WO2014106798A2 - Péptidos antimicrobianos, composiciones que los comprende y usos - Google Patents

Péptidos antimicrobianos, composiciones que los comprende y usos Download PDF

Info

Publication number
WO2014106798A2
WO2014106798A2 PCT/IB2013/061346 IB2013061346W WO2014106798A2 WO 2014106798 A2 WO2014106798 A2 WO 2014106798A2 IB 2013061346 W IB2013061346 W IB 2013061346W WO 2014106798 A2 WO2014106798 A2 WO 2014106798A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
seq
peptides
staphylococcus
bacteria
Prior art date
Application number
PCT/IB2013/061346
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2014106798A3 (es
Inventor
Paulo Maffia
Original Assignee
Inis Biotech Llc
Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas
Universidad Nacional De Quilmes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inis Biotech Llc, Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas, Universidad Nacional De Quilmes filed Critical Inis Biotech Llc
Priority to MX2015008373A priority Critical patent/MX360559B/es
Priority to US14/655,885 priority patent/US9359409B2/en
Publication of WO2014106798A2 publication Critical patent/WO2014106798A2/es
Publication of WO2014106798A3 publication Critical patent/WO2014106798A3/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to antimicrobial peptides such as, for example, the peptides shown in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5. Peptides they have activity against gram positive bacteria and gram negative bacteria.
  • a bactericidal composition comprising an amount between 0.5 ⁇ g / mL and 1024 ⁇ g / mL of the peptides is also provided; and excipients.
  • bactericidal peptides Today there are some bactericidal peptides. Each peptide has different characteristics in terms of the minimum inhibitory concentrations that should be used to achieve the desired bactericidal activity, in addition they show differences in solubility, toxicity, specificity and target of action to different pathogens.
  • US 6696238 discloses polypeptides and defensins used as antimicrobials in the preparation of culture media.
  • Antimicrobial peptides are provided, in a preferred embodiment the peptides may be those shown in SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 5.
  • the peptides have activity against gram positive bacteria and against gram negative bacteria.
  • a bactericidal composition comprising an amount between 0.5 ⁇ g / mL and 1024 ⁇ g / mL of the peptides mentioned in the preceding paragraph; and excipients.
  • peptides 1 The use of peptides 1 to prepare a medicament against bacterial infections is provided.
  • Figure 1 shows the circular dichroism (CD) spectra of the peptides of the invention in an aqueous solution; where it is shown that said peptides are unstructured in aqueous buffer, with a characteristic minimum at approximately 200 nm.
  • Omi Omiganan peptide, pl: Peptide 1; p2: peptide 2, p3: peptide 3, p4: peptide 4, p5: peptide 5.
  • Figure 2 shows the circular dichroism (CD) spectra of the peptides of the invention in a solution with SDS, where conformational changes in peptides 1, 2 and 5 are observed, which are consistent with the formation of alpha-helix structures.
  • Omi Omiganan peptide, pl: Peptide 1; p2: peptide 2, p3: peptide 3, p4: peptide 4, p5: peptide 5.
  • the fundamental characteristic of the peptides of the invention is their sequence and the arrangement of amino acids in the peptide chain that has been designed with the aim of improving the selectivity of action on bacterial strains, decreasing their possible cytotoxic action, something very common in these types of peptides.
  • the peptides presented here have an action on gram positive and gram negative bacteria, including various types of Staphilococcus and Pseudomonas.
  • the MIC values are in some strains are especially interesting.
  • new synthetic peptides amidated at the C-terminus or non-amidated are described, with bactericidal activity in clinically relevant strains and resistant to traditional antibiotics.
  • These peptides can be incorporated into a vehicle suitable for application, for example, topically, which will provide a successful solution to the problem of superficial wounds with high risk of infections. They are also a product of easy application and broad bactericidal spectrum, which solves the growing problem of multiresistant bacterial strains.
  • peptides having antibacterial activity have been synthesized, in a preferred embodiment the peptides were the following:
  • Peptide 2 GLLKKWLKKWKEFKRIVGY (SEQ ID N ° 2)
  • Peptide 3 FGKEKKAWWRRRKWLK (SEQ ID No. 3)
  • Peptide 4 TTCDLLSGVGLPNVPQPLHCVFRGNRKIKW (SEQ ID No. 4)
  • Peptide 5 RIVQRIKKWLLKWKKLGY (SEQ ID No. 5)
  • the 5 peptides designed and synthesized of the invention, most omiganan (peptide of the state of the art) were evaluated in their antimicrobial capacity in microdilution assays to determine the minimum inhibitory concentration (MIC).
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • Table 1 shows the results of MIC obtained, expressed in ⁇ g / ml of each peptide. Lower MIC values indicate greater antimicrobial potency.
  • cytotoxicity The ability of the peptides of the invention to lyse erythrocyte fumes was subsequently evaluated as a measure of cytotoxicity (Table 2). The tests were performed according to the examples and are expressed as a percentage of the total lysis obtained with water or with the Tween20 detergent. In these studies, at a lower percentage of hemolysis, its cytotoxic activity is assumed to be lower.
