WO2014114184A1 - 一种mg53突变体及其突变方法和应用 - Google Patents

一种mg53突变体及其突变方法和应用 Download PDF

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insulin
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肖瑞平
曹春梅
张岩
吕凤翔
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北京博雅和瑞科技有限公司
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Definitions

  • the present invention relates to a MG53 mutant (also referred to as a MG53 protein mutant), and the use of the MG53 mutant for protecting heart palpitations and treating heart diseases caused by cell death, in particular while protecting the heart while protecting the heart It avoids side effects such as insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome that are accompanied by MG53, which is also cardioprotective. Background technique
  • MG53 is a skeletal muscle-specific protein mitsugumin53, referred to as MG53; or TRIM72.
  • Mitsugumin53 MG53
  • TAM muscle-specific tripartite motif family
  • RING, B-BOX, and coiled domains these proteins are labeled with ubiquitin for degradation on egg A, which is no longer needed by cells.
  • MG53 is also an important component of the cell membrane repair mechanism.
  • MG53 protects the heart, which means it protects against heart damage by increasing the amount of MG53.
  • MG53 has a negative effect that cannot be ignored and is considered a major hazard.
  • the increase in MG53 content can cause insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome while protecting the heart.
  • MG53 protects the heart with side effects such as insulin resistance, obesity and diabetes. This is a concern of the industry and does not want it: ⁇ A problem of coexistence of negative effects, so far no solution has been resolved. Summary of the invention
  • the present invention provides a mutant of MG53 which mutates to any one or two or more cysteines of seven cysteines in the N-terminal RING domain of the MG53 protein to a non-polar amino acid (for example) Alanine) MG53 protein 3 ⁇ 4 variant.
  • the MG53 protein mutant protects the heart while avoiding side effects such as insulin resistance, obesity, diabetes, and metabolic syndrome that are accompanied by the same cardioprotective effect of MG53.
  • G53 protects the heart, which means it can protect against heart damage by increasing the amount of MG53.
  • the increase in MG53 content can cause insulin resistance, obesity, diabetes and generation while protecting the heart.
  • MG53 protects the heart with side effects such as insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome.
  • this application has carried out a lot of research work, the main purpose is to mutate the MG53 protein, hope not to cause insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome. Under the premise of side effects, the mutant is retained to exercise the cardioprotective function, but without the corresponding side effects.
  • the present invention provides a MG53 mutant which is one of the seven cysteines of the N-terminal RING domain of MG53 or two or more cysteines mutated to a non-polar amino acid. Mutant; the seven cysteines are at position 14, 17th, 29th, 34th, 37th, 53rd, 56th of the RING domain, respectively. Site.
  • cysteines are important sites in the RING finger region of MG53, while the RING finger region is responsible for its E3 ligase activity, degradation of its substrate, and induction of insulin resistance, obesity, diabetes, and metabolic syndrome. The side effects are necessary, so the inventors chose these seven cysteines as research objects.
  • the above-mentioned MG53 protein mutant provided by the present invention can protect the heart while avoiding side effects such as insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome accompanying MG53, and the cardioprotective effect is not affected at all.
  • the non-polar amino acid is alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, tryptophan, or methionine.
  • the non-polar amino acids are alanine, glycine, -; valine, valine, valine and isoleucine.
  • the non-polar amino acid is alanine.
  • the MG53 mutant is selected from any one of MG53CMA, MG53C17A, MG53C29A, MG53C34A. MG53C37A, MG53C53A, and MG53C56A.
  • the MG53 mutant of the present invention includes primates, rats and mice.
  • the original wild sequence was selected as the NCBI number of mouse MG53 (TRIM72) mRNA: NM 001079932.3. Other sequences may be selected,
  • the MG53 mutant provided by the present invention is a MG53 protein mutant, and the 14th position of the N-terminal RING ⁇ finger region of the mutation is alanine, that is, the N-terminal RING finger region of the MG53 protein.
  • cystine is replaced by alanine, it is mutated to become the MG53 mutant of the present invention, and the cysteine is at the 14th position in the MG53 protein, and the alanine is also substituted at the 14 position, that is, the present invention.
  • the MG53 mutant was MG53C14A.
  • the present invention uses alanine as an example to illustrate the MG53 mutant, and it should be noted that: the cyst of the present invention
  • the 3 ⁇ 4 acid mutation may be selected from not only A (alanine), but also any of the 8 non-polar amino acids, such as glycine, leucine, valine, proline or isoleucine. It also has the effect of exercising heart protection function under the premise of MG53 mutation without causing side effects such as insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome.
  • the mutation method of other non-polar amino acids is the same as that of ruthenium and valine, and will not be described herein.
  • MG53 can act as a structural protein to promote the repair of cell membrane damage in skeletal muscle and myocardium, and also regulate intracellular vesicle transport and skeletal muscle cell regeneration; in addition, in MG53, MG53 is also mediated.
  • the combination of Caveolin-3 and PI3K activates the reperfusion injury salvage kinase pathway (RISK pathway), which plays an important protective role in cardiac ischemic preconditioning.
  • RISK pathway reperfusion injury salvage kinase pathway
  • the inventors found that the MG53 protein is a RING domain (also called a RING finger region), a B-box domain, a Coiled-coil domain, and a SPRY structure which are recognized to have ⁇ 3 ligase activity. Domain composition. From the results of amino acid sequence analysis of MG53, only the RING domain is a recognized domain containing FJ ubiquitin ligase activity, and therefore, the inventors determined that the E3 ubiquitin ligase activity of MG53 is in RING.
  • the first zinc-bonded cysteine in the zinc finger structure of the RING domain the tenth cysteine in the amino acid sequence of wild-type mouse MG53, which maintains the RING domain E3 ubiquitin ligase
  • the key is.
  • the inventors then constructed two mutants that may result in the inactivation of E3 ubiquitin ligase from MG53, one is the MG53 (ARING-MG53) lacking the RING domain, and the other is the fourteenth mutation of the amino acid sequence to the lactam. MG53 (C14A- MG53. 3 ⁇ 4 Comparing the effects of these two mutants with IF.
  • MG53 on the ubiquitination of IRS1 it was found that only normal MG53 can effectively ubiquitinate insulin receptor (IR) and insulin receptor substrate 1 (IRS1), ARING Or C14A does not have this feature.
  • IR insulin receptor
  • IRS1 insulin receptor substrate 1
  • MG53 The high expression of the muscle-specific protein MG53 is an important cause of the development of insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome; second, the first time The overall level and cell level demonstrated that MG53 is an E3 ubiquitin ligase of IR and IRS1, which degrades skeletal muscle IR and IRS1 through the ubiquitin-proteasome pathway, which is essential for the body's insulin resistance, while at the same time causing the body's pancreas 3 ⁇ 4 resistance, further into obesity, diabetes and metabolic syndrome. Second: You can also re-do it to connect ideas.
  • E3 is the only controllable component involved in protein ubiquitination.
  • the combination of ubiquitin and target protein is not
  • the former simultaneously binds to E2 and target eggs loaded with ubiquitin, and transfers ubiquitin directly to the target protein; the latter first transfers ubiquitin from E2 to a cysteine active site of the HECT domain, and then sulfate The ubiquitin is transferred to the target protein.
  • Ubiquitin is composed of 76 3 ⁇ 4 acid groups.
  • Ubiquitin-binding domains The role of the target proteins in Ubiquitin-binding domains (UBDs) is localized to the 26S proteasome, which is hydrolyzed by deubiquitination and unfolding, etc.
  • Ubiquitin-binding domains Ubiquitin-binding domains
  • the present invention supported by a number of experimental data, yielded a MG53 protein mutant which is either or both of the seven cysteines of the RING domain of the MG53 egg yolk. More than one mutant in which cysteine was replaced by alanine.
  • the MG53 protein mutant is any one of MG53C14A, MG53C17A, MG53C29A, MG53C34A, MG53C37A.MG53C53A.MG53C56A, and the MG53 mutant selected in the present invention is MG53CUA.
  • the present invention provides a method for mutating a MG53 egg yolk mutant, which is characterized in that the full-length sequence of the wild-type MG53 plasmid is subjected to site-directed mutagenesis to obtain the MG53 mutant.
  • the kit ⁇ Beijing Mu-gene 3 ⁇ 4-j Easy Mutagenesis System.
  • the above-described transformation method or mutation method is to mutate the full-length sequence of the wild MG53 plasmid by using the site-directed mutagenesis kit (Essue Mutagenesis System of Beijing Quangong) to obtain the cysteine at the 14th position.
  • the MG53 mutation of the polar amino acid is a plasmid; when the non-polar 3 ⁇ 4 acid is a tyrosine, the MG53 protein mutant in which the 1'-cystine at position 14 is mutated to alanine is obtained, and the MG53 is white
  • the mutant was MG53C14A.
  • the modification method that is, the process of site-directed mutagenesis is:
  • mutant plasmid wild type MG53 plasmid
  • DNA polymerase DNA polymerase
  • PCR amplification using a specific mutation primer
  • the MG53 mutant plasmid was obtained by transfecting cells with ScreenFectA to obtain MG53 mutation.
  • ScreenFectA (Compella) is a commercial kit, a kit A. ifi has all the reagents and methods used in this method.
  • J box is Incella's ScreenFect® A transfection reagent and + ScreenFect Dilution Buffer.
  • the overlapping K domain described in the above step (1) is preferably 20 bp.
  • the 14th cysteine of the MG53 amino acid sequence is mutated into the base of the Flag-MG53 plasmid using the QuikChange II point mutation kit. Amino acid.
  • the above mutation process is:
  • a downstream primer for t comes with mutation site and the overlapping region of 18 ⁇ 27bp t
  • mutated plasmid 200 ng as a template, a high-fidelity DNA polymerase was used, and a specific mutation primer was used for PCR amplification. The reaction product was identified on an agarose gel.
  • the PCR reaction conditions are as follows:
  • the PCR product is treated by Dpnl digestion reaction, and the reaction conditions are as follows: ': 10uL PC product is added to luL Dpnl,
  • Transformation of E. coli competent cells TOP10 Melt the competent TOP10, add the treated PCR product, place it on ice for 30 minutes, heat for 42 seconds for 42 seconds, add LB, and incubate for 37 minutes at 37 °C. Ammonia-resistant LB flat plate.
  • the method for modifying the MG53 protein mutant of the present invention can also be found in the commercially available Easy-Gold Company of Beijing.
  • the instructions for the Mutagenesis System (kit) are described in detail for the mutation modification method and the procedure.
  • the present invention also provides the use of the above MG53 mutant (i.e., MG53 protein mutant) for the preparation of a medicament for treating a disease associated with myocardial cell injury.
  • the medicament for treating cardiomyocyte injury further comprises a medicament for treating/preventing a disease caused by cardiac ischemia and 3 ⁇ 4 perfusion injury; the above diseases further include myocardial cell defect, myocardial ischemia, Cardiac ischemia/reperfusion injury, myocardial infarction, heart failure, arrhythmia, heart rupture, etc.
  • the present invention provides the use of MG53 mutant as MG53C14A, i.e., MG53C14A in the preparation of a medicament for treating cardiac damage or myocardial injury.
  • MG53 or MG53C14A can protect against myocardial cell damage caused by hypoxia.
  • the MG53 mutant referred to in this application refers to the MG53 mutein, or the MG53 mutant protein.
  • insulin resistance is one of the fundamental pathogenic factors of various metabolic disorders such as obesity and type 2 diabetes. 11 Although skeletal muscle accounts for 70-90% of the sugar utilization caused by insulin stimulation, but people have a mechanism for muscle insulin resistance: little is known today. The following experimental part of the present invention first confirmed that in mice, the skeletal muscle-specific protein mit SUg urain53 (i.e., MG53 of the present invention) mediates insulin receptor (1R) and insulin receptor substrate 1 (IRS1). degradation. When MG53 is up-regulated, it causes metabolic synthesis characterized by insulin resistance, obesity, hypertension, and lipid metabolism disorders.
  • MG53 acts as an E3 ligase, ubiquitinating insulin receptor (IR) and insulin receptor substrate 1 (IRS1), causing both to degrade through ubiquitin-dependent pathways, constituting the strength of insulin signaling in skeletal muscle.
  • IR insulin receptor
  • IRS1 insulin receptor substrate 1
  • the metabolic syndrome includes a series of diseases such as insulin resistance, central obesity, lipid metabolism, and high blood. Incidence ratio: Increasing has become one of the major threats to human health. Metabolic syndrome makes the incidence of cardiovascular disease h-fold 2 times, and the incidence of type 2 diabetes is up to 5 times. Insulin resistance is the fundamental flash of many metabolic disorders including metabolic syndrome, obesity, and type 2 diabetes. I is 70-90% of the skeletal muscle in the insulin utilization of insulin stimulation, and insulin resistance in skeletal muscle may be the pathogenic mechanism of metabolic synthesis 3 ⁇ 4 ⁇ 2 type disease. Indeed; longitudinal studies provide evidence that skeletal muscle insulin resistance is the earliest step in the pathogenesis of metabolic syndrome and type 2 diabetes. i, little is known about the mechanisms behind skeletal muscle insulin resistance.
  • MG53 knockout mice In order to determine the necessity of MG53 in the pathogenesis of metabolic syndrome, from 3 weeks after birth, the inventors began to follow-up monitoring of MG53 knockout (MG53-/-) mice and corresponding wild-type littermates in rouge. Diet (60% calories from fat) and changes in body weight and metabolic parameters in the case of normal diet. In 3-38 weeks, there was no significant change in body weight, blood k, serum cholesterol, and triglyceride in MG53 knockout mice under normal VR diet. However, in the absence of changes in serum insulin levels, MG53 knockout mice showed a significant reduction in blood glucose levels at 38w.
  • MG53 knockout mice did not show any phenotype under the high-fat diet, but maintained normal licking and insulin levels, even after 30 weeks of high-fat diet, MG53 knockout mice did not appear wild.
  • 3 ⁇ 4 Insulin resistance in mice (glycemic tolerance and insulin MG53 knockout small pancreatic morphological changes and insulin secretion are also H; 3 ⁇ 4d improvement.
  • Hidden, knockout of MG53 protects mice from high-fat diet induces insulin Resistance and metabolic disorders, :: U: indicates that MG53 is a high-fat diet-induced insulin resistance and metabolic syndrome: a must.
  • the intrinsic tyrosine-induced sea-radical activity of the insulin receptor causes the receptor's own tyrosine 15 i:1 phosphorylation.
  • the insulin receptor substrate such as the insulin receptor substrate IRS1, insulin receptor substrate 2 RS2
  • the downstream phosphoinositide-3-excited 3 ⁇ 4 is activated to stabilize the glucose of the skeletal muscle. state.
  • the inventors examined signaling molecules that may be regulated by MG53 at the insulin receptor-IRS1-PI3K-Akt-GSK3p pathway. In G53-transgenic mice with insulin resistance and metabolic disorders, skeletal fistula!
