WO2014123186A1 - 抗セマフォリン３ａ抗体、並びにこれを用いたアルツハイマー病及び免疫・炎症性疾患の治療 - Google Patents

抗セマフォリン３ａ抗体、並びにこれを用いたアルツハイマー病及び免疫・炎症性疾患の治療 Download PDF

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良郎 五嶋
史雄 中村
山下　直也
秀宗 瀬尾
修一 橋本
孝司 村上
高橋　直樹
由貴江 笹倉
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-semaphorin 3A antibody or an antibody fragment thereof that is effective for the prevention and / or treatment of diseases involving semaphorin 3A protein. Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition using the anti-semaphorin 3A antibody or an antibody fragment thereof. Furthermore, the present invention relates to a method for measuring semaphorin 3A protein using an anti-semaphorin 3A antibody or an antibody fragment thereof.
  • Alzheimer's disease is the most common form of dementia (loss of memory) in the elderly.
  • Currently used treatments for Alzheimer's disease include cholinesterase inhibitors that improve cholinergic neurotransmission in the central nervous system, or excitotoxicity caused by ⁇ -methyl-D-aspartate (NMDA) glutamate receptor inhibitors. Suppression is the mechanism of action, but only slight improvement in symptoms has been observed.
  • NMDA ⁇ -methyl-D-aspartate
  • AD The major pathological injury of AD found in the brain is due to extracellular deposits of ⁇ -amyloid protein in the form of plaques and vascular disorders, and intracellular neurofibrillary tangles of aggregated hyperphosphorylated ⁇ protein is doing. Recent evidence indicates that elevated ⁇ -amyloid levels in the brain not only precede the pathology of ⁇ , but also correlate with cognitive decline. Recent studies have further suggested a possible role for ⁇ -amyloid in AD, revealing that aggregated ⁇ -amyloid is toxic to neurons in cell culture.
  • ⁇ -amyloid protein is mainly composed of a peptide of 39 to 42 amino acids, and is produced from a larger precursor protein called amyloid precursor protein (APP) by the continuous action of protease, ⁇ and ⁇ -secretase.
  • APP amyloid precursor protein
  • APP amyloid precursor protein
  • cases of early-onset AD result from gene mutations in APP that lead to overproduction of either the entire ⁇ -amyloid protein or its isoform.
  • people with Down's syndrome have extra chromosomes that contain the gene encoding APP, have elevated ⁇ -amyloid levels, and inevitably develop AD with age.
  • Semaphorin is an endogenous protein that has been identified as a factor that retreats the nerve growth cone and suppresses axonal elongation.
  • Semaphorin genes are classified into eight gene subfamilies and classes based on their structures, and about 20 molecular species have been known so far (Non-patent Document 1).
  • the most studied group is a group of subfamily genes called class 3 type, and the most studied is semaphorin 3A (Sema3A) (Non-patent Documents 2 and 3). It is known that Sema3A protein induces growth cone retraction of cultured neurons in a short time at a low concentration of 10 pM and inhibits nerve regeneration elongation.
  • Sema3A protein is secreted from cancer cells / tissues and inhibits the signal pathway of mitogen-activated protein (MAP) kinase to suppress T cell activation, or Sema3A in cancer tissues of pancreatic cancer patients.
  • MAP mitogen-activated protein
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • the main symptoms are bleeding symptoms and organ symptoms, but it is known that the prognosis becomes extremely poor when clinical symptoms appear.
  • the underlying diseases that trigger DIC include sepsis, acute leukemia, solid cancer, early placenta detachment, amniotic fluid embolism, trauma, burns, collagen disease, shock, aortic aneurysm, fulminant hepatitis, cirrhosis, acute pancreatitis, lateral
  • rhabdomyolysis, thrombosis, severe infection, etc. are known, the relationship with Sema3A has not been clarified.
  • Sema3A protein activity inhibitors such as anti-Sema3A antibodies are effective in treating Alzheimer's and Parkinson's disease (see Patent Document 1), and effective in treating immune diseases and inflammatory diseases (see Patent Document 2).
  • Patent Document 1 Sema3A protein activity inhibitors
  • Patent Document 2 Anti-Sema3A antibodies
  • Patent Document 3 Anti-Sema3A antibodies
  • Sema3A protein is involved in various pathologies as described above, and a technique for measuring the Sema3A protein with high accuracy is indispensable for elucidating the pathology and developing therapeutic agents. ing.
  • the present invention relates to Sema3A protein that can effectively prevent and / or treat disseminated intravascular coagulation syndrome and diseases involving Sema3A protein such as neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, cancer, infectious diseases and the like. It is an object to provide an antibody. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition that enables prevention and / or treatment of a disease associated with the Sema3A protein and alleviation of symptoms associated with the disease. Furthermore, another object of the present invention is to provide an antibody against the Sema3A protein that is effective for measuring the Sema3A protein, and a method for measuring the Sema3A protein using the antibody.
  • an anti-Sema3A antibody having a complementarity determining region (CDR) having a specific amino acid sequence is a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease. It was found that the disease can be effectively prevented and / or treated, and the symptoms associated with the neurodegenerative disease are remarkably improved. Further, in a fatal sepsis model, the anti-Sema3A antibody showed a dramatic improvement in survival rate and an extension of survival period. In addition, the present inventors have found that the anti-Sema3A antibody reduces blood plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), which is one of the exacerbation factors of disseminated intravascular coagulation syndrome.
  • PAI-1 blood plasminogen activator inhibitor-1
  • cancer cell migration / invasion and drug resistance are induced by Sema3A
  • cancer cell migration / invasion and drug resistance can be suppressed by the anti-Sema3A antibody, so that malignancy of cancer can also be suppressed. I found.
  • Sema3A protein can be measured by ELISA using an anti-Sema3A antibody equipped with a CDR having a specific amino acid sequence.
  • Item 2. The anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1, which is a chimeric antibody, a humanized antibody, or an antibody fragment thereof.
  • Item 3. The anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2, which is used for promoting nerve regeneration.
  • Item 4. Item 3.
  • Item 5. Item 3. The anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2, which is used for prevention and / or treatment of sepsis.
  • Item 6. Item 3. The anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2, which is used for prevention and / or treatment of cancer.
  • Item 1 or used for prevention and / or treatment of at least one disease selected from the group consisting of central or peripheral nervous system diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, infectious diseases, and allergic diseases 3.
  • Item 9. Item 9.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to any one of Items 1 to 8.
  • Item 10. Item 10.
  • Item 11. Item 10.
  • Item 13. Item 10.
  • Cancer is colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, brain tumor, melanoma, renal cell carcinoma, leukemia, lymphoma, T cell lymphoma, stomach cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, esophagus Item 14.
  • Item 15. Item 10.
  • Disseminated intravascular coagulation syndrome is sepsis, acute leukemia, solid cancer, early placenta detachment, amniotic fluid embolism, trauma, burn, collagen disease, shock, aortic aneurysm, fulminant hepatitis, cirrhosis, acute pancreatitis, striated muscle Item 16.
  • the pharmaceutical composition according to Item 15 accompanied by at least one selected from the group consisting of thawing, thrombosis, and severe infection.
  • Item 18. The pharmaceutical composition according to Item 17, wherein the central or peripheral nervous system disease is neuropathic pain, spinal cord injury, or neurodegenerative disease.
  • the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, progressive supranuclear palsy, nigrostriatal degeneration, Shy-Drager syndrome, Olive Bridge cerebellar atrophy, or spinal cord Item 19.
  • Item 18 The pharmaceutical composition according to Item 17, wherein the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, type I diabetes, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, systemic lupus erythematosus, or multiple sclerosis.
  • Item 22. Item 18.
  • the infection is a bacterial infection, encephalitis, meningitis, endocarditis, hepatitis C, influenza, severe acute respiratory syndrome, pneumonia, sepsis, burns, or traumatic infection Pharmaceutical composition.
  • Item 23 The pharmaceutical composition according to Item 17, wherein the allergic disease is allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, bronchial asthma, or food allergy.
  • a nerve regeneration method comprising a step of administering the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to item 1 or 2 to a patient for whom nerve regeneration is required.
  • a method for treating Alzheimer's disease comprising a step of administering the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 to a patient suffering from Alzheimer's disease.
  • Item 26 A method for treating Alzheimer's disease, comprising a step of administering the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 to a patient suffering from Alzheimer's disease.
  • a method for treating sepsis comprising a step of administering the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 to a patient suffering from sepsis.
  • Item 27 A method for treating cancer, comprising a step of administering the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 to a patient suffering from cancer.
  • Item 28. Cancer is colon cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, brain tumor, melanoma, renal cell carcinoma, leukemia, lymphoma, T cell lymphoma, stomach cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, esophagus Item 28.
  • Item 29. A method for treating disseminated intravascular coagulation syndrome, comprising a step of administering the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to item 1 or 2 to a patient suffering from disseminated intravascular coagulation syndrome.
  • Disseminated intravascular coagulation syndrome is sepsis, acute leukemia, solid cancer, early placenta detachment, amniotic fluid embolism, trauma, burn, collagen disease, shock, aortic aneurysm, fulminant hepatitis, cirrhosis, acute pancreatitis, striated muscle Item 30.
  • a method for treating the disease comprising the step of administering an anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment.
  • Item 3. Use of the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 for the manufacture of a medicament for nerve regeneration.
  • Item 3. Use of the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 for the manufacture of an agent for preventing and / or treating Alzheimer's disease.
  • Item 34 Use of the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 for the manufacture of an agent for preventing and / or treating sepsis.
  • Item 34 Use of the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 for the manufacture of an agent for preventing and / or treating cancer.
  • Item 35 Use of the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2 for the manufacture of a preventive and / or therapeutic agent for disseminated intravascular coagulation syndrome.
  • Item 36 Use of the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to 2.
  • Item 37 Use of the anti-semaphorin 3A antibody or antibody fragment according to 2.
  • a method for measuring Sema3A protein comprising a step of measuring Sema3A protein in a sample by immunoassay using the anti-Sema3A antibody or antibody fragment according to Item 1 or 2.
  • Item 3. A kit for measuring Sema3A protein, comprising the anti-Sema3A antibody or antibody fragment according to item 1 or 2.
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease can be effectively prevented and / or treated, and the alleviation of symptoms associated with the neurodegenerative diseases can be remarkably improved.
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention inhibits Sema3A signaling by effectively inhibiting the function of the Sema3A protein, As a result, it is thought that accumulation of phosphorylated Collapsin Response Mediator Protein (CRMP) in neurofibrillary tangles is inhibited.
  • CRMP Collapsin Response Mediator Protein
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention is effective for the prevention and / or treatment of central or peripheral nervous system diseases other than neurodegenerative diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, infectious diseases, and allergic diseases. In particular, it can exhibit an excellent preventive and / or therapeutic effect on inflammatory diseases in which the immune system is destroyed by infection or strong inflammation-induced stimulation such as sepsis.
  • the migration / invasion activity of cancer cells induced by Sema3A can be effectively suppressed, anti-cancer agent unresponsiveness induced by Sema3A is canceled, and drug sensitivity is reduced. Since it can be recovered, it is also effective in preventing and / or treating cancer.
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention has an action of suppressing an increase in blood PAI-1 level, and is also effective in the prevention and / or treatment of disseminated intravascular coagulation syndrome.
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention can also be used for measuring Sema3A protein.
  • the Sema3A protein can be measured with high accuracy even in the presence of serum, and the Sema3A protein in a biological sample can be measured.
  • FIG. 1 is a graph showing that 13 strains of anti-Sema3A antibody-producing clones were obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of evaluating the binding specificity of the anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody prepared in Example 1 for the Sema3A protein.
  • FIG. 3 shows the results of CBB staining after electrophoresis of anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody, anti-Sema3A humanized antibody, and anti-Sema3A tri-human chimeric antibody.
  • FIG. 1 is a graph showing that 13 strains of anti-Sema3A antibody-producing clones were obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of evaluating the binding specificity of the anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody prepared in Example 1 for the Sema3A protein.
  • FIG. 3 shows the results of CBB staining after electrophore
  • FIG. 4 shows the results of testing the reactivity of anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody, anti-Sema3A humanized antibody, and tri-human chimeric anti-Sema3A antibody against human Sema3A and mouse Sema3A antigen.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the affinity of the anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody, anti-Sema3A humanized antibody, and tri-human chimeric anti-Sema3A antibody for Sema3A protein by competitive ELISA.
  • FIG. 6 shows the results of measuring Sema3A in a test sample not containing serum by sandwich ELISA using the anti-Sema3A antibody prepared in Examples 2-4.
  • FIG. 7 shows the results of measuring Sema3A in a test sample containing serum by sandwich ELISA using the anti-Sema3A antibody prepared in Example 2.
  • FIG. 8 shows the results of a regression assay using chicken-derived Sema3A protein and avian anti-Sema3A antibody.
  • FIG. 9 shows the results of a regression assay using chicken-derived Sema3A protein and anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody.
  • FIG. 10 shows the results of a regression assay using chicken-derived Sema3A protein and avian anti-Sema3A antibody.
  • FIG. 11 shows the results of a regression assay using chicken-derived Sema3A protein and anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody.
  • FIG. 12 shows the results of a binding assay for human-derived Sema3A protein with respect to the avian anti-Sema3A antibody.
  • FIG. 13 shows the results of a binding assay for anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody against human-derived Sema3A protein.
  • FIG. 14 shows the results of conducting a binding assay for human-derived Sema3F protein with respect to the avian anti-Sema3A antibody.
  • FIG. 15 shows the results of Example 10.
  • FIG. 15A is a graph showing the result of the access rate to the object B when trying to acquire the Novell Object Recognition Task.
  • FIG. 15B is a graph showing a result of an access rate to the object C at the time of a test test of the Novell Object Recognition Task.
  • FIG. 16 shows the results of Example 15.
  • FIG. 3 is a diagram in which three tests administered with anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody were combined, and the survival curve was plotted by the Kaplan-Meier method.
  • FIG. 17 shows the results of Example 16.
  • FIG. 6 is a graph in which survival curves are plotted by the Kaplan-Meier method for a group administered with 500 ⁇ g of anti-Sema3A humanized antibody and a negative control group.
  • FIG. 6 is a graph in which survival curves are plotted by the Kaplan-Meier method for a group administered with 500 ⁇ g of anti-Sema3A humanized antibody and a negative control group.
  • FIG. 18 shows the results of Example 17.
  • FIG. 2 is a graph plotting survival curves of a group administered with 500 ⁇ g of anti-Sema3A humanized antibody and a negative control group after 1 hour after inoculating mice with Lipopolysaccharide and inducing an inflammatory disease state by the Kaplan-Meier method.
  • FIG. 19 shows the results of Example 18. It is a figure which shows the result of having measured the plasminogen activator inhibitor-1 blood concentration of a mouse
  • FIG. 20 shows the results of Example 19.
  • FIG. 21 is a diagram showing the results of Example 20. It is a figure which shows the result of having performed cell invasion assay using the human pancreatic cancer cell line (MIAPaCa-2).
  • FIG. 22 shows the results of Example 20. It is a figure which shows the result of having performed cell invasion assay using the human glioblastoma cell line (U87MG).
  • FIG. 23 shows the results of Example 20. It is a figure which shows the result of having performed cell invasion assay using the mouse-derived lung cancer cell line (3LL).
  • FIG. 24 shows the results of Example 20.
  • FIG. It is the image which performed the cell invasion assay using the mouse-derived lung cancer cell line (3LL), and observed the stained infiltrating cell under a microscope.
  • FIG. 25 shows the results of Example 21.
  • FIG. It is the result of having analyzed the influence which Sema3A protein and / or an anti-Sema3A humanized antibody have about the sensitivity of the gemcitabine hydrochloride in a human pancreatic cancer cell (MIAPaCa-2).
  • Anti-Sema3A antibody and antibody fragment thereof comprises a heavy chain variable region in which CDR1 to CDR3 have a specific amino acid sequence, and a light chain variable region in which CDR1 to CDR3 has a specific amino acid sequence.
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention specifically binds to the Sema3A protein and can effectively inhibit the function of the protein.
  • the Sema3A protein is encoded by a gene belonging to the class 3 subfamily of semaphorins, and is an endogenous protein identified as a factor that retreats the nerve growth cone and suppresses axon elongation.
  • the amino acid sequence of the Sema3A protein is known (GenBank accession number; NP_006071.1 from human, NP_033178.2 from mouse).
  • a preferred embodiment of the anti-Sema3A antibody of the present invention includes those comprising the heavy chain variable region and the light chain variable region shown in the following (A) to (E).
  • C a heavy chain variable region comprising CDR1 comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 68, CDR2 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69, and CDR3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70; and the amino acid shown in SEQ ID NO: 72
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention comprises the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 (SEQ ID NOs: 1 to 6, 60 to 62, 64 to 66, 68 to 70, 72 to 74, 76 to 78, 80 in the heavy chain and the light chain. -82, 84-86 and 88-90) may have one or several amino acids substituted, deleted, added and / or inserted.
  • the number of amino acids to be substituted, deleted, added and / or inserted is not particularly limited, but preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, particularly preferably 1 per CDR.
  • one of the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 in the heavy chain and the light chain may be substituted, deleted, added and / or inserted into one amino acid sequence. Substitutions, deletions, additions and / or insertions may be made to the above amino acid sequences.
  • substitution of amino acids in the amino acid sequence of the CDR substitution with similar amino acids (ie, conservative amino acid substitution) is preferable since it is predicted that no change is caused in the binding activity of the antibody. Specifically, the following classification has been established based on the properties of amino acid side chains.
  • Basic amino acids lysine, arginine, histidine
  • Acidic amino acids glutamic acid, aspartic acid
  • Neutral amino acids glycine, alanine, serine, threonine, methionine, cysteine, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, leucine, isoleucine, valine, glutamine, asparagine, proline more
  • the neutral amino acid has a polar side chain (asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), and has a nonpolar side chain (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine) , Tryptophan), those having amide-containing side chains (asparagine, glutamine), those having sulfur-containing side chains (methionine, cysteine), those having aromatic side chains (pheny It is also possible to classify them into
  • Examples of the method for substituting one or several amino acid residues with other amino acids of interest include, for example, site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh T. et al., Gene, Vol. 152, p. 271-275). (1995); Zoller MJ. Et al., Methods Enzymol. Vol.100, p.468-500 (1983), Kramer W. et al., Nucleic Acids Res.Vol.12, p.9441-9456 (1984). Kramer W. et al., Methods. Enzymol. Vol.154, p.350-367 (1987); Kunkel TA., Proc Natl Acad Sci USA., Vol.82, p.488.
  • the framework region in the variable region and the amino acid sequence of the constant region are not particularly limited as long as they do not substantially affect the binding activity to the Sema3A protein.
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention may be an avian antibody, preferably a chimeric antibody and a humanized antibody.
  • Chimeric antibodies are antibodies in which different regions derived from each other are linked.
  • the anti-Sema3A antibody of the present invention when used as a chimeric antibody, when used as a pharmaceutical composition or a therapeutic agent for various diseases, a tri-human chimeric antibody comprising a variable region derived from an avian antibody and a constant region derived from a human antibody or A tri-mouse chimeric antibody composed of a variable region derived from an avian antibody and a constant region derived from a mouse antibody is desirable, and a tri-human chimeric antibody is more preferable.
  • a tri-rabbit composed of a variable region derived from an avian antibody and a constant region derived from a rabbit antibody
  • a tri-goat chimeric antibody composed of a chimeric antibody or a variable region derived from an avian antibody and a constant region derived from a goat antibody can also be used.
  • Examples of the amino acid sequence of the heavy chain variable region used in the tri-human chimeric antibody, tri-mouse chimeric antibody, tri-rabbit chimeric antibody or tri-rabbit chimeric antibody are SEQ ID NOs: 7, 8, 59, 67, 75, and 83.
  • Examples of the amino acid sequence of the light chain variable region used in the tri-human chimeric antibody, tri-mouse chimeric antibody, tri-rabbit chimeric antibody or tri-rabbit chimeric antibody include SEQ ID NOs: 9 and 10, 63, 71, 79, The amino acid sequence shown in 87 is mentioned.
  • variable regions SEQ ID NOs: 7 to 10, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, and 87
  • One or several amino acids may be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • the number of amino acids to be substituted, deleted, added and / or inserted is not particularly limited.
  • the heavy chain variable region SEQ ID NO: 7, 8, 59, 67, 75, 83
  • the light chain variable region In SEQ ID NO: 9, 10, 63, 71, 79, 87), 1 to 21, preferably 1 to 14, and more preferably 1 to 3 may be mentioned.
  • substitution, deletion In the heavy chain variable region (SEQ ID NO: 7, 8, 59, 67, 75, 83) and / or the light chain variable region (SEQ ID NO: 9, 10, 63, 71, 79, 87), substitution, deletion,
  • the added and / or inserted amino acid is preferably a region other than the amino acid sequences of CDR1 to CDR3.
  • the amino acid substitution in the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain and light chain is preferably the conservative amino acid substitution described above.
  • the humanized antibody is obtained by grafting a non-human-derived CDR sequence onto the framework region of a human antibody.
  • the CDR of the non-human-derived antibody, the framework region derived from a human antibody, and the constant region derived from a human antibody An antibody composed of Since the antigenicity in the human body is reduced, the humanized antibody is suitable when the anti-Sema3A antibody of the present invention is used for pharmaceutical use.
  • An example of the amino acid sequence of the heavy chain variable region used for the humanized antibody is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • Examples of the amino acid sequence of the light chain variable region used in the humanized antibody include the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 12 and 13.
  • variable regions In the amino acid sequences of these variable regions (SEQ ID NOs: 11 to 13), one or several amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted if the binding activity to the Sema3A protein is equivalent to that before modification. Also good.
  • the number of amino acids to be substituted, deleted, added and / or inserted is not particularly limited.
  • 1 to 21 may be mentioned, preferably 1 to 14 and more preferably 1 to 3.
  • the amino acids to be substituted, deleted, added and / or inserted are other than the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 above. It is desirable that The amino acid substitution in the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain and light chain is preferably the conservative amino acid substitution described above.
  • a chimeric antibody can be produced, for example, by substituting the constant region of an avian antibody having the heavy chain variable region and the light chain variable region having the amino acid sequences of the CDR1 to CDR3 with a constant region of a human antibody (for example, , Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.81, p.6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, Vol.312, p.604-608 (1984); al., Nature, Vol. 314, p.452-454 (1985)).
  • a human antibody for example, , Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.81, p.6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, Vol.312, p.604-608 (1984); al., Nature, Vol. 314, p.452-454 (1985)).
  • the nucleotide sequence of DNA encoding SEQ ID NO: 7, 8, 59, 67, 75, and 83, which is the amino acid sequence of the heavy chain variable region used in the tri-human chimeric antibody, is represented by SEQ ID NOs: 14, 15, 103, 111, 119. And 127, respectively.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding SEQ ID NO: 9, 10, 63, 71, 79, and 87, which is the amino acid sequence of the light chain variable region used in the tri-human chimeric antibody is represented by SEQ ID NO: 16, 17, 104, 112. , 120, and 128, respectively.
  • Known constant regions of human antibodies can be used.
  • a tri-human chimeric antibody can be produced by the following method.
  • DNA encoding a tri heavy chain variable region containing CDR having a predetermined amino acid sequence is prepared by chemical synthesis, biochemical cleavage, recombination, or the like.
  • the obtained heavy chain variable region DNA is ligated with a human heavy chain constant region DNA and incorporated into an expression vector to prepare a heavy chain expression vector.
  • a light chain expression vector is prepared in a similar manner.
  • host cells such as HEK293 cell line, CHO cell, and SP2 / 0 cell are cotransformed. After culturing the transformant, the target chimeric antibody is separated from the culture solution of the transformant.
  • amino acids in the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the CDR of the tri-human chimeric antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Research, Vol. 53). , P. 851-856 (1993)).