  • peptides 1, 2 and 5 have higher antimicrobial potency values. Hemolysis values are lower or similar to the Omiganan peptide. Although peptide 2 has high hemolysis values, it is decided to continue with its analysis since in a possible topical use these values would not necessarily be an impediment. In a preferred embodiment, peptides 1 and 5 are selected that have the highest therapeutic index values, understood as the value indicating the antimicrobial potency over the percentage of cytotoxicity.
  • Tables 3 and 4 show the results obtained by analyzing the MIC of the selected peptides 1, 2 and 5 plus the Omiganan control peptide.
  • Table 3 shows the results for a panel of gram-negative bacteria and table 4 shows a panel of gram-positive bacteria. These tables include the gene (s) detected responsible for antibiotic resistance for each strain.
  • peptide 5 is up to eight times more active than the known Omiganan peptide. Something similar is observed against Klebsiella pneumoniae, where great potency improvements of peptides 2 and 5 are observed, while peptide 1, for that strain, has less activity than the Omiganan peptide.
  • the CD spectra of the peptides in aqueous solution show that said peptides are unstructured in aqueous buffer, with a characteristic minimum at approximately 200 nm.
  • conformational changes occur in peptides 2 and 5, which are consistent with the formation of alpha-helix structures, with two characteristic minima, near 208 and 222 nm.
  • Peptide 1 also undergoes a similar transition, although the level of acquired structure is much lower than that observed in peptides 2 and 5.
  • the CD spectrum of peptide 3 is almost invariable with the addition of SDS micelles, indicative of the persistence of a messy conformation.
  • the design of the peptides was oriented to generate cationic, amphipathic alpha-type helices sequences. For this, multiple alignment computer tools, physicochemical properties simulators such as hydrophobicity or alpha helix content were used. All these computer programs (BLAST, CLUSTAL, AGADIR, ExPASY) are free to use and are available online.
  • Peptide synthesis was performed by automated SPPS (solid phase peptide synthesis) synthesis and subsequently analyzed by mass spectrometry and purified by reverse phase HPLC.
  • each peptide was amidated at the C-terminus.
  • the secondary structure content was studied by circular dichroism spectroscopy in the far UV, using a JASCO J 810 device (Jasco Corp., Tokyo, Japan) calibrated with (+) 10-camphorsulfonic acid. The measurements were made under a flow of nitrogen gas of 8 1 / h, at a temperature of 20 ° C, controlled with a Peltier type system (JASCO).
  • the spectra were recorded between 185 and 320 nm, using a 0.1 cm optical path cell.
  • the concentrations of the peptides were 40 ⁇ , dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 or in the same buffer with 10 mM sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • the sensitivity was 100 milligrams.
  • a scan speed of 50 nm / min, a response time of 1 s and a bandwidth of 1 nm were used. It has been made An average of five spectra for each sample. The average was corrected by buffer absorption and then by the baseline using zero average readings between 290 and 320 nm.
  • intermediate solutions of the non-amidated antimicrobial peptides (10x) were prepared by making successive dilutions 1: 2, 1: 4, and 1: 8 by dilutions to the medium. Then a part of the 10X antimicrobial peptide solution in nine parts of molten bacteriological agar was added. The appropriate antibiotic solution for each dilution was added to the molten agar and cooled to 45-50 ° C in a water bath. The agar-antibiotic mixture was then placed in petri dish until it reached a depth of 3-4 mm. The inoculum is prepared with a turbidity of
  • the antimicrobial activity was analyzed through the determination of the MIC (minimum inhibitory concentration) by the microdilution technique.
  • the technique was carried out in a standard manner according to (CLSI M07-A9 Vol. 32 No. 2. January 2012).
  • the peptide concentration range used was 0.5 ⁇ g / mL to 512 ⁇ g / mL in serial dilutions to the medium.
  • the medium used was MH Difco broth supplemented with cations, at a final concentration of 20-25 mg / L of Ca ++ and 10-12.5 mg / L of Mg ++.
  • the working inoculum used corresponds to a 1/100 dilution of a bacterial suspension equivalent to 0.5 of the Me Farland scale.
  • cytotoxic activity was performed by an erythrocyte hemolysis assay (according to Puré Appl. Chem., Vol. 79, No. 4, pp. 717-728, 2007). Briefly, from a volume of heparinized human whole blood, the volume of PBS is added 3 times and centrifuged 10 minutes at 1500 rpm, repeating the wash two more times. With that pe lie t 10% blood solutions were prepared in PBS. Subsequently, the corresponding peptide was added to each group at the indicated concentration and incubated at 37 ° C for 30 minutes. After incubation, centrifuge was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes each tube and the supernatant was read on a 600 nm spectrophotometer.
  • Staphylococcus aureus 11 isolates
  • Negative Staphylococcus Coagulase (12 isolates: 4 S. epidermidis, 2 S. saprophyticus, 2 S. haemolyticus, 2 S. hominis, 1 S. warnerii, 1 S. cohnii)
  • Gly Leu Leu Lys Lys Trp Leu Lys Lys Trp Lys Glu Phe Lys Arg lie 1 5 10 15

