WO2014061882A1 - 카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질 - Google Patents

카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질 Download PDF

Info

Publication number
WO2014061882A1
WO2014061882A1 PCT/KR2013/001093 KR2013001093W WO2014061882A1 WO 2014061882 A1 WO2014061882 A1 WO 2014061882A1 KR 2013001093 W KR2013001093 W KR 2013001093W WO 2014061882 A1 WO2014061882 A1 WO 2014061882A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
compound
amino acid
group
inh
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/001093
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2014061882A9 (ko
Inventor
이동익
안익성
김찬진
이창하
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 연세대학교 산학협력단 filed Critical 연세대학교 산학협력단
Priority to US14/435,884 priority Critical patent/US20150293106A1/en
Publication of WO2014061882A1 publication Critical patent/WO2014061882A1/ko
Publication of WO2014061882A9 publication Critical patent/WO2014061882A9/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/56—Amides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/81—Amides; Imides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C09K2211/1033—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom with oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Definitions

  • the present invention is directed to the fluorescence detection of kadepsin, a cysteine protease, sensitively and accurately using substrates based on diaromatic amino acids.
  • proteases are enzymes that selectively cleave peptide bonds of proteins and polypeptides. Based on their mechanism of action, they are classified into serine proteases, cysteine proteases, aspartic proteases and metalloproteases. Increasing reports of proteases are associated with various types of diseases, such as viral infections such as HIV, cardiovascular disease, cancer, Alzheimer's disease, and inflammatory diseases, and have resulted in a fast, sensitive and specific assessment of protease activity over the past decades. The demand for materials that can be increased greatly.
  • cysteine proteases perform particularly functions in extracellular matrix conversion, antigen presentation, and processing events, leading to major diseases such as osteoporosis, arthritis, immune response related diseases, atherosclerosis, cancer, and many parasitic infections. It can represent various drug targets for.
  • Kadipsin B, L and S are involved in the formation, growth and invasion of tumors, and various carcinomas, for example, Kadipsin B, are associated with breast cancer, colon cancer, esophageal cancer, gastric cancer, lung cancer, In ovarian cancer and thyroid cancer, cardiocin L is in renal and testicular tumors, non-small cell lung cancer and breast cancer, ovarian cancer, colon cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer and thyroid cancer. In related macrophages, they are known to be found at high levels and are of interest. In the case of squamous cell carcinoma of the skin, the expression of kadepsin L in keratinocytes has been shown to protect cells from neoplastic progression.
  • This protective role of kadipsin L is to fully define the role of each cysteine kadopsin in malignant progression, suggesting the need to develop substrates or inhibitors that can distinguish cysteine kadopsin before targeting from a therapeutic point of view. Only a few substrates and inhibitors have been developed for specific cysteine kadipsin. That is, Abz-Gly-Ile-Val-Arg-Ala-Lys (Dnp) -OH for the selective analysis of Kadipsin B, Abz-Leu-Glu-Gln-EDDnp for the selective analysis of Kadipsin S, and Kadipsin AceHis-Gly-Pro-Arg-ACC, a selective inhibitor of K.
  • Abz, Dnp, EDDnp, and ACC mean o- aminobenzoyl, 2,4-dinitrophenyl, ethylene diamine 2,4-dinitrophenyl, and 7-amino-4-carbamoylmethylcourmarin, respectively.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1):
  • X 1 represents glycine, lysine, arginine or leucine
  • X 2 is or Indicates
  • R 1 represents an amine protecting group
  • the present invention also provides a method for preparing a compound represented by the following Chemical Formula 4 by reacting a compound represented by the following Chemical Formula 2 with a compound represented by the following Chemical Formula 3; Removing an amine protecting group (R 1 ) from a compound of Formula 4; And reacting the compound represented by Chemical Formula 4 with the amine protecting group (R 1 ) removed with the compound represented by Chemical Formula 5 to prepare a compound represented by Chemical Formula 1 below:
  • X 1 represents glycine, lysine, arginine or leucine
  • X 2 is or Indicates
  • R 1 represents an amine protecting group
  • the present invention also provides a sensor for detecting Kadipsin comprising the compound represented by the formula (1).
  • the present invention also provides a composition for detecting Kadipsin comprising the compound represented by the formula (1).
  • the present invention also provides a cardipsin high-expression disease diagnosis kit comprising the compound represented by the formula (1).
  • the present invention also provides a composition for the screening of a capepsin inhibitor comprising a compound represented by the formula (1).
  • the present invention can selectively detect fluoridation of kadipsin by connecting the cardiac acid-preferred amino acid to the diaromatic amino acid and isoniazid, which is a quencher, as a substrate for the analysis of cardipine.
  • the substrate has a simple structure and low production cost. It works.
  • the fluorescent substrate has the effect of diagnosing various carcinomas expressing high kadipsin or screening a kadopsin inhibitor.
  • Figure 2 is a result of characterization of the purified purified DBDY- (Gly-INH) 2 ,
  • A) shows the chemical structure,
  • C) shows the 1 H NMR spectrum in d6-DMSO .
  • DBDY- (amino -INH) illustrates a 1 H NMR spectrum in d6-DMSO and chemical structure of the 2
  • 3 is DBDY- (Lys-INH) 2
  • Figure 4 is DBDY- ( Ile-INH) 2
  • FIG. 5 shows DBDY- (Leu-INH) 2
  • FIG. 6 shows DBDY- (Met-INH) 2
  • FIG. 7 shows DBDY- (Phe-INH) 2
  • FIG. 8 shows DBDY- (Val- INH) 2
  • FIG. 9 is DBDY- (Trp-INH) 2
  • FIG. 10 is DBDY- (Tyr-INH) 2 .
  • FIG. 11 to 19 show nine DBDY- (amino acids-INH) 2 Hydrolysis catalyzed by the protease of Figure 11, DBDY- (Gly-INH) 2 12 is DBDY- (Lys-INH) 2 13 is DBDY- (Ile-INH) 2, 14 is DBDY- (Leu-INH) 2, 15 is DBDY- (Met-INH) 2, Figure 16 shows DBDY- (Phe-INH) 2, 17 shows DBDY- (Val-INH) 2, 18 is DBDY- (Trp-INH) 2 And FIG. 19 shows DBDY- (Tyr-INH) 2 Indicates.
  • FIG. 20 shows the results of hydrolysis of DBDY- (Gly-INH) 2 (A) and DBDY- (Lys-INH) 2 (B) by cysteine proteases including kadipsin B, L and S.
  • FIG. 20 shows the results of hydrolysis of DBDY- (Gly-INH) 2 (A) and DBDY- (Lys-INH) 2 (B) by cysteine proteases including kadipsin B, L and S.
  • FIG. 21 shows HPLC chromatograms of hydrolysis products catalyzed by kadipsin B of DBDY- (Gly-INH) 2 (A) and DBDY- (Lys-INH) 2 (B).
  • DBDY- (INH) 2 was synthesized through the combination of N, N'- diBoc-dityrosine (DBDY) and isoniazid 2 molecules, and used it for the selective and sensitive analysis of papain and chymopafein. Said that.
  • DBDY- (INH) 2 was not hydrolyzed by kadipsin B and L.
  • the present invention relates to a compound represented by the following general formula (1):
  • X 1 represents glycine, lysine, arginine or leucine
  • X 2 is or Indicates
  • R 1 represents an amine protecting group
  • Amine protecting group means a kind of protecting group that can bind to an amine group in conventional organic synthesis to provide chemical selectivity of a particular functional group.
  • the amine protecting group is a known amine protecting group, for example, carbenzyloxy group, p-methoxybenzyl carbonyl group, tert-butyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, acetyl group, benzyl group, carba It points to a mating machine.
  • the amine protecting group may be a hydrophilic or hydrophobic compound modified with a carboxyl group, or an amino acid is combined with an amine group to serve as a protecting group.
  • the hydrophilic or hydrophobic compound may be, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polystyrene, polyisoprene, polymethyl methacrylate, derivatives thereof, or copolymers thereof.
  • amino acid moiety refers to a side chain bonded to carbon of an amino acid, and may include a side chain portion excluding a known amino acid type, for example, an amino group such as alanine, cysteine, aspartic acid, and a carboxyl group. .
  • protease preferred amino acid means an amino acid present at the positions of P1, P2, etc. of the substrate, as described above.
  • X 1 represents glycine or lysine
  • R 1 is a tert-butyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, polyethylene glycol, or NH 2 CHR'n, where R 'is an amino acid moiety and n is 1 to 1 It may be a compound representing 20.
  • Compound of formula (1) of the present invention is a quenching compound which eliminates the fluorescence of the protease preferred amino acid and the diaromatic amino acid directly or crosslinkable to the carboxyl group which is a terminal functional group of the fluorescent aromatic amino acid is bonded at both ends It is characterized in that the protease, in particular a complex polymer that can be used as a substrate that can specifically detect the kadipsin.
  • the diaromatic amino acid is a form in which an amine protecting group is bonded to a terminal amine group for chemical selectivity of a terminal carboxyl group, or a hydrophilic or hydrophobic compound or an amino acid is bonded to the amine group through an amide bond. It is characterized by having a structure in which the group is blocked.
  • the compound of the present invention is the amine group of the end of the quencher compound of formula 1 and the carboxyl group of the protease-preferred amino acid reacts, and the amine group of the protease-preferred amino acid reacts with the carboxyl group of the diaromatic amino acid to form a peptide bond by Protease preferred amino acids and quencher compounds may be combined at both ends of the amino acid.
  • Fluorescence of the diaromatic amino acid disappears through peptide bonds between the diaromatic amino acid and the protease-preferred amino acid-quencher compound.
  • the peptide binding site of the protease-preferred amino acid and quencher compound is a recognition site that can be cleaved by the protease, in particular, kadepsin. Is recovered. Therefore, since the compound of the present invention exhibits an increase in fluorescence intensity due to decomposition depending on the presence of cardipsin, it is possible to fluoresce decapitine, and thus the compound of the present invention can be used as a fluorescence sensor for detecting the capidine.
  • the present invention also provides a method for preparing a compound represented by the following Chemical Formula 4 by reacting a compound represented by the following Chemical Formula 2 with a compound represented by the following Chemical Formula 3; Removing an amine protecting group (R 1 ) from a compound of Formula 4; And preparing a compound represented by the following Chemical Formula 1 by reacting the compound represented by the following Chemical Formula 5 with the amine protecting group (R 1 ) removed:
  • X 1 represents glycine, lysine, arginine or leucine
  • X 2 is or Indicates
  • R 1 represents an amine protecting group
  • the first step is a step of preparing a compound of Formula 4 by reacting a carboxyl group of an amino acid of Formula 2 with an amine protecting group at one end thereof under a catalyst and a crosslinking agent and an amine group of a quencher of Formula 3.
  • the amine protecting group may use a known amine protecting group and is not particularly limited, and the introduction method may also perform a known method.
  • a known amine protecting group for example, tert-butyloxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, polyethylene glycol, or NH 2 CHR'n-, wherein R 'is an amino acid moiety, n is 1 to 1 20 may be used.
