximadamente el 80% de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido original, y, con máxima preferencia, al menos aproximadamente el 90% de homología con la misma, con mayor preferencia, al menos aproximadamente el 95% de homología con la misma.
'Receptor de Fc' o 'FcR' describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo
Un anticuerpo que “se une específicamente” a una proteína diana se une a dicha proteína diana con mayor afinidad y/o avidez que a otras proteínas o epítopos, incluso proteínas o epítopos estrechamente relacionados. Preferiblemente, un anticuerpo que se une específicamente a una forma de CD31 soluble específica como se describe en el presente documento, se une a dicha forma con mayor afinidad y/o avidez que se une a otras formas de CD31 solubles. Más preferiblemente, un anticuerpo que se une específicamente a una forma de CD31 soluble específica como se describe en el presente documento no se une a otras formas de CD31 solubles.
Típicamente, el anticuerpo se une a su proteína objetivo con una afinidad correspondiente a K0 de aproximadamente 10”7 M o menos, tal como aproximadamente 10'8 M o menos, tal como aproximadamente 10”9 M o menos,
aproximadamente 10'10 M o menos, o aproximadamente 10”11 M o incluso menos cuando esté determinada por la tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) en un instrumento BIAcore 3000 utilizando CD38 recombinante como ligando y el anticuerpo como analito. El anticuerpo puede unirse al objetivo con una afinidad correspondiente a K0 que es al menos diez veces menor, tal como al menos 100 veces menor, por ejemplo, al menos 1.000 veces menor, tal como al menos 10.000 veces menor, por ejemplo, al menos 100.000 veces menor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, otras formas solubles de CD31, BSA, caseína). La cantidad con la que la afinidad es menor depende de K0 del anticuerpo, de modo que cuando K0 del anticuerpo es muy baja (que, es decir, el anticuerpo es altamente específico), entonces la cantidad con la cual la afinidad por el antígeno es menor que la afinidad por un antígeno no específico puede ser de al menos 10.000 veces.
Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan indistintamente en el presente documento con la expresión “un péptido de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno”. Del mismo modo, las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan indistintamente en el presente documento con la expresión “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.
El término “kd” (seg”1), como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad de equilibrio de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno. Dicho valor también se conoce como el valor koff.
El término “ka” (M”1 x seg”1), como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de velocidad de equilibrio de la asociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno.
El término “K0” (M), como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno.
El término “Ka” (M”1), como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de equilibrio de asociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno y se obtiene dividiendo ka por kd.
Por “ligando” se entiende un ligando natural, un anticuerpo o un aptámero. El ligando es preferiblemente un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente tanto en el ectodominio desprendido como en la variante de empalme.
Un anticuerpo, en particular un anticuerpo de detección, o un ligando de detección puede estar marcado. Preferiblemente, la marca es una marca detectable, tal como una marca fluorescente. Las marcas fluorescentes conocidas en la técnica incluyen FITC (FL1), PE (FL2), fluoróforos para uso en el láser azul (por ejemplo, PerCP, PE-Cy7, PE-Cy5, FL3 y APC o Cy5, FL4), fluoróforos para uso en el láser rojo, violeta o uv (por ejemplo, azul del Pacífico, naranja del Pacífico). Los métodos optimizados incluyen diferentes espectros de emisión para las perlas y los anticuerpos de detección. El anticuerpo está preferiblemente marcado en forma directa. Sin embargo, también puede estar marcado indirectamente, en especial cuando el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo o ligando, en particular un anticuerpo de captura, puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados para su uso en el método de la invención son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. No se pretende que la presente invención se limite a ningún tipo particular de material de soporte sólido o configuración.
Los soportes sólidos pueden ser planos o planares, o pueden tener conformaciones sustancialmente diferentes. Por ejemplo, el soporte sólido puede existir como partículas, perlas, cadenas, precipitados, geles, sol-geles, láminas, tubos, esferas, contenedores, columnas, capilares, almohadillas, rodajas, películas, placas, varillas, diapositivas, etc. Por ejemplo, podrían utilizarse microplacas, en particular microplacas de poliestireno, como las vendidas por Nunc, Dinamarca. Las partículas sólidas o perlas, perlas magnéticas o paramagnéticas o partículas tales como las producidas por Dynal, Merck-Eurolab (Francia) (bajo la marca comercial Estapor™) y Polymer Laboratories, son particularmente preferidas. Las partículas magnéticas se describen, por ejemplo, en la patente U. S. N° 4.672.040, y están disponibles comercialmente, por ejemplo, en PerSeptive Biosystems, Inc. (Framingham MA), Ciba Corning (Medfield MA), Bangs Laboratories (Carmel IN) y BioQuest, Inc. (Atkinson NH). También se puede usar agarosa u otras perlas de tipo gel, tales como perlas activadas con Pierce CDI. También se pueden usar tubos de ensayo de poliestireno o polipropileno, vidrio, plástico o chips de silicona, etc. Una perla preferida es una perla citométrica para uso en citometría de flujo. En el método de acuerdo con la invención, diferentes tipos de perlas se refieren a perlas distinguibles entre sí. Dichas perlas pueden corresponder, por ejemplo, a BD™ Cytometric Beads comercializadas por BD Biosciences (San José, California). Las perlas son bien conocidas en la técnica.
Los materiales de soporte sólidos a modo de ejemplo incluyen vidrios u otras cerámicas, plásticos, polímeros, metales, metaloides, aleaciones, compuestos, sustancias orgánicas. El soporte sólido se elige para maximizar las relaciones de señal a ruido, principalmente para minimizar la unión del fondo, para facilitar el lavado y el costo. Además, ciertos soportes sólidos, como las perlas, se pueden usar fácilmente en sistemas convencionales de manejo de fluidos, como las placas de micropocillos. La separación de materiales que puede lograrse con tales sistemas convencionales de manejo de fluidos se puede usar para construir arreglos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, para proporcionar perlas que comprenden diferentes polipéptidos que no contienen
aminoácidos naturales, o contacto con diferentes reactivos, o ambos.
Por lo tanto, la solicitud describe un método para detectar un ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas entre formas solubles de CD31 en una muestra biológica en la que se usan al menos dos anticuerpos discriminantes, dominio de CD31, uno que se une específicamente a un epítopo localizado en el dominio intracelular de CD31 y otro específicamente se une a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31. También se puede usar un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en cualquiera de los primeros cinco dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina (dominios 1,2, 3, 4 y 5) de CD31, ya sea como un anticuerpo de captura o discriminante. La unión del ligando de captura o señalización a todas las formas solubles puede unirse, por ejemplo, específicamente al primero y/o segundo dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31. El ligando de captura o señalización es preferiblemente un anticuerpo de captura o señalización, que puede unirse, por ejemplo, específicamente a un epítopo localizado en el primero y/o segundo dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31.
Dichos anticuerpos son bien conocidos en la técnica y pueden corresponder, por ejemplo, a cualquiera de los anticuerpos enumerados en la Base de datos de anticuerpos HLDA (ver la página de Internet 99.mhhannover.de/aktuelles/projekte/hlda7/hldabaseyCD31.htm).