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Péptidos antimicrobianos tales como por ejemplo, los péptidos mostrados en las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4 o SEQ ID N° 5. Los péptidos tienen actividad contra bacterias gram positivas y contra bacterias gram negativas. Se provee además, una composición bactericida que puede comprender una cantidad entre 0,5 µg/m L y 1024 µg/m L de los péptidos; y excipientes.

Description

PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS, COMPOSICIONES QUE LOS COMPRENDE Y USOS
La presente invención se refiere a péptidos antimicrobianos tales como por ejemplo, los péptidos mostrados en las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4 o SEQ ID N° 5. Los péptidos tienen actividad contra bacterias gram positivas y contra bacterias gram negativas. Se provee además, una composición bactericida que comprende una cantidad entre 0,5 μg/mL y 1024 μg/mL de los péptidos; y excipientes.
Antecedentes de la invención
El tratamiento de heridas crónicas y úlceras es complejo y dificultoso y representa un desafío para el sistema de salud en su conjunto, con un fuerte impacto en la economía en general. En especial el problema de las infecciones recurrentes con cepas bacterianas resistentes a los tratamientos antimicrobianos.
A pesar que hoy en día se disponen de tratamientos efectivos para la mayoría de las infecciones, el abuso de los antibióticos, realizado durante décadas, ha conducido a la generación de cepas resistentes a los antimicrobianos de uso habitual a través de la transferencia horizontal de genes entre microorganismos patógenos.
Esta progresiva disminución en la eficacia de los antibióticos de primera elección y los limitados enfoques terapéuticos disponibles para el tratamiento y cicatrización de heridas, enfatizan la necesidad de nuevas clases de drogas y sus formas de aplicación.
Hoy en día existen algunos péptidos bactericidas. Cada péptido tiene diferentes características en cuanto a las concentraciones inhibitorias mínimas que se deben usar para logar la actividad bactericida deseada, además presentan diferencias en solubilidad, cito toxicidad, especificidad y blanco de acción a diferentes patógenos.
El documento de patente US 6696238 divulga polipéptidos y defensinas usados como antimicrobianos en la preparación de medios de cultivo.
Breve Descripción de la Invención Se proveen péptidos antimicrobianos, en una realización preferida los péptidos pueden los mostrados en las SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4 o SEQ ID N° 5. Los péptidos tienen actividad contra bacterias gram positivas y contra bacterias gram negativas.
Se provee una composición bactericida que comprende una cantidad entre 0,5 μg/mL y 1024 μg/mL de los péptidos mencionados en el párrafo anterior; y excipientes.
Se provee el uso de los péptidos 1 para preparar un medicamento contra infecciones bacterianas.
Descripción de las Figuras:
La figura 1 muestra los espectros de dicroísmo circular (CD) de los péptidos de la invención en una solución acuosa; donde se muestran que dichos péptidos se encuentran desestructurados en buffer acuoso, con un mínimo característico en aproximadamente 200 nm. Omi: péptido Omiganan, pl: Péptido 1; p2: péptido 2, p3: péptido 3, p4: péptido 4, p5: péptido 5.
La figura 2 muestra los espectros de dicroísmo circular (CD) de los péptidos de la invención en una solución con SDS, donde se observan los cambios conformacionales en los péptidos 1, 2 y 5, que son consistentes con la formación de estructuras alfa-hélice. Omi: péptido Omiganan, pl : Péptido 1; p2: péptido 2, p3: péptido 3, p4: péptido 4, p5: péptido 5.
Descripción Detallada de la Invención:
La característica fundamental de los péptidos de la invención es su secuencia y la disposición de los aminoácidos en la cadena peptídica que ha sido diseñada con el objetivo de mejorar la selectividad de acción sobre las cepas bacterianas, disminuyendo su posible acción citotóxica, algo muy común en estos tipos de péptidos.
Los péptidos aquí presentados tienen acción sobre bacterias gram positivas y gram negativas, incluyendo varios tipos de Staphilococcus y Pseudomonas. Los valores de CIM (concentración inhibitoria mínima) son en algunas cepas son especialmente interesantes. En la presente invención se describen nuevos péptidos sintéticos amidados en el extremo C terminal o no amidados, con actividad bactericida en cepas de relevancia clínica y resistentes a los antibióticos tradicionales. Estos péptidos pueden ser incorporados en un vehículo adecuado para su aplicación, por ejemplo, en forma tópica, lo cual brindará un solución acertada al problema de las heridas superficiales con alto riesgo de infecciones. Además son un producto de fácil aplicación y amplio espectro bactericida, que soluciona el creciente problema de las cepas bacterianas multirresistentes.