  • Islet-stimulated insulin receptor (beta subunit) and 1RS1 tyrosine phosphorylation, and Akt473 silicic acid phosphorylation was covered. At nj, these mouse bones were 3 ⁇ 4]' ⁇ , insulin receptors and insulin were less expressed in the egg yolk of the substrate 1, but their mRNA levels remained unchanged. 3 ⁇ 4 MG53 overexpressing ⁇ 3 ⁇ 4 effect 3 ⁇ 4 compensatory anti-M ⁇ ⁇ , transfection system, overexpressing MG53 gene - T. cultured C2C ⁇ 2 myotubes MG53 increased expression of 3.5 ⁇ 0.? Significantly reduced egg levels in the insulin receptor and IRS1, but their mR A levels were unchanged.
  • Body weight of MG53 transgenic mice, and 38-week-old wild type and MG53-transfected W mice contracted 3 ⁇ 4 and diastolic ⁇ ⁇ ( ⁇ . Please awake, ti oil triester, serum islets and in fasting and eating state ⁇ Levels, . and 30) ( Fat diet 3 ⁇ 4 ⁇ and MG53 knockout mice with a 3 ⁇ 4 ⁇ 4 ⁇ tolerance test and insulin resistant 38! age wild and MG53 ⁇ W mouse pancreas, 38-week-old wild-type and MG53 transgenic mice, glucose t was injected intraperitoneally at 2 g/kg body weight), the concentration of serum insulin under stimuli, or the change in baseline-to-baseline ratio The experimental indicators and the number of statistics are counted.
  • MG53 The expression of MG53 in wild-type mice fed with rouge diet was increased, and MG53 over-expressed, sputum skeletal muscle pancreas was severely inhibited, while IR and protein levels were decreased, and mR A levels were unchanged.
  • IR and IRS1 are down-regulated in various Sichuan studies. If ⁇ J insulin resistance is a common phenomenon. It should be obese or type 2 diabetes animal model and human sample.: In his experiment Furthermore, even in the metabolic k-force caused by the high-fat diet, MG53 deletion can maintain the integrity of IR and IRS and systemic islet sensitivity. In particular, high-fat diets in MG53 knockout mice reduced the abundance of ⁇ and IRS1 by the high-fat diet, MG53 water
  • MG53 knockout mouse pancreas W, 1R 1 3 ⁇ 4 prime cause, iRSK Akt phosphorylation and GSK3P will increase significantly. Therefore, MG53 t regulates the bone UR and IRS1 - tone that is essential for the rouge diet and metabolic diseases
  • MG53-mediated skeletal muscle-specific insulin resistance developed into a systemic metabolic disorder.
  • T 3 ⁇ 4 the inventors tracked the ff-type of MG53TG mice and the high-fat diet feeding sputum (multiple ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Muscle and pancreas.
  • '3 ⁇ 4 ⁇ arrived in Hangyuan J ⁇ -3 ⁇ 4 fl development of disorders (including obesity and polyps; 'insulin resistance'.
  • Acidification and their total protein levels are relative to the GAPDH standard, 3 ⁇ 4 is 1;, ⁇ j'' wild z I ⁇ : multiple of the background.
  • the representative western print id statistics are not narrow, 3 ⁇ 4 W from 6 or 38 weeks,! ⁇ '3 ⁇ 4 and VI G53 transgenic mouse skeletal muscle, liver, eagle) 3 ⁇ 4 Akt phosphorylation.
  • 1RS1 is the node of IR and islet-like factor-I (the IGF-IR channel is a total of ⁇ , the person also returns IMG-1 letter was studied for muscles other than islet signals!
  • MG53 lack of fire increases the dose-response effect of insulin-stimulated IRS] acid phosphorylation, which enhances the effect of iGF-I at beta concentrations, rather than low concentrations of 1GF-I.
  • the MG53 contains a small classical E3 ubiquitination-linked RING finger domain (or Ri G ⁇ ' refers to the [domain, or ING domain) at the amino terminus, and the inventors suggest that MG53 may act as a muscle-specific E3 Generalization of the insulin receptor and IRS1 undergoes a broad-spectrum-dependent degradation. A variety of I are supporting this hypothesis. Fi first, immune co--: ';':: small - endogenous MG53 and insulin receptor, IRS] have physical interactions, and exogenous expression of MG53 and IR, IRS1 in HEK293 cells. The second is ubiquitination of IR and 1RS1 in MG5 TG mouse skeletal muscle spasm.
  • sequence analysis predicted a cysteine-rich region in the RING K domain at the N-terminus of MG53, 3 ⁇ 41 ⁇ 27 half 1 ⁇ 2, 3 ⁇ 4, special!fc ⁇ cyst ( ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
  • this MG53 mutant has neither the total egg A amount of P '3 ⁇ 41 nor the lR-IRSl-AKT-GS: ⁇ i, which is caused by the islet ⁇ : activation of i4 path: W this, --'t water armor', RING finger area is MG53 E3 ligase function must be ⁇ ⁇ ,.
  • MG53 is well known as membrane repair and myocardial protection
  • the inventors have a small MG53 in the movement of insulin resistance and metabolic disorders. '';Spoon
  • MG53 The high expression of MG53 is used to initiate the whole body 1 ⁇ 2 island 3b4 and metabolism. MG53 as
  • Heterologous ⁇ 3 ligase can cause ubiquitin-dependent degradation of IR and IRS, and becomes a decisive regulator of the 1' skeletal muscle signal, resulting in insulin signaling and metabolic defects.
  • Acid is required for MG53 to exert the above-mentioned metabolic clearance. Mutation of cysteine in the RING ⁇ domain can cause loss of insulin resistance, obesity, and diabetes mellitus.
  • MG53 transgenic mice Murine MG53-based full-length cDNA coding sequence was cloned into pUC-CAGGS female Xhol locus, regulated by chicken beta actin. After being linearized by Sail digestion and purified by gelation, this fragment was microinjected into the fertilized egg A of the mouse. PCR W to introduce the type > i!.
  • Plasmid and adenoviral vector MG53 full ⁇ was amplified from mouse cDNA by PCR: column and MG sequence of R. J G domain (ARING), and inserted into p3XFIAG from two cleavage sites of Bglll and Xbal Expression vector of CMV-10 (to Sigma-Aldrich) +).
  • the MG53 variant of C14A 14th, acid is replaced by lactamine is a strategy for the fast-point test
  • the plasmid was transformed.
  • the insulin receptor sequence was cloned from pBABE-bleo human ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ receptor B (to Addgene male 'd > and inserted into the pcDN iO'Myc-His B by Hindll and Xbal cleavage sites.
  • Hugh H Invitrogen.
  • Insulin Receptor Substrate] (IRS1) is derived from pBS-m IRS1 (with Invitrogen), ! V : (1 ⁇ 2 ⁇ , and inserted into pcDNA4/TOMyc by two cleavage sites: Hindlll and Notl -H;s B expression vector (from Invitrogen;).
  • N-terminal HA-tagged ubiquitin and the C-terminal FLAG-containing pancreatic expression plasmid were provided by Dr. Chen and I. Leibiger, respectively.
  • Adenosis 3/4d expressing GF and GFP-G53 is made in
  • C2C12 myoblasts rice cell resource center, IB S, ':: ' 1 Academy of Sciences / China & I and Medical University '" Ding - 37 degrees Celsius with 5%: .
  • the carbonized cell culture chamber was treated with Dulbecco's modified Eagle medium (DME ⁇ culture, supplemented with 10% fetal fetus lfn Tao (Sigma-Aldrich: ⁇ rfj), 0.11 g/L sodium pyruvate and 1 % ⁇ ?3 ⁇ 4 ⁇ -'; myoblasts at 90%, - / ⁇ . by adenovirus infection or plasmid transfection into ⁇ 1 ⁇ 2' ⁇ ! Introduction : Zfn, cells containing DMliM culture of blood stasis; :':i Cultured into a myotube for four days.
  • DME ⁇ culture supplemented with 10% fetal fetus lfn Tao (Sigma-Aldrich: ⁇ r
  • the method of cell hypoxia is to culture the cells in RPMI 1640/5% fetus 4 ⁇ [fi clear culture for 48 hours; ⁇ -, ' ⁇ change medium for serum-free and use 95% Gas and 5% ::.
  • lT : .
  • the cell's medium is replaced by 64 (V5% fetus ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , put / ": H degree incubator containing 5% carbon dioxide ⁇
  • 3 ⁇ 4 ( ⁇ , cell culture solution and sputum reagent are mixed in a ratio of 1:1); 4 The sample is too lightly shaken 2 ⁇ ⁇ (This cell, te nutrient solution and sputum reagent lightly mixed); 5 After standing at room temperature for lOmin: 6 Sampling sample ⁇ ELISA plate, _ I: machine gun Luminesce' ⁇ For LDH concentration, use sea view Source Medical Devices Limited (LDH0360). J3 ⁇ 4 body experiment method: i LDH kit reagent, according to the ratio of reagent 2 and reagent 1 (1:5) completely mixed, 2-8 degrees to be kept in m; 2 add label sample 40ul / hole; 3 After mixing with the Ou!/well reagent. ⁇ : ⁇ Measure the absorbance at 340 nm.
  • Co-immunoprecipitation lyophilized lysate (30 mM HEPES at pH 7.6, OO mM, 0.5 NP-40, and protease inhibitor mixture) lysed tissue or 3 ⁇ 4 cells, 4 C C 3 ⁇ 4 shake for 30 min ,
  • Ubiquitination analysis C2C12 transfected with a specific plasmid.
  • 3 ⁇ 4 ⁇ tube fine fl U lOmM Fl MCI 32 treatment 12 & H ⁇ ⁇ Rinse the cells with ice-cold phosphate buffer PBS, using R1PA lysate (200 ⁇ NaCl, pH 8) .C 2CmM Tris-Cl, ImM EDTA. ImM f3 ⁇ 4 EGI, 1% NP-40, 0.5% deoxy 3 ⁇ 4P.
  • Blood ⁇ measurement systolic blood pressure and relaxation
  • k is measured by - ⁇ ⁇ ' ⁇ ⁇ ⁇ Total knowledge of small ⁇ " -., Sichuan
  • the system was heated to 37 degrees Celsius (Visitech BP-2000 Blood Analysis System).
  • the adaptation of the device to the device was 7-10 days, after which it was tested for two cycles, and 10 animals were tested for a period of -: day ⁇ blood stable ⁇ .
  • 2-NBDG uptake assay C2C12 myotubes with specific gene were transfected in DMEM without blood for 12 hours, then maintained in Krebs-Ringer phosphate buffer (128 mM NaC), 1.4 mM gas Calcium, 1.4 mM ! ⁇ :;; 3 ⁇ 4 of magnesium sulfate, 5.2 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate 3 ⁇ 4 and 2 mM sodium propionate, pH 7.4) incubate at 37 ° C for 30 minutes Subsequently, 6''j, l, i were treated with O.luM insulin and 100 uM 2-NBDG (Invit-ogen) at 37 ° C.
  • the cells were washed with ice-cold PBS buffer : ⁇ :, ⁇ ⁇ . 5% of the pancreas! 3 ⁇ 4 will be «digested b', draw ""; heart for 5 minutes, then resuspend fine fM with PBS, and finally use the FACSCalibur flow cytometer (BD) to measure 3 ⁇ 4 ⁇ of FL3.
  • BD FACSCalibur flow cytometer
  • mice After glucose tolerance 3 ⁇ 4, the mice were fasted overnight (16 hours) and then administrated with D-glucose (2 g / kg body weight). In the insulin tolerance test towel, small ⁇ random feeding and intraperitoneal injection of bovine islet ⁇ (OV J kgi ⁇ ⁇ , Si3 ⁇ 4n.a-Aldri h public ⁇ ]). In order to detect glucose-stimulated insulin release, mice were fasted for 16 hC to shoot D-grass ponds (2 / k collected before and after injection at different times': tail vein blood.
  • bovine islet ⁇ OV J kgi ⁇ ⁇ , Si3 ⁇ 4n.a-Aldri h public ⁇
  • mice were independently placed in a 12-hour light/dark environment.
  • a comprehensive ft animal metabolic monitoring system (CLAMS; Columbus Instruments) was used to evaluate the mice's consumption for more than 72 hours.
  • VOI ft animal metabolic monitoring system
  • VC02 carbon dioxide production
  • the formula for the juice can be: .815+: .232V02/VCO'2)> ⁇ V(.V2.
  • the present invention also provides - an animal expression carrier, 3 ⁇ 4 load inserted: - MG53 3 ⁇ 4 body: ⁇ 3 ⁇ ⁇ :?
  • the animal expression vector can be an adenovirus for the carrier - also " 1 " for pcD / "! / vc His B,
  • the present invention also provides an animal cell transfected with the animal expression vector; the animal cell force C2C! 2 myotube cells.
  • the present invention also provides the above-mentioned MG53 mutant in the treatment of various myocardial injury drugs; including in the repair of myocardial injury, pancreatic resistance, palpitations, diWi/rt irrigation injury, myocardial 3 ⁇ 43 ⁇ 4, heart failure , arrhythmia, heart rupture, ⁇ too day ⁇ ⁇ G5
  • a drug for the treatment of insulin resistance, obesity, ftiW disease and metabolic diseases Preferably fi: use in the manufacture of the ⁇ ⁇ .
  • the above-mentioned use means that the 3 ⁇ 4 variant is the use of MG53C.A, MG5 CA : preparation of heart K; And, the MG53 mutant is MG53C29A, and the above use is the use of MG53C29A in the preparation of a medicament for treating myocardial injury.
  • the MG53 mutant is MG53C34A
  • the use of the MG53C34A is in the preparation of a drug for treating myocardial injury.
  • FIG. 1 MG53, MG53C14A and MG53 ARING both protect against myocardial cell damage caused by hypoxia.
  • MG53, MG53C14A and MG53 ARING both protect against myocardial cell damage caused by hypoxia.
  • cells containing (left; 1-1) and finely dehydrated guanidine lactate (LDH) U (right panel) were tested for hypoxia-induced overexpression of control vector (vector).
  • LDH finely dehydrated guanidine lactate
  • FIG. 1 MG53 knockout protects against metabolic diseases caused by high-fat diets.
  • FIG. 3 MG53 knockout protects against insulin resistance caused by a high-fat diet.
  • MG53 is able to interact with and iRSl and increase its ubiquitination.
  • MG ⁇ RNG finger region deletion and C14A mutation in MG53 did not cause an increase in the ubiquitination of iR and 1RS1, and did not inhibit insulin signaling.
  • MG53 In aC2C12 myotubes, overexpression of MG53 was detected by western Wots assay (Adv-MG53 can inhibit the phosphorylation of iR, IRS1 and Akt by insulin (Insulin), and reduce the total of IR HIRS1 by using proteasome inhibitors. --lac can be used to control the MG53.
  • the side is the western blots of the 3 ⁇ 4 sex, the statistical data of the side data.
  • FIG. 9 MG53C294 and both protect against damage to cardiomyocytes caused by hypoxia.
  • the 3 ⁇ 4 variant does not cause the egg A of IRS1 to drop.
