CN104797704A - 重组细胞以及β-水芹烯的生产方法 - Google Patents

重组细胞以及β-水芹烯的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明要解决的问题在于，提供一种用于高纯度且大量地获得β-水芹烯的一系列的技术。提供一种具有β-水芹烯生产能力的重组细胞，其将选自编码牻牛儿基二磷酸(GPP)合成酶的核酸及编码橙花基二磷酸(NPP)合成酶的核酸构中的至少1种核酸和编码β-水芹烯合成酶的核酸导入宿主细胞而成，且这些核酸在宿主细胞内表达。提供一种β-水芹烯的生产方法，其通过培养该重组细胞来使该重组细胞生产β-水芹烯。

Description

重组细胞以及β-水芹烯的生产方法
技术领域
本发明涉及一种具有β-水芹烯生产能力的重组细胞及使用该重组细胞的β-水芹烯的生产方法。
背景技术
单萜为以牻牛儿基二磷酸(GPP)为生物合成前体的符合具有10个碳的异戊二烯规则的化合物的总称，所述牻牛儿基二磷酸为二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)缩合而成。单萜目前已知有900种以上。
单萜具有如玫瑰及柑橘类之类的芳香，也多用于香水等。例如柠檬烯为柠檬等柑橘类中所含的香气成分，也用作溶剂及粘接剂原料等。另外，薄荷醇具有清爽的芳香，可在点心及医药品中用作清凉剂。另一方面，在树脂产业中，将β-蒎烯、α-蒎烯、柠檬烯、α-水芹烯等作为粘接剂及透明树脂等单体原料进行研究(非专利文献1)
单萜之一的β-水芹烯(β-phellandrene)可期待作为新的聚合物材料的用途。β-水芹烯与α-水芹烯相比能够得到分子量更高的聚合物。但是，在通过合成化学的方法得到β-水芹烯的情况下，无法避免其异构体即α-水芹烯的生成，另外，这些异构体的分离非常困难(非专利文献2)。因此，难以得到高纯度的β-水芹烯，这就难以调查β-水芹烯的聚合物物性等。
另一方面，作为β-水芹烯的生物合成路径，可通过牻牛儿基二磷酸(GPP)合成酶或橙花基二磷酸(NPP)合成酶的作用，由异戊烯基二磷酸(IPP)对牻牛儿基二磷酸(GPP)或橙花基二磷酸(NPP)进行生物合成。接着，可通过β-水芹烯合成酶的作用由GPP或NPP对β-水芹烯进行生物合成。而且，在西红柿和薰衣草中，发现了β-水芹烯合成酶(非专利文献3、4)。
在专利文献1中记载有一种使用导入了对环状萜合成酶(Cyclic terpenesynthase)进行编码的核酸的C1代谢宿主细胞的转化体制造单萜的方法。作为其实施例，记载有一种使用甲基单胞菌属细菌的转化体制造柠檬烯的实验例。但是，关于β-水芹烯虽然有提到，但未示出实施例。有提到β-水芹烯合成酶，但未示出β-水芹烯合成酶和其基因的具体例及获得方法以及可生产β-水芹烯的转化体的具体构成及构建方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2005-500805号公报
非专利文献
非专利文献1：Satou K.,et al.,Green Chemistry 2006,8,878-882
非专利文献2：Mori K.,Tetrahedron：Asymmetry 2006,17,2133-2142
非专利文献3：Demissie,Z.A.,et al.,,Planta.2011,233,685-96.
非专利文献4：Schilmiller,A.L.,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.,2009,106,10865-70.
发明内容
发明所要解决的问题
鉴于上述现状，本发明的目的在于，提供一种用于高纯度且大量地获得β-水芹烯的一系列的技术。
用于解决问题的技术方案
用于解决上述的问题的本发明的一个方面为一种具有β-水芹烯生产能力的重组细胞，其将选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的核酸及编码橙花基二磷酸合成酶的核酸中的至少1种核酸和编码β-水芹烯合成酶的核酸导入宿主细胞而成，且这些核酸在宿主细胞内表达。。
本发明涉及一种具有β-水芹烯生产能力的重组细胞。本发明的重组细胞是将“选自编码牻牛儿基二磷酸(GPP)合成酶的核酸及编码橙花基二磷酸(NPP)合成酶的核酸中的至少1种核酸”和“编码β-水芹烯合成酶的核酸”导入宿主细胞而成的，且这些核酸在宿主细胞内表达。即，在本发明的重组细胞中，相对于宿主细胞新添加或增强了GPP合成酶和/或NPP合成酶的表达能力和β-水芹烯合成酶的表达能力。
在本发明的重组细胞中，可基于细胞内所表达的GPP合成酶的作用由异戊烯基二磷酸(IPP)合成GPP，和/或可基于细胞内所表达的NPP合成酶的作用由IPP合成NPP。并且，可基于细胞内所表达的β-水芹烯合成酶的作用由GPP和/或NPP合成β-水芹烯。其结果，可以通过培养本发明的重组细胞来高纯度且大量地生产β-水芹烯。
优选宿主细胞不具有甲烷单加氧酶。
优选宿主细胞为大肠杆菌或酵母。
可以通过这种构成容易地大量培养重组细胞。
优选重组细胞的湿润菌体1g可生产10mg以上的β-水芹烯。
优选编码牻牛儿基二磷酸合成酶的核酸对下述(a)、(b)或(c)的蛋白质进行编码。
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有牻牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
(c)具有与序列号2所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有牻牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
优选编码橙花基二磷酸合成酶的核酸对下述(d)、(e)或(f)的蛋白质进行编码。
(d)由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(e)由在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
