KR20150059649A

KR20150059649A - 재조합 세포, 및 β-펠란드렌의 생산 방법

Info

Publication number: KR20150059649A
Application number: KR1020157008333A
Authority: KR
Inventors: 마사히로 후루따니; 아끼히로 우에니시; 고이찌로 이와사; 야스유끼 고리; 세이지 다까하시; 다께후미 시모야마
Original assignee: 세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤; 도호쿠 다이가쿠
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2013-09-19
Publication date: 2015-06-01
Also published as: WO2014046174A1; EP2899263A1; US20150218589A1; US9617563B2; JP2014076042A; EP2899263A4; CN104797704A

Abstract

본 발명은, β-펠란드렌을 고순도이면서도 대량으로 취득하기 위한 일련의 기술을 제공하는 것을 과제로 한다. 게라닐이인산(GPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산 및 네릴이인산(NPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 핵산과, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산이 숙주 세포에 도입되어 이루어지고, 또한 이들 핵산이 숙주 세포 내에서 발현되는, β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 세포가 제공된다. 당해 재조합 세포를 배양함으로써, 당해 재조합 세포에 β-펠란드렌을 생산시키는 β-펠란드렌의 생산 방법도 제공된다.

Description

재조합 세포, 및 β-펠란드렌의 생산 방법{RECOMBINANT CELL, AND METHOD FOR PRODUCING Β-PHELLANDRENE}

본 발명은 β-펠란드렌(β-phellandrene) 생산능을 갖는 재조합 세포, 및 당해 재조합 세포를 사용하는 β-펠란드렌의 생산 방법에 관한 것이다.

모노테르펜은, 디메틸알릴이인산(DMAPP)과 이소펜테닐이인산(IPP)이 축합된 게라닐이인산(GPP)을 생합성 전구체로 하는, 탄소 10개를 갖는 이소프렌 법칙에 따른 화합물의 총칭이다. 모노테르펜은, 현재 900종류 이상의 것이 알려져 있다.

모노테르펜은 장미나 감귤류와 같은 방향(芳香)을 가져, 향수 등에도 다용되고 있다. 예를 들어, 리모넨은 레몬 등 감귤류에 포함되는 향기 성분이며, 용제나 접착제 원료 등으로서도 이용되고 있다. 또한, 멘톨은 산뜻한 방향을 가져, 과자나 의약품에 청량제로서 사용되고 있다. 한편, 수지 산업에서는, β-피넨, α-피넨, 리모넨, α-펠란드렌 등이 접착제나 투명 수지 등의 단량체 원료로서 검토되고 있다(비특허문헌 1).

모노테르펜의 일종인 β-펠란드렌은, 새로운 중합체 재료로서의 용도가 기대되고 있다. β-펠란드렌은, α-펠란드렌에 비해 보다 고분자량의 중합체를 얻을 가능성이 있다. 그러나, 합성 화학적 방법에 의해 β-펠란드렌을 얻는 경우에는, 그의 이성체인 α-펠란드렌의 생성을 피할 수 없고, 또한 이들 이성체의 분리는 매우 곤란하다(비특허문헌 2). 그로 인해, 고순도의 β-펠란드렌을 얻는 것은 어렵고, 이것이 β-펠란드렌의 중합체 물성 등을 조사하는 것을 곤란하게 하고 있다.

한편, β-펠란드렌의 생합성 경로로서는, 게라닐이인산(GPP) 합성 효소 또는 네릴이인산(NPP) 합성 효소의 작용에 의해, 이소펜테닐이인산(IPP)으로부터 게라닐이인산(GPP) 또는 네릴이인산(NPP)이 생합성된다. 이어서, β-펠란드렌 합성 효소의 작용에 의해 GPP 또는 NPP로부터 β-펠란드렌이 생합성된다. 그리고, 토마토와 라벤더에 있어서, β-펠란드렌 합성 효소가 발견되어 있다(비특허문헌 3, 4).

특허문헌 1에는, 환상 테르펜 신타아제(환상 테르펜 합성 효소)를 코딩하는 핵산이 도입된 C1 대사 숙주 세포의 형질 전환체를 사용하여, 모노테르펜을 제조하는 방법에 대하여 기재되어 있다. 그의 실시예로서, 메틸로모나스속 세균의 형질 전환체를 사용하여 리모넨을 제조한 실험예가 기재되어 있다. 그러나, β-펠란드렌에 대해서는 언급은 있지만, 실시예는 개시되어 있지 않다. β-펠란드렌 합성 효소에 관한 언급도 있지만, β-펠란드렌 합성 효소와 그의 유전자의 구체예나 취득 방법, 나아가 β-펠란드렌을 생산할 수 있는 형질 전환체의 구체적 구성이나 구축 방법에 대해서는 개시되어 있지 않다.

일본 특허 공표 제2005-500805호 공보

Satou K., et al., Green Chemistry 2006, 8, 878-882 Mori K., Tetrahedron: Asymmetry 2006, 17, 2133-2142 Demissie, Z. A., et al., Planta. 2011, 233, 685-96. Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.

상기 현 상황을 감안하여, 본 발명은, β-펠란드렌을 고순도이면서도 대량으로 취득하기 위한 일련의 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양상은, 게라닐이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산 및 네릴이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 핵산과, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산이 숙주 세포에 도입되어 이루어지고, 또한 이들 핵산이 숙주 세포 내에서 발현되는, β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 세포이다.

본 발명은 β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 세포는, 「게라닐이인산(GPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산 및 네릴이인산(NPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 핵산」과, 「β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산」이 숙주 세포에 도입되어 이루어지는 것이며, 또한 이들 핵산이 숙주 세포 내에서 발현된다. 즉, 본 발명의 재조합 세포에서는, GPP 합성 효소 및/또는 NPP 합성 효소의 발현능과 β-펠란드렌 합성 효소의 발현능이 숙주 세포에 대하여 새롭게 부가 또는 증강되어 있다.

본 발명의 재조합 세포에서는, 세포 내에서 발현된 GPP 합성 효소의 작용에 의해 이소펜테닐이인산(IPP)으로부터 GPP가 합성되고/되거나 세포 내에서 발현된 NPP 합성 효소의 작용에 의해 IPP로부터 NPP가 합성된다. 또한, 세포 내에서 발현된 β-펠란드렌 합성 효소의 작용에 의해, GPP 및/또는 NPP로부터 β-펠란드렌이 합성된다. 그 결과, 본 발명의 재조합 세포를 배양함으로써, β-펠란드렌을 고순도이면서도 대량으로 생산할 수 있다.

바람직하게는, 숙주 세포는 메탄 모노옥시게나제를 갖지 않는 것이다.

바람직하게는, 숙주 세포는 대장균 또는 효모이다.

이러한 구성에 의해, 재조합 세포를 용이하게 대량 배양할 수 있다.

바람직하게는, 재조합 세포의 습윤 균체 1g당 10mg 이상의 β-펠란드렌을 생산 가능하다.

바람직하게는, 게라닐이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산은, 하기 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 코딩하는 것이다.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,

(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 20개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 게라닐이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질,

(c) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고, 또한 게라닐이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질

바람직하게는, 네릴이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산은, 하기 (d), (e) 또는 (f)의 단백질을 코딩하는 것이다.

(d) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,

(e) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 20개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 네릴이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질,

(f) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고, 또한 네릴이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질

바람직하게는, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산은, 하기 (g), (h) 또는 (i)의 단백질을 코딩하는 것이다.

(g) 서열 번호 6 또는 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,

(h) 서열 번호 6 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 20개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 β-펠란드렌 합성 효소의 활성을 갖는 단백질,

(i) 서열 번호 6 또는 8로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고, 또한 β-펠란드렌 합성 효소의 활성을 갖는 단백질

바람직하게는, 이소펜테닐이인산의 합성 경로에서 작용하는 적어도 1개의 효소를 코딩하는 핵산이 더 도입되고, 당해 핵산이 숙주 세포 내에서 발현된다.

이러한 구성에 의해, GPP 합성 효소나 NPP 합성 효소의 기질이 되는 IPP가 효율적으로 공급된다.

바람직하게는, 이소펜테닐이인산의 합성 경로는 메발론산 경로이다.

바람직하게는, 상기 메발론산 경로는 효모 또는 방선균의 메발론산 경로이다.

본 발명의 다른 양상은, 상기한 재조합 세포를 배양함으로써, 당해 재조합 세포에 β-펠란드렌을 생산시키는 β-펠란드렌의 생산 방법이다.

본 발명은, β-펠란드렌의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, 상기한 재조합 세포를 배양함으로써, 당해 재조합 세포에 β-펠란드렌을 생산시킨다. 본 발명에 따르면, β-펠란드렌을 고순도이면서도 대량으로 생산할 수 있다.

바람직하게는, 재조합 세포의 습윤 균체 1g당 10mg 이상의 β-펠란드렌을 생산시킨다.