  • mutant plasmid 200:3 ⁇ 4 for 3 ⁇ 43 ⁇ 4! Plates, which allow high-fidelity DNA to be aggregated and amplified by PCR with specific mutation primers.
  • the reaction product was identified on an agar gel.
  • the PCR reaction conditions are as follows:
  • the PCR product was treated by Dpnl digestion reaction, and the reaction conditions were as follows: 10 uL of the PCR product was added to luL Dpnl and treated at 37 ° C overnight.
  • Transformation of E. coli competent cells TOPI 0 Melt the competent TOPI 0, add 3 ⁇ 4 PCR product, incubate on ice for 30 minutes, heat at 42oC for 60 seconds, add LB, and incubate at 37oC for 45 minutes. Apply 3 ⁇ 4 (resistant LB plate. Incubate overnight at 37oC for 16 hours.
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • Example 4 MG53 mutation ⁇ . MG53C34A.
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • MG53 mutant MG53C29Go Mutation process of MG53C29G: The primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • MG53 mutant MG53C14V.
  • the primer sequence is:
  • MG53 mutant MG53C14I.
  • the primer sequence is: CI 41 primer 1:
  • the primer sequence is:
  • MG53 mutation MG53C17L.
  • the primer sequence is:
  • the primer sequence is:
  • Example 21 MG53 Mutant Plasmid An MG53 mutant was obtained by transfecting cells with ScreenFectA. HEK293T cells were cultured in a 60 mm culture dish to a density of 90%. A large number of plasmids (Flag-MG53 or Flag-C14A MG53) were prepared and transfected with ScreenFectA (Incella). The specific steps are as follows:
  • the cleavage sites were Kpnl and Xhol, and the MG53 full-length plasmid was used as a template.
  • the two primers were used for PCR, and the reaction system was:
  • reaction conditions are:
  • the reaction product was double-digested with Kpnl/Xhol, and the pcDNA4/TO/myc-His B plasmid was also digested with two enzymes. deal with. After that, the DNA was separated by agarose gel, and the gel was recovered. The ligation reaction was carried out by using T4 ligase, and the ligation product was transformed into E. coli ToplO strain. Validated positive clones were sequenced using sequencing to verify correctness.
  • Applicants constructed the dRING plasmid and expressed the protein from the N-terminal 58Ala, to the MG53 whole protein, and the Myc tag at the C-terminus.
  • Example 23 Differences in the ability of different mutants and MG53 wild type to protect cardiomyocytes from hypoxia
  • MG53C14A Three plasmids of MG53C14A, MG53C29A, and MG53C34A were constructed according to Examples 1, 3, and 4, and cardiomyocyte expression was performed according to Example 21, and intracellular ATP content and extracellular lactate dehydrogenase concentration were detected in an anoxic environment to detect hypoxia.
  • Figure 9 Three plasmids of MG53C14A, MG53C29A, and MG53C34A were constructed according to Examples 1, 3, and 4, and cardiomyocyte expression was performed according to Example 21, and intracellular ATP content and extracellular lactate dehydrogenase concentration were detected in an anoxic environment to detect hypoxia.
  • the method of hypoxia is to change the medium to serum-free RPMI1640 medium saturated with 95% nitrogen and 5% carbon dioxide after 48 hours of culture in ⁇ 640/5% fetal bovine serum.
  • the cells were then placed in a sealed chamber (Ohmeda oxygen monitor, type 5120) filled with 95% nitrogen and 5% carbon dioxide at 37 degrees Celsius.
  • the medium of the cells was changed to RPMI1640/5% fetal calf serum and placed in an incubator containing 5% carbon dioxide at 37 °C.
  • the detection method of myocardial cell damage is as follows:
  • Promega's CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Cat# G7571) was used. Specific experimental methods: 1 Take the CellTiter-Glo Substrate (1 tube) in the kit and mix it with CellTiter-Glo Buffer (1 tube). The reagent is returned to room temperature for use. 2 The cell sample is removed from the incubator and placed for recovery.
  • C2C12 myoblasts were constructed according to Examples 1, 3, and 4 (Cell Cell Resource Center, 1BMS, Chinese Academy of Medical Sciences/HH Medical University). Cells with 5% carbon dioxide at 37 degrees Celsius In the incubator, cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich), 0.11 g/L sodium pyruvate and ⁇ ⁇ % green chain? Prime.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • fetal bovine serum Sigma-Aldrich
  • C2C12 myoblasts (Call! 3 ⁇ 4 Cell Resource Center, Chinese Academy of Medical Sciences/ ⁇ W Union Medical University) placed at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide Cell culture incubator, cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), supplemented with 10% fetal bovine serum (S; ma-Aldri «: h), 0.1 lg/L sodium pyruvate and 1% Green 3 ⁇ 4 ⁇ -chain 3 ⁇ 4 ⁇ . •, '1 C2C12 myoblasts 90% dense. I am careful to introduce four plasmids by adenovirus infection or plasmid transfection. After that, the cells were cultured for 4 days in a culture containing 2% horse blood.
  • Co-immunoprecipitation lysate tissue or cells with lysate (30 mM HEPES at pH 7.6, 100 mM sodium chloride, 0.5 NP-40, and protease inhibitor mixture), shake at 4 ° C for 30 min, The lysate is at 4. C, centrifuge at 103,000 rpm for 10 minutes, remove the precipitate, and the supernatant is total protein, and set aside.
  • the protein A beads were washed with ice-cold 1XPBS, the beads were resuspended in PBS, centrifuged at 4000 rpm for 2 min, the supernatant was removed, and the supernatant was washed three times, the PBS was removed, and the total protein lysate and anti-IRS1 antibody were added at 0.5 ug, and the mixture was silenced at 4 ° C. Incubate for 4 hours.
  • the precipitated beads were washed with ice-cold 1XPBS, washed 3 times, then beads were added to lXloading buffer, boiled at 100 ° C for 5 minutes, centrifuged at OOO rpm for 10 min, and the sputum was taken as a sample, and the protein was separated by SDS-PAGE. , Ipokawa anti-IRS1-PYlOO antibody was used for western blot analysis. All other proteins were subjected to immunoblot analysis using the corresponding specific antibodies.
  • MG53C37A, MG53C53A, MG53C56A have protective effects on heart energy and can protect heartache.
  • the increase of MG53 content can cause pancreas, obesity and sugar disease when protecting the heart, MG53 In the heart of the heart, it is accompanied by side effects such as insulin resistance, obesity, diabetes and metabolic syndrome.
  • the cysteine, the 29th, 34th, 37th, 53rd, 56th cysteines of MG53, especially the 14th point of C is necessary for MG53 to cause insulin resistance, obesity and diabetes, That is to say, the cysteine at the above site, especially the MG53 mutant which is mutated at the 14th C (for example, MG53C 14A does not cause insulin resistance, obesity and diabetes, but still protects the damage of cardiomyocytes, ie, MG53 mutant (li ⁇ G53C 14A) can exercise heart protection without causing side effects such as pancreatic resistance, obesity and diabetes.
  • the MG53 mutant of the present invention includes the MG53 mutant of the above examples, and the sequence of the species includes primates (e.g., human), large K, and small wood.
  • the original wild type sequence is mouse MG53 ( The NCBI number of the TRIM72) mRNA: NM-001079932.3 and the other sequences may be selected from human: mRNA: NM-001008274.3 Corresponding acid sequence: NP_001008275.2 c ⁇ mRNA: NM 001077675.1 Corresponding amino acid sequence: NP 001071 143.1.
  • Monkey: mRNA: XMJ) 011 12866.2 i should be ammonia 3 ⁇ 4 acid sequence: XP_001112866.1 and should not be limited - ⁇ ⁇ listed limit sequence, containing all the corresponding sequences of IG53 of the species involved.
  • the MG53 mutant obtained based on the above sequence, the mutant mentioned in the present specification, that is, a mutant protein or a mutant egg.

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Abstract

本发明公开了一种MG53突变体，其为MG53的N端的RING结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上突变为非极性氨基酸的突变体。该MG53突变体在保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病方面具有预防/治疗的效果和应用，同时避免了MG53所带来的胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。

Description

一种 MG53突变体及其突变方法和应用
技术领域
