WO2014046174A1 - 組換え細胞、並びに、β－フェランドレンの生産方法 - Google Patents

組換え細胞、並びに、β－フェランドレンの生産方法 Download PDF

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ferrandrene
synthase
nucleic acid
amino acid
acid sequence
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古谷　昌弘
章太 上西
航一郎 岩佐
郡　悌之
高橋　征司
武文 下山
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積水化学工業株式会社
国立大学法人東北大学
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    • C12Y205/01028—Dimethylallylcistransferase (2.5.1.28)
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    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03051—Beta-phellandrene synthase (neryl-diphosphate-cyclizing) (4.2.3.51)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant cell having the ability to produce ⁇ -ferrandrene, and a method for producing ⁇ -ferrandrene using the recombinant cell.
  • Monoterpene is a compound that follows the isoprene rule with 10 carbons, which is a biosynthetic precursor of geranyl diphosphate (GPP) in which dimethylallyl diphosphate (DMAPP) and isopentenyl diphosphate (IPP) are condensed. It is a generic name. Currently, over 900 types of monoterpenes are known.
  • Monoterpenes have a fragrance like roses and citrus fruits and are often used for perfumes.
  • limonene is an aroma component contained in citrus fruits such as lemon, and is also used as a solvent and an adhesive raw material.
  • Menthol has a refreshing fragrance and is used as a refreshing agent in confectionery and pharmaceuticals.
  • ⁇ -pinene, ⁇ -pinene, limonene, ⁇ -ferrandolene and the like are studied as monomer raw materials for adhesives and transparent resins (Non-patent Document 1).
  • ⁇ -Phellandrene a kind of monoterpene, is expected to be used as a new polymer material.
  • ⁇ -Ferlandolene may give a higher molecular weight polymer than ⁇ -Ferlandolene.
  • ⁇ -ferrandolene is obtained by a synthetic chemical method, formation of ⁇ -ferrandolene, which is an isomer, is unavoidable, and separation of these isomers is extremely difficult (Non-patent Document 2). ). For this reason, it is difficult to obtain high-purity ⁇ -ferrandolene, which makes it difficult to investigate the polymer physical properties of ⁇ -ferrandolene.
  • the biosynthetic pathway of ⁇ -ferrandrene includes geranyl diphosphate (IPP) to geranyl diphosphate (IPP) by the action of geranyl diphosphate (GPP) synthase or neryl diphosphate (NPP) synthase. GPP) or neryl diphosphate (NPP) is biosynthesized.
  • GPP geranyl diphosphate
  • NPP neryl diphosphate
  • ⁇ -ferrandolene is biosynthesized from GPP or NPP by the action of ⁇ -ferrandolene synthase.
  • ⁇ -ferrandrene synthase has been found in tomato and lavender (Non-patent Documents 3 and 4).
  • Patent Document 1 describes a method for producing a monoterpene using a transformant of a C1 metabolic host cell into which a nucleic acid encoding a cyclic terpene synthase (cyclic terpene synthase) has been introduced.
  • a nucleic acid encoding a cyclic terpene synthase cyclic terpene synthase
  • limonene was produced using a transformant of the genus Methylomonas
  • ⁇ -ferrandrene no examples are given.
  • There are also references to ⁇ -ferrandolene synthase but specific examples and methods for obtaining ⁇ -ferrandolene synthase and its genes, as well as specific configurations and construction methods for transformants capable of producing ⁇ -ferrandolene are shown. Not.
  • an object of the present invention is to provide a series of techniques for obtaining ⁇ -ferrandrene in high purity and in large quantities.
  • At least one nucleic acid selected from the group consisting of a nucleic acid encoding geranyl diphosphate synthase and a nucleic acid encoding neryl diphosphate synthase, It is a recombinant cell having the ability to produce ⁇ -ferrandrene, wherein a nucleic acid encoding ⁇ -ferrandrene synthase is introduced into a host cell, and these nucleic acids are expressed in the host cell.
  • the present invention relates to a recombinant cell having the ability to produce ⁇ -ferrandrene.
  • the recombinant cell of the present invention is “at least one nucleic acid selected from the group consisting of a nucleic acid encoding a geranyl diphosphate (GPP) synthase and a nucleic acid encoding a neryl diphosphate (NPP) synthase”, “Nucleic acid encoding ⁇ -ferrandrene synthase” is introduced into a host cell, and these nucleic acids are expressed in the host cell.
  • GPP geranyl diphosphate
  • NPP neryl diphosphate
  • GPP is synthesized from isopentenyl diphosphate (IPP) by the action of GPP synthase expressed in the cell, and / or by the action of NPP synthase expressed in the cell.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • NPP is synthesized from IPP.
  • ⁇ -ferrandolene is synthesized from GPP and / or NPP by the action of ⁇ -ferrandolene synthase expressed in cells.
  • the host cell does not have methane monooxygenase.
  • the host cell is E. coli or yeast.
  • ⁇ -ferrandol Preferably, 10 mg or more of ⁇ -ferrandol can be produced per 1 g of wet cells of the recombinant cells.
  • the nucleic acid encoding geranyl diphosphate synthase encodes the following protein (a), (b) or (c).
  • C a protein having an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the activity of geranyl diphosphate synthase.
  • the nucleic acid encoding neryl diphosphate synthase encodes the following protein (d), (e) or (f).
  • F A protein having an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having the activity of neryl diphosphate synthase.
  • the nucleic acid encoding ⁇ -ferrandrene synthase encodes the following protein (g), (h) or (i).
  • a nucleic acid encoding at least one enzyme acting in the isopentenyl diphosphate synthesis pathway is further introduced, and the nucleic acid is expressed in the host cell.
  • IPP serving as a substrate for GPP synthase or NPP synthase is efficiently supplied.
  • the synthesis route of isopentenyl diphosphate is the mevalonate route.
  • the mevalonate pathway is a mevalonate pathway of yeast or actinomycetes.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing ⁇ -ferrandrene, wherein the recombinant cells are cultured to produce ⁇ -ferrandrene.
  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -ferrandrene.
  • ⁇ -ferrandrene is produced in the recombinant cells by culturing the above-described recombinant cells.
  • ⁇ -ferrandrene can be produced in high purity and in large quantities.
  • ⁇ -ferrandrene is produced per 1 g of wet cells of the recombinant cells.
  • ⁇ -ferrandolene released outside the recombinant cells is recovered.
  • ⁇ -ferrandrene is recovered from the gas phase of the recombinant cell culture system.
  • ⁇ -ferrandrene can be produced in high purity and in large quantities.
  • FIG. 5 is a total ion chromatogram showing the results of GC-MS analysis of the gas phase fraction of the culture performed in Example 5, wherein (a) is a control recombinant, and (b) is ⁇ -ferrandrene-producing ability. This is the case of recombinants having the same.
  • FIG. 1B is a mass spectrum showing the result of identifying each peak in FIG. 1B by GC-MS, where FIG. 1A is peak A ( ⁇ -ferrandrene), FIG. 1B is peak B (limonene), and FIG. This is the case for peak C (Myrcene).
  • the recombinant cell of the present invention comprises at least one nucleic acid selected from the group consisting of a nucleic acid encoding geranyl diphosphate (GPP) synthase and a nucleic acid encoding neryl diphosphate (NPP) synthase, and ⁇ - It is a recombinant cell in which a nucleic acid encoding ferrandolene synthase is introduced into a host cell, and these nucleic acids are expressed in the host cell, and has the ability to synthesize ⁇ -ferrandrene.