바람직하게는, 재조합 세포의 세포 외로 방출된 β-펠란드렌을 회수한다.

바람직하게는, 재조합 세포의 배양계의 기상으로부터 β-펠란드렌을 회수한다.

본 발명에 따르면, β-펠란드렌을 고순도이면서도 대량으로 생산할 수 있다.

도 1은 실시예 5에서 행한 배양의 기상 획분을 GC-MS로 분석한 결과를 나타내는 토탈 이온 크로마토그램이며, (a)는 대조군의 재조합체, (b)는 β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합체의 경우이다.
도 2는 도 1(b)의 각 피크를 GC-MS로 동정한 결과를 나타내는 매스 스펙트럼이며, (a)는 피크 A(β-펠란드렌), (b)는 피크 B(리모넨), (c)는 피크 C(미르센)의 경우이다.

본 발명의 재조합 세포는, 게라닐이인산(GPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산 및 네릴이인산(NPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 핵산과, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산이 숙주 세포에 도입되어 이루어지고, 또한 이들 핵산이 숙주 세포 내에서 발현되는 재조합 세포이고, β-펠란드렌 합성능을 갖는 것이다.

GPP 합성 효소로서는, 재조합 세포 내에서 그의 효소 활성을 발휘할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없다. GPP 합성 효소를 코딩하는 핵산(유전자)에 대해서도 마찬가지이며, 재조합 세포 내에서 정상적으로 전사·번역되는 것이면 특별히 한정은 없다.

NPP 합성 효소, β-펠란드렌 합성 효소 및 이들을 코딩하는 핵산에 대해서도 마찬가지이다.

GPP 합성 효소의 구체예로서는, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래인 것(젠뱅크(GenBank) 기탁 번호: Y17376/At2g34630; Bouvier, F., et al., Plant J,. 2000, 24, 241-52.), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래인 것(젠뱅크 기탁 번호: NP_215504; Mann, F. M., et al., FEBS Lett., 2011, 585, 549-54.) 등을 들 수 있다.

서열 번호 1에 상기 애기장대 유래 GPP 합성 효소를 코딩하는 핵산(DNA)의 염기 서열과 대응하는 아미노산 서열, 서열 번호 2에 아미노산 서열만을 나타낸다. 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA는, GPP 합성 효소를 코딩하는 핵산의 일례가 된다.

또한, GPP 합성 효소를 코딩하는 핵산에는, 적어도 하기 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 코딩하는 핵산이 포함된다.

또한 (c)에 있어서의 아미노산 서열의 상동성에 대해서는, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상이다.

NPP 합성 효소의 구체예로서는, 토마토(Solanum lycopersicum) 유래인 것(젠뱅크 기탁 번호: FJ797956) 등을 들 수 있다.

서열 번호 3에 상기 토마토 유래 NPP 합성 효소를 코딩하는 핵산(DNA)의 염기 서열과 대응하는 아미노산 서열, 서열 번호 4에 아미노산 서열만을 나타낸다. 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA는, NPP 합성 효소를 코딩하는 핵산의 일례가 된다.

또한, NPP 합성 효소를 코딩하는 핵산에는, 적어도 하기 (d), (e) 또는 (f)의 단백질을 코딩하는 핵산이 포함된다.

또한 (f)에 있어서의 아미노산 서열의 상동성에 대해서는, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상이다.

본 발명의 재조합 세포에 있어서, 「게라닐이인산(GPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산」과 「네릴이인산(NPP) 합성 효소를 코딩하는 핵산」에 대해서는, 어느 한쪽의 핵산만이 도입된 것일 수도 있고, 양쪽의 핵산이 도입된 것일 수도 있다.

β-펠란드렌 합성 효소 및 그것을 코딩하는 핵산의 구체예로서는, 토마토(Solanum lycopersicum) 유래인 것(젠뱅크 기탁 번호: FJ797957; Schilmiller, A. L., et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 2009, 106, 10865-70.), 라벤더(Lavandula angustifolia) 유래인 것(젠뱅크 기탁 번호: HQ404305; Demissie, Z. A., et al., Planta, 2011, 233, 685-96) 등을 들 수 있다.

서열 번호 5에 상기 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산(DNA)의 염기 서열과 대응하는 아미노산 서열, 서열 번호 6에 아미노산 서열만을 나타낸다.

서열 번호 7에 상기 라벤더 유래의 β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산(DNA)의 염기 서열과 대응하는 아미노산 서열, 서열 번호 8에 아미노산 서열만을 나타낸다.

서열 번호 5 또는 서열 번호 7로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA는, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산의 일례가 된다.

또한, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산에는, 적어도 하기 (g), (h) 또는 (i)의 단백질을 코딩하는 핵산이 포함된다.

또한 (i)에 있어서의 아미노산 서열의 상동성에 대해서는, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 특히 바람직하게는 95％ 이상이다.

본 발명의 재조합 세포에 있어서의 숙주 세포로서는 특별히 한정은 없으며, 원핵 세포, 진핵 세포 중 어느 것일 수도 있다. 원핵 세포의 예로서는, 세균, 방선균을 들 수 있다. 세균의 예로서는, 대장균 등의 에스케리키아(Escherichia)속 세균, 고초균 등의 바실루스(Bacillus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균, 시아노박테리아(남조), 클로스트리듐(Clostridium)속 세균, 코리네박테륨(Corynebacterium)속 세균, 랄스토니아(Ralstonia)속 세균 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 대량 배양이 용이한 대장균이 특히 바람직하다.

진핵 세포의 예로서는, 효모, 사상균, 진핵 미세 조류, 식물 세포, 동물 세포를 들 수 있다.

효모의 예로서는, 사카로마이세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스·폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스·우바륨(Saccharomyces uvarum), 사카로마이세스·카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스·디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 칸디다·트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다·말토사(Candida maltosa), 칸디다·파라프실로시스(Candida parapsilosis), 피키아·파스토리스(Pichia pastoris), 피키아·파리노사(Pichia farinosa), 피키아·피누스(Pichia pinus), 피키아·반리지이(Pichia varijii), 피키아·페르멘탄스(Pichia fermentans), 피키아·구일리에르몬디(Pichia guilliermondii), 피키아·스티피티스(Pichia stipitis), 사카로마이세스·텔루리스(Saccharomyces elluris), 칸디다·유틸리스(Candida utilis), 칸디다·구일리에르몬디(Candida guilliermondii), 한세뉼라·헨리키이(Hansenula henricii), 한세뉼라·캡슐라타(Hansenula capsulata), 한세뉼라·폴리모르파(Hansenula polymorpha), 한세뉼라·사투르누스(Hansenula saturnus), 리포마이세스·코노넨코애(Lypomyces kononenkoae), 클루이베로마이세스·마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 칸디다·리폴리티카(Candida lipolytica), 사카로마이콥시스·피불리게라(Saccaromycopsis fibuligera), 사카로마이코데스·루드위기(Saccharomycodes ludwigii), 사카로마이세스·클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 트레멜라·메센테리카(Tremella mesenterica), 자이고사카로마이세스·아시도파시엔스(Zygosaccharomyces acidofaciens), 자이고사카로마이세스·퍼멘타티(Zygosaccharomyces fermentati), 야로위아·리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 자이고사카로마이세스·소야(Zygosaccharomyces soja) 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 대량 배양이 용이한 효모를 선택하는 것이 특히 바람직하다.

또한 숙주 세포는, 메탄 모노옥시게나제(EC 1.14.13.25)를 갖지 않는 것이 바람직하다.

GPP 합성 효소, NPP 합성 효소, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 각 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법으로서는 특별히 한정은 없으며, 숙주 세포의 종류 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포에 도입 가능하면서도 내장된 핵산을 발현 가능한 벡터를 사용할 수 있다.

예를 들어, 숙주 세포가 세균 등의 원핵 생물인 경우에는, 당해 벡터로서, 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 내장이 가능하며, 삽입된 상기 핵산(DNA)을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 당해 벡터를 사용하여, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 상기 핵산(DNA) 및 전사 종결 서열을 포함하는 일련의 구성을 숙주 세포 내에서 구축하는 것이 바람직하다.