Como se usa en el presente documento, la expresión “epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31” se refiere a un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 494 a 591 de la SEQ ID NO: 1, es decir, dentro del sexto dominio extracelular de CD31 de tipo de inmunoglobulina (aminoácidos 494 a 591 de la SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones descritas, dicho término también puede abarcar epítopos localizados dentro de la región de la yuxtamembrana (aminoácidos 592 a 601 de la SEQ ID NO: 1). Preferiblemente, dichos epítopos descritos en el presente documento están localizados dentro de los aminoácidos 499 a 591, 524 a 601 o 524 a 538 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones descritas, el anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31 corresponde al anticuerpo PEcAm 1.2 (Invitrogen, San Diego, California), al anticuerpo PECAM1.1 o al anticuerpo HC1/6 (Serotec, Kidlington, RU, o MBC78.2 (dirigido contra el dominio 6 de CD31 humano), y/o el “epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31” puede corresponder al epítopo unido por cualquiera de estos anticuerpos. El anticuerpo PECAM 1.2 se ha descrito, por ejemplo, en Yan et al. (Cell Adhes Commun 3:45-66). La unión positiva de CD31 soluble será detectada por otros cuatro anticuerpos monoclonales anti-CD31, acoplados a FITC, PE, PerCP-Cy5.5 y BD Horizon® V450.
Como se usa en el presente documento, la expresión “epítopo localizado en cualquiera de los primeros cinco dominios extracelulares de CD31 de tipo inmunoglobulina” se refiere a un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 28 a 493 de la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente dentro de los aminoácidos 34 a 493 de la SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas de acuerdo con la invención, dicho epítopo está localizado en el quinto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31, o en el primero y/o segundo dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31.
Como se usa en el presente documento, la expresión “epítopo localizado en el quinto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31” se refiere a un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 424 a 493 de la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, dichos epítopos están ubicados dentro de los aminoácidos 448 a 470 de la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en el quinto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31 es el anticuerpo MEM-05 (Exbio Praha, República Checa) o el anticuerpo MBC78.1.
Como se usa en el presente documento, la expresión “epítopo localizado en el primero y/o segundo dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31” se refiere a un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 34 a 233 de la SEQ ID NO: 1. Un epítopo localizado en el primer dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31 se ubica preferiblemente dentro de los aminoácidos 49 a 68 de la SEQ ID NO: 1. Un epítopo localizado en el segundo dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31 se ubica preferiblemente dentro de los aminoácidos 166 a 187 de la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, el anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en los dos primeros dominios extracelulares de CD31 de tipo inmunoglobulina corresponde al anticuerpo WM59 (dominio 2, BD, San José, California), al anticuerpo JC70A (dominio 1, DAKO, Glostrup, Dinamarca), MBC78.3 (dominio 2) o al anticuerpo 9G11 (dominio 1, R&D systems, Minneapolis, EE. UU.). Los anticuerpos WM59 y JC70A se han descrito, por ejemplo, en Fawcett et al. (J Cell Biol 128:1229-1241).
Como se usa en el presente documento, la expresión “epítopo localizado en el dominio intracelular de CD31” se refiere a un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 621 a 738 de la SEQ ID NO: 1. Anticuerpos que se unen a un epítopo localizado en el dominio intracelular de CD31 incluye el anticuerpo monoclonal de ratón MBC 235.1 y el anticuerpo monoclonal de conejo SP38 (Spring Bio-science/Abcam).
Dichas formas solubles de la proteína transmembrana pueden incluir formas solubles adicionales correspondientes, por ejemplo, a variantes de empalme solubles adicionales, ectodominios desprendidos adicionales o variantes generadas por procesamiento proteolítico. Cuando las formas solubles incluyen al menos tres formas solubles, se
pueden usar más de dos anticuerpos discriminantes. En esta realización, los anticuerpos discriminantes se eligen de tal manera que se distinga entre las formas solubles, y el anticuerpo de captura o señalización se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en todas las formas solubles mencionadas. El método para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de CD31 puede comprender, además, la etapa de calcular la proporción, porcentaje y/o cantidad de dichas formas solubles que corresponde a dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas de CD31, y/o la etapa de comparar las señales medidas con las obtenidas con al menos una muestra biológica que comprende cantidades conocidas de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y de dichas variantes de empalme solubles. El método para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de CD31 comprende preferiblemente la etapa de calcular la relación de ectodominio desprendido derivado de plaquetas a formas solubles totales, es decir, la relación de desprendimiento de CD31 derivado de plaquetas a todas las isoformas solubles (isoforma soluble que comprende dominios) 1-6, isoforma soluble que comprende los dominios 1-5, e isoforma soluble que comprende los dominios 1 2).
La Figura 3 ilustra un método de acuerdo con la invención para la detección y cuantificación de las diversas formas solubles de CD31. Las perlas unidas a anticuerpos que se unen específicamente a epítopos localizados en el primer dominio de tipo Ig se utilizan para eliminar el CD31 soluble total. Se utilizan anticuerpos discriminadores marcados que detectan el segundo y el quinto y el sexto dominio extracelular de tipo Ig y el dominio intracelular.
Las señales obtenidas para cada anticuerpo corresponden a las diferentes formas de la siguiente manera:
aCD31int = variante de empalme soluble
aCD31 d6 = variante de empalme soluble ectodominio desprendido derivado de plaquetas aCD31 d5, aCD31 d2 = variante de empalme soluble ectodominio desprendido derivado de plaquetas ectodominio desprendido derivado de linfocitos
Por lo tanto, un simple cálculo de sustracción basado en la medición de la intensidad de la señal obtenida para cada anticuerpo permite cuantificar la proporción respectiva de cada una de las formas solubles de CD31:
- Variante de empalme soluble = aCD31int
- Ectodominio desprendido derivado de las plaquetas = aCD31int - aCD31d6
- Ectodominio desprendido derivado de los linfocitos = aCD31d5 - aCD31d6
- Ectodominio desprendido derivado de los linfocitos = aCD31d2 - aCD31d6
Los métodos anteriores pueden comprender, además, la etapa de calcular la proporción, el porcentaje y/o la cantidad de dichas formas solubles que corresponde a dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, y/o la etapa de comparar las señales medidas con las obtenidas con al menos una muestra biológica que comprenda cantidades conocidas de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y de dichas formas solubles, y/o la etapa de calcular la proporción de ectodominio desprendido derivado de plaquetas (y/o ectodominio desprendido derivado de linfocitos y/o forma de empalme) a formas solubles (es decir, todas las isoformas solubles o “formas solubles totales”).
Los métodos para detectar formas solubles de CD31 encuentran uso tanto en aplicaciones analíticas como de diagnóstico. Algunas de las aplicaciones de diagnóstico se describen con más detalle en el párrafo siguiente.
Detección específica de ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas
Los métodos para la detección de un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 se describieron con anterioridad. También se contemplan otros métodos descritos en el presente documento y se describen a continuación.