  • GPP geranyl diphosphate
  • NPP neryl diphosphate
  • the GPP synthase is not particularly limited as long as it can exhibit the enzyme activity in a recombinant cell.
  • GPP synthase examples include those derived from Arabidopsis thaliana (GenBank Accession No .: Y17376 / At2g34630; Bouvier, F., et al., Plant J ,. 2000, 24, 241-52.), Those derived from Mycobacterium tuberculosis; (GenBank Accession No .: NP — 215504; Mann, FM, et al., FEBS Lett., 2011, 585, 549-54.), And the like.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence of the nucleic acid (DNA) encoding the Arabidopsis thaliana-derived GPP synthase
  • SEQ ID NO: 2 shows only the amino acid sequence.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an example of a nucleic acid encoding GPP synthase.
  • the nucleic acid encoding the GPP synthase includes at least a nucleic acid encoding the following protein (a), (b), or (c).
  • C a protein having an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having the activity of geranyl diphosphate synthase.
  • the homology of the amino acid sequence in (c) is more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • NPP synthase examples include those derived from tomato (Solanum lycopersicum) (GenBank Accession No .: FJ797956).
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence corresponding to the base sequence of the nucleic acid (DNA) encoding the tomato-derived NPP synthetase, and SEQ ID NO: 4 shows only the amino acid sequence.
  • the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is an example of a nucleic acid encoding NPP synthase.
  • the nucleic acid encoding NPP synthase includes at least a nucleic acid encoding the following protein (d), (e), or (f).
  • (D) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • (E) a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having the activity of neryl diphosphate synthase
  • the amino acid sequence homology in (f) is more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • nucleic acid encoding geranyl diphosphate (GPP) synthase and “nucleic acid encoding neryl diphosphate (NPP) synthase”. May have been introduced, or both nucleic acids may be introduced.
  • ⁇ -ferrandrene synthase and nucleic acid encoding the same include those derived from tomato (Solanum lycopersicum) (GenBank Accession No .: FJ797957; Schilmiller, AL, et al., Proc Natl Acad Sci US A., 2009, 106, 10865-70.), Lavender (Lavandula angustifolia) (GenBank Accession No .: HQ404305; Demissie, ZA, et al., Planta, 2011 ,. 233, 685-96), etc. .
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence corresponding to the base sequence of the nucleic acid (DNA) encoding the tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase
  • SEQ ID NO: 6 shows only the amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence corresponding to the base sequence of the nucleic acid (DNA) encoding the lavender-derived ⁇ -ferrandrene synthase
  • SEQ ID NO: 8 shows only the amino acid sequence.
  • the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 7 is an example of a nucleic acid encoding ⁇ -ferrandrene synthase.
  • the nucleic acid encoding ⁇ -ferrandrene synthase includes at least a nucleic acid encoding the following protein (g), (h) or (i).
  • (G) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8,
  • (H) a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or 8, and having the activity of ⁇ -ferrandrene synthase
  • the homology of the amino acid sequence in (i) is more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • the host cell in the recombinant cell of the present invention is not particularly limited, and may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • prokaryotic cells include bacteria and actinomycetes.
  • bacteria include Escherichia bacteria such as E. coli, Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, Pseudomonas bacteria, cyanobacteria (Cyanobacteria), Clostridium bacteria, Examples include bacteria belonging to the genus Corynebacterium and bacteria belonging to the genus Ralstonia. Among these, Escherichia coli which can be easily cultured in large quantities is particularly preferable.
  • eukaryotic cells include yeast, filamentous fungi, eukaryotic microalgae, plant cells, and animal cells.
  • yeasts examples include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces staticacvar sacchartices Candida tropicalis, Candida maltosa, Candida parapsilosis, Pichia pastoris, Pichia farinosa, Pichia pinus (Pichia pinus) ⁇ Pichia varijii, Pichia fermentans, Pichia guilliermondii, Pichia stipitis, Saccharomyces Telluris (Saccharomyces elluris), Candida utilis, Candida guilliermondii, Hansenula henricii, Hansenula sensensen, ula polymorph (Hansenula capsulata), Hansenula capsulata Hansenula saturnus (Hansenula saturnus), Lipomyces kononenkoae, Kluyveromysces marxianus, Candida lipolytica (
  • the host cell is preferably one that does not have methane monooxygenase (EC 1.14.13.25).
  • the method for introducing each nucleic acid encoding GPP synthase, NPP synthase, and ⁇ -ferrandolene synthase into the host cell is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of the host cell.
  • a vector that can be introduced into a host cell and can express an integrated nucleic acid can be used.
  • the vector is a promoter that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and can transcribe the inserted nucleic acid (DNA). What is contained can be used.
  • a vector that can be used when the host cell is Escherichia coli is preferably a so-called multicopy-type vector, such as a plasmid having a replication origin derived from ColE1, such as a pUC-based plasmid, a pBR322-based plasmid, or a derivative thereof.
  • pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]
  • pUC18, pBR322, pHelix1 manufactured by Roche Diagnostics
  • pKK233-2 manufactured by Amersham Pharmacia Biotech
  • pSE280 Invitrogen
  • pGEMEX-1 Promega
  • pQE-8 Qiagen
  • pET-3 Novagen
  • pBluescript II KS (+) (Stratagene)
  • pSTV28 manufactured by Takara Bio Inc.
  • pUC118 manufactured by Takara Bio Inc.
  • the like can be used.
  • the promoter on the vector may be any as long as it can operate in a host cell such as E. coli.
  • a host cell such as E. coli.
  • Trp promoter Trp promoter
  • lac lac promoter
  • PL promoter PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • promoters derived from E. coli such as T7 promoter, phages, etc.
  • tac promoter lacT7 promoter.
  • Other promoters can also be used.
  • the vector is composed of a replication system for maintaining it stably in the host yeast, a promoter capable of transcribing the inserted nucleic acid (DNA), and a terminator sequence. It is preferable to have.
  • the vector may be a plasmid that can replicate in the host yeast or be integrated into the host chromosome.
  • the vector may also be capable of encoding the expression of repetitive copies of the desired DNA sequence, each separated by a selective cleavage site.
  • the type of promoter operable in yeast is not particularly limited.
  • the promoter of isocitrate lyase gene AOX1 promoter, GAPDH promoter, PHO5 promoter, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TDH3) promoter, ADHI promoter, MF ⁇ 1 A promoter, a GAL10 promoter, and the like can be used.
  • each nucleic acid When introducing each nucleic acid into a host cell using a vector, each nucleic acid may be incorporated into one vector or may be incorporated into separate vectors. Furthermore, when incorporating a plurality of nucleic acids into one vector, each nucleic acid may be expressed under a common promoter or may be expressed under separate promoters.
  • the host cell has ⁇ -ferrandolene synthase
  • this operation is usually not necessary at least when bacteria or yeast are used as host cells.
  • nucleic acids may be introduced in addition to the nucleic acids encoding GPP synthase, NPP synthase, and ⁇ -ferrandrene synthase.
  • a nucleic acid encoding at least one enzyme that acts in the synthetic pathway of isopentenyl diphosphate (IPP) is further introduced and the nucleic acid is expressed in the host cell.