(f)具有与序列号4所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
优选编码β-水芹烯合成酶的核酸对下述(g)、(h)或(i)的蛋白质进行编码。
(g)由序列号6或8所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(h)由在序列号6或8所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质、
(i)具有与序列号6或8所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有β-水芹烯合成酶的活性的蛋白质。
优选还导入对在异戊烯基二磷酸的合成路径中发挥作用的至少1个酶进行编码的核酸，该核酸在宿主细胞内表达。
可通过这种构成有效地供给GPP合成酶及NPP合成酶的基质即IPP。
优选异戊烯基二磷酸的合成路径为甲羟戊酸路径。
优选所述甲羟戊酸路径为酵母或放线菌的甲羟戊酸路径。
本发明的其它方面为一种β-水芹烯的生产方法，其包括：通过培养上述的重组细胞使该重组细胞生产β-水芹烯。
本发明涉及一种β-水芹烯的生产方法。在本发明中，通过培养上述的重组细胞使该重组细胞生产β-水芹烯。根据本发明，可以高纯度且大量地生产β-水芹烯。
优选使重组细胞的湿润菌体1g生产10mg以上的β-水芹烯。
优选对释放到重组细胞的细胞外的β-水芹烯进行回收。
优选从重组细胞的培养体系的气相中回收β-水芹烯。
发明的效果
根据本发明，可以高纯度且大量地生产β-水芹烯。
附图说明
图1是表示用GC-MS对实施例5中进行的培养的气相分率进行分析的结果的总离子色谱图，(a)为对照的重组体的情况，(b)为具有β-水芹烯生产能力的重组体的情况；
图2是表示用GC-MS对图1(b)的各峰进行鉴定的结果的质谱，(a)为峰A(β-水芹烯)的情况，(b)为峰B(柠檬烯)的情况，(c)为峰C(月桂烯)的情况。
具体实施方式
本发明的重组细胞为将选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的核酸及编码橙花基二磷酸合成酶的核酸中的至少1种核酸和编码β-水芹烯合成酶的核酸导入宿主细胞而成，且这些核酸在宿主细胞内表达，并具有β-水芹烯合成能。
作为GPP合成酶，只要为可在重组细胞内发挥其酶活性的酶就没有特别限定。关于编码GPP合成酶的核酸(基因)也同样，只要为可在重组细胞内正常地转录、翻译的核酸就没有特别限定。
关于NPP合成酶、β-水芹烯合成酶及编码这些的核酸也同样。
作为GPP合成酶的具体例，可以举出：源自于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的酶(基因银行注册编号：(GenBankAccession No.):Y17376/At2g34630；Bouvier,F.,et al.,Plant J,.2000,24,241-52.)、源自于结核菌(Mycobacterium tuberculosis)的酶(基因银行注册编号：(GenBankAccession No.):NP_215504；Mann,F.M.,etal.,FEBS Lett.,2011,585,549-54.)等。
序列号1中示出与编码上述源自于拟南芥的GPP合成酶的核酸(DNA)的碱基序列对应的氨基酸序列，序列号2中仅示出氨基酸序列。具有序列号1所示的碱基序列的DNA为编码GPP合成酶的核酸的一个例子。
并且，编码GPP合成酶的核酸中至少含有对下述(a)、(b)或(c)的蛋白质进行编码的核酸。
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有牻牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
(c)具有与序列号2所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有牻牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
需要说明的是，关于(c)中氨基酸序列的同源性，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
作为NPP合成酶的具体例，可以举出源自于西红柿(Solanum lycopersicum)的酶(基因银行注册编号：(GenBankAccession No.):FJ797956)等。
序列号3中示出与编码上述源自于西红柿的NPP合成酶的核酸(DNA)的碱基序列对应的氨基酸序列，序列号4中仅示出氨基酸序列。具有序列号3所示的碱基序列的DNA为编码NPP合成酶的核酸的一个例子。
并且，编码NPP合成酶的核酸中至少含有对下述(d)、(e)或(f)的蛋白质进行编码的核酸。
(d)由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(e)由在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
(f)具有与序列号4所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
关于需要说明的是(f)中的氨基酸序列的同源性，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
在本发明的重组细胞中，关于“编码牻牛儿基二磷酸(GPP)合成酶的核酸”和“编码橙花基二磷酸(NPP)合成酶的核酸”，可以仅导入其中一种核酸，也可以导入两种核酸。
作为β-水芹烯合成酶及对其进行编码的核酸的具体例，可以举出：源自于西红柿(Solanum lycopersicum)的酶(基因银行注册编号：(GenBankAccessionNo.):FJ797957；Schilmiller,A.L.,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.,2009,106,10865-70.)、源自于薰衣草(Lavandula angustifolia)的酶(基因银行注册编号：(GenBankAccession No.)：HQ404305；Demissie,Z.A.,et al.,Planta,2011,.233,685-96)等。