  • the amino acid of Formula 2 may be a type of amino acid preferred by the protease, for example, may be glycine, lysine, arginine or leucine.
  • the lysine it has a side chain (-(CH 2 ) 3 CH 2 NH 2 ) can be used in the form of additionally bonded FMOC to inhibit the side chain binding when combined with a diametric amino acid described below have.
  • the FMOC can be removed by dissolving the compound of Formula 1 in a DMF solution containing 20% piperidine, but is not particularly limited thereto.
  • the quencher compound of Formula 3 is not particularly limited as long as it contains a functional group capable of binding to the amino acid of Formula 2, or a quencher compound whose terminal can be modified and activated to include the functional group, preferably isoniazid , INH).
  • the reaction of the amino acid of Formula 2 and the quencher compound may be carried out under a catalyst and a crosslinking agent.
  • the catalyst and the crosslinking agent are the acyl halides (Cl, F), acyl azides, activated esters, acylisourea (carbodiimide) unhydrides, acyls of the amino acid of formula (2) or the quencher compound of formula (3) It can be used to activate in the form of oxyphosphorium cation, acyluronium cation.
  • the catalyst may be EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, CMC (1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide), DCC (N, N'-dicyclohexyl carbodiimide), or DIC (diisopropyl carbodiimide-based compounds such as carbodiimide) and NHS or sulfo-NHS, carbodiimidazole (N, N'-carbonyldiimidazole), or Woodward's reagent K.
  • EDC EDC
  • CMC 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide
  • DCC N, N'-dicyclohexyl carbodiimide
  • DIC diisopropyl carbodiimide-based compounds such as carbodiimide
  • NHS or sulfo-NHS carbodiimid
  • DSP Dithiobis (succinimidylpropionate)
  • DTSSP dithiobis (succinimidylpropionate)
  • DSS Disuccinimidyl suberate
  • BS 3 Bis (sulfosuccinimidyl) suberate
  • EGS Ethylene glycolbis (succinimidyl DSC)
  • Homobifunctional crosslinking agents such as (N, N'-Disuccinimidyl carbonate), or SPDP (N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate)
  • SMPT Succinimidyloxycarbonyl- ⁇ - (2-pyridyldithio) toluene
  • SMCC Succinimidyl 4- Heterobifunctional crosslinking agents such as (N-maleimidomethyl) -cyclohexane-1-carboxylate
  • the amide group of the compound of Formula 3 may be formed into an activated ester form using a carbodiimide compound and NHS and reacted with a carboxyl group of Formula 2 to form an amide bond.
  • reaction may be carried out while stirring at room temperature in a solvent such as dichloromethane, dimethylformamide, dioxane (1,4-dioxane), or methylene chloride.
  • a solvent such as dichloromethane, dimethylformamide, dioxane (1,4-dioxane), or methylene chloride.
  • dimethylformamide may be used because the carboxyl group activated by NHS is very strong in dimethylformamide with amine groups.
  • the compound of Formula 3 may be used in a molar ratio of 1 to 3 moles per mole of compound of Formula 2 to prepare a compound of Formula 3 in which an amino acid and a quencher compound are preferred by proteases.
  • the compound of Formula 4 may be, for example, glycine-INH, lysine-INH, arginine-INH, or leucine-INH, in which a protecting group is bonded to one end.
  • the second step is to secure a functional group capable of reacting with the diaromatic amino acid of Formula 5 by removing the amine protecting group from the compound of Formula 4.
  • the amine protecting group may be removed by stirring by adding the compound of Formula 4 to a mixed solvent in which the same amount of TFA (trifluoroacetic acid) and CH 2 Cl 2 (methylene chloride) is mixed, but is not particularly limited thereto.
  • the amine protecting group is removed in the above step to react the compound of Formula 4 having a functional group, particularly an amine group, at one end with a carboxyl group of the diaromatic amino acid of Formula 5 To prepare a compound of formula (1).
  • the compound of Formula 1 may be prepared by the reaction of the carboxyl group of the diaromatic amino acid of Formula 5 with the amine groups at both ends blocked with the amine group of the amino acid-isoniazid of Formula 4.
  • the diaromatic amino acid of Chemical Formula 5 may be dityrosine or ditryptophan.
  • aromatic amino acid of Formula 5 for optimal reaction of the terminal carboxyl group, it is preferable to use a diaromatic amino acid in which both terminal amine groups are protected by a protecting group or blocked.
  • Blocking of the diaromatic amino acid may be performed by introducing an amine protecting group or by treating a compound capable of forming an amide bond with an amine group of the diaromatic amino acid.
  • the type of the protecting group may be a known amine protecting group, and is not particularly limited, and the introduction method may also perform a known method.
  • the compound capable of forming an amide bond with the amine group of the diaromatic amino acid may be a hydrophilic or hydrophobic compound modified with a carboxyl group, for example, polyethylene glycol, or the like, or an amino acid, and the like, but is not particularly limited thereto.
  • the coupling reaction of the diaromatic amino acid with the protease preferred amino acid-quencher compound can be carried out under a catalyst and a crosslinking agent.
  • the catalysts and crosslinking agents are acyl halides (Cl, F), acylazides, activated esters, acylisourea (carbodiimide) unhydrides, such as diaromatic amino acids or terminal functional groups of amino acid-quencher compounds It can be used to activate in the form of acyloxyphosphorium cation, acyluronium cation.
  • the kind of the catalyst and the crosslinking agent is as described above.
  • an amide bond may be formed by forming an amine group of the compound of Formula 4 in the form of an activated ester using a carbodiimide compound and NHS and reacting the amine group with a carboxyl group of the diaromatic amino acid.
  • one of the homofunctional crosslinking agents may be used to make an amine group represented by Chemical Formula 4 in the form of an activated ester and then react with the amine group of the diaromatic amino acid to make urea bonds.
  • reaction may be carried out while stirring at room temperature alone or in mixed solvents such as dichloromethane, dimethylformamide, dioxane (1,4-dioxane), or methylene chloride.
  • methylene chloride and dimethylformamide may be mixed in a volume ratio of 8: 2, since the carboxyl group activated by NHS has a very strong reactivity with an amine group in dimethylformamide.
  • the compound of Formula 4 may be used in a molar ratio of 2 to 5 moles per 1 mole of the diaromatic amino acid of Formula 5. More specifically, it can be used in a molar ratio of about 3 moles.
  • a protease preferred amino acid-quencher may bind to both ends of the diaromatic amino acid.
  • the preparation method of the compound of the present invention is a method of precipitation and dialysis (dialysis), silica column (silica column), gel permeate chromatography (GPC), gel filtration chromatography (GFC), or IEC Separation and purification using ion exchange chromatography may be further performed.
  • the present invention also relates to a sensor for detecting Kadipsin comprising the compound represented by Chemical Formula 1.
  • Compound of formula 1 of the present invention can be used as a fluorescent sensor for selectively detecting the cardipsin since the peptide bond is decomposed by the cardipsin, the fluorescence intensity of the diaromatic amino acid is restored to increase the fluorescence intensity.
  • fluorescence signaling decomposes the peptide bond of the protease preferred amino acid and quencher compound in the diaromatic amino acid based substrate, while the quencher compound is separated from the compound of Formula 1 and the fluorescence of the diaromatic amino acid is recovered, resulting in strong fluorescence. It represents the turn-on type of fluorescent signaling characteristics.
  • the compound of formula 1 according to the present invention exhibits a selective increase in fluorescence at concentrations of 284 nm (excitation wavelength) and 410 nm (emission wavelength) depending on the addition of kadipsin in aqueous solution, thus turning the compound of formula 1 "turn-on". It can be used as a (turn-on) type fluorescence probe (probe) to detect the kadipsin.
  • the sensor for detecting kadipsin of the present invention may be provided as a conventional kit that can check the presence and concentration of kadipsin by mixing with the sample solution to detect the kadipsin.
  • the kadipsin may be kadipsin B or L.
  • the present invention also relates to a composition for detecting kadipsin comprising the compound represented by the formula (1).
  • the present invention also comprises the steps of reacting a compound to be detected with the compound represented by the formula (1) and the capidine; And it relates to a method for detecting kadipsin comprising the step of measuring the fluorescence intensity generated in the sample.
  • the compound of formula 1 of the present invention is a "turn-on" type sensor that can detect the cardipsin in the aqueous solution state, and the sensor detects the fact that the intensity of the fluorescence is amplified when the cardipine is detected without fluorescence. It is the type that I made.
  • the composition for detecting kadicesin of the present invention may include a buffer solution in addition to the compound represented by the formula (1).
  • the type and concentration of the buffer solution are not particularly limited, but may be appropriately changed depending on the application of the composition for detecting the capidine. More specifically, it may be a buffer solution of pH 3 to 10. Most specifically, a phosphate buffer of pH 3 to 10 containing NaCl and EDTA may be used, but is not particularly limited thereto.
  • the detection of the kadipsin by the compound of Formula 1 is to measure the change in fluorescence intensity, it can be measured because it shows a significantly increased fluorescence intensity at 410 nm depending on the concentration of the kadipsin.
  • the present invention also relates to a Kadipsin high expression disease diagnosis kit comprising the compound represented by the formula (1).
  • kadipsin B is found in breast cancer, colon cancer, esophageal cancer, gastric cancer, lung cancer, ovarian cancer and thyroid cancer, as well as glioma and melanoma
  • kadipsin L is used for renal and testicular tumors, non-small cell lung cancer and breast cancer, ovarian cancer and colon cancer. Since the high expression in kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer and thyroid cancer, the compound of Formula 1 can diagnose a disease expressing the enzyme through the fluorescence detection of kadipsin.
  • Diagnosis of the Kadipsin high expression disease can be carried out by comparing the fluorescence intensity of the Kadipsin of disease cells with the fluorescence intensity of the Kadipsin of normal cells.
  • the present invention also relates to a composition for screening a kadepsin inhibitor comprising a compound represented by the formula (1).
  • the screening composition of the present invention reacts with a sample containing a kadepsin and a kadepsin inhibitor candidate by using the compound of Chemical Formula 1, and the kadepsin inhibitor inhibits the activity of the enzyme and binds to the peptide of the compound of Chemical Formula 1 Since the degradation of is suppressed, it is possible to measure the decrease in the fluorescence intensity, through which the screening candidate material for inhibiting the kadepsin is characterized.
  • composition of the present invention may include the formulation of the compound of Formula 1 in a dosage form with a control reagent (positive and / or negative).
  • a control reagent positive and / or negative