  • the nucleic acid to be introduced may be only one kind or two or more kinds.
  • the synthesis route of IPP is broadly divided into two types: a mevalonate pathway (MVA pathway) and a non-mevalonate pathway (MEP pathway).
  • the mevalonate pathway is provided by eukaryotes and starts from acetyl CoA.
  • enzymes that act in the mevalonate pathway include, in order from the upstream, acetyl CoA acetyltransferase, HMG-CoA synthase, HMG-CoA reductase, mevalonate kinase, 5-phosphomevalonate kinase, and diphosphomevalonate decarboxylase.
  • the non-mevalonic acid pathway is provided by prokaryotes, chloroplasts, and plastids, and starts with glyceraldehyde 3-phosphate (GAP) and pyruvic acid.
  • Enzymes acting in the non-mevalonate pathway include, in order from the upstream, DOXP synthase, DOXP reductoisomerase, 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase, 4-diphosphoditidyl-2-C-methyl-D- Examples include erythritol kinase, 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase, HMB-PP synthase, and HMB-PP reductase.
  • the “enzyme that acts in the IPP synthesis pathway” encoded by the nucleic acid further introduced in this embodiment is preferably an enzyme that acts in the mevalonate pathway.
  • Enzymes that act in the mevalonate pathway include acetyl CoA acetyltransferase, HMG-CoA synthase, HMG-CoA reductase, mevalonate kinase, 5-phosphomevalonate kinase, diphosphomevalonate decarboxylase, isopentenyl diphosphate isomerase .
  • an enzyme group consisting of HMG-CoA synthase, HMG-CoA reductase, mevalonate kinase, 5-phosphomevalonate kinase, diphosphomevalonate decarboxylase, and isopentenyl diphosphate isomerase is expressed in the host cell.
  • the nucleic acid to be introduced may be selected.
  • Non-eukaryotes that have a mevalonate pathway include Streptomyces sp. Strain CL190 (Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182 (15), 4153-7), Streptomyces griseolosporeus MF730 -N6 (Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65 (7), 1627-35).
  • Examples of bacteria include Lactobacillus helvecticus (Smeds A et al., DNA seq.
  • Aeropyrum genus In the archaea, Aeropyrum genus, Sulfolobus genus, Desulfurococcus genus, Thermoproteus genus, Halobacterium genus, Methanococcus genus, Thermococcus genus, Pyrococcus genus, Methanopyrus genus, Thermoplasma genus, etc. (Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28 (1), 87-99).
  • the origin of the enzyme group acting in the mevalonate pathway is not particularly limited, but an enzyme group acting in the mevalonate pathway of yeast or actinomycetes is particularly preferably employed.
  • enzymes may be naturally occurring or modified enzymes of each enzyme.
  • it may be an amino acid substitution mutant of each enzyme or a polypeptide that is a partial fragment of each enzyme and has the same enzyme activity.
  • the method for culturing the recombinant cell of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately performed according to the type of the host cell.
  • the recombinant cell is aerobic or obligately anaerobic, for example, aeration and agitation culture using a liquid medium can be performed. If the recombinant cell is absolutely anaerobic, for example, replace the gas phase with a high-purity or deoxygenated gas such as nitrogen, and add an appropriate amount of a reducing agent such as sodium sulfide or cysteine to the culture solution. Thus, culture can be performed.
  • the medium is not particularly limited as long as it is a medium in which recombinant cells grow.
  • an organic carbon source such as a saccharide or a protein degradation product.
  • the saccharide include monosaccharides (such as glucose), disaccharides (such as maltose), oligosaccharides, polysaccharides (such as starch), and sugar alcohols.
  • the protein degradation product include peptone, tryptone, casamino acid and the like.
  • ⁇ -ferrandrene By culturing the recombinant cells of the present invention, a large amount of ⁇ -ferrandrene can be produced. As the production capacity of ⁇ -ferrandrene, a production amount of 10 mg or more of ⁇ -ferrandrene per 1 g of wet cells can be realized.
  • the produced ⁇ -ferrandrene is released out of the recombinant cells or accumulated in the cells.
  • any ⁇ -ferrandrene may be recovered. Specifically, it can be recovered from a microbial cell disruption product, a culture solution (culture supernatant), a gas phase of a culture system, or the like.
  • ⁇ -ferrandrene released to the outside of the cell is recovered, and specifically, recovered from the culture solution (culture supernatant) or the gas phase of the culture system.
  • a culture solution (culture supernatant) is extracted with an appropriate solvent such as pentane, and further subjected to reverse phase chromatography or gas chromatography. Etc., and can be purified to a high purity by chromatography. Since ⁇ -ferrandrene released to the outside of the cell also evaporates into the gas phase, it can be liquefied and recovered with a cold trap or the like.
  • recombinant Escherichia coli introduced with a tomato-derived NPP synthase gene and a tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene was prepared, and the recombinant Escherichia coli was cultured to produce ⁇ -ferrandrene.
  • Tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene Tomato-derived ⁇ -ferrandrene was synthesized by RT-PCR using tomato-derived total RNA as a template and primers represented by SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • a nucleic acid encoding a synthase (tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene, SEQ ID NO: 5, GenBank Accession No .: FJ797957) was amplified.
  • the obtained nucleic acid was cleaved with NcoI and BamHI and then introduced into a pACYCDuet-1 vector (Novagen).
  • the base sequence of the nucleic acid introduced into the vector was confirmed, and it was confirmed that there was no difference.
  • a tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase expression vector pACTPD was prepared.
  • the cells were disrupted, and the supernatant of the disrupted solution was extracted with pentane.
  • this extracted fraction was analyzed by gas chromatography, ⁇ -ferrandrene was detected. Further, when the gas phase fraction was analyzed, ⁇ -ferrandrene was also detected in the gas phase.
  • the culture supernatant was also extracted with pentane. When this extracted fraction was analyzed by gas chromatography, ⁇ -ferrandrene was detected.
  • the control recombinant Escherichia coli into which only the pET23a vector or the pACYCDuet-1 vector was introduced ⁇ -ferrandrene was not detected from any of the cells, the culture supernatant, and the gas phase.
  • ⁇ -ferrandolene can be produced by culturing recombinant Escherichia coli introduced with a tomato-derived NPP synthase gene and a tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene.
  • the produced ⁇ -ferrandrene was recoverable from the cells, the culture supernatant, and the gas phase.
  • E. coli BL21BPD2 was cultured in 2 ⁇ YT medium containing ampicillin 100 ⁇ g / mL and chloramphenicol 34 ⁇ g / mL at 30 ° C. and 110 rpm (rotation) for 30 hours. At this time, the system was closed 16 hours after the start of the culture. After completion of the culture, the cells and the culture supernatant were obtained by centrifugation. The cells were disrupted, and the supernatant of the disrupted solution was extracted with pentane. When this extracted fraction was analyzed by gas chromatography, ⁇ -ferrandrene was detected. The culture supernatant was also extracted with pentane.
  • ⁇ -ferrandrene can be produced by culturing recombinant Escherichia coli into which an Arabidopsis thaliana-derived GPP synthase gene and a lavender-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene were introduced.
  • the produced ⁇ -ferrandrene was recoverable from the cells, the culture supernatant, and the gas phase.
  • a recombinant yeast into which a tomato-derived NPP synthase gene and a tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene were introduced was prepared, and the recombinant yeast was cultured to produce ⁇ -ferrandolene.
  • Tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene Tomato-derived ⁇ -ferrandrene was synthesized by RT-PCR using tomato-derived total RNA as a template and primers represented by SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  • a nucleic acid encoding a synthase (tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene, SEQ ID NO: 5, GenBank Accession No: FJ797957) was amplified.
  • the obtained nucleic acid was cleaved with BamHI and then introduced into a pPIC3.5K vector (Invitrogen). The base sequence of the nucleic acid introduced into the vector was confirmed, and it was confirmed that there was no difference.
  • pPIC3.5K vector Invitrogen
  • a recombinant yeast GSNP-1 having a plurality of copies of the tomato-derived NPP synthase gene and the tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene was obtained.
  • a geneticin (Invitrogen) resistant strain having a concentration of 1.5 mg / mL into which only the pPIC3.5K vector into which no nucleic acid had been inserted was introduced was obtained (recombinant yeast GS115).
  • MGY medium 1.34% (w / v) YNB, 1% (w / v) glycerol, 4 X 10 -5 % (w / v) biotin; YMB: 13.4% (w / v) yeast nitrogen base, 10% (w / v) ammonium sulfate) (Invitrogen manual No. 25-0043), the cells were collected, and the collected cells were collected in a Fermentation basal salts medium.
  • the cells and the culture supernatant were collected by centrifugation.
  • the cells were disrupted by the glass bead method (Invitrogen manual No. 25-0043) to obtain a supernatant.
  • the pentane extract of the supernatant was analyzed by gas chromatography, ⁇ -ferrandrene was detected.
  • the culture supernatant was also extracted with pentane.
  • ⁇ -ferrandrene was detected.
  • the gas phase fraction was analyzed, ⁇ -ferrandrene was also detected in the gas phase.
  • ⁇ -ferrandrene was not detected from any of the cells, the culture supernatant, and the gas phase. From the above, it was shown that ⁇ -ferrandrene can be produced by culturing recombinant yeast introduced with a tomato-derived NPP synthase gene and a tomato-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene. The produced ⁇ -ferrandrene was recoverable from the cells, the culture supernatant, and the gas phase.
  • a recombinant yeast into which an Arabidopsis thaliana-derived GPP synthase gene and a lavender-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene were introduced was prepared, and the recombinant yeast was cultured to produce ⁇ -ferrandolene.
  • ⁇ -ferrandrene can be produced by culturing a recombinant yeast introduced with an Arabidopsis thaliana-derived GPP synthase gene and a lavender-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene.
  • the produced ⁇ -ferrandrene was recoverable from the cells, the culture supernatant, and the gas phase.
  • a recombinant Escherichia coli introduced with a tomato-derived NPP synthase gene and a lavender-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene was prepared, and the recombinant Escherichia coli was cultured to confirm the production of ferrandolene and Identification was performed.
  • the pACLPD prepared in Example 2 was cleaved with NCOI and EcoRI, and the lavender-derived ⁇ -ferrandrene synthase gene was excised and introduced into the NcoI and EcoRI cleavage sites of pCOLADuet-1 (Novagen) to construct pCODLFS.
  • PCR was performed using pT21TNPP produced in Example 1 as a template and the primers of SEQ ID NOs: 25 and 26 to amplify the tomato-derived NPP synthase gene.
  • the amplified fragment was cleaved with NdeI and KpnI, and introduced into the NdeI and KpnI cleavage sites of the above pCODLFS to construct a co-expression vector pCOLDFSSNS.
  • the above-described pCOLDFSSNS was introduced into Rosetta 2 (DE3) to obtain a recombinant E. coli ROFSSNS that co-expressed lavender-derived ⁇ -ferrandrene synthase and tomato-derived NPP synthase.
  • a control E. coli a recombinant E. coli ROCOLA having only pCOLA-Duet-1 was also prepared.
  • a nucleic acid (SEQ ID NO: 29) encoding S. griseolosporeus mevalonate pathway enzyme is amplified by PCR using the genomic DNA of Streptomyces griseolosporeus (Kitasatospora griseola) and the primers represented by SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 did.
  • This nucleic acid includes gene clusters encoding Mevalonate kinase, Mevalonate diphosphate decarboxylase, Phosphomevalonate kinase, IPP isomerase, HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase (HMGR), and HMG-CoA synthase. ing.
  • the obtained amplified DNA fragment was cloned into the pT7-Blue T vector to construct pT7SMV.

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Abstract

　β－フェランドレンを高純度かつ大量に取得するための一連の技術を提供することを課題とする。　ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する、β－フェランドレン生産能を有する組換え細胞が提供される。当該組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ－フェランドレンを生産させるβ－フェランドレンの生産方法も提供される。

Description

組換え細胞、並びに、β－フェランドレンの生産方法
　本発明はβ－フェランドレン生産能を有する組換え細胞、及び当該組換え細胞を用いるβ－フェランドレンの生産方法に関する。
　モノテルペンは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）とイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とが縮合したゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を生合成前駆体とする、炭素１０個を持つイソプレイン則に従う化合物の総称である。モノテルペンは、現在９００種類以上のものが知られている。
　モノテルペンはバラや柑橘類のような芳香を持ち、香水などにも多用されている。例えば、リモネンはレモンなど柑橘類に含まれる香気成分であり、溶剤や接着剤原料などとしても利用されている。また、メントールは爽やかな芳香を持ち、菓子や医薬品に清涼剤として用いられている。一方、樹脂産業では、β－ピネン、α－ピネン、リモネン、α－フェランドレン等が、接着剤や透明樹脂等のモノマー原料として検討されている（非特許文献１）
　モノテルペンの一種であるβ－フェランドレン（β-phellandrene）は、新たなポリマー材料としての用途が期待されている。β－フェランドレンは、α－フェランドレンに比べてより高分子量のポリマーを得る可能性がある。しかし、合成化学的手法によってβ－フェランドレンを得る場合には、その異性体であるα－フェランドレンの生成が避けられず、またこれらの異性体の分離は極めて困難である（非特許文献２）。そのため、高純度のβ－フェランドレンを得ることは難しく、このことがβ－フェランドレンのポリマー物性等を調べることを困難にしている。
　一方、β－フェランドレンの生合成経路としては、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素の作用によって、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）又はネリル二リン酸（ＮＰＰ）が生合成される。続いて、β－フェランドレン合成酵素の作用により、ＧＰＰ又はＮＰＰからβ－フェランドレンが生合成される。そして、トマトとラベンダーにおいて、β－フェランドレン合成酵素が見出されている（非特許文献３，４）。
　特許文献１には、環状テルペンシンターゼ（環状テルペン合成酵素）をコードする核酸が導入されたＣ１代謝宿主細胞の形質転換体を用いて、モノテルペンを製造する方法について記載されている。その実施例として、メチロモナス属細菌の形質転換体を用いてリモネンを製造した実験例が記載されている。しかし、β－フェランドレンについては、言及はあるものの、実施例は示されていない。β－フェランドレン合成酵素に関する言及もあるが、β－フェランドレン合成酵素とその遺伝子の具体例や取得方法、さらにβ－フェランドレンを生産できる形質転換体の具体的構成や構築方法については示されていない。
特表２００５－５００８０５号公報
Satou K., et al., Green Chemistry 2006, 8, 878-882 Mori K., Tetrahedron： Asymmetry 2006, 17, 2133-2142 Demissie, Z. A., et al.,, Planta. 2011, 233, 685-96. Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.
