WO2014094546A1

WO2014094546A1 - 一种融合蛋白的应用

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Publication number: WO2014094546A1
Application number: PCT/CN2013/088671
Authority: WO
Inventors: 刘昌胜; 刑万里; 王靖; 钱江潮; 梁婧
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2014-06-26
Anticipated expiration: 2015-06-18
Also published as: US20150337025A1; CN102973922B; US9593151B2; CN102973922A

Abstract

一种融合蛋白的应用，用于刺激骨髓间充质干细胞向造血干/祖细胞分化的药物；或粒系造血祖细胞增殖的药物，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO：2或 SEQ ID NO： 4所示。且所述药物可以用于预防和/或治疗(i) 化疗引起的造血功能低下；(ii) 放疗引起的造血功能低下；或(iii) 白细胞减少症。

Description

一种融合蛋白的应用技术领域

本发明涉及融合蛋白的应用，特别涉及融合蛋白在促进粒系造血祖细胞增殖方面的应用。背景技术

血液具有运输物质、维持组织的兴奋性、调节机能、防御作用等功能，是构成人体和维持人类生命活动的基本物质之一，所以一旦血液的组成成分发生异常变化，就会引起严重的后果。引起血液病的因素很多，诸如：化学因素、物理因素、生物因素等，都可以成为血液病发病的诱因或直接原因，其中很多是近几十年现代工业的产物，从而使血液病的发病率有逐年增高的趋势。

骨髓抑制型贫血是较为常见的一类因化学、物理、生物因素及不明原因所致骨髓造血组织减少，引起造血功能衰竭而发生的贫血。骨髓抑制可引起骨髓微环境、造血干细胞、造血细胞生长因子等的损伤，粒、巨核系细胞系统也会受到抑制，粒细胞缺乏会引起严重感染。

目前放、化疗仍然是肿瘤治疗中最常用的手段，但大多数患者治疗后会产生恶心、呕吐等不良反应，其中最常见而且最为严重的不良反应就是骨髓抑制，不但致使机体造血功能下降，免疫力降低，使得化疗不能按正常剂量进行从而影响治疗的连续性，还可引起白细胞和血小板的减少，患者易并发感染和出血，甚至死亡。尽快促进患者造血功能的恢复成为提高肿瘤治愈率，降低感染发生率，提高患者生存质量的关键。

目前临床上主要用粒系集落刺激因子（G-CSF )、粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF )等集落刺激因子来促进造血功能的恢复。它们直接刺激粒系造血祖细胞的增殖，缩短白细胞和中性粒细胞的恢复时间，疗效快。但是由于 CSF 是直接刺激无自我更新能力的造血祖细胞的增殖，导致造血祖细胞的耗竭，不利于长期的造血功能的恢复，甚至导致骨髓储备不足；另外，一些肿瘤细胞，如白血病细胞具有 CSF的正常受体，用药后可能通过提高宿主残余肿瘤细胞的增殖，提高肿瘤的复发率。同时，由于其作用稳定性差，往往导致外周血及骨髓象中充满大量幼稚白细胞，使白细胞计数呈现成倍增长、成倍下降的现象，患者为维持正常疗程不得不反复用药。因此，临床上需要开发出能有效促进造血细胞增殖而对肿瘤细胞无刺激增殖作用的药物。发明内容

本发明的目的是提供一种促进粒系造血祖细胞增殖的融合蛋白的应用。

本发明的另一目的是提供一种用于促进以粒细胞为主的造血细胞增殖的药物组合物。

本发明的再一目的是提供一种能够在体外促进粒系细胞生长的方法。本发明的第一方面，提供一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示，所述融合蛋白用于制备 (i) 刺激骨髓间充质干细胞向造血干 /祖细胞分化的药物；或

(ii) 促进粒系造血祖细胞增殖的药物。

在另一优选例中，所述药物用于：

(1) 预防和 /或治疗化疗引起的造血功能低下；

(2) 预防和 /或治疗放疗引起的造血功能低下；或

(3) 预防和 /或治疗白细胞减少症。

在另一优选例中，所述药物在放疗或化疗之前、之中、和 /或之后使用。本发明的第二方面，提供一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示，所述融合蛋白用于促进粒系造血祖细胞的增殖。

