WO2014117992A1 - Mikroorganismus und verfahren zur fermentativen herstellung von aminosäuren - Google Patents

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gene
amino acid
organic
chemical compound
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Marcus PERSICKE
Jörn Kalinowski
Andrea HÜSER
Wilfried Claes
Alexander Reth
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Evonik Industries Ag
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the invention relates to a microorganism which produces an organochemical compound and / or
  • the present invention is within the scope of a
  • Organic chemical compounds which include in particular amino acids, organic acids, vitamins, nucleosides and nucleotides, are used in human medicine, in the pharmaceutical industry, in the food industry and especially in animal nutrition.
  • L-lysine are obtained by fermentation of strains of coryneform bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum, or of strains of the family Enterobacteriaceae,
  • Process improvements may include fermentation measures such as stirring and supply with
  • Oxygen or the composition of the nutrient media, such as the sugar concentration during the
  • Microorganisms are used methods of mutagenesis, selection and mutant selection. In this way, one obtains strains that are resistant to antimetabolites or auxotrophic for regulatory metabolites and produce the L-amino acids.
  • One known antimetabolite is the lysine analog S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC).
  • Corynebacterium in particular Corynebacterium glutamicum, or the genus Escherichia, in particular Escherichia coli, by modifying or strengthening or attenuating individual amino acid biosynthesis genes and the effect on amino acid production
  • Bacteria are known.
  • glutamicum ATCC13032 is available from Ikeda and Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), EP 1 108 790 and Kalinowski et al. (Journal of
  • glutamicum R is in Yukawa et al. (Microbiology
  • NCTC 13129 diphteriae NCTC 13129 was described by Cerdeno-Tarraga et al.
  • jeikeium has been described by Tauch et al. (Journal of Bacteriology 187 (13), 4671-4682 (2005)).
  • nucleotide sequences of the genome of Corynebacterium glutamicum are also in the National Library of Biotechnology Information (NCBI) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), in the DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) or in of the NCBI database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), in the DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) or in of the
  • each of these compounds is produced in a biosynthetic pathway in the cell of a microorganism.
  • One of the important coenzymes essential for the function of essential enzymes in the biosynthetic system is reduced
  • NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • Nicotinamide dinucleotide transhydrogenase (hereinafter simply referred to as "transhydrogenase”) is known as one of the enzymes responsible for the production of NADPH. It is known that this enzyme is present in various organisms, including in microorganisms of the genus Escherichia. In Escherichia coli, a typical
  • Makoto Ishimoto Metal Maps, July 25, 1971 (Kyoritsu Suppan Co., Ltd.), pages 1 30-32, discloses that the reducing activity of NADH or NADPH for the biosynthesis of several
  • E. coli contains both a soluble and a
  • the membrane bound pyridine nucleotide transhydrogenase is the
  • PntAB membrane-bound proton-transferring pyridine nucleotide transhydrogenase is the PntAB gene product; PntAB is an important source of NADPH (Sauer et al., The Journal of Biological Chemistry 279 (8) (2004)).
  • the object underlying the present invention is to provide a microorganism improved over the microorganisms described in the prior art, processes for producing such a microorganism, and processes using such a microorganism for overproduction of organic chemical compounds Factors such as the intracellular concentration of the overproduced compound, the yield of the overproduced compound after treatment of the culture, the growth characteristics of the microorganism and the time and number of processing steps required for the overproduction and preparation of the compound, as well as the resource requirements of the process, for example with respect to time , Energy and amount of strains and starting materials used.
  • the object underlying the application is achieved by a method for
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is overexpressed and wherein the fermentation in a suitable
  • Fermentation medium proceeds to form a fermentation broth and b. Enrich (accumulate) the organic chemical
  • Polypeptide whose amino acid sequence is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% identical to the
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is overexpressed.
  • the encoded polypeptide whose amino acid sequence has at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% is identical to the
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 the activity of a transhydrogenase on.
  • microorganisms or strains (parent strains) used for the measures of overexpression of the claimed polypeptide polypeptide preferably already have the
  • Production processes such as amino acid production, is further increased.
  • the method according to the invention or with the use of the microorganisms according to the invention can the microbial production of organic chemical
  • the inventive method for producing an organic-chemical compound also characterized by the fact that the preparation of the organic chemical compound over the fermentation of a
  • tuberculosis a transhydrogenase in C. glutamicum
  • the polynucleotide encoding a polypeptide is derived
  • Amino acid sequence at least 80%, at least 85%,
  • Polypeptide on the activity of a transhydrogenase Polypeptide on the activity of a transhydrogenase.
  • the microorganism according to the invention has an im
  • variants are included which are at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99%
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, i. wherein at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% of the amino acid positions are identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the percent identity is preferably calculated over the entire length of the amino acid or nucleic acid region.
  • Microorganism one compared to the respective one
  • Starting strain increased expression of a polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • an organochemical compound is meant for the measures of the invention a vitamin such as e.g.
  • vitamin B1 Thiamine (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2),
  • microorganism according to the invention is produced and / or excreted, is preferably selected from the group vitamin, nucleoside or nucleotide, L-amino acids,
  • L-amino acids includes the proteinogenic ones
  • Proteinogenic L-amino acids are the L-amino acids which occur in natural proteins, that is in proteins of microorganisms, plants, animals and humans. Proteinogenic amino acids include L-aspartic acid, L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L Isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan, L-arginine, L-proline and optionally L-selenocysteine and L-pyrrolysine.
  • organic acid includes keto acids
  • keto acid selected from the group ketoisocaproic acid, keto-valeric acid and keto- ⁇ -methylvaleric acid.
  • the organochemical compound is selected from the group of proteinogenic L-amino acid, L-ornithine and L-homoserine and - ketoisocaproic acid, -Ketovalerianklare and -Keto-ß- methylvalerianic acid. Particularly preferred is the
  • L-amino acid selected from the group L-threonine, L-lysine, L-methionine, L-valine, L-proline, L-
  • Glutamate especially L-lysine, L-methionine and L-valine, especially L-lysine and L-methionine.
  • amino acids or L-amino acids are mentioned below, the term also includes their salts, for example the lysine monohydrochloride or lysine sulfate in the case of
  • keto acid also includes their salts, as in the case of ketoisocaproic acid (KIC), the calcium KIC, the potassium KIC or the sodium KIC.
  • KIC ketoisocaproic acid
  • the microorganism is preferably selected from the group bacteria, yeast and fungi, among the bacteria particularly preferably from the family Corynebacteriaceae or the family Enterobacteriaceae, wherein the genus
  • Corynebacterium or the genus Escherichia very particularly preferred and of the genera mentioned the species Corynebacterium glutamicum or the species Escherichia coli is particularly preferred.
  • Microorganism is stronger than the native, or the original promoter of the gene; examples for
  • Promoters which can preferably be used according to the invention in Corynebacterium glutamicum are described, for example, in FIG. 1 of the review article by Patek et al. (Journal of
  • the expression of the gene is carried out using a ribosome binding site, which is in the for the process used microorganism is stronger than the original ribosome binding site of the gene; d) the expression of the gene is carried out by optimizing the codon usage of the microorganism used for the method; e) the expression of the gene takes place by reducing secondary mRNA structures in the mRNA transcribed from the gene; f) the expression of the gene takes place with elimination of RNA polymerase terminators in the mRNA transcribed from the gene; g) the expression of the gene is carried out using mRNA-stabilizing sequences in the transcribed from the gene mRNA.
  • the said measures for increasing the expression can be suitably combined with one another.
  • the expression of the polynucleotide encoding a polypeptide having the activity of a transhydrogenase is preferably increased by the combination of at least two of the measures selected from the group a), b) and c), particularly preferably by the combination of the measures a) and b).
  • the present invention comprises a microorganism and a process for the fermentative production of an organic chemical compound
  • the term includes microorganism
  • Bacteria, yeasts and fungi Bacteria, yeasts and fungi.
  • bacteria are in particular the genus Corynebacterium and the genus Escherichia mentioned.
  • Type strain ATCC13032 or strain R are Type strain ATCC13032 or strain R.
  • Corynebacterium ammoniagenes such as
  • strain ATCC6871 with the strains of the species Corynebacterium glutamicum being most preferred.
  • Strain ATCC14020 designated Brevibacterium divaricatum.
  • the term "Micrococcus glutamicus” for Corynebacterium glutamicum was also common.
  • Corynebacterium efficiens have also been referred to in the art as Corynebacterium thermoaminogenes, such as strain FERM BP-1539.
  • the representatives of Enterobacteriaceae are preferably selected from the genera Escherichia, Erwinia,
  • the genera Escherichia and Serratia are particularly preferred. In the genus
  • Escherichia is in particular the species Escherichia coli and in the genus Serratia in particular the species Serratia marcescens.
  • microorganisms or strains (parent strains) used for the measures of overexpression of the claimed disclosed polypeptide preferably already have the ability of the desired (organic) chemical
  • the term "produce” is also used in the following:
  • the strains used for the overexpression measures have the ability> (at least)> 0.10 g / l, 0.25 g / l,> 0.5 g / l ,> 1.0 g / 1,> 1.5 g / 1,> 2.0 g / 1,> 4 g / 1 or> 10 g / 1 of the desired compound in ⁇ (maximum) 120 hours, ⁇ 96 hours ⁇ 48 hours, ⁇ 36 hours, ⁇ 24 hours or ⁇ 12 hours in the cell or in the nutrient medium to accumulate or accumulate.
  • the parent strains are preferably strains obtained by mutagenesis and selection, by recombinant DNA techniques or by a
  • microorganism also characterized by first in a wild strain, such as in the Corynebacterium glutamicum type strain ATCC 13032 or in the strain ATCC 14067, first Trans-overexpressing transhydrogenase and then causing the microorganism to produce the desired L-amino acid (s) by further genetic engineering as described in the prior art.
  • a wild strain such as in the Corynebacterium glutamicum type strain ATCC 13032 or in the strain ATCC 14067
  • first Trans-overexpressing transhydrogenase and then causing the microorganism to produce the desired L-amino acid (s) by further genetic engineering as described in the prior art.
  • the transformation of the wild-type alone with said polynucleotide is not a measure according to the invention.
  • Corynebacterium glutamicum DM1933 described in Blombach et al. (Appl Environ Microbiol. 2009 Jan; 75 (2): 419-27).
  • An L-lysine secreting or producing strain of the species Corynebacterium efficiens is for example:
  • Resistant aspartate kinases are understood as meaning aspartate kinases (LysC), which have a lower susceptibility to inhibition than wild type (wild type)
  • lysC FBR alleles genes or alleles coding for these aspartate kinases, which are desensitized in comparison with the wild type, are also referred to as lysC FBR alleles.
  • strain ATCC13032 is the appropriate wild-type. Numerous lysC FBR alleles encoding aspartate kinase variants are described in the prior art
  • Amino acid exchanges compared to the wild-type protein have.
  • the lysC gene is also referred to as ask gene. at
  • Enterobacteriaceae will be encoded by the lysC gene
  • Aspartate kinase also known as aspartokinase III. A detailed list with details of which
  • Corynebacterium glutamicum lead to desensitization is contained inter alia in WO2009141330.
  • Corynebacterium glutamicum DSM 17322 described in WO 2007/011939.
  • Corynebacterium glutamicum K76 Ferm BP-1847
  • Corynebacterium glutamicum BPS13 Ferm BP-1777
  • Starting strain for the transhydrogenase overexpressing microorganisms according to the invention can serve, for example:
  • Cadaverine producing or excretory microorganisms are described for example in WO 2007/113127.
  • strains of the genus Escherichia in particular of the species Escherichia coli, which can serve as a starting strain for the transhydrogenase overexpressing microorganisms according to the invention, are, for example: Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572)
  • Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4, 278, 765)
  • Escherichia coli VNIIgenetics Ml (US Pat. No. 4,321,325) Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US Pat. No. 5,631,157)
  • Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5, 175, 107)
  • Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)
  • segregating strains of the genus Serratia in particular of the species Serratia marcescens, which can serve as starting strain for the transhydrogenase overexpressing microorganisms according to the invention, are, for example:
  • Serratia marcescens TLrl56 (Gene 57 (2-3): 151-158
  • segregating strains of the genus Escherichia, in particular of the species Escherichia coli, which can serve as starting strain for the transhydrogenase overexpressing microorganisms according to the invention are, for example:
  • Escherichia coli JP4735 / pMU3028 (US5,756,345)
  • Escherichia coli JP6015 / pMU91 (US5,756,345)
  • Escherichia coli JB102 / p5LRPS2 (US Pat. No. 5,939,295).
  • segregating strains of the genus Escherichia, in particular of the species Escherichia coli, which can serve as a starting strain for the transhydrogenase overexpressing microorganisms according to the invention is, for example:
  • Escherichia coli NRRL B-12199 (US4,346,170)
  • Amino acid exchanges in the aspartate kinase III protein of Escherichia coli lead to a desensitization to the inhibition by L-lysine is contained in, inter alia, EP 0 834 559 A1 on page 3 (lines 29 to 41).
  • segregating strains of the genus Escherichia, in particular of the species Escherichia coli, which can serve as a starting strain for the transhydrogenase overexpressing microorganisms according to the invention is, for example:
  • Escherichia coli AJ11502 (NRRL B-12288) (US-A-4391907).
  • Transhydrogenase is an enzyme capable of converting NADH to NADPH and vice versa, i. E. Under the term “transhydrogenase” is part of the
  • Nicotinamide dinucleotide transhydrogenase to understand.
  • the genes for a transhydrogenase can be extracted from the
  • Organisms can be isolated using the polymerase chain reaction (PCR) using suitable primers.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the measures of the invention are preferably used for the transhydrogenase from Corynebacteria encoding genes. Particular preference is given to using genes which code for polypeptides having a transhydrogenase activity whose amino acid sequence is> (at least) ⁇ 80%,> 90%,> 92%,> 94%,> 96%,> 97%,> 98% 99% identical to the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 2.
  • the transhydrogenase-encoding polynucleotide of Corynebacterium glutamicum was identified.
  • the sequence of the gene is deposited under Seq ID No .1.
  • a gene is chemically a polynucleotide.
  • Polynucleotide encoding a protein / polypeptide is used synonymously with the term "gene”.
  • the latter overexpresses a gene coding for a polypeptide selected from the following i) to vi): i) a polypeptide consisting of or containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; ii) a polypeptide having an amino acid sequence which is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% identical to the amino acid sequence of i), ie wherein at least 80%, at least 85% %, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% of the amino acid positions are identical to those of SEQ ID NO: 2; iii) a polypeptide as described under i) or ii), wherein the polypeptide has the activity of a transhydrogenase; iv) a polypeptide having an amino acid sequence containing a deletion, substitution, insertion and / or addition
  • the percent identity is preferably calculated over the entire length of the amino acid or nucleic acid region.
  • Sequence identity percentages are preferably used with the GAP program over the entire sequence region
  • conservative amino acid substitutions are preferred.
  • the aromatic amino acids are called conservative exchanges when phenylalanine, tryptophan and tyrosine are interchanged.
  • the hydrophobic amino acids are called conservative ones
  • Escherichia characterized in that one carries out the following steps
  • a compound-producing microorganism wherein in the microorganism, a polynucleotide is overexpressed, wherein the polynucleotide for a polypeptide according to SEQ ID NO: 2
  • Fermentation broth expires; b) enriching the organic chemical compound in the fermentation broth from a).
  • Escherichia characterized in that one carries out the following steps a) fermentation of an organic chemical
  • a compound-producing microorganism wherein in the microorganism, a polynucleotide is overexpressed, wherein the polynucleotide for a polypeptide according to SEQ ID NO: 2 including 1 to 12, 1 to 6 deletions, substitutions, insertions and / or
  • polypeptide has the activity of a
  • Fermentation broth expires; b) enriching the organic chemical compound in the fermentation broth from a).
  • polynucleotides can be used which hybridize with the nucleotide sequence which is complementary to SEQ ID NO: 1, preferably the coding region of SEQ ID NO: 1, under stringent conditions and encode a polypeptide which has the activity of a transhydrogenase.
  • Hybridization takes place under stringent conditions, that is, only hybrids become
  • the probe i. a polynucleotide comprising the nucleotide sequence complementary to SEQ ID NO: 1, preferably the coding region of SEQ ID NO: 1, and the target sequence, d. H. those treated with the probe
  • Varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration is influenced or determined.
  • Hybridization reaction is generally performed at relatively low stringency as compared to the washing steps (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
  • a buffer corresponding to 5x SSC buffer at a temperature of about 50 ° C - 68 ° C can be used.