Se han sintetizado 5 péptidos que tienen actividad antibacteriana, en una realización preferida los péptidos fueron los siguientes:
péptido 1: WPKWWKWKRRWGRKKAKKRRG (SEQ ID N° 1)
péptido 2: GLLKKWLKKWKEFKRIVGY (SEQ ID N° 2)
péptido 3: FGKEKKAWWRRRKWLK (SEQ ID N° 3)
péptido 4: TTCDLLSGVGLPNVPQPLHCVFRGNRKIKW (SEQ ID N° 4) péptido 5: RIVQRIKKWLLKWKKLGY (SEQ ID N° 5)
péptido conocido (Omiganan): ILRWPWWPWRRK (SEQ ID N° 6)
Los 5 péptidos diseñados y sintetizados de la invención, más omiganan (péptido del estado de la técnica) fueron evaluados en su capacidad antimicrobiana en ensayos de microdilución para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM). En estos ensayos se analizó un primer panel de 8 cepas representativas, que abarcan bacterias gram positivas y gram negativas. En la tabla 1 se observan los resultados de CIM obtenidos, expresados en μg/ml de cada péptido. Los valores de CIM más bajos indican una mayor potencia antimicrobiana.
Tabla 1.
Figure imgf000006_0001
Posteriormente se evaluó la capacidad de los péptidos de la invención para lisar eritrocitos humos, como medida de citotoxicidad (tabla 2). Los ensayos se realizaron de acuerdo a los ejemplos y se expresan como un porcentaje de la lisis total obtenida con agua o con el detergente Tween20. En estos estudios, a menor porcentaje de hemolisis, se supone menor su actividad citotóxica.
Tabla 2.
Figure imgf000006_0002
Se puede observar que los péptidos 1, 2 y 5 poseen mayores valores de potencia antimicrobiana. Los valores de hemolisis son menores o similares al péptido Omiganan. Aunque el péptido 2 posee altos valores de hemolisis, se decide continuar con su análisis ya que en un posible uso tópico estos valores no necesariamente serían un impedimento. En una realización preferida se seleccionan los péptidos 1 y 5 que poseen los mayores valores de índice terapéutico, entendido como el valor que indica la potencia antimicrobiana sobre el porcentaje de citotoxicidad.
Posteriormente, se procedió al análisis de un panel de aislamientos clínicos que incluían cepas con diferentes mecanismos de resistencia a antibióticos convencionales, todas ellas de importancia clínica. En las tablas 3 y 4 se muestran los resultados obtenidos al analizar la CIM de los péptidos seleccionados 1, 2 y 5 más el péptido control Omiganan. En la tabla 3 se muestran los resultados para un panel de bacterias gram negativas y en la tabla 4 un panel de bacterias gram positivas. En estas tablas se incluye el o los genes detectados responsables de la resistencia a antibióticos para cada cepa.
En estos estudios podemos ver que, frente a Pseudomona aeuruginosa el péptido 5 es hasta ocho veces más activo que el péptido conocido Omiganan. Algo similar se observa frente a Klebsiella pneumoniae, donde se observan grandes mejoras de potencia de los péptidos 2 y 5, mientras que el péptido 1, para esa cepa, tiene menor actividad que el péptido Omiganan.
Tabla 3 y 4:
CIM (ug/ml)
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Para evaluar la estructura que adquieren los péptidos en solución acuosa y en presencia de un detergente como SDS, se le realizó un estudio de dicroísmo circular (CD). De esta manera se pudo correlacionar las diferencias entre la estructura adquirida por los péptidos y su actividad biológica.
Los espectros de CD de los péptidos en solución acuosa, muestran que dichos péptidos se encuentran desestructurados en buffer acuoso, con un mínimo característico en aproximadamente 200 nm. Con el agregado de micelas de SDS, se producen cambios conformacionales en los péptidos 2 y 5, que son consistentes con la formación de estructuras alfa-hélice, con dos mínimos característicos, cerca de 208 y 222 nm. El péptido 1 también experimenta una transición semejante, aunque el nivel de estructura adquirido es muy inferior al observado en los péptidos 2 y 5. El espectro de CD del péptido 3 es casi invariable con el agregado de micelas de SDS, indicativo de la persistencia de una conformación desordenada. En el caso de omiganan, el espectro se modifica significativamente en presencia de SDS, atenuándose la banda de 200 nm, y con la aparición de una nueva banda cerca de 230 nm, la cual puede ser resultado de la interacción entre las cadenas laterales de triptófano (Figuras 1 y 2). Estos resultados experimentales coinciden con los parámetros teóricos obtenidos por análisis computacional.