　上記現状に鑑み、本発明は、β－フェランドレンを高純度かつ大量に取得するための一連の技術を提供することを目的とする。
　上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する、β－フェランドレン生産能を有する組換え細胞である。
　本発明はβ－フェランドレン生産能を有する組換え細胞に係るものである。本発明の組換え細胞は、「ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸」と、「β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸」とが宿主細胞に導入されてなるもので、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する。すなわち、本発明の組換え細胞では、ＧＰＰ合成酵素及び／又はＮＰＰ合成酵素の発現能とβ－フェランドレン合成酵素の発現能とが、宿主細胞に対して新たに付加又は増強されている。
　本発明の組換え細胞では、細胞内で発現されたＧＰＰ合成酵素の作用によってイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からＧＰＰが合成され、及び／又は、細胞内で発現されたＮＰＰ合成酵素の作用によってＩＰＰからＮＰＰが合成される。さらに、細胞内で発現されたβ－フェランドレン合成酵素の作用によって、ＧＰＰ及び／又はＮＰＰからβ－フェランドレンが合成される。その結果、本発明の組換え細胞を培養することにより、β－フェランドレンを高純度かつ大量に生産することができる。
　好ましくは、宿主細胞は、メタンモノオキシゲナーゼを有さないものである。
　好ましくは、宿主細胞は、大腸菌又は酵母である。
　かかる構成により、組換え細胞を容易に大量培養することができる。
　好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ－フェランドレンを生産可能である。
　好ましくは、ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
　好ましくは、ネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードするものである。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
　好ましくは、β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードするものである。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ－フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
　好ましくは、イソペンテニル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。
　かかる構成により、ＧＰＰ合成酵素やＮＰＰ合成酵素の基質となるＩＰＰが効率的に供給される。
　好ましくは、イソペンテニル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路である。
　好ましくは、前記メバロン酸経路は、酵母又は放線菌のメバロン酸経路である。
　本発明の他の様相は、上記した組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ－フェランドレンを生産させるβ－フェランドレンの生産方法である。
　本発明は、β－フェランドレンの生産方法に係るものである。本発明では、上記した組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ－フェランドレンを生産させる。本発明によれば、β－フェランドレンを高純度かつ大量に生産することができる。
　好ましくは、組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ－フェランドレンを生産させる。
　好ましくは、組換え細胞の細胞外に放出されたβ－フェランドレンを回収する。
　好ましくは、組換え細胞の培養系の気相からβ－フェランドレンを回収する。
　本発明によれば、β－フェランドレンを高純度かつ大量に生産することができる。
実施例５で行った培養の気相画分をＧＣ－ＭＳで分析した結果を表すトータルイオンクロマトグラムであり、（ａ）はコントロールの組換え体、（ｂ）はβ－フェランドレン生産能を有する組換え体の場合である。 図１（ｂ）の各ピークをＧＣ－ＭＳで同定した結果を表すマススペクトルであり、（ａ）はピークＡ（β－フェランドレン）、（ｂ）はピークＢ（リモネン）、（ｃ）はピークＣ（ミルセン）の場合である。
　本発明の組換え細胞は、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する組換え細胞であり、β－フェランドレン合成能を有するものである。
　ＧＰＰ合成酵素としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（遺伝子）についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。
　ＮＰＰ合成酵素、β－フェランドレン合成酵素、及びこれらをコードする核酸についても同様である。
　ＧＰＰ合成酵素の具体例としては、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のもの（GenBank Accession No.: Y17376/At2g34630; Bouvier, F., et al., Plant J,. 2000, 24, 241-52.）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のもの;（GenBank Accession No.: NP_215504; Mann, F. M., et al., FEBS Lett., 2011, 585, 549-54.）、等が挙げられる。
　配列番号１に上記シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号２にアミノ酸配列のみを示す。配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸の一例となる。
　さらに、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
　なお（ｃ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
　ＮＰＰ合成酵素の具体例としては、トマト（Solanum lycopersicum）由来のもの（GenBank Accession No.: FJ797956）、等が挙げられる。
　配列番号３に上記トマト由来ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号４にアミノ酸配列のみを示す。配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡは、ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸の一例となる。
　さらに、ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
　なお（ｆ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
　本発明の組換え細胞において、「ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）合成酵素をコードする核酸」と「ネリル二リン酸（ＮＰＰ）合成酵素をコードする核酸」については、いずれか一方の核酸のみが導入されたものでもよいし、両方の核酸が導入されたものでもよい。
　β－フェランドレン合成酵素及びそれをコードする核酸の具体例としては、トマト（Solanum lycopersicum）由来のもの（GenBank Accession No.: FJ797957; Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.）、ラベンダー（Lavandula angustifolia）由来のもの（GenBank Accession No.： HQ404305; Demissie, Z. A., et al., Planta, 2011,. 233, 685-96）、等が挙げられる。
　配列番号５に上記トマト由来β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号６にアミノ酸配列のみを示す。
　配列番号７に上記ラベンダー由来のβ－フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号８にアミノ酸配列のみを示す。
　配列番号５又は配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡは、β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸の一例となる。
　さらに、β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸には、少なくとも、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ－フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
　なお（ｉ）におけるアミノ酸配列の相同性については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
　本発明の組換え細胞における宿主細胞としては特に限定はなく、原核細胞、真核細胞のいずれでもよい。原核細胞の例としては、細菌、放線菌、が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌等のエシェリヒア（Escherichia）属細菌、枯草菌等のバチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、シアノバクテリア（ラン藻）、クロストリディウム（Clostridium）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、等が挙げられる。この中でも、大量培養が容易な大腸菌が特に好ましい。
　真核細胞の例としては、酵母、糸状菌、真核微細藻類、植物細胞、動物細胞が挙げられる。
　酵母の例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロミセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・ジアスタチクス（Saccharomyces diastaticus）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・マルトサ（Candida maltosa）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）、ピキア・ピヌス（Pichia pinus）、ピキア・バンリジイ（Pichia varijii）、ピキア・ファーメンタンス（Pichia fermentans）、ピキア・ギリエルモンディイ（Pichia guilliermondii）、ピキア・スチピチス（Pichia stipitis）、サッカロミセス・テルリス（Saccharomyces elluris）、カンジダ・ユーティリス（Candida utilis）、カンジダ・ギリエルモンディイ（Candida guilliermondii）、ハンセヌラ・ヘンリチイ（Hansenula henricii）、ハンセヌラ・カプスラタ（Hansenula capsulata）、ハンセヌラ・ポリモーファ（Hansenula polymorpha）、ハンセヌラ・サツルヌス（Hansenula saturnus）、リポミセス・コノネンコエ（Lypomyces kononenkoae）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、カンジダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、サッカロミコプシス・フィブリゲラ（Saccaromycopsis fibuligera）、サッカロミコデス・ルドウィギイ（Saccharomycodes ludwigii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、トレメラ・メセンテリカ（Tremella mesenterica）、チゴサッカロミセス・アシドファシエンス（Zygosaccharomyces acidofaciens）、チゴサッカロミセス・ファーメンタチ（Zygosaccharomyces fermentati）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、およびチゴサッカロミセス・ソヤ（Zygosaccharomyces soja）、等が挙げられる。この中でも、大量培養が容易な酵母を選択することが特に好ましい。
　また宿主細胞は、メタンモノオキシゲナーゼ（ＥＣ １．１４．１３．２５）を有さないものであることが好ましい。
　ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、β－フェランドレン合成酵素をコードする各核酸を宿主細胞に導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた核酸を発現可能なベクターを用いることができる。