También se describe un método para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 entre formas solubles de dicha proteína en una muestra biológica, cuyo ectodominio desprendido derivado de plaquetas es un fragmento de CD31 como se describe en el presente documento, en donde dichas formas solubles incluyen una variante de empalme soluble de dicha proteína CD31 y opcionalmente ectodominios desprendidos adicionales, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un primer anticuerpo unido a un soporte sólido, que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente tanto en dicho ectodominio desprendido como en dicha variante de empalme (primer anticuerpo discriminante);
b) proporcionar al menos un segundo anticuerpo unido a un soporte sólido, que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido y ausente de dicha variante de
empalme, o presente en dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido (segundo anticuerpo discriminante);
c) proporcionar un ligando marcado con fluorescencia que se une específicamente a una región que está presente tanto en dicho ectodominio desprendido como en dicha variante de empalme (ligando de señalización);
d) poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica que probablemente contenga dichas formas solubles de dicha proteína transmembrana;
e) para cada tipo de anticuerpo, medir la señal obtenida con dicha marca fluorescente; y
f) comparar la señal obtenida para cada anticuerpo.
Una diferencia en las señales medidas en la etapa (f) indica que la muestra biológica comprende dicho ectodominio desprendido de plaquetas de CD31, como se describe en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo discriminante se une preferiblemente al sexto dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31 y el segundo anticuerpo discriminante preferiblemente se une al dominio intracelular de dicho CD31.
En una realización preferida, la señal obtenida con dicha marca fluorescente se mide por citometría de flujo. Preferiblemente, la muestra biológica primero se pone en contacto con los anticuerpos unidos a las perlas, luego las perlas se recuperan y se ponen en contacto con el ligando marcado con fluorescencia.
El método puede comprender, además, la detección de un ectodominio desprendido derivado de linfocitos. Por lo tanto, también se describe un método que comprende las etapas de:
a) proporcionar un primer anticuerpo unido a un soporte sólido, que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente tanto en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos, dicho ectodominio desprendido de plaquetas y ectodominio desprendido y en dicha variante de empalme (primer anticuerpo discriminante);
b) proporcionar al menos un segundo anticuerpo unido a un soporte sólido, que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme, y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos (segundo anticuerpo discriminante);
c) proporcionar al menos un tercer anticuerpo unido a un soporte sólido, que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y ausente de dichos ectodominios desprendidos (tercer anticuerpo discriminante);
d) proporcionar un ligando marcado con fluorescencia que se une específicamente a una región que está presente tanto en dichos ectodominios desprendidos como en dicha variante de empalme (ligando de señalización);
e) poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica que probablemente contenga dichas formas solubles de dicha proteína transmembrana;
f) para cada tipo de anticuerpo, medir la señal obtenida con dicha marca fluorescente mediante citometría de flujo; y g) comparar la señal obtenida por tipo de anticuerpo.
Una diferencia en las señales medidas en la etapa (g) indica que la muestra biológica comprende dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas de CD31 y/o dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos de CD31, como se describe en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, el primer anticuerpo discriminante se une preferiblemente dentro del primero al quinto dominio extracelular de CD31, el segundo anticuerpo discriminante preferiblemente se une dentro del sexto dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31 y el tercer anticuerpo discriminante preferiblemente se une a la intracelular dominio de dicho CD31.
Métodos de detección
La identificación de los presentes inventores de un ectodominio desprendido derivado de plaquetas permite el desarrollo de métodos para diferenciar entre las diferentes isoformas solubles de CD31. Uno de estos métodos se basa en el uso de un anticuerpo de captura inmovilizado en un soporte sólido que reconoce todas las formas solubles de CD31. Los anticuerpos capturados luego se detectan con anticuerpos marcados que reconocen todas las formas de CD31 soluble (derivados de linfocitos, endoteliales y plaquetas). Alternativamente, puede usarse un ligando de detección marcado que se une a todas las formas solubles para la detección.
Las marcas detectables pueden detectarse mediante citometría de flujo. Preferiblemente, la muestra biológica
primero se pone en contacto con los anticuerpos unidos a las perlas, las perlas se recuperan y se ponen en contacto con el ligando marcado. Los citómetros de flujo permiten la caracterización de partículas en base a la dispersión de la luz y la fluorescencia de las partículas. En un citómetro de flujo, las partículas se analizan individualmente exponiendo cada partícula a una luz de excitación, típicamente uno o más láseres, y se miden las propiedades de dispersión de la luz y fluorescencia de las partículas. Las partículas, tales como moléculas, perlas unidas a analito, células individuales o subcomponentes de las mismas, típicamente se marcan con uno o más colorantes fluorescentes espectralmente distintos, y la detección se realiza utilizando una multiplicidad de fotodetectores, uno para cada colorante diferente por detectar. Los citómetros de flujo están disponibles comercialmente, por ejemplo, en BD Biosciences (San José, California). Al inicio del desarrollo de la citometría de flujo, se reconoció que se podían llevar a cabo distintos tipos de ensayos de unión a ligandos usando perlas (también denominadas micropartículas) recubiertas con un miembro de un par de unión. Las perlas recubiertas y los reporteros se incuban con una muestra que contiene (o se sospecha que contiene) el analito de interés para permitir la formación de complejos de perlaanalito-reportero. El análisis por citometría de flujo permite tanto detectar la presencia de complejos de perla-analitoreportero como medir simultáneamente la cantidad de fluorescencia informadora asociada con el complejo como una medida cuantitativa del analito presente en la muestra. También se reconoció temprano en el desarrollo de la citometría de flujo que el análisis simultáneo de múltiples analitos en una muestra podría llevarse a cabo utilizando un conjunto de perlas distinguibles, cada tipo de perla recubierta con un único agente de unión específico para el analito. El conjunto de perlas y los reactivos informadores marcados con fluorescencia, uno para cada especie de analito que se detectará, se incuban con una muestra que contiene los analitos de interés para permitir la formación de complejos de perla-analito-reportero para cada analito presente, y los complejos resultantes se analizan mediante citometría de flujo para identificar y, opcionalmente, cuantificar los analitos presentes en la muestra. Debido a que la identidad del analito unido al complejo está indicada por la identidad de la perla, se pueden detectar múltiples analitos simultáneamente usando el mismo fluoróforo para todos los reactivos informadores.
En la literatura se han descrito varios métodos para hacer y usar conjuntos de micropartículas distinguibles. Estas incluyen perlas distinguibles por tamaño, en donde cada micropartícula de tamaño está recubierta con un anticuerpo específico de dianas diferentes (véase, por ejemplo, Fulwyler y McHugh, 1990, Methods in Cell Biology 33:613-629), perlas con dos o más colorantes fluorescentes a concentraciones variables, en donde las perlas se identifican por los niveles de colorantes de fluorescencia (ver, por ejemplo, la patente europea N° 0 126 450), y las perlas están marcadas de manera distintiva con dos colorantes diferentes, en donde las perlas se identifican midiendo por separado la intensidad de fluorescencia de cada uno de los colorantes (ver, por ejemplo, patentes U. S. Nros.