  • it can be administered orally as sugar-coated tablets, capsules, elixirs and microcapsules as needed, or in the form of injectables of sterile solutions or suspensions with water or other pharmaceutically acceptable liquids. Parenteral administration.
  • the compound of Formula 1 may be a pharmaceutically acceptable carrier or media, specifically sterile water, physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles (vehicle) ), Preservatives, binders and the like.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or media specifically sterile water, physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles (vehicle) ), Preservatives, binders and the like.
  • the amount of active ingredient in the above formulation is in a suitable dosage within the preferred range.
  • additives examples include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth rubber and arabic rubber; Excipients such as crystalline cellulose; Swelling agents such as cornstarch, gelatin, alginic acid; Lubricants such as magnesium stearate; Sweetening agents such as sugar, lactose or saccharin; And flavoring agents such as peppermint, Gaultheria adenothrix oil and cherries.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth rubber and arabic rubber
  • Excipients such as crystalline cellulose
  • Swelling agents such as cornstarch, gelatin, alginic acid
  • Lubricants such as magnesium stearate
  • Sweetening agents such as sugar, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, Gaultheria adenothrix oil and cherries.
  • liquid carriers such as oils may also be included in the above components further.
  • Sterile compounds for injection may be formulated according to the normal drug preparation using a vehicle such as sterile water used in the injection.
  • Other isotonic solutions including physiological saline, glucose, and adjuvants such as D-sorbitol, D-mannitol, D-mannose, and sodium chloride can be used as aqueous solutions of injections. It may be used with suitable solubilizers such as alcohols, in particular polyalcohols such as ethanol, propylene glycol and polyethylene glycol, non-ionic surfactants such as polysorbate 80 (TM) and HCO-50.
  • compositions of the present invention may be prepared in kit form and may include instructions for performing analysis (eg, written, tape, VCR, CD-ROM, etc.).
  • analysis format of the composition is the relative fluorescence value using a fluorescence spectrometer known in the art, for example, the Perkin-Elmer LS55 luminescence spectrometer.
  • Boc-tyrosine-OH (Boc-Tyr) (98%), Boc-phenylalanine-OH (Boc-Phe) ( ⁇ 99%), Boc-tryptophan-OH (Boc-Trp) ( ⁇ 99%), BOC-glycine -OH (BOC-Gly) ( ⁇ 99%), BOC-valine-OH (BOC-Val) ( ⁇ 99%), BOC-Leucine-OH (BOC-Leu) ( ⁇ 99%), BOC-tyrosine-Osu (BOC-Tyr-Osu) ( ⁇ 99%), BOC-phenylalanine-Osu (BOC-Phe-Osu) ( ⁇ 98%), BOC-Tryptophan-Osu (BOC-Trp-Osu), INH, N, N -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (99%), N, N ′ -diisopropylcarbodiimide (DIC) (99%), N -hydroxys
  • BOC-Lysine (FMOC) -OH (BOC-Lys (FMOC)) ( ⁇ 98%), BOC-Isoleucine-OH0.5H 2 O (BOC-Ile0.5H 2 O) ( ⁇ 98%), and BOC-methionine-OH (BOC-Met) ( ⁇ 98%) were purchased from Novabiochem (Darmstadt, Germany). Acetonitrile and water (HPLC grade) were obtained from Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ, USA). Silica 60 aluminum sheet is available from Merck Co. (Darmstadt, Germany). MgSO 4 Showa Chemical Industry Co. (Meguro-ku, Tokyo, Japan). PBS buffer solution was prepared by Hyclone Laboratoreis, Inc.
  • proteases used in the present invention were purchased from Sigma Aldrich: chymotrypsin and trypsin from fetal pancreas, Bacillus licheniformis Derived subtilisin, Tritirachium album Origin Proteinase K, Bacillus thermoproteolyticus rokko Thermolysine derived, Carboxypeptidase A derived from fetal pancreas, Bacillus polymyxa Derived dispase, Clostridium histolyticum Collagenase derived, pepsin derived from porcine gastric mucosa, Aspergillus saitoi Asperylopepsin derived, Papain and chemopapeine derived from papaya latex, Bromelain derived from pineapple stem, Kadipsin B and L derived from human liver, Kadipsin S derived from human spleen.
  • DBDY- (amino acid-INH) 2 which consists of the binding of BOC-amino acid to INH, the removal of BOC, and the binding of DBDY.
  • BOC-Tyr-INH, BOC-Phe-INH, BOC-Trp-INH, and BOC-Val-INH are BOC-amino acids in the DMF (ie, BOC-Tyr, BOC-Phe, BOC-Trp, and BOC-Val) , INH, and DIC were synthesized by mixing in a molar ratio of 2: 1: 2. After reacting at room temperature for overnight, the product was lyophilized to remove DMF. The remaining reaction was removed by washing with methylene chloride (CH 2 Cl 2 ).
  • BOC-Gly-INH, BOC-Ile-INH, BOC-Leu-INH, BOC-Met-INH, and BOC-Lys (FMOC) -INH, in the DMF give BOC-amino acids, INH, NHS, and DCC 1: 2.
  • Synthesis was carried out by mixing in a molar ratio of 1: 1. After reaction for overnight at room temperature, the precipitate of N, N'- dichloro cyclohexyl urea (N, N'- dicyclohexylurea) is filtered off and the filtrate was lyophilized. The remaining residue was taken up in CH 2 Cl 2 , washed three times with water, dried over anhydrous MgSO 4 and evaporated in vacuo.
  • the product was separated and purified on a preparative HPLC system equipped with a UV absorbance detector (Waters 486 Tunable Absorbance Detector, Meadows Instrumentation Inc., USA).
  • the separation process was performed on a C-18 column (5 ⁇ m particle size, 250 mm ⁇ 4.6 mm, 80 mm pore size, Phenomenex, USA) using a mixture of water and acetonitrile containing 0.1% TFA as eluent. Elution was performed with increasing linear gradient of acetonitrile from 0% to 40% for 30 minutes.
  • the flow rate and separation temperature of the eluate were maintained at 1 mL min ⁇ 1 and 35 ° C.
  • the synthesized BOC-amino acid-INH was dissolved in TFA / CH 2 Cl 2 (1: 1) and stirred at room temperature for 30 minutes to remove the BOC groups. After solvent evaporation, the product was eluted with a water and acetonitrile mixture containing 0.1% TFA in a preparative HPLC system using a C-18 column (particle size of 10 ⁇ m, 100 mm ⁇ 21.2 mm, 110 mm pore size, Phenomenex). It was separated and purified using. Elution was performed with increasing linear gradient of acetonitrile from 0% to 40% for 15 minutes. The flow rate and separation temperature of the eluate were maintained at 5 mL min ⁇ 1 and 35 ° C. The product was detected at wavelengths of 210 nm and 280 nm. Fractions containing pure amino acid-INH were poured out and lyophilized.
  • DBDY and amino acid-INH were mixed in a molar ratio of 1: 3: 2.1: 2.1 in CH 2 Cl 2 / DMF (8: 2).
  • TEA was previously added to the solution in moles such as amino acid-INH.
  • the precipitate, N, N'- dichlorohexylurea was filtered off and the filtrate was lyophilized. The remaining reaction was removed by washing with water. The water-insoluble precipitate was separated and purified using a preparative HPLC system.
  • DBDY amino acid-INH
  • a substrate without DBDY ie, BOC-amino acid-INH
  • a substrate with an aromatic amino acid at the P2 position ie BOC-aromatic amino acid-amino acid-INH
  • BOC-aromatic amino acids were combined with Gly-INH and Lys (FMOC) -INH to prepare BOC-aromatic amino acids-Gly-INH and BOC-aromatic amino acids-Lys-INH.
  • BOC-aromatic amino acid-Osu solution contained in DMF and Gly-INH or Lys (FMOC) -INH solution contained in DMF were mixed in a molar ratio of 1: 1.
  • TEA was previously added in moles such as Gly-INH and Lys (FMOC) -INH solutions. After reacting for overnight at room temperature, the residue was lyophilized. The remaining reaction was removed by washing with water and CH 2 Cl 2 .
  • Table 1 summarizes the reaction conditions for these 16 proteases.
  • reaction buffer Prior to the reaction, the mixture of reaction buffer and protease was incubated for 30 minutes in a water bath adjusted to the assay temperature.
  • the hydrolysis reaction was initiated by adding the substrate dissolved in DMSO.
  • the volume of substrate solution added was controlled so that the final concentration of DMSO was lower than 1.5% (v / v).
  • DBDY- (amino acid-INH) 2 Upon hydrolysis of DBDY- (amino acid-INH) 2 , the recovered fluorescence of DBDY was measured using a PerkinElmer LS 55 luminescence spectrometer.
  • Hydrolysis products were analyzed using an HPLC system. To prepare the sample, the hydrolysis reaction was terminated by adding 2% (v / v) 1M HCl for serine, cysteine and metalloprotease and 1M NaOH for aspartic protease. Separation was carried out on a C-18 column (5 ⁇ m particle size, 250 mm ⁇ 4.6 mm, 80 mm pore size, Phenomenex, USA) using a mixture of 10 mM ammonium bicarbonate and acetonitrile as eluent. Was performed. Elution was performed with increasing linear gradient of acetonitrile from 0% to 60% for 15 minutes. The flow rate and separation temperature of the eluate were maintained at 1 mL min ⁇ 1 and 35 ° C. The product was detected at 254 nm wavelength.
  • the fluorescence intensity of DBDY was about 11,000 and 4,300 times higher than that of tyrosine and tryptophan, respectively. Therefore, INH dominated fluorescence scavenging in DBDY- (amino acid-INH) 2 , and fluorescence of DBDY appeared only when the hydrolysis product was DBDY- (amino acid) 2 .
  • DBDY- (amino acid-INH) 2 were tested for the selective analysis of 13 proteases, except for kadipsin, and the experimental results are shown in FIGS. 11 to 19.
  • Initial concentrations of each substrate and protease were 2.5 ⁇ M and 0.1 ⁇ M, respectively.
  • the hydrolysis reaction was carried out for 2 hours.
  • DBDY- (Gly-INH) 2 exhibited sensitivity and selectivity to cysteine proteases (ie, no hydrolysis occurs by other proteases), which means that DBDY (P2 position) and Gly It appears to be due to the bidirectional effect of (P1 position).
  • DBDY- (Phe-INH) 2 , DBDY- (Ile-INH) 2 , DBDY- (Leu-INH) 2 , DBDY- (Met-INH) 2 , and DBDY- (Val-INH) ) 2 was very sensitive to thermolysine and dispase (FIGS. 12-17) and the hydrolysis products were Phe-INH, Ile-INH, Leu-INH, Met-INH, and Val-INH (US). Shown).
  • DY was only pronounced in reaction with chymotrypsin, which is known to have specificity for hydrophobic amino acids such as aromatic amino acids at the P1 position.
  • Both the BOC-aromatic amino acid-Gly-INH and BOC-aromatic amino acid-Lys-INH tested were hydrolyzed by chymotrypsin (see Table 3) and the reaction products were Gly-INH and Lys-INH (not shown).
  • DBDY- (Gly-INH) 2 and DBDY- (Lys-INH) 2 were hardly hydrolyzed by chymotrypsin.
  • dityrosine is hydrophobic, it is not believed to be bulky enough to fit the active site of chymotrypsin.
  • DBDY- (Lys-INH) 2 was hydrolyzed by kadipsin B and L.
  • DBDY- (Gly-INH) 2 was hydrolyzed only by kadipsin B.
  • Kadipsin S is known to prefer aliphatic amino acids rather than aromatic amino acids at the P2 position. For this reason DBDY- (Lys-INH) 2 and DBDY- (Gly-INH) 2 were not hydrolyzed by kadipsin S.
  • K M values ranged from 1.17 ⁇ M to 12.9 ⁇ M and were considerably lower than those reported for other protease analytes (4.6-404 ⁇ M).
  • the K M value of kadipsin B for DBDY- (Gly-INH) 2 was 2.88 ⁇ M, comparable to kadipsin B for other materials. That is, 2.1 ⁇ M for Abz-Phe-Phe-Dap (Dnp) -Trp-OH, 3.0 ⁇ M for Abz-Phe-Arg-Dap (Dnp) -Trp-OH, Abz-Gly-Ile-Val-Arg- 5.9 ⁇ for Ala-Lys (Dnp) -OH.
  • Abz and Dap (Dnp) refer to o -aminobenzoyl and 3- (2,4-dinitrophenyl) -2,3-diaminopropionic acid, respectively.
  • DBDY- (Gly-INH) 2 is useful for selective and sensitive analysis of kadipsin B in that it does not require the use of expensive and complicated equipment for automated peptide synthesis.
  • kadipsin B and L were sensitively and selectively analyzed by DBDY- (Lys-INH) 2 and DBDY- (Gly-INH) 2 .
  • the present invention can be used for a kadipsin detection kit, cancer diagnostic agent, and drug screening.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 카뎁신 검출용 다이아로마틱아미노산 기질에 관한 것으로, 다이아로마틱 아미노산에 프로테아제 선호 아미노산과 소광제를 결합시킨 고분자를 카뎁신 검출을 위한 기질로 사용할 경우 카뎁신에 의해 다이아로마틱 아미노산으로부터 프로테아제 선호 아미노산과 소광제가 분해되면서 형광이 회복되어 카뎁신을 민감하고 정확하게 형광 검출할 수 있다.