  • probes can also hybridize with polynucleotides which have less than 70% identity to the nucleotide sequence of the probe used. Such hybrids are less stable and are removed by washing under stringent conditions. This can be achieved, for example, by lowering the salt concentration to 2 ⁇ SSC or 1 ⁇ SSC and, if appropriate, subsequently 0.5 ⁇ SSC (The DIG System User 's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), a temperature of approx. 50 ° C - 68 ° C, about 52 ° C
  • the salt concentration optionally possible to lower the salt concentration to a concentration corresponding to 0.2x SSC or 0.1x SSC.
  • it contains the SSC buffer Sodium dodecyl sulfate (SDS) at a concentration of 0.1%.
  • Polynucleotide fragments are isolated which have at least 80%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%, optionally 100% identity to the sequence or complementary sequence of the probe used and for polypeptide which has the activity of a
  • Transhydrogenase encoding gene in a desired amino acid (s) producing microorganism or parent or parent strain overexpressed.
  • Overexpression is generally understood as an increase in the intracellular concentration or activity of a patient
  • Ribonucleic acid a protein (polypeptide) or an enzyme compared to the parent strain (parent strain) or wild-type strain, if this is the parent strain.
  • a parent strain is the strain on which the overexpression was performed.
  • DNA molecules include, for example, promoters, expression cassettes, genes, alleles, coding regions, etc .. These are by methods of transformation, conjugation, transduction or
  • the activity (total activity in the cell) or concentration of the corresponding polypeptide is generally increased by at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%. or 500%, preferably at most up to 1000%, 2000%, 4000%, 10000% or 20,000%, based on the activity or concentration of the polypeptide in the strain prior to the measure leading to overexpression.
  • RNA Ribonucleic acid
  • promote activator proteins
  • expression cassette optionally comprising a start codon are also referred to as expression cassette.
  • the increase in copy number can be made by plasmids that replicate in the cytoplasm of the microorganism.
  • plasmids that replicate in the cytoplasm of the microorganism.
  • a wealth of plasmids for the most diverse groups of microorganisms are described in the prior art, with which one can set the desired increase in the copy number of the gene.
  • Suitable plasmids for the genus Escherichia are described, for example, in the handbook Molecular
  • Chromosome of the microorganism done. Suitable methods for the genus Corynebacterium are described for example in the patent WO 03/014330, WO 03/040373 and WO 04/069996. Examples of suitable methods for the genus Escherichia are the incorporation of a gene copy into the site of the phage (Yu and Court, Gene 223, 77-81 (1998)), the chromosomal amplification with the aid of the phage Mu, as described in EP 0 332 448, or Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) or Link et al. (Journal of Bacteriology 179, 6228-6237 (1997)) methods of gene replacement using
  • a strong promoter can be achieved, which is functionally linked to the gene to be expressed.
  • a promoter is used which is stronger than the natural, d. H. the promoter present in the wild type or parent strain. For this purpose, a wealth of methods are available in the prior art.
  • a “functional link” is understood to mean the sequential arrangement of a
  • Suitable promoters for the genus Corynebacterium can be found inter alia in Morinaga et al. (Journal of
  • Promoters T3, T7, SP6, M13, lac, tac and trc are used. Examples of promoters which permit controlled, that is to say inducible or repressible expression are described, for example, in Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)).
  • Such promoters or expression cassettes are typically employed at intervals of 1 to 1000, preferably 1 to 500, nucleotides upstream of the first nucleotide of the start codon of the coding region of the gene.
  • promoters of Escherichia coli The structure of promoters of Escherichia coli is well known. It is therefore possible to alter the strength of a promoter by modifying its sequence by means of one or more exchanges and / or one or more
  • Insertion (s) and / or one or more deletions of nucleotides can be found, inter alia, in "Herder Encyclopedia of Biology” (Spektrum
  • Corynebacterium glutamicum The structure of the ribosome binding site Corynebacterium glutamicum is also well known and is described, for example, in Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)) and in handbooks and textbooks of genetics, such as "genes and
  • the said measures for overexpression can be suitably combined with each other.
  • Expression cassette with the increase in copy number and preferably the use of a suitable promoter with the increase in copy number can be combined.
  • the extent of expression or overexpression can be determined by measuring the amount of mRNA transcribed from the gene, by determining the amount of the polypeptide and by determining the enzyme activity.
  • the method of "Northern Blotting's" and the quantitative RT-PCR can be used.
  • quantitative RT-PCR the polymerase chain reaction is preceded by reverse transcription.
  • the LightCycler TM system from Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) can be used, as described, for example, in Jungwirth et al. (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)).
  • the concentration of the protein can be over 1- and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical resolution
  • the method according to the invention, or the microorganisms according to the invention can / can continuously - as
  • Feed process are operated / cultured for the purpose of producing the desired organic chemical compound.
  • a general summary of known cultivation methods is in the textbook by Chmiel
  • Fermentation medium or medium are mutually exchangeable.
  • sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose,
  • sucrose-containing solutions from sugar beet or cane ⁇ processing starch, starch and cellulose, oils and fats, such as soybean oil,
  • Sunflower oil peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid,
  • Alcohols such as glycerin, methanol and ethanol and organic acids such as acetic acid or lactic acid can be used.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract,
  • Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • phosphorus source can phosphoric acid
  • the culture medium must further contain salts, for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • salts for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids such as homoserine and vitamins such as thiamine, biotin or pantothenic acid in addition to the above substances can be used.
  • the said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • the pH is generally adjusted to a value of 6.0 to 8.5, preferably 6.5 to 8. to
  • Foam control can be used with antifoams, such as fatty acid polyglycol esters.
  • suitable, selectively acting substances such as antibiotics, may be added to the medium.
  • Fermentation is preferably carried out under aerobic conditions. To uphold this, will be
  • Oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as
  • Example air entered into the culture The use of liquids enriched with hydrogen peroxide is also possible. If necessary, the
  • the temperature of the culture is usually from 20 ° C to 45 ° C and preferably from 25 ° C to 40 ° C, more preferably from 30 ° to 37 ° C.
  • In batch process is the cultivation
  • Course of the fermentation can be carried out by separation of the L-amino acids by means of ion exchange chromatography
  • the detection is carried out photometrically (absorption,
  • keto acids such as KIC to determine the concentration at one or more times in the
  • Detection at 215nm (alternatively at 230 or 275 nm) done.
  • a REZEX RFQ Fast Fruit H + column (Phenomenex) may be used, other suppliers for the separation phase (e.g., Aminex from BioRad) are possible. Analogous separations are in corresponding
  • a fermentation broth is understood to mean a
  • Fermentation used media contains / contain
  • the resulting fermentation broth contains accordingly a) due to the proliferation of the cells of the
  • Microorganism b) the desired organic chemical compound formed during the fermentation, c) the organic by-products formed during the fermentation, and d) those not consumed by the fermentation
  • Vitamins such as biotin or salts such as magnesium sulfate.
  • the organic by-products include substances produced by the microorganisms used in the fermentation in addition to the respective desired compound and
  • sugars such as trehalose.
  • the fermentation broth is removed from the culture vessel or the fermentation container, optionally collected, and used to a organic chemical Compound-containing product, preferably to provide an L-amino acid-containing product in liquid or solid form.
  • a organic chemical Compound-containing product preferably to provide an L-amino acid-containing product in liquid or solid form.
  • the simplest case is the fermentation tank
  • withdrawn L-amino acid-containing fermentation broth itself is the recovered product.
  • Water (measure a) is also referred to as drying.
  • a wealth of technical instructions are available in the prior art.
  • purified L-lysine (EP-B-0534865).
  • Another group as described, for example, in US Pat. Nos. 6,340,486 and 6,465,025, comprises aqueous, acidic, biomass-containing concentrates of L-lysine-containing fermentation broths.
  • the most common group of solid products comprises powdered or crystalline forms of purified or pure L-lysine, which is typically in the form of a salt such as L-lysine monohydrochloride.
  • Another group of solid product forms is described for example in EP-B-0533039. The one described there In addition to L-lysine, the product form contains most of the starting materials used and not consumed during the fermentative production and, if appropriate, the biomass of the microorganism used with a proportion of> 0% to 100%.
  • EP-B-0534865 discloses a process for preparing aqueous, basic L-lysine-containing solutions
  • sodium, potassium or ammonium hydroxide a pH between 9 to 11 is set.
  • Mineral constituents inorganic salts are separated from the broth after concentration and cooling by crystallization and either used as fertilizer or discarded.
  • the biomass may be wholly or partly by separation methods such as centrifugation, filtration, decantation or a combination thereof removed from the fermentation broth or left completely in it. If necessary, the biomass
  • biomass-containing fermentation broth during a suitable process step inactivated, for example, by thermal treatment (heating) or by acid addition.
  • the biomass is completely or almost completely removed so that no (0%) or at most 30%, at most 20%, at most 10%, at most 5%, at most 1% or at most 0.1% biomass remains in the product produced.
  • the biomass is not removed or only in minor proportions, so that all (100%) or more than 70%, 80%, 90%, 95%, 99% or 99.9% biomass remains in the product produced. Accordingly, in a method according to the invention, the biomass is removed in proportions of> 0% to - 100%.
  • Fermentation broth before or after the complete or partial removal of the biomass with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid or organic acid such as propionic acid are adjusted to an acidic pH (GB 1,439,728 or EP 1 331 220). It is also possible, the fermentation broth with the complete
  • the broth can also be prepared by adding sodium bisulfite (NaHSC> 3, GB
  • 1,439,728) or another salt for example ammonium, alkali metal or alkaline earth metal salt of sulfurous acid
  • Components of the fermentation medium stay at least partially (> 0%), preferably too
  • these also remain complete (100%) or nearly complete, that is> 95% or> 98% or greater than 99%, in the product. Contains a product in this sense
  • Fermentation broth this is also described by the term “fermentation broth-based product.”
  • the broth is then treated by known methods, such as by means of a rotary evaporator,
  • Concentrated fermentation broth may then be prepared by freeze-drying, spray-drying, spray granulation or other methods such as, for example, in the circulating fluidized bed
  • PCT / EP2004 / 006655 be worked up into free-flowing products, in particular to a finely divided powder or preferably coarse-grained granules.
  • a finely divided powder or preferably coarse-grained granules are preferably fine-grained granules.
  • a coarse-grained granules are preferably coarse-grained granules.
  • free-flowing refers to powders that consist of a series of glass discharge vessels of different sizes
  • Outlet openings leak at least from the vessel with the opening 5 mm (millimeters) unhindered (small: soaps, oils, fats, waxes 94, 12 (1968)).
  • finely divided is a powder with a predominant proportion (> 50%) of a particle size of 20 to 200 pm diameter
  • the particle size can be determined by methods of
  • dust-free means that the product only small proportions ( ⁇ 5%) of particle sizes below 100 pm
  • Diameter contains.
  • Another object of the invention is a method which in its basic features in WO 2007/042363 AI
  • fermentation broth from which the biomass was optionally completely or partially separated, carried out a process comprising the following steps: a) the pH by addition of sulfuric acid to 4.0 to 5.2, in particular 4.9 to 5, 1, and a molar sulfate / L-lysine ratio of 0.85 to 1.2, preferably 0.9 to 1.0, particularly preferably> 0.9 to ⁇ 0.95, in the broth, optionally by adding a further or more sulfate-containing compound (s) and b) the resulting mixture by removal of water
  • step a) one or both of the following measures is / are carried out: c) measurement of the molar ratio of sulfate / L-lysine to determine the required amount of sulfate-containing compound (s) d) additive a sulfate-containing compound selected from the group of ammonium sulfate, ammonium bisulfate and
  • a salt of the sulfurous acid preferably alkali metal hydrogen sulfite
  • Preferred sulfate-containing compounds in the sense of the abovementioned process steps are in particular
  • Ammonium sulfate and / or ammonium hydrogen sulfate or corresponding mixtures of ammonia and sulfuric acid and sulfuric acid itself is calculated according to the
  • Excipients or carriers such as starch, gelatin, cellulose derivatives or similar substances, such as
  • binding, gelling, or thickening agents commonly used in food or feed processing as binding, gelling, or thickening agents, or of other materials such as, for example
  • Silicas, silicates (EP0743016A) and stearates Silicas, silicates (EP0743016A) and stearates.
  • oils can be treated with oils or fats as described in WO 04/054381.
  • oils can be treated with oils or fats as described in WO 04/054381.
  • Mineral oils vegetable oils or mixtures of vegetable oils. Examples of such oils are soybean oil, olive oil, so aöl / Lecithingemische. In the same way, silicone oils, polyethylene glycols or
  • Hydroxyethylcellulose suitable.
  • the treatment of the surfaces with the oils mentioned achieves an increased abrasion resistance of the product and a reduction in the dust content.
  • the content of oil in the product is 0.02 to 2.0 wt .-%, preferably 0.02 to 1.0 wt .-%, and completely
  • the proportion of dust, d. H. Particles with a particle size ⁇ 100 pm, is preferably> 0 to 1 wt .-%, more preferably at most 0.5 wt .-%.
  • the product can also be applied to a conventional and customary organic or inorganic carrier in animal feed processing, such as, for example
  • Thickening or binding agents are mixed and stabilized. Application examples and methods for this are in of the literature (The Mill + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, page 817).
  • Coating with film formers such as metal carbonates, silicas, silicates, alginates, stearates, starches, gums and cellulose ethers, as described in DE-C-4100920, be brought into a state in which it is stable to the digestion by Animal stomachs, especially the stomach of ruminants, is.
  • the L-lysine can be added during the process in the form of a concentrate or optionally a substantially pure substance or its salt in liquid or solid form.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of a solid lysine-containing product, which is described in its basic features in US 20050220933. This is done using the invention
  • a fermentation broth comprising the following steps: a) filtration of the fermentation broth, preferably with a membrane filter, so that a biomass-containing sludge and a filtrate are obtained, b) concentration of the filtrate, preferably such that a solids content of 48 to C) granulation of the concentrate obtained in step b), preferably at a temperature of 50 ° C to 62 ° C, and d) coating of the granules obtained in c) with one or more of the coating agents (coating agent (s))
  • the concentration of the filtrate in step b) can also be such that a solids content of 52 to 55 wt .-%, from 55 to 58 wt .-% or 58 to 61 wt .-%
  • step d) For coating in step d) are preferred
  • Coating agent used which are selected from the group consisting of dl) of the biomass obtained in step a), d2) an L-lysine-containing compound, is preferred
  • L-lysine hydrochloride or L-lysine sulfate d3) a substantially L-lysine-free substance with L-lysine content ⁇ 1 wt .-%, preferably ⁇ 0.5 wt .-%, preferably selected from the group starch , Karageenan, Agar,
  • the content of L-lysine is adjusted to a desired value.
  • the ratio of the ions is preferably adjusted so that the molar ion ratio according to the following formula
  • the fermentation broth-based solid product thus prepared has a lysine content (as lysine base) of 10% to 70% by weight or 20% to 70% by weight, preferably 30% by weight .-% to 70 wt .-% and most preferably from 40 wt .-% to 70 wt .-% based on the dry mass of the product.
  • Lysine base of 71 wt .-%, 72 wt .-%, 73 wt .-% are
  • the water content of the L-lysine-containing solid product is up to 5 wt .-%, preferably up to 4 wt .-%, and particularly preferably less than 3 wt .-%.
  • strain DM1547 was deposited on January 16, 2001 with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures under the accession number DSM13994.
  • Figure 1 shows plasmid pK18msb_Pg3_lpdA.
  • Figure 2 shows plasmid pZ8-l :: lpdA.
  • Dihydroliponamide dehydrogenase belonging to the flavoprotein disulfide reductase (FDR) family whose members, despite their variety of catalyzed redox reactions have a generally high homology at the sequence and structural level to each other classified.
  • glutamicum ATCC13032 is available from Ikeda and Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), EP 1 108 790 and Kalinowski et al. (Journal of
  • glutamicum is also in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA), in the DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) or in the
  • glutamicum ATCC13032 a DNA fragment of approximately 1.7 kb was synthesized by GeneArt (Regensburg, Germany) (SEQ ID NO: 3) which, in addition to the Pgap3 promoter (DE102011118019.6), provided the flanking sequences for insertion of the Promoter before the native lpdA gene carries. The fragment was introduced via the terminal
  • the lpdA gene from C. glutamicum was amplified by means of two primers, by which the gene was provided upstream with an EcoRI and downstream with a Sall interface. Due to the sequence of the lpdA gene known for C. glutamicum, the following oligonucleotides were used as primers: lpdA_pZ8-l-1 (SEQ ID NO: 4):
  • the primers shown were synthesized by the company MWG Biotech (Ebersberg, Germany).
  • Plasmid is called pZ8-l :: lpdA and is shown in FIG. Example 4:
  • the mutation Pg3_lpdA is to be introduced into the strain Corynebacterium glutamicum DM1547.