4.499.052 y 4.717.655).
Las matrices unidimensionales y bidimensionales para el análisis simultáneo de múltiples analitos por citometría de flujo están disponibles en comercios. Los ejemplos de matrices unidimensionales de perlas teñidas individualmente distinguibles por el nivel de intensidad de fluorescencia incluyen BD™ Cytometric Bead Array (CBA) (BD Biosciences, San José, California) y las microesferas de citometría de flujo Cyto-Plex™ (Duke Scientific, Palo Alto, California). Un ejemplo de una matriz bidimensional de perlas distinguibles por una combinación de intensidad de fluorescencia (cinco niveles) y tamaño (dos tamaños) son las microesferas QuantumPlex™ (Bangs Laboratories, Fisher, Ind.). Un ejemplo de una matriz bidimensional de perlas doblemente teñidas distinguibles por los niveles de fluorescencia de cada uno de los dos colorantes se describe en Fulton et al. (1997, Clinical Chemistry 43(9):1749-1756).
Métodos de diagnóstico
La activación y agregación de plaquetas patológicas es responsable de la oclusión trombótica aguda de las arterias de tamaño pequeño y mediano. La oclusión de las arterias coronarias puede conducir a infarto de miocardio, oclusión de las arterias cerebrales hasta accidente cerebrovascular, oclusión de las arterias periféricas hasta infarto mesentérico, infarto esplénico o isquemia aguda de las extremidades. Por lo tanto, la activación y agregación de las plaquetas pueden desempeñar un papel en todas estas condiciones, así como otras condiciones trombóticas. Además, las plaquetas son una fuente muy rica de mediadores inflamatorios, contribuyendo así a la amplificación y diseminación de enfermedades inflamatorias crónicas. Las razones para esto no se entienden por completo, pero pueden incluir la captación del espacio extraplaquetario en sitios inflamatorios y pequeñas embolias plaquetarias que entran en la circulación desde uno de dichos sitios inflamatorios para liberar su contenido proinflamatorio en otro lugar. Este suele ser el caso de las enfermedades ateroscleróticas y otras enfermedades inflamatorias, incluidas las afecciones autoinmunes, como la artritis reumatoide (Science29 de enero de 2010, Vol. 327 no. 5965 pp. 528-529), en la enfermedad de Crohn (Danese S., de la Motte C., Fiocchi C. Platelets in inflammatory bowel disease: clinical, pathogenic, and therapeutic implications. Am J Gastroenterol 2004;99:938-945) y esclerosis múltiple (Journal of Neuroinflammation 2008, 5:27 doi: 10.1186/1742-2094-5-27). Por lo tanto, la capacidad de detectar el CD31 desprendido derivado de plaquetas puede ayudar en la elección del tratamiento adecuado para los pacientes que padecen de tales enfermedades.
La solicitud, por lo tanto, describe un método para diagnosticar si una persona sufre o tiene riesgo de padecer de un trastorno trombótico o inflamatorio, que comprende una etapa para detectar un ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas en una muestra biológica de dicho individuo, en donde la presencia de dicho ectodominio de CD31 desprendido de plaquetas indica que dicho individuo sufre o tiene riesgo de padecer de dicho trastorno trombótico o autoinmune. Cuando se puede detectar el ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas, el
método puede comprender, además, la etapa de calcular la relación de ectodominio desprendido derivado de las plaquetas a las formas solubles totales.
La solicitud describe, además, un método para diagnosticar si una persona sufre o está en riesgo de sufrir de trombosis en curso u otro trastorno trombótico o inflamatorio, que comprende las etapas de:
a) proporcionar una muestra biológica de dicho individuo;
b) detectar el ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas, por ejemplo, de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento en dicha muestra biológica; y
c) opcionalmente, correlacionar el resultado de la etapa (b) con un riesgo de padecer de dicho trastorno;
en donde la presencia de dicho ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas en dicha muestra biológica indica que dicho individuo sufre o está en riesgo de sufrir de dicho trastorno.
El método puede comprender adicionalmente la detección de ectodominio desprendido derivado de linfocitos.
La presencia de al menos el 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95% de ectodominio desprendido derivado de plaquetas en las formas solubles de CD31, o la presencia de al menos el 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90% o 95% de ectodominio desprendido derivado de plaquetas y linfocitos en las formas solubles de CD31 puede indicar que dicho individuo sufre o está en riesgo de sufrir de un trastorno trombótico o inflamatorio.
La solicitud describe, además, un método para seleccionar un tratamiento adecuado para un individuo que padece un trastorno trombótico o inflamatorio, que comprende una etapa de detección de un ectodominio de CD31 desprendido derivado de plaquetas en una muestra biológica de dicho individuo. El método puede comprender, además, la detección de ectodominio de CD31 desprendido derivado de linfocitos y/o variante de empalme soluble de CD31. El método puede comprender, además, la etapa de calcular los niveles relativos de dichas formas solubles y/o la relación de ectodominio desprendido derivado de plaquetas a ectodominio desprendido derivado de linfocitos, la relación de ectodominio desprendido derivado de plaquetas a variante de empalme soluble y/o relación entre el ectodominio desprendido derivado de plaquetas y las formas solubles totales.
Se puede seleccionar un régimen de tratamiento apropiado para dicho individuo. Por ejemplo, si se encuentra un nivel anormalmente bajo de variante de empalme soluble (es decir, CD31 endotelial) en un paciente con aterosclerosis, esto indica el uso de tratamiento con derivados de óxido nítrico, ya que el NO es un agente protector principal liberado por un endotelio sano y contribuye con varias funciones homeostáticas en vasculaturas del cuerpo. Alternativamente, en pacientes con AR, un aumento en la forma soluble derivada de plaquetas en comparación con la forma de linfocitos puede indicar el uso de agentes antiplaquetarios en lugar de aumentar peligrosamente las dosis de los inmunosupresores en pacientes con AR.
Como se usa en el presente documento, la expresión “trastorno inflamatorio” incluye, pero no se limita a trastornos autoinmunes y trombóticos, como los que se describen a continuación, enfermedades reumáticas, dolor neuropático, trastornos viscerales, alergia, asma, eczema y psoriasis.
La expresión “trastorno trombótico” incluye, pero no se limita a aterotrombosis, aterosclerosis, síndrome coronario agudo, trombosis en curso (crónica), accidente cerebrovascular isquémico, infarto esplénico, infarto de miocardio, infarto mesentérico, isquemia aguda de la extremidad, enfermedad isquémica periférica y aneurisma aórtica abdominal.
La expresión “trastorno autoinmune” incluye, pero no se limita a artritis reumatoide (AR), espondiloartritis, esclerosis múltiple (EM), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Graves y diabetes mellitus.
La detección de dichas formas solubles de CD31 se puede realizar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede ser detectado por uno de los métodos descritos en el párrafo anterior.
La muestra biológica puede corresponder, por ejemplo, a plasma, sangre u orina. La muestra biológica corresponde preferiblemente al plasma.