숙주 세포가 대장균인 경우에 사용 가능한 벡터로서는, 소위 멀티 카피형인 것이 바람직하고, ColE1 유래의 복제 개시점을 갖는 플라스미드, 예를 들어 pUC계의 플라스미드나 pBR322계의 플라스미드 또는 그의 유도체를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕, pUC18, pBR322, pHelix1(로슈·다이아그노스틱스사제), pKK233-2(아머샴·파마시아·바이오테크사제), pSE280(인비트로젠사제), pGEMEX-1(프로메가사제), pQE-8(퀴아젠사제), pET-3(노바젠사제) pBluescriptII SK(+), pBluescript II KS(+)(스트라테이진사제), pSTV28(다카라 바이오사제), pUC118(다카라 바이오사제) 등을 사용할 수 있다. 벡터 상의 프로모터로서는, 대장균 등의 숙주 세포 중에서 작동할 수 있는 것이면 어떠한 것일 수도 있다. 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터(Plac), PL 프로모터, PR 프로모터 등의, T7 프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터 및 tac 프로모터, lacT7 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

숙주 세포가 효모인 경우에도 기본적으로 마찬가지이며, 당해 벡터의 구성으로서, 숙주 효모 내에서 안정적으로 유지하기 위한 복제계, 삽입된 상기 핵산(DNA)을 전사 가능한 프로모터 및 터미네이터 서열을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 당해 벡터는, 숙주 효모로 복제할 수 있거나 또는 숙주 염색체 내에 내장될 수 있는 플라스미드일 수도 있다. 또한, 당해 벡터는, 각각이 선택적인 절단 부위에 의해 분리되는, 원하는 DNA 서열의 반복 카피의 발현을 코딩할 수 있는 것일 수도 있다.

효모에서 작동 가능한 프로모터의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 이소시트르산리아제 유전자의 프로모터, AOX1 프로모터, GAPDH 프로모터, PHO5 프로모터, 글리세르알데히드-3-인산데히드로게나제(TDH3) 프로모터, ADHI 프로모터, MFα1 프로모터 및 GAL10 프로모터 등을 사용할 수 있다.

벡터를 사용하여 각 핵산을 숙주 세포에 도입하는 경우, 각 핵산을 1개의 벡터에 내장할 수도 있고, 각각의 벡터에 내장할 수도 있다. 또한, 1개의 벡터에 복수의 핵산을 내장하는 경우에는, 각 핵산을 공통의 프로모터하에서 발현시킬 수도 있고, 각각의 프로모터하에서 발현시킬 수도 있다.

숙주 세포가 α-펠란드렌 합성 효소를 갖는 것인 경우에는, 숙주 세포의 α-펠란드렌 합성 효소를 녹아웃해 두는 것이 바람직하다. 단, 일반적으로 α-펠란드렌 합성 효소를 갖는 생물은 식물뿐이기 때문에, 적어도 세균이나 효모를 숙주 세포로 하는 경우에 있어서는 당해 조작은 통상 필요 없다.

본 발명의 재조합 세포에 있어서는, GPP 합성 효소, NPP 합성 효소, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 각 핵산 이외에, 다른 핵산이 도입되어 있을 수도 있다. 1개의 실시 형태에서는, 이소펜테닐이인산(IPP)의 합성 경로에서 작용하는 적어도 1개의 효소를 코딩하는 핵산이 더 도입되고, 당해 핵산이 숙주 세포 내에서 발현된다. 도입되는 당해 핵산은 1종만일 수도 있고, 2종 이상일 수도 있다.

일반적으로, IPP의 합성 경로는 메발론산 경로(MVA 경로)와 비메발론산 경로(MEP 경로)의 2개로 크게 구별된다.

메발론산 경로는 진핵 생물이 구비하고 있는 것이며, 아세틸 CoA를 출발 물질로 하고 있다. 메발론산 경로에서 작용하는 효소로서는, 상류부터 순서대로 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제, HMG-CoA 신타아제, HMG-CoA 리덕타아제, 메발론산 키나아제, 5-포스포메발론산 키나아제, 디포스포메발론산 디카르복실라아제를 들 수 있다.

한편, 비메발론산 경로는 원핵 생물이나 엽록체·색소체가 구비하고 있는 것이며, 글리세르알데히드3-인산(GAP)과 피루브산을 출발 물질로 하고 있다. 비메발론산 경로에서 작용하는 효소로서는, 상류부터 순서대로 DOXP 신타아제, DOXP 리덕토이소메라아제, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 신타아제, 4-디포스포시티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나아제, 2-C-메틸-D-에리트리톨-2,4-시클로이인산 신타아제, HMB-PP 신타아제, HMB-PP 리덕타아제를 들 수 있다.

본 실시 형태에서 더 도입되는 핵산이 코딩하는 「IPP 합성 경로에서 작용하는 효소」는, 메발론산 경로에서 작용하는 효소가 바람직하다.

메발론산 경로에서 작용하는 효소군으로서는, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제, HMG-CoA 신타아제, HMG-CoA 리덕타아제, 메발론산 키나아제, 5-포스포메발론산 키나아제, 디포스포메발론산 디카르복실라아제, 이소펜테닐이인산 이소메라아제를 들 수 있다. 이 중, 예를 들어 HMG-CoA 신타아제, HMG-CoA 리덕타아제, 메발론산 키나아제, 5-포스포메발론산 키나아제, 디포스포메발론산 디카르복실라아제 및 이소펜테닐이인산 이소메라아제를 포함하는 효소군이 숙주 세포 내에서 발현되도록, 도입하는 핵산을 선택할 수 있다.

메발론산 경로는 모든 진핵 생물이 보유하고 있지만, 진핵 생물 이외에서도 발견되고 있다. 진핵 생물 이외에서 메발론산 경로를 갖는 것으로서는, 방선균에서는 스트렙토마이세스 sp. 스트레인(Streptomyces sp . Strain) CL190(Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182(15), 4153-7), 스트렙토마이세스 그리세올로스포레우스(Streptomyces griseolosporeus) MF730-N6(Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65(7), 1627-35)을 들 수 있다.

세균에서는 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helvecticus)(Smeds A et al., DNA seq. 2001, 12(3), 187-190), 코리네박테륨 아미콜라튬(Corynebacterium amycolatum), 미코박테륨 마리늄(Mycobacterium marinum), 바시실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococuss agalactiae), 마이소코쿠스 산투스(Myxococcus xanthus) 등을 들 수 있다(Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99).

고세균(archaea)에서는, 에로피룸(Aeropyrum)속, 술포로부스(Sulfolobus)속, 데술푸로콕쿠스(Desulfurococcus)속, 서모프로테우스(Thermoproteus)속, 할로박테륨(Halobacterium)속, 메타노코쿠스(Methanococcus)속, 서모코쿠스(Thermococcus)속, 피로코쿠스(Pyrococcus)속, 메타노피루스(Methanopyrus)속, 서모플라즈마(Thermoplasma)속 등을 들 수 있다(Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99).

상기 메발론산 경로에서 작용하는 효소군의 유래로서는 특별히 한정은 없지만, 효모 또는 방선균의 메발론산 경로에서 작용하는 효소군이 특히 바람직하게 채용된다.

이들 효소에 대해서는, 천연으로 존재하는 것 이외에 각 효소의 개변체일 수도 있다. 예를 들어, 각 효소의 아미노산 치환 변이체나, 각 효소의 부분 단편이며 마찬가지의 효소 활성을 갖는 폴리펩티드일 수도 있다.

본 발명의 재조합 세포를 배양하는 방법으로서는 특별히 한정은 없으며, 숙주 세포의 종류 등에 따라 적절히 행할 수 있다.

재조합 세포가 호기성이나 편성 혐기성인 경우에는, 예를 들어 액체 배지를 사용한 통기·교반 배양을 행할 수 있다.

재조합 세포가 절대 혐기성인 경우에는, 예를 들어 기상을 고순도 또는 탈산소 처리된 질소 등의 가스로 치환하고, 나아가 배양액도 황화나트륨, 시스테인 등의 환원제를 적당량 첨가함으로써 배양을 행할 수 있다.

배지에 대해서도, 재조합 세포가 육성되는 배지이면 특별히 한정은 없다. 배지의 주된 탄소원으로서는, 당류나 단백질 분해물과 같은 유기 탄소원을 사용하는 것이 바람직하다. 당류로서는, 단당(글루코오스 등), 이당(말토오스 등), 올리고당, 다당(전분 등), 당알코올 등을 들 수 있다. 단백질 분해물로서는, 펩톤, 트립톤, 카자미노산 등을 들 수 있다.

본 발명의 재조합 세포를 배양함으로써, β-펠란드렌을 대량으로 생산할 수 있다. β-펠란드렌의 생산 능력으로서는, 습윤 균체 1g당 β-펠란드렌 10mg 이상의 생산량이 실현 가능하다.

본 발명의 재조합 세포를 배양하여 β-펠란드렌을 생산하는 경우에는, 합성 화학적 방법으로 생산하는 경우와 달리 α-펠란드렌의 혼입은 실질적으로 일어나지 않는다.

생산된 β-펠란드렌은 재조합 세포의 세포 외로 방출되거나, 세포 내에 축적된다. 본 발명에 있어서는, 어떠한 β-펠란드렌도 회수할 수 있으며, 구체적으로는 균체 파쇄물, 배양액(배양 상청), 배양계의 기상 등으로부터 회수할 수 있다. 바람직하게는 세포 외로 방출된 β-펠란드렌을 회수하고, 구체적으로는 배양액(배양 상청)이나 배양계의 기상으로부터 회수한다.