在另一优选例中，所述融合蛋白用于体外促进粒系造血祖细胞的增殖。本发明的第三方面，提供一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示，所述融合蛋白用于制备预防和 /或治疗白细胞减少症的药物。本发明的第四方面，提供一种体外促进粒系祖细胞增殖的方法，在粒系祖细胞的培养基添加 100 ng/mL〜5 g/mL的融合蛋白，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示。

其中，所述粒系祖细胞为粒系造血祖细胞。本发明的第五方面，提供一种药物组合物，包含：

融合蛋白，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示；以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物是无毒的，并且剂型稳定。

在另一优选例中，所述药物组合物在放疗或化疗之前、之中、和 /或之后使用。在另一优选例中，所述药物组合物还包括环磷酰胺。本发明的第六方面，提供第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备促进粒系造血祖细胞增殖的药物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

图 1为各组小鼠不同时间白细胞数（WBC) 数的变化图。

图 2显示化疗用药后第 10天各组的骨髓有核细胞数。

图 3显示化疗用药后第 10天各组的脾系数。

图 4显示化疗用药后第 10天各组的细胞集落数。

图 5显示化疗用药后第 10天各组的骨髓有核细胞数中 CD34比例。

图 6显示化疗用药后第 10天各组的骨髓有核细胞数中 CD45比例。具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现本发明所用的融合蛋白具有促进粒系造血祖细胞增殖的作用，不仅能够有效预防而且能够有效治疗放疗、化疗等引起的造血功能下降及白细胞的减少。在此基础上，完成了本发明。融合蛋白

本发明所用的融合蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示。蛋白单链分子量约 13-15 kD，经复性后该活性蛋白为二聚体，分子量约为 25-30 kD。本发明所用的融合蛋白，具有良好的活性和稳定性，并提高其表达，促进蛋白复性时正确折叠，延长生物半衰期，增加其在体内的使用效果，且易复性、易分离、活性高及适宜产业化生产和应用。融合蛋白的应用

本发明的融合蛋白（氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示）的用途，能够用于制备 (i) 刺激骨髓间充质干细胞向造血干 /祖细胞分化的药物；或

(ii) 促进粒系造血祖细胞增殖的药物。所述药物用于：

(1) 预防和 /或治疗化疗引起的造血功能低下；

(2) 预防和 /或治疗放疗引起的造血功能低下；或

(3) 预防和 /或治疗白细胞减少症。

在另一优选例中，所述药物用于预防和 /或治疗白细胞减少症。

所述药物在放疗或化疗之前、之中、和 /或之后使用。

实验研究显示，本发明的融合蛋白能促进化疗药物 /放疗导致的造血功能低下的恢复。

该融合蛋白对化疗引起的造血损伤有有效的治疗作用。融合蛋白的促造血作用，主要是作用于骨髓基质细胞，改善造血微环境，从而影响造血干 /祖细胞的增殖和分化。骨髓有核细胞数、骨髓粒系集落的检测是最直接反映骨髓增生的证据。 CD34细胞和 CD45细胞检测则是最直接反映造血干 /祖细胞增殖和分化的证据。

经腹腔注射本发明的融合蛋白后，能促进注射化疗药物环磷酰胺造成的小鼠骨髓有核细胞数和外周血白细胞数的恢复，并且与环磷酰胺对照组相比差别显著，表明本发明的融合蛋白以促进粒系造血为主。因此，本发明的融合蛋白可认为是一种有效的促造血因子，在促进粒细胞造血方面具有临床应用前景。

此外，造血微环境是恢复正常造血的先决条件之一，本发明的融合蛋白在体内通过刺激骨髓间充质干细胞增殖，改善造血微环境，促进自然发生或诱发的骨髓抑制或损伤的造血功能恢复，并能刺激骨髓移植后的造血重建。