序列号5中示出与上述源自于西红柿的编码β-水芹烯合成酶的核酸(DNA)的碱基序列对应的氨基酸序列，序列号6中仅示出氨基酸序列。
序列号7中示出与上述源自于薰衣草的编码β-水芹烯合成酶的核酸(DNA)的碱基序列对应的氨基酸序列，序列号8中仅示出氨基酸序列。
具有序列号5或序列号7所示的碱基序列的DNA为编码β-水芹烯合成酶的核酸的一个例子。
并且，在编码β-水芹烯合成酶的核酸中至少含有对下述(g)、(h)或(i)的蛋白质进行编码的核酸。
(g)由序列号6或8所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(h)由在序列号6或8所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质、
(i)具有与序列号6或8所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质。
需要说明的是，关于(i)中的氨基酸序列的同源性，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
作为本发明的重组细胞中的宿主细胞没有特别限定，可以为原核细胞、真核细胞中的任一种。作为原核细胞的例子，可以举出：细菌、放线菌。作为细菌的例子，可以举出：大肠杆菌等埃希氏菌(Escherichia)属细菌、枯草菌等芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属细菌、蓝细菌(蓝藻)、梭菌(Clostridium)属细菌、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属细菌等。其中，特别优选容易大量培养的大肠杆菌。
作为真核细胞的例子，可以举出：酵母、丝状菌、真核微藻类、植物细胞、动物细胞。
作为酵母的例子，可以举出：发面酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、粉状毕赤酵母(Pichiafarinosa)、Pichia pinus、Pichia varijii、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、Saccharomyces elluris、产朊假丝酵母(Candida utilis)、季力蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii)、亨利汉逊酵母(Hansenula henricii)、M碎囊汉逊酵母(Hansenulacapsulata)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、土星汉逊酵母(Hansenulasaturnus)、桔林油脂酵母(Lypomyces kononenkoae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、溶脂假丝酵母(Candida lipolytica)、扣囊复膜酵母(Saccaromycopsis fibuligera)、路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、黄金银耳(Tremella mesenterica)、产酸结合酵母(Zygosaccharomyces acidofaciens)、发酵结合酵母(Zygosaccharomycesfermentati)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)及大豆结合酵母(Zygosaccharomyces soja)等。其中，特别优选选择容易大量培养的酵母。
另外，宿主细胞优选不具有甲烷单加氧酶(EC 1.14.13.25)。
作为将编码GPP合成酶、NPP合成酶、β-水芹烯合成酶的各核酸导入宿主细胞的方法没有特别限定，只要根据宿主细胞的种类等适宜选择即可。例如可以使用可导入宿主细胞且可表达插入的核酸的载体。
例如在宿主细胞为细菌等原核生物的情况下，作为该载体，可以使用可在宿主细胞中自主复制的载体、或者可整合至染色体中的并在能够对所插入的上述核酸(DNA)进行转录的位置含有启动子的载体。例如优选使用该载体在宿主细胞内构建由启动子、核糖体结合序列、上述核酸(DNA)及转录终结序列构成的一系列的结构。
作为可在宿主细胞为大肠杆菌的情况下使用的载体，优选所谓的多拷贝型的载体，可以举出：具有源自于ColE1的复制开始点的质粒、例如pUC系的质粒及pBR322系的质粒或者其衍生物。更具体而言，例如可以使用pUC19[Gene,33,103(1985)]、pUC18、pBR322、pHelix1(Roche Diagnostics株式会社制造)、pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotech株式会社制造)、pSE280(Invitrogen株式会社制造)、pGEMEX-1(Promega株式会社制造)、pQE-8(Qiagen株式会社制造)、pET-3(Novagen株式会社制造)、pBluescriptIISK(+)、pBluescript II KS(+)(Stratagene株式会社制造)、pSTV28(Takarabio株式会社制造)、pUC118(Takarabio株式会社制造)等。作为载体上的启动子，只要可在大肠杆菌等宿主细胞中启动就可以为任一启动子。例如也可以使用trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子等以T7启动子等源自于大肠杆菌及噬菌体等的启动子及如tac启动子、lacT7启动子的人为设计改变的启动子等。
在宿主细胞为酵母的情况下也基本上相同，作为该载体的结构，优选具有用于在宿主酵母内稳定地维持的复制体系、可转录所插入的上述核酸(DNA)的启动子及终止子序列。例如该载体可以为可在宿主酵母中复制或可整合至宿主染色体内的质粒。另外，该载体可以为各自可通过选择性的切割部位进行分离的、可对期望的DNA序列的重复复制的表达进行编码的载体。