Los parámetros físico químicos de los péptidos analizados en forma teórica para cada secuencia se resumen en la tabla 5.
Tabla 5.
Figure imgf000010_0001
* Escala Wimley-White Kcal mol -1 ** Según algoritmo AGADIR
Cuando se estudiaron los péptidos de la invención sin amidar se obtuvieron los resultados que se muestran en la Tabla 6
Tabla 6:
Figure imgf000011_0001
Para las concentraciones estudiadas: el péptido 1 posee actividad contra S. warnerii y S. cohnii; el péptido 2 posee actividad contra S. warnerii , S. cohnii, E.coli y K. pneumoniae, el péptido 3 posee actividad contra S. warnerii y S. cohnii, el péptido 4 no posee actividad contra ninguna de las cepas estudiadas y el péptido 5 posee actividad contra S. warnerii, S. cohnii y E.coli
Esta invención se encuentra mejor ilustrada según los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser interpretados como una limitación impuesta al alcance de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de la misma que luego de leerse la presente descripción, puede sugerir a aquellos entendidos en el tema sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o alcance de las reivindicaciones anexas. Ejemplos:
El diseño de los péptidos se orientó a generar secuencias catiónicas, anfipáticas de tipo alfa hélices. Para esto se utilizaron herramientas informáticas de alineamientos múltiples, simuladores de propiedades fisicoquímicas como la hidrofobicidad o el contenido de alfa hélice. Todos estos programas informáticos (BLAST, CLUSTAL, AGADIR, ExPASY) son de uso libre y están disponibles a través de internet.
En este análisis se establecieron secuencias y aminoácidos en posiciones específicas consenso, en los casos que hubiera, o motivos semi conservados en algunos péptidos conocidos. Tomando en consideración estos diversos parámetros se diseñaron in silico 5 péptidos de entre 18 y 30 aminoácidos (SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 y 5)
Síntesis y Purificación
La síntesis de los péptidos se realizó mediante síntesis automatizada SPPS (solid phase peptide synthesis) y posteriormente se analizó por espectrometría de masa y se purificaron por HPLC de fase reversa.
También cada péptido fue amidado en el extremo C terminal.
Análisis de dicroísmo circular
Dicroísmo circular en el UV lejano
Se estudió el contenido de estructura secundaria por espectroscopia de dicroísmo circular en el UV lejano, empleando un equipo JASCO J 810 (Jasco Corp., Tokio, Japón) calibrado con ácido (+) 10-canforsulfónico. Las mediciones se realizaron bajo un flujo de nitrógeno gaseoso de 8 1/h, a una temperatura de 20 °C, controlada con un sistema tipo Peltier (JASCO).
Se registraron los espectros entre 185 y 320 nm, utilizando una celda de 0, 1 cm de paso óptico. Las concentraciones de los péptidos fueron de 40 μΜ, disueltos en buffer fosfato de sodio 10 mM pH 7,0 o en el mismo buffer con dodecil sulfato de sodio (SDS) 10 mM. La sensibilidad fue de 100 miligrados. Se usó una velocidad de barrido de 50 nm/min, un tiempo de respuesta de 1 s y un ancho de banda de 1 nm. Se realizó un promedio de cinco espectros para cada muestra. El promedio fue corregido por absorción del buffer y luego por la línea de base utilizando como cero el promedio de lecturas entre 290 y 320 nm. Finalmente, los datos fueron suavizados mediante un polinomio de Savizky Golay de cuarto grado, con una ventana de diez puntos. Los espectros se convirtieron a elipticidad molar media por residuo usando la relación: {&} = 8/(10 X c X n X d) donde [θ\ es la elipticidad molar (en gradosxcm2xdmol"1), Θ es la elipticidad en miligrados, n el número de residuos del péptido y c su concentración molar, d la longitud de la celda en centímetros.
Ensayo in vitro de la sensibilidad de bacterias que crecen aeróbicamente utilizando el método de difusión por discos se realizó de acuerdo a las normas que se encuentran en el documento M2 de la CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute: Perfomance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests.) empleando los péptidos sin amidar
Brevemente se prepararon soluciones intermedias de los péptidos antimicrobianos sin amidar (lOx) haciendo diluciones sucesivas 1 :2, 1:4, y 1 :8 mediante diluciones al medio. Luego se adicionó una parte de la solución del péptido antimicrobiano 10X en nueve partes de agar bacteriológico fundido. Se agregó la solución de antibiótico apropiada para cada dilución, en el agar fundido y enfriado a 45 - 50°C en baño de agua. Luego se colocó la mezcla agar-antibiótico en placa de petri hasta alcanzar una profundidad de 3-4 mm. El inoculo se prepara con una turbidez de