本发明为造血功能低下、白细胞减少症等提供了一种有效的预防 /治疗的药物。药物组合物

本发明的药物组合物包括本发明的融合蛋白。

本发明所述的药物组合物具有提高造血干 /祖细胞的增殖活性、促进造血功能恢复的功能，可用于治疗放、化疗引起或自然发生的骨髓损伤造成的造血功能低下。

与目前临床上普遍使用的重组人粒系集落刺激因子 rhG-CSF和 rhGM-CSF 相比较，本发明的融合蛋白促增殖作用温和，加快外周血细胞恢复，因而有临床应用的广泛前景。另外融合蛋白不易造成免疫原性。

可按制药领域已知的常规方法，将本发明的融合蛋白或药物组合物制成适合临床上特定给药方式的药物。例如可在本发明的融合蛋白或药物组合物中加入适当的载体或稀释剂，如水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液以制成可经肠胃道以外途径给药的注射剂。也可加入淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、脂质体、明胶、甘露醇等赋形剂或载体。

本发明的融合蛋白或药物组合物可通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射等常规途径给药。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例 1

融合蛋白的制备

1. 重组载体的构建

用全基因合成方式合成 DNA 序列 (SEQ ID ΝΟ:1)。通过酶切后将其插入载体 pBV220中。得到优化的表达质粒，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。

2. 工程菌的构建、验证和保存：

采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用步骤 2 所得的表达质粒进行转化大肠杆菌 JM109, 在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的 LB培养液的摇瓶中，在 30°C的条件下以 180 rpm的转速在气浴振荡器中培养 15小时，在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到 15%的浓度，分装后在 -80°C冰箱保存。

3. 工程菌的培养：

从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的 LB培养液的摇瓶中， LB培养基为 10 g/L胰蛋白胨， 5 g/L酵母浸出粉， 5 g/L NaCl _; 氨苄青霉素含量为 100 g/mL; 在 30 °C的条件下以 180 rpm的转速在摇床中培养 8 小时，再按体积比为 1 : 10 的比例将培养物接种到 LB 培养基中， pH 7.0±0.2，培养温度为 30°C，搅拌速度 180 rpm，培养 4小时。然后，升温至 42 °C进行诱导，继续培养 6小时，培养结束后，在 7500 rpm 4±2°C条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在 15 KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

4. 包涵体的提取和洗涤

将步骤 4收集的菌体，与 TE溶液，按 lg: 10 mL的比例混合，再按 lg: 1 mg 的比例，与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在 10000 rpm离心，收集沉淀，以 lg沉淀物： 20 mL洗涤液的比例加入 1 M尿素水溶液洗涤，搅拌 2h后， 4±2°C离心收集沉淀物，再用 0.5%曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以 l g沉淀物： 20 mlTris的比例，加入 10 mM的 Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

5. 包涵体的裂解、复性

以 lg包涵体： 10 mL裂解液的比例加入裂解液，裂解液为 6 M Gu-HCl、 20 mM PBS, 10 mM DTT。在 4±2°C下，搅拌裂解 8小时，离心，离心转速 10000 rpm，离心温度为 4±2°C，离心时间为 30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为 0.1 mg/mL，复性 10天，复性液为 20 mM Na₂HPO₄'12H₂O、 1.5 mM NaH₂PO₄-2H₂O, 140 mM NaCK 5 mM EDTA、 I mM谷胱甘肽等。

6. 蛋白纯化

采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的融合蛋白二倍体。后在 -30〜7°C下冻干，得到融合蛋白，序列如 SEQ ID NO:2所示。

经非还原电泳 SDS-PAGE检测产品纯度超过 95%，分子量约为 30 KD; HPLC 鉴定其纯度超过 95%。经测定， N末端与 C末端测定均与理论值一致。