能够在酵母中启动的启动子的种类没有特别限定，例如可以使用异柠檬酸裂合酶基因的启动子、AOX1启动子、GAPDH启动子、PHO5启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)启动子、ADHI启动子、MFα1启动子及GAL10启动子等。
在使用载体将各核酸导入宿主细胞的情况下，可以将各核酸整合到1个载体，也可以整合到分别的载体。并且，在1个载体中整合多个核酸的情况下，可以使各核酸在通用的启动子下表达，也可以使其在分别的启动子下表达。
在宿主细胞具有α-水芹烯合成酶的情况下，优选预先敲除宿主细胞的α-水芹烯合成酶。但是，通常具有α-水芹烯合成酶的生物仅为植物，因此，通常至少在以细菌及酵母为宿主细胞的情况下不需要该操作。
在本发明的重组细胞中，除对GPP合成酶、NPP合成酶、β-水芹烯合成酶进行编码的各核酸以外，可以导入其它的核酸。在一个实施方式中，还导入对至少1个在异戊烯基二磷酸(IPP)的合成路径发挥作用的酶进行编码的核酸，该核酸在宿主细胞内表达。所导入的该核酸可以为单独的1种，也可以为2种以上。
通常，IPP的合成路径可大致分为甲羟戊酸路径(MVA路径)和非甲羟戊酸路径(MEP路径)这两个。
真核生物具备甲羟戊酸路径，该路径以乙酰CoA为起始物质。作为在甲羟戊酸路径中发挥作用的酶，可从上游开始依次举出：乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶。
另一方面，原核生物及叶绿体/质体具备非甲羟戊酸路径，该路径以甘油醛3-磷酸(GAP)和丙酮酸为起始物质。作为在非甲羟戊酸路径发挥作用的酶，可从上游开始依次举出：DOXP合成酶、DOXP还原异构酶、4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藓醇合成酶、4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶、2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合成酶、HMB-PP合成酶、HMB-PP还原酶。
本实施方式中进一步导入的核酸编码的“在IPP合成路径中发挥作用的酶”优选在甲羟戊酸路径中发挥作用的酶。
作为在甲羟戊酸路径中发挥作用的酶，可以举出：乙酰CoA乙酰转移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯基二磷酸异构酶。其中，例如只要对导入的核酸进行选择，使HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、5-磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶及异戊烯基二磷酸异构酶构成的酶在宿主细胞内表达即可。
真核生物均具有甲羟戊酸路径，但在真核生物以外也发现了甲羟戊酸路径。作为在真核生物中具有甲羟戊酸路径的细菌，放线菌中可以举出：链霉菌菌株CL190(Streptomyces sp.Strain CL190)(Takagi M.et al.,J.Bacteriol.2000,182(15),4153-7)、灰色孢链霉菌MF730-N6(Streptomyces griseolosporeusMF730-N6)(Hamano Y.et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.2001,65(7),1627-35)。
在细菌中，可以举出：瑞士乳杆菌(Lactobacillus helvecticus)(Smeds A et al.,DNA seq.2001,12(3),187-190)、无枝菌酸棒杆菌(Corynebacteriumamycolatum)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、粪链球菌(Enterococcus faecalis)、无乳链球菌(Streptococussagalactiae)、橙黄色黏球菌等(Myxococcus xanthus)(Lombard J.et al.,Mol.Biol.Evol.2010,28(1),87-99)。
在古细菌中，可以举出：气火菌属(Aeropyrum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、脱硫古球菌属(Desulfurococcus)、盐古杆菌属(Halobacterium)、热变形菌属(Thermoproteus)、甲烷热球菌属(Methanococcus)、热火球古菌属(Pyrococcus)、火球菌属(Thermococcus)、甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)、热原体属(Thermoplasma)等(Lombard J.et al.,Mol.Biol.Evol.2010,28(1),87-99)。
作为在上述甲羟戊酸路径中发挥作用的酶的来源没有特别限定，但特别优选采用酵母或放线菌的甲羟戊酸路径中发挥作用的酶。
关于这些酶，除天然存在的酶以外，也可以为各酶的修饰体。例如为各酶的氨基酸置换修饰体及各酶的部分片段，也可以为具有同样的酶活性的多肽。
作为培养本发明的重组细胞的方法没有特别限定，可以根据宿主细胞的种类等适宜进行。
在重组细胞为好氧性及专性厌氧性的情况下，例如可以进行使用了液体培养基的通风、搅拌培养。
在重组细胞为绝对厌氧性的情况下，例如可以通过用高纯度的或者脱氧处理后的氮等气体置换气相，并且，培养液中适量添加硫化钠、半胱氨酸等还原剂来进行培养。
关于培养基，只要为重组细胞会繁殖的培养基就没有特别限定。作为培养基的主要碳源，优选使用糖类及蛋白质分解物这样的有机碳源。作为糖类，可以举出：单糖(葡萄糖等)、二糖(麦芽糖等)、寡糖、多糖(淀粉等)、糖醇等。作为蛋白质分解物，可以举出：蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白水解物等。