本发明涉及一种 MG53突变体 （也可称为 MG53蛋白突变体）， 以及该 MG53突变体在 保护心赃、 治疗细胞死亡导致的心脏疾病方面的应用， 尤其是 MG53突变体在保护心脏的同 时， 避免了同样具有心脏保护功效的 MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病 和代谢综合征等副作用。 背景技术
MG53 是骨骼肌特异性蛋白 mitsugumin53， 简称 MG53;或 TRIM72。 mitsugumin53 (MG53 ), 是一种肌肉特异性 tripartite motif family (TRIM)家族蛋白（该家族蛋白常含三个特 定模序结构， 分别称为 RING, B-BOX, 和卷曲结构域。 它们共同作用结合在细胞不再需要 的蛋 A质上， 将这些蛋白带上泛素标记以便降解）， MG53也是一种细胞膜修复机制的重要组 成部分。
在医学应用方面， MG53 治疗 ώ细胞凋亡引起的心脏疾病的功效已被接受并成为业内前 沿领域的公知。 MG53能够对心脏产生保护作用， 也就是说可以通过增加 MG53的含量保护 心脏损伤。 但是， MG53 同时存在着不可忽视并被视为一大危害的负面效果， MG53 含量的 增加在保护心脏的同时， 会引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征。 也就是说 MG53 在保护心脏的同时， 伴有胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病等副作用。 这是业内所关心的且不希望 其: ι 负面作用共存的一个问题， 至今没有解决渠道。 发明内容
本发明提供一种 MG53的突变体， 为 MG53蛋白在其 N端的 RING结构域 7个半胱氨酸 屮的任 个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸 （例如丙氨酸） 的 MG53蛋白 ¾变体。 该 MG53蛋白突变体在保护心脏的同时， 避免了同样具有心脏保护功效的 MG53所 带来的同时伴有的胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征等副作用。
G53能够对心脏产生保护作用， 也就是说可以通过增加 MG53的含量保护心脏损伤。 但之后发现， MG53 含量的增加在保护心脏的同时， 会引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代 谢综合征。 也就是说 MG53在保护心脏的同时， 伴有胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合 征等副作用。 为促进 MG53蛋白在保护心脏方面能进一歩去劣存优， 本申请进行大量的科研 工作， 最主要目的是对 MG53蛋白进一歩突变， 希望能在不引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病 和代谢综合征等副作用等前提下， 使突变体保留行使心脏保护功能， 但不伴随相应的副作用。
本发明提供了一种 MG53突变体，该 MG53突变体为 MG53的 N端的 RING结构域 7个 半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体； 该 7个半 胱氨酸分别是在 RING结构域的第 14位点、第 17位点、第 29位点、第 34位点、第 37位点、 第 53位点、 第 56位点。
上述这 7个半胱氨酸都是 MG53的 RING手指区的重要位点， 而 RING手指区是其行使 E3连接酶活性、 降解其底物、 以及引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征等副作用所 必需的， 因此发明人选择了这 7个半胱氨酸作为研究对象。
实验和事实证明， 该 7个半胱氨酸的任意一个或者两个或两个以上的组合突变为非极性 氨基酸都能达到本发明的预期目的和有益效果。
本发明提供的上述 MG53蛋白突变体在保护心脏的同时， 能够避免 MG53所带来的问时 伴有的胰岛素抵抗、 肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用， 且心脏保护作用却不受任何影响。
上述的 MG53突变体中， 所述的非极性氨基酸为丙氨酸、 甘氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异 亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸、 或蛋氨酸。 优选地， 非极性氨基酸为丙氨酸、 甘氨酸、 -; 氨酸、 脯氨酸、 纈氨酸和异亮氨酸。 最优选地， 该非极性氨基酸为丙氨酸。
当上述 MG53突变体中非极性氨基酸为丙氨酸时，所述的 MG53突变体选自 MG53CMA、 MG53C17A, MG53C29A 、 MG53C34A. MG53C37A、 MG53C53A 、 MG53C56A中的任 -一。
本发明所述的 MG53突变体， 其序列的属种包括灵长类动物、 大鼠和小鼠。
其中本试验选用原始野生序列为小鼠 MG53(TRIM72)mRNA 的 NCBI 编号： NM一 001079932.3。 其他序列可选自，
人类： mRNA： NM 001008274.3 相应氨基酸序列： NP 001008275.2；
大 ¾(: mRNA: NM— 001077675.1相应氨基酸序列： NP— 001071143.1；
猴子： mRNA:XM_001112866.2相应氨基酸序列： XP_001112866.1；
且不应局限于所列举的有限序列， 包含所涉及物种的所有 MG53相应序列。 以如上序列 为基础得到的 MG53突变体。
在优选实施例中， 本发明提供的 MG53突变体， 其为 MG53蛋白突变体， 该突变休的 N 端的 RING ^指区域的第 14位是丙氨酸， 即， MG53蛋白的 N端的 RING手指区域的第一个 胱氨酸被丙氨酸替代后突变成为本发明的 MG53突变体， ώ于 MG53蛋白中该半胱氨酸位 十第 14位，取而代之的丙氨酸也在 14位，也就是说，本发明的 MG53突变体为 MG53C14A。
通过大量实验研究，发明人惊喜地发现， MG53蛋白第 14位点的 C (半胱氨酸），是 MG53 引起胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病所必需的， 即， 第 14位 C突变的 MG53 (MG53C14A)不能 引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征。 而 MG53C14A却仍然能够保护心肌细胞的损 伤 （科研实验过程中有可靠的实验数据能够支持这一发明点）， 也就是说 MG53C14A能够在 不引起胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病等副作用等前提下， 行使心脏保护功能。 这正是发明人希 望得到的出乎意料的有益效果。 若有需要， 这些证明效果的药理实验将在本发明随后部分予 以奉上， 以提供本论点也是本发明的创造性的实验数据的具体支持。
以下部分， 本发明以丙氨酸为例， 来阐述 MG53突变体， 需要说明的是： 本发明中半胱
¾酸突变可选的不仅仅是 A (丙氨酸）， 还可以是 8种非极性氨基酸中的任意 种， 例如甘氨 酸、 亮氨酸、 脯氨酸、 缬氨酸或异亮氨酸， 同样可起到 MG53突变后不引起胰岛素抵抗、 肥 胖、 糖尿病和代谢综合征等副作用等前提下， 行使心脏保护功能的效果。 ώ于篇幅所限， 仅 以 Α做最优选实施例， 其他非极性氨基酸的突变方法与 Ρ、ϊ氨酸相同， 在此不再赘述。
MG53是 TRIM家族 （The superfamily of tripartite motif-containing proteins) 中新发现的
-个蛋白质， 与其他家族成员不同， 它只在骨骼肌和心朋表达。 初期的研究表明， 在骨骼肌 和心肌中 MG53能够作为一种结构蛋白促进细胞膜损伤的修复， 同时也能够调节细胞内小泡 的转运和骨骼肌细胞再生； 另外在心肌中， MG53还通过介导 Caveolin-3与 PI3K的结合， 激 活再灌注损伤救援通路 (reperfusion injury salvage kinase pathway, RISK pathway), 进而在心 脏缺血预处理中发挥重要保护功能。 本发明人通过实验证明， 蛋白质免疫印迹实验可以得出 这样的结论， 骨骼肌 MG53在多种胰岛素抵抗的动物模型中表达量显著上调， 提示 MG53很 可能参与骨骼肌胰岛素抵抗的发生发展过程。
进一少地， 通过氨基酸序列分析， 发明人发现 MG53蛋白是 ώ公认具有 Ε3连接酶活性 的 RING结构域 （也可叫做 RING手指区域）、 B-box结构域、 Coiled-coil结构域和 SPRY结 构域组成。 从 MG53氨基酸序列分析的结果来看， 只有 RING结构域是公认的含有 FJ泛素 连接酶活性的结构域， 因此， 发明人认定 MG53的 E3泛素连接酶活性就在 RING中。 RING 结构域内部锌指结构中第一个结合锌原子的半胱氨酸， ^野生型小鼠 MG53氨基酸序列上第 十 位的半胱氨酸， 是维持 RING结构域 E3泛素连接酶^性的关键所在。于是发明人构建了 两个可能导致 MG53 的 E3 泛素连接酶失活的突变体， 一个是缺失 RING 结构域的 MG53 ( ARING-MG53 )， 另一个是氨基酸序列第十四位突变为内氨酸的 MG53 (C14A- MG53 。 ¾ 比较这两个突变体与 IF.常的 MG53对 IRS1泛素化的影响吋， 发现只有正常的 MG53能够有 效地泛素化胰岛素受体（IR)和胰岛素受体底物 1 ( IRS1 )， ARING或 C14A都不具备这一功 能。 这也完全证明 MG53的 RING结构域， 特别是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸， 对于 MG53催化 IR和 IRS1泛素化是必需的。 而与 C14A-MG53相似， ARING-MG53也能够保护 缺氧引起的心肌细胞损伤， AR1 G-MG53的心脏保护作 ) ， 我们是首次发现的。
上述这个重要发现引导着发明人对 MG53在骨骼肌胰岛素抵抗中的潜在作用进行了深入 研究。 这样的科研思路和大量实验数据决定了本发明不 ^科学猜想或是科研臆断， 而是一种 ¾ ιΚ可以产业化的科研成果， 一种真正的发明创新。
为进一歩探讨 MG53致 IR和 IRS1降解在 MG53负调控肌肉胰岛素信号通路中的作用及 弄清被 MG53泛素化的 IR和 IRS1的具体降解途径， 发明人进行了研究。在 C2C12肌管中分 别过表达 iF.常的 MG53及它的两个突变体， 比较它们对胰岛素信号的影响。 结果发现， 只有 能降解 1R和 IRS1 的正常 MG53才能够抑制胰岛素信号通路， 而失去 E3泛素连接酶活性的 W个突变体，尤其是 C14A,即使只有一个氨基酸突变，也不能行使其抑制胰岛素信号的功能。
也就是说， 本发明的前期科研实验得到的结论是： 第 ·， 肌肉特异性蛋白 MG53 常高 表达是胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征发生发展的重要原因； 第二， 第一次在整体 水平和细胞水平证明了 MG53是 IR和 IRS1的 E3泛素连接酶， 它通过泛素-蛋白酶体途径降 解骨骼肌 IR和 IRS1 , 是造成机体胰岛素抵抗状态所必 的， 同时通过引起机体的胰¾素抵 抗， 进一歩造成肥胖、 糖尿病和代谢综合征的发生。 第二:， 还可以再进 歩做以关联构想。
E3是参与蛋白质泛素化反应的唯一可控成分。按介 泛素与靶蛋白的结合方式不 |HJ， E3 可分为两大类： 含 RING ( real ly interesting new gene )结杓域的 E3和含 HECT ( homologous to E6-associated protein C terminus) 结构域的 E3。 前者同时与装载泛素的 E2和靶蛋 结合， 将 泛素直接转移到靶蛋白上； 后者先将泛素从 E2转移到 HECT结构域的一个半胱氨酸活性位 点匕 再将硫脂化的泛素转移到靶蛋白上。 泛素 76个¾基酸组成. 其中散布着 7个赖¾酸 残基， 即， 本发明涉及的 7个半胱氨酸， 这些残基可以作为其他泛素共价结合的位 。 经过 儿轮结合后， 泛素链将会变得很长， 这样有助于对 "标 '的识别。 一般认为， ώ 48位赖氨 酸介导结合的泛素链聚合体是介导靶标蛋白质经蛋白酶体降解的经典引导信号，由 63位赖氨 酸介导结合的泛素链聚合体将介导靶标蛋白质进行其他 非降解功能。 然而， 这一观点近来 有被打破的趋势。 泛素化的靶标蛋白质在泛素结合域 （Ubiquitin-binding domains, UBDs) 的 作用 卜'定位于 26S蛋白酶体， 经去泛素化和解折叠等 ¾j p， ¾终被水解。 随着科学研究的不 断深入， 在大多数胰岛素靶器 ΐ？中， 人们已经基本认^ Θ¾岛素信号网络的大致骨架结构， 即 IR/IRSs-PI3K-Akt通路； 然而， 对于影响此信号途径的-A体分子机制， 人们的研究 却刚 刚起^。 正如本发明人在科研实验中发现的， 在胰岛 ί ί号的凋控中， 除去广泛的磷酸化修 饰调控以外， 蛋白质降解对于胰岛素信号传递的影响也是巨大的。 早在胰岛素抵抗研究的初 期， 人们就在胰岛素抵抗的病人或动物模型中观察到， 1R和 IRS1 在酪氨酸磷酸化普遍受抑 制的同时， 存在其蛋白含量的下降。 直到近些年， 人们/ ί对 IRSs的蛋白质降解得到了一 认 ， 比如， SOCS1/3作为 culling-RING类泛素连接酶的 f¾物识别分子， 通过与 IRS1 和 I S2 结合， 介导了它们的泛素化降解。后来人们又发现 SOCSs能 :多种炎症因子的刺激下、' 著上 调，结合大量临床和动物模型的证据，人们意识到肥胖和 π 型糖尿病实质上是一种炎症状态，
1(U各种炎症因子在胰岛素抵抗的发生中起了重要作用。 除此之外， 也有证据表明在某 组织 细胞中 Akt及其下游分子也可能成为 UPS的靶标， 发生降解从而影响葡萄糖转运和糖异生。 然而对于胰岛素抵抗中 IR的降解机制， 至今仍然有待进一^研究。
简而 '之， 本发明在诸多试验数据的支持下， 得到了 MG53蛋白突变体， 其为 MG53蛋 ΙΊ在其 Ν端的 RING结构域的 7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸被丙氨 酸替代的突变体。该 MG53蛋白突变体是 MG53C14A、MG53C17A、MG53C29A 、MG53C34A、 MG53C37A.MG53C53A .MG53C56A中任一，本发明 选的 MG53突变体是 MG53CUA。
本发明提供了 种 MG53蛋 Λ突变体的突变方法， ^方法在于， 利坷定点突变 剂盒对 野生型 MG53质粒的全长序列进行定点突变， 得到所述的 MG53突变体。 该试剂盒 ^北京全 A金公 ¾-j的 Easy Mutagenesis System。
即， 上述改造方法或突变方法是利用定点芡变试剂盒 （北京全式金公 的 Easy Mutagenesis System) 对野生 MG53质粒的全长序列进行芡变， 得到第 14位的半胱 酸¾ 变为非极性氨基酸的 MG53突变休质粒； 当该非极性¾基酸为 氨酸时， 即可得到第 14位的 1'·胱氨酸突变为丙氨酸的 MG53蛋白突变体， 该 MG53蚩白突变体为 MG53C14A。
同样地， 发明人也做了半胱氨酸突变为甘氨酸、 亮氨酸、 脯氨酸、 缬氨酸和异亮氣酸等 其他非极性氨基酸的实验，突变/ /法同上，同样得到了 MG53Ci4G、 MG53C14L. MG53C14P G53C14V , MG53C14L
在本发明的具体实施例中， 所述的改造方法即定点突变的过程为：
( Π 先设计突变引物， 1:下游引物都带有突变 ί. 域为 18-27bp;
(2 ) 以待突变质粒 (野生型 MG53质粒) 作为模板， 使用 DNA聚合酶， 用特异性突变 引物进行 PCR反应扩增， 反,'、 产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(3 ) 利用 Dpnl进行酶切反应处理 PCR产物； (4 ) 转化大肠杆菌感受态细胞 TOP10, 融解感受态 TOP10, 加入处理后的 PCR产物， 冰上孵 ， 加入 LB， 孵育， 凃氨苄抗性 LB平板， 培养， 挑取平板上的単菌落， DNA测序 检测得芡变结果为阳性， 得到 MG53突变体质粒；
( 5 ) 述 MG53突变体质粒通过利用 ScreenFectA转染细胞方式获得 MG53突变休。 ScreenFectA ( Incella) 是商业试剂盒， 一个试剂盒甲 .ifi有该方法用到的所有试剂和方法。 上述试齐 !J盒是 Incella公司的 ScreenFect®A transfection reagent和 + ScreenFect Dilution Buffer。
上述 骤 （1 ) 所述的重叠 K域优选 20bp。
在另一优选实施例中， 为了得到 Flag-C14A MG53质粒， 在 Flag-MG53质粒的基础丄， 利用 QuikChange II点突变试剂盒， 将 MG53氨基酸序列的第十四位半胱氨酸突变成內氨酸。
在本发明又一优选实施例中， 上述突变过程是：
1、 -先设计突变引物， 使 t下游引物都带有突变位点， 并且重叠区域为 18~27bpt
2、以待突变质粒 200ng作为模板，使用高保真 DNA聚合酶，用特异性突变引物进行 PCR 反应扩增。 反应产物用琼脂糖凝胶鉴定。
PCR反应条件如下：
95 °C 〗0min (分钟）
95 °C 30sec (秒）
55 °C 30sec (秒） 20 Cycles (即， 20个循环）
72 °C 3.5sec (秒）
72 °C 5min (分钟）
4°CHold (维持）
3、利用 Dpnl进行酶切反应处理 PCR产物，反应条件如 '： 10uL PC 产物加入 luL Dpnl,
37°C处理过夜。
4、 转化大肠杆菌感受态细胞 TOP10: 融解感受态 TOP10, 加入处理后的 PCR产物， 放 在冰上孵冇 30分钟， 42Ό热刺激 60秒， 加入 LB, 37Ό孵育 45分钟。 涂氨苄抗性 LB平扳。
37Γ过夜培养 16小时。
5、 挑取平板上的单菌落， DNA测序检测突变结果。
参考： Stratagene的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit，北京全式金公司 Easy Mutagenesis S stem , 说明 15可参见如'卜'公开内容： http:// ww.transgen.com.cn/uploadfi!e/201 11 1 /201 1 1 109161357731.pdf.