  • Strain DM1547 is an aminoethylcysteine-resistant mutant of
  • the vector can not self-replicate in DM1547 and is retained in the cell only if it is integrated into the chromosome as a result of a recombination event.
  • pKl 8msb_Pg3_lpdA was done by plating out the
  • Kanamycin-resistant transcon gants were then streaked on kanamycin (25 mg / l) supplemented LB agar plates and incubated for 24 hours at 33 ° C.
  • the clones were cultured unsupported in LB liquid medium for 30 hours, then streaked on LB agar supplemented with 10% sucrose and incubated for 24 hours Incubated at 33 ° C.
  • the plasmid pKI 8msb_Pg3_lpdA contains as well as the
  • Bacillus subtilis encoding sacB gene Bacillus subtilis encoding sacB gene.
  • the sucrose-inducible expression of the sacB gene results in the formation of levan sucrase, which catalyzes the synthesis of the C. glutamicum toxic product levan.
  • Recombination event with respect to the site of mutation takes place in the excision of AllelS or the incorporation of the mutation or the original copy remains in the chromosome of the host.
  • the primers shown were synthesized by the company MWG Biotech (Ebersberg, Germany).
  • the PCR reactions were carried out with the Taq PCR Core Kit from Quiagen (Hilden,
  • the PCR approach was first subjected to preliminary denaturation at 94 ° C for 2 minutes. This was followed 35 times by repetition of a denaturation step at 94 ° C for 30 seconds, a step of binding the primers to the DNA at 57 ° C for 30 seconds, and the extension step of extending the primers at 72 ° C for 60 seconds.
  • the PCR was subjected to agarose gel electrophoresis (0.8% agarose).
  • the identification of a DNA fragment of 1080 bp length indicates the integration of the promoter Pg3 before lpdA, whereas a DNA fragment of 591 bp length, the wild-type status of the
  • mutants were identified which have the mutation Pg3_lpdA in the form of an integration, one of the strains obtained being called C. glutamicum DM1547_Pg3_lpdA.
  • Plasmids pZ8-l and pZ8-l :: lpdA were analyzed by the electroporation method of Liebl et al. (FEMS
  • Plasmid DNA was made by the usual methods from each one transformant (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927) and checked by restriction cleavage followed by agarose gel electrophoresis.
  • strains obtained were named DM1547 / pZ8-l and DM1547 / pZ8-l :: lpdA as well as DM1933 / pZ8-l and DM1933 / pZ8-l :: lpdA.
  • DM1547_Pg3_lpdA and the starting strain DM1547 were cultured in a nutrient medium suitable for the production of lysine and the lysine content in the culture supernatant was determined.
  • the clones were first propagated on brain Her z agar plates (Merck, Darmstadt, Germany) for 24 hours at 33 ° C. Starting from these agar plate cultures, a preculture was in each case inoculated (10 ml of medium in 100 ml
  • the medium MM was used as medium for the preculture.
  • the preculture was incubated for 24 hours at 33 ° C and 240 rpm on a shaker. From this preculture, a major culture was inoculated so that the initial OD (660 nm) of the major culture was 0.1 OD.
  • the medium MM was also used for the main culture.
  • Table 1 gives an overview of the composition of the cultivation medium used.
  • MOPS morpholinopropanesulfonic acid
  • CSL Corn Steep Liquor
  • MOPS morpholinopropanesulfonic acid
  • saline solution was adjusted to pH 7 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, the sterile substrate and vitamin solutions as well as the dry autoclaved CaCC> 3 were added.
  • Culturing was done in volumes of 10 ml contained in 100 ml baffled Erlenmeyer flasks. The temperature was 33 ° C, the number of revolutions was 250 rpm and the humidity was 80%.
  • the optical density (OD) at a measuring wavelength of 660 nm was determined with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Kunststoff). The educated
  • Lysine was with an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by
  • Control strains DM1547 / pZ8-l and DM1933 / pZ8-l were cultured in a nutrient medium suitable for the production of lysine and the lysine content in the culture supernatant was determined.
  • the strains were first incubated on agar plate with the appropriate antibiotic (brain-heart agar with kanamycin (25 mg / 1)) for 24 hours at 33 ° C. Starting from these agar plate cultures was ever a preculture
  • the medium MM (Table 1 from Example 6) was used which was mixed with kanamycin (25 mg / 1).
  • the preculture was incubated for 24 hours at 33 ° C and 240 rpm on a shaker. From this preculture, a major culture was inoculated so that the initial OD
  • the medium MM was also used for the main culture. Culturing was done in volumes of 10 ml contained in 100 ml baffled Erlenmeyer flasks. The temperature was 33 ° C, the number of revolutions was 250 rpm and the humidity was 80%. After 40 hours, the optical density (OD) at a measuring wavelength of 660 nm was determined with the Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Kunststoff). The educated
  • Lysine was with an amino acid analyzer from Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany) by
  • the L-methionine-producing E. coli strain ECM3 is based on the wild-type K12 strain MG1655.
  • the strain ECM3 as described in EP2205754A2, EP2326724A1 and EP12156052.8 describes a feedback-resistant metA allele, a deletion of the genes metJ, yncA, pykA, pykF and purU, a variant of the spoT gene, and in each case a promoter enhancement in front of the genes metH, metF, gcvT , cysP and cysJ.
  • the strain ECM3 was transformed with the plasmids pZ8-l and pZ8-l_lpdA from example 3 and the transformants were selected with 20 mg / l kanamycin.
  • the resulting strains were designated ECM3 / pZ8-l and ECM3 / pZ8-l_lpdA.
  • ECM3 and ECM3 / pZ8-l_lpdA were evaluated by production trials in 100 ml Erlenmeyer flasks.
  • preculture medium 10% LB medium with 2.5 g / 1 glucose and 90% minimal medium PCI (Table 4)
  • PCI minimal medium
  • 10 ml of PCI minimal medium were then inoculated to an OD 600 nm of 0.2 (Eppendorf Bio-Photometer, Eppendorf AG, Hamburg, Germany) and cultured for 24 hours at 37 ° C.
  • the extracellular L-methionine concentration was measured with a
  • FIG. 1 Map of the plasmid pKI 8msb_Pg3_lpdA
  • KanR kanamycin resistance gene
  • FIG. 2 Map of the plasmid pZ8-l :: lpdA
  • the abbreviations and designations used have the following meaning.
  • the base pair numbers are approximations obtained as part of the reproducibility of measurements.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der eine organisch-chemische Verbindung produziert und/oder ausscheidet, wobei der Mikroorganismus eine erhöhte Expression im Vergleich zu dem jeweiligen Ausgangsstamm von einem Polypeptid LpdA mit der Aktivität einer Transhydrogenase aufweist; sowie ein Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus.

Description

Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der eine organisch-chemische Verbindung produziert und/oder
ausscheidet, wobei der Mikroorganismus eine erhöhte
Aktivität einer Transhydrogenase (LpdA Protein, Genprodukt des lpdA Gens) aufweist; sowie ein Verfahren zur
Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mikroorganismus.
Die vorliegende Erfindung ist im Rahmen eines vom
Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF)
geförderten Projektes (Förderkennzeichen 0313917A)
zustandegekommen .
Stand der Technik
Organisch-chemische Verbindungen, zu denen insbesondere Aminosäuren, organische Säuren, Vitamine, Nukleoside und Nukleotide zählen, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
Zahlreiche dieser Verbindungen werden, wie beispielsweise das L-Lysin, durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, oder von Stämmen der Familie der Enterobacteriaceae,
insbesondere Escherichia coli, hergestellt. Wegen der großen ökonomischen Bedeutung wird ständig an der
Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet.
Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit
Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der
Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die
intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen. Biosynthesewege von Aminosäuren unterliegen in Wildtyp- Stämmen einer strengen metabolischen Kontrolle, die gewährleistet, dass die Aminosäuren nur in dem für den Eigenbedarf der Zelle erforderlichen Maß hergestellt werden. Eine wichtige Voraussetzung für effiziente Produktionsprozesse ist es deshalb, dass geeignete Mikroorganismen verfügbar sind, die im Gegensatz zu Wildtyp-Organismen eine drastisch über den Eigenbedarf hinaus gesteigerte Produktionsleistung (Überproduktion) für die Herstellung der gewünschten Aminosäure aufweisen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die L- Aminosäuren produzieren. Ein bekannter Antimetabolit ist das Lysinanalogon S- ( 2-Aminoethyl ) -L-Cystein (AEC) .
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen der Gattung
Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum, eingesetzt, oder der Gattung Escherichia, insbesondere Escherichia coli, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene modifiziert bzw. verstärkt oder abschwächt und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion
untersucht .
Die Nukleotidsequenzen der Chromosomen zahlreicher
Bakterien sind bekannt.
Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium
glutamicum ATCC13032 ist bei Ikeda und Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), in der EP 1 108 790 und bei Kalinowski et al . (Journal of
Biotechnolgy 104(1-3), (2003)) beschrieben. Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium
glutamicum R ist bei Yukawa et al . (Microbiology
153 (4) : 1042-1058 (2007)) beschrieben.
Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium
efficiens ist bei Nishio et al (Genome Research. 13 (7), 1572-1579 (2003)) beschrieben.
Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium
diphteriae NCTC 13129 wurde von Cerdeno-Tarraga et al .
(Nucleic Acids Research 31 (22), 6516-6523 (2003))
beschrieben.
Die Nukleotidsequenz des Genoms von Corynebacterium
jeikeium wurde von Tauch et al . (Journal of Bacteriology 187 (13), 4671-4682 (2005)) beschrieben.
Die Nukleotidsequenzen des Genoms von Corynebacterium glutamicum sind ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) , in der DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) oder in der
Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) verfügbar.
Eine zusammenfassende Darstellung zu verschiedenen Aspekten der fermentativen Produktion von L-Aminosäuren findet man bei R. Faurie und J. Thommel in Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, Band 79 (Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg (Deutschland) 2003).
Bei der Herstellung der vorstehend genannten organischchemischen Verbindungen unter Einsatz von Mikroorganismen wird jede dieser Verbindungen in einem Biosyntheseweg in der Zelle eines Mikroorganismus hergestellt. Eines der wichtigen Coenzyme, die für die Funktion von wesentlichen Enzymen in dem Biosynthesesystem essentiell sind, ist reduziertes
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (im Folgenden als NADPH bezeichnet ) . Die Beziehung zwischen NADPH und der Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Einsatz von
Mikroorganismen wird zum Beispiel in der EP0733712B
erläutert . Nicotinamiddinukleotidtranshydrogenase (im Folgenden einfach als "Transhydrogenase" bezeichnet) ist als eines der Enzyme bekannt, die für die Produktion von NADPH verantwortlich sind. Es ist bekannt, dass dieses Enzym in verschiedenen Organismen vorhanden ist, einschließlich in Mikroorganismen der Gattung Escherichia. In Escherichia coli, ein typischer
Mikroorganismus der Gattung Escherichia, wurde die Reinigung von Transhydrogenase (David M. Clarke and Philip D. Bragg, Eur. J. Biochem. , 149, 517-523 (1985)), das Klonieren eines dafür kodierenden Gens (David M. Clarke and Philip D. Bragg, J. Bacteriology . , 162, 367-373 (1985)) und die Bestimmung der Nukleotidsequenz des Gens (David M. Clarke, Tip W. Loo,
Shirley Gillam, and Philip D. Bragg, Eur. J. Biochem. 158, 647-653 (1986)) durchgeführt, und es wurde das Vorhandensein des Enzyms gezeigt. Eine physiologische Funktion des Enzyms ist bislang jedoch fast unbekannt. Dies wird typischerweise durch die Tatsache gezeigt, dass Varianten, denen das Enzym fehlt, keine phänotypische Expression zeigen.
Makoto Ishimoto"Metabolic Maps, July 25, 1971 (Kyoritsü Suppan Co., Ltd.), Seiten 130-32, offenbart, dass die reduzierende Aktivität von NADH oder NADPH für die Biosynthese mehrerer
Aminosäuren erforderlich ist. Dieses Dokument offenbart jedoch nicht die Umwandlung von NADH in NADPH für die Biosynthese einer Zielsubstanz.
Bunji Maruo, Nobuo Tamiya (Autoren) "Enzyme Handbook", March 1, 1983 (01.03.83), Asakura Shoten) , S. 132-133 und Arch. Biochem. Biophys. Vol. 176, Nr. 1, 1976, Wermuth B et al . "Pyridine nucleotide transhydrogenase from Pseudomonas aeruginosa purification by affinity chromatography and physiochemical properties", S. 136-143, offenbaren jeweils ein Enzym, das in der Lage ist, NADH in NADPH und umgekehrt umzuwandeln. Keines dieser Dokumente betrifft die Herstellung einer Zielsubstanz oder eine erhöhte
Produktivität für NADPH, die für die Herstellung einer Zielsubstanz eingesetzt werden könnte.
E. coli enthält sowohl eine lösliche als auch eine
membrangebundene Pyridin-Nukleotid-Transhydrogenase . Die lösliche Pyridin-Nukleotid-Transhydrogenase ist das
Genprodukt SthA (Sth, UdhA) ; seine primäre physiologische Rolle scheint der Reoxidation von NADPH. Die
membrangebundene Protonen-übertragende Pyridin-Nukleotid- Transhydrogenase ist das PntAB Genprodukt; PntAB ist eine wichtige Quelle von NADPH (Sauer et al . , The Journal of Biological Chemistry 279(8) (2004)).
Anderlund et al . (Applied and Environmental Microbiology 56(6) (1999)) untersuchten die physiologische Wirkung der Expression der Membran-gebundenen Transhydrogenase (pntA- und pntB-Gene) aus Escherichia coli in rekombinanten
Saccharomyces cerevisiae.
Vor diesem Hintergrund besteht die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe darin, einen gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Mikroorganismen verbesserten Mikroorganismus, Verfahren zur Herstellung eines solchen Mikroorganismus und Verfahren unter Verwendung eines solchen Mikroorganismus zur Überproduktion von organisch chemischen Verbindungen bereitzustellen, wobei die Verbesserung Faktoren wie die intrazellulär erreichte Konzentration der überproduzierten Verbindung, die Ausbeute der überproduzierten Verbindung nach Aufbereitung der Kultur, die Wachstumseigenschaften des Mikroorganismus sowie die für die Überproduktion und Aufbereitung der Verbindung benötigte Zeit und Zahl von Verfahrensschritten sowie den Ressourcenbedarf des Prozesses, beispielsweise mit Hinblick auf Zeit, Energie und Menge der eingesetzten Stämme und Edukte, betrifft. Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand der vorliegenden Anmeldung und insbesondere durch den
Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst, wobei sich Ausführungsformen aus den Unteransprüchen ergeben.
In einem ersten Aspekt wird die der Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen
Verbindung unter Verwendung eines Mikroorganismus
enthaltend die Schritte: a. Fermentation eines eine organisch-chemische Verbindung produzierenden Mikroorganismus,
wobei in dem Mikroorganismus ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert dessen Aminosäuresequenz wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99% identisch ist mit der
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, überexprimiert vorliegt und wobei die Fermentation in einem geeigneten
Fermentationsmedium unter Bildung einer Fermentationsbrühe abläuft und b. Anreichern (Akkumulieren) der organisch-chemischen
Verbindung in der Fermentationsbrühe aus a) .
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter einem eine organisch-chemische Verbindung produzierenden
Mikroorganismus ein Mikroorganismus zu verstehen, der die organisch-chemische Verbindung über den Bedarf hinaus, der zur Erhaltung der Lebensfähigkeit des Mikroorganismus erforderlich ist, produziert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter dem
Anreichern, bzw. Akkumulieren der organisch-chemischen Verbindung in der Fermentationsbrühe sowohl die
Anreicherung/Akkumulierung der organisch-chemischen
Verbindungen in den Mikrorganismenzellen als auch die
Ausscheidung der organisch-chemischen Verbindung in das den Mikroorganismus umgebende Nährmedium, d.h. in die
Fermentationsbrühe, zu verstehen. Die der Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe wird in einem weiteren Aspekt gelöst durch einen Mikroorganismus, der eine organisch-chemische Verbindung produziert, wobei in dem Mikrorganismus ein ein Polynukleotid, das für ein
Polypeptid kodiert dessen Aminosäuresequenz wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99% identisch ist mit der
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, überexprimiert vorliegt. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung, bzw. des erfindungsgemäßen Mikrorganismus weist das kodierte Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99% identisch ist mit der
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, die Aktivität einer Transhydrogenase auf.
Die Aktivität einer Transhydrogenase wird über den
Enzymtest nach Argyrou et al . (2004) nachgewiesen. Hierbei wird aufgereinigte Transhydrogenase hinsichtlich der
NAD (P) H-abhängigen Reduktion von 5-HNQ, einem artifiziellen Elektronenakzeptor, untersucht.