재조합 세포의 배양물로부터 β-펠란드렌을 단리·정제하는 방법으로서는, 예를 들어 배양액(배양 상청)을 펜탄 등의 적절한 용매로 추출하고, 나아가 역상 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피 등의 크로마토그래피에 의해 고순도로 정제 할 수 있다. 세포 외로 방출된 β-펠란드렌은 기상으로도 증발되기 때문에, 콜드 트랩 등으로 이들을 액화하고, 회수하는 것도 가능하다.

이하, 실시예로 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예에서는, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자와 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 대장균을 제작하고, 당해 재조합 대장균을 배양하여 β-펠란드렌을 생산하였다.

(1) 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자의 단리

토마토(Solanum lycopersicum) 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 9와 서열 번호 10으로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 토마토 유래 NPP 합성 효소를 코딩하는 핵산(토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자, 서열 번호 3, 젠뱅크 기탁 번호: FJ797956)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 NdeI 및 EcoRI로 절단한 후, pET23a 벡터(노바젠(Novagen)사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 토마토 유래 NPP 합성 효소 발현 벡터 pT21TNPP를 제작하였다.

(2) 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자의 단리

토마토 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 11과 서열 번호 12로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산(토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자, 서열 번호 5, 젠뱅크 기탁 번호: FJ797957)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 NcoI 및 BamHI로 절단한 후, pACYCDuet-1 벡터(노바젠사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 발현 벡터 pACTPD를 제작하였다.

(3) β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 대장균의 제작

상기 (1), (2)에서 얻어진 발현 벡터 pT23TNPP 및 pACTPD를 대장균 BL21(DE3)주에 도입하여, β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 대장균 BL21BPD1을 제작하였다.

대조군으로서, 핵산이 삽입되지 않은 pET23a 벡터만을 도입한 재조합 대장균, 및 핵산이 삽입되지 않은 pACYCDuet-1 벡터만을 도입한 재조합 대장균을 별도 제작하였다.

(4) β-펠란드렌 생산

재조합 대장균 BL21BPD1을 암피실린 100μg/mL 및 클로람페니콜 34μg/mL를 포함하는 2×YT 배지(1.6％(w/v) 박토 트립톤(Bacto Tripton), 1％(w/v) 이스트 추출물(Yeast Extract), 0.5％(w/v) NaCl)에서, 30℃, 110rpm(선회)의 조건으로 30시간 배양하였다. 이때, 배양 개시로부터 16시간 후에 밀폐계로 하였다. 배양 종료 후, 원심 분리에 의해 균체와 배양 상청을 얻었다.

균체를 파쇄하고, 파쇄액의 상청을 펜탄으로 추출하였다. 이 추출 획분을 가스 크로마토그래피로 분석한 바, β-펠란드렌이 검출되었다. 또한, 기상 획분을 분석한 바, 기상에도 β-펠란드렌이 검출되었다.

배양 상청에 대해서도 펜탄으로 추출하였다. 이 추출 획분을 가스 크로마토그래피로 분석한 바, β-펠란드렌이 검출되었다.

한편, pET23a 벡터 또는 pACYCDuet-1 벡터만을 도입한 대조군의 재조합 대장균에서는, 균체, 배양 상청 및 기상의 어느 것으로부터도 β-펠란드렌은 검출되지 않았다.

이상으로부터, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자와 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 대장균을 배양함으로써, β-펠란드렌을 생산할 수 있는 것이 나타났다. 또한 생산된 β-펠란드렌은, 균체, 배양 상청 및 기상으로부터 회수 가능하였다.

실시예 2

본 실시예에서는, 애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자와 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 대장균을 제작하고, 당해 재조합 대장균을 배양하여 β-펠란드렌을 생산하였다.

(1) 애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자의 단리

애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 13과 서열 번호 14로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 애기장대 유래 GPP 합성 효소를 코딩하는 핵산(애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자, 서열 번호 1, 젠뱅크 기탁 번호: Y17376)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 NdeI 및 EcoRI로 절단한 후, pET23a 벡터(노바젠사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 애기장대 유래 GPP 합성 효소 발현 벡터 pT23AGPP를 제작하였다.

(2) 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자의 단리

라벤더(Lavandula angustifolia) 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 15와 서열 번호 16으로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산(라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자, 서열 번호 7, 젠뱅크 기탁 번호: HQ404305)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 NcoI 및 EcoRI로 절단한 후, pACYCDuet-1 벡터(노바젠사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 발현 벡터 pACLPD를 제작하였다.

(3) β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 대장균의 제작

상기 (1), (2)에서 얻어진 발현 벡터 pT23AGPP 및 pACLPD를 대장균 BL21(DE3)주에 도입하여, β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 대장균 BL21BPD2를 제작하였다.

(4) β-펠란드렌 생산

재조합 대장균 BL21BPD2를 암피실린 100μg/mL 및 클로람페니콜 34μg/mL를 포함하는 2×YT 배지에서, 30℃, 110rpm(선회)의 조건으로 30시간 배양하였다. 이때, 배양 개시로부터 16시간 후에 밀폐계로 하였다. 배양 종료 후, 원심 분리에 의해 균체와 배양 상청을 얻었다.

균체를 파쇄하고, 파쇄액의 상청을 펜탄으로 추출하였다. 이 추출 획분을 가스 크로마토그래피로 분석한 바, β-펠란드렌이 검출되었다.

배양 상청에 대해서도 펜탄으로 추출하였다. 이 추출 획분을 가스 크로마토그래피로 분석한 바, β-펠란드렌이 검출되었다. 또한, 기상 획분을 분석한 바, 기상에도 β-펠란드렌이 검출되었다.

이상으로부터, 애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자와 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 대장균을 배양함으로써, β-펠란드렌을 생산할 수 있는 것이 나타났다. 또한 생산된 β-펠란드렌은, 균체, 배양 상청 및 기상으로부터 회수 가능하였다.

실시예 3

본 실시예에서는, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자와 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 효모를 제작하고, 당해 재조합 효모를 배양하여 β-펠란드렌을 생산하였다.

(1) 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자의 단리

토마토 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 13과 서열 번호 14로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 토마토 유래 NPP 합성 효소를 코딩하는 핵산(토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자, 서열 번호 3, 젠뱅크 기탁 번호: FJ797956)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 BamHI로 절단한 후, pPIC3.5K 벡터(인비트로젠사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 토마토 유래 NPP 합성 효소 발현 벡터 pP3.5TNPP를 제작하였다.

(2) 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자의 단리

토마토 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 19와 서열 번호 20으로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산(토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자, 서열 번호 5, 젠뱅크 기탁 번호: FJ797957)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 BamHI로 절단한 후, pPIC3.5K 벡터(인비트로젠사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 발현 벡터 pP3.5TPD를 제작하였다.

(3) β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 효모의 제작

메탄올 자화성 효모 피키아 파스토리스 GS115주(인비트로젠사)를, 상기 (1), (2)에서 얻어진 발현 벡터 pP3.5TNPP 및 pP3.5TPD의 등량 혼합물로 형질 전환하였다. 형질 전환의 방법은, 인비트로젠사의 매뉴얼(No.25-0156, No.25-0043)에 따라 행하였다. 멀티 카피의 유전자 도입체를 얻기 위해, 1.5mg/mL 농도의 제네티신(Geneticin)(인비트로젠사) 내성주를 취득하였다. 이에 따라, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자 및 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 각각 복수 카피 유지하는 재조합 효모 GSNP-1을 취득하였다.

대조군으로서, 핵산이 삽입되지 않은 pPIC3.5K 벡터만을 도입한, 1.5mg/mL 농도의 제네티신(인비트로젠사) 내성주를 취득하였다(재조합 효모 GS115).

(4) β-펠란드렌 생산

GSNP-1을 MGY 배지(1.34％(w/v) YNB, 1％(w/v) 글리세롤(glycerol), 4×10^-5％(w/v) 비오틴(biotin); YMB: 13.4％(w/v) 이스트 니트로젠 베이스(yeast nitrogen base), 10％(w/v) 황산암모늄(ammonium sulfate))(인비트로젠사 매뉴얼 No.25-0043)에서 전(前)배양한 후, 균체를 회수하고, 회수 균체를 발효 기저 염(Fermentation basal salts) 배지(85％ 인산(Phosphoric acid) 26.7ml, 황산칼슘(Calcium sulfate) 0.093％(w/v), 황산칼륨(Potassium sulfate) 1.82％(w/v), 황산마그네슘(Magnesium sulfate)-7H₂O 1.49％(w/v), 수산화칼륨(Potassium hydroxide) 0.413％(w/v), 글리세롤 4.0％(w/v))(인비트로젠사 매뉴얼 Ver.B 053002)에서 64시간 본배양하였다. 이때, 배양 개시로부터 24시간 후에 밀폐계로 하였다. 도입한 효소 유전자의 발현 유도를 위해, 배양 개시로부터 24시간 경과시와 48시간 경과시에, 1/200 용량의 100％ 메탄올을 배양액에 첨가하였다. 배양 종료 후, 원심 분리에 의해 균체 및 배양 상청을 회수하였다.