本发明的 MG53 蛋白突变体的改造方法也可参见市售可得到的北京全式金公司的 Easy Mutagenesis System (试剂盒） 的说明书， 其对突变改造方法和歩骤均有详细的说明记载。 本发明还提供了上述的 MG53突变体 （即 MG53蛋白突变体） 在制备治疗心肌细胞损伤 相关疾病的药物中的用途。
上述的 MG53突变体的用途，其中所述的治疗心肌细胞损伤的药物还包括治疗 /预防心脏 缺血、 ¾灌注损伤所致疾病的药物； 上述疾病进一歩还包括心肌细胞缺损、 心肌缺血、 心脏 缺血 /再灌损伤、 心肌梗塞、 心力衰竭、 心律失常、 心脏破裂等的药物。
本发明尤其提供了 MG53突变体为 MG53C14A时， 即， MG53C14A在制备治疗心脏损 伤或心肌损伤的药物中的用途
关于 MG53 在治疗心脏损伤 /心肌损伤中的应用， 以及其在治疗 /预防心脏缺血、 再灌汴 损伤所致疾病中的用途，可参见 20091024145】 .3公开的药学实验部分的实验方法和实验数据。
在心肌细胞中过表达 MG53或 MG53C14A,都能对缺氧引起的心肌细胞损伤产生保护作 。 本中请中所提及的 MG53突变体， 是指 MG53突变蛋白， 或 MG53突变体蛋白。
众所周知， 胰岛素抵抗是肥胖、 2 型糖尿病等多种代谢障碍疾病的根本致病因素之一。 11然骨骼肌在胰岛素刺激引起的糖利用中占 70-90%，但是人们对肌肉胰岛素抵抗的具休机制 个:今仍所知甚少。 本发明以下实验部分先证实， 在小鼠中， 骨骼肌特异性蛋白 mitSUgurain53 (即本发明所述的 MG53 ) 介导了胰岛素受体 （1R) 和胰岛素受体底物 1 (IRS1 ) 的降解。 上调MG53时， 引起以胰岛素抵抗、 肥胖、 高血压、 脂代谢紊乱为表征的代谢综合汪。 在 胰岛素抵抗动物模型中， MG53表达水平显著升高； MG53过表达可以导致肌肉胰岛素柢抗， 继而引发代谢综合征。 相反， 通过保护 1R和 IRS1 , 保持胰岛素信号通路完整性， MG53的 敲除成功阻止了饮食诱发的代谢综合征的发生。 在机制上， MG53作为 E3连接酶， 泛¾化胰 岛素受体 （IR) 和胰岛素受休底物 1 (IRS1 ) , 导致二者通过泛素依赖的途径降解， 构成骨骼 肌中控制胰岛素信号强度的主要机制 t 这些发现确切地证 ¾ MG53是一个治疗代谢紊乱和 ffl 关心血管并发症的新靶点。
代谢综合征包含胰岛素抵抗、 中心型肥胖， 脂代谢紊¾和高血 等一系列的病 ，
Figure imgf000009_0001
行病比率: 在增加， 已经成为人类健康的重大威胁之一。 代谢综合征使心血管疾病发 几率 h调 2倍， 2型糖尿病发生几率上调 5倍。 胰岛素抵抗是包括代谢综合征、 肥胖、 2型糖尿病 在内的众多代谢紊乱疾病的根本 闪。 I为骨骼肌在胰岛素刺激' i起的糖利用中占 70-90%的 比例， 骨骼肌中胰岛素抵抗可能是代谢综合 ¾ Π 2型 ^病的 ¾要致病机理。 确实； 纵 研 究提供证据表明骨骼肌胰岛素抵抗是代谢综合征和 2型糖尿病病理过程的最早期歩骤。 i， 人们对骨骼肌胰岛素抵抗背后的机制所知甚少。 在 MG53保护小鼠抵抗饮食诱导的代谢综合征的¾验中， 用 western blots检测骨骼肌中 MG53 含量平均值 （胰岛素紊乱和代谢疾病大鼠、 非人灵长类模¾， 与年龄性别对应的对照 相比）， 数据与 GAPDH相比后标准化， 结果表明， 在高脂喂养 i秀导的肥胖小鼠、 db.'db糖 病模型小鼠、 自发性高血压大鼠和非人灵长类代谢综合征模型中， MG53 丰度均上调。 在肥 胖人类个体中， MG53水平上调也被实验证实 （图暂欠奉 λ 这些结果为未曾预料到的 MG53 和代谢疾病之间的联系提供了揮：要线索。
为了确定 MG53在代谢综合征致病过程中的必要性， 从小鼠出生 3周起， 发明人开始跟 踪监测 MG53敲除 (MG53-/-)小鼠和对应的野生型同窝出生仔在髙脂饮食（60%热量來自脂肪） 和普通饮食情况下的体重和代谢指标变化。 在 3-38周内, VR常饮食情况下, ^野^ ^小 相 比， MG53 敲除小鼠体重、 血 k、. 血清胆固醇、 甘油三酯， 都没有明显变化。 然而， 在不改 变血清胰岛素水平的情况下， MG53敲除小鼠血糖含量明显减少 在 38w检测 。
在髙脂喂养情况下， MG53敲除小鼠和野生型小 It有显著不 |H]。 经过 35周的高脂喂养， 野生型小鼠 MG53水平上调， 发生了以肥胖和高血压、 高血糖、 高胰岛素、 脂代谢紊乱、 肝 脂肪化为特征的代谢综合征。 值得注意的是 MG53敲除小鼠不会发生高脂喂养引发的代谢紊 乱。 与正常饮食喂养的野生型和 MG53敲除小鼠相比， 经过 35周高脂喂养 MG53敲除小鼠 的血压、 血糖、 血清胰岛素、 血脂 (胆固醇和甘油 : 水、 !ZH MG53 缺失也 了高脂喂养诱导的肥胖， 脂肪肝骨骼肌脂肪积聚， 脂昉细胞肥大， 白色和棕色脂昉含頻： 调。
为探究全身性胰岛素敏感性与代谢综合征发牛之间的关系， 泎饮食千预后的不 |: 、;', 点 进行了葡萄糖耐量试验（GT s) 和胰岛素耐量试验（ITTS)。 给予高脂饮食的野生型小¾在 7 周时表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抵杭， 即， 该现象 ^于 ^周时肥胖的发生。 随着 饮^ 的继续喂养， 野生型小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗逐渐加剧。 35周后， 高脂饮食导致了 胰岛的代偿性肥大、 血清胰岛素水平较本底升高 7倍， 致使蔔萄糖刺激胰岛素分泌障
但是， MG53 敲除小鼠在高脂饮食下没有表现出 任一表型， 而是维持 常 迎.搪 和胰岛素水平， 即便在经过高脂饮食 30周后， MG53敲除的小鼠, 未出现野生 ¾小鼠屮的胰 岛素抵抗 (糖耐量和胰岛素附 MG53敲除小 的胰腺形态变化和胰岛素分泌反 也 H; ¾d 改善。 隱， MG53 的敲除 Γ保护小鼠免于高脂饮食诱^的胰岛素抵抗和代谢紊乱， ：: U:表 明， MG53为高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和代谢综合征发 ：所必 。
为进一歩确定 MG53的 LJK 足以引发代谢紊乱 : 发明人构建了过表达 MG53 ¾ 闪小鼠 （MG53TG )。 在 38周龄时 , 其 MG53蛋^ I水 :Τ·骨骼肌中升 2.6+0.3倍, -' ,'· '心赃 屮升高 2.6+0.7倍。 然而， 在 Μ 53转¾因小鼠的非肌^绍.织 (肿 -、 脑、 下丘脑、 肝、 肠、 、 内脏脂肪和睾丸）， 并没有检测到 MG53 , 这说明 MG53的表达受到一种肌肉特 忭方式 的严格调控。即使在没有饮食干预的情况下， 38周龄的 MG53转基因小鼠出现肥胖和高 lilL/K， 并作随着血脂异常、 高胰岛素血症肥胖和禁食后血糖水平升卨。 与同窝出生的野生^小 ¾相 比， MG53 转基因小鼠的昼夜能 消耗明显降低， 但 H摄食 不变。 值得一提的 ， 葡霸 耐量试验和胰岛素耐量试验显 ^， MG53 转基因小鼠的 代谢和胰岛素敏感性存在严 ¾的损 伤， 并伴随着胰岛肥大和葡萄糖剌激胰岛素分泌的障碍。 解剖学和组织学数据进 · ½ - MG53 转基因小鼠出现了中心性肥胖、 脂肪肝、 脂肪细胞肥大和骨骼肌内脂质沉积。 这 ^数 据表明， MG53 的上调对于引发胰岛素祇抗和进一歩发展为代谢综合征既是必要的也^充分 的。 注： MG53的敲除阻断了饮食诱 ^的全身胰岛素抵抗相关实验中， 野 4·:型和 敲除 小鼠， 给予 ΪΕ常饮食或高脂饮 后在指定时问点进行葡萄糖耐景试验和胰岛素耐 fi试验。 胰 腺用苏木精和伊红染色。 葡萄糖 按 2克毎千克体重腹陀汴射、 剌激下血淸胰岛素的 变 化。 野生型和 MG53敲除小鼠均给予^常饮食或高脂饮食 35周。 所有数据均显示为 均值 十 /-标准误。
胰岛素刺激时，胰岛素受体的内在酪氨酸激海活性可引起受体自身的酪氨酸 15 i:1磷酸 化。随后招募并磷酸化胰岛素受体底物如胰岛秦受体底物 IRS1 )、胰岛素受休底物 2 RS2 ), 并激活下游的磷酸肌醇 -3-激 ¾， 以凋节骨骼肌的葡萄糖稳态。 为探究 MG53介导的胰岛 抵 抗的分于机制， 发明人检测了 MG53可能调控的位于胰岛素受体 -IRSl -PI3K-Akt-GSK3p途径 的信号分子。 在胰岛素抵抗和代谢紊乱的 G53转基 小鼠校 屮， 骨骼叽内 ! 胰岛 刺激 引起的胰岛素受体 （β亚基） 和 1RS1 的酪氨酸磷酸化， 以及 Akt473位丝氣酸的磷酸化均被 麵。 |nj时, 这些小鼠骨骼 ¾]' ψ， 胰岛素受体和胰岛素受沐底物 1的蛋 Α表达水平 少， 但其 mRNA水平保持不变。 ¾ 别 MG53过表达的裒 ¾效 ¾代偿性反^ M时釆川 , 转染系统， 过表达 MG53基因 - T.培养的 C2C】2肌管细胞 MG53升高表达了 3.5 ±0.? , 显著降低了胰岛素受体和 IRS1 的蛋 水平， 但其 mR A水平不变 G53的过表达也 | 断 了胰岛素诱导的胰岛素受体、 1RS I , Akt ¾l GSK33的活化 , 这表明在细胆水平 I·调 MG53成 功模拟了 MG53转基因小鼠的典 特征 此， 发明人的体内 ^体外实验数据均 i ;
的 I：调表达足以同时降低胰岛素受体和胰岛素受体底物从而抑制胰岛素信号转导的这两个关 键歩骤。 注： 在过表达 MG53 引发全 岛素¾抗和代 ^综合征的试骀中， 通过
MG53转基因小鼠的体重、及 38周龄的野 型和 MG53转荜 W小鼠的收缩 ¾和舒张 Ι Ι(Π.请 胆醒、 ti油三酯、 血清胰岛 及在禁食和进食状态 ^ 水平， .及 30 )( 脂饮食 ¾ ^型和 MG53敲除小鼠的葡 ¾¾ί耐量试验和胰岛素耐 38 !龄的野生 和 MG53 ^ W小鼠胰腺、 38周龄的野生型和 MG53转基因小鼠葡萄糖 t按 2克每千克体重腹腔注射）剌 激下的血清胰岛素的浓度变化，或其相 ¾于基线的变化 ή分比来做实验指标和数 ¾进 统计。
髙脂饮食喂养的野生型小鼠 MG53表达跫增 ^， 和 MG53过表达 -样， †骼肌胰 ^發 ·被严重抑制了， 同时 IR和 蛋白水平降低， mR A水平不变。 此外， 伴随着 上 调， IR和 IRS1 后下调在各种川 研究 if^J胰岛素抵抗啮 ^型屮是 ·个普 ¾的现象. 應 肥胖或 2型糖尿病动物模型和人 ·样.： 他实验中， 还^ 了即使在高脂饮食导致的代谢 k力下， MG53缺失可以使小 |¾维持 IR和 IRS)的完整性以及全身的胰岛紊敏感性。 特别的， 在 MG53敲除小鼠中高脂饮食¾法降低 Π 和 IRS1的丰度 ' 际 h， MG53 水
会使骨骼肌中 IR和 IRS1的 积累， 可能导致 MG53敲除小 ! ,相对于 同窝野 对 . 糖水平降低。 相对于野生型正常饮食小鼠， MG53 敲除小鼠 W胰,1 ¾素引起的 1R、 iRSK Akt 和 GSK3P磷酸化会显著增加。 因此， MG53 t调对于卨脂饮食和代谢疾病引起的骨骼 UR 和 IRS1— 调看起来必不可少
之后，寻找决定 MG53介导的骨骼肌特异的胰岛素抵杭发展成为全身的代谢紊乱的 ^。 为 T ¾ 的，发明人跟踪了 MG53TG小鼠和高脂饮食喂奍的 f生型小 (多种器 'ύ代谢紊乱发 生的不 R]时期。 结果显示通过过农达 和^脂饮食诱 骨骼肌胰.' ¾ ί抵杭远 J ^-¾ f l 谢紊乱的发展 （包括肥胖和多 ΐ; '胰岛素抵抗）。 6周龄 lii MG53TG体 i和野' k型 ， 但是肌肉的胰岛素信号明显被损伤了 , 而肝脏和腹部脂 的胰岛素信号却没^变化。 W烊^， 高脂饮食喂养 1周的野生型小^会导致 G53显 ！ 肌胰岛素〈i^¾ ， 这在 ί:：】脂 7周之后才出现的系统性葡萄糖胰岛素不耐受和 1 1周出现 显的肥胖之 。 这之后； 1!：常饮 食的 MG53TG小鼠 ( 38周) 和高 ¾饮食的野生型小 ( ¾脂喂养 35 的肝 ^fl ''.''^织 才发展为完全的胰岛素抵抗 这 数据和 MG53缺 对于代谢紊乱 ¾ ¾保护作 ¾ 烈说明 MG53介导的骨骼肌胰 ¾ ¾抗在病理发 过 ·Α:'Τ':要的 '-jZ wii - 致的是， 在人和动物模型上的研究也揭示了肌肉胰岛素信号降低在肥胖和葡萄糖小^受病^ 过程中是 个重要的环节。 ΪΓ : MG53 调节的胰岛素信号的 !1关实 ¾， 川代表忭 r^fi^均 western blots数据显示 38周 型和 MG53转¾闵小 ¾或 ι 常饮食或高脂饮食喂养的 MG53 敲除小鼠和他们的野生型 [R]窝小^胰¾素诱导的 -β和 Rsi的 ? 氨酸磷酸化，
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酸化和他们的总蛋白水平。 憐酸化蛋 H和总蛋 相对 GAPDH标^化， ¾为其 1;、」· j''野 z I·:型本底的倍数。代表性的 western印 id 统计数据显不狭 ,¾ W 起 6 、 38周野 ,！ ·' ¾和 VI G53 转基因小鼠骨骼肌、 肝脏、 鹰) ¾的 Akt的磷酸化。
因为 1RS1是 IR和胰岛尜祥 长因子 -I受休 ( IGF-IR 号通路共 ^的节点， 发 人还 研究了 MG53 对于肌肉除胰岛 信号之外 IGF-1 信 的！;响 通过比较不^剂量朕½ ^或 IGF-I诱导的野生型和 MG53缺陷小鼠 骼肌 IRS1酪¾酸¾ ^化， 发明人发现 N4G5 ' u 在胰岛素信号中的 IRS1作为「i标。 特别地， 尽 MG53缺火增加了胰岛素刺激的 IRS】 酸磷酸化的剂量效应， 这加强了 iGF-I在 β浓度的效果， 而不是低浓度的 1GF-I。 如 \1053 选择性的把胰岛素受体介导的； RS1 ίΗ号作为目标，那么 MG53 〖GF-I受休信 ^^ '！功 丁胰岛素受体和 IGF-I受体的 一.聚化或高剂景 1GF-1 ' !¾ι' 胰岛素受体交叉激活，
山于 MG53在氨基端包含 - -小经典的 E3泛素化连接 RING finger结构域 (或称 R.i G Γ' 指 [ 域， 或 ING结构域）， 发明人提出 MG53可能作为 -个肌肉特异的 E3泛 化 接 作 用胰岛素受体和 IRS1进行泛察依赖的降解。 多种 I正据支持这个假设。 fi先， 免疫共 ·:';':: 小- 了内源性 MG53和胰岛素受体、 IRS]之问有物理相互作 ，在 HEK293细胞外源性表达 MG53 和 IR、 IRS1也是如此。其二 在 MG5 TG小鼠骨骼肌屮， 过^达 MG53可以提 IR和 1RS1 的泛素化。 另外， 高脂饮食增加了野' k型小鼠骨骼肌胰岛素受体 l IRS1 的泛 化. 不 i MG53敲除。 现有的结果证明了 MG53 E3泛素化连接酶促进了泛素依赖的骨骼肌 IR和 1RS1 降解， 尽管在 (FBXO40 是. 肉特异性的） 特定的 ^胞培养系统和 织其他 S3连 接酶和 IRS1降解有关。相反的，无论足 MG53过表达还 I 除， 血糖稳态有关^卻 iR: \ GLUT1或 GLUT4的蛋白丰度却没冇改变， 说明他们不, G5 的底物 ,
根据以^对其他 RING类型 E 连接酶的了解，序列分析预测到 MG53 N端的 RING K域中的半胱氨酸丰富区， ¾½7个半½ ,¾， 特 !fc^ ·个^'胱 Μ (' ' . 'j¾ 'J锌离子结合)可能是 MG53作为 E3连接^功能的关键 H '½确， RING下 ! >0' '除^ 者半胱氨酸位点的丙胺酸突变 换能够彻底的去除或者 ½地缓解 MG53对 IR和 IRS1的泛 素化程度。 需要注意的是， 与^ 4型 MG5j不 M, 这 MG53突变体既没冇 ^响 P '¾1 的总蛋 A量， 也没有影响胰岛 ^促使的 lR-IRSl-AKT-GS:<^ i,:i4 径的激活： W此， --'t 水甲', RING finger区是 MG53 现 E3连接酶功能所必^ ί ,. !¾ !:!.， 頻 c!asto-lactac stin- β-lactone (β-lac) 对蛋白酶体抑制能够彻底的去除 MG53引, 的 1R和 1RS1蛋「ϊ的下 ； l IR和 IRS1酪氨酸的磷酸化 以及 ΑΚΎ的丝氨酸 473的 酸化，还有胰岛尜'
纖， 这证明了 MG53介导的咦^； 信兮通路的抑制是通过蛋 嗨体系统。 MG!32, ·种蛋白酶体抑制剂的实 Ψί£^到了类似结 、之, 们1 体^': ¾^ 、外' 〈！ 验结果证明， MG53是 -个新的 F3连接 它能够通 j 泛 ：赖的降解， 接 i ΊΪ IR,:1' I "SI 的蛋白稳定性。 这个发现证 了 MG53能够 M时 调！R和 IRS1- 是 个解籽