　例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記核酸（ＤＮＡ）、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
　宿主細胞が大腸菌の場合に使用可能なベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。より具体的には、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。ベクター上のプロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で作動できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、Ｔ７プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、及びtacプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
　宿主細胞が酵母の場合も基本的に同様であり、当該ベクターの構成として、宿主酵母内で安定に維持するための複製系、挿入された上記核酸（ＤＮＡ）を転写可能なプロモーター、およびターミネーター配列を有することが好ましい。例えば、当該ベクターは、宿主酵母で複製し得るまたは宿主染色体内に組み込まれ得るプラスミドであってもよい。また当該ベクターは、各々が選択的な切断部位により分離される、所望ＤＮＡ配列の反復コピーの発現をコードし得るものでもよい。
　酵母で作動可能なプロモーターの種類は特に限定されないが、例えば、イソクエン酸リアーゼ遺伝子のプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ３）プロモーター、ＡＤＨＩプロモーター、ＭＦα１プロモーター、およびＧＡＬ１０プロモーターなどを用いることができる。
　ベクターを用いて各核酸を宿主細胞に導入する場合、各核酸を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の核酸を組み込む場合には、各核酸を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。
　宿主細胞がα－フェランドレン合成酵素を有するものである場合には、宿主細胞のα－フェランドレン合成酵素をノックアウトしておくことが好ましい。ただし、一般にα－フェランドレン合成酵素を有する生物は植物のみであるので、少なくとも、細菌や酵母を宿主細胞とする場合においては当該操作は通常必要ない。
　本発明の組換え細胞においては、ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、β－フェランドレン合成酵素をコードする各核酸に加えて、他の核酸が導入されていてもよい。１つの実施形態では、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する。導入される当該核酸は１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
　一般に、ＩＰＰの合成経路はメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）と非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路）の２つに大別される。
　メバロン酸経路は真核生物が備えているものであり、アセチルＣｏＡを出発物質としている。メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５－ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、が挙げられる。
　一方、非メバロン酸経路は原核生物や葉緑体・色素体が備えているものであり、グリセルアルデヒド３－リン酸（ＧＡＰ）とピルビン酸を出発物質としている。非メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトールシンターゼ、４－ジホスホヂチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトールキナーゼ、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトール－２，４－シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ－ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ－ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。
　本実施形態でさらに導入される核酸がコードする「ＩＰＰ合成経路で作用する酵素」は、メバロン酸経路で作用する酵素が好ましい。
　メバロン酸経路で作用する酵素群としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５－ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。このうち、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５－ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼからなる酵素群が宿主細胞内で発現するように、導入する核酸を選択すればよい。
　メバロン酸経路は全ての真核生物が保有しているが、真核生物以外でも見出されている。真核生物以外でメバロン酸経路を有するものとしては、放線菌では、Streptomyces sp. Strain CL190 (Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182 (15), 4153-7)、Streptomyces griseolosporeus MF730-N6 (Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65(7), 1627-35）が挙げられる。
　細菌では、Lactobacillus helvecticus (Smeds A et al., DNA seq. 2001, 12(3), 187-190)、Corynebacterium amycolatum、Mycobacterium marinum、Bacillus coagulans、Enterococcus faecalis、Streptococuss agalactiae、Myxococcus xanthus等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99)。
　アーキアでは、Aeropyrum属、Sulfolobus属、Desulfurococcus属、Thermoproteus属、Halobacterium属、Methanococcus属、Thermococcus属、Pyrococcus属、Methanopyrus属、Thermoplasma属等が挙げられる（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99）。
　上記メバロン酸経路で作用する酵素群の由来としては特に限定はないが、酵母又は放線菌のメバロン酸経路で作用する酵素群が特に好ましく採用される。
　これらの酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
　本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等に応じて適宜行うことができる。
　組換え細胞が好気性や偏性嫌気性の場合には、例えば、液体培地を用いた通気・撹拌培養を行うことができる。
　組換え細胞が絶対嫌気性の場合には、例えば、気相を高純度もしくは脱酸素処理された窒素等のガスで置換し、さらに培養液も硫化ナトリウム、システイン等の還元剤を適量添加することにより、培養を行うことができる。
　培地についても、組換え細胞が成育する培地であれば特に限定はない。培地の主たる炭素原としては、糖類やタンパク質分解物のような有機炭素原を用いることが好ましい。糖類としては、単糖（グルコース等）、二糖（マルトース等）、オリゴ糖、多糖（デンプン等）、糖アルコールなどが挙げられる。タンパク質分解物としては、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸などが挙げられる。
　本発明の組換え細胞を培養することにより、β－フェランドレンを大量に生産することができる。β－フェランドレンの生産能力としては、湿潤菌体１ｇあたりβ－フェランドレン１０ｍｇ以上の生産量が実現可能である。
　本発明の組換え細胞を培養してβ－フェランドレンを生産する場合には、合成化学的手法で生産する場合と異なり、α－フェランドレンの混入は実質的に起こらない。
　生産されたβ－フェランドレンは、組換え細胞の細胞外に放出されるか、細胞内に蓄積される。本発明においては、いずれのβ－フェランドレンを回収してもよく、具体的には、菌体破砕物、培養液（培養上清）、培養系の気相などから回収することができる。好ましくは、細胞外に放出されたβ－フェランドレンを回収し、具体的には、培養液（培養上清）や培養系の気相から回収する。
　組換え細胞の培養物からβ－フェランドレンを単離・精製する方法としては、例えば、培養液（培養上清）をペンタン等の適切な溶媒で抽出し、さらに逆相クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによって高純度に精製することできる。細胞外に放出されたβ－フェランドレンは気相にも蒸発するため、コールドトラップ等でこれらを液化し、回収することも可能である。
　以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
　本実施例では、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養してβ－フェランドレンを生産した。
（１）トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子の単離
　トマト（Solanum lycopersicum）由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号９と配列番号１０で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、トマト由来ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸（トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号３、GenBank Accession No.: FJ797956）を増幅した。得られた核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＥＴ２３ａベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来ＮＰＰ合成酵素発現ベクターｐＴ２１ＴＮＰＰを作製した。
（２）トマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
　トマト由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１１と配列番号１２で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、トマト由来β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸（トマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号５、GenBank Accession No.: FJ797957）を増幅した。得られた核酸をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断した後、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１ベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来β－フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＡＣＴＰＤを作製した。
（３）β－フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌の作製
　上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＴ２３ＴＮＰＰ及びｐＡＣＴＰＤを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、β－フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ１を作製した。
　コントロールとして、核酸が挿入されていないｐＥＴ２３ａベクターのみを導入した組換え大腸菌、並びに、核酸が挿入されていないｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１ベクターのみを導入した組換え大腸菌を別途作製した。
（４）β－フェランドレン生産
　組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ１をアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地（1.6% (w/v)Bacto Tripton, 1%(w/v) Yeast Extract, 0.5%(w/v)NaCl）にて、３０℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件で３０時間培養した。この際、培養開始から１６時間後に密閉系にした。培養終了後、遠心分離により菌体と培養上清を得た。