균체를 글래스 비즈법(인비트로젠사 매뉴얼 No.25-0043)에 의해 파쇄하고, 상청을 얻었다. 이 상청의 펜탄 추출물을 가스 크로마토그래피로 분석한 바, β-펠란드렌이 검출되었다.

한편, pPIC3.5K 벡터만을 도입한 대조군의 재조합 효모 GS115에서는, 균체, 배양 상청 및 기상의 어느 것으로부터도 β-펠란드렌은 검출되지 않았다.

이상으로부터, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자와 토마토 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 효모를 배양함으로써, β-펠란드렌을 생산할 수 있는 것이 나타났다. 또한 생산된 β-펠란드렌은, 균체, 배양 상청 및 기상으로부터 회수 가능하였다.

실시예 4

본 실시예에서는, 애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자와 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 효모를 제작하고, 당해 재조합 효모를 배양하여 β-펠란드렌을 생산하였다.

(1) 애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자의 단리

애기장대 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 21과 서열 번호 22로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 애기장대 유래 GPP 합성 효소를 코딩하는 핵산(애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자, 서열 번호 1, 젠뱅크 기탁 번호: Y17376)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 BamHI로 절단한 후, pPIC3.5K 벡터(인비트로젠사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 애기장대 유래 GPP 합성 효소 발현 벡터 pP3.5AGPP를 제작하였다.

(2) 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자의 단리

라벤더 유래의 전체 RNA를 주형으로 하고, 서열 번호 23과 서열 번호 24로 표시되는 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해, 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산(라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자, 서열 번호 7, 젠뱅크 기탁 번호: HQ404305)을 증폭하였다. 얻어진 핵산을 EcoRI로 절단한 후, pPIC3.5K 벡터(인비트로젠사)에 도입하였다. 벡터에 도입된 핵산의 염기 서열을 확인하여, 틀림없는 것을 확인하였다. 이에 따라, 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 발현 벡터 pP3.5LPD를 제작하였다.

(3) β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 효모의 제작

메탄올 자화성 효모 피키아 파스토리스 GS115주(인비트로젠사)를, 상기 (1), (2)에서 얻어진 발현 벡터 pP3.5AGPP 및 pP3.5LPD의 등량 혼합물로 형질 전환하였다. 형질 전환의 방법은, 인비트로젠사의 매뉴얼(No.25-0156, No.25-0043)에 따라 행하였다. 멀티 카피의 유전자 도입체를 얻기 위해, 1.5mg/mL 농도의 제네티신(인비트로젠사) 내성주를 취득하였다. 이에 따라, 애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자 및 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 각각 복수 카피 유지하는 재조합 효모 GSNP-2를 취득하였다.

(4) β-펠란드렌 생산

GSNP-2를 MGY 배지(인비트로젠사 매뉴얼 No.25-0043)에서 전배양한 후, 균체를 회수하고, 회수 균체를 발효 기저 염 배지(인비트로젠사 매뉴얼 Ver.B 053002)에서 64시간 본배양하였다. 도입한 효소 유전자의 발현 유도를 위해, 배양 개시로부터 24시간 경과시와 48시간 경과시에, 1/200 용량의 100％ 메탄올을 배양액에 첨가하였다. 이때, 배양 개시로부터 24시간 후에 밀폐계로 하였다. 배양 종료 후, 원심 분리에 의해 균체 및 배양 상청을 회수하였다.

한편, pPIC3.5K 벡터만을 도입한 대조군의 재조합 효모 GS115(실시예 3에서 제작)에서는, 균체, 배양 상청 및 기상의 어느 것으로부터도 β-펠란드렌은 검출되지 않았다.

이상으로부터, 애기장대 유래 GPP 합성 효소 유전자와 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 효모를 배양함으로써, β-펠란드렌을 생산할 수 있는 것이 나타났다. 또한 생산된 β-펠란드렌은, 균체, 배양 상청 및 기상으로부터 회수 가능하였다.

실시예 5

본 실시예에서는, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자와 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 대장균을 제작하고, 당해 재조합 대장균을 배양하여, 펠란드렌의 생성 확인과 부생성물의 동정을 행하였다.

실시예 2에서 제작한 pACLPD로부터 NCOI 및 EcoRI로 절단하여, 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 잘라내고, pCOLADuet-1(노바젠사)의 NcoI 및 EcoRI 절단 부위에 도입하여, pCODLFS를 구축하였다. 한편, 실시예 1에서 제작한 pT21TNPP를 주형으로 하여 서열 번호 25 및 26의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자를 증폭하였다. 증폭한 단편을 NdeI 및 KpnI로 절단하고, 상기 pCODLFS의 NdeI 및 KpnI 절단 부위에 도입하여, 공발현 벡터 pCOLDFSNS를 구축하였다. 상기 pCOLDFSNS를 로제타(Rosetta)2(DE3)에 도입하여, 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 및 토마토 유래 NPP 합성 효소를 공발현하는 재조합 대장균 ROFSNS를 얻었다. 대조군 대장균으로서 pCOLA Duet-1만을 갖는 재조합 대장균 ROCOLA도 제작하였다.

재조합 대장균 ROFSNS 및 ROCOLA를 클로람페니콜 34μg/mL 및 카나마이신 15μg/mL를 포함하는 2×YT 배지(1.6％(w/v) 박토 트립톤, 1％(w/v) 이스트 추출물, 0.5％(w/v) NaCl)에서, 18℃, 110rpm(선회)의 조건하에, 밀폐계에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후, 기상 획분을 GC-MS에 의해 분석하였다. 도 1에 도시한 바와 같이 ROFSNS에서는 β-펠란드렌이 검출되고(피크 A), 부생성물이라고 생각되는 피크 B 및 C도 검출되었다. 한편, ROCOLA에서는 이들 피크는 검출되지 않았다. 또한 각 피크의 동정을 행한 바, 도 2에 도시한 바와 같이 ROFSNS의 배양 기상에서는, 주요 생성물인 β-펠란드렌 이외에도 리모넨(피크 B) 및 미르센(피크 C)이 부생성물로서 소량 생성되어 있었다.

ROFSNS에 의한 β-펠란드렌의 기상에서의 생성량은 750μg/L 배양액이었다.

실시예 6

본 실시예에서는, 방선균 유래 메발론산 경로 유전자, 토마토 유래 NPP 합성 효소 유전자 및 라벤더 유래 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 도입한 재조합 대장균을 제작하고, 당해 재조합 대장균을 배양하여 β-펠란드렌을 생산하였다.

스트렙토마이세스 그리세올로스포레우스(키타사토스포라 그리세올라(Kitasatospora griseola))의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 27과 서열 번호 28로 표시되는 프라이머를 사용한 PCR에 의해, S. 그리세올로스포레우스의 메발론산 경로 효소를 코딩하는 핵산(서열 번호29)을 증폭하였다. 이 핵산에는, 메발로네이트 키나아제(Mevalonate kinase), 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라아제(Mevalonate diphosphate decarboxylase), 포스포메발로네이트 키나아제(Phosphomevalonate kinase), IPP 이소메라아제, HMG-CoA(3-히드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A) 리덕타아제(HMGR) 및 HMG-CoA 신타아제를 코딩하는 유전자 클러스터가 포함되어 있다. 얻어진 증폭 DNA 단편을 pT7-Blue T 벡터에 클로닝하고, pT7SMV를 구축하였다.

상기 벡터 pT7SMV로부터, NcoI 및 EcoRI에 의한 절단에 의해 회수한 유전자 단편을 pCOLA Duet-1(노바젠사)의 NcoI 및 EcoRI 절단 사이트에 도입하고, pCSMV를 구축하였다.

pCSMV의 NdeI-KpnI 절단 부위에, 서열 번호 30으로 표시되는 토마토 NPP 합성 효소 유전자, 라벤더 β-펠란드렌 합성 효소 유전자 오페론의 합성 핵산을 도입하고, 방선균 메발론산 경로 유전자, 토마토 NPP 합성 효소 유전자 및 라벤더 β-펠란드렌 합성 효소 유전자를 포함하는 pCSMVNSFS를 구축하였다. 발현 벡터 pCSMVNSFS를 대장균 로제타2(DE3)에 도입하여, 재조합 대장균 ROSMVNSFS를 얻었다.