El método de diagnóstico de acuerdo con la invención se puede repetir al menos en dos puntos diferentes en el tiempo para monitorear la progresión de un trastorno trombótico o autoinmune en el individuo y/o evaluar la gravedad de dicho trastorno en dicho individuo y/o para monitorear la respuesta del individuo a un fármaco.
Como se usa en el presente documento, los eventos que ocurren en “un momento diferente (o posterior) en el tiempo” se refieren a eventos que ocurren en un intervalo de al menos 1 hora. Preferiblemente, los eventos ocurren en un intervalo de al menos 6 horas, 12 horas, 1 día, una semana, dos semanas o un mes.
En una realización preferida, la cantidad y/o el porcentaje de una forma soluble dada en una muestra biológica de dicho individuo por diagnosticar se comparan con la cantidad y/o el porcentaje de dicha forma en una muestra
biológica de un individuo sano.
Los altos niveles de variantes de empalme solubles en CD31 asociadas con bajos niveles de CD31 desprendido pueden indicar que el individuo por diagnosticar sufre de dolor torácico no específico, eventualmente asociado con placas carotídeas. Un ligero aumento de los niveles de CD31 desprendido asociados con niveles normales o reducidos de variantes de empalme solubles de CD31 puede indicar que el individuo por diagnosticar padece aterosclerosis. Un aumento mayor de los niveles de CD31 desprendido asociados con cantidades indetectables de variantes de empalme solubles de CD31 indica que el individuo por diagnosticar sufre de aterotrombosis.
Los métodos de diagnóstico de acuerdo con la invención se pueden usar, por ejemplo, para determinar si un individuo sufre de un trastorno trombótico o autoinmune, para evaluar la gravedad de un trastorno trombótico o autoinmune en un individuo, para predecir el riesgo de eventos cardiovasculares mayores, como la recurrencia de un infarto de miocardio, para diseñar un tratamiento régimen, para monitorear la progresión de un trastorno trombótico o autoinmune en un paciente, para predecir y monitorear la respuesta de un paciente a un medicamento y/o para ajustar el tratamiento de un paciente.
Cuando el método de diagnóstico de acuerdo con la invención se usa para monitorear la progresión de un trastorno, para evaluar la gravedad de un trastorno, para monitorear la respuesta a un medicamento y/o para ajustar el tratamiento de un paciente, se realizó en muestras biológicas tomadas de un paciente dado en diferentes puntos en el tiempo. Por ejemplo, se pueden tomar muestras biológicas cada mes para seguir la respuesta del paciente a un tratamiento. Con base en estos análisis, el tratamiento puede ser ajustado. Se puede decidir, por ejemplo, cambiar el medicamento o ajustar la dosis del medicamento para mejorar su eficacia y/o minimizar los efectos secundarios. Tal control de fármacos es especialmente recomendable en tratamientos a largo plazo, por ejemplo, cuando se administra un compuesto inmunosupresor a un paciente. La detección de CD31 desprendido se puede usar para controlar la respuesta inflamatoria en el paciente y, por lo tanto, para determinar la dosis mínima efectiva del fármaco que se puede administrar al paciente.
Por lo tanto, la solicitud describe un método para monitorear la progresión de un trastorno trombótico o autoinmune, y/o para evaluar la gravedad de un trastorno trombótico o autoinmune en un individuo, y/o para monitorear la respuesta de un paciente a un fármaco que comprende las etapas de:
a) proporcionar una primera muestra biológica de dicho paciente;
b) detectar ectodominio desprendido derivado de plaquetas, ectodominio desprendido derivado de linfocitos y/o variante de empalme soluble de CD31 en dicha primera muestra biológica como se describió anteriormente;
c) proporcionar al menos una segunda muestra biológica de dicho paciente, en donde dicha al menos una segunda muestra biológica se ha tomado de dicho paciente en un momento posterior al de la primera muestra biológica; d) detectar ectodominio desprendido derivado de plaquetas, ectodominio desprendido derivado de linfocitos y/o variante de empalme soluble de CD31 en dicha al menos una segunda muestra biológica como se describió anteriormente;
e) comparar los resultados obtenidos en las etapas (b) y (d).
En las etapas (c), (d) y (e), se pueden usar varias muestras biológicas diferentes, tomadas del mismo paciente en distintos momentos del tiempo. Por ejemplo, en el contexto de un tratamiento a largo plazo para el paciente, se pueden tomar muestras biológicas del paciente a intervalos regulares (por ejemplo, cada mes, cada dos meses o dos veces al año).
Un método de este tipo para controlar la progresión de un trastorno trombótico o autoinmune; y/o para evaluar la gravedad de dicho trastorno; y/o para monitorear la respuesta de un paciente a un fármaco puede comprender, además, una etapa (f) de diseño de un régimen de tratamiento para dicho paciente basándose en los resultados de la etapa (e).
En el marco del monitoreo de fármacos, la muestra biológica de la etapa (a) se toma preferiblemente antes del inicio del tratamiento del paciente, y la muestra biológica de la etapa (c) después del inicio del tratamiento. Una disminución de los niveles de CD31 desprendido medidos en la etapa (d) en comparación con los niveles de CD31 desprendido medidos en la etapa (b) indica que el fármaco es eficaz para tratar a dicho paciente.
Más específicamente, la solicitud describe un método para monitorear la respuesta de un paciente que sufre de un trastorno trombótico o autoinmune a un fármaco, que comprende las etapas de:
a) detección de ectodominio desprendido derivado de plaquetas, ectodominio desprendido derivado de linfocitos y/o variante de empalme soluble de CD31 en una muestra biológica de dicho paciente antes y después del inicio de un tratamiento de dicho paciente con dicho fármaco;
b) comparar los niveles de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, el ectodominio desprendido derivado de linfocitos y/o la variante de empalme soluble de CD31 detectada en la etapa (a); y, opcionalmente,
c) correlacionar una diferencia en dichos niveles de ectodominio derivado de plaquetas, ectodominio desprendido derivado de linfocitos y/o variante de empalme soluble de CD31 con la eficacia del fármaco para el tratamiento de dicho paciente.
En general, una disminución en los niveles de ectodominio desprendido derivado de plaquetas y/o ectodominio desprendido de linfocitos de CD31 después del inicio del tratamiento en comparación con los niveles de dichos ectodominios de CD31 desprendidos antes del inicio del tratamiento indica que el paciente responde a dicho fármaco y dicho fármaco es eficaz para tratar a dicho paciente. Preferiblemente, la disminución es de al menos el 5, 10, 25, 50, 75 o 90%. A la inversa, si no se encuentra una diferencia significativa en los niveles de ectodominios de CD31 desprendidos en la etapa (b), o si se encuentra un aumento en los niveles de ectodominios de CD31 desprendidos después del inicio del tratamiento en la etapa (b), el paciente no responde a dicho fármaco y el fármaco no es eficaz para tratar a dicho paciente.