  • a humanized antibody can be prepared, for example, by grafting CDR1 to CDR3 containing each of the amino acid sequences onto the framework region of a human antibody (for example, Jones et al., Nature, Vol. 321, p.522). -525 (1986); Riechmann et al., Nature, Vol.332, p.323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, Vol.239, p.1534-1536 (1988)).
  • the nucleotide sequences of DNAs encoding heavy chain CDR1 (SEQ ID NOs: 1, 60, 68, 76, and 84) are shown in SEQ ID NOs: 18, 97, 105, 113, and 121, respectively.
  • the nucleotide sequences of DNAs encoding heavy chain CDR2 are shown in SEQ ID NOs: 19, 98, 106, 114, and 122, respectively.
  • the nucleotide sequences of DNAs encoding heavy chain CDR3 are shown in SEQ ID NOs: 20, 99, 107, 115, and 123, respectively.
  • the nucleotide sequences of DNAs encoding the light chain CDR1 are shown in SEQ ID NOs: 21, 100, 108, 116, and 124, respectively.
  • the nucleotide sequences of DNAs encoding the light chain CDR2 are shown in SEQ ID NOs: 22, 101, 109, 117, and 125, respectively.
  • the nucleotide sequences of DNAs encoding the light chain CDR3 are shown in SEQ ID NOs: 23, 102, 110, 118, and 126, respectively.
  • a humanized antibody can be produced by the following method.
  • a DNA encoding a heavy chain variable region in which CDRs 1 to 3 having a predetermined amino acid sequence and four human antibody-derived framework regions are linked in a predetermined order is prepared by chemical synthesis, biochemical cleavage, recombination, or the like.
  • mutations such as substitution, deletion and / or addition of amino acids in the framework region may be added so that each CDR of the humanized antibody can form an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al. Cancer Research, Vol. 53, p. 851-856 (1993)).
  • the obtained heavy chain variable region DNA is ligated with a human heavy chain constant region DNA and incorporated into an expression vector to prepare a heavy chain expression vector.
  • a light chain heavy chain expression vector is prepared. Using the obtained heavy chain expression vector and light chain expression vector, host cells such as Free Style 293 cell line (Life Technologies), CHO cells, SP2 / 0 cells and the like are cotransformed. After culturing the transformant, the desired humanized antibody is separated from the culture medium of the transformant.
  • SEQ ID NO: 24 shows the base sequence of DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, which is a heavy chain variable region used for humanized antibodies.
  • the nucleotide sequences of DNAs encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12 and 13, which are amino acid sequences of the light chain variable region used in the humanized antibody are shown in SEQ ID NOs: 25 and 26, respectively.
  • Known constant regions of human antibodies can be used.
  • the isotype of the anti-Sema3A antibodies of the present invention is not particularly limited, for example, IgG (IgG 1, IgG 2 , IgG 3, IgG 4), IgA (IgA 1, IgA 2), IgM, IgD, and IgE Is mentioned. Among these, IgG is preferable.
  • an antibody fragment thereof can also be used as long as it contains the antigen-binding region of the anti-Sema3A antibody.
  • antibody fragments include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, dsFv and the like. These antibody fragments can be prepared according to a conventionally known method.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment thereof of the present invention may be a conjugated antibody or conjugated antibody fragment bound to various compounds such as polyethylene glycol, radioactive substance, and toxin.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment thereof of the present invention may be modified in the sugar chain to which it is bound, or may be fused with other proteins as necessary.
  • compositions comprising the anti-Sema3A antibody or antibody fragment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can effectively inhibit the function of the Sema3A protein by the anti-Sema3A antibody or antibody fragment, and can exhibit various pharmacological effects.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment contained as an active ingredient may be any of the above-described embodiments (A) to (E), but the function of the Sema3A protein can be more effectively achieved.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment of the embodiment (A) is preferable from the viewpoint of inhibiting and exerting an excellent drug effect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention only needs to contain an effective amount of the anti-Sema3A antibody or antibody fragment, and may further contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive examples include surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, pH buffering agents, disintegrating agents, solubilizing agents, solubilizing agents, Examples include isotonic agents, binders, disintegrants, lubricants, diluents, and flavoring agents.
  • the carrier or additive generally used in the pharmaceutical composition can be used suitably.
  • the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention may be either oral or parenteral, specifically, oral administration; intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration. And parenteral administration such as nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration, transmucosal administration, and intraocular administration.
  • the formulation form of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately set according to the dosage form employed.
  • it when used for oral administration, it may be prepared into a pharmaceutical form such as powder, granule, capsule, syrup, suspension, etc.
  • a pharmaceutical form such as powder, granule, capsule, syrup, suspension, etc.
  • parenteral administration liquid, What is necessary is just to prepare in formulation forms, such as suspension, an emulsion, a spray agent, a suppository, and eye drops.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can effectively inhibit the function of the Sema3A protein by the action of the anti-Sema3A antibody or antibody fragment, it is useful for the prevention and / or treatment of diseases involving the Sema3A protein.
  • diseases involving the Sema3A protein include central or peripheral nervous system diseases, autoimmune diseases, inflammatory diseases, infectious diseases, allergic diseases, cancer and the like.
  • central or peripheral nervous system diseases include neuropathic pain, spinal cord injury, neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, advanced nuclear Paralysis, substantia nigra degeneration, Shy-Drager syndrome, olive bridge cerebellar atrophy, spinocerebellar degeneration, etc.).
  • neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, advanced nuclear Paralysis, substantia nigra degeneration, Shy-Drager syndrome, olive bridge cerebellar atrophy, spinocerebellar degeneration, etc.
  • autoimmune disease include rheumatoid arthritis, type I diabetes, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, systemic lupus erythematosus, and multiple sclerosis.
  • inflammatory diseases include sepsis, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, arthritis, hepatitis, spondyloarthritis, and Sjogren's syndrome.
  • infections include bacterial infections, encephalitis / meningitis, endocarditis, hepatitis C, influenza / severe acute respiratory syndrome (SARS), pneumonia, sepsis, burn, traumatic infection Symptoms and the like.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • allergic diseases include allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, bronchial asthma, food allergy, and the like.
  • cancer examples include colorectal cancer, colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, brain tumor, melanoma, renal cell cancer, leukemia, lymphoma, T cell lymphoma, gastric cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, endometrium
  • cancer examples include cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, liver cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, skin cancer, urinary tract cancer, prostate cancer, choriocarcinoma, pharyngeal cancer, and laryngeal cancer.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment can effectively suppress the nerve regeneration inhibitory ability of the Sema3A protein and can promote nerve regeneration and elongation. It is useful as a pharmaceutical composition for the purpose of regeneration elongation (ie, pharmaceutical composition for nerve regeneration elongation).
  • the pharmaceutical composition of the present invention is particularly useful as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating neurodegenerative diseases because the nerve itself can be regenerated and elongated by the anti-Sema3A antibody or antibody fragment. is there.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment may be used to treat sepsis or other diseases involving cytokine storms such as graft-versus-host disease (GVHD), acute respiratory distress syndrome (ARDS), avian influenza, smallpox, systemic inflammation syndrome (SIRS), drug-induced cytokine storms, etc., which exhibit excellent preventive and / or therapeutic effects on inflammatory diseases in which the immune mechanism fails due to infection or strong inflammation-induced stimulation, so prevention and / or treatment of these diseases It is also highly useful as a pharmaceutical composition.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • SIRS systemic inflammation syndrome
  • drug-induced cytokine storms etc.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment exerts an action of effectively suppressing the migration / invasion activity of cancer cells induced by Sema3A, and is excellent in prevention and / or prevention of pathological conditions related to cancer exacerbation and progression. Since it shows a therapeutic effect, it is highly useful as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating cancer diseases. Moreover, when using the pharmaceutical composition of this invention for the prevention and / or treatment use of cancer, you may use together with another anticancer agent. In particular, the anti-Sema3A antibody or antibody fragment can cancel the anti-cancer agent unresponsiveness of cancer cells induced by Sema3A and restore the drug sensitivity. In combination with cancer drugs, excellent cancer prevention and / or treatment effects can be demonstrated.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment and the other anticancer agent may be formulated in the same pharmaceutical composition, or The anti-Sema3A antibody or antibody fragment and another anticancer agent may be contained in separate pharmaceutical compositions to be formulated.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can suppress an increase in blood PAI-1 level by the action of the anti-Sema3A antibody or antibody fragment, it is also effective for the prevention and / or treatment of disseminated intravascular coagulation syndrome.
  • Basic diseases associated with disseminated intravascular coagulation syndrome include sepsis, acute leukemia, solid cancer, early placenta detachment, amniotic fluid embolism, trauma, burns, collagen disease, shock, aortic aneurysm, fulminant hepatitis, cirrhosis, acute Examples include pancreatitis, thrombosis, and severe infection.
  • the dosage and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention vary depending on the dosage form, the age and weight of the patient, the type of disease, the degree of symptoms, etc., and cannot be defined uniformly, but are usually the number for nerve regeneration. Since a period of several months or more is required from the day, it is preferable to administer as many times as necessary to suppress the activity of semaphorin during that period. For example, if an amount corresponding to 0.1 mg to 1000 mg, preferably 1 mg to 500 mg, in terms of weight of the anti-Sema3A antibody or antibody fragment is administered once per administration, the dose may be administered about once every 1 to 30 days. Good.
  • a sustained-release preparation can be used, or it can be administered in small amounts over a long period of time using an osmotic pump or the like.
  • the present invention provides a method for measuring Sema3A protein using the anti-Sema3A antibody or antibody fragment.
  • Sema3A in a sample is immunoassay using an antigen-antibody reaction between the anti-Sema3A antibody or antibody fragment and Sema3A in the sample.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment reacted with Sema3A in the sample may be any of the above-described aspects (A) to (E), but the Sema3A protein is measured with higher accuracy.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment of the embodiment (A) is preferable.
  • the sample is not particularly limited as long as Sema3A measurement is required.
  • Sema3A measurement is required.
  • biological specimens such as various tissue extracts.
  • the measurement method of the present invention may employ any immunoassay such as a sandwich method, a competition method, and an agglutination method.
  • a capture antibody that captures an antigen and a primary antibody that binds to the antigen bound to the capture antibody are used.
  • the sandwich method is employed in the measurement method of the present invention, the (A Among the anti-Sema3A antibodies or antibody fragments of the embodiments)) to (E), one embodiment may be used as a capture antibody, and the other embodiment may be used as a primary antibody.
  • the anti-Sema3A antibody or antibody fragment of the aspect (A) is used as a capture antibody, and the anti-Sema3A antibody or antibody fragment of the aspect (B) or (C) is used as a primary antibody. It is particularly preferable because it enables measurement of Sema3A protein with higher accuracy, particularly measurement of Sema3A protein in the presence of serum.
  • immunoassay includes enzyme immunoassay (ELISA), fluorescent immunoassay, radioisotope immunoassay, etc. depending on the type of label, and any of these is used in the measurement method of the present invention. May be. From the viewpoint of simplicity of measurement and rapidity, an enzyme immunoassay is preferable.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • fluorescent immunoassay fluorescent immunoassay
  • radioisotope immunoassay radioisotope immunoassay
  • Immunoassay using antigen-antibody reaction is known per se, and the measurement method of the present invention can be performed by a known technique according to the measurement principle of immunoassay and the type of label.
  • the present invention also provides a measurement kit used in the measurement method.
  • the measurement kit of the present invention contains the anti-Sema3A antibody or antibody fragment.
  • the measurement kit of the present invention may further contain other reagents and instruments depending on the measurement principle of immunoassay and the type of label.
  • a measurement plate, a chromogenic substrate solution, a reaction stop solution, a washing solution, a standard solution, and the like may be included in addition to the anti-Sema3A antibody or antibody fragment.
  • the sandwich method the anti-Sema3A antibody or antibody fragment used as a capture antibody may be provided in a state immobilized on a solid phase.
  • Example 1 Preparation of anti-Sema3A antibody (avian antibody, tri-mouse chimeric antibody) 1) Cell culture Cell culture of DT40 cells derived from chicken B cells was performed by the following method. The incubator was a CO 2 thermostatic chamber and cultured at 39.5 ° C. in the presence of 5% CO 2 . The medium used was IMDM medium (Life Technologies), and 10 vol% FBS, 1 vol% chicken serum, penicillin 100 units / mL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, 2-mercaptoethanol 55 ⁇ M were used.
  • IMDM medium Life Technologies
  • Trichostatin A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is stocked with DMSO dissolved at 5 mg / mL, and is diluted with a suitable medium so that the final concentration is 1.25 ng / mL or 2.5 ng / mL. Using.
  • ADLib Autonomous Diversifying Library
  • the cells bound to the antigen-fixed magnetic beads were suspended in 500 ⁇ L medium, added to 20 mL medium, dispensed 200 ⁇ L each into a 96-well plate, and cultured at 39.5 ° C.
  • the medium after this operation was IMDM medium (Life Technologies) supplemented with 10 vol% FBS, penicillin 100 units / mL, streptomycin 100 ⁇ g / mL, 2-mercaptoethanol 55 ⁇ M.
  • the plate was washed 5 times with 120 ⁇ L of ELISA wash buffer (PBS containing 0.05 wt% Tween 20), and 25 ⁇ L of each of the colony-derived culture supernatants selected by the above 2-2) was added and incubated at room temperature for 1 hour. After washing 5 times with 120 ⁇ L of ELISA washing solution, 25 ⁇ L of secondary antibody diluted 2000 times with blocking buffer was added and incubated at room temperature for 45 minutes. As the secondary antibody, anti-chicken IgM-HRP (BETHYL) was used. After washing 5 times with 120 ⁇ L of ELISA washing solution, 25 ⁇ L of TMB + (Dako) was added and incubated for 30 minutes. Thereafter, the reaction was stopped with 25 ⁇ L of 1N sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • ELISA wash buffer PBS containing 0.05 wt% Tween 20
  • 25 ⁇ L of secondary antibody diluted 2000 times with blocking buffer was added and incubated
  • Each strain is prepared to 1 ⁇ 10 3 cells / mL, 150 ⁇ L is added to 60 mL of medium, and 96 ⁇ l plate (Thermo Fisher Scientific Co.) is sprinkled at 200 ⁇ L / well and left for 7 days. Culture was performed. Twenty clones in which cell colonies were confirmed from each strain were screened for mouse Sema3A antibody-producing clones by the method described in 2-3). For each strain, 2 clones were selected from clones showing positive mouse Sema3A antibody production, and high-density culture was performed.
  • each clone was expanded and grown until the number of cells reached 4 ⁇ 10 7 .
  • the cells were cultured in CELLine CL-1000 (BD) using AIM-V medium (Life Technologies) containing 20 vol% chicken serum components.
  • the chicken serum component is antibody-removed chicken serum.
  • immunoglobulin was removed from chicken serum (Life Technologies) with 50% saturated ammonium sulfate as a precipitate, the supernatant was dialyzed against PBS buffer, and the volume increase caused by dialysis was concentrated by Centri Prep (Amicon). It was corrected with. After culturing for about 96 hours, the culture was continued until the survival rate reached 50% or less while measuring the cell survival rate. When the survival rate reached 50% or less, the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant whose titer was analyzed by ELISA was prepared as follows in order to remove serum-derived IgM and the like.
  • Chicken serum components were added to AIM-V serum-free medium (Life Technologies) at a concentration of 3%.
  • Cells were added to a concentration of about 1 ⁇ 10 6 cells / mL, and cultured for 2 days to obtain a culture supernatant.
  • a sense primer (primer 1: GAAGATCTAAGCTTGCCATGGCCCTGGCTCCCTCTCCTCCT (SEQ ID NO: 27)
  • a sequence of a tri-antibody ⁇ light chain variable region and a sequence of a mouse antibody light chain constant region
  • the light chain variable region gene was amplified by PCR using the included antisense primer (Primer 2: TGGCGAAGACTTCCGCTGGCCTAGGAC (SEQ ID NO: 28)).
  • a sense primer (primer 3: GAAGATCTAAGCTTACCATGAGCCCACTCG (SEQ ID NO: 29)) containing an avian antibody heavy chain variable region sequence
  • an antisense primer (primer 4) containing an avian antibody heavy chain variable region region and a mouse IgG2a antibody constant region.
  • the heavy chain variable region gene was amplified by PCR using CGATGGGGCTGTTGTTTTGGCGGAGGAGACGATGAACTTC (SEQ ID NO: 30)).
  • a sense primer (primer 5: AAGTCTCCGCATCATGCTCCCCTGTTCCA (SEQ ID NO: 31) containing the sense primer sequence of the avian antibody ⁇ light chain variable region and the sequence of the mouse antibody ⁇ light chain constant region. )
  • an antisense primer (primer 6: TATGCGGCCGCTTACTAGGAACAGTCA (SEQ ID NO: 32) was used to amplify the mouse light chain constant region gene.
  • a sense primer sequence containing the sense antibody sequence of the tri-antibody heavy chain variable region and the mouse IgG2a antibody heavy chain constant region sequence (Primer 7: GCCAAAAACAAGCCCCCATCGTCTCATCCACTGGGCCCCT (SEQ ID NO: 33))
  • the mouse heavy chain constant region gene was amplified by PCR using an antisense primer (Primer 8: AGATAGCGGCCGCTTATCATTTACCCGG (SEQ ID NO: 34)).
  • the tri-mouse chimeric antibody light chain gene was amplified by PCR using the amplified light chain variable region fragment and the light chain constant region fragment as a template and primers 1 and 6. Further, the tri-mouse chimeric antibody heavy chain gene was amplified by PCR using the amplified heavy chain variable region fragment and heavy chain constant region fragment as a template and primers 3 and 8.
  • the tri-mouse chimeric antibody light chain gene and the tri-mouse chimeric antibody heavy chain gene were treated with restriction enzymes HindIII and NotI, respectively, and then cloned into the HindIII-NotI site of the mammalian cell expression plasmid pCEP4 (Life Technologies).
  • the cloned antibody gene sequence was confirmed by sequencing using a DNA sequencer. Based on the determined nucleotide sequence, the amino acid sequences of the tri-mouse chimeric antibody light chain and the tri-mouse chimeric antibody heavy chain were translated.
  • the amino acid sequence of the finally determined tri-mouse chimeric antibody heavy chain is shown in SEQ ID NO: 35, and the amino acid sequence of the finally determined tri-mouse chimeric antibody light chain is shown in SEQ ID NO: 36.
  • the above-prepared plasmid was introduced into FreeStyle293 cell line (Life Technologies) by transfection using polyethyleneimine, and cultured for 7 days at 37 ° C., 8% CO 2 , shaking at 135 rpm. The supernatant was collected.
  • the concentration of anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody (IgG) contained in the culture supernatant was quantified by ELISA. From this culture supernatant, anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody was purified using a column prepared by filling Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) into Poly-Prep Chromatography Columns (BIO-RAD). did. The solvent was replaced with PBS buffer using a PD-10 column (GE Healthcare).
  • the specificity of the purified antibody for the antigen was measured by ELISA using PBS buffer. 2.5 ⁇ g / mL of the antigen was dispensed into 96 Well Maxi Sorp Plate (Nunc) and reacted at 4 ° C. overnight, and the plate was coated with the antigen (mouse Sema3A protein). In order to examine the specificity of the antibody, ovalbumin, rabbit IgG, and skim milk were also immobilized on the plate in the same manner as a negative control.
  • the plate was washed 3 times with 200 ⁇ L of a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20), 200 ⁇ L of a blocking solution (PBS containing 0.5% skim milk) was added, and the mixture was reacted for 30 minutes.
  • the plate was washed 3 times with 200 ⁇ L of the washing solution, and 100 ⁇ L of the culture supernatant containing the antibody was added and allowed to react for 1 hour.
  • the plate was washed 5 times with 200 ⁇ L of the washing solution, and 100 ⁇ L of horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG2a goat antibody (BETHYL) diluted 2000-fold with PBS buffer was added and reacted for 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • BETHYL horseradish peroxidase
  • the plate was washed 5 times with 200 ⁇ L of the washing solution, 100 ⁇ L of TMB + (Dako) was added, color reaction was performed for 5 minutes, and 100 ⁇ L of 1M sulfuric acid was added to stop the reaction. Absorbance at 450 nm was measured using a ⁇ Quant Biomolecular Spectrometer (Bio-Tek Instruments). The results are shown in FIG.
  • CDR sequence of the anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody obtained above was determined.
  • the CDR sequence was determined according to the method by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH publication, 91-3242). As a result, the following sequences were identified as the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of the heavy chain and the light chain.
  • Example 2 Preparation of anti-Sema3A antibody (humanized antibody, tri-human chimeric antibody) 1) Construction of humanized antibody (Humanized-1, Humanized-2) gene Clone No. 1 obtained in 4) of Example 1 above.
  • the design of the two humanized antibodies (Humanized-1 and Humanized-2) was made by changing the framework region of the variable region of the anti-Sema3A antibody produced by strain 4-2 to the amino acid of the framework region of the human antibody. I did it.
  • the genes encoding the designed heavy chain (Humanized-1 and 2) and the light chain amino acid sequence of Humanized-1 were synthesized in consideration of codon optimization for expression in human cells.
  • the light chain of Humanized-2 is a sense primer (primer A ⁇ : GAAGATCTAAGCTTCCCACTCATGGCAT (SEQ ID NO: 37)) and an antisense primer (primer B ⁇ : TGTTAATAGATCACTGTCACGGGGA (SEQ ID NO: 38)) using the light chain gene sequence of Humanized-1 as a template.
  • the product amplified by PCR with the sense primer (primer C ⁇ : TCCCGTGACAGTGATCTTATACAA (SEQ ID NO: 39)) and the antisense primer (primer D ⁇ : AGATAGCGGCCGCTTAGGAACATTC (SEQ ID NO: 40)) were used as the sense primer A ⁇ and the antisense primer D ⁇ . It was synthesized by assembling PCR.
  • a tri-human chimeric antibody gene was constructed as follows. Clone No. obtained in 4) of Example 1 above. 4-2 Using the cDNA of strain 4-2 as a template, a sense primer (primer E ⁇ : GAAGATCTAAGCTTCCCACCCATGCCCTGGCTCCTCT (SEQ ID NO: 41)) containing the sequence of the avian antibody ⁇ light chain variable region and the sequence of the avian antibody ⁇ light chain variable region and human antibody ⁇ light chain constant The light chain variable region gene was amplified by PCR using an antisense primer containing a normal region sequence (primer F ⁇ : CTTTGGGCTGGCCTAGGACGGGTCAGGGTTGT (SEQ ID NO: 42)).
  • a sense primer (primer G ⁇ : GAAGATCTAAGCTTCCCACCATGAGCCCACTCG (SEQ ID NO: 43)) containing an avian antibody heavy chain variable region sequence
  • an antisense primer (primer H ⁇ : GCCCCTTTGTTACTAGCGGAGAGAGACGATGAACTTC) containing a human antibody IgG1 constant region.
  • the heavy chain variable region gene was amplified by PCR using (SEQ ID NO: 44).
  • a sense primer (primer I ⁇ : GGCCAGCCCAAAGCCACACCTACCGTG (SEQ ID NO: 45)) containing the sequence of the human antibody ⁇ light chain constant region, using the synthesized humanized ⁇ light chain constant region DNA sequence as a template, and antisense
  • the human ⁇ light chain constant region gene was amplified by PCR using a primer (primer J ⁇ : AGATAGCGGCCGCTTATAGGAACATTCGGTT (SEQ ID NO: 46)).
  • a sense primer (primer K ⁇ : GCTAGTACAAAGGGGCCCCTCAGTGTTCCCACTTG (SEQ ID NO: 47)) containing a human IgG1 antibody heavy chain constant region DNA sequence as a template and a synthesized humanized human IgG1 antibody heavy chain constant region DNA sequence
  • the human IgG1 heavy chain constant region gene was amplified by PCR using (primer L ⁇ : AGATAGCGGCCGCTTTATTTTTCCAGGTGAGAG (SEQ ID NO: 48)).
  • the Trie human chimeric antibody light chain gene was amplified by PCR using primer E ⁇ and primer J ⁇ . Further, the trie human chimeric antibody heavy chain gene was amplified by PCR using the amplified heavy chain variable region fragment and heavy chain constant region fragment as a template and using the primer G ⁇ and the primer L ⁇ .