재조합 대장균 ROSMVNSFS를 클로람페니콜 34μg/mL 및 카나마이신 15μg/mL를 포함하는 2×YT 배지(1.6％(w/v) 박토 트립톤, 1％(w/v) 이스트 추출물, 0.5％(w/v) NaCl)에서, 18℃, 110rpm(선회)의 조건하에, 밀폐계에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후, 기상 획분을 가스 크로마토그래피에 의해 분석한 바, β-펠란드렌이 검출되었다. β-펠란드렌의 기상에서의 생성량은 8.5mg/L 배양액이었다.

이상의 결과와 실시예 5에서의 β-펠란드렌 생성량으로부터, 방선균 MVA 경로 유전자를 더 도입함으로써, β-펠란드렌의 산생량을 증대시키는 것이 가능하였다.

SEQUENCE LISTING <110> ?????????? ?????????? <120> ???????????????????????? <130> 13P01059 <150> JP2012-208292 <151> 2012-09-21 <150> JP2013-119612 <151> 2013-06-06 <160> 30 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1269 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1269) <223> <400> 1 atg tta ttc acg agg agt gtt gct cgg att tct tct aag ttt ctg aga 48 Met Leu Phe Thr Arg Ser Val Ala Arg Ile Ser Ser Lys Phe Leu Arg 1 5 10 15 aac cgt agc ttc tat ggc tcc tct caa tct ctc gcc tct cat cgg ttc 96 Asn Arg Ser Phe Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Ser His Arg Phe 20 25 30 gca atc att ccc gat cag ggt cac tct tgt tct gac tct cca cac aag 144 Ala Ile Ile Pro Asp Gln Gly His Ser Cys Ser Asp Ser Pro His Lys 35 40 45 ggt tac gtt tgc aga aca act tat tca ttg aaa tct ccg gtt ttt ggt 192 Gly Tyr Val Cys Arg Thr Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Val Phe Gly 50 55 60 gga ttt agt cat caa ctc tat cac cag agt agc tcc ttg gtt gag gag 240 Gly Phe Ser His Gln Leu Tyr His Gln Ser Ser Ser Leu Val Glu Glu 65 70 75 80 gag ctt gac cca ttt tcg ctt gtt gcc gat gag ctg tca ctt ctt agt 288 Glu Leu Asp Pro Phe Ser Leu Val Ala Asp Glu Leu Ser Leu Leu Ser 85 90 95 aat aag ttg aga gag atg gta ctt gcc gag gtt cca aag ctt gcc tct 336 Asn Lys Leu Arg Glu Met Val Leu Ala Glu Val Pro Lys Leu Ala Ser 100 105 110 gct gct gag tac ttc ttc aaa agg ggt gtg caa gga aaa cag ttt cgt 384 Ala Ala Glu Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Val Gln Gly Lys Gln Phe Arg 115 120 125 tca act att ttg ctg ctg atg gcg aca gct ctg gat gta cga gtt cca 432 Ser Thr Ile Leu Leu Leu Met Ala Thr Ala Leu Asp Val Arg Val Pro 130 135 140 gaa gca ttg att ggg gaa tca aca gat ata gtc aca tca gaa tta cgc 480 Glu Ala Leu Ile Gly Glu Ser Thr Asp Ile Val Thr Ser Glu Leu Arg 145 150 155 160 gta agg caa cgg ggt att gct gaa atc act gaa atg ata cac gtc gca 528 Val Arg Gln Arg Gly Ile Ala Glu Ile Thr Glu Met Ile His Val Ala 165 170 175 agt cta ctg cac gat gat gtc ttg gat gat gcc gat aca agg cgt ggt 576 Ser Leu Leu His Asp Asp Val Leu Asp Asp Ala Asp Thr Arg 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Leu Gly Leu Ala Phe 290 295 300 caa tta ata gac gac att ctt gat ttc acg ggc aca tct gcc tct ctc 960 Gln Leu Ile Asp Asp Ile Leu Asp Phe Thr Gly Thr Ser Ala Ser Leu 305 310 315 320 gga aag gga tcg ttg tca gat att cgc cat gga gtc ata aca gcc cca 1008 Gly Lys Gly Ser Leu Ser Asp Ile Arg His Gly Val Ile Thr Ala Pro 325 330 335 atc ctc ttt gcc atg gaa gag ttt cct caa cta cgc gaa gtt gtt gat 1056 Ile Leu Phe Ala Met Glu Glu Phe Pro Gln Leu Arg Glu Val Val Asp 340 345 350 caa gtt gaa aaa gat cct agg aat gtt gac att gct tta gag tat ctt 1104 Gln Val Glu Lys Asp Pro Arg Asn Val Asp Ile Ala Leu Glu Tyr Leu 355 360 365 ggg aag agc aag gga ata cag agg gca aga gaa tta gcc atg gaa cat 1152 Gly Lys Ser Lys Gly Ile Gln Arg Ala Arg Glu Leu Ala Met Glu His 370 375 380 gcg aat cta gca gca gct gca atc ggg tct cta cct gaa aca gac aat 1200 Ala Asn Leu Ala Ala Ala Ala Ile Gly Ser Leu Pro Glu Thr Asp Asn 385 390 395 400 gaa gat gtc aaa aga tcg agg cgg gca ctt att gac ttg acc cat aga 1248 Glu Asp Val Lys Arg Ser Arg Arg Ala Leu Ile Asp Leu Thr His Arg 405 410 415 gtc atc acc aga aac aag tga 1269 Val Ile Thr Arg Asn Lys 420 <210> 2 <211> 422 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Leu Phe Thr Arg Ser Val Ala Arg Ile Ser Ser Lys Phe Leu Arg 1 5 10 15 Asn Arg Ser Phe Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Leu Ala Ser His Arg Phe 20 25 30 Ala Ile Ile Pro Asp Gln Gly His Ser Cys Ser Asp Ser Pro His Lys 35 40 45 Gly Tyr Val Cys Arg Thr Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Pro Val Phe Gly 50 55 60 Gly Phe Ser His Gln Leu Tyr His Gln Ser Ser Ser Leu Val Glu Glu 65 70 75 80 Glu Leu Asp Pro Phe Ser Leu Val Ala Asp Glu Leu Ser Leu Leu Ser 85 90 95 Asn Lys Leu Arg Glu Met Val Leu Ala Glu Val Pro Lys Leu Ala Ser 100 105 110 Ala Ala Glu Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Val Gln Gly Lys Gln Phe Arg 115 120 125 Ser Thr Ile Leu Leu Leu Met Ala Thr Ala Leu Asp Val Arg Val Pro 130 135 140 Glu Ala Leu Ile Gly Glu Ser Thr Asp Ile Val Thr Ser Glu Leu Arg 145 150 155 160 Val Arg Gln Arg Gly Ile Ala Glu Ile Thr Glu Met Ile His Val Ala 165 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gct ttg ata atg gat ggt aat agg aga tgg gca aag gat aag ggt 288 Ile Ala Leu Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Trp Ala Lys Asp Lys Gly 85 90 95 tta gaa gta tat gaa ggt cac aaa cat att att cca aaa tta aaa gag 336 Leu Glu Val Tyr Glu Gly His Lys His Ile Ile Pro Lys Leu Lys Glu 100 105 110 att tgt gac att tct tct aaa ttg gga ata caa att atc act gct ttt 384 Ile Cys Asp Ile Ser Ser Lys Leu Gly Ile Gln Ile Ile Thr Ala Phe 115 120 125 gca ttc tct act gaa aat tgg aaa cga tcc aag gag gag gtt gat ttc 432 Ala Phe Ser Thr Glu Asn Trp Lys Arg Ser Lys Glu Glu Val Asp Phe 130 135 140 ttg ttg caa atg ttc gaa gaa atc tat gat gag ttt tcg agg tct gga 480 Leu Leu Gln Met Phe Glu Glu Ile Tyr Asp Glu Phe Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 gta aga gtg tct att ata ggt tgt aaa tcc gac ctc cca atg aca tta 528 Val Arg Val Ser Ile Ile Gly Cys Lys Ser Asp Leu Pro Met Thr Leu 165 170 175 caa aaa tgc ata gca tta aca gaa gag act aca aag ggc aac aaa gga 576 Gln Lys Cys Ile Ala Leu Thr Glu Glu Thr Thr Lys Gly Asn Lys Gly 180 185 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Leu Asn Tyr Gly Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu 195 200 205 Gln Ala Thr Lys Ser Ile Val Asn Lys Ala Met Asn Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Val Glu Asp Ile Asn Lys Asn Leu Phe Asp Gln Glu Leu Glu Ser Lys 225 230 235 240 Cys Pro Asn Pro Asp Leu Leu Ile Arg Thr Gly Gly Glu Gln Arg Val 245 250 255 Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Leu Ala Tyr Thr Glu Phe Tyr Phe Thr 260 265 270 Asn Thr Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Glu Asp Leu Lys Glu Ala Ile 275 280 285 Met Asn Phe Gln Gln Arg His Arg Arg Phe Gly Gly His Thr Tyr 290 295 300 <210> 5 <211> 2337 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> CDS <222> (1)..