Kits de diagnóstico
La solicitud también describe un kit de diagnóstico que comprende:
a) opcionalmente, al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos, en ectodominios desprendidos derivados de plaquetas, y en dicha variante de empalme,
b) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos;
c) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región presente en dicha variante de empalme, pero ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos;
Los anticuerpos pueden estar unidos a un soporte, como una perla, como se describió anteriormente, y/o se pueden marcar de forma detectable como se describió anteriormente. De modo alternativo, el kit puede comprender, además, un ligando de detección marcado que se une a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos, en ectodominios desprendidos derivados de plaquetas y en dicha variante de empalme.
Dicho anticuerpo (a) puede ser un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en los dominios extracelulares 1, 2, 3, 4 o 5 de CD31 de tipo inmunoglobulina. Dicho anticuerpo (b) puede ser un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31. Dicho tercer anticuerpo (c) puede ser un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el dominio intracelular de dicho CD31. Los anticuerpos adecuados se describieron con anterioridad.
Por lo tanto, la aplicación describe un kit de diagnóstico que comprende:
a) una perla unida a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el primer, segundo, tercero, cuarto o quinto dominio extracelular de tipo Ig de CD31;
b) un primer anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31; y
c) un segundo anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el 1°, 2°, 3°, 4° o 5° dominio extracelular de tipo Ig de CD31;
d) un tercer anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el dominio intracelular de dicho CD31.
También se describe un kit de diagnóstico que comprende:
- un primer tipo de perla unido a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31;
- un segundo tipo de perla unida a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el dominio intracelular de dicho CD31; y opcionalmente
- un anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en los dominios extracelulares 1°, 2°, 3° o 4° de CD31 de tipo inmunoglobulina.
También se describe un kit de diagnóstico que comprende:
- una perla unida a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el primer, segundo, tercero, cuarto o quinto dominio extracelular de CD31de tipo Ig;
- un primer tipo de anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de c D31; y
- un segundo tipo de anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el 1°, 2°, 3°, 4° o 5° dominio extracelular de tipo Ig de CD31.
Dichos kits se pueden usar, por ejemplo, en los métodos de diagnóstico de acuerdo con la invención, y/o en la elección de fármacos, y/o en el monitoreo de fármacos.
Los anticuerpos marcados por fluorescencia pueden incluir fluoróforos que se excitan con un láser azul y se emiten en los canales FITC, PE, PerCP o PE-tándem, o se excitan con un láser rojo y se emiten en los canales Cy5/APC o APC-tándem, o con un láser violeta y se emiten en los canales azul del Pacífico o naranja del Pacífico o con un láser UV y se emiten en los canales Quantum Dot).
Estos kits pueden comprender adicionalmente otros componentes como, por ejemplo, reactivos y/o instrucciones. Los kits también pueden comprender muestras que comprenden una cantidad conocida de ectodominio de CD31 desprendido y/o de variantes de empalme solubles, muestras de individuos sanos y/o muestras de individuos que padecen de aterosclerosis o aterotrombosis.
Los kits de acuerdo con la invención pueden comprender, además, un anticuerpo marcado con fluorescencia que se une específicamente a la fosfotirosina o a la fosfoserina/treonina.
Los diferentes anticuerpos utilizados en los métodos y kits para analizar un complejo molecular preferiblemente no compiten entre sí.
A lo largo de la especificación, términos tales como “comprende”, “comprendido”, “que comprende” pueden tener el significado que se les atribuye en la mayoría de las jurisdicciones de patentes, preferiblemente en la jurisdicción en cuestión; por ejemplo, pueden significar “incluye”, “incluido”, “que incluye”, etc. Términos tales como “que consiste en”, “que consiste esencialmente en” y “consiste esencialmente en” tienen el significado que se les atribuye en la mayoría de las jurisdicciones de patentes, preferiblemente en la jurisdicción en cuestión; por ejemplo, pueden implicar la exclusión de todos, la mayoría o todos menos una cantidad insignificante de otros elementos, o pueden permitir elementos no recitados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.
Un péptido, proteína o ácido nucleico “aislado” puede aislarse sustancial o completamente de uno o más elementos con los cuales está asociado en la naturaleza, como otros péptidos, proteínas o ácidos nucleicos naturales u otros péptidos o secuencias de ácidos nucleicos.
El término “aproximadamente” como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ±20% o ±10%, más preferiblemente ±5%, incluso más preferiblemente ±1%, y aún más preferiblemente ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos.
La invención se describirá ahora con más detalle por medio de las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.
Descripción de las figuras
La Figura 1 es una representación esquemática de las diversas formas de CD31, que muestra la forma de longitud completa, anclada a la membrana que incluye el dominio transmembrana; la variante de empalme soluble que carece de los dominios transmembrana y yuxtamembrana, el ectodominio desprendido derivado de linfocitos que resulta de la escisión de la forma anclada a la membrana entre los dominios extracelulares quinto y sexto y que comprende los dominios extracelulares 1 a 5; y el recientemente identificado ectodominio desprendido derivado de plaquetas resultante de la escisión de la forma anclada a la membrana entre el sexto dominio extracelular de tipo Ig y los dominios yuxtamembrana y que comprende los dominios extracelulares 1 a 6.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de CD31 humano.
La Figura 3 representa un ensayo de ejemplo según la invención. En este ensayo, se usan perlas que llevan un anticuerpo específico para el primer dominio extracelular de tipo Ig de CD31 para eliminar todas las formas solubles de CD31. Las diferentes formas de CD31 soluble pueden detectarse luego utilizando un anticuerpo marcado que se une solo a la variante de empalme derivada de células endoteliales (unión de anticuerpo dentro del dominio intracelular), un anticuerpo marcado que se une a la variante de empalme y al ectodominio desprendido derivado de plaquetas (unión de anticuerpos dentro del sexto dominio de tipo Ig), y anticuerpos marcados que se unen a las 3 formas solubles (anticuerpos que se unen dentro de los dominios segundo y quinto similares a Ig).
La Figura 4 muestra la detección de CD31 en el sobrenadante de las plaquetas de agregación usando avance con anticuerpos contra el dominio 5 de tipo Ig y la detección con anticuerpos dirigidos contra el dominio 2 de tipo Ig (gris) y el dominio 6 de tipo Ig (negro).
La Figura 5 muestra la detección de CD31 en el sobrenadante de linfocitos T estimulados con TCR (receptor de células T) usando avance con anticuerpos contra el dominio 1 de tipo Ig y detección con anticuerpos dirigidos hacia el dominio 2 de tipo Ig (gris), dominio 5 de tipo Ig (blanco) y el dominio 6 de tipo Ig (negro).
Ejemplos
Métodos:
Linfocitos
Los sobrenadantes se prepararon a partir de linfocitos T activados y se detectó CD31 soluble como se describe en el documento PCT/EP2009/058220 (documento WO2010/000756).