0,5 de la escala de McFarland (aproximadamente 1-2 10^ UFC/ml). El inoculo final requerido para la prueba de dilución en agar es de 10^ unidades formadoras de colonias (UFC) por "spot" de 5 - 8 mm de diámetro. Las placas inoculadas se deben incubar invertidas a 35°C por el término 16 - 20 hs. La CIM se registró como el valor de la menor dilución que inhibe completamente el desarrollo bacteriano, sin considerar el desarrollo de una simple colonia o una tenue película causada por el depósito del inoculo. El punto final en estos casos corresponderá a la concentración en la que haya más del 80% de reducción del crecimiento comparando con el control. Análisis de actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana se analizó a través de la determinación de la CIM (concentración inhibitoria mínima) por la técnica de microdilución. La técnica se llevo a cabo de manera estándar según (CLSI M07-A9 Vol. 32 N° 2. January 2012). El rango de concentración de péptidos usado fue de 0,5 μg/mL a 512 μg/mL en diluciones seriadas al medio. El medio utilizado fue caldo MH Difco suplementado con cationes, a una concentración final de 20-25 mg/L de Ca++ y 10-12,5 mg/L de Mg++. El inoculo de trabajo usado corresponde a una dilución 1/100 de una suspensión bacteriana equivalente al 0,5 de la escala de Me Farland.
Análisis de actividad hemolítica
La evaluación de actividad citotóxica se realizó mediante un ensayo de hemolisis de eritrocitos (según Puré Appl. Chem., Vol. 79, No. 4, pp. 717-728, 2007). Brevemente, a partir de un volumen de sangre entera humana heparinizada, se agrega 3 veces el volumen de PBS y se centrifuga 10 minutos a 1500 rpm, repitiendo el lavado dos veces más. Con ese pe lie t se prepararon soluciones de sangre 10% en PBS. Posteriormente se agregó a cada grupo el péptido correspondiente en la concentración indicada y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Transcurrido la incubación se centrifugó a 10000 rpm por 5 minutos cada tubo y el sobrenadante se leyó en un espectrofotómetro a 600 nm.
Cepas bacterianas
Se estudiaron 78 aislamientos previamente caracterizados en el Laboratorio Nacional de Referencia INEI-ANLIS del Instituto Carlos Malbran, con diferentes mecanismos de resistencia a antibióticos.
Se analizaron 40 cepas Gram-positivas, 37 aislamientos INEI-ANLIS más tres cepas de referencia ATCC :
• Staphylococcus aureus (11 aislamientos) • Staphylococcus Coagulasa Negativo (12 aislamientos: 4 S. epidermidis, 2 S. saprophyticus, 2 S. haemolyticus , 2 S. hominis, 1 S. warnerii, 1 S. cohnii )
• Enterococcus spp. (17 aislamientos: 6 E. faecium, 8 E. faecalis, 2 E. gallinarum, 1 E. raffinosus
Los mecanismos de resistencia para este grupo, como se puede ver en la tabla 4 fueron:
WT, vanA, vanB, vanC, mecA, ermA, ermC, msrA, InuA
Se analizaron 43 cepas Gram-negativas, 41 aislamientos INEI-ANLIS más tres cepas de referencia ATCC:
• Pseudomonas aeruginosa (12 aislamientos)
• Acinetobacter sp. (10 aislamientos: 9 A. baumanii, 1 A. junii)
• Klebsiella pneumoniae (12 aislamientos)
• Escherichia coli (9 aislamientos)
Los mecanismos de resistencia para este grupo, como se puede ver en la tabla 4 fueron: (tem-1, cmy, cit, shv-1, ctx-m-2, per-2, ges-1/3, veb-1, oxa-9, oxa-23, oxa-58, vim-11, imp-1/13/16, spm-1, kpc-2).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Conicet
<120> Péptidos antimicrobianos
<130> Péptidos antimicrobianos
<160> 6
<170> Patentln versión 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> péptido 1
<400> 1
Trp Pro Lys Trp Trp Lys Trp Lys Arg Arg Trp Gly Arg Lys Lys Ala 1 5 10 15
Lys Lys Arg Arg Gly
20
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> péptido 2
<400> 2
Gly Leu Leu Lys Lys Trp Leu Lys Lys Trp Lys Glu Phe Lys Arg lie 1 5 10 15
Val Gly Tyr
<210>
<211> <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> péptido 3
<400> 3
Phe Gly Lys Glu Lys Lys Ala Trp Trp Arg Arg Arg Lys Trp Leu Lys 1 5 10 15
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> péptido 4
<400> 4
Thr Thr Cys Asp Leu Leu Ser Gly Val Gly Leu Pro Asn Val Pro Gln 1 5 10 15
Pro Leu His Cys Val Phe Arg Gly Asn Arg Lys lie Lys Trp
20 25 30
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> péptido 5
<400> 5
Arg lie Val Gln Arg lie Lys Lys Trp Leu Leu Lys Trp Lys Lys Leu 1 5 10 15
Gly Tyr
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Omiganan
<400> 6
lie Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys 1 5 10