(2337) <223> <400> 5 atg ata gtt ggc tat aga agc aca atc ata acc ctt tct cat cct aag 48 Met Ile Val Gly Tyr Arg Ser Thr Ile Ile Thr Leu Ser His Pro Lys 1 5 10 15 cta ggc aat ggg aaa aca att tca tcc aat gca att ttc cag aga tca 96 Leu Gly Asn Gly Lys Thr Ile Ser Ser Asn Ala Ile Phe Gln Arg Ser 20 25 30 tgt aga gta aga tgc agc cac agt acc act tca tca atg aat ggt ttc 144 Cys Arg Val Arg Cys Ser His Ser Thr Thr Ser Ser Met Asn Gly Phe 35 40 45 gaa gat gca agg gat aga ata agg gaa agt ttt ggg aaa tta gag tta 192 Glu Asp Ala Arg Asp Arg Ile Arg Glu Ser Phe Gly Lys Leu Glu Leu 50 55 60 tct cct tct tcc tat gac aca gca tgg gta gct atg gtc cct tca aga 240 Ser Pro Ser Ser Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 cat tca cta aat gag cca tgt ttt cca caa tgt ttg gat tgg att att 288 His Ser Leu Asn Glu Pro Cys Phe Pro Gln Cys Leu Asp Trp Ile Ile 85 90 95 gaa aat caa aga gaa gat gga tct tgg gga cta aac cct acc cat cca 336 Glu Asn Gln Arg Glu Asp Gly Ser Trp Gly Leu Asn Pro Thr His Pro 100 105 110 ttg ctt cta aag gac tca ctt tct tcc act ctt gca tgt ttg ctt gca 384 Leu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ala Cys Leu Leu Ala 115 120 125 cta acc aaa tgg aga gtt gga gat gag caa atc aaa aga ggt ctt ggc 432 Leu Thr Lys Trp Arg Val Gly Asp Glu Gln Ile Lys Arg Gly Leu Gly 130 135 140 ttc att gaa acg tat ggt tgg gca gta gat aac aag gat caa att tca 480 Phe Ile Glu Thr Tyr Gly Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Gln Ile Ser 145 150 155 160 cct tta gga ttt gaa gtt ata ttt tct agt atg atc aaa tct gca gag 528 Pro Leu Gly Phe Glu Val Ile Phe Ser Ser Met Ile Lys Ser Ala Glu 165 170 175 aaa tta gat tta aat ttg cct ttg aat ctt cat ctt gta aat ttg gtg 576 Lys Leu Asp Leu Asn Leu Pro Leu Asn Leu His Leu Val Asn Leu Val 180 185 190 aaa tgc aaa aga gat tca aca att aaa agg aat gtt gaa tat atg ggt 624 Lys Cys Lys Arg Asp Ser Thr Ile Lys Arg Asn Val Glu Tyr Met Gly 195 200 205 gaa gga gtt ggt gaa tta tgt gat tgg aag gaa atg ata aag tta cat 672 Glu Gly Val Gly Glu Leu Cys Asp Trp Lys Glu Met Ile Lys Leu His 210 215 220 caa aga caa aat ggt tca tta ttt gat tca cca gcc act act gca gct 720 Gln Arg Gln Asn Gly Ser Leu Phe Asp Ser Pro Ala Thr Thr Ala Ala 225 230 235 240 gcc ttg att tat cat caa cat gat caa aaa tgc tat caa tat ctt aat 768 Ala Leu Ile Tyr His Gln His Asp Gln Lys Cys Tyr Gln Tyr Leu Asn 245 250 255 tca atc ttc caa caa cac aaa aat tgg gtt ccc act atg tat cca aca 816 Ser Ile Phe Gln Gln His Lys Asn Trp Val Pro Thr Met Tyr Pro Thr 260 265 270 aag gta cat tca ttg ctt tgc ttg gtt gat aca ctt caa aat ctt gga 864 Lys Val His Ser Leu Leu Cys Leu Val Asp Thr Leu Gln Asn Leu Gly 275 280 285 gta cat cgg cat ttt aaa tca gaa ata aag aaa gct cta gat gaa ata 912 Val His Arg His Phe Lys Ser Glu Ile Lys Lys Ala Leu Asp Glu Ile 290 295 300 tac agg cta tgg caa caa aag aat gaa caa att ttc tca aat gtc acc 960 Tyr Arg Leu Trp Gln Gln Lys Asn Glu Gln Ile Phe Ser Asn Val Thr 305 310 315 320 cat tgt gct atg gct ttt cga ctt cta agg atg agc tac tat gat gtc 1008 His Cys Ala Met Ala Phe Arg Leu Leu Arg Met Ser Tyr Tyr Asp Val 325 330 335 tcc tca gat gaa cta gca gaa ttt gtg gat gaa gaa cat ttc ttt gca 1056 Ser Ser Asp Glu Leu Ala Glu Phe Val Asp Glu Glu His Phe Phe Ala 340 345 350 aca aat ggg aaa tat aaa agt cat gtt gaa att ctt gaa ctc cac aaa 1104 Thr Asn Gly Lys Tyr Lys Ser His Val Glu Ile Leu Glu Leu His Lys 355 360 365 gca tca caa ttg gct att gat cat gag aaa gat gac att ttg gat aaa 1152 Ala Ser Gln Leu Ala Ile Asp His Glu Lys Asp Asp Ile Leu Asp Lys 370 375 380 ata aac aat tgg aca aga gct ttt atg gag caa aaa ctc tta aac aat 1200 Ile Asn Asn Trp Thr Arg Ala Phe Met Glu Gln Lys Leu Leu Asn Asn 385 390 395 400 ggc ttc ata gat agg atg tca aag aaa gag gtg gaa ctt gct ttg agg 1248 Gly Phe Ile Asp Arg Met Ser Lys Lys Glu Val Glu Leu Ala Leu Arg 405 410 415 aag ttt tat acc aca tct cat cta gca gaa aat aga aga tat ata aag 1296 Lys Phe Tyr Thr Thr Ser His Leu Ala Glu Asn Arg Arg Tyr Ile Lys 420 425 430 tca tac gaa gag aac aat ttt aaa atc tta aaa gca gct tat agg tca 1344 Ser Tyr Glu Glu Asn Asn Phe Lys Ile Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ser 435 440 445 ccc aac att aac aat aag gac ttg tta gca ttt tca ata cac gac ttt 1392 Pro Asn Ile Asn Asn Lys Asp Leu Leu Ala Phe Ser Ile His Asp Phe 450 455 460 gaa tta tgc caa gct caa cac cga gaa gaa ctt caa caa ctc aag agg 1440 Glu Leu Cys Gln Ala Gln His Arg Glu Glu Leu Gln Gln Leu Lys Arg 465 470 475 480 tgg ttt gaa gat tat aga ttg gac caa ctc gga ctt gca gaa cga tat 1488 Trp Phe Glu Asp Tyr Arg Leu Asp Gln Leu Gly Leu Ala Glu Arg Tyr 485 490 495 ata cat gct agt tac tta ttt ggt gtt act gtt atc ccc gag cct gaa 1536 Ile His Ala Ser Tyr Leu Phe Gly Val Thr Val Ile Pro Glu Pro Glu 500 505 510 tta tcc gat gct cgc ctc atg tac gcg aaa tac gtc atg ctc ctg act 1584 Leu Ser Asp Ala Arg Leu Met Tyr Ala Lys Tyr Val Met Leu Leu Thr 515 520 525 att gtc gat gat cat ttc gag agt ttt gca tct aaa gat gaa tgt ttc 1632 Ile Val Asp Asp His Phe Glu Ser Phe Ala Ser Lys Asp Glu Cys Phe 530 535 540 aac atc att gaa tta gta gaa agg tgg gat gac tat gca agt gta ggt 1680 Asn Ile Ile Glu Leu Val Glu Arg Trp Asp Asp Tyr Ala Ser Val Gly 545 550 555 560 tat aaa tct gag aag gtt aaa gtt ttt ttt tct gtt ttc tat aaa tca 1728 Tyr Lys Ser Glu Lys Val Lys Val Phe Phe Ser Val Phe Tyr Lys Ser 565 570 575 ata gag gag ctt gca aca