可以通过培养本发明的重组细胞来大量地生产β-水芹烯。作为β-水芹烯的生产能力，湿润菌体1g可实现β-水芹烯10mg以上的生产量。
在培养本发明的重组细胞产生β-水芹烯的情况下，与以合成化学的方法生产的情况不同，实质上不会产生α-水芹烯的混入。
所生产的β-水芹烯可释放到重组细胞的细胞外或蓄积在细胞内。在本发明中，可以对任一种β-水芹烯进行回收，具体而言，可以从菌体破碎物、培养液(培养上清)、培养体系的气相等中回收。优选对释放到细胞外的β-水芹烯进行回收，具体而言，从培养液(培养上清)及培养体系的气相中回收。
作为从重组细胞的培养物中分离、精制β-水芹烯的方法，例如可以用戊烷等适当的溶剂萃取培养液(培养上清)，并且，通过反相色谱、气相色谱等色谱高纯度地进行纯化。释放到细胞外的β-水芹烯在气相中会蒸发，因此，也可用冷阱等对这些进行液化、回收。
下面，举出实施例对本发明进一步具体地进行说明，但本发明并不仅限定于这些实施例。
实施例1
在本实施中，制作导入了源自于西红柿的NPP合成酶基因和源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因的重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌生产β-水芹烯。
(1)源自于西红柿的NPP合成酶基因的分离
以源自于西红柿(Solanum lycopersicum)的总RNA为模板，通过使用了序列号9和序列号10所示的引物的RT-PCR，对编码源自于西红柿的NPP合成酶的核酸(源自于西红柿的NPP合成酶基因、序列号3、(基因银行注册编号：(GenBankAccession No.)FJ797956)进行扩增。将所得到的核酸用NdeI及EcoRI切割后，导入pET23a载体(Novagen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于西红柿的NPP合成酶表达载体pT21TNPP。
(2)源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因的分离
以源自于西红柿的的总RNA为模板，通过使用了序列号11和序列号12所示的引物的RT-PCR，对编码源自于西红柿的β-水芹烯合成酶的核酸(源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因、序列号5、(基因银行注册编号：(GenBankAccession No.)FJ797957)进行扩增。将所得到的核酸用NcoI及BamHI切割后，导入到pACYCDuet-1载体(Novagen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于西红柿的β-水芹烯合成酶表达载体pACTPD。
(3)具有β-水芹烯生产能力的重组大肠杆菌的制作
将上述(1)、(2)中所得到的表达载体pT23TNPP及pACTPD导入大肠杆菌BL21(DE3)株，制作具有β-水芹烯生产能力的重组大肠杆菌BL21BPD1。
作为对照，另行制作仅导入了未插有核酸的pET23a载体的重组大肠杆菌以及仅导入了未插有核酸的pACYCDuet-1载体的重组大肠杆菌。
(4)β-水芹烯生产
将重组大肠杆菌BL21BPD1在含有氨苄青霉素100μg/mL及氯霉素34μg/mL的2×YT培养基(1.6％(w/v)细菌用蛋白胨,1％(w/v)酵母抽提物,0.5％(w/v)NaCl)中，在30℃、110rpm(旋转)的条件下培养30小时。此时，自培养开始16小时后制成密闭体系。培养结束后，通过离心分离得到菌体和培养上清。
破碎菌体，用戊烷萃取破碎液的上清。将该萃取分率用气相色谱进行分析，结果，检测到β-水芹烯。另外，分析气相分率，结果，在气相中也检测到β-水芹烯。
关于培养上清也用戊烷萃取。将该萃取分率用气相色谱进行分析，结果，检测到β-水芹烯。
另一方面，在仅导入了pET23a载体或者pACYCDuet-1载体的对照的重组大肠杆菌中，菌体、培养上清及气相中均未检测到β-水芹烯。
由以上显示，可通过反对导入了源自于西红柿的NPP合成酶基因和源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因的重组大肠杆菌进行培养，来生产β-水芹烯。另外，所生产的β-水芹烯可从菌体、培养上清及气相中回收。
实施例2
在本实施中，制作导入了源自于拟南芥的GPP合成酶基因和源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌生产β-水芹烯。
(1)源自于拟南芥的GPP合成酶基因的分离
以源自于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的总RNA为模板，通过使用了序列号13和序列号14所示引物的RT-PCR对编码源自于拟南芥的GPP合成酶的核酸(源自于拟南芥的GPP合成酶基因、序列号1、基因银行注册编号(GenBankAccession No.)：Y17376)进行扩增。将所得到的核酸用NdeI及EcoRI切割后，导入至pET23a载体(Novagen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于拟南芥的GPP合成酶表达载体pT23AGPP。
(2)源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的分离
以源自于薰衣草(Lavandula angustifolia)的总RNA为模板，通过使用了序列号15和序列号16所示引物的RT-PCR对编码源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶的核酸(源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因、序列号7、基因银行注册编号(GenBankAccession No.)：HQ404305)进行扩增。将所得到的核酸用NcoI及EcoRI切割后，导入至pACYCDuet-1载体(Novagen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶表达载体pACLPD。