Description

카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질
본 발명은 다이아로마틱 아미노산을 기반으로 한 기질을 이용하여 민감하고 정확하게 시스테인 프로테아제인 카뎁신을 형광 검출하는 것에 관한 것이다.
프로테아제는 단백질 및 폴리펩타이드의 펩타이드 결합을 선택적으로 절단하는 효소이다. 그들의 작용 메카니즘을 기초로 하여 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파틱 프로테아제 및 메탈로프로테아제로 분류한다. 프로테아제는 여러 종류의 질환, 예를 들어, HIV 같은 바이러스 감염, 심혈관 질환, 암, 알츠하이머 질환 및 염증성 질환과 연관이 있다는 보고들이 증가하면서, 과거 수십 년 동안 프로테아제 활성의 빠르고, 민감하며 특이적인 평가를 할 수 있는 물질에 대한 요구가 크게 증가하였다. 예컨대, 시스테인 프로테아제는 세포외 기질 전환, 항원 제시, 및 프로세싱 이벤트에 특히 기능을 수행하고 있어, 골다공증, 관절염, 면역 반응 관련 질환, 아테로마성 동맥경화증, 암, 및 다수의 기생충 감염 등의 주요 질환에 대한 다양한 약물 타겟을 대표할 수 있다.
시스테인 프로테아제 중 카뎁신 B, L 및 S는 종양의 형성, 성장 및 침습에 관여하고, 다양한 암종, 예를 들어, 카뎁신 B는 신경교종 및 흑색종뿐만 아니라 유방암, 결장암, 식도암, 위암, 폐암, 난소암 및 갑상선암에서, 카뎁신 L은 신장 및 고환 종양, 비소세포폐암 및 유방암, 난소암, 결장암, 신장암, 방광암, 전립선암 및 갑상선암에서, 카뎁신 S는 고등급 전립샘의 상피내신생물 및 종양 관련 대식세포에서, 높은 수준으로 발견되는 것이 알려져 있어 많은 흥미를 끌고 있다. 피부의 편평세포암종의 경우, 각질세포에서 카뎁신 L의 발현은 신생물 진행으로부터 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다. 카뎁신 L의 이러한 보호 역할은 악성 진행에서 각각의 시스테인 카뎁신의 역할을 완전히 정의하고, 치료적 측면에서 표적화하기 전에 시스테인 카뎁신들을 구별할 수 있는 기질 또는 억제제를 개발할 필요가 있음을 시사하는 것이다. 소수의 기질 및 억제제 만이 특이 시스테인 카뎁신을 위해 개발되어 있다. 즉, 카뎁신 B의 선택적 분석을 위한 Abz-Gly-Ile-Val-Arg-Ala-Lys(Dnp)-OH, 카뎁신 S의 선택적 분석을 위한 Abz-Leu-Glu-Gln-EDDnp, 및 카뎁신 K의 선택적 억제제인 AceHis-Gly-Pro-Arg-ACC. Abz, Dnp, EDDnp, 및 ACC 각각 o-aminobenzoyl, 2,4-dinitrophenyl, ethylene diamine 2,4-dinitrophenyl, 및 7-amino-4-carbamoylmethylcourmarin를 의미한다.
그러나, 이러한 펩타이드 기반 기질은 펩타이드 합성을 위한 비용이 비싸고, 장비가 복잡하여 생산단가가 높은 단점이 있다.
본 발명의 목적은 카뎁신을 민감하고, 선택적으로 분석할 수 있는 다이아로마틱 아미노산 기반 기질, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000001
상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000002
또는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000003
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 하기 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기(R1)를 제거하는 단계; 및 아민 보호기(R1)가 제거된 화학식 4의 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000004
[화학식 3]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000005
[화학식 4]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000006
[화학식 5]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000007
[화학식 1]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000008
상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000009
또는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000010
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 센서를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
본 발명은 다이아로마틱 아미노산에 카뎁신 선호 아미노산과 소광제인 이소니아지드를 연결하여 카뎁신 분석을 위한 기질로 사용함으로써 카뎁신을 선택적으로 민감하게 형광 검출할 수 있으며, 상기 기질은 구조가 간단하고 생산단가가 저렴한 효과가 있다.
또한, 상기 형광 기질은 카뎁신을 고 발현하는 각종 암종을 진단하거나, 카뎁신 억제물질을 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 DBDY-(아미노산-INH)2의 합성과정을 도시한 것이다.
도 2는 분리 정제된 DBDY-(Gly-INH)2의 특성 규명 결과로, (A)는 화학적 구조, (B)는 HPLC 크로마토그램, (C)는 d6-DMSO에서 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3 내지 10은 분리 정제된 DBDY-(아미노산-INH)2의 화학적 구조 및 d6-DMSO에서 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 도 3은 DBDY-(Lys-INH)2, 도 4는 DBDY-(Ile-INH)2, 도 5는 DBDY-(Leu-INH)2, 도 6은 DBDY-(Met-INH)2, 도 7은 DBDY-(Phe-INH)2, 도 8은 DBDY-(Val-INH)2, 도 9는 DBDY-(Trp-INH)2, 도 10은 DBDY-(Tyr-INH)2이다.
도 11 내지 19는 9종의 DBDY-(아미노산-INH)2의 프로테아제에 의해 촉매된 가수분해 결과를 나타낸 것으로, 도 11은 DBDY-(Gly-INH)2, 도 12는 DBDY-(Lys-INH)2, 도 13은 DBDY-(Ile-INH)2, 도 14는 DBDY-(Leu-INH)2, 도 15는 DBDY-(Met-INH)2, 도 16은 DBDY-(Phe-INH)2, 도 17은 DBDY-(Val-INH)2, 도 18은 DBDY-(Trp-INH)2 및 도 19는 DBDY-(Tyr-INH)2를 나타낸다.
도 20은 카뎁신 B, L 및 S를 포함한 시스테인 프로테아제에 의한 DBDY-(Gly-INH)2 (A) 및 DBDY-(Lys-INH)2 (B) 의 가수분해 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 DBDY-(Gly-INH)2 (A) 및 DBDY-(Lys-INH)2 (B)의 카뎁신 B에 의해 촉매된 가수분해 산물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 선행 연구에서 N,N'-diBoc-다이타이로신(DBDY)과 이소니아지드 2분자의 결합을 통해 DBDY-(INH)2를 합성하고, 이를 파페인 및 키모파페인의 선택적이고 민감한 분석에 사용할 수 있음을 밝혔다. DBDY-(이소니아지드)2에서, 형광 염료 및 형광 소거제로서 뿐만 아니라 파페인 및 키모파페인에 대한 특이성을 주는 펩타이드 성분(DBDY=P1 위치 아미노산, INH=P2 위치 아미노산)으로서 DBDY 및 이소니아지드를 사용하였다. 그러나, DBDY-(INH)2 는 카뎁신 B 및 L에 의해 가수분해 되지 않았다. 또한, 카뎁신 B 및 L을 포함하는 대부분의 파페인 유사 시스테인 프로테아제들이 P1 위치에 아르기닌, 라이신, 루신, 및 글리신을 선호함이 보고되어 있어 이를 기반으로 하여, 본 발명자들은 P1 위치에서 글리신, 라이신 등을 포함하여 프로테아제가 인식하는 아미노산이 고정된 다양한 종류의 DBDY-(아미노산-INH)2를 합성함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000011
상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000012
또는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000013
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.
"아민 보호기"는, 통상의 유기합성 시 아민기에 결합하여 특정 기능기의 화학적 선택성을 제공할 수 있는 보호기의 일종을 의미한다. 상기 아민 보호기는 공지의 아민 보호기, 예를 들어, 카보벤질록시기, p-메톡시벤질 카보닐기, 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 아세틸기, 벤질기, 카바메이트기 등을 가리킨다. 또한, 상기 아민 보호기는 카르복실기로 개질된 친수성 또는 소수성 화합물, 또는 아미노산이 아민기와 결합하여 보호기 역할을 수행할 수도 있다. 상기 친수성 또는 소수성 화합물로, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리스티렌, 폴리아이소피렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 이들의 유도체, 또는 이들의 공중합체 등일 수 있다.
"아미노산 모이어티"는 아미노산의 탄소에 결합되어 있는 사이드 체인을 의미하는 것으로, 공지의 아미노산 종류, 예를 들어, 알라닌, 시스테인, 아스파르트산 등의 아미노기와 카르복실기를 제외한 사이드 체인 부분을 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "프로테아제 선호 아미노산"이란 Schechter와 Berger의 명명법에 따르면 기질의 N 말단 사이드(terminal side)인 부분을 P1, P2,...Pn으로 C 말단 사이드 부분을 P1', P2',...P'n으로 명명하는데, 대부분의 파페인 유사 시스테인 프로테아제들은 P2 위치에는 Phe, Tyr 등의 소수성(hydrophobic)의 아미노산을 P1 위치에는 Arg, Lys, Gly, Leu 등의 아미노산을 선호한다. 따라서 본 발명의 경우, P2 위치에는 소수성 성질을 유지하는 다이아로마틱 아미노산을 P1 위치에는 Gly, Lys 등의 아미노산을 위치시켜 파페인 유사 시스테인 프로테아제에 의한 선택적인 분해를 유도할 수 있다. 한편 소광제의 경우에는 P1' 위치에 결합시킬 수 있다. 따라서, 프로테아제 선호 아미노산은 상술한 바와 같이, 기질의 P1, P2 등의 위치에 존재하는 아미노산을 의미한다.
상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로는,
X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
X2는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000014
를 나타내며,
R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 화합물일 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 형광성을 갖는 다이아로마틱 아미노산의 말단 작용기인 카르복실기와 직접 또는 가교성 결합을 통해 프로테아제가 선호하는 아미노산과 다이아로마틱 아미노산의 형광을 소거하는 소광제 화합물이 양 말단에 결합되어 프로테아제, 특히 카뎁신을 특이적으로 검출할 수 있는 기질로 사용할 수 있는 복합형 고분자인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 화합물에 있어서, 상기 다이아로마틱 아미노산은 말단의 카르복실기의 화학적 선택성을 위해 말단 아민기에 아민 보호기가 결합된 형태이거나, 상기 아민기와 아마이드 결합을 통해 친수성 또는 소수성 화합물, 또는 아미노산 등이 결합되어 아민기가 블라킹되어 있는 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 화합물은 화학식 1의 소광제 화합물 말단의 아민기와 프로테아제 선호 아미노산의 카르복실기가 반응하여 결합하고, 상기 프로테아제 선호 아미노산의 아민기는 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기와 반응하여 펩타이드 결합을 형성함으로써 다이아로마틱 아미노산의 양 말단에 프로테아제 선호 아미노산과 소광제 화합물이 결합되어 제조될 수 있다.
상기 다이아로마틱 아미노산과 프로테아제 선호 아미노산-소광제 화합물의 펩타이드 결합을 통해 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 사라진다. 상기 프로테아제 선호 아미노산과 소광제 화합물의 펩타이드 결합 부위는 프로테아제, 특히 카뎁신이 분해할 수 있는 인식 부위로서, 카뎁신에 의한 분해를 통해 다이아로마틱 아미노산 기반 기질로부터 소광제 화합물이 제거되어 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 회복된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 카뎁신 존재 여부에 따라 분해에 의한 형광 강도의 증가를 나타내므로 카뎁신을 형광 검출할 수 있어 본 발명의 화합물은 카뎁신 검출을 위한 형광 센서로 사용할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 하기 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기(R1)를 제거하는 단계; 및 아민 보호기(R1)가 제거된 화학식 4의 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000015
[화학식 3]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000016
[화학식 4]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000017
[화학식 5]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000018
[화학식 1]
Figure PCTKR2013001093-appb-I000019
상기 식에서,
X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
X2는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000020
또는
Figure PCTKR2013001093-appb-I000021
를 나타내고,
R1은 아민 보호기를 나타낸다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법을 도면 1을 참조하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 촉매 및 가교제 하에서 일 말단에 아민 보호기가 결합된 화학식 2의 아미노산의 카르복실기와 화학식 3의 소광제의 아민기를 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계이다.
상기 아민 보호기는 공지의 아민 보호기를 사용할 수 있어 특별히 제한하지 않으며, 도입 방법 역시 공지의 방법을 수행할 수 있다. 예컨대, 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 것을 사용할 수 있다.
상기 화학식 2의 아미노산은 프로테아제가 선호하는 아미노산의 종류를 사용할 수 있고, 예컨대, 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신일 수 있다. 상기 라이신의 경우, 사이드 체인(-(CH2)3CH2NH2)을 가지고 있어 후술하는 다이아로마틱 아미노산과 결합 시 상기 사이드 체인이 결합하는 것을 억제하기 위해 FMOC가 추가로 결합된 형태로 사용할 수 있다. 상기 FMOC는 화학식 1의 화합물이 합성된 후 20% 피페리딘을 함유하는 DMF 용액에 용해시켜 제거할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 화학식 3의 소광제 화합물은 화학식 2의 아미노산과 결합할 수 있는 작용기를 포함하거나, 상기 작용기를 포함하도록 말단이 개질 및 활성화될 수 있는 소광제 화합물이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 이소니아지드(isoniazid, INH)일 수 있다.