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido antimicrobiano, caracterizados porque comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4 y SEQ ID N° 5.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene actividad contra bacterias gram positivas.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene actividad contra bacterias gram negativas.
4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque las bacterias son seleccionadas del grupo comprendido por Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus , Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warnerii, Staphylococcus cohnii, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus gallinarum y Enterococcus raffinosus.
5. El péptido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque las bacterias son seleccionadas del grupo comprendido por Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junii, Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli.
6. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque está amidado en su extremo C terminal.
7. Una composición bactericida, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de al menos un péptido de la reivindicación 1; y excipientes.
8. La composición bactericida de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende una cantidad entre 0,5 μg/mL y 1024 μg/mL del péptidos.
9. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque el péptido está aminado en su extremo C terminal
10. El uso del péptido de la reivindicación 1 para preparar un medicamento contra infecciones bacterianas.
PCT/IB2013/061346 2012-12-28 2013-12-26 Péptidos antimicrobianos, composiciones que los comprende y usos WO2014106798A2 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MX2015008373A MX360559B (es) 2012-12-28 2013-12-26 Péptidos antimicrobianos, composiciones que los comprende y usos.
US14/655,885 US9359409B2 (en) 2012-12-28 2013-12-26 Antimicrobial peptides, compositions comprising the same and uses thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ARP20120105083 2012-12-28
ARP120105083A AR089615A1 (es) 2012-12-28 2012-12-28 Peptidos antimicrobianos, composiciones que los comprenden y usos