  • the amino acid sequence of the heavy chain of the finally determined humanized antibodies (Humanized-1 and Humanized-2) is shown in SEQ ID NO: 49, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 50.
  • the amino acid sequence of the heavy chain (SEQ ID NO: 49) includes the amino acid sequence of the variable region shown in SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequence of the light chain of the finally determined humanized antibody (Humanized-1) is shown in SEQ ID NO: 51
  • the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 52.
  • the amino acid sequence of the light chain (SEQ ID NO: 51) includes the amino acid sequence of the variable region shown in SEQ ID NO: 12.
  • amino acid sequence of the light chain of the finally determined humanized antibody (Humanized-2) is shown in SEQ ID NO: 53, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 54.
  • the amino acid sequence of the light chain (SEQ ID NO: 53) includes the amino acid sequence of the variable region shown in SEQ ID NO: 13.
  • amino acid sequence of the heavy chain of the finally determined tri-human chimeric antibody is shown in SEQ ID NO: 55, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 56.
  • the amino acid sequence of the heavy chain includes the amino acid sequence of the variable region shown in SEQ ID NO: 8.
  • amino acid sequence of the light chain of the finally determined tri-human chimeric antibody is shown in SEQ ID NO: 57, and the base sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 58.
  • the amino acid sequence of the light chain includes the amino acid sequence of the variable region shown in SEQ ID NO: 10.
  • the expression plasmid prepared above was introduced into the FreeStyle293 cell line (Life Technologies) by transfection using polyethyleneimine, and cultured for 7 days at 37 ° C., 8% CO 2 , shaking culture at 135 rpm. Thereafter, the culture supernatant was collected.
  • An anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-1) was prepared from a column prepared by filling Poly-Prep Chromatography Columns (BIO-RAD) with Protein A Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) from this culture supernatant. And Humanized-2) and Trihuman chimeric antibodies were purified. The solvent was replaced with PBS buffer using a PD-10 column (GE Healthcare).
  • the molecular extinction coefficient was calculated from the amino acid composition of the purified antibody, and the concentration was determined by the ultraviolet absorption method. 500 ng of the purified antibody was electrophoresed in a reduced or non-reduced state, and the gel was stained with CBB (Coomassie Brilliant Blue). The results are shown in FIG. FIG. 3 also shows the results of electrophoresis and CBB staining of the tri-mouse antibody obtained in Example 1 and the CL18M (+) tri-mouse chimeric antibody (control) in the same manner.
  • Example 3 Production of Anti-Sema3A Antibody (Tri-Mouse Chimeric Antibody) 1 described in Example 1 except that DT40 cells in which human Sema3A protein was used as an antigen and chicken IgM constant region was substituted with mouse IgG were used. ) And 2), antibody screening was performed to obtain 8 clones showing positive anti-Sema3A antibody production.
  • antibody screening was performed to obtain 8 clones showing positive anti-Sema3A antibody production.
  • anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody IgG
  • the heavy chain and light chain variable regions and CDR sequences of each anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody were determined.
  • the CDR sequence was determined according to the method by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH publication, 91-3242). The obtained results are shown in Tables 2 and 3.
  • Example 4 Production of anti-Sema3A antibody (avian antibody, tri-human chimeric antibody) 1) Production of avian antibody (IgM) Using mouse Sema3A protein as an antigen in the same manner as in 1) and 2) described in Example 1
  • Anti-Sema3A avian antibody is obtained by screening for antibodies, obtaining clones showing positive anti-Sema3A antibody production, using 240-40 and 255-72 strains among them, and producing and purifying anti-Sema3A antibodies (From clone No. 240-40 and clone No. 255-72).
  • the heavy and light chain variable regions and CDR sequences of each anti-Sema3A avian antibody were determined.
  • the CDR sequence was determined according to the method by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH publication, 91-3242). The results obtained are shown in Tables 4 and 5.
  • RNA was extracted from anti-Sema3A antibody-producing clones 240-40 and 255-72, and cDNA was obtained by reverse transcription using reverse transcriptase (SuperScriptIII, Life Technologies). Was synthesized.
  • a sense primer (primer M ⁇ : AGCTGTCTAGCGGCCCACCCATGGCCTGGGCTCCTCTC (SEQ ID NO: 91)
  • an antisense primer (primer N ⁇ : TCTGCGCGCGCGTAGACTCACCTAGGGGTTGTC) (sequence number using PCR)
  • PCR using a sense primer (primer O ⁇ : AGCTTGCTAGCGGCCCACCATGAGCCCACTCGTCCTCC (SEQ ID NO: 93)
  • an antisense primer (primer P ⁇ : TCTGGCGGCCCGTAGTAGACTCACCGAGGGAGACGATGAACTTC (SEQ ID NO: 94)) containing the sequence of the avian antibody heavy chain variable region was used.
  • the chain variable region gene was amplified.
  • SEQ ID NO: 95 for the heavy chain constant region and SEQ ID NO: 96 for the light chain constant region was prepared by total gene synthesis, and both were subjected to NotI treatment and EagI treatment, followed by vector pCEP4 (Life Technologies) ) To the NotI site.
  • variable region amplified above was cloned into the vector containing the constant region prepared as described above. Specifically, both the heavy chain constant region vector and the light chain constant region vector were treated with NotI, and the heavy chain variable region cDNA and the light chain variable region cDNA were respectively obtained using In-fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.). Connected.
  • the plasmid prepared above was introduced into the FreeStyle293 cell line (Life Technologies) by transfection using polyethyleneimine, and cultured with shaking at 37 ° C., 8% CO 2 , 135 rpm / min.
  • Protein A anti-Sema3A tri-human chimeric antibody (IgG1) (derived from clone No. 240-40 and clone No. 255-72) was obtained.
  • Example 5 Measurement of specificity for antigen About the tri-mouse chimeric antibody obtained in Example 1, and the humanized antibodies (Humanized-1 and Humanized-2) and the tri-human chimeric antibody obtained in Example 2. Specificity for the antigen was determined by antigen solid phase ELISA using PBS buffer. In addition, the antigen-specificity of the tri-mouse chimeric antibody obtained in Example 1 labeled with biotin was also measured. Further, as a negative control, the specificity to the antigen was similarly measured for CL18M (+) tri-mouse chimeric antibody. Specific measurement conditions are as follows.
  • the plate was washed 3 times with 50 ⁇ L of the washing solution, 20 ⁇ L of each antibody was added, and the mixture was reacted for 1 hour. Washed 5 times with 50 ⁇ L of the washing solution, horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-human ⁇ light chain goat antibody (SouthernBiotech) diluted 4000 times with PBS buffer, or horseradish peroxidase (HRP) -labeled 20 ⁇ L of anti-mouse IgG2a goat antibody (BETHYL) diluted 2000 times with PBS buffer, horseradish peroxidase (HRP) labeled streptavidin (Thermo) diluted 10,000 times with PBS buffer For 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • BETHYL horseradish peroxidase labeled streptavidin
  • the plate was washed 5 times with 50 ⁇ L of the washing solution, 20 ⁇ L of TMB + (Dako) was added, and the color reaction was carried out for 20 minutes. Absorbance at 450 nm was measured using Infinite M1000 (TECAN).
  • Example 6 Measurement of affinity for antigen-1 Clone No. obtained in Example 1
  • the affinity for the antigen was evaluated by competitive ELISA.
  • CL18M (+) tri-mouse antibody was similarly measured for affinity for the antigen. Specific measurement conditions are as follows.
  • Humanized antibodies (Humanized-1 and Humanized-2), tri-human chimera antibody, and tri-mouse chimera antibody were each serially diluted 2-fold to obtain a biotin-labeled anti-Sema3A tri-mouse chimera antibody at a final concentration of 60 ng / mL. Then, the mixture was reacted with an antigen solid phase plate washed 3 times with 50 ⁇ L of washing solution for 1 hour. The plate was washed 5 times with 50 ⁇ L of the washing solution, 20 ⁇ L of horseradish peroxidase (HRP) -labeled streptavidin (Thermo) diluted 10000-fold with PBS buffer was added, and reacted for 30 minutes.
  • HRP horseradish peroxidase
  • streptavidin Thermo
  • the plate was washed 5 times with 50 ⁇ L of the washing solution, 20 ⁇ L of TMB + (Dako) was added, and the color reaction was carried out for 20 minutes. Absorbance at 450 nm was measured using Infinite M1000 (TECAN).
  • Table 6 shows the results of calculating the 50% inhibitory concentration IC 50 ( ⁇ g / mL) for the antigen-antibody reaction of the anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody for each antibody.
  • IC 50 50% inhibitory concentration
  • Example 7 Measurement of affinity for antigen-2 Clone No. obtained in Example 1 4-2 derived tri-mouse chimeric antibody, and humanized antibody (Humanized-1 and Humanized-2) and tri-human chimeric antibody obtained in Example 2 were tested against the antigen using BIACORE (GE Healthcare). Affinity was evaluated. Specific conditions are as follows.
  • the binding time was 3 minutes, the divergence time was 4 minutes, and the sensorgram obtained from the reaction was analyzed with Langmuir binding model (BIAevaluation Version 4.1) (GE Healthcare) to calculate the KD value (dissociation constant). .
  • the KD value for human Sema3A was 3 to 4 nM for humanized antibodies (Humanized-1 and Humanized-2), and 14 to 15 nM for tri-human chimeric antibodies and tri-mouse chimeric antibodies.
  • the KD values for mouse Sema3A were 4-5 nM for humanized antibodies (Humanized-1 and Humanized-2), and 17-18 nM for tri-human chimeric antibody and tri-mouse chimeric antibody. Both humanized-1 and humanized-2 humanized antibodies had lower KD values for Sema3A than the chimeric antibodies, indicating that the affinity was improved by humanization.
  • Example 8 Measurement of Human Sema3A by Sandwich ELISA Using the anti-Sema3A antibody obtained in Examples 2 to 4, human Sema3A was measured by sandwich ELISA. Specific conditions are as follows.
  • the capture antibodies shown in Table 7 were diluted to 1/2000, dispensed into 384 Well Maxi Sorp Plate (Nunc) and reacted overnight at 4 ° C., and the plates were coated with the capture antibodies. After the reaction, each well was washed 3 times with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20, pH 7.2), 45 ⁇ L of blocking solution (PBS containing 1% bovine serum albumin, pH 7.2) was added, and 2 ml at room temperature was added. Reacted for hours. Subsequently, it was washed 3 times with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20, pH 7.2), and 20 ⁇ L of each antibody was added and allowed to react for 1 hour.
  • a washing solution PBS containing 0.05% Tween 20, pH 7.2
  • test samples recombinant human Sema3A-Fc chimeric protein (R & D systems, # 1250-S3-02J) serially diluted with PBS, or recombinant human Sema3A-Fc chimeric protein (R & D systems, # 1250- S3-02J) was serially diluted with human serum type AB (Sigma, # H4522) diluted 5-fold with PBS.
  • HRP horseradish peroxidase
  • GE # NA931 horseradish peroxidase
  • PBS pH 7.2
  • bovine serum albumin a washing solution
  • 20 ⁇ L of TMB Dako, # S1599 was added, and a color reaction was performed for 20 minutes.
  • the reaction was stopped by adding 20 ⁇ L of 1N sulfuric acid. Absorbance at 450 nm was measured using Infinite M1000 (TECAN).
  • the plate was washed 5 times with a washing solution (PBS containing 0.05% Tween 20, pH 7.2). Thereafter, 20 ⁇ L of TMB (Dako, # S1599) was added, and a color reaction was performed for 20 minutes. The reaction was stopped by adding 20 ⁇ L of 1N sulfuric acid. Absorbance at 450 nm was measured using Infinite M1000 (TECAN).
  • FIG. 6 shows the relationship between the antigen (Sema3A) and OD450 (absorbance at 450 nm) as a result of measuring test samples that do not contain serum under conditions 1 to 4 and 8.
  • FIG. 7 shows the relationship between the antigen (Sema3A) and OD450 (absorbance at 450 nm) as a result of measuring test samples containing serum under conditions 1 and 2. From these results, it was revealed that Sema3A can be measured by ELISA using the anti-Sema3A antibody obtained in Examples 1 to 4.
  • Example 2 humanized antibody (Humanized-2) obtained in Example 2 was used as a capture antibody, and the tri-mouse chimeric antibody obtained in Example 3 (derived from clone No. 165 and clone No. 165) was used as a primary antibody. 582 strain derived) (Conditions 1 and 2), it was also confirmed that Sema3A in serum could be measured with high accuracy and that Sema3A in biological samples could be measured. On the other hand, when a commercially available anti-Sema3A antibody was used (condition 9), Sema3A could not be detected.
  • Example 9 Collapse assay-1 1) Test method The dorsal root ganglion (DRG) of a chicken 7-day embryo was removed. The excised DRG was statically cultured at 37 ° C. for 16-20 hours in a PLL / laminin-coated 24-well dish containing 250 ⁇ L of NGF-containing medium, and it was confirmed that NGF-sensitive DRG neurons were extended. Separately, chicken-derived Sema3A protein (3 nM) and the anti-Sema3A avian antibody (culture supernatant) obtained in Example 1 (antibody concentration 10 ⁇ g / mL) or anti-Sema3A avian-mouse chimeric antibody (10 ⁇ g / mL).
  • DRG dorsal root ganglion
  • the containing mixture was preincubated on ice for 30 minutes. This mixed solution was added to the 24-well dish so that the final concentrations of chicken-derived Sema3A protein were 0, 0.1, and 0.3 nM, followed by static culture at 37 ° C. for 30 minutes. Next, after fixing with a 3.7% formalin solution, the growth cone formed at the tip of the axon of cultured neurons was visualized with Alexa488-conjugated Phalloidin. Under the fluorescence microscope, the ratio (%) of neurons in which the growth cone was collapsed among all NGF-sensitive DRG neurons was determined.
  • anti-Sema3A avian antibody or anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody an anti-rabbit IgG antibody or mouse IgG was used, and a regression assay was performed in the same manner as described above.
  • Example 10 Collapse assay-2 1) Test method A regression assay was performed in the same manner as in Example 9 except that human-derived Sema3A protein was used instead of chicken-derived Sema3A protein.
  • Example 11 Collapse assay-3 1) Test method The dorsal root ganglion (DRG) of a chicken 7-day embryo was removed. The excised DRG was statically cultured at 37 ° C. for 16-20 hours in a PLL / laminin-coated 24-well dish containing 250 ⁇ L of NGF-containing medium, and it was confirmed that NGF-sensitive DRG neurons were extended. Separately, a mixture containing human-derived Sema3A protein (3 nM) and anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-2) (culture supernatant) obtained in Example 2 (100 ⁇ g / mL as the antibody concentration) on ice was mixed with 30 ml. Pre-incubated for minutes.
  • DRG dorsal root ganglion
  • This mixed solution was added to the 24-well dish so that the final concentration of the human-derived Sema3A protein was 0, 0.05, 0.1, and 0.3 nM, followed by static culture at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the growth cone formed at the tip of the axon of cultured neurons was visualized with Alexa488-conjugated Phalloidin. Under the fluorescence microscope, the ratio (%) of neurons in which the growth cone was collapsed among all NGF-sensitive DRG neurons was determined.
  • a regression assay was performed in the same manner as described above using Human IgG-lambda instead of the anti-Sema3A humanized antibody.
  • FIG. 11 shows the results of the regression assay using the anti-Sema3A humanized antibody.
  • the anti-Sema3A humanized antibody has an action of suppressing the regression of the growth cone by the Sema3A protein. That is, it has been clarified that an anti-Sema3A antibody having CDRs 1 to 3 having a specific amino acid sequence can effectively suppress the ability of Sema3A protein to induce growth cone retraction even when humanized.
  • Example 12 Binding Assay for Human Sema3A 1) Test Method COS-7 cells transformed to express wild-type COS-7 cells or EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) -fused NRP1 (Neuropilin-1) (NRP1) Expression COS-7 cells) were prepared.
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • NRP1 Neuroropilin-1
  • alkaline phosphatase-conjugated human-derived Sema3A protein 0.1 nM
  • avian anti-Sema3A antibody culture supernatant obtained in Example 1
  • antibody concentration 10 ⁇ g / mL or anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody (10 ⁇ g) / Ml
  • 500 ⁇ L of this medium is preliminarily containing HBH buffer (20 mM sodium HEPES, pH 7.00, 0.05% by volume BSA, and 10% by volume FBS).
  • the anti-Sema3A antibody having CDRs 1 to 3 having a specific amino acid sequence can bind to the human-derived Sema3A protein and inhibit the binding between the human-derived Sema3A protein and NRP1.
  • Example 13 Binding assay for human Sema3F 1) Test method COS-7 cells transformed to express EGFP-fused NRP2 (Neuropilin-2) instead of NRP1-expressing COS-7 cells (NRP2-expressing COS-7 cells) ) And the alkaline phosphatase-conjugated human-derived Sema3A protein was used in place of the alkaline phosphatase-conjugated human-derived Sema3A protein, and a binding assay was performed in the same manner as in Example 12 above.
  • Example 14 Analysis of effect of anti-Sema3A antibody on cognitive function 1) Test material 1-1) A ⁇ (25-35) and A ⁇ (35-25) A ⁇ (25-35) (Amyloid ⁇ -Protein (25-35)) (Bachem, # H-1192) and A ⁇ (35-25) (Amyloid ⁇ -Protein (35-25)) (Bachem, # H-2964 ) was adjusted to 1 mg / mL with distilled water and incubated at 37 ° C. for 4 days to prepare an A ⁇ (25-35) solution and an A ⁇ (35-25) solution. By this operation, A ⁇ (25-35) aggregates and acquires cytotoxicity.
  • a ⁇ (35-25) is an inactive A ⁇ obtained by reversing the amino acid sequence of the active A ⁇ 25-35 and does not exhibit cytotoxicity even after the above operation. A ⁇ (35-25) was used as a negative control.
  • Anti-Sema3A Antibody The anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody prepared in Example 1 was prepared at 1 mg / mL with physiological saline to prepare an anti-Sema3A antibody solution.
  • normal IgG 1 mg / mL normal mouse IgG obtained from Calbiochem was used as the normal IgG solution.
  • mice Three-week-old mice (C57BL / 6J) purchased from Charles River Japan were used.
  • NERT novel object recognition task
  • a 3-week-old mouse was prepared, and handling work was carried out by placing the mouse on the experimenter's hand for 10 minutes a day for 2 weeks so that the mouse would get used to the experimenter.
  • the mice were divided into 5 groups shown in Table 8, and A ⁇ and antibody were administered into the ventricle under the conditions shown in Table 8. These solutions were administered 1 mm below the right from bregma.
  • a Teflon tube (Eicom) was connected to the tip of a microsyringe, and a 27 G injection needle (Terumo) with a 3.3 mm needle tip was inserted at the tip was used.
  • mice Three days after intraventricular administration, the mice were transferred to a 35 cm ⁇ 35 cm ⁇ 35 cm test cage and habituated to the test cage for 10 minutes.
  • the objects A and B were placed at predetermined positions in the test cage, and the time for accessing each object during 10 minutes was measured (acquisition trial). At this time, the time when the distance between the object and the nose tip was 1 cm or less was measured as the access time. Further, on the next day (5 days after administration), the object B was replaced with the new object C, and the access time during the 10-minute trial was measured (test trial).
  • the objects A, B, and C were different in shape and color. Specific shapes and colors of the objects A, B, and C are as follows.
  • Object A A base portion (green) extending in the horizontal direction and an extension portion (green) extending vertically from the center thereof are formed in a T-shape when viewed from the front.
  • the shapes of the base and the extension are both cuboids.
  • Object B Same as Object A except that the base is yellow and the extension is cylindrical and red.
  • Object C Same as Object A, except that the base is yellow and the extension is yellow with the shape cut out in a circular arc when viewed from the side.
  • the bases of the objects A, B, and C were placed on the bottom surface of the test cage, and the extensions were installed so as to extend upward.
  • the access rate to the object B of all groups was approximately 50%, and no significant difference was recognized between any groups. Therefore, it was shown that no impairment such as cognitive function was observed, and evaluation for memory acquisition in this experiment was possible.
  • the access rate to the object C was about 75% in the Intact group and the A ⁇ (35-25) administration group (negative control).
  • the access rate to the object C was limited to about 50%, and a decrease in the preference for the object C was recognized with a significant difference compared to the intact group (p ⁇ 0. 0001, vs. Intact group). This result indicates that the memory for object A was not acquired due to memory impairment due to administration of A ⁇ (25-35).
  • the access rate to the object C is about 75%
  • the A ⁇ (25-35) administration group and A ⁇ (25 ⁇ 35) Significant recovery compared to the + normal IgG administration group (p ⁇ 0.0001 vs. A ⁇ (25-35) administration group or A ⁇ (25-35) + normal IgG administration group).
  • the anti-Sema3A antibody having a CDR of a specific amino acid sequence has an effect of inhibiting the induction of memory impairment caused by A ⁇ .
  • An increase in Sema3A protein expression has already been observed in the postmortem brain of Alzheimer's disease patients, and Collaspin Response Mediator Protein (CRMP), which undergoes phosphorylation modification in the Sema3A signaling pathway, is one of Alzheimer's lesions. It is known that the fiber is highly phosphorylated in CRMP. Therefore, such a pharmacological effect is considered that the anti-Sema3A antibody blocks the Sema3A-CRMP signal.
  • CRMP Collaspin Response Mediator Protein
  • Example 15 Analysis of the effect of anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody on immune / inflammatory diseases
  • a Lipopolysaccharide inoculation model which is a pseudo-pathological model of sepsis
  • Test material 1-1) Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide (hereinafter LPS, Sigma, Lot number: 032M4082V) was prepared with physiological saline to a concentration of 6 mg / mL.
  • Tri-mouse anti-Sema3A antibody The anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody prepared in Example 2 was diluted to 5 mg / mL with physiological saline to obtain an anti-Sema3A antibody solution.
  • Non-specific tri-mouse chimeric antibody (IgG) (negative control chimeric antibody) prepared using an antibody library constructed from DT40 cells derived from chicken B cells, The solution was diluted to 5 mg / mL with saline to obtain a negative control chimeric antibody solution.
  • mice Male 6-week-old mice (C57BL / 6J) purchased from Charles River Japan were used.
  • Results Table 10 shows the results obtained.
  • Example 16 Analysis of the effect of an anti-Sema3A humanized antibody on immune / inflammatory diseases The effect of the anti-Sema3A humanized antibody obtained in Example 2 on an LPS-induced inflammatory disease model was analyzed in the same manner as in Example 12. did.
  • Test material 1-1) LPS LPS was prepared in the same manner as in Example 15.
  • Anti-Sema3A humanized antibody The anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-2) prepared in Example 2 was diluted with physiological saline to obtain an anti-Sema3A humanized antibody solution.
  • an anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-2) prepared to a concentration of 5 mg / mL was used, and in the anti-Sema3A humanized antibody 100 ⁇ g administration group, the anti-Sema3A humanized antibody (Humanized antibody) was used.
  • -2) prepared to a concentration of 1 mg / mL was used.
  • Human antibody for negative control group A non-specific human polyclonal antibody (human IgG POLYCLONAL Isotype Control; BioXCell, # BE0092) was diluted to 5 mg / mL with physiological saline, and a human antibody solution for negative control It was.
  • mice Male 6-week-old mice (C57BL / 6J) purchased from Charles River Japan were used.
  • Example 3 Statistical analysis Similar to Example 12, the unilateral Cochran-Armitage test was used for the ineffective and effective binarized survival rates, and three possible dose response types, namely linear increase, low dose saturation The dose response of the effect of improving the survival rate was determined by setting the contrast of the high dose rising type. In addition, the survival time extension effect was determined by applying a log-rank test.
  • Results Table 12 shows the survival rate of each group.