상기 화학식 2의 아미노산과 소광제 화합물의 결합 반응은 촉매 및 가교제 하에서 실시할 수 있다.
상기 촉매 및 가교제는 화학식 2의 아미노산 또는 화학식 3의 소광제 화합물의 말단 작용기를 아실 할라이드(Cl, F), 아실아지드, 활성화된 에스테르, 아실아이소우레아(카르보다이이미드) 언하이드라이드, 아실록시포스포리움 양이온, 아실우론니움 양이온의 형태로 활성화시키기 위해 사용할 수 있다.
상기 촉매로 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, CMC(1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide), DCC(N,N'-dicyclohexyl carbodiimide), 또는 DIC(diisopropyl carbodiimide)) 등의 카르보다이이미드계 화합물 및 NHS 또는 sulfo-NHS, 카르보다이이미다졸(N,N'-carbonyldiimidazole), 또는 우드워드 리에이젼트 K(woodward's reagent K) 등을 사용할 수 있다.
상기 가교제로 DSP(Dithiobis(succinimidylpropionate)), DTSSP(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)), DSS(Disuccinimidyl suberate), BS3(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), EGS(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate)), DSC(N,N'-Disuccinimidyl carbonate) 등의 Homobifunctional 가교제, 또는, SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SMPT(Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluene), SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate) 등의 heterobifunctional 가교제를 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 화학식 3의 화합물의 아민기를 카보디이미드계 화합물과 NHS를 이용하여 활성화된 에스테르 형태로 만들고 이를 화학식 2의 카르복실기와 반응시킴으로써 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 반응은 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 다이옥산(1,4-dioxane), 또는 메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 등의 용매에서 상온에서 교반하면서 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 디메틸포름아마이드를 사용할 수 있는데, NHS로 활성화된 카르복실기는 디메틸포름아마이드에서 아민기와의 반응성이 매우 강하기 때문이다.
상기 화학식 3의 화합물은 화학식 2의 화합물 1 몰당 1 내지 3몰의 몰 비로 사용하여 프로테아제가 선호하는 아미노산과 소광제 화합물이 결합된 화학식 3의 화합물을 제조할 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물은 예컨대, 일 말단에 보호기가 결합된, 글리신-INH, 라이신-INH, 아르기닌-INH 또는 루신-INH 일 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법에 있어서, 제2단계는 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기를 제거하여 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산과 반응할 수 있는 작용기를 확보하는 단계이다.
상기 아민 보호기는 화학식 4의 화합물을 TFA(trifluoroacetic acid) 및 CH2Cl2(methylene chloride)를 동량 혼합한 혼합 용매에 부가하여 교반을 통해 제거할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법에 있어서, 제3단계는 상기 단계에서 아민 보호기가 제거되어 일 말단에 작용기 특히, 아민기를 갖는 화학식 4의 화합물과 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기를 반응시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계이다.
상기 화학식 1의 화합물은 양 말단의 아민기가 블라킹되어 있는 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기와 화학식 4의 아미노산-이소니아지드의 아민기의 반응을 통해 제조할 수 있다.
상기 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산은 다이타이로신 또는 다이트립토판일 수 있다.
상기 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산은 말단 카르복실기의 최적 반응을 위해 양 말단의 아민기가 보호기로 보호되어 있거나, 블라킹되어 있는 다이아로마틱 아미노산을 사용하는 것이 좋다.
상기 다이아로마틱 아미노산의 블라킹은 아민 보호기를 도입하거나, 다이아로마틱 아미노산의 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 화합물을 처리하여 수행할 수 있다.
상기 보호기의 종류는 공지의 아민 보호기를 사용할 수 있어 특별히 제한하지 않으며, 도입 방법 역시 공지의 방법을 수행할 수 있다.
상기 다이아로마틱 아미노산의 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 화합물은 카르복실기로 개질된 친수성 또는 소수성 화합물, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등을 사용하거나, 아미노산 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 다이아로마틱 아미노산과 프로테아제 선호 아미노산-소광제 화합물의 결합 반응은 촉매 및 가교제 하에서 실시할 수 있다.
상기 촉매 및 가교제는 다이아로마틱 아미노산 또는 화학식 4의 아미노산-소광제 화합물의 말단 작용기를 아실 할라이드(Cl, F), 아실아지드, 활성화된 에스테르, 아실아이소우레아(카르보다이이미드) 언하이드라이드, 아실록시포스포리움 양이온, 아실우론니움 양이온의 형태로 활성화시키기 위해 사용할 수 있다.
상기 촉매 및 가교제의 종류는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 화학식 4의 화합물의 아민기를 카보디이미드계 화합물과 NHS를 이용하여 활성화된 에스테르 형태로 만들고 이를 다이아로마틱 아미노산의 카르복실기와 반응시킴으로써 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, homofunctional 가교제 중 하나인 DSC를 이용하여 화학식 4의 아민기를 활성화된 에스테르 형태로 만든 후 다이아로마틱 아미노산의 아민기와 반응시켜 우레아 결합을 시킬 수 있다.
또한, 상기 반응은 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 다이옥산(1,4-dioxane), 또는 메틸렌 클로라이드(methylene chloride) 등의 단독 또는 2종 이상의 혼합 용매에서 상온에서 교반하면서 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 메틸렌 클로라이드 및 디메틸포름아마이드를 8:2의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있는데, NHS로 활성화된 카르복실기는 디메틸포름아마이드에서 아민기와의 반응성이 매우 강하기 때문이다.
상기 반응 결과, 24시간 내에 높은 수율로 다이아로마틱 아미노산의 양 말단에 프로테아제 선호 아미노산-소광제 화합물이 결합된 고분자를 얻을 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물은 화학식 5의 다이아로마틱 아미노산의 1 몰당 2 내지 5몰의 몰 비로 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 약 3몰의 몰 비로 사용할 수 있다. 상기 범위 내로 사용할 경우, 다이아로마틱 아미노산의 양 말단에 프로테아제 선호 아미노산-소광제가 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 제조방법은 반응 후 제조된 화합물에 대해 용매를 이용한 침전법과 투석(dialysis), 실리카 컬럼(silica column), GPC(gel permeate chromatography), GFC(gel filtration chromatography), 또는 IEC(ion exchange chromatography)를 이용한 분리정제 단계를 추가로 실시할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 센서에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 카뎁신에 의해 펩타이드 결합이 분해되면서 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 회복되어 형광 세기가 증가하므로 카뎁신을 선택적으로 검출하기 위한 형광센서로 사용할 수 있다.
도면 1에서와 같이, 형광 신호화는 다이아로마틱 아미노산 기반 기질에서 프로테아제 선호 아미노산과 소광제 화합물의 펩타이드 결합을 분해하면서 화학식 1의 화합물로부터 소광제 화합물이 분리되고 다이아로마틱 아미노산의 형광성이 회복되어 강한 형광성을 나타내는 턴-온 타입의 형광 신호화 특성을 나타낸다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 수용액에서 카뎁신을 첨가함에 따라 농도의존적으로 284 nm(여기 파장) 및 410 nm(방출 파장)에서 선택적인 형광 증가를 나타내므로 상기 화학식 1의 화합물을 "턴-온(turn-on)" 타입의 형광 프로브(probe)로 사용하여 카뎁신을 검출할 수 있다.
본 발명의 카뎁신 검출용 센서는 카뎁신을 검출하고자 하는 시료용액과 혼합하여 카뎁신의 유무 및 농도를 확인할 수 있는 통상의 키트로 제공될 수 있다.
상기 카뎁신은 카뎁신 B 또는 L 일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 카뎁신을 검출하고자 하는 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 시료에서 발생되는 형광 강도를 측정하는 단계를 포함하는 카뎁신의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 카뎁신을 수용액 상태에서 검출할 수 있는 "턴-온(turn-on)" 타입의 센서로서 형광을 나타내지 않는 상태에서 카뎁신을 감지하면 형광의 세기가 증폭되는 사실을 센서화시킨 타입이다.
본 발명의 카뎁신 검출용 조성물은 화학식 1로 표시되는 화합물 외에 완충용액을 포함할 수 있다. 완충용액의 종류 및 농도는 특별히 제한되지 아니하나, 상기 카뎁신 검출용 조성물의 적용 용도에 따라 적절히 변경할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로는, pH 3 내지 10의 완충용액일 수 있다. 가장 구체적으로는, NaCl 및 EDTA가 포함된 pH 3 내지 10의 인산염 완충용액을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물에 의한 카뎁신의 검출은 형광 강도의 변화를 측정하는 것으로, 카뎁신의 농도 의존적으로 410 nm에서 큰 폭으로 증가된 형광 강도를 나타내므로 이를 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트에 관한 것이다.
카뎁신의 경우, 카뎁신 B는 신경교종 및 흑색종뿐만 아니라 유방암, 결장암, 식도암, 위암, 폐암, 난소암 및 갑상선암에서, 카뎁신 L은 신장 및 고환 종양, 비소세포폐암 및 유방암, 난소암, 결장암, 신장암, 방광암, 전립선암 및 갑상선암에서 고 발현되므로 상기 화학식 1의 화합물은 카뎁신의 형광 검출을 통해 상기 효소를 고 발현하는 질환을 진단할 수 있다.
상기 카뎁신 고 발현 질환 진단은 정상세포의 카뎁신의 형광 강도 대비 질환세포의 카뎁신의 형광 강도를 비교함으로써 실시할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 스크리닝 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 카뎁신 및 카뎁신 억제 후보물질이 포함된 시료와 반응시켜 카뎁신 억제물질이 상기 효소의 활성을 억제하고, 상기 화학식 1의 화합물의 펩타이드 결합의 분해가 억제되므로, 형광 강도의 감소를 측정할 수 있어 이를 통해 카뎁신 억제 후보물질을 스크리닝할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 대조군 시약(양성 및/또는 음성)과 함께 상기 화학식 1의 화합물을 투여 형태로 제형화한 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 필요에 따라, 당-코팅된 정제, 캡슐제, 엘릭서제 및 마이크로캡슐제로서 경구투여될 수 있으며, 또는 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체를 가지는 멸균 용액 또는 현탁제의 주사제 형태로 비경구 투여될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 매질(media), 구체적으로는 멸균수, 생리 식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향신제, 부형제, 비히클(vehicle), 보존제, 결합제등과 혼합될 수 있다. 상기 제제화에서 활성 성분의 양은 바람직한 범위 내에서 적절한 투여량으로 한다.
정제 및 캡슐제에 혼합될 수 있는 첨가제의 예는 젤라틴, 옥수수 녹말, 트라거캔스 고무 및 아라빅 고무와 같은 결합제; 크리스탈 셀룰로스와 같은 부형제; 옥수수 녹말, 젤라틴, 알긴산(alginic acid)과 같은 팽윤제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 설탕, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 및 페퍼민트, 가울테리아 아데노쓰릭스(Gaultheria adenothrix) 오일 및 체리와 같은 향신제이다.
단위-투여 형태가 캡슐일 경우, 오일과 같은 액상 담체가 또한 추가로 상기의 성분에 포함될 수 있다. 주사제용 멸균 합성물들은 주사제에 사용된 멸균수와 같은 비히클을 사용하는 정상 약물 제조법에 따라 제형화될 수 있다. 생리 식염수, 글루코스, 및 D-솔비톨, D-만니톨, D-만노스, 및 염화 나트륨과 같은 보조제를 포함하는 다른 등장액이 주사제의 수용액으로 사용될 수 있다. 이는 알코올, 구체적으로는 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알코올, 폴리솔베이트 80(TM) 및 HCO-50과 같은 비-이온성 계면 활성제와 같은 적합한 용해제와 함께 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 키트 형태로 제조될 수 있어 분석을 수행하기 위한 사용설명서(예, 서면, 테이프, VCR, CD-ROM 등)가 포함될 수 있다. 상기 조성물의 분석 포맷은 당해 기술분야에 알려진 형광분석장치, 예를 들어, Perkin-Elmer LS55 luminescence spectrometer를 이용한 상대형광값이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 카뎁신 검출용 다이타이로신 기반 기질의 합성