每批培养物的得率为 7.02 mg/L融合蛋白。实施例 2

融合蛋白在化疗损伤模型中的促进造血作用

2.1 本实施例的目的是观察融合蛋白对化疗引起的白细胞减少症的治疗作用，为治疗肿瘤患者化疗后骨髓损伤造血功能低下寻找安全有效的药物。其中，本实施例中使用实施例 1制备的融合蛋白，序列如 SEQ ID NO:2所示。

本实施例采用清洁级 BALB/c小鼠，雄性，体重 18〜20 g，随机分组，每组

10只。小鼠共分为五组，如下：

CTX组：单独给予环磷酰胺（CTX) , 剂量为 100 mg/kg体重 /天，注射体积为 100 μΐ^, 连续给药 3天；第 4天起每天注射 100 磷酸缓冲溶液 (PBS), 连续注射 6天；

50μ_δ组：在连续 3天给予环磷酰胺（100 mg/kg体重 /天，注射体积为 100 μL 后，连续 6天给予融合蛋白，剂量为 50 μ_§/鼠 /天，注射体积为 lOO L;

25 μ_δ组：在连续 3天给予环磷酰胺（ 100 mg/kg体重 /天，注射体积为 100 μL 后，连续 6天给予融合蛋白，剂量为 25 μ_§/鼠 /天，注射体积为 100 L;

10μ_δ组：在连续 3天给予环磷酰胺（ 100 mg/kg体重 /天，注射体积为 100 μL 后，连续 6天给予融合蛋白，剂量为 10 μ_§/鼠 /天，注射体积为 100 L。

正常组：每天注射 100 磷酸缓冲溶液 (PBS), 连续注射 9天；

检测指标如下：

(1) 各组分别于第 1 天（未给药时），第 2-10 天，连续检测外周血白细胞

(WBC) 数。步骤如下：用毛细管在小鼠右眼眼睚取血，每次取 5(^L，放在含有抗凝剂的试管中，然后用血细胞分析仪采用全血模式测试血液中白细胞数。

(2) 第 10 天检测各组小鼠骨髓有核细胞数（BMNC)。步骤如下：无菌环境下处死小鼠，在 75%的酒精浸泡 5 min。剥开小鼠大腿的肌肉，取出股骨，用剪刀把股骨两端剪断，用 5 mL 的注射器吸取 PBS, 从股骨一端冲洗，然后用 400 目的无菌纱布过滤冲洗液，过滤后调整细胞浓度，然后用计数板在显微镜下计数。

(3) 第 10天检测各组小鼠胸骨和股骨骨髓中粒系细胞的变化，步骤如下：处死小鼠，取出股骨和胸骨，在 10%的甲醛溶液中浸泡 48h 后，做 HE染色的石蜡切片，然后在显微镜下观察粒系细胞的变化。

(4) 第 10天检测各组小鼠脾系数的变化，步骤如下：处死小鼠前，先测量每只小鼠的体重。处死后，取出脾脏称重，脾重与体重的比值即为脾系数。

(5) 第 10天检测各组小鼠骨髓细胞中 CD34⁺细胞比例的变化；

步骤：按检测指标（2) 的方法取出骨髓细胞，调整细胞浓度为 5X10⁶个 /mL，用抗体稀释液洗涤，离心弃上清液，加 10μΙ ¾34抗体， 4°C孵化半小时，加抗体稀释液洗去多余的抗体，离心弃上清液，加抗体保存液调整细胞浓度为 1X10⁶ 个 /mL，采用流式细胞仪检测。

(6) 第 10天检测各组小鼠骨髓细胞中 CD45⁺细胞比例的变化；

步骤：按检测指标（2)的方法取出骨髓细胞，调整细胞浓度为 5X10⁶个 /mL。用抗体稀释液洗涤，离心弃上清液，加 10μΙ ¾45抗体， 4°C孵化半小时，加抗体稀释液洗去多余的抗体，离心弃上清液，加抗体保存液调整细胞浓度为 1 X10⁶个 /mL，采用流式细胞仪检测。