抗和代谢疾病的潜在机制， !iij RING手指区域中的半胱氨酸足 MG53介导 1R和 IRS!降解. 产生胰岛素抵抗， 发生全身肥胖和代谢性疾病所必需的。
归纳起来，尽管 MG53作为膜修复和心肌保护已经众所周知， 发明人在这 小了 MG53 足一个在胰岛素抵抗和代谢紊乱的动 ¾模型屮
Figure imgf000014_0001
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MG53 高表达做为启动全身 ½岛素 ¾抗和代谢 合^^必 ^的。 MG53 作为
异性 Ε3连接酶能够导致 IR和 IRS】 的泛素依赖性降解, 成为了一个决定性的1'骼肌 信号的负向调节者， 从而引起 的胰岛素信"及代谢的缺陷。 而 RING手指 i 域屮的 胱
¾：酸是 MG53发挥上述代谢扣关作用必需的，突变 RING ^指 域中的半胱氨酸能够使 丧失引起胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿^ 代谢综合征的作^
这些发现不仅定义了 MG53足- -个骨骼肌胰岛素敏感性的负向^节者， 还 —'、':，' MG53 介导的肌肉胰岛素信号抑制是 ·个导致全身胰岛素抵抗和代谢综介征的 i要的机制 这也标 志着 MG53 Ε3连接酶能够被作为一个治疗各种代谢疾病， 包括肥胖、 2型糖]^病和相关的心 血管并发症的重要潜在靶点。
实验方法总结：
试剂和材料： PY100.p-Akt,'p-GSl p以及 1RS1的抗体均来 '=] Cell Signaling Technok 〉 公 ]； MG53和 GLUT1的抗休. ί'! Abeam公 ； p-IR-β禾「' 1RS1的抗体来 Upstate公 1： -β, GAPDH, GSK3p和 GLUT4 ίί勺抗体來 U Santa Cruz Biotechnology 公 ： Μϋ Ζ , clasto-lactacystin β-lactone (β-lac), anti-b-actin, Flag. Myc and insulin抗体来自 Sigma-Aldrich公 ι:ί]。 Z^N-y-nitrobenzJ-oxa-lJ-dia ol -4-yl¼mino -2-dejx giucose (2-NBDG)¾ |'| In vitro ^en公 。 人的胰岛素样生长因子 ^IGF-n来 Π PeProTech 、 π)。 如^ 别说明， fe化' 试. 均来自 Sigma-Aldrich公司 ^
胰岛素抵抗的动物模型： 糖 (db/db) 小鼠 （年龄 25 周的雄性糖尿病小^ 和对 照组瘦小鼠来自 Jackson Labor torv公司。 发性高 !iL^人鼠 (年龄为 Π个 i的雄性 !'；：' 性
^血压大鼠） 和同源同龄雄' i:常血！：、:大¾来 北); 利^公司 ί:ί发 ^ z^^d 代谢综合征的非人灵长类动物模型的幵展和鉴定在之前的文献中已有报迫。
MG53 基因敲除小鼠和饮 ft千 f : 所有动物^序和安乐死术都是桉照中 北京人 'V^j物 研究委 会批准的协议來执行的， 并 符合实验动物护理和使用指南 (iQ85
Figure imgf000014_0002
^研究所修订发行， 发行号 .'·,· ；? ί 吻都^ 八中! 北」」 (-大 ¾验动物 二 个 光照 /黑暗循环的温控屏障设 ¾们可 t'i ¾取 ^ 水。 本研究仅使川 f !;¾ λ^Ι·¾ 材料。 MG53 基因敲除小 (的 Hi逑之 iiij'Liii说明 t, MG 1 敲呤小 和野
鼠从出生三周 iJ「始进行高脂 含 60 - .路 脂肪. ¾ii'Jf 'Hl!¾^,iJ. f' j、j 12492) 和正常饮食 ui.4%的卡路 束 i'l脂肪， 屮国 事医学科 学院） 的十预 3
MG53转基因小鼠： 鼠科 MG53基 ^全长 cDNA编码序列被克隆到 pUC-CAGGS 雌 Xhol位点， 受鸡 beta肌动蛋白 ^动子调控。经 Sail酶切线性化并通过凝胶纯化以后, 这个片 段被显微注射到小鼠的受精卵 A。 PCR W来进 因型鉴〉 i!。
质粒和腺病毒载体： 通过 PCR从小鼠 cDNA文 扩增了 MG53全 †:列和缺 ' 了 R.J G 结构域的 MG53序列 （ARING), 并从 Bglll 和 Xbal两个 切位点插入 p3XFIAG-CMV-10 的表达载体 （来 Sigma-Aldrich公 +])。 仝长的 MG53 ' 也 pnF 和 Xhol两个, 1?': 点嵌入 pcDNA4/TO/Myc-His B的表込载体 (来! Ί Invitrogen公司）。 C14A (第 14位的、 酸被內氨酸钤代） 的 MG53 变体是利 快速点 变试^盒的策略对野 (
质粒改造而成。 胰岛素受体序列^从 pBABE- bleo人咦 ¾ ^受体 B (来 Addgene公 'd > 克隆而来， 并经 Hindlll和 Xbal两个酶切位点嵌入 pcDN iO'Myc-His B的¾达载休 ( H Invitrogen公司）。 胰岛素受体底物】 （IRS1) 是从 pBS-m IRS1 (夹 Invitrogen公司）、！ V : (½ιίιί 来，并经 Hindlll和 Notl两个酶切位点嵌入 pcDNA4/TOMyc-H;s B的表达载体（來自 Invitrogen 公司；)。 N端带 HA标签的泛素 ^达 粒和 C端带 FLAG标^的胰 紊¾体表达质粒分别 '陈 博士和 I. Leibiger提供。 表达 GF 和 合¾达 GFP- G53的腺病 ¾d在之^做出
细胞培养， 腺病毒感染和质粒转染: C2C12成肌细胞 ：米 细胞资源中心, IB S, '：: ' 1 学科学院 /中 &I办和医科大' 「 丁- 37摄氏度含 5%: .ί化碳的细胞培养箱屮，经 Dulbecco 改良的 Eagle培养基 (DME < 培养， 该培养¾中补充有 10%牛胎儿 lfn涛 (Sigma-Aldrich：· rfj), 0.11g/L丙酮酸钠和 1%的 Γ?¾素 - ' ; 成肌细胞 90% 度时， - /Π.通 过腺病毒感染或质粒转染进^ ½'Α·!导入 : Zfn, 细胞 含 ^ 血淸的 DMliM培; <:':i 培养四天分化成肌管。
细胞缺氧的方法是， 把细胞培养在 RPMI 1640/5% 胎 4··· [fi清的培养 ^屮 48小时以; ή-, 'Ιί 换培养基为不含血清的并利用 95%滅气和 5% ::.氧化 ^饱和的 RPM11640培养 ， ifnH1细, '〗Μ 放到 37摄氏度的充满 95%氮气 ίΠ 5%二氧化碳的密封 ,'!、 -·Τ( 'O neda ox gen mo itor. t>ne： 1；0) 实现细胞缺氧。 对于: lT:.常的对 Γ.¾， 细胞的培养基换成
Figure imgf000015_0001
64(V5% 胎 Ιίΐί洁， 放/「：H 度含有 5%二氧化碳的孵箱屮
心肌细胞损伤的检测方 :
对于 ATP 含量， 采用 Pix.^ega 公 ' -」 CdlTii、t- o Luminescent Cell Viability Assay (Cat#G7571)o具体的实验方法： 1 取试剂食中的 Cell l it r-Glo Substrate ( I 'ΐν ) ! j Cdirii r-G!o Buffer (1管） 混合， 实验^将 剂恢 待 ： 中取出， 放 个: 温待用; 3 细胞培养板中每 样本留取 定 ϋ的细胞坊养液， 等 的 ΑΤΡ试剂¾ （叩， 细胞培养液与 ΑΓΡ试剂按照 1:1的比例混合） ； 4 将样太轻摇 2ηιίη (此^骤中细胞， te 养液和 ΛΓΡ试剂轻混）； 5 室温静置 lOmin后： 6 吸取样本^酶标板屮， _ I：机枪测 Luminesce'^ 对于 LDH浓度， 采用上海景源医疗器械有限公 (LDH0360)。 j¾体的实验 法: i LDH试剂盒内试剂， 按照试剂 2和试剂 1 (1:5) 的比例完全混合后， 2-8度保存待 m; 2 嗜 标板中加样本 40ul/孔； 3 与 Ou!/孔的试剂混合后. ί: Λ测定 340nm处的吸光度值。
进行免疫共沉淀 (CoIP): 利月裂解液 (pH7.6的 30mM的 HEPES, !OOmM的¾化 . 0.5 NP-40, 和蛋白酶抑制剂混合物） 裂解组织或 ¾胞， 4C C ¾ 摇动 30min，
Figure imgf000016_0001
4。 C， 13,000 rpm离心 10分钟. 去除沉淀， L?清为总蛋 Π， 备闭 = 利用冰冷的 1XPBS '： t proteinA beads, PBS重悬 beads, 4000rpm离心 2min, 去除上清， 如此反 ί ίΐ洗 3次, i除 PBS, 加入总蛋白裂解液和 anti-IRSl的抗体 0.5ug， 4。 C静 ¾合孵 ft 4小时。 棚 冰冷 1XPBS清洗沉淀后的 beads. 清洗 3次, 之后 beads加入 lXloading buffer, 100。 C 5 分钟， 13000rpm离心 10min， 取上清做为样品， SDS-PA.GE上样分离蛋 ， ^ PVD «¾； 利 用 anti-IRSl-PYlOO的抗体进行蛋 质免疫印迹分析。 Jti'lii¾^均利用选相 的特^ 'ΐ 蛋白质免疫印迹分析。
泛素化分析：转染了特定质粒的 C2C12 ¾ί管细 fl U lOmM： Fl MCI 32处理 12 & H · ΐ 用冰冷的磷酸缓冲溶液 PBS漂洗细胞，用 R1PA裂解液 (200ηιΜ的 NaCl, pH值 8.C 2CmM 的 Tris-Cl, 在 ImM的 EDTA. ImM f¾ EGI , 1%NP-40, 0.5%脱氧 ¾P.酸钠, O.l^SCS, 2.5 mM焦磷酸钠， 1 mM的 β-甘；;; i磷酸盐， 1 mM四氧嘧 f :酵抑制剂混合物及】0nM的 MG132) 于冰上裂解 10分钭， 然后 1 000 rpm离心，0分钟 fi A： ίίϋ!ί¾ ^ Hii 动 （GE Healthcare公司） 处 ffl. 1小 il、， 然 和 ^ ί ， 蛋 Α ¾脂糖¾ 4 -t; 〔J:、 ff 4小时， 最后用 RIPA缓冲液洗涤 ¾树脂::：'.次， 洗脱 十¾疫印迹分析。
为了检测在体水平泛素化情况. 骨骼肌闳在液氮中磨成粉水. 用上述提到的 RiPA绂^ 液于 4摄氏度裂解 1小时， /π 13000 mm离心 ?0分钟: :Γ Α琼脂糖珠 f特 !"· 4 摄氏度孵存 8小时， 然后和 ''COug裂解物 4摄氏度^ fi 3 时 . Π]？ ΛΡ\ 冲 ί^ ' 沉淀物， 用 2XSDS样品缓冲液洗脱卜'來) 1千免疫 n迹 5:ri^
组织学分析： 用于组织 分析的 U Oiilj'L 睡, ：：色脂肪 - 内脏脂肪和 '' ·^： ½ 定在 4%多聚甲醛 (ρΗ7.4) Φ过夜. 包^在石蜡中， ：： f !:5 u 连续切片。 并对他们 r 准的苏木精和曙红染色以及 ¾光¾色。
血 ίΚ测量： 收缩压和舒张) k的测 是以 -祌^^ λ' ^万法 Υ 】总识的小^」 -.， 川) 系统加热至 37摄氏度 (Visitech BP- 2000血 分析系统） 成的。小鼠对该设备的适应 为 7-10 天， 之后经历了两个周期的测_ ， 天测 10个动物， 为期 -：天^血 稳^。
2-NBDG摄取测定：导入特 ^基因的 C2C12肌管细胞在不含血沾的 DMEM培^ ½屮 ' 12 小时， 然后维持在的 Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液（128mM的 NaC】， 1.4mM氣化钙， 1.4mM !"·：；；¾ 的硫酸镁， 5.2mM氯化钾， 10mM的磷酸¾二钠和 2mM丙 W酸钠， pH7.4) 中于 37摄氏¾下孵 fj—30分钟， 随后用 O.luM的胰岛素和 100uM2-NBDG (Invit-ogen) 于 37摄氏度处理 6''j、l、i。 然 后, 将细胞用冰冷的 PBS缓冲液洗潘 :·:次， Π Ο.5%的胰蛋 !¾将«消化卜'来， 画" ";心 5分钟， 再用 PBS重新悬浮细 fM， 最后用 FACSCalibur流式细胞仪 (BD) 测 ¾FL1的 ' ¾^ 。
代谢测量：在葡萄糖耐量 ¾验屮，小鼠禁食过夜（16小吋），然后腹胺注射 D-葡萄糖（2g/kg 体重）。 在胰岛素耐量实验巾， 小^随机喂养和腹腔注射牛胰岛^ (O.V J kgi^^, Si¾n.a-Aldri h 公 π])。 为了检测葡萄糖刺激胰岛素的释放， 小鼠禁食 16 hC 射 D-葡萄塘 (2 /k 收 集注射前和注射后不同时间 '：的尾静脉血。 测血糖和胰岛 浓度的测镜是利 HI AccuCheck 的血糖仪 (罗氏诊断公 ¾制) 和凌 研究的 EUSA试剂盒 ( F!^f¾¾HtEZR I-13K 分别; 勺。 血淸甘油三酯和胆固醇浓度 利用试, fj盒 ( Π ^编 ¾分别 Αι290··63701和 294-65801 )测 i ;
对于代谢率分析， 小鼠分别独立安 在一个 12小时光照 /黑暗的环境内 一个综合 ft的动 物代谢监控系统（CLAMS;哥伦布仪器公司）被用来评价小鼠迩续超过 72小时的^耗 i! VOI) 和二氧化碳生产 (VC02)。能 的汁 '公式为：
Figure imgf000017_0001
.815+:.232V02/VCO'2)><V(.V2。
统计：统计显着性检验组 异;^ fj Φ·因素方差分析 > ANOVA 或 复测 s的 /J J， 适当时候用 Bonferroni 后 t检验 所有 P{£小于 认为! 数据表不为 meanrS.e.m
本发明还提供了-一种动物表达载休， ¾载 插入了 ： -述的 MG53 ¾体: ^3· ϋί:？ 动物表达载体可以为腺病毒 达载休 - 还「1 "以为 pcD /"! / vc His B,
本发明还提供了一种动物细胞，该细胞转染了 . h述 动物表达载体；该动物细胞力 C2C! 2 肌管细胞。
本发明还提供了上述 MG53突变体在制各应 心肌损伤 的药物^的川途； 乜 括在心肌损伤修复引起的胰 素抵抗、 心赃缺 、 diWi/rt灌损伤、 心肌¾¾、 心力 哀竭、 心律失常、 心脏破裂的 物屮的 迨 太 日 ^了 ^ G5
备治疗胰岛素抵抗、 肥胖、 ftiW病 代谢类疾病的药物 Ψ 川途。 优选 fi:制各 节 ιίιι. 的药物中的用途。
上述的用途是指， 该 ¾变体为 MG53C .A, MG5 C A :制备治 心 K; )i 物中的用途。 以及， MG53突变体为 MG53C29A, 上述的用途为 MG53C29A在制备治疗心肌损伤的药 物中的用途。
以及， MG53突变体为 MG53C34A, i述的用途为 MG53C34A在制备治疗心肌损伤的药物 屮的用途。 附图说明
图 1: MG53、 MG53C14A和 MG53 ARING都能够保护缺氧引起的心肌细胞的损伤。 在培养的心肌细胞中， 过细胞 含 (左; 1-1)和细 ¾外乳酸脱氢嗨 ( LDH ) U (右图） 检测缺氧引起过表达对照载体 （vector) 的细胞出现明 的死亡， 而在过表达 MG53 或者 MG53C14A的细胞中， 细胞的死亡均明显减少。 同样， 过表达 MG53 ARING 能够降 低缺氧引起的心肌细胞的死亡 （ '
图 2: MG53敲除能够保护高脂饮食引起的代谢疾病。
a 正常饮食或高脂饮食喂养不同时间的野生型和 MG53 敲除小鼠的体電变化。 b-e i 常 饮食或高脂饮食喂养 35周的.野 ^和 MG53敲除小鼠的 ΐίπΓΚ (b),
Figure imgf000018_0001
(c；)、血献 ( d：'、 幢隱 (e) 和血甘油三酯 （f) 数据。
图 3: MG53敲除能够保护高脂饮食引起的胰岛素祗抗。
a iK常饮食或高脂饮食喂养 30周的野生型和 MG53敲除小鼠的糖耐量（ 、和胰岛尜咐 ：½ (右)数据。 b 正常饮食或髙脂饮食喂养 30周的野生型和 MG53敲除小鼠屮葡萄糖 起的 胰岛素分泌数据。
图 4: MG53转基因能够引起的^胖和代谢疾病,，
a 用 westernblots实验 ^：测 MG53转基 W小鼠的不;「 : .织 MG53 ¾达 :(。 b 'F:::;'次 食喂养不同时间的野生型和 MG53转基因小鼠的体電数据^ 正常饮食喂养 38 的野 z
MG53转基因小鼠的血胰岛素、 血糖、 血压和血胆 醇数 Φ；。
图 5: MG53敲除能够保护高脂饮禽引起的胰岛素抵抗
a 正常饮食喂养 38周的 ^'^ί 转½闪小 !H的骨骼 fl中， 瞎岛素 (Insulin) 刺¾ 引起的 IR， IRSl和 Akt的磷酸化和总蛋 ： »变化,, ：侧 代表忭的 western blots阁.