Boc-타이로신-OH (Boc-Tyr) (98%), Boc-페닐알라닌-OH (Boc-Phe) (≥99%), Boc-트립토판-OH (Boc-Trp) (≥99%), BOC-글리신-OH (BOC-Gly) (≥99%), BOC-발린-OH (BOC-Val) (≥99%), BOC-루신-OH (BOC-Leu) (≥99%), BOC-타이로신-Osu (BOC-Tyr-Osu) (≥99%), BOC-페닐알라닌-Osu (BOC-Phe-Osu) (≥98%), BOC-트립토판-Osu (BOC-Trp-Osu), INH, N,N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (99%), N,N′-diisopropylcarbodiimide (DIC) (99%), N-hydroxysuccinimide (NHS), L-시스테인, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), Tris-HCl, sodium phosphate monobasic, sodium phosphate dibasic, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) (99%), N,N'-디메틸 포름아마이드(DMF) (99.8%), deuterium oxide (D2O), 디메틸 설폭사이드-D6 ([D6]-DMSO) (99.9%), 및 디메틸 설폭사이드는 모두 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. BOC-라이신(FMOC)-OH (BOC-Lys(FMOC)) (≥98%), BOC-이소루신-OH·0.5H2O (BOC-Ile·0.5H2O) (≥98%), 및 BOC-메티오닌-OH (BOC-Met) (≥98%)는 Novabiochem (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 아세토니트릴 및 물 (HPLC grade)는 Baker Chemical Co. (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. Silica 60 알루미늄 시트는 Merck Co. (Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. MgSO4는 Showa Chemical Industry Co. (Meguro-ku, Tokyo, Japan)에서 구입하였다. PBS 완충용액은 Hyclone Laboratoreis, Inc. (South Logan, Utah, USA)에서 구입하였다. 소듐 클로라이드(Sodium chloride), 칼슘 클로라이드(calcium chloride), 및 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, 99%)는 Duksan Pure Chemical Co. (Ansan, GyonggiDo, Korea)에서 구입하였다. 여과를 위해 기공 크기가 0.2 ㎛인 Advantec PTFE filter membrane (Advantec, Japan)를 사용하였다. 본 발명에 사용된 모든 프로테아제는 Sigma Aldrich에서 구입하였다: 우태아 췌장 유래의 키모트립신 및 트립신, Bacillus licheniformis 유래의 서브틸리신, Tritirachium album 유래의 프로티나아제 K, Bacillus thermoproteolyticus rokko 유래의 써모라이신, 우태아 췌장 유래의 카르복시펩티다아제 A, Bacillus polymyxa 유래의 디스파아제, Clostridium histolyticum 유래의 콜라게나아제, 돼지 위점막 유래의 펩신, Aspergillus saitoi 유래의 아스퍼질로펩신, 파파야 유액 유래의 파페인 및 키모파페인, 파인애플 줄기 유래의 브로멜라인, 사람의 간 유래의 카뎁신 B 및 L, 사람의 비장 유래의 카뎁신 S.
(DBDY-(아미노산-INH)2의 합성)
도 1은 DBDY-(아미노산-INH)2의 합성을 도식적으로 나타내는 것으로, BOC-아미노산과 INH의 결합, BOC의 제거, 및 DBDY의 결합으로 구성된다. 본 발명에서, 9종류의 DBDY-(아미노산-INH)2 를 합성하였다: DBDY-(Tyr-INH)2; DBDY-(Phe-INH)2; DBDY-(Trp-INH)2; DBDY-(Val-INH)2; DBDY-(Gly-INH)2; DBDY-(Ile-INH)2; DBDY-(Leu-INH)2; DBDY-(Met-INH)2; 및 DBDY-(Lys-INH)2.
BOC-Tyr-INH, BOC-Phe-INH, BOC-Trp-INH, 및 BOC-Val-INH는 DMF에 BOC-아미노산(즉, BOC-Tyr, BOC-Phe, BOC-Trp, 및 BOC-Val), INH, 및 DIC를 2:1:2의 몰 비로 혼합하여 합성하였다. 실온에서 오버나이트 동안 반응시킨 후, 동결 건조하여 DMF를 제거하였다. 남아있는 반응물은 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2)로 세척하여 제거하였다. BOC-Gly-INH, BOC-Ile-INH, BOC-Leu-INH, BOC-Met-INH, 및 BOC-Lys(FMOC)-INH는 DMF에 BOC-아미노산, INH, NHS, 및 DCC를 1:2:1:1의 몰 비로 혼합하여 합성하였다. 실온에서 오버나이트 동안 반응시킨 후, 침전물인 N,N'-디클로로헥실우레아(N,N'-dicyclohexylurea)는 여과하여 제거하고, 여과물은 동결 건조하였다. 남아있는 잔여물은 CH2Cl2에 녹이고, 물로 3회 세척하고, 무수 MgSO4로 건조한 후 진공 증발시켰다. 산물은 UV 흡광 검출기(Waters 486 Tunable Absorbance Detector, Meadows Instrumentation Inc., USA)가 장착된 preparative HPLC 시스템에서 분리 정제하였다. 분리 과정은 용출액으로 0.1% TFA를 포함한 물 및 아세토니트릴 혼합물을 사용하여 C-18 컬럼(5 ㎛ 입자 크기, 250 mm×4.6 mm, 80 Å 기공 크기, Phenomenex, USA)에서 수행하였다. 용출은 30분 동안 0%에서 40%까지 아세토니트릴의 직선 구배를 증가하면서 수행하였다. 용출액의 유속 및 분리 온도는 1 mL min-1 및 35℃ 로 유지하였다. 합성된 BOC-아미노산-INH는 TFA/CH2Cl2 (1:1)에 녹이고, 실온에서 30분 동안 교반하여 BOC 기를 제거하였다. 용매 증발 후, 산물은 C-18 컬럼(10 ㎛ 의 입자 크기, 100 mm×21.2 mm, 110 Å 기공 크기, Phenomenex)을 이용하여 preparative HPLC 시스템에서 0.1% TFA를 포함하는 물과 아세토니트릴 혼합물을 용출액으로 사용하여 분리정제 하였다. 용출은 15분 동안 0%에서 40%까지 아세토니트릴의 직선 구배를 증가시키면서 수행하였다. 용출액의 유속 및 분리 온도는 5 mL min-1 및 35℃ 로 유지하였다. 산물은 210nm 및 280nm의 파장에서 검출하였다. 순수 아미노산-INH를 함유하는 분획을 붓고 동결 건조하였다.
DBDY의 합성 방법은 D.I. Lee 등, "Large-scale production of N,N-diBoc-dityrosine and dityrosine by HRP-catalyzed N-Boc-L-tyrosine oxidation and one-step chromatographic purification", Process Biochem. 46 (2011) 142-147에 구체적으로 개시되어 있다.
DBDY 및 아미노산-INH의 결합을 위해, CH2Cl2/DMF(8:2)에서 DBDY, 아미노산-INH, NHS, 및 DCC를 1:3:2.1:2.1의 몰 비로 혼합하였다. TEA를 아미노산-INH과 같은 몰로 상기 용액 내에 미리 부가하여 두었다. 실온에서 오버나이트 동안 반응시킨 후, 침전물, N,N'-디클로로헥실우레아는 여과하여 제거하고, 여과물은 동결 건조하였다. 남아있는 반응물은 물로 세척하여 제거하였다. 물에 녹지 않는 침전물은 preparative HPLC 시스템을 이용하여 분리정제하였다.
사이드 체인(-(CH2)3CH2NH2)을 갖는 라이신의 경우, DBDY에 사이드 체인이 결합하는 것을 억제하기 위해 BOC-Lys(FMOC)-OH를 사용하였다. DBDY-(Lys(FMOC)-INH)2의 분리정제 후, 20% 피페리딘을 함유하는 DMF 용액에 용해시켜 FMOC를 제거하였다. 혼합물은 실온에서 30분 동안 교반하고, 동결 건조하였다. DMF-에틸 에테르에서 재결정 후, 침전물은 여과하여 회수하고, preparative HPLC 시스템을 이용하여 분리정제 하였다.
DBDY-(아미노산-INH)2 의 구조 동정은 Bruker Advance 500-MHz nuclear magnetic resonance spectrometer(Bruker BioSpin Corp., Germany)에서 기록된 1H-NMR 스펙트럼을 기반으로 하여 수행하였다.
(BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH의 합성)
시스테인 프로테아제의 선택적 분석을 위한 DBDY의 효과를 평가하기 위해, DBDY 없는 기질(즉, BOC-아미노산-INH) 및 P2 위치에 아로마틱 아미노산이 있는 기질(즉, BOC-아로마틱 아미노산-아미노산-INH)를 합성하고, DBDY-(아미노산-INH)2과 비교하였다.
이를 위해, BOC-아로마틱 아미노산과 Gly-INH 및 Lys(FMOC)-INH를 결합하여 BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH를 제조하였다. DMF에 포함된 BOC-아로마틱 아미노산-Osu 용액과 DMF에 포함된 Gly-INH 또는 Lys(FMOC)-INH 용액을 1:1의 몰비로 혼합하였다. TEA는 Gly-INH 및 Lys(FMOC)-INH 용액과 같은 몰로 미리 첨가해 두었다. 실온에서 오버나이트 동안 반응 시킨 후, 잔여물을 동결 건조하였다. 남아있는 반응물은 물과 CH2Cl2로 세척하여 제거하였다. BOC-아로마틱 아미노산-Lys(FMOC)-INH의 경우, FMOC 기를 제거하였다. 산물(즉, BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH)는 preparative HPLC 시스템을 이용하여 분리 정제하고, 그들의 구조는 그들의 1H-NMR 스펙트럼을 이용하여 동정하였다.
(이소니아지드 및 아미노산의 소거 효율)
DBDY-(아미노산-INH)2에서 INH 및 아미노산의 소거 효율을 비교하기 위해, INH 및 아미노산의 여부에 따라 DBDY의 형광을 측정하였다. 재흡수 및 재방출 효과를 제거하기 위해, PBS 완충용액(pH 7.4, 25℃) 에서 DBDY의 농도를 0.25 μM로 조정하는 반면, 타이로신을 제외하고, INH 및 아미노산의 농도는 10mM로 하였다. pH7.4 PBS 완충용액에서의 낮은 용해성으로 인해 타이로신은 5mM로 부가하였다. 형광 강도는 PerkinElmer LS 55 luminescence spectrometer를 이용하여 측정하였다. 여기 파장(λex) 및 방출 파장(λem)은 각각 320 nm 및 410 nm로 하였다.
(프로테아제에 의해 촉매된 가수분해)
프로테아제들의 의미 있는 비교를 위해, 다른 문헌(키모트립신, 서브틸리신, 써모라이신 및 펩신에 대해서는 R. Beynon, J.S. Bond, Proteolytic Enzymes (Second Edition), Oxford University Press, 2001, pp. 295-316를 참조; 트립신, 프로티나아제 K, 카복시펩티다아제 A, 콜라게나아제, 디스파아제, 아스퍼질로펩신, 파페인, 키모파페인, 브로메라인, 카뎁신 B, 카뎁신 L, 및 카뎁신 S에 대해서는 시그마-알드리치 사의 카달로그를 참조함)에서 보고된 최적 조건에서 가수분해 반응을 수행하였다.
표 1은 이들 16종의 프로테아제들에 대한 반응 조건을 요약한 것이다.
표 1
Figure PCTKR2013001093-appb-T000001
반응 전에, 반응 완충용액과 프로테아제의 혼합물을 분석 온도로 온도를 조정한 수조에서 30분 동안 미리 인큐베이션 하였다. 가수분해 반응은 DMSO에서 녹인 기질을 부가하여 개시하였다. 부가된 기질 용액의 부피는 DMSO의 최종 농도가 1.5%(v/v) 보다 낮도록 제어하였다.
DBDY-(아미노산-INH)2의 가수분해 시, PerkinElmer LS 55 luminescence spectrometer를 사용하여 DBDY의 회복된 형광을 측정하였다. 파페인, 키모파페인, 브로멜라인, 카뎁신류, 아스퍼질로펩신 및 펩신에 대해서는 λex 및 λem는 284 nm 및 410 nm로 하는 한편, 키모트립신, 트립신, 서브틸리신, 프로티아나제 K, 써모라이신, 카복시펩티다아제 A, 콜라게나아제 및 디스파아제에 대해서는 λex=320 nm 및 λemm=410 nm로 하며, 반응은 알칼리 조건에서 수행하였다.
DBDY-(아미노산-INH)2를 부가하자 마자, 형광을 측정하고, 초기 형광으로 표시하였다. 반응 말기에 측정된 형광은 최종 형광으로 표시하였다. 증가된 형광을 그들의 차이로 정의하였고, 이는 생성된 DBDY (또는 DBDY-(아미노산)2) 및 반응된 DBDY-(아미노산-INH)2간의 형광에서의 차이와 동일하다.
가수분해 산물은 HPLC 시스템을 사용하여 분석하였다. 샘플을 제조하기 위해, 가수분해 반응은 세린, 시스테인 및 메탈로프로테아제에 대해서는 2% (v/v) 1M HCl를, 아스파틱 프로테아제에 대해서는 1M NaOH를 부가하여 종결시켰다. 분리는 용출액으로 10 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate) 및 아세토니트릴(acetonitrile)의 혼합물을 사용하여 C-18 컬럼 (5 ㎛ 입자 크기, 250 mm×4.6 mm, 80 Å 기공 크기, Phenomenex, USA)에서 수행하였다. 용출은 15분 동안 0%에서 60%까지의 아세토니트릴의 직선 구배를 높이면서 수행하였다. 용출액의 유속 및 분리 온도는 1 mL min-1 및 35℃로 유지하였다. 산물은 254nm 파장에서 검출하였다.
<실험예 1> DBDY-(아미노산-INH)2의 합성 및 특성 규명
합성된 DBDY-(아미노산-INH)2의 순도 및 화학 구조는 HPLC 크로마토그램 및 1H NMR 스펙트럼(Bruker Advance 500-MHz nuclear magnetic resonance spectrometer (Bruker BioSpin Corp., Germany))으로부터 측정하였다. 도 2는 DBDY-(Gly-INH)2에 대한 결과를 나타낸 것으로, HPLC 크로마토그램은 DBDY-(Gly-INH)2 (RT=20.1 min)의 존재를 나타내고, DBDY (RT=28.0 min) 및 Gly-INH (RT=2.9 min)를 부재를 나타내며, RT는 체류시간을 의미한다. 종류 별 DBDY-(아미노산-INH)2의 화학식 구조 및 d6-DMSO에서 1H NMR 스펙트럼 결과는 도 2 내지 10에 나타내었다.
DBDY-(아미노산-INH)2 에 있는 INH 또는 아미노산의 존재에서 DBDY의 형광 강도를 측정하였고, DBDY 자체의 형광 강도에 대한 그것의 비율을 상대 형광 양자 수득률(relative fluorescence quantum yield)로 정의하였다(표 2 참조).
표 2
Figure PCTKR2013001093-appb-T000002
INH 만이 타이로신 및 트립토판의 존재 하에서(즉, φf,rel(DBDY,Tyr) 및 φf,rel(DBDY, Trp)) DBDY의 의미 있는 형광 소거, φf,rel를 나타냈고, 1.0 보다 더 높았다. 이는 5 mM 타이로신 및 10 mM 트립토판의 형광 강도가 0.25 μM DBDY의 것에 부가되었기 때문이다. 같은 농도에서 측정할 때(λex=320 nm 및 λem=410 nm), DBDY의 형광 강도는 타이로신 및 트립토판에 비해 각각 약 11,000 및 4,300배 더 높았다. 그러므로, INH는 DBDY-(아미노산-INH)2에서 형광 소거에 주도적으로 영향을 미치며, DBDY의 형광은 가수분해 산물이 DBDY-(아미노산)2일 때만 나타났다.
<실험예 2> 프로테아제 분석을 위한 DBDY-(아미노산-INH)2 의 선택성 평가
카뎁신을 제외하고 13종의 프로테아제의 선택적 분석을 위해 9종류의 DBDY-(아미노산-INH)2 를 시험하였고, 실험 결과는 도 11 내지 19에 도시하였다. 각 기질 및 프로테아제의 초기 농도는 각각 2.5 μM 및 0.1 μM로 하였다. 가수분해 반응은 2시간 수행하였다. X-축에 있는 첨자, C1=papain; C2=chymopapain; C3=bromelain; S1=chymotrypsin; S2=trypsin; S3=subtilisin; S4=proteinase K; M1=thermolysin; M2=carboxypeptidase A; M3=dispase; M4=collagenase; A1=pepsin; 및 A2=aspergillopepsin를 뜻한다. 각 실험은 최소 3회 반복하였다.