(3)具有β-水芹烯生产能力的重组大肠杆菌的制作
将上述(1)、(2)中所得到的表达载体pT23AGPP及pACLPD导入大肠杆菌BL21(DE3)株，制作具有β-水芹烯生产能力的重组大肠杆菌BL21BPD2。
作为对照，另行制作仅导入了未插有核酸的pET23a载体的重组大肠杆菌以及仅导入了未插有核酸的pACYCDuet-1载体的重组大肠杆菌。
(4)β-水芹烯生产
将重组大肠杆菌BL21BPD2在含有氨苄青霉素100μg/mL及氯霉素34μg/mL的2×YT培养基中，在30℃、110rpm(旋转)的条件下培养30小时。此时，自培养开始16小时后设为密闭体系。培养结束后，通过离心分离得到菌体和培养上清。
破碎菌体，用戊烷萃取破碎液的上清。将该萃取分率用气相色谱进行分析，结果，检测到β-水芹烯。
关于培养上清也用戊烷萃取。将该萃取分率用气相色谱进行分析，结果，检测到β-水芹烯。另外，分析气相分率，结果，在气相中也检测到β-水芹烯。
另一方面，在仅导入了pET23a载体或者pACYCDuet-1载体的对照的重组大肠杆菌中，菌体、培养上清及气相中均未检测到β-水芹烯。
由以上显示，可通过培养导入了源自于拟南芥的GPP合成酶基因和源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的重组大肠杆菌，来生产β-水芹烯。另外，所生产的β-水芹烯可从菌体、培养上清及气相中回收。
实施例3
在本实施中，制作导入了源自于西红柿的NPP合成酶基因和源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因的重组酵母，培养该重组酵母生产β-水芹烯。
(1)源自于西红柿的NPP合成酶基因的分离
以源自于西红柿的的总RNA为模板，通过使用了序列号13和序列号14所示的引物的RT-PCR，对编码源自于西红柿的NPP合成酶的核酸(源自于西红柿的NPP合成酶基因、序列号3、基因银行注册编号(GenBankAccessionNo.)：FJ797956)进行扩增。将所得到的核酸用BamHI切割后，导入至pPIC3.5K载体(Invitrogen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于西红柿的NPP合成酶表达载体pP3.5TNPP。
(2)源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因的分离
以源自于西红柿的的总RNA为模板，通过使用了序列号19和序列号20所示引物的RT-PCR，对编码源自于西红柿的β-水芹烯合成酶的核酸(源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因、序列号5、基因银行注册编号(GenBankAccession No.)：FJ797957)进行扩增。将所得到的核酸用BamHI切割后，导入至pPIC3.5K载体(Invitrogen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于西红柿的β-水芹烯合成酶表达载体pP3.5TPD。
(3)具有β-水芹烯生产能力的重组酵母的制作
对甲醇利用性酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115株(Invitrogen株式会社)利用上述(1)、(2)中所得到的表达载体pP3.5TNPP及pP3.5TPD的等量混合物进行转化。转化的方法按照Invitrogen株式会社的手册(No.25-0156、No.25-0043)进行。为了得到多拷贝的基因导入体，获得1.5mg/mL浓度的遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen株式会社)抗性株。由此，获得重组酵母GSNP-1，其具有各自多个复制的源自于西红柿的NPP合成酶基因及源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因。
作为对照，获得仅导入了未插有核酸的pPIC3.5K载体的、浓度为1.5mg/mL的遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen株式会社)抗性株(重组酵母GS115)。
(4)β-水芹烯生产
将GSNP-1在MGY培养基(1.34％(w/v)YNB,1％(w/v)甘油(glycerol),4×10-5％(w/v)生物素(biotin)；YMB:13.4％(w/v)酵母氮源(yeast nitrogen base),10％(w/v)硫酸铵(ammonium sulfate))(Invitrogen株式会社手册No.25-0043)中进行预培养后，回收菌体，将回收菌体在发酵基础盐(Fermentation basal salts)培养基(85％磷酸26.7ml,硫酸钙0.093％(w/v),硫酸钾1.82％(w/v),硫酸镁-7H2O 1.49％(w/v),氢氧化钾0.413％(w/v),甘油4.0％(w/v))(Invitrogen株式会社手册Ver.B 053002)中主培养64小时。此时，自培养开始24小时后制成密闭体系。为了诱导导入的酶基因进行表达，在自培养开始经过24小时时和经过48小时时，在培养液中添加1/200容积的100％甲醇。培养结束后，通过离心分离回收菌体及培养上清。
通过玻璃珠法(Invitrogen株式会社手册No.25-0043)使菌体破碎，得到上清。将该上清的戊烷萃取物用气相色谱分析，结果，检测到β-水芹烯。
关于培养上清也用戊烷萃取。将该萃取分率用气相色谱进行分析，结果，检测到β-水芹烯。另外，分析气相分率，结果，在气相中也检测到β-水芹烯。
另一方面，在仅导入了pPIC3.5K载体的对照的重组酵母GS115中，菌体、培养上清及气相中均未检测到β-水芹烯。
由以上显示，可通过培养导入了源自于西红柿的NPP合成酶基因和源自于西红柿的β-水芹烯合成酶基因的重组酵母，来生产β-水芹烯。另外，所生产的β-水芹烯可从菌体、培养上清及气相中回收。