(7) 第 11天检测 CFU-GM集落数的变化步骤：在无菌环境下处死小鼠，在 75%的酒精浸泡 5 min。剥开小鼠大腿的肌肉，取出股骨，用剪刀把股骨两端剪断，用注射器吸取 5mL PBS , 从股骨一端冲洗，然后用 400 目的无菌纱布过滤冲洗液，过滤后的液体调整浓度为 I X 10⁵/mL。在无菌环境下，离心 lmL冲洗液，加入 100 的 DMEM培基，吹打均匀成细胞悬浮液。取一个细胞冻存瓶，里面加入 lmL甲基纤维素培养基，再加入 10 μL细胞悬浮液，用移液枪吹打均匀。在 24孔细胞培养板中每孔加入 500 均匀混合的含细胞的甲基纤维素培基。然后放到恒温培养箱中培养两周，显微镜下数 CFU-GM集落的个数（50个细胞以上为一个集落）。 2.2 本实施例研究融合蛋白对化疗损伤的预防治疗作用，其中使用实施例 1 制备的融合蛋白。

实验分组如下：

CTX组：连续注射 6天 PBS , 注射体积为 lOO L, 然后再注射 3天 CTX, 剂量为 100 mg/kg体重 /天，注射体积为 100 μ^,

联合用药组：先连续 6天腹腔注射融合蛋白，剂量为 50 μ_§/鼠 /天，注射体积为 lOO L, 随后再连续注射 3天环磷酰胺，剂量为 100 mg/kg体重 /天，注射体积为 100 μ^,

对照组：每天注射 lOO L PBS溶液，连续注射 9天。

各组小鼠于第 10天处死。

检测指标：

各组小鼠与第 1天，第 8天，第 10天检测外周血白细胞数，方法同实施例

2.1。

2.3 本实施例研究融合蛋白与化疗药联合使用时对化疗引起的白细胞损伤的促恢复作用，其中使用实施例 1制备的融合蛋白。实验分组如下：

CTX组：连续 3天注射 CTX,剂量为 100 mg/kg体重 /天，注射体积为 100 μL_a 然后再连续 3天注射与 CTX等体积的 PBS溶液；

联合用药组：从第 1天起同时给予融合蛋白（剂量为 50 μ_§/鼠 /天）和 CTX (剂量为 100 mg/kg体重 /天），注射体积均为 100 μL■, 三天后停用 CTX, 融合蛋白再继续注射 3天，注射体积为 100 μ^,

对照组：每天注射 lOO L PBS溶液，连续注射六天。

各组小鼠于第 7天处死。

检测指标：各组小鼠与第 1天，第 4天，第 7天检测外周血白细胞数，方法同实施例 2.1。

统计学处理

各项数据均以 x±s 表示，实验数据经方差齐性检验后，采用方差分析或 t 检验。结果：

表 1显示了实施例 2.1 自实验开始第 10天，各组小 I骨骨髓细胞中粒系细胞的变化情况。

表 1

表 2显示了实施例 2.1 自实验开始第 10天，各组小鼠股骨骨髓细胞中粒系细胞的变化情况。

表 2

由表 1和表 2的结果可以看出，小鼠腹腔注射 CTX后，成熟粒系细胞减少，表现为轻度骨髓抑制，特别是粒系细胞的抑制作用比较明显。而给予融合蛋白后，粒系细胞数有上升的趋势，在胸骨中， 50 μ_§组的粒系细胞数约为 CTX组的 1.8倍，在股骨中， 50 μ_§组的粒系细胞数约为 CTX组的 1.6倍。可见该融合蛋白表现出恢复粒系细胞增生的作用，特别是高剂量注射组，使粒系细胞和正常对照组已无显著差另 |J。从图 1 可见，在未给予融合蛋白前，实验组的外周血白细胞与对照组相比均显著下降，从第 4天开始腹腔注射融合蛋白后，可以看到融合蛋白组比单纯 CTX组外周血白细胞上升快。第 10天时，注射融合蛋白的各组的外周血白细胞已经恢复到正常值或以上，而单纯 CTX组的外周血白细胞仍比正常对照组的外周血白细胞值低。注射不同剂量的融合蛋白对外周血中白细胞的恢复也有剂量依赖性。由此可以看出，该融合蛋白可以恢复化疗损伤引起的外周血中白细胞减少的症状，缩短其恢复时间，表现出促进造血作用。