시험된 기질 중 어느 것도 아스파틱 프로테아제(즉, 펩신 및 아스퍼질로펩신) 및 카르복시펩티다아제 A에 의해 가수분해되는 것은 없었다. 도 11에 나타난 바와 같이, DBDY-(Gly-INH)2 는 시스테인 프로테아제에 대해 민감도와 선택도를 나타냈고(즉, 다른 프로테아제에 의해서는 가수분해가 일어나지 않음), 이는 DBDY(P2 위치) 및 Gly(P1 위치)의 쌍방향 효과에서 기인한 것으로 보인다.
거의 모든 파페인 유사 시스테인 프로테아제들과 트립신은 P1 위치에서 라이신을 선호한다는 보고와 일치하게도, DBDY-(Lys-INH)2 는 시스테인 프로테아제뿐만 아니라 트립신에 의해서도 가수분해 되었다(도 12 참조). 써모라이신 및 디스파아제는 P1' 위치에서 Phe, Ile, Leu, Met, 및 Val를 갖는 펩타이드를 선호한다는 보고가 있다. 이 보고와도 일치하게, DBDY-(Phe-INH)2, DBDY-(Ile-INH)2, DBDY-(Leu-INH)2, DBDY-(Met-INH)2, 및 DBDY-(Val-INH)2 는 써모라이신 및 디스파아제에 매우 민감함을 나타냈고(도 12 내지 17), 가수분해 산물은 Phe-INH, Ile-INH, Leu-INH, Met-INH, 및 Val-INH 이었다(미도시됨).
시스테인 프로테아제에 대한 선택도는 비록 후자가 트립신에 의해 약간의 가수분해를 나타내긴 하였으나, DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2에서 자명하였다.
<실험예 3> 시스테인 프로테아제에 의한 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 의 선택적 가수분해에 대한 다이타이로신의 효과
시스테인 프로테아제에 의한 선택적 가수분해 시 다이타이로신의 영향을 조사하기 위해, DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2에서 DBDY 대신 BOC-아미노산으로 치환하였다. 거의 모든 파페인 유사 시스테인 프로테아제는 P2 위치에 페닐알라닌 같은 소수성 아미노산을 선호한다는 보고를 기반으로, BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH를 특별히 제조하고 키모트립신, 트립신, 파페인, 펩신 및 써모라이신에 대한 기질로서 시험하였다. 실험 결과는 표 3에 요약하였다.
표 3
Figure PCTKR2013001093-appb-T000003
P1 위치에서 아로마틱 아미노산과 같은 소수성 아미노산에 대해 특이성을 갖는 것으로 알려진 키모트립신과의 반응에서만 DY의 영향이 뚜렷했다. 시험된 BOC-아로마틱 아미노산-Gly-INH 및 BOC-아로마틱 아미노산-Lys-INH 모두 키모트립신에 의해 가수분해 되었고(표 3 참조), 반응 산물은 Gly-INH 및 Lys-INH였다(미도시됨). 그러나, DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 는 키모트립신에 의해 거의 가수분해되지 않았다. 비록 다이타이로신이 소수성이기는 하지만, 키모트립신의 활성 부위에 꼭 맞을 만큼 벌키하지는 않는 것으로 생각된다.
<실험예 4> 카뎁신 B, L 및 S에 대한 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 의 선택도
카뎁신 B, L 및 S는 시스테인 프로테아제로 분류되므로, 이들 카뎁신에 의한 선택적 가수분해를 위해 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 를 시험하였다. 실험 결과는 도 20에 도시하였다. 카뎁신 B에 의한 가수분해는 파페인 및 키모파페인에 의한 것 보다 훨씬 빨랐기 때문에, 도 20에서 반응은 실험예 2(기질(2.5 μM) 및 프로테아제(0.1 μM)의 농도에서 2시간 동안 반응시킴)에 비해 기질(1.0 μM) 및 프로테아제(10 nM)의 농도를 더 낮게 하여 30분 동안 실시하였다. X-축에 표시된 C1, C2, CB, CL, 및 CS는 각각 파페인, 키모파페인, 카뎁신 B, 카뎁신 L, 및 카뎁신 S를 나타낸다. 각 실험은 최소 3회 반복하였다.
예상대로, DBDY-(Lys-INH)2 는 카뎁신 B 및 L에 의해 가수분해되었다. 그러나, 흥미롭게도, DBDY-(Gly-INH)2 는 카뎁신 B에 의해서만 가수분해되었다. 카뎁신 S는 P2 위치에서 아로마틱 아미노산이 아닌 지방족 아미노산을 선호하는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 DBDY-(Lys-INH)2 및 DBDY-(Gly-INH)2는 카뎁신 S에 의해 가수분해되지 않았다.
가수분해 산물을 동정하기 위해 HPLC 분석을 하고, 카뎁신 B와의 반응 결과를 도 21에 도시하였다. 각 기질 및 카뎁신 B의 초기 농도는 각각 0.1 mM 및 0.1 μM이다. 반응은 5시간 수행하였다.
HPLC 크로마토그램 둘 다에서, 체류시간(retention time, RT) 8분에서 INH에 대한 피크가 발견되는 반면, Gly-INH (RT=4.9 min) 및 Lys-INH (RT=7.1 min)에 대한 피크는 나타나지 않았다. 카뎁신 B는 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2의 가수분해 시 P1 위치 아미노산으로서 글리신과 라이신을 인식하였다. 카뎁신 L은 또한 DBDY-(Lys-INH)2의 가수분해 시 P1 위치 아미노산으로 라이신을 인식하였다(카뎁신 L에 대한 HPLC 크로마토그램은 도시되지 않음).
시스테인 프로테아제에 의한 DBDY-(Gly-INH)2 및 DBDY-(Lys-INH)2 의 가수분해는 Michaelis-Menten kinetics를 따르는 것으로 확인되었다. 표 4는 카이네틱스 파라미터를 요약한 것이다.
표 4
Figure PCTKR2013001093-appb-T000004
KM 값은 1.17 μM 내지 12.9 μM의 범위를 나타냈고, 다른 프로테아제 분석 물질에 대해 보고된 것에 비해 꽤 낮았다(4.6-404 μM). 특히, DBDY-(Gly-INH)2 에 대한 카뎁신 B의 KM 값은 2.88 μM이었고, 다른 물질에 대한 카뎁신 B에 필적할만하였다. 즉, Abz-Phe-Phe-Dap(Dnp)-Trp-OH 에 대해서는 2.1 μM, Abz-Phe-Arg-Dap(Dnp)-Trp-OH 에 대해서는 3.0 μM, Abz-Gly-Ile-Val-Arg-Ala-Lys(Dnp)-OH에 대해서는 5.9 μM임. Abz 및 Dap(Dnp)는 각각 o-aminobenzoyl 및 3-(2,4-dinitrophenyl)-2,3-diaminopropionic acid를 뜻한다.
자동 펩타이드 합성을 위한 비싸고 복잡한 장비를 이용할 필요가 없다는 점에서, DBDY-(Gly-INH)2는 카뎁신 B의 선택적이고 민감한 분석에 유용하다.
결론적으로, 다이아로마틱 아미노산을 프로테아제 선호 아미노산 및 이소니아지드의 2 분자와 결합시켜 프로테아제 분석을 위한 기질로 사용가능한지 시험한 결과, DBDY-(아미노산-INH)2에서 DBDY (λex=284~320 nm; λem=400~420 nm)의 형광은 INH의 소거 효과로 인해 사라졌으나, 아미노산-INH 또는 INH의 방출을 유도하는 프로테아제에 의해 촉매된 가수분해 시 형광은 회복되었다. 특히 카뎁신 B 및 L은 DBDY-(Lys-INH)2 및 DBDY-(Gly-INH)2에 의해 민감하고 선택적으로 분석되었다.
본 발명은 카뎁신 검출 키트, 암 진단제, 약물 스크리닝에 사용할 수 있다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000022
    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000023
    또는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000024
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000025
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 화합물.
  3. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;
    하기 화학식 4의 화합물에서 아민 보호기(R1)를 제거하는 단계; 및
    아민 보호기(R1)가 제거된 화학식 4의 화합물과 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1의 화합물의 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000026
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000027
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000028
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000029
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000030
    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000031
    또는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000032
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  4. 제3항에 있어서,
    화학식 4의 화합물 또는 화학식 1의 화합물을 제조하는 반응은 촉매 및 가교제 하에서 실시하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    촉매는 카르보다이이미드계 화합물(carbodiimide) 및 NHS 또는 sulfo-NHS, 카르보다이이미다졸(carbodiimidazole), 또는 우드워드 리에이젼트 K(woodward's reagent K) 중 적어도 하나인 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    가교제는 DSP(Dithiobis(succinimidylpropionate)), DTSSP(3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate)), DSS(Disuccinimidyl suberate), BS3(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), EGS(Ethylene glycolbis(succinimidylsuccinate)), DSC(N,N'-Disuccinimidyl carbonate), SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SMPT(Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluene) 및 SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  7. 제3항에 있어서,
    화학식 3의 화합물은 화학식 2의 화합물 1 몰 당 1 내지 3 몰의 몰 비로 첨가하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  8. 제3항에 있어서,
    화학식 4의 화합물 또는 화학식 1의 화합물을 제조하는 반응은 디클로로메탄(dichloromethane), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 다이옥산(1,4-dioxane) 및 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유기용매 하에서 실시하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  9. 제3항에 있어서,
    화학식 4의 화합물은 화학식 5의 화합물 1 몰 당 2 내지 5 몰의 몰 비로 첨가하는 화학식 1의 화합물의 제조방법.
  10. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 센서:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000033
    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000034
    또는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000035
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  11. 제10항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000036
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 검출용 센서.
  12. 제10항에 있어서,
    카뎁신은 카뎁신 B 또는 L인 카뎁신 검출용 센서.
  13. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 검출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000037
    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000038
    또는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000039
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  14. 제13항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000040
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 검출용 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    pH 3 내지 10인 NaCl 및 EDTA가 포함된 인산염 완충용액을 더 포함하는 카뎁신 검출용 조성물.
  16. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000041
    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000042
    또는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000043
    를 나타내며,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  17. 제16항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000044
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 고 발현 질환 진단 키트.
  18. 제16항에 있어서,
    질환은 암인 키트.
  19. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000045
    상기 식에서,
    X1은 글리신, 라이신, 아르기닌 또는 루신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000046
    또는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000047
    를 나타내고,
    R1은 아민 보호기를 나타낸다.
  20. 제19항에 있어서,
    X1은 글리신 또는 라이신을 나타내고,
    X2는
    Figure PCTKR2013001093-appb-I000048
    를 나타내며,
    R1은 터트-부틸록시카보닐기, 9-플루오레닐메틸록시카보닐기, 벤질록시카보닐기, 폴리에틸렌글리콜, 또는 NH2CHR'n-이고, 여기서, R'는 아미노산 모이어티이고, n은 1 내지 20을 나타내는 카뎁신 억제물질의 스크리닝용 조성물.
PCT/KR2013/001093 2012-10-16 2013-02-13 카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질 WO2014061882A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/435,884 US20150293106A1 (en) 2012-10-16 2013-02-13 Diaromatic amino acid substrate for cathepsin detection