Die für die Maßnahmen der Überexpression des anspruchsgemäß offenbarten Polypeptids eingesetzten Mikroorganismen bzw. Stämme (Ausgangsstämme) besitzen bevorzugt bereits die
Fähigkeit die gewünschte organische chemische Verbindung in der Zelle anzureichern oder in das sie umgebende Nährmedium auszuscheiden und dort zu akkumulieren.
Der Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass die Produktausbeute bei biotechnologischen
Produktionsprozessen, z.B. der Aminosäureproduktion, weiter erhöht wird. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, bzw. mit der Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen kann die mikrobielle Produktion von organisch-chemischen
Verbindungen weiter gesteigert werden.
Daher zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung auch dadurch aus, dass die Herstellung der organisch chemischen Verbindung gegenüber der Fermentation eines
Mikroorganismus, in dem das Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert dessen Aminosäuresequenz wenigstens 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, nicht überexprimiert vorliegt, um mindestens 0,5%,
mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% erhöht ist. Überraschenderweise wurde über eine hohe
Sequenzidentität zu einem Protein mit der Aktivität einer Transhydrogenase (LpdA Protein) in Mycobacterium
tuberculosis eine Transhydrogenase in C. glutamicum
identifiziert. Die Verstärkung der Expression der
Transhydrogenase führte zu einer erhöhten Produktion einer organisch-chemischen Verbindung bei Verwendung eines entsprechenden Produktionsstammes . In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren/ des erfindungsgemäßen Mikroorganismus stammt das Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert dessen
Aminosäuresequenz wenigstens 80%, wenigstens 85%,
wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder
wenigstens 99%, bzw.100% identisch ist mit der
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 2 aus Corynebacterium glutamicum. Besonders bevorzugt weist dieses kodierte
Polypeptid die Aktivität einer Transhydrogenase auf.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus weist eine im
Vergleich zu dem jeweiligen Ausgangstamm erhöhte Expression eines Polynukleotids kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von 80% oder mehr zu der in SEQ ID NO : 2 gezeigten Aminosäuresequenz zeigt, auf.
In bevorzugten Ausführungsformen sind Varianten umfasst, die wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99%
identisch zu der in SEQ ID NO : 2 gezeigten Aminosäuresequenz sind, d.h. wobei wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99% der Aminosäurepositionen identisch zu der in SEQ ID NO : 2 gezeigten Aminosäuresequenz sind. Die prozentuale Identität wird vorzugsweise über die gesamte Länge der Aminosäure oder Nukleinsäureregion berechnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der
Mikroorganismus eine im Vergleich zu dem jeweiligen
Ausgangstamm erhöhte Expression eines Polynukleotids kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 auf.
Da für die Biosynthese von organisch-chemischen
Verbindungen Reduktionsäquivalente in Form von NADPH benötigt werden, ist die verbesserte Versorgung mit
Reduktionsäquivalenten vorteilhaft .
Unter einer organisch-chemischen Verbindung versteht man für die Maßnahmen der Erfindung ein Vitamin wie z.B.
Thiamin (Vitamin Bl), Riboflavin (Vitamin B2),
Cyanocobalamin (Vitamin B12), Folsäure (Vitamin M) ,
Tocopherol (Vitamin E) oder Nicotinsäure/Nicotinsäureamid, ein Nukleosid oder Nukleotid wie z.B. S-Adenosyl-Methionin, Inosin-5- " -Monophosphorsäure und Guanosin-5 " - Monophosphorsäure, L-Aminosäuren, organische Säuren oder auch ein Amin wie z.B. Cadaverin. Bevorzugt hergestellt werden L-Aminosäuren und diese enthaltende Produkte.
Die organisch-chemische Verbindung, die von dem
erfindungsgemäßen Mikroorganismus produziert und/oder ausgeschieden wird, ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Vitamin, Nukleosid oder Nukleotid, L-Aminosäuren,
organische Säuren und Amin.
Der Begriff L-Aminosäuren umfasst die proteinogenen
Aminosäuren, sowie L-Ornithin und L-Homoserin. Unter proteinogenen L-Aminosäuren versteht man die L-Aminosäuren die in natürlichen Proteinen, das heißt in Proteinen von Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen, vorkommen. Zu den proteinogenen Aminosäuren zählen L-Asparaginsäure, L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutaminsäure, L- Glutamin, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L- Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin, L-Prolin und gegebenenfalls L-Selenocystein und L- Pyrrolysin . Der Begriff organische Säure umfasst -Ketosäuren,
insbesondere eine -Ketosäure ausgewählt aus der Gruppe - Ketoisocapronsäure, -Ketovaleriansäure und -Keto-ß- methylvaleriansäure .
In besonders bevorzugter Weise ist die organisch-chemische Verbindung ausgewählt aus der Gruppe proteinogene L- Aminosäure, L-Ornithin und L-Homoserin sowie - Ketoisocapronsäure, -Ketovaleriansäure und -Keto-ß- methylvaleriansäure . Besonders bevorzugt ist die
proteinogene L-Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe L- Threonin, L-Lysin, L-Methionin, L-Valin, L-Prolin, L-
Glutamat, L-Leucin und L-Isoleucin, insbesondere L-Lysin, L-Methionin und L-Valin, ganz besonders L-Lysin und L- Methionin .
Werden im Folgenden Aminosäuren oder L-Aminosäuren erwähnt, umfasst der Begriff auch deren Salze wie beispielsweise das Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat im Falle der
Aminosäure L-Lysin. Ebenso umfasst der Begriff -Ketosäure auch deren Salze wie im Fall der -Ketoisocapronsäure (KIC) das Calcium-KIC, das Kalium-KIC oder das Natrium-KIC. Der Mikroorganismus ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Bakterien, Hefe und Pilze, unter den Bakterien besonders bevorzugt aus der Familie Corynebacteriaceae oder der Familie Enterobacteriaceae, wobei die Gattung
Corynebacterium oder die Gattung Escherichia ganz besonders bevorzugt und aus den genannten Gattungen die Art Corynebacterium glutamicum oder die Art Escherichia Coli besonders bevorzugt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des Polynukleotids kodierend für ein Polypeptid dessen Aminosäuresequenz wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder
wenigstens 99%, bzw.100% identisch ist mit der
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 2 und bevorzugt mit der Aktivität einer Transhydrogenase durch eine oder mehrere Maßnahmen ausgewählt aus der folgenden Gruppe erhöht: a) die Expression des Gens steht unter der Kontrolle eines Promotors, der in dem für das Verfahren verwendeten
Mikroorganismus stärker ist als der native, bzw. der ursprüngliche Promotor des Gens; Beispiele für
erfindungsgemäß bevorzugt in Corynebacterium glutamicum einsetzbare Promotoren sind beispielsweise in Fig. 1 des Übersichtsartikels von Patek et al . (Journal of
Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)) beschrieben. In gleicher Weise können die von Vasicova et al . (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)) beschrieben Varianten des dapA-Promotors , beispielsweise der Promotor A25
eingesetzt werden. Weiterhin kann der gap-Promotor von Corynebacterium glutamicum (EP 06007373) verwendet werden. Schließlich können die hinlänglich bekannten von Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Amann und Brosius
(Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. b) Erhöhung der Kopienzahl des Gens kodierend für ein
Polypeptid mit der Aktivität einer Transhydrogenase;
vorzugsweise durch Einfügen des Gens in Plasmiden mit erhöhter Kopienzahl und/oder durch Integration des Gens in das Chromosom des Mikroorganismus in mindestens einer
Kopie ; c) die Expression des Gens erfolgt unter Verwendung einer Ribosomen-Bindestelle, die in dem für das Verfahren verwendeten Mikroorganismus stärker ist als die ursprüngliche Ribosomen-Bindestelle des Gens; d) die Expression des Gens erfolgt unter Optimierung der Kodon-Verwendung (codon usage) des für das Verfahren verwendeten Mikroorganismus; e) die Expression des Gens erfolgt unter Reduzierung von mRNA Sekundärstrukturen in der vom Gen transkribierten mRNA; f) die Expression des Gens erfolgt unter Eliminierung von RNA-Polymerase-Terminatoren in der vom Gen transkribierten mRNA; g) die Expression des Gens erfolgt unter Verwendung mRNA- stabilisierender Sequenzen in der vom Gen transkribierten mRNA. Die genannten Maßnahmen zur Erhöhung der Expression können in geeigneter Weise miteinander kombiniert werden.
Bevorzugt wird die Expression des Polynukleotids kodierend für ein Polypeptidmit der Aktivität einer Transhydrogenase durch die Kombination mindestens zwei der Maßnahmen ausgewählt aus der Gruppe a) , b) und c) erhöht, besonders bevorzugt durch die Kombination der Maßnahmen a) und b) .
Wie oben erwähnt umfasst die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus sowie ein Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung
enthaltend die Schritte: a) Kultivieren des oben beschriebenen Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung in einem geeignetem Medium, wobei eine Fermentationsbrühe erhalten wird, und b) Anreichern der organisch-chemischen Verbindung in der
Fermentationsbrühe aus a) .
Dabei ist bevorzugt, dass man aus der Fermentationsbrühe ein Produkt in flüssiger oder fester Form herstellt. Wie oben erwähnt, umfasst der Begriff Mikroorganismus
Bakterien, Hefen und Pilze. Unter den Bakterien sind insbesondere die Gattung Corynebacterium und die Gattung Escherichia zu nennen.
Innerhalb der Gattung Corynebacterium werden Stämme
bevorzugt, die auf folgenden Arten beruhen:
Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der
Typstamm DSM44549,
Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der
Typstamm ATCC13032 oder der Stamm R, und
Corynebacterium ammoniagenes , wie zum Beispiel
der Stamm ATCC6871, wobei die Stämme der Art Corynebacterium glutamicum ganz besonders bevorzugt wird.
Einige Stämme der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Bezeichnungen bekannt, Hierzu gehören beispielsweise:
Stamm ATCC13870 der als Corynebacterium acetoacidophilum bezeichnet wurde,
Stamm DSM20137 der als Corynebacterium lilium
bezeichnet wurde,
Stamm ATCC17965 der als Corynebacterium melassecola bezeichnet wurde,
Stamm ATCC14067 der als Brevibacterium flavum
bezeichnet wurde,
Stamm ATCC13869 der als Brevibacterium lactofermentum bezeichnet wurde, und
Stamm ATCC14020 der als Brevibacterium divaricatum bezeichnet wurde. Der Begriff „Micrococcus glutamicus" für Corynebacterium glutamicum war ebenfalls gebräuchlich.
Einige Stämme der Art Corynebacterium efficiens wurden im Stand der Technik auch als Corynebacterium thermoaminogenes bezeichnet, wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539.
Die Vertreter der Enterobacteriaceae werden bevorzugt ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Erwinia,
Providencia und Serratia. Die Gattungen Escherichia und Serratia werden besonders bevorzugt. Bei der Gattung
Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli und bei der Gattung Serratia insbesondere die Art Serratia marcescens zu nennen.
Die für die Maßnahmen der Überexpression des anspruchsgemäß offenbarten Polypeptids eingesetzten Mikroorganismen bzw. Stämme (Ausgangsstämme) besitzen bevorzugt bereits die Fähigkeit die gewünschte (n) organisch-chemischen
Verbindungen in der Zelle anzureichern oder in das sie umgebende Nährmedium auszuscheiden und dort zu
akkumulieren. Hierfür wird im Folgenden auch der Ausdruck „produzieren" verwendet. Insbesondere besitzen die für die Maßnahmen der Überexpression eingesetzten Stämme die Fähigkeit > (mindestens) > 0,10 g/1, 0,25 g/1, > 0,5 g/1, > 1,0 g/1, > 1,5 g/1, > 2,0 g/1, > 4 g/1 oder > 10 g/1 der gewünschten Verbindung in < (maximal) 120 Stunden, < 96 Stunden, < 48 Stunden, < 36 Stunden, < 24 Stunden oder < 12 Stunden in der Zelle oder im Nährmedium anzureichern bzw. zu akkumulieren. Bei den Ausgangsstämmen handelt es sich bevorzugt um Stämme, die durch Mutagenese und Selektion, durch rekombinante DNA-Techniken oder durch eine
Kombination beider Methoden hergestellt wurden.
Es ist für den Fachmann verständlich, dass man zu einem für die Maßnahmen der Erfindung geeignetem Mikroorganismus auch dadurch gelangen kann, indem man in einem Wildstamm, wie zum Beispiel in dem Corynebacterium glutamicum Typstamm ATCC 13032 oder in dem Stamm ATCC 14067, zunächst eine Transhydrogenase überexprimiert und anschließend durch weitere, im Stand der Technik beschriebene, genetische Maßnahmen, den Mikrorganismus veranlasst, die gewünschte (n) L-Aminosäure (en) zu produzieren. Die Transformation des Wildtyps allein mit dem genannten Polynukleotid ist keine erfindungsgemäße Maßnahme.
L-Lysin ausscheidende bzw. produzierende Stämme der Art Corynebacterium glutamicum, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise:
Corynebacterium glutamicum DSM13994 beschrieben in US
6,783,967, und
Corynebacterium glutamicum DM1933 beschrieben bei Blombach et al. (Appl Environ Microbiol. 2009 Jan; 75 ( 2 ) : 419-27 ) . Ein L-Lysin ausscheidender bzw. produzierender Stamm der Art Corynebacterium efficiens ist beispielsweise:
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) beschrieben in US 5,250,423.
L-Lysin produzierende Mikrorganismen besitzen
typischerweise eine „feed back" resistente bzw.
desensibilisierte Aspartatkinase. Unter „feed back"
resistenten Aspartatkinasen versteht man Aspartatkinasen (LysC) , die im Vergleich zur Wildform (Wildtyp) eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch
Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC
(Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin allein oder AEC allein aufweisen. Die für diese im Vergleich zum Wildtyp desensibilisierten Aspartatkinasen kodierenden Gene bzw. Allele werden auch als lysCFBR-Allele bezeichnet. Im Falle der Aspartatkinasen der Art Corynebacterium glutamicum ist der Stamm ATCC13032 der geeignete Wildtyp. Im Stand der Technik sind zahlreiche lysCFBR-Allele beschrieben, die für Aspartatkinasevarianten kodieren, welche
Aminosäureaustausche im Vergleich zum Wildtypprotein besitzen. Bei Bakterien der Gattung Corynebacterium wird das lysC-Gen auch als ask-Gen bezeichnet. Bei
Enterobacteriaceae wird die vom lysC-Gen kodierte
Aspartatkinase auch als Aspartokinase III bezeichnet. Eine ausführliche Liste mit Angaben welche
Aminosäureaustausche im Aspatatkinaseprotein von
Corynebacterium glutamicum zu einer Desensibilisierung führen ist unter anderem in der WO2009141330 enthalten. Bevorzugt werden Aspartatkinasevarianten, welche folgende Aminosäureaustausche tragen, ausgewählt aus der Gruppe: an Position 380 der Aminosäuresequenz L-Isoleucin anstelle von L-Threonin und gegebenenfalls an Position 381 L- Phenylalanin anstelle L-Serin, an Position 311 L-Isoleucin anstelle L-Threonin und an Position 279 L-Threonin anstelle L-Alanin.
Ein L-Methionin ausscheidender bzw. produzierender Stamm der Art Corynebacterium glutamicum, der als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase
überexprimierenden Mikroorganismen dienen kann, ist
beispielsweise
Corynebacterium glutamicum DSM 17322 beschrieben in WO 2007/011939.
Bekannte Vertreter L- Tryptophan produzierender bzw.
ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise :
Corynebacterium glutamicum K76 (=Ferm BP-1847) beschrieben in US 5,563,052, Corynebacterium glutamicum BPS13 (=Ferm BP-1777) beschrieben in US 5,605,818, und
Corynebacterium glutamicum Ferm BP-3055
beschrieben in US 5,235,940. Bekannte Vertreter L-Valin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise:
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763
beschrieben in US 5,188,948,
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007
beschrieben in US 5,521,074, Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006
beschrieben in US 5,521,074, und
Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764
beschrieben in US 5,188,948.
Bekannte Vertreter L-Isoleucin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien, die als
Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise :
Brevibacterium flavum FERM BP-760
beschrieben in US 4,656,135,
Brevibacterium flavum FERM BP-2215
beschrieben in US 5,294,547, und
Corynebacterium glutamicum FERM BP-758
beschrieben in US 4,656,135. Bekannte Vertreter L-Homoserin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme coryneformer Bakterien, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise : Micrococcus glutamicus ATCC 14296
beschrieben in US 3,189,526 und Micrococcus glutamicus ATCC 14297
beschrieben in US 3,189,526.