左边数据的统计图。 b 常饮食或 脂饮食喂养 35周的 !Pf^型和 MG53敲除小鼠的 fi¾屮， 胰岛素 （Insulin) 刺激引起的 ！R, IRSl 和 Akt 的磷酸化和总蛋甶量变化。 侧是代表性的 western blots图， 右侧是 敉 ^^阁。 +
图 6: MG53能够与 和 iRSl相互作用， 并增加其泛素化。
a通过免疫共沉淀实验检测野牛 小; ¾的骨骼肌 MG53 '-7 IF. ¾， I S 相 仆 . b ;1； 常饮食喂养 38周的野生型和 MG53转基 [¾小鼠的骨骼肌中， IR (上） 和 IRS1 「卜) Π勺泛桌 化程度数据。 c IH常饮食或高脂饮食喂养 35周的野生型和 MG53敲除小鼠的骨骼肌屮，IR( 和 IRS1 (下） 的泛素化程度数据。
图 Ί·· RNG手指区删除和 C14A突变的 MG53, 不能引起 iR和 1RS1的泛素化增加， 而 且不能抑制胰岛素信号。
a 在 C2C12肌管细胞中， MG5?的过表达（Flag-FL.-MG53 )能显著引起 IR ( r.)和 IRS1 (右)的泛素化增加，但 R G于-指区删除 (Flag-ARNG)和 C14A突变 (Flag-C14A)的 MG53 过表达，对于 IR (左）和 IRS1 (右）的泛素化 f影响。 b C2C1 肌管细朐中， ¾过 wesrem blcts 实验检测 MG53的过表达 （FL-MG53) 能显著抑制胰岛素 （Insulin) 引起的 IR， IRS1和 Akt 的磷酸化， 减少 IR和 IRS1 的总 i ; RNG手指 删除 (細 G) 和 C14A突变 (C14A) 的 MG53无类似的作用。 左为代表性的 western blots图， 右为:r边数据的统计图。
图 8: 蛋白酶体抑制剂能抑制 MG53引起的胰岛素信号变化
aC2C12肌管细胞中， 通过 western Wots实验检测 MG53的过表达 （Adv-MG53 能够. ^抑制胰岛素 （Insulin) 引起的 iR， IRS1和 Akt的磷酸化， 并减少 IR HIRS1的总 而利 用蛋白酶体抑制剂 β-lac能够仰制 MG53的作川。 侧是代¾性的 western blots阁， 边数据的统计图。 b C2C12肌 细胞屮，赌岛素（Insulin)引 细 对于匍萄糖衍 :物( 2-NBDG) 的摄取增加， 而 ^»353过 Flag- G53) ίί 够抑制 )] ¾ 引^ 2-.NBD(3 MG:;3 的作用能够被蛋 β酶体抑制剂 p-lac抑制。
附图 9: MG53C294与 都能够保护缺氧引起的心肌细胞的损伤。
在培养的心肌细胞中， 通过细胞内 ATP ( rJfi) 细 IM外乳酸脱 酶 (LDH 度
(右图）检测缺氧引起过表达对照载休（vector)的细 Kk W^i^ '死 Γ— 而过 达 MC;5.'C29\ l MG53C34A两种突变体都能够和 MG53或者 MG53C14A相 ί以， 明显的减少细胞的死
附图 10: MG53C29A与 MG53C 4A不能够引起 的降解，
a 在培养的 C2C12细胞屮，转染野 ： V1G53，以及 G53C14A,MG5329A和 MG53C34A 突变体后， 能够表达类似水' MGD'MG53文 1 , b 的 C2C12细跑屮， 05"ί 'ιί 农达能够降低细胞内 IRS1的含^， 而与 MG53C14A 体类似， MG53C29A和
¾变体不能够引起 IRS1的蛋 A 下降。 具体实施方案
以下实施例中采 的 ；; '：全 ： ^公 I'^ Mutagenesis Systen, r 实施例 1. MG53C14A— ¾' f变 ^ G5'^ ¾f：-1;¾ -： ί;- I'JJ . ； G53CI-IA) 1、设计突变引物，使上下游引物都带有突变位点， 并且重叠 域为 18-27bp。引物序列为： C14A primer 1 :
5'-gaactgtccgccccactgtgcttgcagctg-3 '
C14A primer 2:
5，- agcacagtggggcggacagttcctgacgca-3'
2、 以突变质粒 200:¾作¾¾！板， 使 高保真 DNA聚含隨， 用特异性突变引物进行 PCR 反应扩增。 反应产物用琼脂 凝胶鉴定。
PCR反应条件如下：
95 °C l Omin
95 °C 30sec
55 °C 30sec 20 Cycles
72 °C 3.5sec
72 "C 5min
4°C Hold (维持）
3、利用 Dpnl进行酶切反应处理 PCR产物，反应条件如下： 10uL PCR产物加入 luL Dpnl, 37°C处理过夜。
4、 转化大肠杆菌感受态细胞 TOPI 0: 融解感受态 TOPI 0， 加入处 ¾ 的 PCR产物， 放 在冰上孵育 30分钟， 42oC热刺激 60秒，加入 LB， 37oC孵 fT 45分钟。涂¾( 抗性 LB 板。 37oC过夜培养 16小时。
5、 挑取平板上的单菌落， I A测序检测突变结果。
参考： Stratagene的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit. '；；（今式 :公 "， Easy
Figure imgf000020_0001
System » 说明 15可参见如 卜公开内容：
Figure imgf000020_0002
实施例 2. MG53蛋白的突变体， 即， MG53突变休： MG53C17A。
MG53C17A的突变过 ：
引物序列为：
C 17 A primer 1：
5， - gcccactggccttgcagctgttcgat gcgc-3"
C17A primer 2:
5'- cagctgcaaggccagtgggcaggacagttc-3"
其他歩骤同 C14A。 T N2014/000078 实施例 3. MG53突变体： MG53C29A。
MG53C29A的突变过程：
引物序列为：
C29A primer 1：
5,- acggctgaggctggccacagttictgccj.'t- '
C29A primer 2:
5，- actgtggccagcctcagccgtcactggcgc -3，
其他歩骤同 C14A。 或可参见实施例 1或 2. 实施例 4. MG53突变^. MG53C34A。
MG53C34A的突变过程：
引物序列为：
C34A primer 1：
5 ' - cacagtttcgcccgtgcctgcctgatccg -3 '
C34A primer 2:
5'- gcaggcacgggcgaaactgtggccacactc-3'
其他^骤同 C14A。 实施例 5. MG53突变休： MG53C37A。
MG53C37A的突变过禾
引物序列为：
C37A primer 1 :
5，- tgccgtgccgccctgatccgggtggcaggg -3'
C37 A primer 2:
5'- ccggatcagggcggcacggcagaaactgtg -3'
其他歩骤同 C14A。 或"」参见实施例】〜4.
序列对比见附图 9. 实施例 6. MG53突变体： MG53C53A。
MG53C53A的突变过
引物序列为：
C53A primer 1 : 5 ' - acagttgccgctccctgttgtcaggcacct-3 ' C53 A primer 2:
5， - acaacagggagcggcaactgtgccgtccgc -3' 其他歩骤同 C14A。 实施例 7. MG53突变体： MG53C56A。 MG53C56A的突变过稃：
引物序列为：
C56A primer 1：
5'- tgtccctgtgctcaggcacctacacg ccg -3' C56A primer 2:
5 , - aggtgcctgagcacagggacaggcaactgt-3 ' 其他 骤同 C14A。
¾施例 8. MG53突变体： MGWC14G。 MG53C14G的突变过程：
引物序列为：
C14G primer 1 :
5 '-gaactgtccggcccactgtgcttgcagctg-3， C14G primer 2:
5， - agcacagtgggccggacagttcctgacgca-3 ' 其他歩骤同 C14A。 例 9. MG53突变体： MG53C17G。 MG53C17G的突变过禾^
引物序列为：
C 17G primer 1：
5， - gcccactgggcttgcagctgttcgatgcgc-3 ' C17G primer 2:
5， - cagctgcaagcccagtgggcaggacagttc-3 ' 其他歩骤同 C 14A。 实施例 10. MG53突变体： MG53C29Go MG53C29G的突变过程： 引物序列为：
C29G primer 1：
5 , - acggctgagggtggccacagtttctgccgt-3 ' C29G primer 2:
5，- actgtggccaccctcagccgtcactggcgc -3' 其他歩骤同 C14A。 实施例 11. MG53突变体： MG5?'C34G。 MG53C34G的突变过稃：
引物序列为：
C34G primer 1：
5 ' - cacagtttcggccgtgcctgcctgatccgg-3， C34G primer 2:
5，- gcaggcacggccgaaactgtggccacactc-3 ' 其他歩骤同 C14A。 实施例 12. MG53突变体： MG53C37Go MG53C37G的突变过程：
引物序列为：
C37G primer 1：
5,- tgccgtgccggcctgatccgggtggcaggg -3' C37G primer 2:
5，- ccggatcaggccggcacggcagaaactgtg -3' 其他歩骤同 C14A。 实施例 13. MG53突变木: MG53C53Go MG53C53G的突变过禾^
引物序列为：
C53G primer 1：
5 ' - acagttgccggtccctgttgtcaggcacct-3 ' C53G primer 2: 5'- acaacagggaccggcaactgtgccgtccgc -3' 其他歩骤同 C 14A。 实施例 14. MG53突变体： MG53C56Go MG53C56G的突变过程：
引物序列为：
C56G primer 1：
5，- tgtccctgtggtcaggcacctacacggccg -3' C56G primer 2:
5'- aggtgcctgaccacagggacaggcaactgt-3' 其他歩骤同 C14A。 实施例 15. MG53突变体： MG53C ! 4L。 MG53C14L的突变过程：
引物序列为：
C 14L primer 1 :
5 ' -gaactgtccctcccactgtgcttgcagctg- ' C 14L primer 2:
5 , - agcacagtgggagggacagttcctgacgca-3 ' 其他 骤同 C 14A。 实施例 16. MG53突变体： MG53C14V。 MG53C14V的突变过程：
引物序列为：
C 14V primer】：
5 ' -gaactgtccgtcccactgtgcttgcagctg-3 , C14V primer 2:
5 ' - agcacagtgggacggacagttcctgacgca-3 ' 其他^骤同 C14A。 实施例 17. MG53突变体： MG53C14I。 MG53C14I的突变过程：
引物序列为： CI 41 primer 1：
5 ' -gaactgtccatcccactgtgcttgcagctg-3， CI 41 primer 2:
5， - agcacagtgggatggacagttcctgacgca-3 ' 其他^骤同 C 14A。 实施例 18. MG53突变体： MG53C14P。 MG53C14P的突变过程：
引物序列为：
C14P primer 1 :
5， -gaactgtccccaccactgtgcttgcagctg-3， C14P primer 2:
5 , - agcacagtggtggggacagttcctgacgca-3 ' 其他^骤同 C14A。 实施例 19. MG53突变休: MG53C17L。 MG53C17L的突变过程：
引物序列为：
C17L primer 1：
5'- gcccactgctcttgcagctgttcgatgcgc-3'
C17L primer 2:
5 ' - cagctgcaagagcagtgggcaggacagttc-3， 其他 骤同 C14A。 实施例 20. MG53突变木： MG53C29L。
MG53C29L的突变过程：
引物序列为：
C29L primer 1：
5， -acggctgagcttggccacagtttctgccgt-3 ' C29L primer 2:
5 ' -actgtggccaagctcagccgtcactggcgc-3 ' 其他^骤同 C14A。 实施例 21. MG53突变体质粒通过利用 ScreenFectA转染细胞方式获得 MG53突变体。 HEK293T 细胞培养在 60mm 培养皿中至 90%密度， 准备大量的质粒 （Flag-MG53 或 Flag-C14A MG53 ) , 利用 ScreenFectA (Incella) 转染细胞， 具体歩骤如下：
( 1 ) .首先弃去细胞培养液， 加入 DMEM 2mL。
( 2 ) .在一个 eppendoff管 A中加入提供的 dilution buffer 250uL， 加入 5mg质粒， M匀；
(3 ) .在 eppendoff管 B中加入提供的 dilution buffer 250uL， 加入 ScreenFectA50uL, 混匀：
(4 ) .5min后， A、 B两管液体混匀， 室温放置 30min;
( 5 ) .将混合物均匀加入细胞， 培养 6小时， 换成普通培养基。