  • the survival rate 60%) was twice that of the negative control group (30%), and in the 500 ⁇ g group, the survival rate (80%) exceeded that of the 100 ⁇ g group. Observed. Survival was improved at both doses of anti-Sema3A humanized antibody and a dose-dependent trend was observed.
  • the anti-Sema3A humanized antibody also has the effect of suppressing the LPS-induced lethal inflammatory pathology and improving the survival rate, like the anti-Sema3A tri-mouse chimeric antibody shown in Example 15. Is clearly shown.
  • FIG. 17 shows the survival rate curve of the 500 ⁇ g administration group in which a clear survival rate improving effect was observed.
  • p 0.0303
  • Example 17 Analysis of the effect of anti-Sema3A humanized antibody on lethal inflammatory disease after induction of pathology Based on the results obtained in Example 16, the effect of anti-Sema3A humanized antibody was compared with that of LPS. The effect of treatment after inoculation and induction of pathology was determined.
  • Test material 1-1) LPS LPS was prepared in the same manner as in Example 15.
  • Anti-Sema3A humanized antibody The anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-2) prepared in Example 2 was diluted with physiological saline to obtain an anti-Sema3A humanized antibody solution.
  • Anti-Sema3A humanized antibody 500 ⁇ g, 250 ⁇ g, and 125 ⁇ g administration groups were prepared using anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-2) prepared at concentrations of 5, 2.5, and 1.25 mg / mL, respectively.
  • mice Male 6-week-old mice (C57BL / 6J) purchased from Charles River Japan were used.
  • Dose response types that can be taken by the four groups including the negative control group are as follows: (1) linear regression of practical dose, (2) linear increase, (3) medium dose rise, (4) high dose rise, (5 Seven types are envisaged: medium dose saturation, (6) low dose saturation, and (7) medium dose rising saturation.
  • the survival time extension effect was determined by applying a log-rank test.
  • Results Table 14 shows the survival rate of each group 4 days after administration.
  • the survival rate of the negative control group was 10%, but the survival rate of each group administered with anti-Sema3A humanized antibodies 125, 250, and 500 ⁇ g 1 hour after LPS inoculation was 30, 40, and 100%, respectively. A tendency to increase the survival rate with increasing dose was observed.
  • the anti-Sema3A humanized antibody 500 ⁇ g administration group a remarkable effect was confirmed that all 10 mice survived.
  • Table 15 shows the calculation result of the p value. Note that the number of display digits is unnecessarily increased in order to indicate the order of the p values.
  • FIG. 18 shows the survival rate curve of the anti-Sema3A humanized antibody 500 ⁇ g administration group in which all cases survived and a clear survival rate improvement effect was observed.
  • p ⁇ 0.0001 and the result satisfying the significance level was obtained. It became clear that the anti-Sema3A humanized antibody controls the pathological condition and exhibits a survival time-extending effect even after the onset of the lethal inflammatory pathological condition.
  • Example 18 Effect of anti-Sema3A humanized antibody on disseminated intravascular coagulation syndrome model mice
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • PAI-1 plasma Plasmogen activator inhibitor- 1
  • PAI-1 increases and suppresses the fibrinolytic system, causing multiple organ failure and becoming serious. Since the progression of disseminated intravascular coagulation syndrome can be prevented if the increase in blood PAI-1 level can be suppressed, the effect of anti-Sema3A humanized antibody on blood PAI-1 level fluctuation was examined.
  • Test material 1-1) LPS LPS (Sigma, Lot number: 102M4017V) was prepared in physiological saline to a concentration of 1.5 mg / mL.
  • Anti-Sema3A humanized antibody The anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-2) prepared in Example 2 was prepared in physiological saline to a concentration of 5 mg / mL.
  • mice Male 6-week-old mice (C57BL / 6J) purchased from Charles River Japan were used.
  • Test method 2-1 Group configuration After arrival, C57BL / 6J mice acclimated in the breeding room were divided into 5 mice per group, and the test groups shown in Table 16 were established.
  • LPS inoculation and antibody administration LPS was inoculated intraperitoneally to a dose of 15 mg / kg. The 5 mg / mL solution was administered from the 0.1 mL tail vein so that the antibody solution had an inoculum of 500 ⁇ g / mouse. In addition, physiological saline was inoculated intraperitoneally into the condition 1 group without LPS inoculation.
  • FIG. 19 shows the measurement results of blood PAI-1 concentration.
  • the blood PAI-1 level was very small, but the blood PAI-1 level after LPS inoculation showed a trend of increase from 1.5 hours, 3 hours and 9 hours later Later it was significantly increased compared to non-LPS treated animals (conditions 2, 5 and 8).
  • the anti-Sema3A humanized antibody (humanized-2) prepared in Example 2 has an action of suppressing an increase in blood PAI-1 level, which is one of the exacerbating factors of DIC. Became clear.
  • Example 19 Effect of anti-Sema3A humanized antibody on cancer cell migration ability It is known that the survival rate of cancer patients is greatly reduced by disseminated metastasis or distant metastasis that occurs after surgical treatment or chemotherapy remission is introduced. . Activation of cancer cell migration ability leads to disseminated metastasis and distant metastasis from cancer cells, confirming the effect of anti-Sema3A humanized antibodies on cancer malignant transformation induced by Sema3A did.
  • Example 2 Test method The anti-Sema3A humanized antibody (Humanized-2) prepared in Example 2 was used to evaluate the effect on cancer cell migration ability induced by Sema3A. Here, the effect was examined using cells of pancreatic cancer, for which the prognosis of patients with high Sema3A expression was poor.
  • the specific experimental method is as follows.
  • Fibronectin was diluted to 0.1 mg / mL with PBS buffer solution to prepare a fibronectin diluted solution, and 10 ⁇ L of this fibronectin diluted solution was applied to the lower surface of the filter of a 24-well chamber (Kurabo Chemotaxel chamber, 8 ⁇ m hole).
  • the migration chamber was produced by allowing to stand at room temperature for about 1 hour and drying.
  • the migration chamber prepared above was set in a 24-well plate, and 600 ⁇ L of DMEM medium containing 0.1% fetal bovine serum was added to the outer layer.
  • 2 ⁇ 10 5 cells / mL human pancreatic cancer cell line (MIAPaCa-2) and 200 ⁇ L of serum-free DMEM medium containing each additive component shown in Table 17 were added to the inner layer of the chamber at 37 ° C., 5% CO 2. Culture was performed in the presence of 2 for 4 hours. Thereafter, the chamber was taken out, the cancer cells in the inner layer of the chamber were removed by suction, and the cells remaining in the chamber were removed with a cotton swab moistened with PBS buffer.
  • the chamber was immersed in a cell staining solution (Diff-Quick, International Reagent) for 10 minutes or more, and then washed twice with ultrapure water and dried. After drying, the number of cells that migrated to the lower surface of the filter in the chamber was counted with a microscope.
  • a cell staining solution Diff-Quick, International Reagent
  • Example 20 Effect of anti-Sema3A humanized antibody on cancer cell invasion ability Cancer cells with activated migration ability melt and infiltrate the surrounding extracellular matrix, destroy the basement membrane, and migrate to blood vessels and lymphatic vessels Eventually, it will spread to distant organs. Suppression of the ability of cancer cells to infiltrate and metastasize leads to suppression of metastatic recurrence, and is thought to be useful for improving the survival rate of cancer patients. In addition to the inhibitory effect on Sema3A-induced increased migration ability examined in Example 19, the effect of anti-Sema3A humanized antibody on cancer cell invasion ability was also examined.
  • Test method Sema3A-inducible using an invasion chamber (BD, BioCoat TM 8 ⁇ m pore, # 354443) filled with an inner layer of an extracellular matrix (BD, Matrigel TM Growth Factor Reduced) from which growth factors have been removed.
  • BD BioCoat TM 8 ⁇ m pore, # 354443
  • BD Matrigel TM Growth Factor Reduced
  • human pancreatic cancer cell line MIAPaCa-2
  • human glioblastoma cell line U87MG
  • mouse-derived lung cancer cell line 3LL
  • the invasion chamber was set in a 24-well plate, and 0.1% fetal bovine serum (in the case of 3LL cells in the case of 3LL cells) was set on the outer layer.
  • 0.75 mL of DMEM medium containing 1% fetal bovine serum 125 ⁇ L of serum-free DMEM medium containing 2 ⁇ 10 5 cells / mL of cancer cells and additional components of each concentration shown in Table 18 are added to the inner layer,
  • the culture was performed at 37 ° C.
  • Example 19 the number of infiltrating cells that had moved to the lower surface of the filter was measured with a microscope.
  • FIG. 21 shows the results of measurement of infiltrating cells in each condition when using MIAPaCa-2 cells, FIG. 22 using U87MG cells, and FIG. 23 using 3LL cells.
  • Sema3A was added (condition 5)
  • the invasive ability of cancer cells was clearly enhanced in all cell lines compared to the Sema3A non-stimulated group (condition 1).
  • anti-Sema3A humanized antibody was added together with human Sema3A, invasion of cancer cells was suppressed to the same extent as Sema3A unstimulated in any cancer cell line (conditions 6-8). Under Sema3A non-stimulation conditions, no remarkable invasion suppressing action was observed except for 3LL (conditions 1 to 4).
  • FIG. 24 shows a microscopic image of infiltrated 3LL cells. Cancer cell invasion is marked in condition 5 where Sema3A is added compared to condition 1 where Sema3A is not added, and cancer induced by Sema3A in conditions 7 and 8 where anti-Sema3A humanized antibody is treated in the presence of Sema3A It can be visually confirmed that the invasive activity of the cells is clearly suppressed.
  • the anti-Sema3A antibody having a CDR of a specific amino acid sequence has an action of suppressing the invasive activity of cancer cells induced by Sema3A to the same extent as Sema3A non-stimulation. became.
  • Example 21 Effect of anti-Sema3A humanized antibody on anticancer agent unresponsiveness induced by Sema3A
  • pancreatic cancer has a very low 5-year survival rate among cancers. The cause of this is that pancreatic cancer tissue is poorly vascularized, but cancer cells proliferate and progress even under such nutrient-starvation conditions, often against anticancer drugs such as gemcitabine hydrochloride (GEM). It is mentioned that resistance is shown. That is, since overcoming anti-cancer drug unresponsiveness has become an important issue in the treatment of pancreatic cancer, Sema3A drug resistance induction under nutrient starvation conditions and its release action by anti-Sema3A humanized antibodies were evaluated.
  • GEM gemcitabine hydrochloride
  • a cell suspension obtained by suspending 4 ⁇ 10 4 cells / mL human pancreatic cancer cells (MIAPaCa-2) in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum was seeded in each well of a 96-well plate. After culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 24 hours, the medium was replaced with 100 ⁇ L of 0.1% fetal bovine serum-containing DMEM medium, and further cultured for 24 hours. Next, 100 ⁇ L of 0.1% fetal bovine serum-containing DMEM medium containing a predetermined amount of each of the components shown in Table 20 was added to each well and cultured for 2 days.
  • FIG. 25 shows the results of a pancreatic cancer cell proliferation determination test.
  • GEM condition 2 for condition 1
  • human Sema3A attenuated the sensitivity to GEM and induced drug unresponsiveness
  • This Sema3A-induced GEM resistance was relieved by treatment with anti-Sema3A humanized antibody 1-10 ⁇ g / mL and was shown to restore GEM sensitivity to the same extent as in the absence of Sema3A (as opposed to condition 3).
  • Conditions 4-6 On the other hand, in the negative control human antibody addition group, GEM sensitivity could not be recovered to the same extent as the Sema3A absence condition (conditions 7 to 9).
  • the humanized anti-Sema3A antibody prepared in Example 2 also has an action of canceling anticancer drug resistance induced by Sema3A under nutrient starvation conditions such as pancreatic cancer tissue. It became clear.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of heavy chain CDR1 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of heavy chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of heavy chain CDR3 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the light chain CDR1 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of light chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of the light chain CDR3 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of the light chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence of the light chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the humanized antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence of the light chain variable region of a humanized antibody (Humanized-1) (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 13 is the amino acid sequence of the light chain variable region of a humanized antibody (Humanized-2) (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 14 is the base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of the heavy chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 15 is the base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of the heavy chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 16 is the base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) of the light chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 17 is the base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of the light chain variable region of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 18 is a base sequence encoding the amino acid sequence of heavy chain CDR1 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 19 is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of heavy chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 20 is a base sequence encoding the amino acid sequence of heavy chain CDR3 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 21 is the base sequence encoding the amino acid sequence of light chain CDR1 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 22 is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of light chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 23 is a base sequence encoding the amino acid sequence of light chain CDR3 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No.
  • SEQ ID NO: 24 is the base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) of the heavy chain variable region of the humanized antibody (from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 25 is a base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) of the light chain variable region of a humanized antibody (Humanized-1) (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 26 is a base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 13) of the light chain variable region of a humanized antibody (Humanized-2) (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 27 is the base sequence of primer 1.
  • SEQ ID NO: 28 is the base sequence of primer 2.
  • SEQ ID NO: 29 is the base sequence of primer 3.
  • SEQ ID NO: 30 is the base sequence of the primer 4.
  • SEQ ID NO: 31 is the base sequence of the primer 5.
  • SEQ ID NO: 32 is the base sequence of the primer 6.
  • SEQ ID NO: 33 is the base sequence of the primer 7.
  • SEQ ID NO: 34 is the base sequence of the primer 8.
  • SEQ ID NO: 35 is the amino acid sequence of the heavy chain of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 36 is the amino acid sequence of the light chain of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 37 is the base sequence of the primer A ⁇ .
  • SEQ ID NO: 38 is the base sequence of the primer B ⁇ .
  • SEQ ID NO: 39 is the base sequence of the primer C ⁇ .
  • SEQ ID NO: 40 is the base sequence of the primer D ⁇ .
  • SEQ ID NO: 41 is the base sequence of the primer E ⁇ .
  • SEQ ID NO: 42 is the base sequence of the primer F ⁇ .
  • SEQ ID NO: 43 is the base sequence of the primer G ⁇ .
  • SEQ ID NO: 44 is the base sequence of the primer H ⁇ .
  • SEQ ID NO: 45 is the base sequence of the primer I ⁇ .
  • SEQ ID NO: 46 is the base sequence of the primer J ⁇ .
  • SEQ ID NO: 47 is the base sequence of the primer K ⁇ .
  • SEQ ID NO: 48 is the base sequence of the primer L ⁇ .
  • SEQ ID NO: 49 is the amino acid sequence of the heavy chain of a humanized antibody (Humanized-1 and Humanized-2) (from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 50 is the base sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of the humanized antibody (Humanized-1 and Humanized-2) (from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 51 is the amino acid sequence of the light chain of a humanized antibody (Humanized-1) (from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 52 is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of a humanized antibody (Humanized-1) (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 53 is the amino acid sequence of the light chain of a humanized antibody (Humanized-2) (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 54 is the base sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized antibody (Humanized-2) (from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 55 is the amino acid sequence of the heavy chain of a tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2).
  • SEQ ID NO: 56 is the base sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 57 is the amino acid sequence of the light chain of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 58 is the base sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of the tri-human chimeric antibody (derived from clone No. 4-2 strain).
  • SEQ ID NO: 59 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 60 is the amino acid sequence of heavy chain CDR1 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 61 is the amino acid sequence of heavy chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 62 is the amino acid sequence of heavy chain CDR3 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 63 is the amino acid sequence of the light chain variable region of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 64 is the amino acid sequence of light chain CDR1 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 65 is the amino acid sequence of light chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 66 is the amino acid sequence of light chain CDR3 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 67 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 582).
  • SEQ ID NO: 68 is the amino acid sequence of heavy chain CDR1 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 69 is the amino acid sequence of heavy chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 70 is the amino acid sequence of heavy chain CDR3 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
  • SEQ ID NO: 71 is the amino acid sequence of the light chain variable region of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 582 strain).
  • SEQ ID NO: 72 is the amino acid sequence of light chain CDR1 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 582).
  • SEQ ID NO: 73 is the amino acid sequence of light chain CDR2 of a tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 582).
  • SEQ ID NO: 74 is the amino acid sequence of light chain CDR3 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 582).
  • SEQ ID NO: 75 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the avian antibody (derived from clone No. 240-40).
  • SEQ ID NO: 76 is the amino acid sequence of heavy chain CDR1 of the avian antibody (from clone No. 240-40 strain).
  • SEQ ID NO: 77 is the amino acid sequence of heavy chain CDR2 of the avian antibody (from clone No.
  • SEQ ID NO: 78 is the amino acid sequence of heavy chain CDR3 of the avian antibody (derived from clone No. 240-40 strain).
  • SEQ ID NO: 79 is the amino acid sequence of the light chain variable region of the avian antibody (derived from clone No. 240-40).
  • SEQ ID NO: 80 is the amino acid sequence of light chain CDR1 of the avian antibody (derived from clone No. 240-40).
  • SEQ ID NO: 81 is the amino acid sequence of light chain CDR2 of the avian antibody (derived from clone No. 240-40).
  • SEQ ID NO: 82 is the amino acid sequence of light chain CDR3 of the avian antibody (derived from clone No. 240-40).
  • SEQ ID NO: 83 is the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 84 is the amino acid sequence of heavy chain CDR1 of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 85 is the amino acid sequence of heavy chain CDR2 of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 86 is the amino acid sequence of heavy chain CDR3 of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 87 is the amino acid sequence of the light chain variable region of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 88 is the amino acid sequence of light chain CDR1 of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 89 is the amino acid sequence of light chain CDR2 of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 90 is the amino acid sequence of light chain CDR3 of the avian antibody (derived from clone No. 255-72).
  • SEQ ID NO: 91 is the base sequence of the primer M ⁇ .
  • SEQ ID NO: 92 is the base sequence of the primer N ⁇ .
  • SEQ ID NO: 93 is the base sequence of the primer O ⁇ .
  • SEQ ID NO: 94 is the base sequence of the primer P ⁇ .
  • SEQ ID NO: 95 is the base sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the humanized antibody.
  • SEQ ID NO: 96 is the base sequence encoding the amino acid sequence of the light chain constant region of the humanized antibody.
  • SEQ ID NO: 97 is the base sequence encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 60) of the heavy chain CDR1 of the tri-mouse chimeric antibody (derived from clone No. 165 strain).