由图 2可以看出，小鼠经给予环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§组的骨髓有核细胞数约是 CTX组的 2倍（Ρ<0.01 )，其余注射剂量组骨髓有核细胞数增加也显著高于单纯 CTX实验组（Ρ<0.01 )，并且不同的注射剂量组效果也有差别，表现出剂量依赖性。结合表 2可以看出，融合蛋白组骨髓细胞增加以粒系为主。从而有望将该融合蛋白用于治疗骨髓抑制引起的血液病。

由图 3可以看出小鼠经给予环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 10 μ_§ 组、 25μ_§组、 50 μ_§组使脾系数增加高于单纯 CTX组，且脾系数随着融合蛋白浓度的升高而增加（Ρ<0.05〜0.01 )，呈明显的剂量效应关系。说明该融合蛋白能保护残存的造血干细胞，促进髓外造血。

由图 4可以看出小鼠经给予环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§ 组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 2.8倍（Ρ<0.01 )， 10 μ_δ组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 2倍（Ρ<0.01 )，且 CD34阳性细胞随着融合蛋白浓度的升高而增加 (Ρ<0.05 )，呈明显的剂量效应关系。 CD34 细胞数高说明造血旺盛一般是进入恢复阶段，表明该融合蛋白可能刺激骨髓间充质干细胞向造血干 /祖细胞分化，改善造血微环境，从而促进造血的恢复。

由图 5可以看出小鼠经环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 1.8倍（Ρ<0.001 )， 10 组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 1.5 倍（P<0.001 )，且 CD45 细胞随着融合蛋白浓度的升高而增加 (P<0.001 ) , 呈明显的剂量效应关系。这与外周血中白细胞的变化相吻合。 CD45细胞的变化进一步表明该融合蛋白可能刺激骨髓间充质干细胞向造血干 /祖细胞分化，改善造血微环境，从而促进造血的恢复。

由图 6可以看出小鼠经环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§组的粒系祖细胞集落数数约是 CTX组的 1.5倍（Ρ<0.05 )，其余注射剂量组粒系祖细胞集落数增加也高于单纯 CTX 实验组，且集落数随着融合蛋白浓度的升高而增加 (Ρ<0.05 )，呈明显的剂量效应关系。表明该融合蛋白可能通过刺激骨髓间充质干细胞、改善造血微环境以及其他机制而发挥其促造血活性。表 3显示了实施例 2.2中各组不同时间外周血白细胞（WBC) 的变化情况。

表 3

由表 3 可以看出提前注射一定量的融合蛋白可以有效减轻化疗引起的外周血白细胞下降，在第 10天时，联合用药组外周血白细胞数约为 CTX组的 4.3倍，说明通过提前给予该融合蛋白可预防化疗引起的白细胞减少。

表 4显示了实施例 2.3中各组不同时间外周血白细胞（WBC) 的变化情况

表 4

由表 4的结果可以看出融合蛋白与 CTX联用时能减轻 CTX对外周血白细胞的损伤，在第 4天时，联合用药组外周血白细胞数量约为 CTX组的 3倍。在停用 CTX 后，联合用药组外周血白细胞的恢复又比 CTX组要快，说明融合蛋白可以用于修复化疗引起的白细胞下降。由以上结果可看出化疗过程中同时给予该融合蛋白，可预防化疗中或化疗后引起的白细胞减少。实施例 3

融合蛋白在放疗损伤模型中的促进造血作用

本实施例的目的是观察融合蛋白对放疗引起的造血损伤的治疗作用，为治疗肿瘤患者放疗后骨髓损伤造血功能低下寻找安全有效的药物。其中，使用实施例 1制备的融合蛋白。方法- 采用清洁级 BALB/c小鼠，雄性，体重 18〜20 g, 随机分组，每组 30只。实验分组如下：放疗组：小鼠经 6.0Gy—次性照射后，连续两周注射 lOO L PBS溶液；融合蛋白组：小鼠经 6.0Gy —次性照射后，连续两周注射融合蛋白溶液，剂量为 50 μ_§/鼠 /天，注射体积为 100 μ^,