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0114666 2012-10-16
KR1020120114666A KR101385855B1 (ko) 2012-10-16 2012-10-16 카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2014061882A1 true WO2014061882A1 (ko) 2014-04-24
WO2014061882A9 WO2014061882A9 (ko) 2015-01-22

Family

ID=50488419

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/001093 WO2014061882A1 (ko) 2012-10-16 2013-02-13 카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20150293106A1 (ko)
KR (1) KR101385855B1 (ko)
WO (1) WO2014061882A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19980703261A (ko) * 1995-03-24 1998-10-15 다니엘 이이치. 페트리 가역성 프로테아제 억제제
KR20020058076A (ko) * 1999-12-03 2002-07-12 개리 이. 프라이드만 피코르나바이러스 억제 화합물 및 조성물, 이들의 약학적용도, 및 이들의 합성을 위한 물질

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR19980703261A (ko) * 1995-03-24 1998-10-15 다니엘 이이치. 페트리 가역성 프로테아제 억제제
KR20020058076A (ko) * 1999-12-03 2002-07-12 개리 이. 프라이드만 피코르나바이러스 억제 화합물 및 조성물, 이들의 약학적용도, 및 이들의 합성을 위한 물질

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WYSOCKA, M. ET AL.: "New chromogenic substrates of human neutrophil cathepsin G containing non-natural aromatic amino acid residues in position P1 selected by combinatorial chemistry methods", MOLECULAR DIVERSITY, vol. 11, no. 2, 2007, pages 93 - 99 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014061882A9 (ko) 2015-01-22
US20150293106A1 (en) 2015-10-15
KR101385855B1 (ko) 2014-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI94254C (fi) Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten peptidijohdannaisten valmistamiseksi
US4086136A (en) Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase
NO142812B (no) Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater
Myers et al. Facile incorporation of urea pseudopeptides into protease substrate analogue inhibitors
Bernhardt et al. The solid‐phase synthesis of side‐chain‐phosphorylated peptide‐4‐nitroanilides
Lapeyre et al. Aryldithioethyloxycarbonyl (Ardec): a new family of amine protecting groups removable under mild reducing conditions and their applications to peptide synthesis
JP2009503077A (ja) 複素環式ボロン酸およびその誘導体を調製するための方法
WO2014061882A1 (ko) 카뎁신 검출용 다이아로마틱 아미노산 기질
NZ193077A (en) Peptides with ubiquitin-like activity; and pharmaceutical compositions
US3853838A (en) Sedative peptides related to acth containing a d-phe moiety
CA1105925A (en) Pentapeptide compositions and methods
Wu et al. A novel high-yield synthesis of aminoacyl p-nitroanilines and aminoacyl 7-amino-4-methylcoumarins: important synthons for the synthesis of chromogenic/fluorogenic protease substrates
Van Leeuwen et al. The synthesis of amides and dipeptides from unprotected amino acids by a simultaneous protection–activation strategy using boron trifluoride diethyl etherate
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
Basak et al. Aminoethyl benzenesulfonyl fluoride and its hexapeptide (Ac-VFRSLK) conjugate are both in vitro inhibitors of subtilisin kexin isozyme-1
SE443789B (sv) Psykofarmakologiskt aktiva peptider
Senten et al. Polymer-assisted solution-phase parallel synthesis of dipeptide p-nitroanilides and dipeptide diphenyl phosphonates
CA1059938A (en) Process for producing a peptide
Choi et al. Orthogonality and compatibility between Tsc and Fmoc amino-protecting groups
HIRATA et al. Synthesis of human angiotensinogen (1‐17) containing one of the putative glycosylation binding sites and its hydrolysis by human renin and porcine pepsin
KR102574341B1 (ko) 아미노산 특이적 차단제 및 이의 용도
Dutta et al. Inhibitors of human renin. Cyclic peptide analogs containing a D-Phe-Lys-D-Trp sequence
Bérubé et al. Convenient route to Fmoc-homotyrosine via metallaphotoredox catalysis and its use in the total synthesis of anabaenopeptin cyclic peptides
Sato et al. Late-stage macrolactonisation enabled by tandem acyl transfers followed by desulphurisation
JPS5837840B2 (ja) ペプチドの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13847028

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14435884

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13847028

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1