　菌体を破砕し、破砕液の上清をペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β－フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ－フェランドレンが検出された。
　培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β－フェランドレンが検出された。
　一方、ｐＥＴ２３ａベクターあるいはｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１ベクターのみを導入したコントロールの組換え大腸菌では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ－フェランドレンは検出されなかった。
　以上のことから、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を培養することにより、β－フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ－フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
　本実施例では、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養してβ－フェランドレンを生産した。
（１）シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子の単離
　シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１３と配列番号１４で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号１、GenBank Accession No: Y17376）を増幅した。得られた核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＥＴ２３ａベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素発現ベクターｐＴ２３ＡＧＰＰを作製した。
（２）ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
　ラベンダー（Lavandula angustifolia）由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１５と配列番号１６で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号７、GenBank Accession No.: HQ404305）を増幅した。得られた核酸をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１ベクター（Novagen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＡＣＬＰＤを作製した。
（３）β－フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌の作製
　上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＴ２３ＡＧＰＰ及びｐＡＣＬＰＤを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、β－フェランドレン生産能を有する組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ２を作製した。
　コントロールとして、核酸が挿入されていないｐＥＴ２３ａベクターのみを導入した組換え大腸菌、並びに、核酸が挿入されていないｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１ベクターのみを導入した組換え大腸菌を別途作製した。
（４）β－フェランドレン生産
　組換え大腸菌ＢＬ２１ＢＰＤ２をアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地にて、３０℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件で３０時間培養した。この際、培養開始から１６時間後に密閉系にした。培養終了後、遠心分離により菌体と培養上清を得た。
　菌体を破砕し、破砕液の上清をペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β－フェランドレンが検出された。
　培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β－フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ－フェランドレンが検出された。
　一方、ｐＥＴ２３ａベクターあるいはｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１ベクターのみを導入したコントロールの組換え大腸菌では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ－フェランドレンは検出されなかった。
　以上のことから、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を培養することにより、β－フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ－フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
　本実施例では、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を作製し、当該組換え酵母を培養してβ－フェランドレンを生産した。
（１）トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子の単離
　トマト由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１３と配列番号１４で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、トマト由来ＮＰＰ合成酵素をコードする核酸（トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号３、GenBank Accession No:FJ797956）を増幅した。得られた核酸をＢａｍＨＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来ＮＰＰ合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＴＮＰＰを作製した。
（２）トマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
　トマト由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号１９と配列番号２０で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、トマト由来β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸（トマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号５、GenBank Accession No:FJ797957）を増幅した。得られた核酸をＢａｍＨＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、トマト由来β－フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＴＰＤを作製した。
（３）β－フェランドレン生産能を有する組換え酵母の作製
　メタノール資化性酵母Pichia pastoris GS115株（Invitrogen社）を、上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＰ３．５ＴＮＰＰ及びｐＰ３．５ＴＰＤの等量混合物で形質転換した。形質転換の方法は、Invitrogen社のマニュアル（No.25-0156、No. 25-0043）に従って行った。マルチコピーの遺伝子導入体を得るために、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（Invitrogen社）耐性株を取得した。これにより、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子及びトマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子をそれぞれ複数コピー保持する組換え酵母ＧＳＮＰ－１を取得した。
　コントロールとして、核酸が挿入されていないｐＰＩＣ３．５Ｋベクターのみを導入した、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（Invitrogen社）耐性株を取得した（組換え酵母ＧＳ１１５）。
（４）β－フェランドレン生産
　ＧＳＮＰ－１をＭＧＹ培地（1.34%(w/v) YNB, 1%(w/v) glycerol, 4 X 10-5 %(w/v) biotin; YMB:13.4%(w/v) yeast nitrogen base, 10%(w/v)ammonium sulfate）（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）にて前培養した後、菌体を回収し、回収菌体をFermentation basal salts培地（85% Phosphoric acid 26.7 ml, Calcium sulfate 0.093%(w/v), Potassium sulfate 1.82%(w/v), Magnesium sulfate-7H2O 1.49%(w/v), Potassium hydroxide 0.413%(w/v), Glycerol 4.0%(w/v)）（Invitrogen社マニュアルVer.B 053002）にて６４時間本培養した。この際、培養開始から２４時間後に密閉系にした。導入した酵素遺伝子の発現誘導のために、培養開始から２４時間経過時と４８時間経過時に、１／２００容の１００％メタノールを培養液に添加した。培養終了後、遠心分離により菌体及び培養上清を回収した。
　菌体をガラスビーズ法（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）によって破砕し、上清を得た。この上清のペンタン抽出物をガスクロマトグラフィーで分析したところ、β－フェランドレンが検出された。
　培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β－フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ－フェランドレンが検出された。
　一方、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクターのみを導入したコントロールの組換え酵母ＧＳ１１５では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ－フェランドレンは検出されなかった。
　以上のことから、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とトマト由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を培養することにより、β－フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ－フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
　本実施例では、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を作製し、当該組換え酵母を培養してβ－フェランドレンを生産した。
（１）シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子の単離
　シロイヌナズナ由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号２１と配列番号２２で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸（シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子、配列番号１、GenBank Accession No.: Y17376）を増幅した。得られた核酸をＢａｍＨＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＡＧＰＰを作製した。
（２）ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子の単離