正常组：小鼠不做任何处理，连续两周注射 lOO L PBS溶液。

各组小鼠于给药结束后检测外周血白细胞数，然后处死，检测小鼠骨髓有核细胞数（BMNC) ; 小鼠脾系数，方法同实施例 2。计算小鼠存活率。统计学处理

各项数据均以 x±s 表示，实验数据经方差齐性检验后，采用方差分析或 t 检验。结果- 放疗组的外周血白细胞与正常组相比显著下降，连续两周注射融合蛋白的融合蛋白组的外周血白细胞已经恢复到正常值或以上。由此可以看出，该融合蛋白可以恢复放疗损伤引起的外周血中白细胞减少的症状，缩短其恢复时间，表现出促进造血作用。

表 5显示了放疗 2周后各组小鼠粒细胞、骨髓有核细胞数、脾系数及小鼠存活率情况。

由表 5 可以看出放疗小鼠在注射融合蛋白两周后，骨髓粒系细胞数、有核细胞数、脾系数和存活率都明显高于放疗组，其中骨髓粒系细胞数、有核细胞数和脾系数都比放疗组提高了约两倍，存活率提高了约 1.7倍，从而有望将该融合蛋白用于治疗放疗后骨髓移抑制所引起的疾病。实施例 4

采用与实施例 1相类似的方法，不同之处在于，用全基因合成方式合成 DNA序列 (SEQ ID NO:3), 得到的融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:4所示。实施例 5

采用与实施例 2相同的方法，分组方式相同，检测实施例 4制备的融合蛋白在对化疗引起的白细胞减少症、化疗后骨髓损伤造血功能低下等的预防和 /或治疗作用。

结果表明，给予实施例 4制备的融合蛋白后，粒系细胞数有上升的趋势，在胸骨中， 50 μ_§组的粒系细胞数约为 CTX组的 1.9倍，在股骨中， 50 μ_§组的粒系细胞数约为 CTX组的 1.7倍。可见该融合蛋白表现出恢复粒系细胞增生的作用，特别是高剂量注射组，使粒系细胞和正常对照组已无显著差别。

从第 4天开始腹腔注射融合蛋白后，可以看到融合蛋白组比单纯 CTX组外周血白细胞上升快。第 10天时，注射融合蛋白的各组的外周血白细胞已经恢复到正常值或以上，而单纯 CTX组的外周血白细胞仍比正常对照组的外周血白细胞值要低。该融合蛋白可以恢复化疗损伤引起的外周血中白细胞减少的症状，缩短其恢复时间，表现出促进造血作用。

小鼠经给予环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§组的骨髓有核细胞数约是 CTX组的 2.2倍（Ρ<0.01 )，其余注射剂量组骨髓有核细胞数增加也显著高于单纯 CTX实验组（Ρ<0.01 )，并且不同的注射剂量组效果也有差别，表现出剂量依赖性。融合蛋白组骨髓细胞增加以粒系为主。从而有望将该融合蛋白用于治疗骨髓抑制引起的血液病。

小鼠经给予环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 10 μ_§组、 25μ_§组、

50 μ_§组使脾系数增加高于单纯 CTX组，且脾系数随着融合蛋白浓度的升高而增加 (Ρ<0.05〜0.01 )，呈明显的剂量效应关系。说明该融合蛋白能保护残存的造血干细胞，促进髓外造血。

小鼠经给予环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 2.9倍（Ρ<0.01 )， 10 μ_δ组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 2.1倍（Ρ<0.01 )，且 CD34阳性细胞随着融合蛋白浓度的升高而增加（Ρ<0.05 )，呈明显的剂量效应关系。 CD34细胞数高说明造血旺盛一般是进入恢复阶段，表明该融合蛋白可能刺激骨髓间充质干细胞向造血干 /祖细胞分化，改善造血微环境，从而促进造血的恢复。