Se realizó citometría de flujo de diez colores en leucocitos de sangre periférica de 5 individuos sanos en condiciones basales o después de la estimulación durante la noche con 1 pg/ml soluble de anticuerpo anti-CD3 purificado (R&D Systems). La citometría de flujo de Tencolor se realizó después de la lisis hipotónica de eritrocitos (10 minutos a 37°C 1:10 v:v en Tris 10 mM, NH4CI 155 mM, KHCO3 10 mM, pH 7,4) en leucocitos de sangre periférica heparinizados de 5 individuos sanos, se fijaron en PBS/formaldehído al 1%/FCS al 1% durante 4 minutos a 37°C antes del procesamiento. Las células peletizadas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente y se protegieron de la luz con un cóctel de anticuerpos monoclonales fluorescentes dirigidos a CD3 (PETexas Red), CD4 (PE-Cy7), CD8 (PerCP), HLA-DR (APC-Cy7), CD45RA (Pacific Blue) y CD31 (WM59, PE) de BD Biosciences y anti-CD20 (AlexaFluor®700) y anti-CD31 (PeCa M 1.2, FITC) de Invitrogen (1 pl de cada uno). Al menos 50.000 eventos fueron adquiridos en la puerta de los linfocitos utilizando un BD LSRII® equipado con 3 láseres (405, 488 y 633 nm) y analizados con el software BD DIVA® 6.0.
Para detectar la variante de empalme y CD31 desprendido derivado de linfocitos en plasma, se utilizó una matriz de perlas de citoquinas (CBA®, BD). Tres perlas de CBA funcionalmente diferentes (A9, D5 y E9) se acoplaron con cualquiera de los siguientes anticuerpos monoclonales anti-CD31 purificados JC70A (dominio 1, DAKO), MEM-05 (dominio 5, Zymed) y PECAM 1.2 (dominio 6, Invitrogen). Las perlas acopladas se incubaron luego con el sobrenadante del cultivo y se detectó la unión positiva de CD31 circulante por un cuarto anticuerpo monoclonal anti-CD31, WM-59 (dominios 1-2) acoplado a PE (BD). La concentración de plasma CD31 que incluye al menos el dominio 1 (JC70A), o los dominios 1 a 5 (MEM-05) o todos los dominios extracelulares 1 a 6 de CD31 (PECAM 1.2) se determinó mediante el análisis de la intensidad fluorescente media del anticuerpo detector en >1000 perlas cerradas en muestras y diluciones en serie del mismo estándar (CD31 extracelular recombinante de longitud completa, R&D Systems). La curva estándar se obtuvo para cada una de las perlas utilizando las mismas concentraciones conocidas del CD31 recombinante para superar cualquier sesgo debido a las diferencias en la afinidad de unión de los diversos anticuerpos. La concentración en ng/ml de CD31 determinada con perlas acopladas con PECAM 1.2 (dom 1-6) se restó de la obtenida usando perlas acopladas con MEM-05 para obtener la cantidad de CD31 circulante que carece de dom6 (dom 1-5). Este último se restó de la concentración de CD31 obtenida utilizando las perlas acopladas a JC70A para calcular el valor de CD31 soluble que carece de ambos dominios 5 y 6 pero que contiene al menos los dominios 1 y 2 (dom 1-2).
Plaquetas
Las plaquetas se prepararon a partir de sangre humana fresca obtenida de voluntarios sanos que no habían ingerido ningún fármaco en los 10 días anteriores recolectados en anticoagulante ácido-citrato-dextrosa (ACDA, concentración final 13,6 mmol/L de dextrosa, pH 6,5). Se recogió plasma rico en plaquetas que contenía menos de un leucocito por 105 plaquetas mediante centrifugación a 800 g durante 5 minutos a 20°C. Las plaquetas se sedimentaron mediante centrifugación a 800 g durante 11 minutos y se lavaron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) modificada mediante la adición de dextrosa (4,45 mmol/L), NaHCO3 (3,35 mmol/L), MgCh (500 (pmol/L) albúmina de suero bovino (fracción V, alcohol precipitado, 0,1%), pH 7,5 (con NaOH).
La agregación plaquetaria se monitorizó fotométricamente en un agregómetro Chronolog (4 canales) a 37°C. Las alícuotas (240 pL) de plaquetas suspendidas en cubetas de vidrio siliconado que contenían barras de agitación se equilibraron a 37°C durante 5 minutos. Se añadió CaCI2 (concentración final de 2,5 mmol/L) y colágeno (colágeno de caballo, concentración final 2,5 ng/L) 1 minuto después del inicio del registro de agregación y se recogieron los sobrenadantes a los 2, 5, 10 y 30 minutos después de la agregación plaquetaria inducida por colágeno.
Los sobrenadantes de las plaquetas agregadas recolectadas en los diferentes momentos se centrifugaron a 2500 durante 15 minutos para eliminar las plaquetas y los residuos antes de la detección.
La detección de CD31 en el sobrenadante de plaquetas se llevó a cabo utilizando el avance con anticuerpos conjugados con perlas para el dominio 5 de tipo Ig (MEM-05, Exbio Praha) y la detección con anticuerpos dirigidos hacia el dominio 2 de tipo Ig (WM59-PE, BD Biosciences) y el dominio 6 de tipo Ig (MBC78.2-Fitc, Caltag).
Resultados:
Como se muestra en la Figura 4, el fragmento CD31 derivado de la agregación plaquetaria y detectable en fluidos biológicos contiene tanto el dominio 5 como el dominio 6. Esto muestra que las plaquetas escinden la CD31 extracelular entre el epítopo del anticuerpo dirigido al dominio 6 (MBC78.2) y la membrana celular.
Por el contrario, como se ve en la Figura 5, los linfocitos T estimulados con TCR (receptor de células T) escinden su CD31 extracelular entre el dominio 5 y el dominio 6. Por lo tanto, la CD31 escindida por las plaquetas se puede distinguir de la producida por las células T a través de la detección del dominio 6 (positivo en el caso de las plaquetas y negativo en el caso del origen de las células T).
Detección simultánea de ectodominio desprendido derivado de plaquetas, ectodominio desprendido derivado de linfocitos y variante de empalme CD31
Las muestras biológicas (por ejemplo, muestras de plasma) se centrifugan a 2500 g durante 15' para evitar sesgos debido a los agregados y micropartículas inducidas por congelamiento-descongelamiento. Se incuban cincuenta microlitros de muestra con perlas citométricas funcionales (CBA u otras) acopladas a anticuerpos purificados monoclonales WM59 (dirigidos contra el dominio 1 de CD31 humano). La unión positiva de CD31 soluble se detecta mediante otros cuatro anticuerpos monoclonales anti-CD31, MBC78.3 (dirigido contra el dominio 2 de CD31 humano) acoplado a FITC, MBC78.1 (dirigido contra el dominio 5 de CD31 humano) acoplado a PE, MBC78.2 (dirigido contra el dominio CD31 humano 6) acoplado a PerCp-Cy5.5).
La adquisición se realiza con el software DIVA 6.0 en un citómetro LSRII equipado con un lector de placas de 96 pocillos. El análisis se realiza con el software FCAP Array® (BD Biosciences) y las concentraciones de CD31 se obtienen mediante la fórmula logística de 4 parámetros. Las curvas estándar se obtienen con cada uno de los anticuerpos fluorescentes monoclonales de detección utilizados simultáneamente con el CD31 recombinante para superar cualquier sesgo debido a las diferencias en la afinidad de unión de los diversos anticuerpos.