　ラベンダー由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号２３と配列番号２４で表されるプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸（ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子、配列番号７、GenBank Accession No.: HQ404305）を増幅した。得られた核酸をＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクター（Invitrogen社）に導入した。ベクターに導入された核酸の塩基配列を確認し、相違ないことを確認した。これにより、ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素発現ベクターｐＰ３．５ＬＰＤを作製した。
（３）β－フェランドレン生産能を有する組換え酵母の作製
　メタノール資化性酵母Pichia pastoris GS115株（Invitrogen社）を、上記（１）、（２）で得られた発現ベクターｐＰ３．５ＡＧＰＰ及びｐＰ３．５ＬＰＤの等量混合物で形質転換した。形質転換の方法は、Invitrogen社のマニュアル（No.25-0156、No. 25-0043）に従って行った。マルチコピーの遺伝子導入体を得るために、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（Invitrogen社）耐性株を取得した。これにより、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子及びラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子をそれぞれ複数コピー保持する組換え酵母ＧＳＮＰ－２を取得した。
（４）β－フェランドレン生産
　ＧＳＮＰ－２をＭＧＹ培地（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）にて前培養した後、菌体を回収し、回収菌体をFermentation basal salts培地（Invitrogen社マニュアルVer.B 053002）にて６４時間本培養した。導入した酵素遺伝子の発現誘導のために、培養開始から２４時間経過時と４８時間経過時に、１／２００容の１００％メタノールを培養液に添加した。この際、培養開始から２４時間後に密閉系にした。培養終了後、遠心分離により菌体及び培養上清を回収した。
　菌体をガラスビーズ法（Invitrogen社マニュアルNo. 25-0043）によって破砕し、上清を得た。この上清のペンタン抽出物をガスクロマトグラフィーで分析したところ、β－フェランドレンが検出された。
　培養上清についてもペンタンで抽出した。この抽出画分をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、β－フェランドレンが検出された。また、気相画分を分析したところ、気相にもβ－フェランドレンが検出された。
　一方、ｐＰＩＣ３．５Ｋベクターのみを導入したコントロールの組換え酵母ＧＳ１１５（実施例３で作製）では、菌体、培養上清、及び気相のいずれからもβ－フェランドレンは検出されなかった。
　以上のことから、シロイヌナズナ由来ＧＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え酵母を培養することにより、β－フェランドレンを生産できることが示された。また生産されたβ－フェランドレンは、菌体、培養上清、及び気相から回収可能であった。
　本実施例では、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子とラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養して、フェランドレンの生成確認と副生成物の同定を行った。
　実施例２で作製したｐＡＣＬＰＤより、ＮＣＯＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を切り出し、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１(Novagen社)のＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ切断部位へ導入し、ｐＣＯＤＬＦＳを構築した。一方、実施例１で作製したｐＴ２１ＴＮＰＰを鋳型として配列番号２５および２６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子を増幅した。増幅した断片をＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで切断し、上記ｐＣＯＤＬＦＳのＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ切断部位へ導入し、共発現ベクターｐＣＯＬＤＦＳＮＳを構築した。上記ｐＣＯＬＤＦＳＮＳをＲｏｓｅｔｔａ２(ＤＥ３)へ導入し、ラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素およびトマト由来ＮＰＰ合成酵素を共発現する組換え大腸菌ＲＯＦＳＮＳを得た。コントロール大腸菌としてｐＣＯＬＡ Ｄｕｅｔ－１のみを有する組換え大腸菌ＲＯＣＯＬＡも作製した。
　組換え大腸菌ＲＯＦＳＮＳおよびＲＯＣＯＬＡをクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、およびカナマイシン１５μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地（1.6% (w/v)Bacto Tripton, 1%(w/v) Yeast Extract, 0.5%(w/v)NaCl）にて、１８℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件下で、密閉系で２４時間培養した。培養終了後、気相画分をＧＣ－ＭＳによって分析した。図１に示すようにＲＯＦＳＮＳではβ－フェランドレンが検出され（ピークＡ）、副生成物と思われるピークＢおよびＣも検出された。一方、ＲＯＣＯＬＡではこれらのピークは検出されなかった。また各ピークの同定を行ったところ、図２に示すようにＲＯＦＳＮＳの培養気相では、主要生成物であるβ－フェランドレン以外にも、リモネン（ピークＢ）およびミルセン（ピークＣ）が副生成物として少量生成していた。
　ＲＯＦＳＮＳによるβ－フェランドレンの気相での生成量は７５０μｇ／Ｌ培養液であった。
　本実施例では、放線菌由来メバロン酸経路遺伝子、トマト由来ＮＰＰ合成酵素遺伝子、およびラベンダー由来β－フェランドレン合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌を作製し、当該組換え大腸菌を培養してβ－フェランドレンを生産した。
　Streptomyces griseolosporeus (Kitasatospora griseola)のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８で表されるプライマーを使用したＰＣＲによって、S. griseolosporeusのメバロン酸経路酵素をコードする核酸（配列番号２９）を増幅した。この核酸には、Mevalonate kinase、Mevalonate diphosphate decarboxylase、Phosphomevalonate kinase、IPP isomerase、HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase (HMGR)、及びHMG-CoA synthaseをコードする遺伝子クラスターが含まれている。得られた増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７-Ｂｌｕｅ Ｔ ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＳＭＶを構築した。
　上記ベクターｐＴ７ＳＭＶより、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩによる切断によって回収した遺伝子断片をｐＣＯＬＡ Ｄｕｅｔ-１ (Novagen社)のＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ切断サイトへ導入し、ｐＣＳＭＶを構築した。
　ｐＣＳＭＶのＮｄｅＩ－ＫｐｎＩ切断部位へ、配列番号３０で示されるトマトＮＰＰ合成酵素遺伝子、ラベンダーβ－フェランドレン合成酵素遺伝子オペロンの合成核酸を導入し、放線菌メバロン酸経路遺伝子、トマトＮＰＰ合成酵素遺伝子、及びラベンダーβ－フェランドレン合成酵素遺伝子を含むｐＣＳＭＶＮＳＦＳを構築した。発現ベクターｐＣＳＭＶＮＳＦＳを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２(ＤＥ３)へ導入し、組換え大腸菌ＲＯＳＭＶＮＳＦＳを得た。
　組換え大腸菌ＲＯＳＭＶＮＳＦＳをクロラムフェニコール３４μｇ／ｍＬ、およびカナマイシン１５μｇ／ｍＬを含む２×ＹＴ培地（1.6% (w/v)Bacto Tripton, 1%(w/v) Yeast Extract, 0.5%(w/v)NaCl）にて、１８℃、１１０ｒｐｍ（旋回）の条件下で、密閉系で２４時間培養した。培養終了後、気相画分をガスクロマトグラフィーによって分析したところ、β－フェランドレンが検出された。β－フェランドレンの気相での生成量は８．５ｍｇ／Ｌ培養液であった。
　以上の結果と実施例５でのβ－フェランドレン生成量とから、放線菌ＭＶＡ経路遺伝子をさらに導入することで、β－フェランドレンの産生量を増大させることが可能であった。

Claims (14)

  1. 　ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸及びネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの核酸と、β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸とが宿主細胞に導入されてなり、かつこれらの核酸が宿主細胞内で発現する、β－フェランドレン生産能を有する組換え細胞。
  2. 　宿主細胞は、メタンモノオキシゲナーゼを有さないものである請求項１に記載の組換え細胞。
  3. 　宿主細胞は、大腸菌又は酵母である請求項２に記載の組換え細胞。
  4. 　組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ－フェランドレンを生産可能である請求項１～３のいずれかに記載の組換え細胞。
  5. 　ゲラニル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである請求項１～４のいずれかに記載の組換え細胞。
    （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
    （ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつゲラニル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
  6. 　ネリル二リン酸合成酵素をコードする核酸は、下記（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のタンパク質をコードするものである請求項１～５のいずれかに記載の組換え細胞。
    （ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
    （ｆ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつネリル二リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質。
  7. 　β－フェランドレン合成酵素をコードする核酸は、下記（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のタンパク質をコードするものである請求項１～６のいずれかに記載の組換え細胞。
    （ｇ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｈ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ－フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
    （ｉ）配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、かつβ－フェランドレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
  8. 　イソペンテニル二リン酸の合成経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする核酸がさらに導入され、当該核酸が宿主細胞内で発現する請求項１～７のいずれかに記載の組換え細胞。
  9. 　イソペンテニル二リン酸の合成経路は、メバロン酸経路である請求項８に記載の組換え細胞。
  10. 　前記メバロン酸経路は、酵母又は放線菌のメバロン酸経路である請求項９に記載の組換え細胞。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載の組換え細胞を培養することにより、当該組換え細胞にβ－フェランドレンを生産させるβ－フェランドレンの生産方法。
  12. 　組換え細胞の湿潤菌体１ｇあたり１０ｍｇ以上のβ－フェランドレンを生産させる請求項１１に記載のβ－フェランドレンの生産方法。
  13. 　組換え細胞の細胞外に放出されたβ－フェランドレンを回収する請求項１１又は１２に記載のβ－フェランドレンの生産方法。
  14. 　組換え細胞の培養系の気相からβ－フェランドレンを回収する請求項１１～１３のいずれかに記載のβ－フェランドレンの生産方法。
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