Cadaverin produzierende bzw. ausscheidende Mikroorganismen sind beispielsweise in der WO 2007/113127 beschrieben. Bekannte Vertreter L-Threonin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise: - Escherichia coli H4581 (EP 0 301 572)
Escherichia coli KY10935 (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61 ( 11 ) : 1877-1882 (1997)
- Escherichia coli VNIIgenetika MG442 (US-A-4, 278, 765)
- Escherichia coli VNIIgenetika Ml (US-A-4, 321, 325) - Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 (US-A-5, 631, 157)
- Escherichia coli BKIIM B-3996 (US-A-5 , 175 , 107 )
- Escherichia coli kat 13 (WO 98/04715)
- Escherichia coli KCCM-10132 (WO 00/09660)
Bekannte Vertreter L-Threonin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme der Gattung Serratia, insbesondere der Art Serratia marcescens, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise:
Serratia marcescens HNr21 (Applied and Environmental Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979))
Serratia marcescens TLrl56 (Gene 57(2-3): 151-158
(1987) )
Serratia marcescens T-2000 (Applied Biochemistry and Biotechnology 37(3): 255-265 (1992)). Bekannte Vertreter L-Tryptophan produzierender bzw.
ausscheidender Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise:
- Escherichia coli JP4735/pMU3028 (US5 , 756 , 345 )
- Escherichia coli JP6015/pMU91 (US5 , 756 , 345 )
- Escherichia coli SV164(pGH5)
(WO94/08031) - E. coli AGX17(pGX44) (NRRL B-12263) (US 4 , 371 , 614 )
- E. coli AGX6 (pGX50 ) aroP (NRRL B-12264) (US 4 , 371 , 614 )
- Escherichia coli AGX17/pGX50 , pACKG4-pps (WO97/08333)
- Escherichia coli ATCC 31743
(CA1182409) - E. coli C534/pD2310,pDM136 (ATCC 39795) (WO87/01130)
- Escherichia coli JB102/p5LRPS2 (US5, 939, 295) .
Bekannter Vertreter L-Homoserin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, ist beispielsweise:
Escherichia coli NZ10rhtA23/pAL4 (US
6, 960, 455) .
Bekannte Vertreter L-Lysin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, sind beispielsweise: • Escherichia coli pDAl/TOC21R (= CNCM 1-167) (FR-A- 2511032) ,
• Escherichia coli NRRL B-12199 (US4 , 346 , 170 )
• Escherichia coli NRRL B-12185 (US4 , 346 , 170 ) . Eine ausführliche Liste mit Angaben welche
Aminosäureaustausche im Aspartatkinase III Protein von Escherichia coli zu einer Desensibilisierung gegenüber der Hemmung durch L-Lysin führen ist in unter anderem in der EP 0 834 559 AI auf Seite 3 (Zeilen 29 bis 41) enthalten.
Bevorzugt wird eine Aspartkinasevariante, welche an
Position 323 der Aminosäuresequenz L-Asparaginsäure
anstelle Glycin und/oder an Position 318 L-Isoleucin anstelle L-Methionin enthält.
Bekannter Vertreter L-Valin produzierender bzw.
ausscheidender Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli, die als Ausgangsstamm für die erfindungsgemäß die Transhydrogenase überexprimierenden Mikroorganismen dienen können, ist beispielsweise:
• Escherichia coli AJ11502 (NRRL B-12288) (US-A- 4391907) .
Unter einem Polypeptid mit der Aktivität einer
Transhydrogenase versteht man ein Enzym, das in der Lage ist, NADH in NADPH und umgekehrt umzuwandeln, d.h. unter dem Begriff „Transhydrogenase" ist im Rahmen der
vorliegenden Erfindung eine
Nicotinamiddinukleotidtranshydrogenase zu verstehen.
In den öffentlichen Datenbanken, wie beispielsweise der Datenbank UniProtKB (Universal Protein Resource
Knowledgebase) , sind Transhydrogenasen verschiedenster Lebewesen beschrieben. Die Datenbank UniProtKB wird vom UniProt Konsortium unterhalten, dem das European Bioinformatics Institute (EBI, Wellcome Trust, Hinxton Cambridge, United Kingdom) , das Swiss Institute of
Bioinformatics (SIB, Centre Medical Universitaire, Genf, Schweiz) und die Protein Information Resource (PIR,
Georgetown University, Washington, DC, US) angehören.
Die Gene für eine Transhydrogenase können aus den
Organismen mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung geeigneter Primer isoliert werden.
Anleitungen findet man unter anderem im Laborhandbuch „PCR" von Newton und Graham (Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Deutschland, 1994)und in der WO 2006/100211 auf Seite 14 bis 17.
Für die Maßnahmen der Erfindung werden bevorzugt für die Transhydrogenase aus Corynebacterien kodierende Gene eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Gene eingesetzt, die für Polypeptide mit Aktivität einer Transhydrogenase kodieren, deren Aminosäuresequenz > (mindestens) ^ 80%, ^ 90%, > 92%, > 94%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, identisch sind mit der Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 2. Während der Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurde das für die Transhydrogenase kodierende Polynukleotid von Corynebakterium glutamicum identifiziert.
Die Sequenz des Gens ist unter Seq ID No .1 hinterlegt.
Ein Gen ist chemisch gesehen ein Polynukleotid. Ein
Polynukleotid, das ein Protein/Polypeptide kodiert wird hier synonym zum Begriff „Gen" gebraucht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bzw. des erfindungsgemäßen Mikroorganismus überexprimiert dieser ein Gen kodierend für ein Polypeptid ausgewählt aus den folgenden i) bis vi) : i) ein Polypeptid bestehend aus oder enthaltend die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz; ii) ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von i), d.h. wobei wenigstens 80%, wenigstens 85%, wenigstens 90%, wenigstens 95%, wenigstens 98% oder wenigstens 99% der Aminosäurepositionen identisch zu jenen der SEQ ID NO: 2 sind; iii) ein Polypeptid wie unter i) oder ii) beschrieben, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Transhydrogenase aufweist; iv) ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz enthaltend eine Deletion, Substitution, Insertion und/oder Addition von 1 bis 90, 1 bis 45, 1 bis 23, 1 bis 12, 1 bis 6
Aminosäureresten bezüglich der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist; v) ein Polypeptid wie unter iv) beschrieben, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Transhydrogenase aufweist; vi) ein Polypeptid wie unter v) beschrieben, wobei das Polypeptid die Aktivität einer Transhydrogenase aufweist und die Deletion, Substitution, Insertion und/oder Addition von Aminosäureresten die Aktivität im Wesentlichen nicht beeinflusst ;
Die prozentuale Identität wird vorzugsweise über die gesamte Länge der Aminosäure oder Nukleinsäureregion berechnet. Eine Reihe von Programmen, die auf einer
Vielzahl von Algorithmen beruhen, steht dem Fachmann für den Sequenzvergleich zur Verfügung. In diesem Zusammenhang ergeben die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders verlässliche Ergebnisse. Für das Alignment der Sequenzen stehen das Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al . , CABIOS, 5 1989: 151-153 ) oder die Programme Gap und BestFit
[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) und Smith and Waterman (Adv. Appl . Math. 2; 482-489
(1981))], die zum Softwarepaket GCG gehören [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] zur Verfügung. Die oben aufgeführten
Prozentwerte für die Sequenzidentität werden vorzugsweise mit dem Programm GAP über die gesamte Sequenzregion
berechnet .
Gegebenenfalls werden konservative Aminosäureaustausche bevorzugt. Bei den aromatischen Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den hydrophoben Aminosäuren spricht man von konservativen
Austauschen, wenn Leucin, Isoleucin und Valin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den polaren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Glutamin und
Asparagin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den basischen Aminosäuren spricht man von konservativen
Austauschen, wenn Arginin, Lysin und Histidin gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den sauren Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Asparaginsäure und Glutaminsäure gegeneinander ausgetauscht werden. Bei den Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Aminosäuren spricht man von konservativen Austauschen, wenn Serin und Threonin
gegeneinander ausgetauscht werden.
Besonders bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen daher die fermentative Herstellung von L-Lysin oder L-Methionin unter Verwendung eines
Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder
Escherichia, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt
Fermentation eines eine organisch-chemische
Verbindung produzierenden Mikroorganismus, wobei in dem Mikroorganismus ein Polynukleotid überexprimiert vorliegt, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO : 2
einschließlich 1 bis 12, 1 bis 6 Deletionen, Substitutionen, Insertionen und/oder Additionen kodiert, und wobei die Fermentation in einem Fermentationsmedium unter Bildung einer
Fermentationsbrühe abläuft; b) Anreichern der organisch-chemischen Verbindung in der Fermentationsbrühe aus a) .
Besonders bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen weiterhin die fermentative Herstellung von L-Lysin oder L-Methionin unter Verwendung eines
Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder
Escherichia, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt a) Fermentation eines eine organisch-chemische
Verbindung produzierenden Mikroorganismus, wobei in dem Mikroorganismus ein Polynukleotid überexprimiert vorliegt, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO : 2 einschließlich 1 bis 12, 1 bis 6 Deletionen, Substitutionen, Insertionen und/oder
Additionen kodiert,
wobei das Polypeptid die Aktivität einer
Transhydrogenase aufweist und wobei die Fermentation in einem Fermentationsmedium unter Bildung einer
Fermentationsbrühe abläuft; b) Anreichern der organisch-chemischen Verbindung in der Fermentationsbrühe aus a) .
Weiterhin können Polynukleotide verwendet werden, die mit der zu SEQ ID NO:l, bevorzugt der Kodierregion von SEQ ID NO: 1, komplementären Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren und für ein Polypeptid, welches die Aktivität einer Transhydrogenase aufweist, kodieren.
Anleitungen zur Hybridisierung von Nukleinsäuren
beziehungsweise Polynukleotiden findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al .
(International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255- 260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride
gebildet, bei denen die Sonde d.h. ein Polynukleotid umfassend die zu SEQ ID NO: 1, bevorzugt die Kodierregion von SEQ ID NO: 1, komplementäre Nukleotidsequenz und die Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten
beziehungsweise identifizierten Polynukleotide, mindestens 80% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die
Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) .
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C - 68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Nukleotidsequenz der eingesetzten Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC oder lx SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User 's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C - 68°C, ca. 52°C
- 68°C, ca. 54°C - 68°C, ca. 56°C - 68°C, ca. 58°C - 68°C, ca. 60°C - 68°C, ca. 62°C - 68°C, ca. 64°C - 68°C, ca. 66°C
- 68°C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 64°C - 68°C oder ca. 66°C - 68°C werden bevorzugt. Es ist
gegebenenfalls möglich, die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2x SSC oder 0,lx SSC zu senken. Gegebenenfalls enthält der SSC-Puffer Natriumdodecylsulfat (SDS) in einer Konzentration von 0,1%. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2°C von 50°C auf 68°C können
Polynukleotidfragmente isoliert werden, die mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 92%, mindestens 94%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99%, gegebenenfalls 100% Identität zur Sequenz beziehungsweise komplementären Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen und für Polypeptid, welches die Aktivität einer
Transhydrogenase aufweist, kodieren. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No .
1603558) . Für die Maßnahmen der Erfindung wird ein für eine
Transhydrogenase kodierendes Gen in einem die gewünschte (n) Aminosäure ( n ) produzierenden Mikroorganismus bzw. Ausgangsoder Elternstamm überexprimiert .
Unter Überexpression versteht man allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer
Ribonukleinsäure, eines Proteins (Polypeptids) oder eines Enzyms im Vergleich zum Ausgangsstamm (Elternstamm) oder Wildtypstamm, wenn dies der Ausgangsstamm ist. Unter einem Ausgangsstamm (Elternstamm) versteht man den Stamm, an dem die zur Überexpression führende Maßnahme durchgeführt wurde .
Bei der Überexpression werden die Methoden der
rekombinanten Überexpression bevorzugt. Hierunter werden alle Methoden zusammengefasst bei denen ein Mikroorganismus unter Verwendung eines in-vitro bereitgestellten DNA- Moleküls hergestellt wird. Derartige DNA-Moleküle umfassen beispielsweise Promotoren, Expressionskassetten, Gene, Allele, Kodierregionen etc.. Diese werden durch Methoden der Transformation, Konjugation, Transduktion oder
gleichartige Methoden in den gewünschten Mikroorganismus überführt . Durch die Maßnahmen der Überexpression, wird die Aktivität (Gesamtaktivität in der Zelle) oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, bevorzugt maximal bis 1000%, 2000%, 4000%, 10000% oder 20000% bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Überexpression führenden Maßnahme, erhöht.
Zur Erzielung einer Überexpression stehen im Stand der Technik eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung. Hierzu gehören die Erhöhung der Kopienzahl und die Modifikation der Nukleotidsequenzen, die die Expression des Gens steuern bzw. kontrollieren. Die Transkription eines Gens wird unter anderem kontrolliert durch den Promotor und gegebenenfalls durch Proteine, welche die Transkription unterdrücken
(Repressorproteine ) oder fördern (Aktivatorproteine) . Die Translation der gebildeten RNA wird unter anderem
kontrolliert durch die Ribosomenbindungsstelle und das Startkodon. Polynukleotide bzw. DNA-Moleküle, welche einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle und
gegebenenfalls ein Startkodon umfassen, werden auch als Expressionskassette bezeichnet.
Die Erhöhung der Kopienzahl kann durch Plasmide erfolgen, die im Cytoplasma des Mikroorganismus replizieren. Hierzu sind im Stand der Technik eine Fülle von Plasmiden für die verschiedensten Gruppen von Mikroorganismen beschrieben, mit denen man die gewünschte Erhöhung der Kopienzahl des Gens einstellen kann. Geeignete Plasmide für die Gattung Escherichia sind beispielsweise im Handbuch Molecular
Biology, Labfax (Ed.: T. A. Brown, Bios Scientific, Oxford, UK, 1991) beschrieben. Geeignete Plasmide für die Gattung Corynebacterium sind beispielsweise bei Tauch et al .
(Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)), oder bei Stansen et al . (Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)) beschrieben. Die Erhöhung der Kopienzahl um mindestens eine (1) Kopie kann weiterhin durch Einfügen weiterer Kopien in das
Chromosom des Mikroorganismus erfolgen. Geeignete Methoden für die Gattung Corynebacterium sind beispielsweise in der Patentschrift WO 03/014330, WO 03/040373 und WO 04/069996 beschrieben. Geeignete Methoden für die Gattung Escherichia sind beispielsweise der Einbau einer Genkopie in die att- site des Phagen (Yu und Court, Gene 223, 77-81 (1998)), die chromosomale Amplifikation mit Hilfe des Phagen Mu, wie in der EP 0 332 448 beschrieben, oder die von Hamilton et al . (Journal of Bacteriology 174, 4617 - 4622 (1989)) oder Link et al. (Journal of Bacteriology 179, 6228-6237 (1997)) beschriebenen Methoden des Genaustausches mit Hilfe
konditional replizierender Plasmide. Die Erhöhung der Genexpression kann weiterhin durch
Verwendung eines starken Promotors erzielt werden, der funktionell mit dem zu exprimierenden Gen verknüpft wird. Vorzugsweise wird ein Promotor verwendet, der stärker ist als der natürliche, d. h. der im Wildtyp oder Elternstamm vorhandene Promotor. Hierfür stehen im Stand der Technik eine Fülle von Methoden zur Verfügung.
Unter einer "funktionellen Verknüpfung" versteht man in diesem Zusammenhang die sequentielle Anordnung eines
Promotors mit einem Gen, die zur Expression des Gens und deren Steuerung führt .
Geeignete Promotoren für die Gattung Corynebacterium finden sich unter anderem bei Morinaga et al . (Journal of
Biotechnology 5, 305-312, (1987)), in den Patentschriften EP 0 629 699 A2 , US 2007/0259408 AI , WO 2006/069711, EP 1 881 076 AI und EP 1 918 378 AI und in zusammenfassenden Darstellungen wie dem „Handbook of Corynebacterium
glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling und Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)) oder dem Buch
„Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology"
(Ed.:Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)). Einsetzbare Promotoren sind auch in Fig. 1 des Übersichtsartikels von Patek et al . (Journal of
Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)) beschrieben. In gleicher Weise können die von Vasicova et al . (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)) beschrieben Varianten des dapA-Promotors , beispielsweise der Promotor A25 eingesetzt werden. Weiterhin kann der gap-Promotor von Corynebacterium glutamicum (EP 06007373, EP 2386650) oder Varianten des gap-Promotors (WO 2013000827) verwendet werden. Schließlich können die hinlänglich bekannten von Amann et al . (Gene 69(2), 301-315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen
Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Beispiele für Promotoren, die eine kontrollierte, das heißt induzierbare oder reprimierbare Expression erlauben, sind beispielsweise bei Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)) beschrieben.