小鼠经环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 1.9倍（PO.001 )， 10 μ_δ组的 CD34阳性细胞数约是 CTX组的 1.6倍（PO.001 ), 且 CD45细胞随着融合蛋白浓度的升高而增加（Ρ<0.001 )，呈明显的剂量效应关系。这与外周血中白细胞的变化相吻合。 CD45细胞的变化进一步表明该融合蛋白可能刺激骨髓间充质干细胞向造血干 /祖细胞分化，改善造血微环境，从而促进造血的恢复。

由图 6可以看出小鼠经环磷酰胺化疗 3天再腹腔注射融合蛋白 6天后， 50 μ_§组的粒系祖细胞集落数数约是 CTX组的 1.7倍（Ρ<0.05 )，其余注射剂量组粒系祖细胞集落数增加也高于单纯 CTX 实验组，且集落数随着融合蛋白浓度的升高而增加 (Ρ<0.05 )，呈明显的剂量效应关系。表明该融合蛋白可能通过刺激骨髓间充质干细胞、改善造血微环境以及其他机制而发挥其促造血活性。

此外，提前注射一定量的融合蛋白可以有效减轻化疗引起的外周血白细胞下降，在第 10天时，联合用药组外周血白细胞数约为 CTX组的 4.5倍，说明通过提前给予该融合蛋白可预防化疗引起的白细胞减少。

融合蛋白与 CTX联用时能减轻 CTX对外周血白细胞的损伤，在第 4天时，联合用药组外周血白细胞数量约为 CTX组的 3.5倍。在停用 CTX后，联合用药组外周血白细胞的恢复又比 CTX组要快，说明融合蛋白可以用于修复化疗引起的白细胞下降。由以上结果可看出化疗过程中同时给予该融合蛋白，可预防化疗中或化疗后引起的白细胞减少。实施例 6

采用与实施例 3相同的方法，分组方式相同，检测实施例 4制备的融合蛋白对放疗引起的造血损伤等的预防和 /或治疗作用。

结果表明，放疗组的外周血白细胞与正常组相比显著下降，连续两周注射融合蛋白的融合蛋白组的外周血白细胞已经恢复到正常值或以上。骨髓粒系细胞数、有核细胞数、脾系数和存活率都明显高于放疗组，其中骨髓粒系细胞数、有核细胞数和脾系数都比放疗组提高了约两倍，存活率提高了约 2倍。由此可以看出，该融合蛋白可以恢复放疗损伤引起的外周血中白细胞减少的症状，缩短其恢复时间，表现出促进造血作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1、一种融合蛋白的用途，其特征在于，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 4所示，用于制备：

(i) 刺激骨髓间充质干细胞向造血干 /祖细胞分化的药物；或

(ii) 促进粒系造血祖细胞增殖的药物。

2、如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述药物用于：

(1) 预防和 /或治疗化疗引起的造血功能低下；

(2) 预防和 /或治疗放疗引起的造血功能低下；或

(3) 预防和 /或治疗白细胞减少症。

3、如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述药物在放疗或化疗之前、之中、和 /或之后使用。

4、一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示，其特征在于，用于促进粒系造血祖细胞的增殖。

5、一种融合蛋白的用途，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 4所示，其特征在于，用于制备预防和 /或治疗白细胞减少症的药物。

6、一种体外促进粒系祖细胞增殖的方法，其特征在于，在粒系祖细胞的培养基添加 100 ng/mL〜5 g/mL的融合蛋白，所述融合蛋白的序列如 SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 4所示。

7、一种药物组合物，其特征在于，包含：

8、如权利要求 7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物在放疗或化疗之前、之中、和 /或之后使用。

9、如权利要求 7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括环磷酰胺。

10、如权利要求 7所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备促进粒系造血祖细胞增殖的药物。