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Abstract

　本発明は、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、感染症等のＳｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患や播種性血管内凝固症候群を効果的に予防及び／又は治療できるセマフォリン３Ａタンパク質に対する抗体を提供することを主な課題とする。　特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ（配列番号１～６、６０～６２、６４～６６、６８～７０、７２～７４、７６～７８、８０～８２、８４～８６及び８８～９０）を備えた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、感染症等のＳｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患や播種性血管内凝固症候群を効果的に予防及び／又は治療でき、当該疾患に伴う症状が顕著に改善される。

Description

抗セマフォリン３Ａ抗体、並びにこれを用いたアルツハイマー病及び免疫・炎症性疾患の治療
　本発明は、セマフォリン３Ａタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療に有効である抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片に関する。更に、本発明は、当該抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を利用した医薬組成物に関する。更に、本発明は、抗セマフォリン３Ａ抗体又はその抗体断片を利用したセマフォリン３Ａタンパク質の測定方法に関する。
　アルツハイマー病（ＡＤ）は高齢者における痴呆（記憶の喪失）の最も一般的な形態である。現在使用されているアルツハイマー病の治療薬は、コリンエステラーゼ阻害薬による中枢神経系内におけるコリン作動性神経伝達の改善、あるいはΝ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）グルタミン酸受容体阻害薬による興奮毒性の抑制をその作用機序としているが、いずれも軽度の症状改善が認められるにとどまっている。原因となる神経変性の進行を抑制し、また改善できるような、根本的な治療法の開発が待たれている。
　脳中で見出されるＡＤの主たる病理学的傷害は、斑及び血管障害の形態のβアミロイドタンパク質の細胞外沈着物、並びに凝集型の過剰リン酸化されたτタンパク質の細胞内神経原線維変化に起因している。最近の証拠は、脳中の上昇されたβアミロイドレベルがτの病態に先行するのみならず、認識低下ともまた相関することを示している。最近の研究では、ＡＤにおけるβアミロイドの原因としての役割をさらに示唆しており、凝集型βアミロイドが細胞培養物中のニューロンに対し毒性を示すことが明らかにされている。
　βアミロイドタンパク質は、主として３９～４２アミノ酸のペプチドから構成され、プロテアーゼ、β及びγ－分泌酵素の連続的作用により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるより大きな前駆体タンパク質から産生される。稀とは言え、早期発症のＡＤの症例は、全βアミロイドタンパク質若しくはそのアイソフォームのいずれかの過剰産生につながるＡＰＰの遺伝子突然変異に起因している。さらに、ダウン症を伴う人は、ＡＰＰをコードする遺伝子を含有する余分な染色体を所有し、βアミロイドレベルが上昇しており、かつ加齢によって必ずＡＤを発症する。
　一方、セマフォリンは、神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質である。セマフォリン遺伝子は、その構造に基づいて８つの遺伝子サブファミリー、クラス、に分類されており、これまでに約２０種の分子種が知られている（非特許文献１）。しかしながら、多くのセマフォリンファミリーの大部分の機能について詳しいことはわかっていない。最も良く研究されているのがクラス３型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群であり、中でも最も良く研究されているのがセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ）（非特許文献２、３）である。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質は１０ｐＭという低濃度で短時間のうちに培養神経細胞の成長円錐退縮を誘発し、神経再生伸長を阻害することが知られている。
　近年、樹状細胞がＳｅｍａ３Ａタンパク質を感知してリンパ管に入り、リンパ節に移動していくことも報告されており、自己免疫疾患に関与していること（例えば、非特許文献４参照）や、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とその受容体であるＰｌｅｘｉｎ－Ａ４を介したシグナルが敗血症の発症において重要であることも明らかにされており（例えば、非特許文献６参照）、免疫・感染症等の病態形成においても深く関与していることが知られている。更に、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質は、がん細胞・組織から分泌され、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼのシグナル経路を阻止してＴ細胞の活性化を抑制することや、膵癌患者の癌組織でＳｅｍａ３Ａ発現の高い患者群では予後が不良であることも報告されており、がんの悪性化に関与していることも明らかにされている（例えば、非特許文献５、７参照）。
　また、播種性血管内凝固症候群（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ＤＩＣ）は、基礎疾患の悪化に伴って全身性かつ持続性の著しい凝固活性化が起こる重篤な病態である。主な症状は出血症状と臓器症状であるが、臨床症状が出現すると予後は極めて不良となることが知られている。ＤＩＣの誘因となる基礎疾患としては、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、重症感染症などが知られているが、Ｓｅｍａ３Ａとの関連については明らかにされていない。
　従来、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する抗体についても報告されている。例えば、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体等Ｓｅｍａ３Ａタンパク質活性阻害物質が、アルツハイマーやパーキンソン病の治療に有効であること（特許文献１参照）や、免疫疾患や炎症性疾患の治療に有効であること（特許文献２参照）が報告されている。しかしながら、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患について、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて予防及び／又は治療する際に、その薬効をより高めて発揮させるには如何なる構造の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が有効であるかについては明らかにされていない。
　また、このようにＳｅｍａ３Ａタンパク質が様々な病態に関与していることが知られており、その病態の解明や治療薬の開発をする上で、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質を高精度に測定する技術も不可欠となっている。
Ｃｅｌｌ　９７，５５１，１９９９ Ｃｅｌｌ　７５，２１７，１９９３ Ｃｅｌｌ　７５，１３８９，１９９３ Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１１，５９４－６００，２０１０ Ｂｌｏｏｄ　１０７，３３２１－３３２９，２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２０７，２９４３，２０１０ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　　１２１，２４２１－２４３３，２００７
ＷＯ０３／００７８０３号パンフレット ＷＯ２０１１／０６６２８４号パンフレット
　本発明は、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、がん、感染症等のＳｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患、及び播種性血管内凝固症候群を効果的に予防及び／又は治療できるＳｅｍａ３Ａタンパク質に対する抗体を提供することを課題とする。また、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療、並びに当該疾患に伴う症状の緩和を可能にする医薬組成物を提供することを課題とする。更に、本発明は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定に有効なＳｅｍａ３Ａタンパク質に対する抗体、及び当該抗体を用いてＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定する方法を提供することも課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を備えた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、アルツハイマー病等の神経変性疾患を効果的に予防及び／又は治療でき、当該神経変性疾患に伴う症状が顕著に改善されることを見出した。また、致死的な敗血症病態モデルにおいて、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が劇的な生存率の改善、及び生存期間延長効果を示した。加えて、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が、播種性血管内凝固症候群の増悪因子の一つである血中Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１（ＰＡＩ－１）を減少させることを見出した。更に、癌細胞の遊走・浸潤や薬剤抵抗性がＳｅｍａ３Ａにより誘導されるが、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によって癌細胞の遊走・浸潤や薬剤抵抗性を抑制できることから、がんの悪性化を抑えることもできることを見出した。
　また、特定のアミノ酸配列を有するＣＤＲを備えた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を利用したＥＬＩＳＡによって、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定が可能になることをも見出した。
　本発明はこのような知見に基づき、さらに研究を重ねた結果完成されたものである。即ち、本発明は、以下の態様の発明を提供する。
項１．　下記（Ａ）～（Ｅ）のいずれか示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体、又はその抗原結合領域を含む抗体断片：
（Ａ）　配列番号１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号１に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号３に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
　配列番号４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号５に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｂ）　配列番号６０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６１に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
　配列番号６４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６５に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｃ）　配列番号６８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６８に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
　配列番号７２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７３に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｄ）　配列番号７６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７７に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７８に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
　配列番号８０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８１に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
（Ｅ）　配列番号８４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８５に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
　配列番号８８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８８に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号９０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
項２．　キメラ抗体、ヒト化抗体、又はこれらの抗体断片である、項１に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項３．　神経再生促進のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項４．　アルツハイマー病の予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項５．　敗血症の予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項６．　がんの予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項７．　播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項８．　中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療のために使用される、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
項９．　項１～８のいずれかに記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を含有する、医薬組成物。
項１０．　神経再生促進用である、項９に記載の医薬組成物。
項１１．　アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１２．　敗血症の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１３．　がんの予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１４．　がんが、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、又は喉頭癌である、項１３に記載の医薬組成物。
項１５．　播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１６．　播種性血管内凝固症候群が、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、及び重症感染症よりなる群から選択される少なくとも１種を伴っている、項１５に記載の医薬組成物。
項１７．　中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療用である、項９に記載の医薬組成物。
項１８．　中枢又は末梢神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、又は神経変性疾患である、項１７に記載の医薬組成物。
項１９．　神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、又は脊髄小脳変性症である、項１８に記載の医薬組成物。
項２０．　自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、又は多発性硬化症である、項１７に記載の医薬組成物。
項２１．　炎症性疾患が、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節炎、肝炎、脊椎関節炎、又はシェーグレン症候群である、項１７に記載の医薬組成物。
項２２．　感染症が、細菌感染症、脳炎、髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群、肺炎、敗血症、火傷性、又は外傷性感染症である、項１７に記載の医薬組成物。
項２３．　アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、又は食物アレルギーである、項１７に記載の医薬組成物。
項２４．　神経再生が求められる患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、神経再生方法。
項２５．　アルツハイマー病を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法。
項２６．　敗血症を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、敗血症の治療方法。
項２７．　がんを罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、癌の治療方法。
項２８．　がんが、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、又は喉頭癌である、項２７に記載の治療方法。
項２９．　播種性血管内凝固症候群を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、播種性血管内凝固症候群の治療方法。
項３０．　播種性血管内凝固症候群が、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、及び重症感染症よりなる群から選択される少なくとも１種を伴っている、項２９に記載の播種性血管内凝固症候群の治療方法。
項３０．　中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、前記疾患の治療方法。
項３１．　神経再生用の医薬の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３２．　アルツハイマー病の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３３．　敗血症の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項
項３４．　がんの予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３５．　播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３６．　中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療剤の製造のための、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
項３７．項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を用いて免疫測定により検体中のＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定する工程を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法。
項３８．項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定用キット。
　本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によれば、アルツハイマー病等の神経変性疾患を効果的に予防及び／又は治療でき、当該神経変性疾患に伴う症状の緩和が顕著に改善することができる。本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の作用機序について限定的な解釈を望むものではないが、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に阻害することによりＳｅｍａ３Ａのシグナル伝達を阻害し、その結果、神経原線維変化における、リン酸化型Ｃｏｌｌａｐｓｉｎ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｍｅｄｉａｔｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＭＰ）の蓄積が阻害されるからであると考えられる。更に、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によれば、神経変性疾患以外の中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患等の予防及び／又は治療にも有効であり、とりわけ、敗血症のように感染や強い炎症誘発刺激により免疫力機構が破綻した炎症性疾患に対して卓越した予防及び／又は治療効果を示すことができる。また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体によれば、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される癌細胞の遊走・浸潤活性を効果的に抑制でき、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される抗がん剤不応答性を解除し、薬剤感受性を回復できるので、がんの予防及び／又は治療にも有効である。更に、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、血中ＰＡＩ－１量の増加を抑制する作用があり、播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療にも有効である。
　また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定にも使用することができる。とりわけ、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用することにより、血清存在下でもＳｅｍａ３Ａタンパク質を高精度に測定でき、生体由来検体中のＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定することも可能になる。
図１は、実施例１において、１３株の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンが得られたことを示すグラフである。 図２は、実施例１で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体のＳｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合特異性を評価した結果を示すグラフである。 図３には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体、及び抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－ヒトキメラ抗体を電気泳動してＣＢＢ染色した結果を示す。 図４には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体、及びトリ－ヒトキメラ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、ヒトＳｅｍａ３ＡとマウスＳｅｍａ３Ａ抗原に対する反応性を試験した結果を示す。 図５には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体、及びトリ－ヒトキメラ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、競合ＥＬＩＳＡ法により、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する親和性を測定した結果を示す。 図６には、実施例２～４で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて、血清を含まない試験サンプル中のＳｅｍａ３ＡをサンドイッチＥＬＩＳＡにて測定した結果を示す。 図７には、実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて、血清を含む試験サンプル中のＳｅｍａ３ＡをサンドイッチＥＬＩＳＡにて測定した結果を示す。 図８には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とトリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。 図９には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。 図１０には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とトリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。 図１１には、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を使用して退縮アッセイを行った結果を示す。 図１２には、トリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合アッセイを行った結果を示す。 図１３には、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体について、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合アッセイを行った結果を示す。 図１４には、トリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体について、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質に対する結合アッセイを行った結果を示す。 図１５は、実施例１０の結果を示す図である。図１５Ａは、Ｎｏｖｅｌ　Ｏｂｊｅｃｔ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｓｋの獲得試行時における、物体Ｂに対するアクセス率の結果を示すグラフである。図１５Ｂは、Ｎｏｖｅｌ　Ｏｂｊｅｃｔ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｓｋのテスト試行時における、物体Ｃに対するアクセス率の結果を示すグラフである。 図１６は実施例１５の結果を示す図である。抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を投与した３試験を併合し、その生存率曲線をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法によりプロットした図である。 図１７は実施例１６の結果を示す図である。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇを投与した群と陰性対照群について、生存率曲線をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法によりプロットした図である。 図１８は実施例１７の結果を示す図である。Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅをマウスに接種し、炎症病態を惹起した後、１時間後に抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇを投与した群と陰性対照群の生存率曲線をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法によりプロットした図である。 図１９は実施例１８の結果を示す図である。播種性血管内凝固症候群モデルマウスに与える抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響を確認するため、マウスのＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１血中濃度を測定した結果を示す図である。 図２０は実施例１９の結果を示す図である。ヒト膵癌細胞（ＭＩＡＰａＣａ－２）に対する細胞遊走能について、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質及び／又は抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が及ぼす影響を分析した結果である。 図２１は実施例２０の結果を示す図である。ヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ－２）を用いて細胞浸潤アッセイを行った結果を示す図である。 図２２は実施例２０の結果を示す図である。ヒト膠芽腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）を用いて細胞浸潤アッセイを行った結果を示す図である。 図２３は実施例２０の結果を示す図である。マウス由来肺癌細胞株（３ＬＬ）を用いて細胞浸潤アッセイを行った結果を示す図である。 図２４は実施例２０の結果を示す図である。マウス由来肺癌細胞株（３ＬＬ）を用いて細胞浸潤アッセイを行い、染色した浸潤細胞を顕微鏡観察した像である。 図２５は実施例２１の結果を示す図である。ヒト膵癌細胞（ＭＩＡＰａＣａ－２）におけるゲムシタビン塩酸塩の感受性について、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質及び／又は抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が及ぼす影響を分析した結果である。
１．抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体及びその抗体断片
　本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３が特定のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及びＣＤＲ１～ＣＤＲ３が特定のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。
　本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に特異的に結合し、当該タンパク質の機能を効果的に阻害することができる。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質は、セマフォリンのクラス３型サブファミリーに属する遺伝子にコードされており、神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制する因子として同定された内因性のタンパク質である。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質のアミノ酸配列は公知である（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号；ヒト由来はＮＰ＿００６０７１．１、マウス由来はＮＰ＿０３３１７８．２）。
　本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の好適な一態様として、以下の（Ａ）～（Ｅ）に示す重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むものが挙げられる。
（Ａ）　配列番号１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｂ）　配列番号６０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号６４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号６６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｃ）　配列番号６８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号７２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｄ）　配列番号７６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７７に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号７８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号８０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８２に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
（Ｅ）　配列番号８４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域；並びに配列番号８８に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８９に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
　また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、重鎖及び軽鎖におけるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（配列番号１～６、６０～６２、６４～６６、６８～７０、７２～７４、７６～７８、８０～８２、８４～８６及び８８～９０）は、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入されたＣＤＲ配列を含む抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性が改変前のＣＤＲ配列を含む抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体と同等又同等以上であることが望ましい。置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１つのＣＤＲにつき１～３個、更に好ましくは１～２個、特に好ましくは１個が挙げられる。また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体において、重鎖及び軽鎖におけるＣＤＲ１～３のアミノ酸配列の中で、１つのアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよく、２以上のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加及び／又は挿入されてもよい。
　また、前記ＣＤＲのアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換に関しては、類似アミノ酸による置換（即ち保存的アミノ酸置換）は、抗体の結合活性に変化をもたらさないことが予測されるため好適である。具体的には、アミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン
酸性アミノ酸：グルタミン酸、アスパラギン酸
中性アミノ酸：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、プロリン
　更に、前記中性アミノ酸は、極性側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するもの（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、アミド含有側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン）、硫黄含有側鎖を有するもの（メチオニン、システイン）、芳香族側鎖を有するもの（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基含有側鎖を有するもの（セリン、トレオニン、チロシン）、脂肪族側鎖を有するもの（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等に分類することもできる。
　１又は数個のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法については、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，　Ｖｏｌ．１５２，ｐ．２７１－２７５（１９９５）；　Ｚｏｌｌｅｒ　ＭＪ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１００，ｐ．４６８－５００（１９８３）、Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１２，ｐ．９４４１－９４５６（１９８４）；　Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０－３６７（１９８７）；　Ｋｕｎｋｅｌ　ＴＡ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８２，ｐ．４８８－４９２（１９８５）等）が知られており、当該部位特異的変異誘発法を用いてＣＤＲのアミノ酸配列にアミノ酸置換を行うことができる。また、他のアミノ酸に置換する方法としては、ＷＯ２００５／０８０４３２に記載されているライブラリー技術が挙げられる。
　本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体において、可変領域中のフレームワーク領域、及び定常領域のアミノ酸配列は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性に実質的な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。
　前記ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（配列番号１～６、６０～６２、６４～６６、６８～７０、７２～７４、７６～７８、８０～８２、８４～８６及び８８～９０）は、トリ抗体由来であり、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、トリ抗体であってもよいが、好ましくはキメラ抗体及びヒト化抗体が挙げられる。
　キメラ抗体とは、互いに由来の異なる領域同士を連結した抗体である。本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体をキメラ抗体にする場合、医薬組成物や各種疾患の治療剤として用いる場合には、トリ抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域から構成されるトリ－ヒトキメラ抗体ないしはトリ抗体由来の可変領域とマウス抗体由来の定常領域から構成されるトリ－マウスキメラ抗体であることが望ましく、トリ－ヒトキメラ抗体がより好ましい。また、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の免疫測定及び測定用キットに用いる場合には、トリ‐ヒトキメラ抗体、トリ－マウスキメラ抗体の他、トリ抗体由来の可変領域とウサギ抗体由来の定常領域から構成されるトリ－ウサギキメラ抗体やトリ抗体由来の可変領域とヤギ抗体由来の定常領域から構成されるトリ－ヤギキメラ抗体も使用できる。トリ－ヒトキメラ抗体、トリ－マウスキメラ抗体、トリ－ウサギキメラ抗体又はトリ－ウサギキメラ抗体に用いられる重鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号７、８、５９、６７、７５、及び８３に示すアミノ酸配列が挙げられる。また、トリ－ヒトキメラ抗体、トリ－マウスキメラ抗体、トリ－ウサギキメラ抗体又はトリ－ウサギキメラ抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号９及び１０、６３、７１、７９、８７に示すアミノ酸配列が挙げられる。これらの可変領域のアミノ酸配列（配列番号７～１０、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、及び８７）は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性が改変前と同等又は同等以上であれば、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、重鎖可変領域（配列番号７、８、５９、６７、７５、８３）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号９、１０、６３、７１、７９、８７）において、１～２１個、好ましくは１～１４個、更に好ましくは１～３個が挙げられる。なお、重鎖可変領域（配列番号７、８、５９、６７、７５、８３）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号９、１０、６３、７１、７９、８７）において、置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸は、前記ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列以外の領域であることが望ましい。また、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換は、前記する保存的アミノ酸置換であることが望ましい。
　また、ヒト化抗体とは、非ヒト由来のＣＤＲ配列をヒト抗体のフレームワーク領域上に移植したものであり、非ヒト由来抗体のＣＤＲとヒト抗体由来のフレームワーク領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成される抗体である。ヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を医薬用途に使用する場合に好適である。ヒト化抗体に用いられる重鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号１１に示すアミノ酸配列が挙げられる。また、ヒト化抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列の一例としては配列番号１２及び１３に示すアミノ酸配列が挙げられる。これらの可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１～１３）は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対する結合活性が改変前と同等であれば、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、重鎖可変領域（配列番号１１）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号１２、１３）において、１～２１個、好ましくは１～１４個、更に好ましくは１～３個が挙げられる。なお、重鎖可変領域（配列番号１１）及び／又は軽鎖可変領域（配列番号１２、１３）において、置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸は、前記ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列以外の領域であることが望ましい。また、重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換は、前記する保存的アミノ酸置換であることが望ましい。
　キメラ抗体は、例えば、前記各ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するトリ抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８１，ｐ．６８５１－６８５５（１９８４）；　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐ．６０４－６０８（１９８４）；　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１４，ｐ．４５２－４５４（１９８５）等）。トリ－ヒトキメラ抗体に用いられる重鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号７、８、５９、６７、７５、及び８３をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号１４、１５、１０３、１１１、１１９、及び１２７にそれぞれ示す。また、トリ－ヒトキメラ抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号９、１０、６３、７１、７９、及び８７をコードするＤＮＡの塩基配列を、配列番号１６、１７、１０４、１１２、１２０、及び１２８にそれぞれに示す。ヒト抗体の定常領域については公知のものを用いることができる。具体的には、以下の方法により、トリ－ヒトキメラ抗体を作製することができる。
　まず、所定のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むトリ重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、化学合成、生化学的切断、再結合等により作製する。得られた重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことにより重鎖発現ベクターを作製する。同様の方法で、軽鎖発現ベクターを作製する。得られた重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、ＨＥＫ２９３細胞株、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の宿主細胞を共形質転換する。形質転換体を培養した後、形質転換体の培養液から目的のキメラ抗体を分離する。また、トリ－ヒトキメラ抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域中のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，　Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．８５１－８５６（１９９３））。
　また、ヒト化抗体は、例えば、前記各アミノ酸配列を含むＣＤＲ１～３をヒト抗体のフレームワーク領域上に移植することにより作製できる（例えば、Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１，ｐ．５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２，ｐ．３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９，ｐ．１５３４－１５３６（１９８８））。重鎖ＣＤＲ１（配列番号１、６０、６８、７６、及び８４）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１８、９７、１０５、１１３、及び１２１に示す。重鎖ＣＤＲ２（配列番号２、６１、６９、７７、及び８５）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号１９、９８、１０６、１１４、及び１２２に示す。重鎖ＣＤＲ３（配列番号３、６２、７０、７８、及び８６）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２０、９９、１０７、１１５、及び１２３に示す。軽鎖ＣＤＲ１（配列番号４、６４、７２、８０及び８８）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２１、１００、１０８、１１６、及び１２４に示す。軽鎖ＣＤＲ２（配列番号５、６５、７３、８１、及び８９）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２２、１０１、１０９、１１７、及び１２５に示す。軽鎖ＣＤＲ３（配列番号６、６６、７４、８２、及び９０）をコードするＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号２３、１０２、１１０、１１８、及び１２６に示す。具体的には、以下の方法により、ヒト化抗体を作製することができる。