实施例4
在本实施中，制作导入了源自于拟南芥的GPP合成酶基因和源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的重组酵母，培养该重组酵母生产β-水芹烯。
(1)源自于拟南芥的GPP合成酶基因的分离
以源自于拟南芥的的总RNA为模板，通过使用了序列号21和序列号22所示引物的RT-PCR对编码源自于拟南芥的GPP合成酶的核酸(源自于拟南芥的GPP合成酶基因、序列号1、基因银行注册编号(GenBankAccession No.)：Y17376)进行扩增。将所得到的核酸用BamHI切割后，导入至pPIC3.5K载体(Invitrogen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于拟南芥的GPP合成酶表达载体pP3.5AGPP。
(2)源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的分离
以源自于薰衣草的的总RNA为模板，通过使用了序列号23和序列号24所示引物的RT-PCR对编码源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶的核酸(源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因、序列号7、基因银行注册编号(GenBankAccessionNo.)：HQ404305)进行扩增。将所得到的核酸用EcoRI切割后，导入至pPIC3.5K载体(Invitrogen株式会社)。确认载体中所导入的核酸的碱基序列，确认到没有差异。由此，制作源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶表达载体pP3.5LPD。
(3)具有β-水芹烯生产能力的重组酵母的制作
对甲醇利用性酵母毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115株(Invitrogen株式会社)用上述(1)、(2)中所得到的表达载体pP3.5AGPP及pP3.5LPD的等量混合物进行转化。转化的方法按照Invitrogen株式会社的手册(No.25-0156、No.25-0043)进行。为了得到多拷贝的基因导入体，获得浓度为1.5mg/mL的遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen株式会社)抗性株。由此，获得重组酵母GSNP-2，其具有各自多个复制的源自于拟南芥的GPP合成酶基因及源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因。
(4)β-水芹烯生产
将GSNP-2在MGY培养基(Invitrogen株式会社手册No.25-0043)中进行预培养后，回收菌体，将回收菌体在发酵基础盐(Fermentation basal salts)培养基(Invitrogen株式会社手册Ver.B 053002)中主培养64小时。为了诱导导入的酶基因进行表达，在自培养开始经过24小时时和经过48小时时，在培养液中添加1/200容积的100％甲醇。此时，自培养开始24小时后制成密闭体系。培养结束后，通过离心分离回收菌体及培养上清。
通过玻璃珠法(Invitrogen株式会社手册No.25-0043)使菌体破碎，得到上清。将该上清的戊烷萃取物用气相色谱分析，结果，检测到β-水芹烯。
关于培养上清也用戊烷萃取。将该萃取分率用气相色谱进行分析，结果，检测到β-水芹烯。另外，分析气相分率，结果，在气相中也检测到β-水芹烯。
另一方面，在仅导入了pPIC3.5K载体的对照的重组酵母GS115(实施例3中制作)中，菌体、培养上清及气相中均未检测到β-水芹烯。
由以上显示，可通过培养导入了源自于拟南芥的GPP合成酶基因和源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的重组酵母，来生产β-水芹烯。另外，所生产的β-水芹烯可从菌体、培养上清及气相中回收。
实施例5
在本实施中，制作导入了源自于西红柿的NPP合成酶基因和源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，并进行水芹烯的产生确认和副产物的鉴定。
将实施例2中制作的pACLPD用NCOI及EcoRI切割，切下源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因，导入至pCOLADuet-1(Novagen株式会社)的NcoI及EcoRI切割部位，构建pCODLFS。另一方面，以实施例1中制作的pT21TNPP为模板使用序列号25及26的引物进行PCR，对源自于西红柿的NPP合成酶基因进行扩增。将扩增的片段用NdeI及KpnI切割，导入上述pCODLFS的NdeI及KpnI切割部位，构建共表达载体pCOLDFSNS。将上述pCOLDFSNS导入至Rosetta2(DE3)，得到对源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶及源自于西红柿的NPP合成酶进行共表达的重组大肠杆菌ROFSNS。作为对照大肠杆菌，制作仅具有pCOLA Duet-1的重组大肠杆菌ROCOLA。
将重组大肠杆菌ROFSNS及ROCOLA在含有氯霉素34μg/mL及卡那霉素15μg/mL的2×YT培养基(1.6％(w/v)细菌用蛋白胨(Bacto Tription),1％(w/v)酵母抽提物(Yeast Extract),0.5％(w/v)NaCl)中，在18℃、110rpm(旋转)的条件下以密闭体系培养24小时。培养结束后，通过GC-MS分析气相分率。如图1所示，在ROFSNS中，检测到β-水芹烯(峰A)，也检测到认为是副产物的峰B及C。另一方面，在ROCOLA中，未检测到这些峰。另外，进行各峰的鉴定，结果，如图2所示，在ROFSNS的培养气相中，除主要生成物即β-水芹烯以外，也生成少量的作为副产物的柠檬烯(峰B)及月桂烯(峰C)。