La concentración en pg/ml de CD31 total se determina por la fluorescencia verde (clon MBC78.3, dominio 2 de CD31). El CD31 derivado del endotelio se determina con la fluorescencia media de V450 (clon 235.1) porque es el único que comprende la cola citoplásmica. CD31 desprendido en las plaquetas se determina con la fluorescencia media de PerCp-Cy5.5 (dominio 6 de CD31). Esta cantidad se resta de la obtenida con la fluorescencia media de PE (dominio 5 de CD31) para obtener el nivel de CD31 derivado de leucocitos. La sustracción de esta fracción de la concentración de CD31 obtenida con Fitc (dominio 2 de CD31) permite la cuantificación de fracciones de CD31 de menor tamaño que son insignificantes en sujetos sanos, pero podrían ser diferentes en caso de patología.
Claims (13)
1. Un fragmento de una proteína CD31 de longitud completa, que comprende al menos una parte del sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de dicha proteína CD31 de longitud completa, en donde dicho fragmento no comprende los dominios yuxtamembrana, transmembrana e intracelular de dicha proteína de longitud completa, en donde dicho fragmento tiene una longitud de al menos 30 aminoácidos y en donde dicho fragmento comprende un epítopo dentro del sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina unido específicamente por el anticuerpo MBC78.2.
2. El fragmento de una proteína CD31 de longitud completa de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en los dominios 1 a 6 extracelulares de tipo inmunoglobulina de dicha proteína CD31 de longitud completa.
3. El fragmento de proteína CD31 de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha proteína CD31 de longitud completa tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
4. El fragmento de proteína CD31 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde
(i) dicho sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina corresponde a los aminoácidos 494-591 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(ii) dicho dominio yuxtamembrana corresponde a los aminoácidos 592-601 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(iii) dicho dominio transmembrana corresponde a los aminoácidos 602-620 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y/o
(iv) dicho dominio intracelular corresponde a los aminoácidos 621-738 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
5. Un método para detectar un ectodominio derivado de plaquetas de una proteína CD31 que es un fragmento de CD31 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 entre formas solubles de CD31 en una muestra biológica, en donde dichas formas solubles incluyen una variante de empalme soluble de dicha proteína CD31, que comprende las etapas de:
a) proporcionar un primer anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, cuyo anticuerpo está opcionalmente marcado con una marca detectable;
b) proporcionar un segundo anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, anticuerpo que está opcionalmente marcado con una marca detectable;
c) poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica que probablemente contenga dichas formas solubles de dicha proteína transmembrana;
d) medir la señal obtenida de dichos marcadores detectables, opcionalmente mediante citometría de flujo;
en donde dicho primer anticuerpo discriminante se une al sexto dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31 y no reconoce la forma de CD31 desprendida por los linfocitos;
y en donde dicho segundo anticuerpo discriminante se une al dominio intracelular de dicho CD31.
6. Un método para detectar un ectodominio desprendido derivado de plaquetas de una proteína CD31 que es un fragmento de CD31 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un ectodominio desprendido derivado de linfocitos de una proteína de CD31 y una variante de empalme soluble de dicha proteína de CD31 en una muestra biológica, método que comprende:
a) proporcionar un anticuerpo de captura opcionalmente inmovilizado en un soporte sólido, en donde dicho anticuerpo de captura se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos y en dicha variante de empalme;
b) proporcionar un primer anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de los linfocitos;
c) proporcionar un segundo anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicha variante de empalme y ausente de dicho ectodominio desprendido derivado de
plaquetas y de dicho ectodominio desprendido derivado de los linfocitos;
d) proporcionar un tercer anticuerpo discriminante que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, en dicho ectodominio desprendido derivado de linfocitos y en dicha variante de empalme;
en donde dichos anticuerpos discriminantes están marcados con una marca detectable, opcionalmente una marca fluorescente;
e) poner en contacto dichos anticuerpos con una muestra biológica que probablemente contenga dichas formas solubles de dicha proteína transmembrana;
f) medir la señal obtenida de la marca asociada con cada anticuerpo discriminante, opcionalmente mediante citometría de flujo;
en donde el anticuerpo de captura y el tercer anticuerpo discriminante se unen dentro de la región definida por los dominios extracelulares 1°, 2°, 3°, 4° y 5° de dicho CD31, el primer anticuerpo discriminante se une dentro del 6° dominio extracelular de tipo Ig de dicho CD31 y el segundo anticuerpo discriminante se une al dominio intracelular de dicho CD31.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que comprende, además, la etapa de calcular el porcentaje y/o la cantidad de dichas formas solubles que corresponde a dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas, y/o la etapa de calcular la relación de dicho ectodominio desprendido derivado de plaquetas a formas solubles, o la relación de variante de empalme soluble a formas solubles.
8. Un método de detección de agregación plaquetaria en un sujeto, que comprende la detección de un fragmento de proteína CD31 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una muestra biológica de un sujeto.
9. Un método de diagnóstico de trombosis o una afección inflamatoria, que comprende la detección de un fragmento de proteína CD31 de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 en una muestra biológica de un sujeto.
10. Un método para monitorear la respuesta de un paciente a un fármaco, que comprende las etapas de:
a) detectar un fragmento de proteína CD31 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una muestra biológica de dicho paciente antes y después del inicio de un tratamiento de dicho paciente con dicho fármaco; b) comparar los niveles de los fragmentos de CD31 detectados en la etapa (a); y, opcionalmente,
c) correlacionar una diferencia en dichos niveles de fragmentos de CD31 con la efectividad del fármaco para tratar a dicho paciente.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la etapa de detección de dicho fragmento de proteína CD31 se realiza según el método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
12. Un kit de diagnóstico que comprende:
a) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho CD31 desprendido derivado de linfocitos, en CD31 desprendido derivado de plaquetas, y en dicha variante de empalme de CD31, en donde dicho epítopo está ubicado en una región que está presente en el 1°, 2°, 3°, 4° o 5° dominio extracelular de tipo Ig de CD31,
b) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en dicho CD31 desprendido derivado de plaquetas y dicha variante de empalme de CD31, pero ausente de dicho CD31 desprendido derivado de los linfocitos, en donde dicho epítopo se encuentra en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31 y está unido por el anticuerpo MBC78.2;
c) al menos un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región presente en dicha variante de empalme de CD31, pero ausente de dicho CD31 desprendido derivado de plaquetas y dicho CD31 desprendido derivado de linfocitos, en donde dicho epítopo se ubica en una región que está presente en el dominio intracelular de dicho CD31.
13. Un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende:
a) una perla unida a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el primero, segundo, tercero, cuarto o quinto dominio extracelular de tipo Ig de CD31;
b) un primer anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en el sexto dominio extracelular de tipo inmunoglobulina de CD31;
c) un segundo anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el 1°, 2°, 3°, 4° o 5° dominio extracelular de tipo Ig de CD31; y
d) un tercer anticuerpo marcado que se une específicamente a un epítopo localizado en una región que está presente en el dominio intracelular de dicho CD31.
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