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2014106798A2 true WO2014106798A2 (es) 2014-07-10
WO2014106798A3 WO2014106798A3 (es) 2015-12-30

Family

ID=51062518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/IB2013/061346 WO2014106798A2 (es) 2012-12-28 2013-12-26 Péptidos antimicrobianos, composiciones que los comprende y usos

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9359409B2 (es)
AR (1) AR089615A1 (es)
MX (1) MX360559B (es)
WO (1) WO2014106798A2 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018086516A1 (zh) * 2016-11-09 2018-05-17 湖南科技学院 一种抑制耐药性细菌的抗菌肽及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3638371A2 (en) 2017-06-13 2020-04-22 Rijksuniversiteit Groningen Antimicrobial peptides and admixtures thereof showing antimicrobial activity against gram-negative pathogens
WO2023063909A1 (en) * 2021-10-11 2023-04-20 Yildiz Teknik Universitesi Nanoformulations that include antimicrobial agent(s), targeted by peptide 6.2

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6632616B2 (en) * 2000-03-16 2003-10-14 Duke University Compounds that selectively bind to expanded polyglutamine repeat domains and methods of use thereof
AU2001279073B2 (en) 2000-07-28 2006-08-24 Christopher J. Murphy Transplant media
FR2841556B1 (fr) * 2002-07-01 2007-07-20 Centre Nat Rech Scient Peptides ayant des proprietes antimicrobiennes et les compositions les contenant notamment pour la conservation des aliments

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018086516A1 (zh) * 2016-11-09 2018-05-17 湖南科技学院 一种抑制耐药性细菌的抗菌肽及其应用
US10603350B2 (en) 2016-11-09 2020-03-31 Hunan University Of Science And Engineering Antimicobial peptides for inhibiting drug-resistant bacteria and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US9359409B2 (en) 2016-06-07
MX360559B (es) 2018-11-07
WO2014106798A3 (es) 2015-12-30
US20150344527A1 (en) 2015-12-03
AR089615A1 (es) 2014-09-03
MX2015008373A (es) 2016-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Romanelli et al. Peptides from Royal Jelly: studies on the antimicrobial activity of jelleins, jelleins analogs and synergy with temporins
Giacometti et al. Comparative activities of cecropin A, melittin, and cecropin A–melittin peptide CA (1–7) M (2–9) NH2 against multidrug-resistant nosocomial isolates of Acinetobacter baumannii
Cao et al. StCT2, a new antibacterial peptide characterized from the venom of the scorpion Scorpiops tibetanus
ES2683392T3 (es) Péptidos catiónicos cíclicos con actividad antimicrobiana
KR102499670B1 (ko) 라이신 치환을 포함하는 Romo1 유래 항균 펩타이드 및 그 변이체
BR112017023707B1 (pt) Composição, uso de uma composição, vetor recombinante, microrganismo transgênico, e polipeptídeo recombinante
AU2015279705B2 (en) Acinetobacter lysins
EP3434287B1 (en) Short and ultra-short antimicrobial lipopeptides and use thereof
CN111087460B (zh) 一种广谱型抗菌肽及其应用
Jeong et al. Antibiotic and synergistic effect of Leu–Lys rich peptide against antibiotic resistant microorganisms isolated from patients with cholelithiasis
KR20210007075A (ko) 해삼에서 분리한 항균 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도
KR100964136B1 (ko) 울도하늘소유충으로부터 분리한 항균 및 항진균 펩타이드 유전자 및 항균 및 항진균 활성을 가지는 합성 펩타이드
CN112341522B (zh) 一种抗菌肽及其应用
WO2018138102A1 (en) Therapeutic combinations for the treatment of bacterial infections
WO2014106798A2 (es) Péptidos antimicrobianos, composiciones que los comprende y usos
ES2475765T3 (es) P�ptido antimicrobiano, formas ramificadas del mismo y su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas
CN112625108A (zh) 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm5及其制备方法和应用
WO2018175410A1 (en) Antimicrobial peptides and methods of treating gram-negative pathogens
EP3911668A1 (en) Amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides treat infections by gram-negative pathogens
CN115043924B (zh) 一种改造体抗菌肽及其应用
CN113999297A (zh) 一种抗菌肽hrNCM及其制备方法与应用
Chockalingam et al. A peptide derived from human bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) exerts bactericidal activity against Gram-negative bacterial isolates obtained from clinical cases of bovine mastitis
WO2017093210A1 (en) Peptidic compounds useful as antibacterial agents
Goncharov et al. Assessing Serratia spp. pathogenic potential from cryogenic habitats
RU2771493C1 (ru) Пептид, обладающий антибактериальной активностью в отношении микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13870277

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2015/008373

Country of ref document: MX

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14655885

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112015015505

Country of ref document: BR

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13870277

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112015015505

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20150626