利用ROFSNS的β-水芹烯在气相中的生成量为750μg/L培养液。
实施例6
在本实施中，制作导入了源自于放线菌的甲羟戊酸路径基因、源自于西红柿的NPP合成酶基因及源自于薰衣草的β-水芹烯合成酶基因的重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌生产β-水芹烯。
以灰色孢链霉菌(Streptomyces griseolosporeus)(Kitasatospora griseola)的基因组DNA为模板，通过使用了序列号27和序列号28所示引物的PCR对编码灰色孢链霉(S.griseolosporeus)的甲羟戊酸路径酶的核酸(序列号29)进行扩增。在该核酸中含有编码甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶、甲羟戊酸磷酸激酶、IPP异构酶、HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A)还原酶(HMGR)及HMG-CoA合成酶的基因簇。向pT7-Blue T载体克隆所得到的扩增DNA片段，构建pT7SMV。
对由上述载体pT7SMV用NcoI及EcoRI切割而回收得到的基因片段导入至pCOLA Duet-1(Novagen株式会社)的NcoI及EcoRI切割位点，构建pCSMV。
向pCSMV的NdeI-KpnI切割部位导入序列号30所示的西红柿NPP合成酶基因、薰衣草β-水芹烯合成酶基因操纵子的合成核酸，构建含有放线菌甲羟戊酸路径基因、西红柿NPP合成酶基因及薰衣草β-水芹烯合成酶基因的pCSMVNSFS。将表达载体pCSMVNSFS导入至大肠杆菌Rosetta2(DE3)，得到重组大肠杆菌ROSMVNSFS。
将重组大肠杆菌ROSMVNSFS在含有氯霉素34μg/mL及卡那霉素15μg/mL的2×YT培养基(1.6％(w/v)细菌用蛋白胨,1％(w/v)酵母抽提物,0.5％(w/v)NaCl)中，在18℃、110rpm(旋转)的条件下以密闭体系培养24小时。培养结束后，通过气相色谱分析气相分率，结果，检测到β-水芹烯。β-水芹烯在气相中的生成量为8.5mg/L培养液。
从以上的结果和实施例5中的β-水芹烯生成量考虑，可通过进一步导入放线菌MVA路径基因来增大β-水芹烯的产生量。

Claims (14)

1.一种具有β-水芹烯生产能力的重组细胞，其将选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的核酸及编码橙花基二磷酸合成酶的核酸中的至少1种核酸和编码β-水芹烯合成酶的核酸导入宿主细胞而成，且这些核酸在宿主细胞内表达。
2.如权利要求1所述的重组细胞，其中，宿主细胞不具有甲烷单加氧酶。
3.如权利要求2所述的重组细胞，其中，宿主细胞为大肠杆菌或酵母。
4.如权利要求1～3中任一项所述的重组细胞，其中，重组细胞的湿润菌体1g能够生产10mg以上的β-水芹烯。
5.如权利要求1～4中任一项所述的重组细胞，其中，编码牻牛儿基二磷酸合成酶的核酸对下述(a)、(b)或(c)的蛋白质进行编码，
(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(b)由在序列号2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有牻牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
(c)具有与序列号2所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有牻牛儿基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
6.如权利要求1～5中任一项所述的重组细胞，其中，编码橙花基二磷酸合成酶的核酸对下述(d)、(e)或(f)的蛋白质进行编码，
(d)由序列号4所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(e)由在序列号4所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质、
(f)具有与序列号4所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白质。
7.如权利要求1～6中任一项所述的重组细胞，其中，编码β-水芹烯合成酶的核酸对下述(g)、(h)或(i)的蛋白质进行编码，
(g)由序列号6或8所示的氨基酸序列构成的蛋白质、
(h)由在序列号6或8所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加有1～20个氨基酸而成的氨基酸序列构成，且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质、
(i)具有与序列号6或8所示的氨基酸序列显示60％以上的同源性的氨基酸序列，且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质。
8.如权利要求1～7中任一项所述的重组细胞，其还导入对在异戊烯基二磷酸的合成路径中发挥作用的至少1个酶进行编码的核酸，该核酸在宿主细胞内表达。
9.如权利要求8所述的重组细胞，其中，异戊烯基二磷酸的合成路径为甲羟戊酸路径。
10.如权利要求9所述的重组细胞，其中，所述甲羟戊酸路径为酵母或放线菌的甲羟戊酸路径。
11.一种β-水芹烯的生产方法，其包括：通过培养权利要求1～10中任一项所述的重组细胞来使该重组细胞生产β-水芹烯。
12.如权利要求11所述的β-水芹烯的生产方法，其包括：使重组细胞的湿润菌体1g生产10mg以上的β-水芹烯。
13.如权利要求11或12所述的β-水芹烯的生产方法，其包括：对释放到重组细胞的细胞外的β-水芹烯进行回收。
14.如权利要求11～13中任一项所述的β-水芹烯的生产方法，其包括：从重组细胞的培养体系的气相中回收β-水芹烯。
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