　所定のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１～３と、４つのヒト抗体由来のフレームワーク領域を所定の順に連結した重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、化学合成、生化学的切断、再結合等により作製する。ここで、ヒト化抗体の各ＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成できるようにフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失及び／又は付加等の変異を加えていてもよい（Ｓａｔｏ，　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．８５１－８５６（１９９３））。得られた重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことにより重鎖発現ベクターを作製する。同様に、軽鎖重鎖発現ベクターを作製する。得られた重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の宿主細胞を共形質転換する。形質転換体を培養した後、形質転換体の培養液から目的のヒト化抗体を分離する。ヒト化抗体に用いられる重鎖可変領域である配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２４に示す。また、ヒト化抗体に用いられる軽鎖可変領域のアミノ酸配列である配列番号１２及び１３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２５及び２６にそれぞれ示す。ヒト抗体の定常領域については公知のものを用いることができる。
　また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体のアイソタイプについては、特に制限されないが、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4）、ＩｇＡ（ＩｇＡ1、ＩｇＡ2）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好適である。
　また、本発明では、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の抗原結合領域を含む限り、その抗体断片を使用することもできる。このような抗体断片として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ等が挙げられる。これらの抗体断片は、従来公知の方法に従って作製することができる。
　本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又はその抗体断片は、ポリエチレングリコール、放射性物質、トキシン等の各種化合物と結合したコンジュゲート抗体又はコンジュゲート抗体断片であってもよい。また、本発明の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又はその抗体断片は、必要に応じて、結合している糖鎖を改変したり、他のタンパク質が融合していてもよい。
２．医薬組成物
　本発明は、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片によって、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に阻害することができ、各種薬理効果を奏することができる。
　本発明の医薬組成物において、有効成分として含有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、前記（Ａ）～（Ｅ）の態様のいずれであってもよいが、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能をより一層効果的に阻害させて卓越した薬効を奏させるという観点から、好ましくは前記（Ａ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を有効量含んでさえあればよく、その他に、医薬的に許容される担体又は添加剤を含むものであってもよい。このような担体又は添加剤としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、矯味剤等が挙げられる。更にこれらに制限されず、その他に、医薬組成物において一般的に使用されている担体又は添加剤が適宜使用できる。
　また、本発明の医薬組成物の投与形態については、経口的又は非経口的のいずれであってもよく、具体的には、経口投与；静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与、経粘膜投与、眼内投与等の非経口投与が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の製剤形態については、採用する投与形態に応じて、その製剤形態を適宜設定することができる。例えば、経口投与で使用される場合には、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の製剤形態に調製すればよく、非経口投与で使用される場合には、液剤、懸濁液、エマルジョン、スプレー剤、坐剤、点眼剤等の製剤形態に調製すればよい。
　本発明の医薬組成物は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の作用により、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に阻害できるので、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療に有用である。Ｓｅｍａ３Ａタンパク質が関与する疾患としては、例えば、中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、アレルギー性疾患、がん等が挙げられる。中枢又は末梢神経系疾患としては、具体的には、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、脊髄小脳変性症等）等が挙げられる。自己免疫疾患としては、具体的には、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症等が挙げられる。炎症性疾患としては、具体的には、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節炎、肝炎、脊椎関節炎、シェーグレン症候群等が挙げられる。感染症としては、具体的には、細菌感染症、脳炎／髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ／重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、肺炎、敗血症、火傷性、外傷性感染症等が挙げられる。アレルギー性疾患としては、具体的には、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、食物アレルギー等が挙げられる。がんとしては、具体的には、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌等が挙げられる。
　特に、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の神経再生阻害能を効果的に抑制でき、神経の再生及び伸長を促進することが可能であることから、本発明の医薬組成物は、神経再生伸長を目的とした医薬組成物（即ち、神経再生伸長用医薬組成物）として有用である。また、本発明の医薬組成物は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片によって神経そのものを再生及び伸長させることが可能であるので、神経変性疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物として特に有用である。
　更に、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、敗血症や、他のサイトカインストームを伴う疾患、例えば移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、トリインフルエンザ、天然痘、全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）、薬物誘発性サイトカインストーム等、感染や強い炎症誘発刺激によって免疫機構が破綻する炎症性疾患に対して卓越した予防及び／又は治療効果を示すので、これらの疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物としての有用性も高い。
　また、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される癌細胞の遊走・浸潤活性を効果的に抑制する作用を発揮し、癌の憎悪・進展に関する病態に対して卓越した予防及び／又は治療効果を示すので、癌の疾患の予防及び／又は治療用の医薬組成物としての有用性も高い。また、本発明の医薬組成物を癌の予防及び／又は治療用途に使用する場合には、他の抗癌剤と併用してもよい。特に、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導されるがん細胞の抗がん剤不応答性を解除し、薬剤感受性を回復できるので、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を他の抗がん剤と併用することによって卓越したがんの予防及び／又は治療効果を示すことができる。前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を他の抗がん剤と併用する場合、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片と他の抗がん剤を同一の医薬組成物に含有させて製剤化してもよく、また前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片と他の抗がん剤を別々の医薬組成物に含有させて製剤化してもよい。
　また、本発明の医薬組成物は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の作用により、血中ＰＡＩ－１量の増加を抑制できるので、播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療にも有効である。播種性血管内凝固症候群を伴う基礎疾患としては、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、血栓症、重症感染症等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物の投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢や体重、疾患の種類や症状の程度等によって異なり、一律に規定することはできないが、神経の再生には通常数日から数ヶ月以上の期間を要することから、その間セマフォリンの活性を抑制するために必要な回数投与することが好ましい。例えば、１回の投与当たり、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の重量換算で０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～５００ｍｇに相当する量を、１～３０日に１回程度の頻度で投与すればよい。なお、投与回数を減らすために徐放性製剤を用いたり、オスモティックポンプ等で長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。そして、これらのいずれの投与方法においても、作用部位においてＳｅｍａ３Ａタンパク質の活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。
３．Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法及び測定キット
　本発明は、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を利用したＳｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法を提供する。本発明の測定方法では、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片と、検体中のＳｅｍａ３Ａとの抗原抗体反応を利用して検体中のＳｅｍａ３Ａを免疫測定する。
　本発明の測定方法では、検体中のＳｅｍａ３Ａと反応させる抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、前記（Ａ）～（Ｅ）の態様のいずれであってもよいが、より高精度にＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定するという観点から、好ましくは前記（Ａ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片が挙げられる。
　検体としては、Ｓｅｍａ３Ａの測定が求められるものであることを限度として特に制限されないが、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、関節液、リンパ液、羊水、乳汁、各種組織液、海馬抽出液、各種組織抽出液等の生体由来検体が挙げられる。
　本発明の測定方法は、サンドイッチ法、競合法、凝集法等のいずれの免疫測定を採用してもよい。サンドイッチ法では、抗原を捕獲するキャプチャー抗体と、当該キャプチャー抗体に結合した抗原に対して結合する一次抗体を使用するが、本発明の測定方法において、サンドイッチ法を採用する場合には、前記（Ａ）～（Ｅ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片の中から、１つの態様のものをキャプチャー抗体として使用し、他の態様のものを一次抗体として使用すればよい。サンドイッチ法を採用する場合、前記（Ａ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片をキャプチャー抗体として使用し、前記（Ｂ）又は（Ｃ）の態様の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を一次抗体として使用すると、より一層高精度なＳｅｍａ３Ａタンパク質の測定、とりわけ血清存在下でのＳｅｍａ３Ａタンパク質の高精度な測定が可能になるため、特に好適である。
　また、免疫測定は、標識の種類に応じて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、放射性同位体免疫測定法等があるが、本発明の測定方法では、これらのいずれを使用してもよい。測定の簡易性や迅速性の観点から、好ましくは酵素免疫測定法が挙げられる。
　抗原抗体反応を利用した免疫測定自体は公知であり、本発明の測定方法は、免疫測定の測定原理や標識の種類に応じた公知の手法で行うことができる。
　更に、本発明は、前記測定方法に使用される測定キットについても提供する。本発明の測定キットには、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片が含まれる。
　また、本発明の測定キットには、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片以外に、更に免疫測定の測定原理や標識の種類に応じて、他の試薬や器具が含まれていてもよい。例えば、酵素免疫測定法を選択する場合、前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片以外に、測定プレート、色原性基質溶液、反応停止液、洗浄液、標準溶液等が含まれていてもよい。また、サンドイッチ法を採用する場合には、キャプチャー抗体として使用される前記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片は、固相に固定化された状態で提供されてもよい。
　以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されて解釈されるものではない。
実施例１：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（トリ抗体、トリ－マウスキメラ抗体）の作製
１）細胞培養
　ニワトリＢ細胞由来のＤＴ４０細胞の細胞培養を以下の方法で行った。培養機はＣＯ2恒温槽を用い、５％のＣＯ2存在下で３９．５℃で培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）を用い、１０容量％ＦＢＳ、１容量％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、２－メルカプトエタノール５５μＭを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬに溶解したものをストックとし、最終濃度が１．２５ｎｇ／ｍＬ又は２．５ｎｇ／ｍＬとなるように、適宜培地で希釈して用いた。
２）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生細胞取得
　横浜市立大学医学部分子薬理神経生物学教室で所有しているマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質発現株を用いて作製したマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質を抗原として、Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ　Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＡＤＬｉｂ）システム（カイオム・バイオサイエンス社）を用いて抗体産生細胞を得た。具体的には以下の実験プロセスを経ている。
２－１）抗原固定磁気ビーズの作製
　Ｈｉｓ－ｔａｇ用磁気ビーズへのマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質の固定は、以下の手順に従って実施した。磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ　ＴＡＬＯＮ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、磁気スタンドはＤｙｎａｌ　ＭＰＣ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。
　ビーズ２２．５μＬを４５μＬのＰＢＳ緩衝液で３回洗った後、ＰＢＳ緩衝液中で６．１μｇのマウスＳｅｍａ３Ａタンパク質と４℃で１０分間、回転により攪拌しながら反応させた。その後４５μＬのＢｕｆｆｅｒＣ（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液）で４回洗浄した後、ＢｕｆｆｅｒＣ４５μＬに懸濁した。
２－２）抗原固定磁気ビーズによる抗体産生クローンの選択
　トリコスタチンＡ１．２５ｎｇ／ｍＬ又は２．５ｎｇ／ｍＬを含むＩＭＤＭ培地で５週間以上培養した野生型ＤＴ４０細胞約８×１０8個を１×１０8個ずつ８分割し、それぞれを洗浄液（１重量％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液）１０ｍＬで１回、更に同洗浄液１ｍＬで１回洗浄した後、１ｍＬの洗浄液中において２－１）で作製した抗原固定磁気ビーズ５×１０6個とそれぞれ混合し、４℃で３０分間、穏やかに回転させつつインキュベートした。その後ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ　ｍＬ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して、１．７ｍＬの洗浄液で３分、３回洗浄した。最後に、抗原固定磁気ビーズに結合した細胞を５００μＬ培地に懸濁し、これを２０ｍＬの培地に加えたのち、９６穴プレートに２００μＬずつ分注し、３９．５℃で培養した。この作業以降の培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に、１０容量％ＦＢＳ、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ，２－メルカプトエタノール５５μＭを加えたものを使用した。
２－３）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンのスクリーニング
　ＥＬＩＳＡは直接固相法で、以下の手順に従って行った。前記２－２）のステップの６日後、マウスＳｅｍａ３Ａタンパク質を２．５μｇ／ｍＬで３８４ｗｅｌｌ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社）に２０μＬずつ分注し一晩放置した。なお、抗体の特異性を検討するために、ネガティブコントロールとして、オボアルブミン（ＯＡ）、ウサギＩｇＧ（ｒＩｇＧ）も同様にプレートに固定した。翌日プレートの中身を捨て、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液）４５μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５重量％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）１２０μＬで５回洗浄し、前記２－２）で選別して生じたコロニー由来の培養上清それぞれ２５μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄液１２０μＬで５回洗浄したのち、二次抗体をブロッキングバッファーで２０００倍に希釈したものを２５μＬ入れ、室温で４５分インキュベートした。なお、二次抗体はａｎｔｉ－ｃｈｉｃｋｅｎ　ＩｇＭ－ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）を使用した。ＥＬＩＳＡ洗浄液１２０μＬで５回洗浄したのち、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）を２５μＬ入れ、３０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸２５μＬで停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　この結果、図１に示すように、抗原固定磁気ビーズへの直接固定法セレクションにより、直接固相ＥＬＩＳＡで、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローン１３株が得られた。
　得られた陽性クローンの内、Ｎｏ．４及びＮｏ．６株について限界希釈法により抗体産生細胞のクローニングを以下のように行った。
　各株の各々を細胞１×１０3個／ｍＬに調製し、その１５０μＬを６０ｍＬの培地に加え、２００μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）３枚に撒きこみ、７日間静置培養を行った。各株より細胞コロニーが確認できた２０クローンについて２－３）の欄に記載の方法でマウスＳｅｍａ３Ａ抗体産生クローンのスクリーニングを実施した。各株について、マウスＳｅｍａ３Ａ抗体産生が陽性を示すクローンから２クローンずつ選択し、高密度培養を行った。
　高密度培養は、各クローンを拡大培養し、細胞数が４×１０7個になるまで増殖させた。十分な細胞数にまで増殖したことを確認し、２０容量％ニワトリ血清成分入りＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）を使用して、ＣＥＬＬｉｎｅ　ＣＬ－１０００（ＢＤ社）での培養を行った。ニワトリ血清成分は、抗体除去ニワトリ血清のことである。作製方法は、ニワトリ血清（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）から５０％飽和硫安によりイムノグロブリンを沈殿として除去し、上清をＰＢＳ緩衝液に透析し、透析により生じた体積増加をＣｅｎｔｒｉ　Ｐｒｅｐ（Ａｍｉｃｏｎ社）による濃縮で補正した。約９６時間程度培養後、細胞の生存率を測定しながら、生存率が５０％以下になるまで培養を継続した。生存率が５０％以下になった時点で、培養上清を回収した。
３）ＥＬＩＳＡ用培養上清の作製
　ＥＬＩＳＡにより力価を解析した培養上清は、血清由来のＩｇＭ等を除去するため、以下のようにして調製した。ニワトリ血清成分をＡＩＭ－Ｖ無血清培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）に３％の濃度で加えた。ここに約１×１０6個／ｍＬの濃度になるように細胞を加え、２日培養して、培養上清を取得した。
４）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンの選択
　前記３）で得られたＥＬＩＳＡ用培養上清について、ＥＬＩＳＡにより抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体濃度の測定を行い、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生能が高いクローンＮｏ．４－２株を得た。
５）抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体（ＩｇＭ）を含む培養上清の調製
　前記４）で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体産生クローンＮｏ．４－２株を用いて、ＩＭＤＭ培地で５％ＣＯ2存在下、３９．５℃でＣＯ2恒温槽を用いて培養し、その培養上清を回収した。
６）抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）の作製
　前記４）で得た抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローンＮｏ．４－２株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）及びｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー１：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号２７））、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列とマウス抗体軽鎖定常領域の配列を含むアンチセンスプライマー（プライマー２：ＴＧＧＣＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＧＧＡＣ（配列番号２８））を用いたＰＣＲにより、軽鎖可変領域遺伝子を増幅した。その一方で、トリ抗体重鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー３：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧ（配列番号２９））、トリ抗体重鎖可変領域の領域とマウスＩｇＧ２ａ抗体定常領域を含むアンチセンスプライマー（プライマー４：ＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号３０））を用いたＰＣＲにより、重鎖可変領域遺伝子を増幅した。一方、マウス抗体λ軽鎖定常領域のＤＮＡ配列を鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域のセンスプライマー配列とマウス抗体λ軽鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー５：ＡＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡ（配列番号３１））、及びアンチセンスプライマー（プライマー６：ＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧＧＡＡＣＡＧＴＣＡ（配列番号３２））を用いたＰＣＲにより、マウス軽鎖定常領域遺伝子を増幅した。さらにマウスＩｇＧ２ａ抗体重鎖定常領域のｃＤＮＡ配列を鋳型とし、トリ抗体重鎖可変領域のセンスプライマー配列とマウスＩｇＧ２ａ抗体重鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマー７：ＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴ（配列番号３３））、及びアンチセンスプライマー（プライマー８：ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧ（配列番号３４））を用いたＰＣＲにより、マウス重鎖定常領域遺伝子を増幅した。
　増幅された軽鎖可変領域断片と軽鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマー１及びプライマー６を用いたＰＣＲにより、トリ－マウスキメラ抗体軽鎖遺伝子を増幅した。さらに、増幅された重鎖可変領域断片と重鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマー３及びプライマー８を用いたＰＣＲにより、トリ－マウスキメラ抗体重鎖遺伝子を増幅した。
　トリ－マウスキメラ抗体軽鎖遺伝子とトリ－マウスキメラ抗体重鎖遺伝子をそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで処理した後、哺乳細胞発現用プラスミドｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｏｔＩサイトにそれぞれクローニングした。クローニングした抗体遺伝子配列はＤＮＡシークエンサーを用いたシークエンシングによって確認した。決定された塩基配列をもとに、トリ－マウスキメラ抗体軽鎖とトリ－マウスキメラ抗体重鎖のアミノ酸配列を翻訳した。最終的に決定されたトリ－マウスキメラ抗体重鎖のアミノ酸配列を配列番号３５に、最終的に決定されたトリ－マウスキメラ抗体軽鎖のアミノ酸配列を配列番号３６に示す。
　上記にて作製したプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）へポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションにより導入し、３７℃、８％ＣＯ2、１３５回転／分の振とう培養で７日間培養した培養上清を回収した。
　培養上清中に含まれる抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）の濃度はＥＬＩＳＡで定量した。この培養上清から、Ｐｏｌｙ－Ｐｒｅｐ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｃｏｌｕｍｎｓ　（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）にＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）を充填して作製したカラムを用いて、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を精製した。ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて溶媒をＰＢＳ緩衝液に置換した。
　精製した抗体の抗原に対する特異性の測定は、ＰＢＳ緩衝液を用いたＥＬＩＳＡにより行った。２．５μｇ／ｍＬの抗原を９６Ｗｅｌｌ　Ｍａｘｉ　Ｓｏｒｐ　Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、抗原（マウスＳｅｍａ３Ａタンパク質）によるプレートのコートを行った。なお、抗体の特異性を検討するために、ネガティブコントロールとして、別途、オボアルブミン、ウサギＩｇＧ、スキムミルクも同様にプレートに固定した。翌日、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬで３回洗浄し、ブロッキング液（０．５％スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μＬを加え、３０分反応させた。洗浄液２００μＬで３回洗浄し、抗体を含む培養上清を１００μＬ加え、１時間反応させた。洗浄液２００μＬで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）をＰＢＳ緩衝液で２０００倍に希釈したものを１００μＬ加え、一時間反応させた。洗浄液２００μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）１００μＬを加え、５分発色反応させ、１Ｍ硫酸１００μＬを加えて反応を停止させた。μＱｕａｎｔＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
７）抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体の可変領域におけるＣＤＲ配列の決定
　上記で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体について、ＣＤＲ配列の決定を行った。ＣＤＲ配列の決定は、Ｋａｂａｔらによる方法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＮＩＨ　ｐｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ，９１－３２４２）に従って行った。その結果、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列として、下記配列が特定された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（ヒト化抗体、トリ－ヒトキメラ抗体）の作製
１）ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）遺伝子の構築
　前記実施例１の４）で得たクローンＮｏ．４－２株が産生する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の可変領域のフレームワーク領域を、ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸に変更することにより２種のヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）の設計を行なった。
　設計された重鎖（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１、２共通）及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－１の軽鎖アミノ酸配列をコードする遺伝子を、ヒト細胞で発現させるためのコドンオプティマイゼーションを考慮して、それぞれ合成した。一方、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２の軽鎖は、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１の軽鎖遺伝子配列を鋳型として、センスプライマー（プライマーＡγ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＴ（配列番号３７））とアンチセンスプライマー（プライマーＢγ：ＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＡ（配列番号３８））でＰＣＲ増幅した産物と、センスプライマー（プライマーＣγ：ＴＣＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＡ（配列番号３９））とアンチセンスプライマー（プライマーＤγ：ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣ（配列番号４０））でＰＣＲ増幅した産物を、センスプライマーＡγとアンチセンスプライマーＤγでアセンブルＰＣＲすることで合成した。
２）トリ‐ヒトキメラ抗体遺伝子の構築
　トリ‐ヒトキメラ抗体遺伝子を次のように構築した。前記実施例１の４）で得たクローンＮｏ．４－２株のｃＤＮＡを鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＥγ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴ（配列番号４１））及びトリ抗体λ軽鎖可変領域の配列とヒト抗体λ軽鎖定常領域の配列を含むアンチセンスプライマー（プライマーＦγ：　ＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号４２））を用いたＰＣＲにより、軽鎖可変領域遺伝子を増幅した。また、トリ抗体重鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＧγ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧ（配列番号４３））、トリ抗体重鎖可変領域の領域とヒト抗体ＩｇＧ１定常領域を含むアンチセンスプライマー（プライマーＨγ：　ＧＣＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号４４））を用いたＰＣＲにより、重鎖可変領域遺伝子を増幅した。一方、合成したＨｕｍａｎｉｚｅｄ－１のヒト抗体λ軽鎖定常領域のＤＮＡ配列を鋳型とし、ヒト抗体λ軽鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＩγ：　ＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＴＡＣＣＧＴＧ（配列番号４５））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＪγ：　ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＧＧＴＴ（配列番号４６））を用いたＰＣＲにより、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子を増幅した。さらに合成したＨｕｍａｎｉｚｅｄ－１のヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域のＤＮＡ配列を鋳型とし、ヒトＩｇＧ１抗体重鎖定常領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＫγ：ＧＣＴＡＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号４７））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＬγ：ＡＧＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧ（配列番号４８））を用いたＰＣＲにより、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子を増幅した。
　増幅された軽鎖可変領域断片と軽鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマーＥγ及びプライマーＪγを用いたＰＣＲにより、トリーヒトキメラ抗体軽鎖遺伝子を増幅した。更に、増幅された重鎖可変領域断片と重鎖定常領域断片を鋳型とし、プライマーＧγ及びプライマーＬγを用いたＰＣＲにより、トリーヒトキメラ抗体重鎖遺伝子を増幅した。
３）発現ベクターの構築とタンパク質発現、精製、濃度測定
　合成したＨｕｍａｎｉｚｅｄ－１の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子、並びにトリ‐ヒトキメラ抗体の軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで処理した後、哺乳細胞発現用プラスミドｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｏｔＩサイトにそれぞれクローニングした。クローニングされた抗体遺伝子配列はＤＮＡシークエンサーを用いたシークエンシングによって確認した。決定された塩基配列をもとに、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）とトリ‐ヒトキメラ抗体の重鎖と軽鎖のアミノ酸配列を翻訳した。
　最終的に決定されたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）の重鎖のアミノ酸配列を配列番号４９に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５０に示す。当該重鎖のアミノ酸配列（配列番号４９）には、配列番号１１に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。また、最終的に決定されたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１）の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５１に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５２に示す。当該軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５１）には、配列番号１２に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。また、最終的に決定されたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５３に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５４に示す。当該軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５３）には、配列番号１３に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。
　また、最終的に決定されたトリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２由来）の重鎖のアミノ酸配列を配列番号５５に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５６に示す。当該重鎖のアミノ酸配列（配列番号５５）には、配列番号８に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。また、最終的に決定されたトリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２由来）の軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５７に示し、当該アミノ酸配列をコードしている塩基配列を配列番号５８に示す。当該軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５７）には、配列番号１０に示す可変領域のアミノ酸配列が含まれている。
　上記にて作製した発現プラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）にポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションにより導入し、３７℃、８％ＣＯ2、１３５回転／分の振とう培養で７日間培養した後、培養上清を回収した。
　この培養上清から、Ｐｏｌｙ－Ｐｒｅｐ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｃｏｌｕｍｎｓ　（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）にＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社）を充填して作製したカラムを用いて、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）、及びトリーヒトキメラ抗体を精製した。ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて溶媒をＰＢＳ緩衝液に置換した。
　精製した抗体のアミノ酸組成より分子吸光係数を算出し、紫外吸光法により濃度を決定した。精製した抗体５００ｎｇを還元又は非還元の状態で電気泳動し、ゲルをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）染色した。結果を図３に示す。なお、図３には、実施例１で得られたトリ－マウス抗体、及びＣＬ１８Ｍ（＋）トリ－マウスキメラ抗体（コントロール）について、同様に電気泳動してＣＢＢ染色した結果も併せて示す。
実施例３：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（トリ－マウスキメラ抗体）の作製
　ヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質を抗原とし、ニワトリＩｇＭの定常領域をマウスＩｇＧに置換したＤＴ４０細胞を用いたこと以外は、実施例１に記載の１）及び２）と同様の手法で抗体のスクリーニングを行い、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローン８株を得た。抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローンの中の１６５株及び５８２株を使用し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の製造及び精製を行うことにより、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）（クローンＮｏ．１６５株由来及びクローンＮｏ．５８２株由来）を得た。各抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲ配列の決定を行った。ＣＤＲ配列の決定は、Ｋａｂａｔらによる方法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＮＩＨ　ｐｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ，９１－３２４２）に従って行った。得られた結果を表２及び３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例４：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（トリ抗体、トリ－ヒトキメラ抗体）の作製
１）トリ抗体（ＩｇＭ）の作製
　マウスＳｅｍａ３Ａタンパク質を抗原として、実施例１に記載の１）及び２）と同様の手法で抗体のスクリーニングを行い、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生陽性を示すクローンを得て、その中の２４０－４０株及び２５５－７２株を使用し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の製造及び精製を行うことにより、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来及びクローンＮｏ．２５５－７２株由来）を得た。各抗Ｓｅｍａ３Ａ　トリ抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域及びＣＤＲ配列の決定を行った。ＣＤＲ配列の決定は、Ｋａｂａｔらによる方法（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，　ＮＩＨ　ｐｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ，９１－３２４２）に従って行った。得られた結果を表４及び５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
２）トリ－ヒトキメラ抗体（ＩｇＧ１）の作製
　抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体産生クローン２４０－４０株及び２５５－７２株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型とし、トリ抗体λ軽鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＭγ：ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣ（配列番号９１））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＮγ：ＴＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＴＣ（配列番号９２））を用いたＰＣＲにより、軽鎖可変領域遺伝子を増幅した。その一方で、トリ抗体重鎖可変領域の配列を含むセンスプライマー（プライマーＯγ：ＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号９３））、及びアンチセンスプライマー（プライマーＰγ：ＴＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号９４））を用いたＰＣＲにより、重鎖可変領域遺伝子を増幅した。
　また、重鎖定常領域については配列番号９５、軽鎖定常領域については配列番号９６のＤＮＡ配列を遺伝子全合成によって作製し、いずれもＮｏｔＩ処理およびＥａｇＩ処理を行った後、ベクターｐＣＥＰ４（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のＮｏｔＩサイトに接続した。