Derartige Promotoren oder Expressionskassetten werden typischerweise im Abstand von 1 bis 1000, bevorzugt 1 bis 500, Nukleotiden stromaufwärts des ersten Nukleotids des Startkodons der Kodierregion des Gens eingesetzt.
Es ist ebenfalls möglich, mehrere Promotoren vor das gewünschte Gen zu positionieren bzw. funktionell mit dem zum exprimierenden Gen zu verknüpfen und auf diese Weise zu einer erhöhten Expression zu gelangen. Beispiele hierfür werden in der Patentschrift WO 2006/069711 beschrieben.
Die Struktur von Promotoren von Escherichia coli ist gut bekannt. Es ist daher möglich, die Stärke eines Promotors durch Modifikation seiner Sequenz mittels einem oder mehreren Austausch (en) und/oder einer oder mehrerer
Insertion (en) und/oder einer oder mehrerer Deletion(en) von Nukleotiden zu erhöhen. Beispiele hierfür finden sich unter anderem in „Herder Lexikon der Biologie" (Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland (1994)).
Beispiele für die Veränderung von Promotoren zur Erhöhung der Expression in coryneformen Bakterien finden sich in der US 6,962,805 B2 und in einer Publikation von Vasicovä et al. (Bacteriol. 1999 Oct; 181 ( 19 ): 6188-91.) · Die
Verstärkung eins Zielgens durch Hinzufügen oder Ersatz eines homologen Promotors findet sich beispielsweise in der EP 1 697 526 Bl .
Die Struktur der Ribosomenbindungsstelle Corynebacterium glutamicum ist ebenfalls gut bekannt und beispielsweise bei Amador (Microbiology 145, 915-924 (1999)) und in Hand- und Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise „Gene und
Klone" (Winnacker, Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland (1990)) oder „Molecular Genetics of Bacteria" (Dale und Park, Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK (2004))
beschrieben .
Zur Erzielung einer Überexpression ist es ebenfalls
möglich, die Expression von Aktivatorproteinen zu steigern oder die Expression von Repressorproteinen zu verringern oder auszuschalten.
Die genannten Maßnahmen zur Überexpression können in geeigneter Weise miteinander kombiniert werden. So kann beispielsweise die Verwendung einer geeigneten
Expressionskassette mit der Erhöhung der Kopienzahl und bevorzugt die Verwendung eines geeigneten Promotors mit der Erhöhung der Kopienzahl kombiniert werden.
Anleitungen zum Umgang mit DNA, Verdauung und Ligation von DNA, Transformation und Selektion von Transformanten findet man unter anderem in dem bekannten Handbuch von Sambrook et al . „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Das Ausmaß der Expression beziehungsweise Überexpression kann durch Messung der Menge der vom Gen transkribierten mRNA, durch Bestimmung der Menge des Polypeptids und durch Bestimmung der Enzymaktivität festgestellt werden.
Für die Bestimmung der Menge an mRNA können unter anderem die Methode des „Northern Blotting's" und der quantitativen RT-PCR verwendet werden. Bei der quantitativen RT-PCR wird der Polymerase-Kettenreaktion eine reverse Transkription vorgeschaltet. Hierzu kann das LightCycler™ System der Firma Roche Diagnostics (Boehringer Mannheim GmbH, Roche Molecular Biochemicals , Mannheim, Deutschland) verwendet werden, wie beispielsweise bei Jungwirth et al . (FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)) beschrieben. Die Konzentration des Proteins kann über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische
Identifizierung der Proteinkonzentration mit enstprechender Auswertesoftware im Gel bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al . (Electrophoresis , 22:1712-23 (2001)) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper
(Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual . 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit ensprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)) bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren, bzw. die erfindungsgemäßen Mikroorganismen kann/können kontinuierlich - wie
beispielsweise in der WO 05/021772 beschrieben- oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung bzw. Satzverfahren) oder im fed batch ( Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives
Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion der gewünschten organisch chemischen Verbindung betrieben/kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise
Fermentationsmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von
Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und
Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar .
Für das Durchführen der vorliegenden Erfindung ist kein spezielles Medium erforderlich.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben¬ oder Zuckerrohrverarbeitung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure,
Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder Milchsäure verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.
Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 8,5 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel , wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Die
Fermentation wird bevorzugt unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Um diese aufrechtzuerhalten, werden
Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum
Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die
Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem
Überdruck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C, besonders bevorzugt bei 30° bis 37°C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung
bevorzugt solange fortgesetzt, bis sich eine für die
Maßnahme der Gewinnung der gewünschten organisch chemischen Verbindung ausreichende Menge, gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere
Kultivierungszeiten möglich. Durch die Tätigkeit der
Mikroorganismen kommt es zu einer Anreicherung
(Akkumulation) der organisch chemischen Verbindung im
Fermentationsmedium und/oder in den Zellen der
Mikroorganismen .
Beispiele für geeignete Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den Patentschriften 5,770,409, US
5,990,350, US 5,275,940, WO 2007/012078, US 5,827,698, WO 2009/043803, US 5,756,345 oder US 7,138,266.
Die Analyse von L-Aminosäuren zur Bestimmung der
Konzentration zu einem oder mehreren Zeitpunkt (en) im
Verlauf der Fermentation kann durch Trennung der L- Aminosäuren mittels Ionenaustauschchromatographie
vorzugsweise Kationenaustauschchromatographie mit
anschließender Nachsäulenderivatisierung unter Verwendung von Ninhydrin erfolgen, so wie bei Spackman et al .
(Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)) beschrieben. Anstelle von Ninhydrin kann auch ortho-Phtadialdehyd zur Nachsäulenderivatisierung eingesetzt werden. Einen
Übersichtsartikel zur Ionenaustauschchromatographie findet man bei Pickering (LC-GC (Magazine of Chromatographie Science) 7(6), 484-487 (1989)).
Es ist ebenfalls möglich eine Vorsäulenderivatisierung beispielsweise unter Verwendung von ortho-Phtadialdehyd oder Phenylisothiocyanat vorzunehmen und die entstandenen Aminosäurederivate durch Reversed-Phase-Chromatographie (RP) vorzugsweise in Form der Hochleistungsflüssigkeits- chromatographie (HPLC) aufzutrennen. Eine derartige Methode ist beispielsweise bei Lindroth et al . (Analytical
Chemistry 51: 1167-1174 (1979)) beschrieben.
Die Detektion erfolgt photometrisch (Absorption,
Fluoreszenz ) .
Eine zusammenfassende Darstellung zur Aminosäureanalyse findet man unter anderem im Lehrbuch „Bioanalytik" von Lottspeich und Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag,
Heidelberg, Deutschland 1998).
Die Analyse von -Ketosäuren wie KIC zur Bestimmung der Konzentration zu einem oder mehreren Zeitpunkt (en) im
Verlauf der Fermentation kann durch Trennung der Ketosäuren und anderen Ausscheidungsprodukten mittels
Ionenaustauschchromatographie , vorzugsweise
Kationenaustauschchromatographie an einem sulfonierten Styrol-Divinylbenzol Polymeren in der H+ Form, z.B.
mittels 0,025 N Schwefelsäure mit anschließender UV-
Detektion bei 215nm (alternativ auch bei 230 oder 275 nm) erfolgen. Vorzugsweise kann eine REZEX RFQ - Fast Fruit H+ Säule (Phenomenex) eingesetzt werden, andere Lieferanten für die Trennphase (z.B. Aminex von BioRad) sind möglich. Analoge Trennungen sind in entsprechenden
Applikationsbeispielen der Lieferanten beschrieben.
Die Leistung der erfindungsgemäßen Verfahren bzw.
Fermentationsprozesse bezüglich eines oder mehrerer der Parameter ausgewählt aus der Gruppe der Konzentration
(gebildete Verbindung pro Volumen) , der Ausbeute (gebildete Verbindung pro verbrauchter Kohlenstoff-Quelle ) , der
Bildung (gebildete Verbindung pro Volumen und Zeit) und der spezifischen Bildung (gebildete Verbindung pro
Zelltrockenmasse bzw. Biotrockenmasse und Zeit oder
gebildete Verbindung pro Zellprotein und Zeit) oder auch anderer Prozess-Parameter und Kombinationen davon, wird um mindestens 0,5%, mindestens 1%, mindestens 1,5% oder mindestens 2% erhöht, bezogen auf Verfahren bzw.
Fermentationsprozesse mit Mikroorganismen, in denen die Aktivität einer Transhydrogenase erhöht vorliegt.
Durch die Maßnahmen der Fermentation erhält man eine
Fermentationsbrühe, welche die gewünschte organisch
chemische Verbindung, bevorzugt L-Aminosäure, enthält. Anschließend erfolgt die Bereitstellung bzw. Herstellung oder Gewinnung eines die organisch chemische Verbindung enthaltenden Produktes in flüssiger oder fester Form.
Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein
Fermentationsmedium bzw. Nährmedium, in dem ein
Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer
gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das
Fermentationsmedium beziehungsweise die während der
Fermentation eingesetzten Medien enthält /enthalten
sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Produktion der gewünschten Verbindung und typischerweise die Vermehrung bzw. Lebensfähigkeit sicherstellen.
Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des
Mikroorganismus entstandene Biomasse (Zellmasse) des
Mikroorganismus , b) die im Laufe der Fermentation gebildete gewünschte organisch chemische Verbindung, c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte, und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten
Bestandteile des eingesetzten Fermentationsmediums
beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise
Vitamine wie Biotin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
Zu den organischen Nebenprodukten gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen neben der jeweiligen gewünschten Verbindung erzeugt und
gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu gehören auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Die Fermentationsbrühe wird dem Kulturgefäß beziehungsweise dem Fermentationsbehälter entnommen, gegebenenfalls gesammelt, und dazu verwendet, ein die organisch chemische Verbindung enthaltendes Produkt, bevorzugt ein L- Aminosäure-haltiges Produkt in flüssiger oder fester Form bereitzustellen. Hierfür wird auch der Ausdruck „Gewinnen des L-Aminosäure haltigen Produktes" verwendet. Im
5 einfachsten Fall stellt die dem Fermentationsbehälter
entnommene L-Aminosäure-haltige Fermentationsbrühe selbst das gewonnene Produkt dar.
Durch eine oder mehrere der Maßnahmen ausgewählt aus der Gruppe a$0 teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%) Entfernung des Wassers, b) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, >
15 97%, > 98%, ^ 99%) Entfernung der Biomasse, wobei diese gegebenenfalls vor der Entfernung inaktiviert wird, c) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, > 99,7%) Entfernung der im
20 Laufe der Fermentation gebildeten organischen
Nebenprodukte, und d) teilweise (> 0%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, > 99,7%) Entfernung der durch die
25 Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des
eingesetzten Fermentationsmediums beziehungsweise der Einsatzstoffe, aus der Fermentationsbrühe erzielt man eine Konzentrierung bzw. Reinigung der gewünschten organisch chemischen
30 Verbindung. Auf diese Weise werden Produkte isoliert, die einen gewünschten Gehalt an der Verbindung aufweisen. Die teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige 80% bis < 100%) Entfernung des
Wassers (Maßnahme a) ) wird auch als Trocknung bezeichnet.
In einer Variante des Verfahrens gelant man durch
vollständige oder nahezu vollständige Entfernung des
Wassers, der Biomasse, der organischen Nebenprodukte und der nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten
Fermentationsmediums gelangt man zu reinen ( (> 80 Gew.-%, > 90 Gew.-%) oder hochreinen (> 95 Gew.-%, > 97 Gew.-%, > 99% Gew.-%) Produktformen der gewünschten organisch chemischen Verbindung, bevorzugt L-Aminosäuren . Für die Maßnahmen gemäß a) , b) , c) oder d) sind im Stand der Technik eine Fülle von technischen Anleitungen verfügbar.
Bei Verfahren zur Herstellung von organischen Säuren oder L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin unter Verwendung von Bakterien der Gattung Corynebacterium werden solche
Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die keine Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden insbesondere in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet .
Im Falle der Aminosäure L-Lysin sind im Stand der Technik im Wesentlichen vier verschiedene Produktformen bekannt.
Eine Gruppe L-Lysin-haltiger Produkte umfasst
konzentrierte, wässrige, alkalische Lösungen von
aufgereinigtem L-Lysin (EP-B-0534865) . Eine weitere Gruppe, wie beispielsweise in der US 6,340,486 und US 6,465,025 beschrieben, umfasst wässrige, saure, Biomasse-halt ige Konzentrate von L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühen. Die bekannteste Gruppe fester Produkte umfasst pulverförmige oder kristalline Formen von aufgereinigtem beziehungsweise reinem L-Lysin, das typischerweise in Form eines Salzes wie zum Beispiel L-Lysin-Monohydrochlorid vorliegt. Eine weitere Gruppe fester Produktformen ist beispielsweise in der EP-B-0533039 beschrieben. Die dort beschriebene Produktform enthält neben L-Lysin den größten Teil der während der fermentativen Herstellung verwendeten und nicht verbrauchten Einsatzstoffe und gegebenfalls die Biomasse des eingesetzten Mikroorganismus mit einem Anteil von >0% - 100%.
Entsprechend der verschiedenen Produktformen kennt man verschiedenste Verfahren, bei denen aus der
Fermentationsbrühe das L-Lysin-haltige Produkt oder das gereinigte L-Lysin hergestellt wird. Zur Herstellung von festem, reinem L-Lysin werden im
Wesentlichen Methoden der Ionenaustauschchromatographie gegebenfalls unter Verwendung von Aktivkohle und Methoden der Kristallisierung angewendet. Auf diese Weise erhält man die entsprechende Base oder ein entsprechendes Salz wie beispielsweise das Monohydrochlorid (Lys-HCl) oder das Lysinsulfat (Lys2-H2S04) .
In der EP-B-0534865 ist ein Verfahren zur Herstellung wässriger, basischer L-Lysin-haltiger Lösungen aus
Fermentationsbrühen beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren wird die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt und verworfen. Mittels einer Base wie
beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid wird ein pH-Wert zwischen 9 bis 11 eingestellt. Die
mineralischen Bestandteile (anorganischen Salze) werden nach Konzentrierung und Abkühlung durch Kristallisation aus der Brühe abgetrennt und entweder als Dünger verwendet oder verworfen .
Bei Verfahren zur Herstellung von Lysin unter Verwendung von Bakterien der Gattung Corynebacterium werden solche Verfahren bevorzugt, bei denen Produkte erhalten werden, die Bestandteile der Fermentationsbrühe enthalten. Diese werden insbesondere als Tierfuttermitteladditive verwendet.
Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden wie z.B. der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden. Gegebenenfalls wird die Biomasse
beziehungsweise die Biomasse enthaltene Fermentationsbrühe während eines geeigneten Verfahrensschrittes inaktiviert beispielsweise durch thermische Behandlung (Erhitzen) oder durch Säurezugabe.
In einer Verfahrensweise wird die Biomasse vollständig oder nahezu vollständig entfernt, sodass keine (0 %) oder höchstens 30%, höchstens 20%, höchstens 10%, höchstens 5%, höchstens 1% oder höchstens 0,1% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einer weiteren Verfahrensweise wird die Biomasse nicht oder nur in geringfügigen Anteilen entfernt, sodass sämtliche (100%) oder mehr als 70%, 80%, 90%, 95%, 99% oder 99,9% Biomasse im hergestellten Produkt verbleibt. In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird dementsprechend die Biomasse in Anteilen > 0% bis -S 100% entfernt .
Schließlich kann die nach der Fermentation erhaltene
Fermentationsbrühe vor oder nach der vollständigen oder teilweisen Entfernung der Biomasse mit einer anorganischen Säure wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder organischen Säure wie beispielsweise Propionsäure auf einen sauren pH Wert eingestellt werden (GB 1,439,728 oder EP 1 331 220). Es ist gleichfalls möglich, die Fermentationsbrühe mit der vollständig
enthaltenen Biomasse anzusäuern. Schließlich kann die Brühe auch durch Zusatz von Natriumbisulfit (NaHSC>3, GB
1,439,728) oder einem anderen Salz beispielsweise Ammonium- , Alkali- oder Erdalkalisalz der schwefligen Säure
stabilisiert werden.
Bei der Abtrennung der Biomasse werden gegebenenfalls in der Fermentationsbrühe enthaltene organische oder
anorganische Feststoffe teilweise oder ganz entfernt. Die in der Fermentationsbrühe gelösten organischen
Nebenprodukte und die gelösten nicht verbrauchten
Bestandteile des Fermentationsmediums (Einsatzstoffe) bleiben mindestens teilweise (> 0%) , bevorzugt zu
mindestens 25%, besonders bevorzugt zu mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt zu mindestens 75% im Produkt.