48小时后， 利用细胞裂解 buffer裂解细胞， SDS-PAGE分离蛋白， 转膜后利用 Flag抗体检 测蛋白表达。 实施例 22. 通过 PCR的方法截断 RING结构域：
PCR引物：
dR-F: 5'-ata ggtacc gccacc atg gcacctacacggccgcagg-3 '
dR-R: 5'-ata ctcgag gc ggcctgttcctgctccggc-3 '
酶切位点为 Kpnl 和 Xhol, 以此 MG53全长质粒为模板， 利用这两个引物做 PCR， 反应 体系为：
Template DNA: 1 uL ( 100ng/uL)
Primer dR-F： 1 uL
Primer dR-R: 1 uL
KAPA Hotstart PCR mix: 50 uL
H20: 47 uL
反应条件为：
98 °C 5 mir
98 °C 30 sec
66 °C 30 sec 卜 30 Cycles
72 °C 70 sec 」
72 °C 5 min
4 °C Hold
反应产物经 Kpnl/Xhol双酶切处理， 同时 pcDNA4/TO/myc-His B质粒也用两种酶双酶切 处理。 之后琼脂糖凝胶分离 DNA， 做胶回收， 利用 T4连接酶做连接反应， 连接产物转化大 肠杆菌 ToplO菌株。 验证阳性克隆利用测序验证序列正确。
申请人构建好的 dRING质粒， 表达的蛋白为： 从 N-端 58Ala幵始， 到 MG53全蛋白结 束， 并在 C-端带有 Myc标签。 实施例 23. 不同突变体和 MG53野生型保护心肌细胞缺氧的能力差异
根据实施例 1、 3、 4构建 MG53C14A、 MG53C29A, MG53C34A三种质粒， 根据实施例 21进行心肌细胞表达，在缺氧环境下检测细胞内 ATP含量和细胞外乳酸脱氢酶浓度检测來检 测缺氧引起过表达对照载体 (vector)的细胞出现明显的死亡， 而过表达 MG53C29A 与 MG53C34A两种突变体都能够和 MG53或者 MG53C14A相似，明显减少细胞的死亡。如图 9。
细胞缺氧的方法是， 把细胞培养在 Ι ΡΜΠ640/5% 胎牛血清的培养基中 48小时以后， 更 换培养基为不含血清的并利用 95%氮气和 5%二氧化碳饱和的 RPMI1640培养基，而后把细胞 放到 37摄氏度的充满 95%氮气和 5%二氧化碳的密封小室 （Ohmeda oxygen monitor, type 5120) ¾现细胞缺氧。 对于 JH常的对照， 细胞的培养基换成 RPMI1640/5% 胎牛血清， 放在 37摄氏 度含有 5%二氧化碳的孵箱中。
心肌细胞损伤的检测方法如下：
对于 ATP 含量， 采用 Promega 公司的 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Cat#G7571)。具体的实验方法： 1 取试剂盒中的 CellTiter-Glo Substrate ( 1管）与 CellTiter-Glo Buffer ( 1管） 混合， 实验 将试剂恢复至室温待用； 2 细胞样本 ώ孵箱中取出， 放置恢复至 ¾温待用； 3 细胞培养板中每个样本留取一定量的细胞培养液， 与等量的 ΑΤΡ试剂混合（即， 细胞培养液与 ΑΤΡ试剂按照 1 :1的比例'混合) ； 4 将样本轻摇 2min (此歩骤屮细胞， 细胞培 养液和 ATP试剂轻混）； 5 室温静靑 lOmin后； 6 吸取样本至酶标板中，上机检测 Luminescent 对于 LDH浓度， 采用上海景源医疗器械有限公司 （LDH0360)。 具体的实验方法： 1 LDH 试剂盒内试剂， 按照试剂 2和试剂 1 ( 1 :5 ) 的比例完全混合后， 2-8度保存待用； 2 酶标板中 加样本 40ιι1/孔； 3 与 200ul/孔的试剂混合后， 上机测定 340nm处的吸光度值。
¾施例 24. 不 | j突变体和 MG53 !2f ΐ型 C2C12细胞的蛋 ft表达能力差异
根据实施例 1、 3、 4构建 MG53C14A、 MG53C29A, MG53C34A三种质粒， C2C12成肌 细胞 （来 细胞资源中心， 1BMS, 中国医学科学院 /中 H协和医科大学） 賈于 37摄氏度含 5 %二氧化碳的细胞培养箱中， 经 Dulbecco改良的 Eagle培养基 （DMEM) 培养， 该培 屮 补充有 10%牛胎儿血清 （Sigma-Aldrich公司）， 0.11g/L丙酮酸钠和〗％的青 素 链?！素。 Ί C2C12成肌细胞 90%密度时， 我们通过腺病毒感染或质粒转染进行四种质粒导入。 之后， 细胞在含有 2%的马血淸的 培养基 ¾培养四天分化成肌管 c
在培养的 C2C12细胞中，转染野生型 MG53 ,以及 MG53C14A、 MG5329A和 MG53C34A ¾变体后， 能够表达类似水平的 MG53/MG53突变体。 如图 10a。 实施例 25. 不同 ¾变体和 MG53野生型降解 IRS1能力的差异
根据实施例 1、 3、 4构建 MG53C14A、 MG53C29A, MG53C34A三种质粒， C2C12成肌 细胞 （来! ¾细胞资源中心， 屮国医学科学院 /中 W协和医科大学） 置于 37摄氏度含 5 %二氧化碳的细胞培养箱屮， 经 Dulbecco改良的 Eagle培养基 （DMEM) 培养， ¾培养 中 补充有 10%牛胎儿血清 （S ;ma-Aldri«:h公 ）， 0.1 lg/L丙酮酸钠和 1 %的青 ¾素 -链¾素。 •、'1 C2C12成肌细胞 90%密¾^ . 我 ίΠ通过腺病毒感染或质粒转染进行四种质粒导入。 之后， 细胞在含有 2%的马血淸的 培养某毕.培养四天分化成肌管
进行免疫共沉淀 （CoIP ): 利用裂解液 （pH7.6的 30mM的 HEPES, lOOmM的氯化钠， 0.5 NP-40, 和蛋白酶抑制剂混合物） 裂解组织或细胞， 4° C混合摇动 30min， 将裂解物在 4。 C, 13,000 rpm离心 10分钟, 去除沉淀， 上清为总蛋白， 备用。 利用冰冷的 1XPBS清洗 protein A beads, PBS重悬 beads, 4000rpm离心 2min， 去除上清， 如此反复清洗 3次， 去除 PBS, 加入总蛋白裂解液和 anti-IRSl的抗体 0.5ug， 4° C静音混合孵育 4小时。 照 法利用 冰冷 1XPBS清洗沉淀后的 beads, 清洗 3次， 之后 beads加入 lXloading buffer, 100° C煮 5 分钟， OOOrpm离心 10min， 取上淸做为样品， SDS-PAGE上样分离蛋白， 转 PVDF fi, 利 川 anti-IRSl -PYlOO的抗体进行蛋白质免疫印迹分析。其他蛋白均利用选相应的特异抗体进行 质免疫印迹分析。
培养的 C2C12细胞中， MG53过表达能够降低细胞内 IRS1的含量， 而与 MG53C14A突 变体类似， MG53C29A和 MG53C34A 变体不能够引起 IRS1的蛋白量下降。 该实施例说明 相较与 MG53过表达，其他 G53 变体不能引起胰岛素抵抗，较小影响机体代谢。见阁 10b。
经实验证实， 包括 ¾施例1所述的 MG53C14A在内的 MG53突变体， , MG53C14A、
MG53C17A, MG53C29A 、 MG53C34A. MG53C37A、 MG53C53A 、 MG53C56A均对心脏 能产 保护作用，可保护心 伤. MG53含量的增加在保护心脏的 时，会引起胰¾素诋杭、 肥胖和糖]^病， MG53在保 心脏的 ^时， 伴有胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病和代谢综合征等 副作用。 而 MG53的第 14 .^ . 第 位点、 第 29位点、 第 34位点、 第 37位点、 第 53位点、 第 56 位点的半胱氨酸， 特别 ½第14位点的 C， 是 MG53引起胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病所必需的， 也就是说上述位点的半胱氨酸尤其足第 14位 C发生突变的 MG53突变体 （例如 MG53C 14A 不能 引起胰岛素抵抗、 肥胖和糖尿病， 却仍然能够保护心肌细胞的损伤， 即， MG53突变体（li拈 G53C 14A )能够在不引起胰 ^抵抗、肥胖和糖尿病等副作用等^提下， 行使心脏保护功能。
本发明所述的 MG53突变体， 包括上述实施例的 MG53突变体， 其序列的 种包括灵长 类动物（例如：人）、大 K和小 其中木试验选用原始野^序列为小鼠 MG53(TRIM72)mRNA 的 NCBI编号： NM— 001079932.3而其他序列可选自人类： mRNA： NM— 001008274.3 相应 酸序列： NP_001008275.2 c Κ mRNA: NM 001077675.1相应氨基酸序列： NP 001071 143.1。 猴子： mRNA:XMJ)011 12866.2 i应氨 ¾酸序列： XP_001112866.1 且不应局限- ϊ·所列举的冇限 序列， 包含所涉及物种的所有 IG53相应序列。 以如上序列为棊础得到的 MG53突变体.、 本中请中所提及的突变体， 即突变蛋白或突变体蛋 。
以上旨在进…歩说明本发明， 并不对本发明的范围加以限制。 本领域技术人员对在此公 丌的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种 MG53突变体， 其特征在丁 ·， 该 MG53突变体为 MG53氨基酸序列的 N端的 RING结构域 7 个†.胱氨酸中的任一个成两个或两个以上的 1'··胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体； 该 7个 1'··胱氨酸分别 RING结构域的第 14位点、 笫】7位点、 第 29位点、 第 34位点、 第 37位点、 第 53位点、 第 56位点。
2、 如权利耍求 1所述的 MG53突变体， 其特征在丁， 所述的氨基酸为丙氨酸、 甘氨酸、 缬氨酸、 亮 ¾酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 色氨酸或蚩氨酸。
3、 如权利耍求 2所述的 MG53突变体， 其特征在丁， 所述的 极性氨基酸为丙氨酸、 甘氨酸、 亮氨 酸、 脯氨酸、 纈氨酸成异亮氨酸。
4. 一种 MG53突变体基闪，其特征在于， MG53突变体基闪 Λ有编码权利耍求 1所述的 MG53突变体 的碱 ¾序列。
5、 如权利耍求 3所述的 MG53突变体， 其特征在丁， 所述的非极性氨基酸为丙氨酸， 所述的 MG53 突变体选 ΰ G53C 14A , MG53C17A、 MG53C29A 、 MG53C34A , MG53C37A MG53C53A 、 MG53C56A 中的任意一种。
6、 一种 MG53突变体的突变方法， 其特征在丁-, 该方法是利 W定点突变试剂盒对野生^ MG53质粒 的全 K序列进行定点突变， 得到所述的 MG53突变体质粒。
7、 如权利耍求 6所述的突变方法， 其特征在丁， 利 定点突变试剂盒对野生 MG53质粒的全〔；序 进行突变， 得到第 14位的 1 光氨酸突变为 1f极性氨基酸的 MG53突变体质粒。
8、 如权利耍求 6所述的改造方法， 其特征在丁 ·， 该定点突变的过程为：
( I ) 先设计突变引物， 使上下游引物都带有突变位点， ^ 区域为 18-27bp;
( 2 ) 以待突变质粒作为投板， 使 W DNA聚合 MJ特异性突变引物进行 PCR反应扩增， 反应产物 川琼脂糖凝胶屯泳鉴定； 该待突变质粒为野生 MG53质粒；
( 3 ) 利 W Dpnl进行酶切反应处理 PCR产物；
( 4 )转化人肠杆 感受态细胞 TOP10, 融解感受态 TOP10, 加入处理后的 PCR产物， 冰上孵育， 加 A LB , 孵育， 涂氨苄， 抗性 LB平板， 培养， 挑取平板上的单 '落， DNA测序检测得突变结果为 PII性， 将所得到的突变基闪插入到载体中得到 MG53突变体的质粒；
( 5 ) 上述 MG53突变体质粒通过利 W ScreenFectA转染细胞方式获得 MG53突变体。
9、 种动物表达载体， 其特征在丁 '该载体插入了权利耍求 8所述的 MG53突变体基闪。
10、 如权利耍求 9所述的动物表込载体， 其特征在丁载体可以 Λ (腺病 ¾表达载体。
U、 如权利耍求 10所述的动物表达载体， 其特征在丁载体可以为 pcDNA4/TO/Myc-His B。
12、 一种动物细胞， 其特征在 Γ该细胞转染了权利耍求 9或 10所述的动物表达载体。
13、 如权利耍求 12所述的动物细胞， 其特征在丁所述动物细胞为 C2C 12肌管细胞。
14、 权利耍求 1所述的 MG53突变体在制备应 心肌损伤修复的药物中的 途。
15、 如权利耍求 14所述的 途， 其特征在 Τ·, 所述药物在制备应 心肌损伤修复引起的胰岛紊抵抗、 心脏缺血损伤、 心脏缺血 /再灌损伤、 心肌梗塞、 心力袞竭、 心掉火常、 心脏破裂的药物中的 W途。
16、 如权利耍求 14所述的 J途， 其特征在丁 ·， 所述药物在制备治疗胰岛素抵抗、 肥胖、 糖尿病 ^代 谢类疾病的药物中的 HJ途。
17、 如权利耍求 14所述的 途， 其特征在丁， 所述药物在制备 / 川调' 1*！血压的药物中的 途。
18、如权利耍求 14-17任 - 项所述的 Mj途,其特征在丁 ·，该 MG53突变体为 MG53C 14A，其为 MG53C14A ίΐ制备治疗心肌损伤的药物中的 MJ途。
19、 如权利耍求 〗4-Π 任一项所述的 W途， 其特征在丁 ·， 该 MG53 突变体为 MG53C29A , 其为 MG53C29A在制备治疗心肌损伤的药物中的 W途。
20、 如权利耍求 〗4-17 任一项所述的 HJ途， 其特征在丁 ·， 该 MG53 突变体为 MG53C34A , 其为 MG53C34A在制备治疗心肌损伤的药物中的川途。
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