　上記のように作製した定常領域を含むベクターに対して、上記で増幅した可変領域の配列をクローニングした。具体的には、重鎖定常領域ベクター、軽鎖定常領域ベクターをいずれもＮｏｔＩ処理し、それぞれ重鎖可変領域ｃＤＮＡ、軽鎖可変領域ｃＤＮＡをＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて接続した。
　上記にて作製したプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ社）へポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションにより導入し、３７℃、８％ＣＯ2、１３５回転／分の振とう培養し、培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＡによる精製を行うことにより、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－ヒトキメラ抗体（ＩｇＧ１）（クローンＮｏ．２４０－４０株由来及びクローンＮｏ．２５５－７２株由来）を得た。
実施例５：抗原に対する特異性の測定
　実施例１で得られたトリ－マウスキメラ抗体、並びに実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）及びトリ－ヒトキメラ抗体について、抗原に対する特異性をＰＢＳ緩衝液を用いた抗原固相ＥＬＩＳＡによって測定した。また、実施例１で得られたトリ－マウスキメラ抗体をビオチン標識したものについても、同様に、抗原に対する特異性を測定した。更に、ネガティブコントロールとしてＣＬ１８Ｍ（＋）トリ－マウスキメラ抗体についても、同様に、抗原に対する特異性を測定した。具体的測定条件は、以下の通りである。
　先ず、２．５μｇ／ｍＬの抗原（マウス及びヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質）を３８４Ｗｅｌｌ　Ｍａｘｉ　Ｓｏｒｐ　Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、抗原によるプレートのコートを行った。なお、抗体の特異性を検討するために、ネガティブコントロールとして、別途、オボアルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）も同様にプレートに固定した。反応後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）５０μＬで３回洗浄し、ブロッキング液（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ）２５μＬを加え、３０分反応させた。洗浄液５０μＬで３回洗浄し、各抗体を２０μＬ加え、１時間反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗ヒトλ軽鎖ヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）をＰＢＳ緩衝液で４０００倍に希釈したもの、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ２ａヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社）をＰＢＳ緩衝液で２０００倍に希釈したもの、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社）をＰＢＳ緩衝液で１００００倍に希釈したものを２０μＬ加え、一時間反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｍ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　結果を図４に示す。図４から明らかなように、実施例１及び２で得られた各抗体は、ヒトＳｅｍａ３ＡとマウスＳｅｍａ３Ａ抗原に対する反応性が確認され、陰性抗原として用いられたオボアルブミンやＢＳＡには反応が認められなかった。この結果、実施例１及び２で得られた各抗体は、Ｓｅｍａ３Ａに対して特異的に交差性を示すことが確認された。
実施例６：抗原に対する親和性の測定－１
　実施例１で得られたクローンＮｏ．４－２由来のトリ－マウスキメラ抗体、並びに実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）及びトリ－ヒトキメラ抗体について、抗原に対する親和性の評価を競合ＥＬＩＳＡにより行った。また、ネガティブコントロールとしてＣＬ１８Ｍ（＋）トリ－マウス抗体についても、同様に、抗原に対する親和性を測定した。具体的測定条件は、以下の通りである。
　まず、２．５μｇ／ｍＬの抗原（マウス及びヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質）を３８４Ｗｅｌｌ　Ｍａｘｉ　Ｓｏｒｐ　Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、抗原によるプレートのコートを行った。翌日、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）５０μＬで３回洗浄し、ブロッキング液（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ）２５μＬを加え、３０分反応させた。ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）、トリ－ヒトキメラ抗体、及びトリ－マウスキメラ抗体をそれぞれ２倍連続希釈し、ビオチン標識した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を最終濃度が６０ｎｇ／ｍＬになるように混合し、洗浄液５０μＬで３回洗浄した抗原固相プレートと１時間反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社）をＰＢＳ緩衝液で１００００倍に希釈したものを２０μＬ加え、３０分反応させた。洗浄液５０μＬで５回洗浄し、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｍ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　得られた結果を図５に示す。また、各抗体について抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体の抗原抗体反応に対する５０％阻害濃度ＩＣ50（μｇ／ｍＬ）を算出した結果を表６に示す。その結果、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）、トリ－ヒトキメラ抗体、及びトリ－マウスキメラ抗体の親和性はほぼ同等であり、ヒト化による親和性の大きな変化は認められなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例７：抗原に対する親和性の測定－２
　実施例１で得られたクローンＮｏ．４－２由来のトリ－マウスキメラ抗体、並びに実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）及びトリ－ヒトキメラ抗体について、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケア社）を用いて抗原に対する親和性の評価を行った。具体的条件は、以下の通りである。
　センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社）をＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）とＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド）にて活性化し、Ａｃｅｔａｔｅ５．０（ＧＥヘルスケア社）で５０μｇ／ｍＬに希釈されたＰｒｏｔｅｉｎＡ（ナカライテスク社）を反応、センサーとアミンカップリングした。キャプチャー量が約２００ＲＵになる抗体濃度で各抗体を反応させて、抗原（マウス及びヒトＳｅｍａ３Ａタンパク質）を１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭの濃度で反応させた。結合時間は３分で乖離時間を４分とし、反応により得られたセンサグラムをＬａｎｇｍｕｉｒ　ｂｉｎｄｉｎ　ｍｏｄｅｌ（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１）（ＧＥヘルスケア社）にて解析してＫＤ値（解離定数）を算出した。
　その結果、ヒトＳｅｍａ３Ａに対するＫＤ値は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）では３～４ｎＭ、トリ－ヒトキメラ抗体及びトリ－マウスキメラ抗体では１４～１５ｎＭであった。また、マウスＳｅｍａ３Ａに対するＫＤ値は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２）では４～５ｎＭ、トリ－ヒトキメラ抗体及びトリ－マウスキメラ抗体では１７～１８ｎＭであった。Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ－２のいずれのヒト化抗体も、キメラ抗体に比べてＳｅｍａ３Ａに対するＫＤ値は低く、ヒト化により親和性が向上していることが分かった。
実施例８：サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＳｅｍａ３Ａの測定
　実施例２～４で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＳｅｍａ３Ａの測定を行った。具体的条件は、以下の通りである。
　先ず、表７に示すキャプチャー抗体を１／２０００に希釈して、３８４Ｗｅｌｌ　Ｍａｘｉ　Ｓｏｒｐ　Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に分注し４℃で一晩反応させ、キャプチャー抗体によるプレートのコートを行った。反応後、各ウェルを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、ブロッキング液（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）４５μＬを加え、室温で２時間反応させた。次いで、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、各抗体を２０μＬ加え、１時間反応させた。その後、各ウェルに試験サンプルを２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた。なお、試験サンプルとしては、組換えヒトＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ，＃１２５０－Ｓ３－０２Ｊ）をＰＢＳで段階希釈したもの、又は組換えヒトＳｅｍａ３Ａ－Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ，＃１２５０－Ｓ３－０２Ｊ）を、ＰＢＳで５倍希釈したヒト血清ｔｙｐｅ　ＡＢ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ４５２２）で段階希釈したものを使用した。次いで、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄し、表７に示す一次抗体（濃度０．１μｇ／ｍＬ、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した後に、以下の方法で二次抗体の反応及び検出を行った。
（条件１、２及び５～８の場合）
　西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ　＃ＮＡ９３１；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１／１０００に希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、ＴＭＢ（Ｄａｋｏ、＃Ｓ１５９９）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｎ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（条件３及び４の場合）
　ビオチン標識されたマウス抗トリＩｇＭ抗体（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ　＃７３３０８７；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１／２００００に希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ　２１１３０；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１００００倍希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、ＴＭＢ（Ｄａｋｏ、＃Ｓ１５９９）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｎ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（条件９の場合）
　西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識された抗ヤギＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社　＃Ａ５０；１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１／１００００に希釈）を各ウェルに２５μＬ添加し、室温で１時間反応させた後に、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。その後、ＴＭＢ（Ｄａｋｏ、＃Ｓ１５９９）２０μＬを加え、２０分発色反応させ、１Ｎ硫酸２０μＬを加えて反応を停止させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００（ＴＥＣＡＮ社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　得られた結果を表７、図６及び７に示す。なお、図６には、条件１～４及び８で血清を含まない試験サンプルを測定した結果として、抗原（Ｓｅｍａ３Ａ）とＯＤ４５０（４５０ｎｍの吸光度）値の関係を示す。また、図７には、条件１及び２で血清を含む試験サンプルを測定した結果として、抗原（Ｓｅｍａ３Ａ）とＯＤ４５０（４５０ｎｍの吸光度）値の関係を示す。これらの結果から、実施例１～４で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用することによって、ＥＬＩＳＡにてＳｅｍａ３Ａを測定できることが明らかとなった。また、キャプチャー抗体として実施例２で得られたヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）を使用し、一次抗体として実施例３で得られたトリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来及びクローンＮｏ．５８２株由来）を使用した場合（条件１及び２）には、血清中のＳｅｍａ３Ａについても高精度な測定ができ、生体由来の検体中のＳｅｍａ３Ａを測定可能であることも確認された。一方、市販されている抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を使用した場合（条件９）では、Ｓｅｍａ３Ａの検出はできなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例９：退縮アッセイ（ｃｏｌｌａｐｓｅ　ａｓｓａｙ）－１
１）試験方法
　ニワトリ７日胚の後根神経節（ＤＲＧ）を摘出した。摘出したＤＲＧをＮＧＦ含有培地２５０μＬ入りのＰＬＬ・ラミニンコートした２４ウェルディッシュにて、３７℃で１６～２０時間静置培養し、ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンが伸長しているのを確認した。別途、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（３ｎＭ）と、実施例１で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体（培養上清）（抗体濃度として１０μｇ／ｍＬ）又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体（１０μｇ／ｍＬ）とを含む混合液を氷上で３０分間プレインキュベートした。この混合液を、ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の最終濃度が、０、０．１、０．３ｎＭになるように、前記２４ウェルディッシュに添加し、３７℃で３０分間静置培養した。次いで、３．７％ホルマリン溶液で固定後、Ａｌｅｘａ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎにて、培養ニューロンの軸索先端に形成される成長円錐の可視化を行った。蛍光顕微鏡下にて、全ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンのうち、成長円錐が退縮（ｃｏｌｌａｐｓｅ）しているニューロンの割合（％）を求めた。また、コントロールとして、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体の代わりに、抗ウサギＩｇＧ抗体又はマウスＩｇＧを使用して、上記と同様に退縮アッセイを行った。
２）結果
　抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した退縮アッセイの結果を図８に、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を使用した退縮アッセイの結果を図９に示す。図８及び９から明らかなように、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体及び抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体には、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質によって成長円錐が退縮するのを抑制する作用があることが認められた。即ち、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１～３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質による成長円錐の退縮誘導能を効果的に抑制できることが明らかとなった。
実施例１０：退縮アッセイ（ｃｏｌｌａｐｓｅ　ａｓｓａｙ）－２
１）試験方法
　ニワトリ由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の代わりにヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質を使用したこと以外は、上記実施例９と同様の手法で、退縮アッセイを行った。
２）結果
　抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した退縮アッセイの結果を図１０に示す。図１０から分かるように、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体がヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の機能を効果的に抑制し、成長円錐の退縮を抑制できていた。即ち、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１～３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ヒトにおいても、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質による成長円錐の退縮誘導能を効果的に抑制できることが明らかとなった。
実施例１１：退縮アッセイ（ｃｏｌｌａｐｓｅ　ａｓｓａｙ）－３
１）試験方法
　ニワトリ７日胚の後根神経節（ＤＲＧ）を摘出した。摘出したＤＲＧをＮＧＦ含有培地２５０μＬ入りのＰＬＬ・ラミニンコートした２４ウェルディッシュにて、３７℃で１６～２０時間静置培養し、ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンが伸長しているのを確認した。別途、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（３ｎＭ）と、実施例２で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）（培養上清）（抗体濃度として１００μｇ／ｍＬ）とを含む混合液を氷上で３０分間プレインキュベートした。この混合液を、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の最終濃度が、０、０．０５、０．１、０．３ｎＭになるように、前記２４ウェルディッシュに添加し、３７℃で３０分間静置培養した。次いで、３．７％ホルマリン溶液で固定後、Ａｌｅｘａ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎにて、培養ニューロンの軸索先端に形成される成長円錐の可視化を行った。蛍光顕微鏡下にて、全ＮＧＦ感受性ＤＲＧニューロンのうち、成長円錐が退縮（ｃｏｌｌａｐｓｅ）しているニューロンの割合（％）を求めた。また、コントロールとして、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の代わりに、Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－ｌａｍｂｄａを使用して、上記と同様に退縮アッセイを行った。
２）結果
　抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体を使用した退縮アッセイの結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体には、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質によって成長円錐が退縮するのを抑制する作用があることが認められた。即ち、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１～３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ヒト化した場合にもＳｅｍａ３Ａタンパク質による成長円錐の退縮誘導能を効果的に抑制できることが明らかとなった。
実施例１２：ヒトＳｅｍａ３Ａに対する結合アッセイ
１）試験方法
　野生型ＣＯＳ－７細胞、又はＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）融合ＮＲＰ１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１）を発現するように形質転換させたＣＯＳ－７細胞（ＮＲＰ１発現ＣＯＳ－７細胞）を準備した。別途、アルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質（０．１ｎＭ）と、実施例１で得られたトリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（培養上清）（抗体濃度として１０μｇ／ｍＬ）又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体（１０μｇ／ｍＬ）とを含むＤＭＥＭ培地を氷上で３０分間プレインキュベートしておき、この培地５００μＬを、予めＨＢＨバッファー（２０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．００，０．０５容量％ＢＳＡ，及び１０容量％ＦＢＳを含むハンクス平衡塩類溶液）でブロッキングしておいた野生型ＣＯＳ－７細胞又はＮＲＰ１発現ＣＯＳ－７細胞に添加して、氷上で１時間静置した。次いで、ＨＢＨバッファーを用いて細胞を４回洗浄した後、４％ホルムアルデヒドを用いて細胞の固定化を行った。固定化された細胞をＨＨバッファー（２０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．００を含むハンクス平衡塩類溶液）で１回洗浄した後、５００μＬのアルカリフォスファターゼ基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ：ｎｉｔｒｏ－ｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ／　５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３’－ｉｎｄｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐ－ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　ｓａｌｔ）を添加して、室温で一晩静置した。その後、顕微鏡にて細胞の発色の程度を観察した。また、コントロールとして、アルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質を添加しなかったこと、或いは抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体の代わりにウサギＩｇＧを使用したこと以外は、上記と同様の手法で、結合アッセイを行った。なお、本試験に供したＮＲＰ１発現ＣＯＳ－７細胞において、ＮＲＰ１発現量に差がないことは、細胞から発せられるＥＧＦＰの蛍光強度から確認している。
２）結果
　抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した結合アッセイの結果を図１２に、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を使用した結合アッセイの結果を図１３に示す。図１２及び１３から明らかなように、トリ抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体と、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質との混合物を添加した場合には、ＮＲＰ１発現ＣＯＳ－７細胞へのヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の結合が阻害された。即ち、本結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１～３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に結合し、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質とＮＲＰ１との結合を阻害できることが明らかとなった。
実施例１３：ヒトＳｅｍａ３Ｆに対する結合アッセイ
１）試験方法
　ＮＲＰ１発現ＣＯＳ－７細胞の代わりに、ＥＧＦＰ融合ＮＲＰ２（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－２）を発現するように形質転換したＣＯＳ－７細胞（ＮＲＰ２発現ＣＯＳ－７細胞）を使用し、且つアルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の代わりにアルカリフォスファターゼ結合ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質を使用したこと以外は、上記実施例１２と同様の手法で、結合アッセイを行った。
２）結果
　抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体を使用した結合アッセイの結果を図１４に示す。図１４から分かるように、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ抗体と、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質との混合物を添加した場合でも、ヒト由来Ｓｅｍａ３Ｆタンパク質のＮＲＰ２発現ＣＯＳ－７細胞への結合は阻害されなかった。即ち、本結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲ１～３を有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質と相同性の高いサブファミリー分子であるＳｅｍａ３Ｆタンパク質には結合せず、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質に対して特異的に結合する可能性が示唆された。
実施例１４：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が認知機能に与える影響の分析
１）試験材料
１－１）Ａβ（２５－３５）及びＡβ（３５－２５）
　Ａβ（２５－３５）（Ａｍｙｌｏｉｄ　β－Ｐｒｏｔｅｉｎ（２５－３５））（Ｂａｃｈｅｍ，＃Ｈ－１１９２）及びＡβ（３５－２５）（Ａｍｙｌｏｉｄ　β－Ｐｒｏｔｅｉｎ（３５－２５））（Ｂａｃｈｅｍ，＃Ｈ－２９６４）を蒸留水にて１ｍｇ／ｍＬに調製した後、３７℃にて４日間インキュベートし、Ａβ（２５－３５）溶液及びＡβ（３５－２５）溶液を調製した。この操作により、Ａβ（２５－３５）は凝集し、細胞毒性を獲得するようになる。また、Ａβ（３５－２５）は、活性型であるＡβ２５－３５のアミノ酸配列を逆転させた不活性型のＡβであり、上記操作後でも細胞毒性を発揮しない。Ａβ（３５－２５）は、ネガティブコントロールとして使用した。
１－２）抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体
　前記実施例１で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を生理食塩水にて１ｍｇ／ｍＬに調製し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体溶液を調製した。
１－４）ｎｏｒｍａｌ　ＩｇＧ
　１ｍｇ／ｍＬのｎｏｒｍａｌ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより入手）をｎｏｒｍａｌ　ＩｇＧ溶液として用いた。
１－５）マウス
　日本チャールス・リバー社より購入した３週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。
２）試験方法
　Ｎｏｖｅｌ　Ｏｂｊｅｃｔ　Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　Ｔａｓｋ　（ＮＯＲＴ）を以下の方法に従い行った。
　まず、３週齢のマウスを用意し、マウスが実験者に慣れるよう、２週間の間、一日１０分間、実験者の手の上にマウスをのせるという、ハンドリング作業を行った。次に、マウスを表８に示す５群に分けて、表８に示す条件でＡβ及び抗体を脳室内に投与した。これらの溶液は、ｂｒｅｇｍａから右下１ｍｍに投与した。投与には、マイクロシリンジの針先にテフロンチューブ（エイコム）を連結させ、その先端に針先３．３ｍｍの部分を直角にした２７Ｇの注射針（テルモ）を挿入したものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　脳室内投与から３日後、マウスを３５ｃｍ×３５ｃｍ×３５ｃｍのテストケージに移し、１０分間テストケージに慣れさせた。翌日（投与４日後）、テストケージの所定の位置に物体Ａと物体Ｂを設置して１０分間の間にそれぞれの物体にアクセスした時間を測定した（獲得試行）。この時、物体と鼻先との距離が１ｃｍ以下になった時間をアクセス時間として測定した。さらに翌日（投与５日後）、物体Ｂを新規物体Ｃに替えて１０分間の試行中のアクセス時間を測定した（テスト試行）。
　なお、物体Ａ、Ｂ、及びＣは、それぞれ形状及び色が異なるものを使用した。物体Ａ、Ｂ、及びＣの具体的な形状・色は以下の通りである。
物体Ａ：水平方向に延びる基部（緑色）と、その中央から垂直に伸びる延長部（緑色）とで構成され、正面視Ｔ字型に形成されている。当該基部と延長部の形状は、共に直方体である。
物体Ｂ：基部が黄色、延長部が円柱形状で赤色であること以外は、上記物体Ａと同様である。
物体Ｃ：基部が黄色、延長部が側面の正面視で円弧状にくり抜かれた形状で黄色であること以外は、上記物体Ａと同様である。
　物体Ａ、Ｂ、及びＣの基部をテストケージの底面に配置し、延長部が上方に延びるように設置した。
３）統計解析
　獲得試行において、物体Ａ及び物体Ｂへの合計アクセス時間に対する、物体Ｂへのアクセス時間の割合（物体Ｂに対するアクセス率）を算出した。獲得試行時は物体Ａ及び物体Ｂ共に、新規物体であるので、どちらも同程度にアクセスすることが見込まれる。この時どちらかの物体に偏ったアクセスを示した場合は、薬物投与によって、認知機能等が障害された可能性があるので、本実験では評価できないということになる。更に、テスト試行において、物体Ａ及び物体Ｃへの合計アクセス時間に対する、物体Ｃへのアクセス時間の割合（物体Ｃに対するアクセス率）を算出した。テスト試行時は物体Ｃのみが新規物体であるので、もし物体Ａについての記憶を獲得していれば、物体Ｃに偏ったアクセスが見込まれる。以上から算出した物体Ｂに対するアクセス率、物体Ｃに対するアクセス率を、それぞれ一元配置分散分析を用いて統計解析を行った。群間比較はＴｕｋｅｙ－ＫｒａｍｅｒのＨＳＤ検定により行った。
４）結果
　得られた結果を図１５Ａ（獲得試行）及び１５Ｂ（テスト試行）に示す。
　図１５Ａから明らかなように、獲得試行時は全ての群の物体Ｂに対するアクセス率がほぼ約５０％で、どの群間も有意な差は認められなかった。従って、認知機能等の障害が認められず、本実験での記憶獲得に対する評価が可能であることが示された。一方、図１５Ｂに示されるように、テスト試行において、Ｉｎｔａｃｔ群及びＡβ（３５－２５）投与群（ネガティブコントロール）では、物体Ｃに対するアクセス率７５％程度であった。一方、Ａβ（２５－３５）投与群では、物体Ｃに対するアクセス率が５０％程度に止まり、Ｉｎｔａｃｔ群と比べて物体Ｃに対する嗜好性の減少が有意差を持って認められた（ｐ＜０．０００１，対Ｉｎｔａｃｔ群）。この結果は、Ａβ（２５－３５）投与による記憶障害により、物体Ａに対する記憶を獲得しなかったことを示している。
　一方、図１５Ｂから明らかなように、Ａβ（２５－３５）＋抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体投与群では、物体Ｃに対するアクセス率が７５％程度であり、Ａβ（２５－３５）投与群、及びＡβ（２５－３５）＋ｎｏｒｍａｌ　ＩｇＧ投与群と比べ、有意差を持った回復を示した（ｐ＜０．０００１，対Ａβ（２５－３５）投与群ないしはＡβ（２５－３５）＋ｎｏｒｍａｌ　ＩｇＧ投与群）。
　以上の結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲを有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体には、Ａβにより惹起される記憶障害誘導を阻害する効果が確認された。既に、Ｓｅｍａ３Ａタンパクの発現上昇がアルツハイマー病患者の死後脳において認められていること、またＳｅｍａ３Ａシグナル伝達経路においてリン酸化修飾を受けるＣｏｌｌａｐｓｉｎ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｍｅｄｉａｔｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＭＰ）が、アルツハイマー病変の一つである神経原線維変化にて、高度にリン酸化ＣＲＭＰされていることが知られている。従って、このような薬理効果は、上記抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が、Ｓｅｍａ３Ａ－ＣＲＭＰシグナルを遮断したものであると考察される。
実施例１５：抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体が免疫・炎症性疾患に与える影響の分析
　実施例２で得られたトリ－マウスキメラ抗体について、敗血症の疑似病態モデルとされるＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　接種モデルを用い、致死的炎症病態に対する影響を分析した。
１）試験材料
１－１）Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
　Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（以下ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ番号：０３２Ｍ４０８２Ｖ）を生理食塩水にて６ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。
１－２）トリ－マウス抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体
　実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体を生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬに希釈し、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体溶液とした。
１－３）陰性対照用キメラ抗体
　ニワトリＢ細胞由来のＤＴ４０細胞によって構築される抗体ライブラリーを用いて作製された非特異的トリ‐マウスキメラ抗体（ＩｇＧ）（陰性対照用キメラ抗体）を、生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬに希釈し、陰性対照用キメラ抗体溶液とした。
１－４）マウス
　日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。
２）試験方法
　入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群５匹に分けて、表９に示す試験群を設定した。各抗体を尾静脈より投与した後、３０分後にＬＰＳを腹腔内に接種した。これらの処置を施した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ４までの各個体の生死を観察し、効力判定の指標とした。同一の試験を計３回実施し再現性の確認を行った。
　３試験間の非解離性を確認したうえで、これらの結果を併合しＤａｙ　４における生存率改善効果とその有効性を判定した。また、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｙｅｒ法により生存率曲線を作成し、生存期間延長効果を判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
３）統計解析
　投与４日以前の死亡例を生存期間の延長なし（無効）とし、４日まで生存した例を生存期間の延長有り（有効）と判定した。これらの２値化データについて、Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｄａｙ検定を用いて３試験間の同一性を判定した上で、Ｃｏｃｈｒａｎ－Ｍａｎｔｅｌ－Ｈａｅｎｚｅｌ検定により３試験を併合した有効率の差を判定した。生存期間延長効果はｌｏｇ－ｒａｎｋ検定を適用し判定した。
４）結果
　得られた結果を表１０に示す。表１０から明らかなように、３試験すべてにおいて抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体投与群の生存率が、陰性対照である非特異配列キメラ抗体投与群に比べ優れていた。これらの試験間での非乖離性を確認するため実施したＢｒｅｓｓｌｏｗ－Ｄａｙ検定が有意ではないことから３試験間に乖離はないと判断した（ｐ＝０．６２０２）。そのうえで３試験の結果を併合し、Ｃｏｃｈｒａｎ－Ｍａｎｔｅｌ－Ｈａｅｎｚｅｌ検定を実施したところ、ｐ＝０．０３６４となり、陰性対照群と抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体群間の生存率には有意水準５％で統計的有意差が認められた。これらの結果から抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体は、致死的炎症病態を有するモデル動物において生存率を改善する効果を示し、かつその効果には再現性のあることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　併合した３試験についてＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法により生存率曲線を作成し、その有意性を検討するためｌｏｇ－ｒａｎｋ検定を実施した。その結果を図１６に示す。図１６に示す如く、生存期間分析においてもｐ＝０．０１１５という有意性を示し、抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体には生存期間延長効果のあることが明らかとなった。
実施例１６：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が免疫・炎症性疾患に与える影響の分析
　実施例２で得られた抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体についても、実施例１２と同様にＬＰＳ誘発炎症疾患モデルに対する影響を分析した。
１）試験材料
１－１）ＬＰＳ
　ＬＰＳの調製は実施例１５と同様に行った。
１－２）抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体
　実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）を生理食塩水にて希釈し、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体溶液とした。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ投与群では、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）を５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したものを用い、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体１００μｇ投与群では、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）を１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したものを用いた。
１－３）陰性対照群用ヒト抗体
　非特異的なヒトポリクローナル抗体（ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ＰＯＬＹＣＬＯＮＡＬ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ；　ＢｉｏＸＣｅｌｌ社、＃ＢＥ００９２）を、生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬに希釈し、陰性対照用ヒト抗体溶液とした。
１－４）マウス
　日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。
２）試験方法
　入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群１０匹に分けて、表１１に示す試験群を設定した。各抗体を尾静脈より投与した後、３０分後にＬＰＳを腹腔内に接種した。これらの処置を施した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ４までの各個体の生死を観察し、効力判定の指標とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
３）統計解析
　実施例１２と同様に無効及び有効の２値化した生存割合に対し、片側によるＣｏｃｈｒａｎ－Ａｒｍｉｔａｇｅ検定を用い、想定される３種類の用量反応型、即ち直線的増加、低用量飽和、及び高用量立ち上がり型の対比を設定して生存率改善効果の用量反応性を判定した。また、生存期間延長効果はｌｏｇ－ｒａｎｋ検定を適用し判定した。
４）結果
　表１２に各群の生存率を示す。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体投与１００μｇ投与群では、陰性対照群（３０％）の２倍の生存率（６０％）となり、更に５００μｇ投与群は、１００μｇ投与群の結果を上回る生存率（８０％）が観察された。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体両用量において生存率が改善され、かつ用量依存傾向が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　２値化された生存率に対するＣｏｃｈｒａｎ－Ａｒｍｉｔａｇｅ検定では、直線増加型（ｐ＝０．０２１５）、低用量飽和型（ｐ＝０．０４５１）、および高用量立上り型（ｐ＝０．０７４３）の結果となり、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体による生存率改善効果は、１００μｇ以上の用量でほぼ直線的に増加したと判定された。
　以上の結果は、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体も、実施例１５で示した抗Ｓｅｍａ３Ａトリ－マウスキメラ抗体と同様に、ＬＰＳ誘発性の致死的炎症病態を抑え、生存率を改善し得る効果を有することを明瞭に示している。
　明瞭な生存率改善効果の認められた５００μｇ投与群の生存率曲線を図１７に示す。ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定においてｐ＝０．０３０３となり、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が生存期間延長効果をもたらし得ることが示された。
実施例１７：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が病態誘発後の致死的炎症性疾患に与える影響の分析
　実施例１６で得られた結果をもとに、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の効果について、ＬＰＳを先に接種し、病態を誘発した後からの処置による影響を判定した。
１）試験材料
１－１）ＬＰＳ
　ＬＰＳの調製は実施例１５と同様に行った。
１－２）抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体
　実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）を生理食塩水にて希釈し、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体溶液とした。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ、２５０μｇ、１２５μｇ投与群では、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）をそれぞれ５、２．５、１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したものを用いた。
１－３）陰性対照群用ヒト抗体
　実施例１６と同様の方法で、陰性対照用ヒト抗体溶液を調製した。
１－４）マウス
　日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。
２）試験方法
　入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群１０匹に分けて、表１３に示す試験群を設定した。本試験では実施例１５及び１６と異なり、実医療に則した使用を想定し、既に炎症が惹起された後からの投与による効力判定を行った。まずＬＰＳを腹腔内に接種し炎症反応を惹起した。各抗体はＬＰＳ腹腔内接種１時間後に尾静脈より投与した。これらの処置を施した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ４までの各個体の生死を観察し、効力判定の指標とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
３）統計解析
　陰性対照群を含む４群がとり得る用量反応型として、（１）実用量の直線回帰、（２）直線増加、（３）中用量立上り、（４）高用量立上り、（５）中用量飽和、（６）低用量飽和、及び（７）中用量立上り飽和型、の７つのタイプが想定される。この計７種の反応パターンに対しＣｏｃｈｒａｎ－Ａｒｍｉｔａｇｅ検定を用い、並べ替え再抽出法で多重調整したｐ値を算出したうえで、そのｐ値が最小となる対比反応型を適切な用量反応型として採択することとした。また、生存期間延長効果はｌｏｇ－ｒａｎｋ検定を適用し判定した。
４）結果