Gegebenenfalls bleiben diese auch vollständig (100%) oder nahezu vollständig, das heißt > 95% oder > 98% oder größer 99%, im Produkt. Enthält ein Produkt in diesem Sinn
mindestens einen Teil der Bestandteile der
Fermentationsbrühe, so wird dies auch mit dem Begriff „Produkt auf Fermentationsbrühebasis" umschrieben. Anschließend wird der Brühe mit bekannten Methoden wie z.B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers,
Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch
Umkehrosmose oder durch Nanofiltration Wasser entzogen beziehungsweise eingedickt oder konzentriert. Diese
aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Methoden der Gefriertrocknung, der Sprühtrocknung, der Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfahren wie zum Beispiel in der zirkulierenden Wirbelschicht gemäß
PCT/EP2004/006655 beschrieben, zu rieselfähigen Produkten insbesondere zu einem feinteiligen Pulver oder vorzugsweise grobkörnigem Granulat aufgearbeitet werden. Gegebenenfalls wird aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder
Staubabtrennung ein gewünschtes Produkt isoliert.
Es ist ebenfalls möglich, die Fermentationsbrühe direkt, d. h. ohne vorherige Aufkonzentrierung durch Sprühtrocknung oder Sprühgranulation, zu trocknen.
Unter „rieselfähig" versteht man Pulver, die aus einer Serie von Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen
AuslaufÖffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 mm (Millimeter) ungehindert auslaufen (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Mit „feinteilig" ist ein Pulver mit überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 20 bis 200 pm Durchmesser
gemeint . Mit „grobkörnig" ist ein Produkt mit einem überwiegendem Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 200 bis 2000 pm
Durchmesser gemeint.
Die Korngrößenbestimmung kann mit Methoden der
Laserbeugungsspektrometrie durchgeführt werden. Die
entsprechenden Methoden sind im Lehrbuch zur
„Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis" von R. H. Müller und R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) oder im Lehrbuch „Introduction to Particle Technology" von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben .
Das rieselfähige, feinteilige Pulver kann wiederum durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerfähiges und
weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
Der Begriff „staubfrei" bedeutet, daß das Produkt lediglich geringe Anteile (< 5 %) an Korngrößen unter 100 pm
Durchmesser enthält.
„Lagerfähig", im Sinne dieser Erfindung, bedeutet ein
Produkt, das mindestens ein (1) Jahr oder länger, bevorzugt mindestens 1,5 Jahre oder länger, besonders bevorzugt zwei (2) Jahre oder länger in trockener und kühler Umgebung gelagert werden kann, ohne dass ein wesentlicher Verlust (maximal 5%) der jeweiligen Aminosäure auftritt. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, das in seinen Grundzügen in der WO 2007/042363 AI
beschrieben ist. Hierfür wird unter Verwendung der
erfindungsgemäß erhaltenen Fermentationsbrühe, aus der die Biomasse gegebenenfalls ganz oder teilweise abgetrennt wurde, ein Verfahren durchgeführt, das folgende Schritte umfasst : a) den pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4,0 bis 5,2, insbesondere 4,9 bis 5,1, absenkt, und ein molares Sulfat /L-Lysin-Verhältnis von 0,85 bis 1,2, bevorzugt 0,9 bis 1,0, besonders bevorzugt >0,9 bis <0,95, in der Brühe einstellt, gegebenenfalls durch Zugabe von einer weiteren oder mehreren Sulfat-haltigen Verbindung (en) und b) das so erhaltene Gemisch durch Wasserentzug
aufkonzentriert und gegebenenfalls granuliert, wobei gegebenenfalls vor Schritt a) eine oder beide der folgenden Maßnahmen durchgeführt wird/werden: c) Messung des molaren Verhältnisses von Sulfat /L-Lysin zur Ermittlung der benötigten Menge an Sulfat-haltigen Verbindung (n) d) Zusatz einer Sulfat-haltigen Verbindung ausgewählt aus der Gruppe Ammoniumsulfat, Ammoniumhydrogensulfat und
Schwefelsäure in entsprechenden Verhältnissen.
Gegebenenfalls wird weiterhin vor Schritt b) ein Salz der schwefligen Säure, bevorzugt Alkalihydrogensulfit,
besonders bevorzugt Natriumhydrogensulfit in einer
Konzentration von 0,01 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0,1 bis 0,3 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gew.-% bezogen auf die Fermentationsbrühe hinzugesetzt. Als bevorzugte Sulfat-haltige Verbindungen im Sinne der oben genannten Verfahrensschritte sind insbesondere
Ammoniumsulfat und/oder Ammoniumhydrogensulfat oder entsprechende Mischungen von Ammoniak und Schwefelsäure und Schwefelsäure selbst zu nennen. Das molare Sulfat /L-Lysin-Verhältnis V wird nach der
Formel: V = 2 x [S04 2~] / [L-Lysin] berechnet. Diese Formel berücksichtigt die Tatsache, dass das S04 2~ Anion, bzw. die Schwefelsäure zweiwertig ist. Ein Verhältnis V = 1
bedeutet, dass ein stöchiometrisch zusammengesetztes Lys2- H2S04) vorliegt, während bei einem Verhältnis von V = 0,9 ein 10%iger Sulfatmangel und bei einem Verhältnis von V = 1,1 ein 10% Sulfatüberschuss gefunden wird. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompakt ierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen
Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie
üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel
Kieselsäuren, Silikaten (EP0743016A) und Stearaten.
Weiterhin ist es vorteilhaft, die Oberfläche der erhaltenen Granulate mit Ölen oder Fetten zu behandeln so wie es in der WO 04/054381 beschrieben ist. Als Öle können
Mineralöle, pflanzliche Öle oder Mischungen pflanzlicher Öle verwendet werden. Beispiele für derartige Öle sind Sojaöl, Olivenöl, So aöl/Lecithingemische . In gleicher Weise sind auch Silikonöle, Polyethylenglykole oder
Hydroxyethylcellulose geeignet. Durch die Behandlung der Oberflächen mit den genannten Ölen erzielt man eine erhöhte Abriebfestigkeit des Produktes und einen Verringerung des Staubanteils. Der Gehalt an Öl im Produkt beträgt 0,02 bis 2,0 Gew.-%, bevorzugt 0,02 bis 1,0 Gew.-%, und ganz
besonders bevorzugt 0,2 bis 1,0 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Futtermitteladditivs.
Bevorzugt sind Produkte mit einem Anteil von > 97 Gew.-% einer Korngröße von 100 bis 1800 pm oder einem Anteil von > 95 Gew.-% einer Korngröße von 300 bis 1800 pm Durchmesser. Der Anteil an Staub, d. h. Partikeln mit einer Korngrösse < 100 pm, liegt bevorzugt bei > 0 bis 1 Gew.- besonders bevorzugt bei maximal 0,5 Gew.-%.
Alternativ kann das Produkt aber auch auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel
Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen
Verdickungs- oder Bindemitteln vermischt und stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Schließlich kann das Produkt auch durch
Beschichtungsverfahren („Coating") mit Filmbildnern wie beispielsweise Metallcarbonaten, Kieselsäuren, Silikaten, Alginaten, Stearaten, Stärken, Gummis und Celluloseether , wie in der DE-C-4100920 beschrieben, in einen Zustand gebracht werden, in dem es stabil gegenüber der Verdauung durch Tiermägen, insbesondere dem Magen von Wiederkäuern, ist.
Zur Einstellung einer gewünschten L-Lysin Konzentration im Produkt kann je nach Anforderung das L-Lysin während des Verfahrens in Form eines Konzentrates oder gegebenenfalls einer weitgehend reinen Substanz beziehungsweise dessen Salz in flüssiger oder fester Form hinzugefügt werden.
Diese können einzeln oder als Mischungen zur erhaltenen oder aufkonzentrierten Fermentationsbrühe, oder auch während des Trocknungs- oder Granulationsprozesses ,
hinzugefügt werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines festen Lysin-haltigen Produktes, das in seinen Grundzügen in der US 20050220933 beschrieben ist. Hierbei wird unter Verwendung der erfindungsgemäß
erhaltenen Fermentationsbrühe ein Verfahren durchgeführt, das folgende Schritte umfasst: a) Filtration der Fermentationsbrühe, bevorzugt mit einem Membranfilter, so dass ein Biomasse-haltiger Schlamm und ein Filtrat erhalten wird, b) Aufkonzentration des Filtrates, bevorzugt so, dass ein FestStoffgehalt von 48 bis 52 Gew.-% erhalten wird, c) Granulation des in Schritt b) erhaltenen Konzentrates, bevorzugt bei einer Temperatur von 50°C bis 62°C, und d) Beschichtung des in c) erhaltenen Granulates mit einem oder mehreren der Beschichtungsmittel (coating agent(s))
Die Aufkonzentrierung des Filtrates in Schritt b) kann auch derart erfolgen, dass ein FestStoffgehalt von 52 bis 55 Gew.-%, von 55 bis 58 Gew.-% oder 58 bis 61 Gew.-%
erhalten wird.
Zur Beschichtung in Schritt d) werden bevorzugt
Beschichtungsmittel verwendet, welche ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus dl) der in Schritt a) erhaltenen Biomasse, d2 ) einer L-Lysin-haltigen Verbindung, bevorzugt
ausgewählt aus der Gruppe L-Lysinhydrochlorid oder L- Lysinsulfat , d3 ) einem im wesentlichen L-Lysin-freien Stoff mit L- Lysingehalt < 1 Gew.-%, bevorzugt < 0,5 Gew.-%, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Stärke, Karageenan, Agar,
Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien und Mehle, und d4) einem wasserabstoßenden Stoff, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Öle, Polyethylenglykole und flüssige
Paraffine.
Durch die Maßnahmen entsprechend den Schritten dl) bis d4), insbesondere dl) bis d3 ) , wird der Gehalt an L-Lysin auf einen gewünschten Wert eingestellt.
Bei der Herstellung L-Lysin-haltiger Produkte wird das Verhältnis der Ionen bevorzugt so eingestellt, dass das molare Ionenverhältnis entsprechend nachstehender Formel
2x [S04 2~] + [Cl~] - [NH4 +] - [Na+] - [K+] -2x [Mg2+] -2x [Ca2+] / [L-Lys]
0,68 bis 0,95, bevorzugt 0,68 bis 0,90, besonders bevorzugt 0,68 bis 0,86 ergibt, so wie von Kushiki et al . in der US 20030152633 beschrieben. Im Falle des L-Lysins hat das auf diese Weise hergestellte feste Produkt auf Fermentationsbrühebasis einen Lysingehalt (als Lysinbase) von 10 Gew.-% bis 70 Gew.-% oder 20 Gew.-% bis 70 Gew.-%, bevorzugt 30 Gew.-% bis 70 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 40 Gew.-% bis 70 Gew.-% bezogen auf die Trockenmasse des Produkts. Maximale Gehalte an
Lysinbase von 71 Gew.-%, 72 Gew.-%, 73 Gew.-% sind
ebenfalls möglich.
Der Wassergehalt des L-Lysin-haltigen, festen Produktes beträgt bis zu 5 Gew.-%, bevorzugt bis zu 4 Gew.-%, und besonders bevorzugt weniger als 3 Gew.-%.
Der Stamm DM1547 wurde am 16. Januar 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Zugangsnummer DSM13994 hinterlegt.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 zeigtPlasmid pK18msb_Pg3_lpdA.
Figur 2 zeigt Plasmid pZ8-l::lpdA.
Beispiele
Beispiel 1 :
Das Genprodukt des lpdA-Gens (cg0790) aus Corynebacterium glutamicum wurde wie im Fall des LpdA-Proteins aus
Mycobacterium tuberculosis (Argyrou et al . , 2004) bei einer überwiegend automatischen Genomannotation als mögliche
Dihydroliponamid-Dehydrogenase zugehörig der Flavoprotein- Disulfid-Reduktase- (FDR) -Familie, deren Mitglieder trotz ihrer Vielfalt an katalysierten Redoxreaktionen eine allgemein hohe Homologie auf Sequenz- und Strukturebene zueinander aufweisen, klassifiziert. Durch die
bioinformatische Analyse von C. glutamicum LpdA mit Hilfe der blastp-Funkt ion des BLAST-Programmes (Basic Local
Alignment Search Tool) wurde die Homologie dieses Proteins zu dem bereits charakterisierten LpdA aus Mycobacterium tuberculosis und anderen Flavoprotein-Disulfid-Reduktasen aus C. glutamicum und verschiedenen weiteren Organismen ermittelt .
Beispiel 2 :
Konstruktion des Austauschvektors pKl 8msb_Pg3_lpdA Die Nukleot idsequenz des Genoms von Corynebacterium
glutamicum ATCC13032 ist bei Ikeda und Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109 (2003)), in der EP 1 108 790 und bei Kalinowski et al . (Journal of
Biotechnolgy 104(1-3), (2003)) beschrieben. Die Nukleot idsequenz des Genoms von Corynebacterium
glutamicum ist ebenfalls in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) , in der DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan) oder in der
Nukleot idsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) verfügbar.
Ausgehend von der Genomsequenz von Corynebacterium
glutamicum ATCC13032 wurde ein ca.1,7 kb großes DNA- Fragment bei der Firma GeneArt (Regensburg, Deutschland) synthetisiert (SEQ ID NO: 3), welches neben dem Pgap3- Promotor (DE102011118019.6 ) die flankierenden Sequenzen für eine Insertion des Promotors vor das native lpdA-Gen trägt. Das Fragment wurde über die terminal eingeführten
Schnittstellen Xmal und Xbal durch Xmal und Xbal -Spaltung geschnitten und anschließend in den ebenfalls Xmal / Xbal - geschnittenen von Schäfer et al . (Gene, 145, 69-73 (1994)) beschriebenen, mobilisierbaren Vektor pK18mobsacB kloniert. Das Plasmid trägt die Bezeichnung pKl 8msb_Pg3_lpdA und ist in Figur 1 dargestellt.
Beispiel 3: Konstruktion des Vektors pZ8-l_lpdA
Das lpdA Gen aus C. glutamicum (cg0790) wurde mit Hilfe zweier Primer amplifiziert , durch die das Gen upstream mit einer EcoRI- und downstream mit einer Sall-Schnittstelle versehen wurde. Aufgrund der für C. glutamicum bekannten Sequenz des lpdA-Gens wurden folgende Oligonukleotide als Primer verwendet: lpdA_pZ8-l-l (SEQ ID NO : 4 ) :
5" GGTGGTGAATTCAAAGGAGGACAACCATGGCAAAGAGGATCGTAAT 3 " lpdA_pZ8-l-2 (SEQ ID NO : 5 ) :
5" GGTGGTGTCGACTTAGCCTAGATCATCATGTT 3 "
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert.
Sie ermöglichen die Amplifizierung eines 1448 bp langen DNA-Abschnittes gemäß SEQ ID NO : 6. Das PCR-Produkt wurde mit dem Nucleospin® Extract II Kit aufgereinigt . Das Fragment wurde über die terminal
eingeführten Schnittstellen EcoRI und Sali durch EcoRI und Sali -Spaltung geschnitten und anschließend in den
ebenfalls EcoRI / Sali -geschnittenen Vektor pZ8-l
(DE3841454A1 ; E . coli DH5/pZ8-l wurde bei der Deutschen
Stammsammlung für Mikroorganismen unter der Numme DSM 4939 hinterlegt) mit Hilfe von T4 DNA-Ligase kloniert. Das
Plasmid trägt die Bezeichnung pZ8-l::lpdA und ist in Figur 2 dargestellt. Beispiel 4:
Herstellung des Stammes DM1547_Pg3_lpdA
Die Mutation Pg3_lpdA soll in den Stamm Corynebacterium glutamicum DM1547 eingebracht werden. Der Stamm DM1547 ist eine Aminoethylcystein-resistente Mutante von
Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Sie ist unter der Bezeichnung DSM13994 am 16.01.2001 bei der Deutschen
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,
Braunschweig, Deutschland) hinterlegt. Der in Beispiel 2 beschriebene Vektor pKl 8msb_Pg3_lpdA wurden mit der Elektroporationsmethode von Liebl et al . (FEMS Microbiological Letters, 53:299-303 (1989)) in
Corynebacterium glutamicum DM1547 elektroporiert. Die
Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch
Ausplattieren des Elektroporationsansat zes auf LB Agar
(Sambrook et al . , Molecular cloning: a laboratory manual . 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/1 Kanamycin
Supplementiert worden war. Der Vektor kann in DM1547 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er als Folge eines Rekombinationsereignisses im Chromosom integriert vorliegt. Die Selektion von
Transkon uganten, d.h. von Klonen mit integriertem
pKl 8msb_Pg3_lpdA erfolgte durch Ausplattieren des
Kon ugationsansatzes auf LB-Agar, der mit 25 mg/1 Kanamycin und 50 mg/1 Nalidixinsäure Supplementiert worden war.
Kanamycin-resistente Transkon uganten wurden anschließend auf mit Kanamycin (25 mg/1) Supplementierten LB-Agarplatten ausgestrichen und für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Zur Selektion von Mutanten, bei denen als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses die Exzision des Plasmides stattgefunden hatte, wurden die Klone 30 Stunden unselektiv in LB-Flüssigmedium kultiviert, anschließend auf LB-Agar, der mit 10% Sucrose Supplementiert worden war ausgestrichen und 24 Stunden bei 33°C bebrütet. Das Plasmid pKl 8msb_Pg3_lpdA enthält ebenso wie das
Ausgangsplasmid pK18mobsacB neben dem Kanamycin- Resistenzgen eine Kopie des für die Levan-Sucrase aus
Bacillus subtilis kodierenden sacB-Gens. Die durch Sucrose induzierbare Expression des sacB-Gens führt zur Bildung der Levan-Sucrase, welche die Synthese des für C. glutamicum toxischen Produktes Levan katalysiert.
Auf mit Sucrose Supplementiertem LB-Agar wachsen daher nur solche Klone, bei denen das integrierte pKl 8msb_Pg3_lpdA als Folge eines zweiten Rekombinationsereignisses exzisiert hat. In Abhängigkeit von der Lage des zweiten
Rekombinationsereignisses in bezug auf den Mutationsort findet bei der Exzision der Allelaustausch bzw. der Einbau der Mutation statt oder es verbleibt die ursprüngliche Kopie im Chromosom des Wirtes.
Anschließend wurde jeweils ein Klon gesucht, bei dem der gewünschte Austausch, d. h. der Einbau der Mutation
Pg3_lpdA erfolgt war.
Hierzu wurden jeweils 20 Klone mit dem Phänotyp „Wachstum in Gegenwart von Sucrose" und „Nicht-Wachstum in Gegenwart von Kanamycin" auf Integration der Mutation Pg3_lpdA unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) überprüft.
Hierfür wurden folgende synthetische Oligonukleotide
(Primer) verwendet: lpdA_l.p (SEQ ID NO: 8):
5" AACACGTCCCAGGATCAATG 3 " lpdA_2.p (SEQ ID NO: 9):
5" TTTCGCAAGGTCCTTCACAC 3 "
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert. Die PCR-Reaktionen wurden mit dem Taq PCR Core Kit von Quiagen (Hilden,
Deutschland) , enthaltend die Taq DNA Polymerase aus Thermus aquaticus, in einem Mastercycler der Firma Eppendorf (Hamburg, Deutschland) durchgeführt . Die Bedingungen im Reaktionsansatz wurden nach Angaben des Herstellers
eingestellt. Der PCR-Ansatz wurde zuerst einer einleitenden Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten unterzogen. Darauf folgten sich 35x wiederholend ein Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 Sekunden, ein Schritt zum Binden der Primer an die DNA bei 57°C für 30 Sekunden und der Extensions-Schritt zur Verlängerung der Primer bei 72°C für 60 sec.
Nach dem abschliessenden Extensions-Schritt für 5 min bei 72 °C wurde der PCR-Ansatz einer Agarosegel-Elektrophorese (0,8% Agarose) unterworfen. Die Identifizierung eines DNA- Fragmentes von 1080 bp Länge zeigt hierbei die Integration des Promotors Pg3 vor lpdA an, wohingegen ein DNA-Fragment von 591 bp Länge den wildtypischen Status des
Ausgangsstammes anzeigt.
Auf diese Weise wurden Mutanten identifiziert, welche die Mutation Pg3_lpdA in Form einer Integration vorliegen haben, wobei einer der erhaltenen Stämme C. glutamicum DM1547_Pg3_lpdA genannt wurde.
Beispiel 5:
Herstellung der Stämme DM1547 / pZ8-l, DM1547 / pZ8- l::lpdA, DM1933 / pZ8-l und DM1933 / pZ8-l::lpdA
Die Plasmide pZ8-l und pZ8-l::lpdA (Beispiel 3) wurden mit der Elektroporationsmethode von Liebl et al . (FEMS
Microbiological Letters, 53:299-303 (1989)) in
Corynebacterium glutamicum DM1547 und DM1933
elektroporiert . Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Elektroporationsansat zes auf LB Agar (Sambrook et al . , Molecular cloning: a
laboratory manual . 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 25 mg/1 Kanamycin Supplementiert worden war. Plasmid DNA wurde nach den üblichen Methoden aus jeweils einer Transformante isoliert (Peters-Wendisch et al . , 1998, Microbiology , 144, 915-927) und durch Restriktionsspaltung mit anschließender Agarosegel-Elektrophorese überprüft .
Die erhaltenen Stämme wurden DM1547 / pZ8-l und DM1547 / pZ8-l::lpdA sowie DM1933 / pZ8-l und DM1933 / pZ8-l::lpdA genannt .
Beispiel 6:
Herstellung von L-Lysin mit den Stämmen DM1547_Pg3_lpdA und DM1547 Der in Beispiel 4 erhaltenen C. glutamicum Stamm
DM1547_Pg3_lpdA und der Ausgangsstamm DM1547 wurden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurden die Klone zunächst auf Hirn-Her z-Agarplatten (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 24 Stunden bei 33°C vermehrt. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde je eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml
Erlenmeyerkolben) . Als Medium für die Vorkultur wurde das Medium MM verwendet. Die Vorkultur wurde 24 Stunden bei 33°C und 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde ebenfalls das Medium MM verwendet.
Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die Zusammensetzung des verwendeten Kultivierungsmediums.
Tabelle 1 : Medium MM
CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/1
MOPS (Morpholinopropansufonsäure ) 20 g/1
Glucose (getrennt autoklaviert ) 50 g/1 Salze :
(NH4)2S04) 25 g/1
KH2P04 0,1 g/1
MgS04 * 7 H20 1,0 g/1
CaCl2 * 2 H20 10 mg/1
FeS04 * 7 H20 10 mg/1
MnS04 * H20 5 , 0 mg/ 1
Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/1
Thiamin * HCl (sterilfiltriert) 0 , 2 mg/ 1
CaC03 25 g/1
CSL (Corn Steep Liquor) , MOPS (Morpholinopropansulfonsäure ) und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert . Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCC>3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgte in Volumina von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen enthalten waren. Die Temperatur betrug bei 33 °C, die Umdrehungszahl war 250 rpm und die Luftfeuchte 80%.
Nach 40 Stunden wurde die optische Dichte (OD) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete
Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch
Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
In Tabelle 2 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt. Tabelle 2: Herstellung von L-Lysin
Figure imgf000056_0001
Alle Werte sind Mittelwerte von 3 unabhängigen Experimenten mit den genannten Stämmen
Das Ergebnis zeigt, dass die Ausbeute des gewünschten
Produktes (L-Lysin) deutlich erhöht ist.
Beispiel 7:
Herstellung von L-Lysin mit den Stämmen DM1547 /pZ8- l::lpdA, DM1547 / pZ8-l, DM1933 / pZ8-l und DM1933 / pZ8- 1 : : lpdA
Die in Beispiel 5 erhaltenen C. glutamicum Stämme DM1547 /pZ8-l::lpdA und DM1933 / pZ8-l::lpdA und die
Kontrollstämme DM1547 / pZ8-l und DM1933 / pZ8-l wurden in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurden die Stämme zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin (25 mg/1)) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von diesen Agarplattenkulturen wurde je eine Vorkultur
angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben) . Als
Medium für die Vorkultur wurde das Medium MM (Tabelle 1 aus Beispiel 6) verwendet welches mit Kanamycin (25 mg/1) versetzt wurde. Die Vorkultur wurde 24 Stunden bei 33 °C und 240 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so dass die Anfangs-OD
(660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde ebenfalls das Medium MM verwendet. Die Kultivierung erfolgte in Volumina von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen enthalten waren. Die Temperatur betrug bei 33 °C, die Umdrehungszahl war 250 rpm und die Luftfeuchte 80%. Nach 40 Stunden wurde die optische Dichte (OD) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete
Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch
Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivat isierung mit Ninhydrindetekt ion bestimmt.
In Tabelle 3 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Tabelle 3: Herstellung von L-Lysin
Figure imgf000057_0001
Alle Werte sind Mittelwerte von 3 unabhängigen Experimenten mit den genannten Stämmen
Das Ergebnis zeigt, dass die Ausbeute des gewünschten
Produktes (L-Lysin) deutlich erhöht ist.
Beispiel 8:
Transformation des Stammes ECM3 mit den Plasmiden pZ8-l und pZ8-l_lpdA
Der L-Methionin produzierende E. coli Stamm ECM3 basiert auf dem wildtypischen K12-Stamm MG1655. Der Stamm ECM3 trägt wie in EP2205754A2, EP2326724A1 und EP12156052.8 beschrieben ein feedbackresistentes metA-Allel, eine Deletion der Gene metJ, yncA, pykA, pykF und purU, eine Variante des spoT-Gens, sowie jeweils eine Promotorverstärkung vor den Genen metH, metF, gcvT, cysP und cysJ.
Der Stamm ECM3 wurde mit den Plasmiden pZ8-l und pZ8-l_lpdA aus Beispiel 3 transformiert und die Transformanden mit 20 mg/1 Kanamycin selektioniert . Die resultierenden Stämme wurden mit ECM3/pZ8-l und ECM3/pZ8-l_lpdA bezeichnet.
Beispiel 9:
Herstellung von L-Methionin mit den Stämmen ECM3 und ECM3/pZ8-l_lpdA
Die Leistungsfähigkeit der E.coli L-Methionin- Produktionsstämme ECM3 und ECM3/pZ8-l_lpdA wurde durch Produktionsversuche in 100 ml Erlenmeyer-Kolben bewertet. Als Vorkulturen wurden jeweils 10 ml Vorkulturmedium (10% LB-Medium mit 2,5 g/1 Glucose und 90% Minimalmedium PCI (Tabelle 4)) mit ΙΟΟμΙ Zellkultur beimpft und 10 Stunden bei 37°C kultiviert. Hiermit wurden anschließend je 10 ml PCI-Minimalmedium auf eine OD 600 nm von 0,2 (Eppendorf Bio-Photometer; Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) beimpft und für 24 Stunden bei 37°C kultiviert. Die extrazelluläre L-Methionin-Konzentration wurde mit einem
Aminosäureanalysator (Sykam GmbH, Eresing, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nach¬ säulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt. Die extrazelluläre Glucose-Konzentration wurde mit einem YSI 2700 Select Glucose Analyzer (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio, USA) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Nach 48 Stunden war die Glucose in beiden Kulturen vollständig verbraucht. Tabelle 4: Minimal Medium PCI
Substanz Konzentration
ZnS04 * 7 H20 4 mg/1
CuC12 * 2 H20 2 mg/ 1
MnS04 * H20 20 mg/1
H3B03 1 mg/ 1
Na2Mo04 * 2 H20 0, 4 mg/1
MgS04 * 7 H20 1 g/i
Citronensäure * 1 H20 6,56 g/1
CaC12 * 2 H20 40 mg/1
K2HP04 8,02 g/1
Na2HP04 2 g/1
(NH4) 2HP04 8 g/1
NH4C1 0,13 g/1
(NH4) 2S03 5,6 g/1
MOPS 5 g/1
NaOH 10M auf pH 6,8 eingestellt
FeS04 * 7 H20 40 mg/1
ThiaminhydroChlorid 10 mg/1
Vitamin B12 10 mg/1
Glucose 10 g/1
Kanamycin 50 mg/1 Tabelle 5: L-Methioninkonzentrationen in den
Fermentationsbrühen der untersuchten E. coli Stämme
Figure imgf000060_0001
Alle Werte sind Mittelwerte von 3 unabhängigen Experimenten mit den genannten Stämmen Das Ergebnis zeigt, dass die Ausbeute des gewünschten
Produktes (L-Methionin) deutlich erhöht ist.
Figur 1: Karte des Plasmids pKl 8msb_Pg3_lpdA
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der
Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
KanR: Kanamycin Resistenz-Gen
Xmal Schnittstelle des Restriktionsenzyms Xmal
EcoRI Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
Xbal Schnittstelle des Restriktionsenzyms Xbal sacB : sacB-Gen oriV : Replikationsursprung V Figur 2:Karte des Plasmids pZ8-l::lpdA
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Km Kanamycin Resistenz-Gen
EcoRI Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
Salll Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sali
Ptac tac-Promoter rep Replikationsursprung Escherichia coli
TrrnB rrnB Terminator

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organischchemischen Verbindung unter Verwendung eines
Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation eines eine organisch-chemische
Verbindung produzierenden Mikroorganismus, wobei in dem Mikroorganismus ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert dessen Aminosäuresequenz wenigstens 80% identisch ist mit der
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, überexprimiert vorliegt und wobei die Fermentation in einem Fermentationsmedium unter Bildung einer Fermentationsbrühe abläuft, b) Anreichern der organisch-chemischen Verbindung in der Fermentationsbrühe aus a) .
2. Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Mikroorganismus ein Polynukleotid, das für ein
Polypeptid kodiert dessen Aminosäuresequenz wenigstens 95% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 2 , überexprimiert vorliegt
3. Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid die
Aktivität einer Transhydrogenase aufweist.
4. Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid die
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 2 umfasst. Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung der organisch chemischen Verbindung gegenüber der Fermentation eines Mikroorganismus, in dem das Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert dessen Aminosäuresequenz wenigstens 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, nicht überexprimiert vorliegt, um mindestens 0,5% erhöht ist.
Das Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Überexpression durch eine oder mehrere der Maßnahmen erzielt wird ausgewählt aus der Gruppe a) die Expression des Gens steht unter der Kontrolle eines Promotors, der in dem für das Verfahren
verwendeten Mikroorganismus stärker ist als der native Promotor des Gens; b) Erhöhung der Kopienzahl des Gens kodierend für ein Polypeptid mit der Aktivität einer Transhydrogenase ; vorzugsweise durch Einfügen des Gens in Plasmiden mit erhöhter Kopienzahl und/oder durch Integration des Gens in das Chromosom des Mikroorganismus in mindestens einer Kopie ; c) die Expression des Gens erfolgt unter Verwendung einer Ribosomen-Bindestelle, die in dem für das
Verfahren verwendeten Mikroorganismus stärker ist als die ursprüngliche Ribosomen-Bindestelle des Gens; d) die Expression des Gens erfolgt unter Optimierung der Kodon-Verwendung (codon usage) des für das Verfahren verwendeten Mikroorganismus; e) die Expression des Gens erfolgt unter Reduzierung von mRNA Sekundärstrukturen in der vom Gen transkribierten mRNA; f) die Expression des Gens erfolgt unter Eliminierung von RNA-Polymerase-Terminatoren in der vom Gen
transkribierten mRNA; g) die Expression des Gens erfolgt unter Verwendung mRNA-stabilisierender Sequenzen in der vom Gen
transkribierten mRNA.
Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der organisch¬ chemischen Verbindung um eine L-Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe L-Threonin, L-Isoleucin, L-Lysin, L- Methionin, L-Ornithin, L-Prolin, L-Valin, L-Leucin und L-Tryptophan handelt.
Das Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen eine organisch¬ chemische Verbindung ausscheidenden Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium oder Escherichia handelt.
Das Verfahren zur Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen eine organisch¬ chemische Verbindung ausscheidenden Mikroorganismus der Art Corynebacterium glutamicum oder der Art Escherichia coli handelt.
Das Verfahren zur Herstellung einer organischchemischen Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe Satzverfahren,
Zulaufverfahren, repetitives Zulaufverfahren und
kontinuierliches Verfahren handelt. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der organisch-chemischen Verbindung- haltigen Fermentationsbrühe die organisch-chemische Verbindung oder ein flüssiges oder festes organischchemischen Verbindung-haltiges Produkt gewinnt.
12. Mikroorganismus, der eine organisch-chemische
Verbindung produziert, worin ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, dessen Aminosäuresequenz > 80% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, überexprimiert vorliegt.
13. Mikroorganismus nach Anspruch 12 dadurch
gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des
kodierten Polypeptids ^ 95% identisch ist mit der
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 2. 14. Mikroorganismus nach Anspruch 12 dadurch
gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid die
Aminosäuresequenz von SEQ ID NO : 2 umfasst.
15. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 12 bis 14,
ausgewählt aus der Gruppe der Gattung Corynebacterium und der Bakterien der Familie Enterobacteriacae, wobei die Art Corynebacterium glutamicum bevorzugt wird.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das überexprimierte
Polynukleotid die Aktivität einer Transhydrogenase
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