　表１４に投与４日後の各群の生存率を示す。陰性対照群の生存率は１０％であったが、ＬＰＳ接種後１時間に抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体１２５、２５０、及び５００μｇを投与した各群の生存率はそれぞれ、３０、４０、１００％であり、用量増加に伴い生存率も上がる傾向が観察された。特に、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ投与群ではマウス１０匹全個体が生存するという特筆すべき効果が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　２値化した生存率がとり得る７種の用量反応型を設定し、並べ換え再抽出法による多重調整Ｃｏｃｈｒａｎ－Ａｒｍｉｔａｇｅ検定を実施した。そのｐ値の計算結果を表１５に示す。なお、ｐ値の序列を示すため、表示桁数は不必要に多くしてある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　解析の結果、想定した全ての用量反応型において、有意性を示す結果が得られた。もっとも小さなｐ値を示した用量反応型は実用量直線増加型（ｐ＝０．００００１７９０）で、次いで直線増加型（ｐ＝０．００００４５４）、中用量立上り型（ｐ＝０．００００５７３０）、高用量立上り型（ｐ＝０．００００８０４０）の順であった。これらの結果は、本試験における生存率改善効果には明瞭な用量依存性があったことを科学的に示していると同時に、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が致死的炎症病態を制御し、生存率を改善し得る効力を有していることを示すものである。
　全例が生存し明瞭な生存率改善効果の認められた抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体５００μｇ投与群の生存率曲線を図１８に示す。ｌｏｇ－ｒａｎｋ検定ではｐ＜０．０００１となり有意水準を満たす結果が得られた。抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体は致死性炎症病態発症後も、その病態を制御し生存期間延長効果を示すことが明瞭となった。
実施例１８：播種性血管内凝固症候群モデルマウスに与える抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響
　敗血症や固形腫瘍等に伴う播種性血管内凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｍｉｎａｔｅｄ　Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、以下ＤＩＣ）では、血中Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－１（以下ＰＡＩ－１）が増加し、線溶系を抑制することから多臓器不全を起こし重篤化する。血中ＰＡＩ－１量の増加を抑制できれば播種性血管内凝固症候群の進行を阻止できると考えられることから、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の血中ＰＡＩ－１量変動への影響を検討した。
１）試験材料
１－１）ＬＰＳ
　ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌｏｔ番号：１０２Ｍ４０１７Ｖ）を生理食塩水にて１．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。
１－２）抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体
　実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）を生理食塩水にて５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。
１－３）マウス
　日本チャールス・リバー社より購入した雄性６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を使用した。
２）試験方法
２－１）群構成
　入荷後、飼育室で馴化させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１群５匹に分けて、表１６に示す試験群を設定した。
２－２）ＬＰＳ接種と抗体投与
　ＬＰＳは１５ｍｇ／ｋｇの接種量となるよう腹腔内に接種した。抗体溶液は５００μｇ／マウスの接種量となるよう、５ｍｇ／ｍＬ溶液を０．１ｍＬ尾静脈より投与した。なお、ＬＰＳ非接種の条件１群には生理食塩水を腹腔内接種した。
２－３）マウスＰＡＩ－１の測定
　ＬＰＳ接種から１．５、３、及び９時間後に血漿を採取し、マウスＰＡＩ－１　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用い処置動物の血中ＰＡＩ－１濃度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
３）統計解析
　抗体非投与群に対する抗体投与群について両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。
４）結果
　図１９に血中ＰＡＩ－１濃度の測定結果を示す。ＬＰＳ非処置群（条件１）では血中ＰＡＩ－１量はごくわずかであったが、ＬＰＳ接種後の血中ＰＡＩ－１量は１．５時間から増加傾向を示し、３時間後及び９時間後ではＬＰＳ非処置動物に比べ著しく増加していた（条件２、５及び８）。
　ＬＰＳ接種後３時間の抗体投与群ではＬＰＳ前投与群（条件６、ｐ＝０．００２７）、ＬＰＳ後投与群（条件７、ｐ＝０．００５１）のいずれの群においても抗体非投与群に比べ血中ＰＡＩ－１量の増加が抑制されていた。この抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体によるＰＡＩ－１増加抑制効果は、ＬＰＳ接種後９時間においても持続し、ＬＰＳ後３時間の結果と同様にＬＰＳ前投与群（条件９、ｐ＜０．０００１）、ＬＰＳ後投与群（条件１０、ｐ＝０．００２９）いずれの抗体投与群においても血中ＰＡＩ－１量の増加が抑制されていた。
　以上の結果から、実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）は、ＤＩＣの増悪因子の一つである血中ＰＡＩ－１量の増加を抑制する作用を有していることが明らかとなった。
実施例１９：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の癌細胞遊走能に与える影響
　外科治療、又は化学療法寛解導入後に起こる播種性転移や遠隔転移により、癌患者の生存率が大きく低下することが知られている。癌細胞の遊走能の活性化は、癌細胞が原発巣から離脱し、播種性転移や遠隔転移につながることから、Ｓｅｍａ３Ａによって誘導されるがんの悪性化に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響を確認した。
１）試験方法
　実施例２で作製した抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）を用い、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される癌細胞遊走能に与える影響について評価した。ここでは、Ｓｅｍａ３Ａ高発現患者の予後が不良とされている膵癌の細胞を用いてその効果を検討した。具体的な実験手法は以下の通りである。
　フィブロネクチンをＰＢＳ緩衝液で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈してフィブロネクチン希釈液を調製し、このフィブロネクチン希釈液１０μＬを、２４穴用チャンバー（クラボウ・ケモタキセルチャンバー、８μｍ孔）のフィルター下面に塗布し、室温で約１時間静置し乾燥させ、マイグレーションチャンバーを作製した。
　次いで、前記で調製したマイグレーションチャンバーを２４穴プレートにセットし、外層に０．１％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地６００μＬを添加した。また、チャンバー内層には、２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ－２）と表１７に示す各添加成分を含む無血清ＤＭＥＭ培地２００μＬとを添加し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で４時間培養を行った。その後チャンバーを取り出して、チャンバー内層の癌細胞を吸引除去し、さらにＰＢＳ緩衝液で湿らせた綿棒でチャンバー内に残留した細胞を除去した。次いで、チャンバーを細胞染色液（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、国際試薬）に１０分以上浸した後に、超純水で洗浄を２回行って乾燥させた。乾燥後に、チャンバーのフィルター下面に遊走した細胞数を顕微鏡で計測した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
２）統計解析
　多重性を考慮し、条件２に対する条件３～５、及び条件６～８について両側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定によりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。
３）試験結果
　得られた結果を図２０に示す。ヒトＳｅｍａ３Ａの刺激により膵癌細胞ＭＩＡＰａＣａ－２の遊走活性は２倍以上亢進した（条件２）。しかし、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体存在下では、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される膵癌細胞の遊走活性が抑制された（条件３～５）。抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体１μｇ／ｍＬ処置群（Ｐ＝０．００３１）と１０μｇ／ｍＬ処置群（Ｐ＜０．００１）では、Ｓｅｍａ３Ａ非処置群（条件１）と同程度にまで癌細胞の遊走が抑制されていた。一方、陰性対照群では、Ｓｅｍａ３Ａによる癌細胞遊走を抑制しなかった（条件６～８）。即ち、本結果から、特定のアミノ酸配列のＣＤＲを有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される膵癌細胞の遊走を特異的に抑制することが明らかとなった。
実施例２０：抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の癌細胞浸潤能に与える影響
　遊走能が活性化された癌細胞は周辺の細胞外基質を融解・浸潤し、基底膜を破壊して血管やリンパ管に移行し、やがて遠隔臓器へと転移する。癌細胞の浸潤・転移能の抑制は、転移性再発の抑止につながり、癌患者の生存率を改善する上で有用と考えられている。実施例１９で検討したＳｅｍａ３Ａ誘導性遊走能亢進に対する抑制効果に加え、癌細胞浸潤能に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の効果についても検討した。
１）試験方法
　増殖因子を除去した細胞外基質（ＢＤ社、ＭａｔｒｉｇｅｌTM Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｄｕｓｅｄ）を内層に充填したインベージョンチャンバー（ＢＤ社、ＢｉｏＣｏａｔTM　８μｍ孔、＃３５４４８３）を用いてＳｅｍａ３Ａ誘導性の癌細胞浸潤能に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体が与える影響について評価した。具体的な実験手法は以下の通りである。
　癌細胞は、ヒト膵癌細胞株（ＭＩＡＰａＣａ－２）、ヒト神経膠芽腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）、及びマウス由来肺癌細胞株（３ＬＬ）を使用した。先ず、インベージョンチャンバー内に充填された細胞外基質に膨潤処置を施した後、そのインベージョンチャンバーを２４穴プレートにセットし、外層に０．１％ウシ胎児血清（３ＬＬ細胞の場合は１％ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地を０．７５ｍＬ添加し、内層に２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの癌細胞と表１８に示す各濃度の添加成分を含む無血清ＤＭＥＭ培地を１２５μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時間培養を行った。その後、インベージョンチャンバーを取り出し、実施例１９と同様にインベージョンチャンバー内層の残留細胞を除去した後、フィルター下面に移動した浸潤細胞数を顕微鏡で計測した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
２）統計解析
　Ｓｅｍａ３Ａ誘導性の浸潤活性に対する阻害作用について、多重性を考慮し、条件５に対する条件６～８および条件９～１０についてそれぞれ両側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定によりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。ｐ値一覧を表１９に示す。
３）試験結果
　図２１にＭＩＡＰａＣａ－２細胞を用いた場合、図２２にＵ８７ＭＧ細胞を用いた場合、及び図２３に３ＬＬ細胞を用いた場合について、各条件での浸潤細胞を計測した結果を示す。Ｓｅｍａ３Ａを添加した場合（条件５）、いずれの細胞株においてもＳｅｍａ３Ａ非刺激群（条件１）に比べ癌細胞の浸潤能が明らかに亢進していた。そして、ヒトＳｅｍａ３Ａと共に抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体を添加した場合、いずれの癌細胞株においてもＳｅｍａ３Ａ非刺激と同程度にまで癌細胞の浸潤が抑制されていた（条件６～８）。Ｓｅｍａ３Ａ非刺激条件下では、３ＬＬを除いて特筆すべき浸潤抑制作用は観察されなかった（条件１～４）。一方、陰性対照抗体添加群ではＳｅｍａ３Ａによる癌細胞浸潤能の亢進をほとんど抑制しなかった（条件９～１１）。また、図２４には浸潤した３ＬＬ細胞の顕微鏡下撮影像を示す。Ｓｅｍａ３Ａ非添加の条件１に対し、Ｓｅｍａ３Ａを添加した条件５において癌細胞浸潤が顕著であること、Ｓｅｍａ３Ａ存在下で抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体を処置した条件７および条件８において、Ｓｅｍａ３Ａによって誘導される癌細胞の浸潤活性が明らかに抑制されていることが可視的にも確認できる。これらの結果から明らかなように、特定のアミノ酸配列のＣＤＲを有する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体は、Ｓｅｍａ３Ａによって誘導される癌細胞の浸潤活性をＳｅｍａ３Ａ非刺激と同程度にまで抑制する作用を有することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
実施例２１：Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される抗がん剤不応答性に対する抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体の影響
　膵癌は、がんの中でも５年生存率が非常に低いことが知られている。その原因として、膵癌組織は乏血管性の状態となっているが、このような栄養飢餓状態でも癌細胞の増殖・進展が起こり、しばしばゲムシタビン塩酸塩（以下ＧＥＭ）等の抗がん剤に対し耐性化を示すことが挙げられる。即ち、膵癌治療において、抗がん剤不応答性の克服は重要な課題となっていることから、栄養飢餓条件におけるＳｅｍａ３Ａの薬剤耐性誘導と抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体によるその解除作用について評価した。
１）試験方法
　膵癌の特徴である栄養飢餓条件において、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導されるＧＥＭ不応答性に対するヒト化抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体（実施例２で作製したｈｕｍａｎｉｚｅｄ－２）が与える影響について評価した。具体的な実験手法は以下の通りである。
　４×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト膵癌細胞（ＭＩＡＰａＣａ－２）を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地に浮遊させた細胞浮遊液を９６穴プレートの各穴に１００μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ2存在下で２４時間培養を行った後に、培地を０．１％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地１００μＬに交換し、更に２４時間培養を行った。次いで、表２０に示す各成分を所定量含有させた０．１％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地１００μＬを各穴に添加して、２日間培養を行った。その後、各穴から培養上清を１００μＬ除去して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　ＡＱｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で１時間培養した後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
２）統計解析
　条件３に対する条件４～６、及び条件７～９について多重性を考慮し、両側Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を実施しによりｐ値を算出し、有意水準５％以内の場合、統計有意性があるものと判断した。ｐ値を表２１に示す。
３）試験結果
　図２５に膵癌細胞増殖判定試験の結果を示す。ＧＥＭにより膵癌細胞の増殖は抑制されたが（条件１に対し条件２）、ヒトＳｅｍａ３Ａは、ＧＥＭに対する感受性を減弱させ薬剤不応答性を誘導した（条件２に対し条件３）。このＳｅｍａ３Ａにより誘導されるＧＥＭ抵抗性は、抗Ｓｅｍａ３Ａヒト化抗体１ないし１０μｇ／ｍＬ処置により解除され、Ｓｅｍａ３Ａ非存在条件と同程度にまでＧＥＭ感受性を回復させることが示された（条件３に対し条件４～６）。一方、陰性対照ヒト抗体添加群では、Ｓｅｍａ３Ａ非存在条件と同程度までのＧＥＭ感受性を回復することはできなかった（条件７～９）。本結果から、実施例２によって作製したヒト化抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体には、膵癌組織のような栄養飢餓条件において、Ｓｅｍａ３Ａにより誘導される抗がん剤抵抗性を解除する作用も有していることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　配列番号１は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号２は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号３は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号４は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号５は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号６は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号７は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号８は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号９は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号１０は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号１１は、ヒト化抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号１２は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－１）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号１３は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－２）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号１４は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１５は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１６は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１７は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１８は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号１９は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号２０は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号２１は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号２２は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号２３は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号２４は、ヒト化抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）をコードしている塩基配列である。
　配列番号２５は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－１）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）をコードしている塩基配列である。
　配列番号２６は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－２）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）をコードしている塩基配列である。
　配列番号２７は、前記プライマー１の塩基配列である。
　配列番号２８は、前記プライマー２の塩基配列である。
　配列番号２９は、前記プライマー３の塩基配列である。
　配列番号３０は、前記プライマー４の塩基配列である。
　配列番号３１は、前記プライマー５の塩基配列である。
　配列番号３２は、前記プライマー６の塩基配列である。
　配列番号３３は、前記プライマー７の塩基配列である。
　配列番号３４は、前記プライマー８の塩基配列である。
　配列番号３５は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖のアミノ酸配列である。
　配列番号３６は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
　配列番号３７は、前記プライマーＡγの塩基配列である。
　配列番号３８は、前記プライマーＢγの塩基配列である。
　配列番号３９は、前記プライマーＣγの塩基配列である。
　配列番号４０は、前記プライマーＤγの塩基配列である。
　配列番号４１は、前記プライマーＥγの塩基配列である。
　配列番号４２は、前記プライマーＦγの塩基配列である。
　配列番号４３は、前記プライマーＧγの塩基配列である。
　配列番号４４は、前記プライマーＨγの塩基配列である。
　配列番号４５は、前記プライマーＩγの塩基配列である。
　配列番号４６は、前記プライマーＪγの塩基配列である。
　配列番号４７は、前記プライマーＫγの塩基配列である。
　配列番号４８は、前記プライマーＬγの塩基配列である。
　配列番号４９は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ　－２）（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖のアミノ酸配列である。
　配列番号５０は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－１及びＨｕｍａｎｉｚｅｄ　－２）（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号５１は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－１）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
　配列番号５２は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－１）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号５３は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－２）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
　配列番号５４は、ヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　－２）（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号５５は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖のアミノ酸配列である。
　配列番号５６は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の重鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号５７は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列である。
　配列番号５８は、トリ－ヒトキメラ抗体（クローンＮｏ．４－２株由来）の軽鎖のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号５９は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号６０は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号６１は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号６２は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号６３は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号６４は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号６５は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号６６は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号６７は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号６８は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号６９は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号７０は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号７１は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号７２は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号７３は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号７４は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号７５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号７６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号７７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号７８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号７９は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号８０は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号８１は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号８２は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号８３は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号８４は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号８５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号８６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号８７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
　配列番号８８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
　配列番号８９は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
　配列番号９０は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
　配列番号９１は、前記プライマーＭγの塩基配列である。
　配列番号９２は、前記プライマーＮγの塩基配列である。
　配列番号９３は、前記プライマーＯγの塩基配列である。
　配列番号９４は、前記プライマーＰγの塩基配列である。
　配列番号９５は、ヒト化抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号９６は、ヒト化抗体の軽鎖定常領域のアミノ酸配列をコードしている塩基配列である。
　配列番号９７は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号６０）をコードしている塩基配列である。
　配列番号９８は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号６１）をコードしている塩基配列である。
　配列番号９９は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号６２）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１００は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号６４）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０１は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号６５）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０２は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号６６）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０３は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５９）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０４は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．１６５株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６３）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０５は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号６８）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０６は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号６９）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０７は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号７０）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０８は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号７２）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１０９は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号７３）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１０は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号７４）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１１は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６７）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１２は、トリ－マウスキメラ抗体（クローンＮｏ．５８２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７１）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１３は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号７６）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１４は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号７７）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号７８）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号８０）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８１）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号８２）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１１９は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７５）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２０は、トリ抗体（クローンＮｏ．２４０－４０株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７９）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２１は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号８４）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２２は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８５）をコードしている塩基配列である。
　配列番号Ｄ１２３は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号８６）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２４は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（配列番号８８）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２５は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（配列番号８９）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２６は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（配列番号９０）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２７は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８３）をコードしている塩基配列である。
　配列番号１２８は、トリ抗体（クローンＮｏ．２５５－７２株由来）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８７）をコードしている塩基配列である。

Claims (31)

  1. 　下記（Ａ）～（Ｅ）のいずれか示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗セマフォリン３Ａ抗体、又はその抗原結合領域を含む抗体断片：
    （Ａ）　配列番号１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号１に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号３に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
    　配列番号４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号５に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
    （Ｂ）　配列番号６０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６１に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
    　配列番号６４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６５に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号６６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
    （Ｃ）　配列番号６８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６８に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号６９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号６９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
    　配列番号７２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７３に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７３に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
    （Ｄ）　配列番号７６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号７７に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号７８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号７８に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
    　配列番号８０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８１に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８１に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８２に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域；
    （Ｅ）　配列番号８４に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８４に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８５に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８５に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号８６に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８６に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する重鎖可変領域、並びに
    　配列番号８８に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８８に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号８９に示すアミノ酸配列、或いは配列番号８９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号９０に示すアミノ酸配列、或いは配列番号９０に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域。
  2. 　キメラ抗体、ヒト化抗体、又はこれらの抗体断片である、請求項１に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片。
  3. 　請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を含有する、医薬組成物。
  4. 　神経再生促進用である、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 　アルツハイマー病の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
  6. 　敗血症の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
  7. 　がんの予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
  8. 　がんが、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、膵臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頚部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、又は喉頭癌である、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
  10. 　播種性血管内凝固症候群が、敗血症、急性白血病、固形がん、常位胎盤早期剥離、羊水塞栓、外傷、熱傷、膠原病、ショック、大動脈瘤、劇症肝炎、肝硬変、急性膵炎、横紋筋融解、血栓症、及び重症感染症よりなる群から選択される少なくとも１種を伴っている、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 　中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療用である、請求項３に記載の医薬組成物。
  12. 　中枢又は末梢神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、又は神経変性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、黒質線状体変性症、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、又は脊髄小脳変性症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 　自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、全身性エリテマトーデス、又は多発性硬化症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  15. 　炎症性疾患が、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節炎、肝炎、脊椎関節炎、又はシェーグレン症候群である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  16. 　感染症が、細菌感染症、脳炎、髄膜炎、心内膜炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、重症急性呼吸器症候群、肺炎、敗血症、火傷性、又は外傷性感染症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  17. 　アレルギー性疾患が、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、又は食物アレルギーである、請求項１１に記載の医薬組成物。
  18. 　神経再生が求められる患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、神経再生方法。
  19. 　アルツハイマー病を罹患している患者に対して、項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、アルツハイマー病の治療方法。
  20. 　敗血症を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、敗血症の治療方法。
  21. 　がんを罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、がんの治療方法。
  22. 　播種性血管内凝固症候群を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、播種性血管内凝固症候群の治療方法。
  23. 　中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患を罹患している患者に対して、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片を投与する工程を含む、前記疾患の治療方法。
  24. 　神経再生用の医薬の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
  25. 　アルツハイマー病の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
  26. 　敗血症の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
  27. 　がんの予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
  28. 　播種性血管内凝固症候群の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
  29. 　中枢又は末梢神経系疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、及びアレルギー性疾患よりなる群から選択される少なくとも１種の疾患の予防及び／又は治療剤の製造のための、請求項１又は２に記載の抗セマフォリン３Ａ抗体又は抗体断片の使用。
  30. 　請求項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を用いて免疫測定により検体中のＳｅｍａ３Ａタンパク質を測定する工程を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定方法。
  31. 　請求項１又は２に記載の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体又は抗体断片を含む、Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の測定用キット。
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