att gct gaa att aaa caa gga cga tcc gtc 1776 Ile Glu Glu Leu Ala Thr Ile Ala Glu Ile Lys Gln Gly Arg Ser Val 580 585 590 aaa aat cac ctt att aat ttg tgg ctt gaa ttg atg aag ttg atg ttg 1824 Lys Asn His Leu Ile Asn Leu Trp Leu Glu Leu Met Lys Leu Met Leu 595 600 605 atg gag cga gta gag tgg tgt tct ggc aag aca ata cca agc ata gaa 1872 Met Glu Arg Val Glu Trp Cys Ser Gly Lys Thr Ile Pro Ser Ile Glu 610 615 620 gag tac ttg tat gtt aca tct ata aca ttt tgt gca aaa ttg att cct 1920 Glu Tyr Leu Tyr Val Thr Ser Ile Thr Phe Cys Ala Lys Leu Ile Pro 625 630 635 640 ctc tca aca caa tat ttt ctt gga ata aaa ata tcc aaa gat cta cta 1968 Leu Ser Thr Gln Tyr Phe Leu Gly Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Leu 645 650 655 gaa agt gat gaa ata tgt ggc cta tgg aat tgt agc ggt aga gtg atg 2016 Glu Ser Asp Glu Ile Cys Gly Leu Trp Asn Cys Ser Gly Arg Val Met 660 665 670 cga atc ctt aat gat tta caa gat tcc aag aga gaa caa aag gag gtc 2064 Arg Ile Leu Asn Asp Leu Gln Asp Ser Lys Arg Glu Gln Lys Glu Val 675 680 685 tca ata aat tta gtc aca tta cta atg aaa agt atg tct gag gaa gaa 2112 Ser Ile Asn Leu Val Thr Leu Leu Met Lys Ser Met Ser Glu Glu Glu 690 695 700 gct ata atg aag ata aag gaa atc ttg gaa atg aat aga aga gag tta 2160 Ala Ile Met Lys Ile Lys Glu Ile Leu Glu Met Asn Arg Arg Glu Leu 705 710 715 720 ttg aaa atg gtt tta gtt caa aaa aag gga agc caa ttg cct caa tta 2208 Leu Lys Met Val Leu Val Gln Lys Lys Gly Ser Gln Leu Pro Gln Leu 725 730 735 tgc aaa gat ata ttt tgg agg aca agc aaa tgg gct cat ttc act tat 2256 Cys Lys Asp Ile Phe Trp Arg Thr Ser Lys Trp Ala His Phe Thr Tyr 740 745 750 tca caa act gat gga tat aga att gca gag gaa atg aag aat cac att 2304 Ser Gln Thr Asp Gly Tyr Arg Ile Ala Glu Glu Met Lys Asn His Ile 755 760 765 gat gaa gtc ttt tac aaa cca ctc aat cat taa 2337 Asp Glu Val Phe Tyr Lys Pro Leu Asn His 770 775 <210> 6 <211> 778 <212> PRT <213> Solanum lycopersicum <400> 6 Met Ile Val Gly Tyr Arg Ser Thr Ile Ile Thr Leu Ser His Pro Lys 1 5 10 15 Leu Gly Asn Gly Lys Thr Ile Ser Ser Asn Ala Ile Phe Gln Arg Ser 20 25 30 Cys Arg Val Arg Cys Ser His Ser Thr Thr Ser Ser Met Asn Gly Phe 35 40 45 Glu Asp Ala Arg Asp Arg Ile Arg Glu Ser Phe Gly Lys Leu Glu Leu 50 55 60 Ser Pro Ser Ser Tyr Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 His Ser Leu Asn Glu Pro Cys Phe Pro Gln Cys Leu Asp Trp Ile Ile 85 90 95 Glu Asn Gln Arg Glu Asp Gly Ser Trp Gly Leu Asn Pro Thr His Pro 100 105 110 Leu Leu Leu Lys Asp Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ala Cys Leu Leu Ala 115 120 125 Leu Thr Lys Trp Arg Val Gly Asp Glu Gln Ile Lys Arg Gly Leu Gly 130 135 140 Phe Ile Glu Thr Tyr Gly Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Gln Ile Ser 145 150 155 160 Pro Leu Gly Phe Glu Val Ile Phe Ser Ser Met Ile Lys Ser Ala Glu 165 170 175 Lys Leu Asp Leu Asn Leu Pro Leu Asn Leu His Leu Val Asn Leu Val 180 185 190 Lys Cys Lys Arg Asp Ser Thr Ile Lys Arg Asn Val Glu Tyr Met Gly 195 200 205 Glu Gly Val Gly Glu Leu Cys Asp Trp Lys Glu Met Ile Lys Leu His 210 215 220 Gln Arg Gln Asn Gly Ser Leu Phe Asp Ser Pro Ala Thr Thr Ala Ala 225 230 235 240 Ala Leu Ile Tyr His Gln His Asp Gln Lys Cys Tyr Gln Tyr Leu Asn 245 250 255 Ser Ile Phe Gln Gln His Lys Asn Trp Val Pro Thr Met Tyr Pro Thr 260 265 270 Lys Val His Ser Leu Leu Cys Leu Val Asp Thr Leu Gln Asn Leu Gly 275 280 285 Val His Arg His Phe Lys Ser Glu Ile Lys Lys Ala Leu Asp Glu Ile 290 295 300 Tyr Arg Leu Trp Gln Gln Lys Asn Glu Gln Ile Phe Ser Asn Val Thr 305 310 315 320 His Cys Ala Met Ala Phe Arg Leu Leu Arg Met Ser Tyr Tyr Asp Val 325 330 335 Ser Ser Asp Glu Leu Ala Glu Phe Val Asp Glu Glu His Phe Phe Ala 340 345 350 Thr Asn Gly Lys Tyr Lys Ser His Val Glu Ile Leu Glu Leu His Lys 355 360 365 Ala Ser Gln Leu Ala Ile Asp His Glu Lys Asp Asp Ile Leu Asp Lys 370 375 380 Ile Asn Asn Trp Thr Arg Ala Phe Met Glu Gln Lys Leu Leu Asn Asn 385 390 395 400 Gly Phe Ile Asp Arg Met Ser Lys Lys Glu Val Glu Leu Ala Leu Arg 405 410 415 Lys Phe Tyr Thr Thr Ser His Leu Ala Glu Asn Arg Arg Tyr Ile Lys 420 425 430 Ser Tyr Glu Glu Asn Asn Phe Lys Ile Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ser 435 440 445 Pro Asn Ile Asn Asn Lys Asp Leu Leu Ala Phe Ser Ile His Asp Phe 450 455 460 Glu Leu Cys Gln Ala Gln His Arg Glu Glu Leu Gln Gln Leu Lys Arg 465 470 475 480 Trp Phe Glu Asp Tyr Arg Leu Asp Gln Leu Gly Leu Ala Glu Arg Tyr 485 490 495 Ile His Ala Ser Tyr Leu Phe Gly Val Thr Val Ile Pro Glu Pro Glu 500 505 510 Leu Ser Asp Ala Arg Leu Met Tyr Ala Lys Tyr Val Met Leu Leu Thr 515 520 525 Ile Val Asp Asp His Phe Glu Ser Phe Ala Ser Lys Asp Glu Cys Phe 530 535 540 Asn Ile Ile Glu Leu Val Glu Arg Trp Asp Asp Tyr Ala Ser Val Gly 545 550 555 560 Tyr Lys Ser Glu Lys Val Lys Val Phe Phe Ser Val Phe Tyr Lys Ser 565 570 575 Ile Glu Glu Leu Ala Thr Ile Ala Glu Ile Lys Gln Gly Arg Ser Val 580 585 590 Lys Asn His Leu Ile Asn Leu Trp Leu Glu Leu Met Lys Leu Met Leu 595 600 605 Met Glu Arg Val Glu Trp Cys Ser Gly Lys Thr Ile Pro Ser Ile Glu 610 615 620 Glu Tyr Leu Tyr Val Thr Ser Ile Thr Phe Cys Ala Lys Leu Ile Pro 625 630 635 640 Leu Ser Thr Gln Tyr Phe Leu Gly Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Leu 645 650 655 Glu Ser Asp Glu Ile Cys Gly Leu Trp Asn Cys Ser Gly Arg Val Met 660 665 670 Arg Ile Leu Asn Asp Leu Gln Asp Ser Lys Arg Glu Gln Lys Glu Val 675 680 685 Ser Ile Asn Leu Val Thr Leu Leu Met Lys Ser Met Ser Glu Glu Glu 690 695 700 Ala Ile Met Lys Ile Lys Glu Ile Leu Glu Met Asn Arg Arg Glu Leu 705 710 715 720 Leu Lys Met Val Leu Val Gln Lys Lys Gly Ser Gln Leu Pro Gln Leu 725 730 735 Cys Lys Asp Ile Phe Trp Arg Thr Ser Lys Trp Ala His Phe Thr Tyr 740 745 750 Ser Gln Thr Asp Gly Tyr Arg Ile Ala Glu Glu Met Lys Asn His Ile 755 760 765 Asp Glu Val Phe Tyr Lys Pro Leu Asn His 770 775 <210> 7 <211> 1746 <212> DNA <213> Lavandula angustifolia <220> <221> CDS <222> (1)..(1746) <223> <400> 7 atg tct acc att att gcg ata caa gtg ttg ctt cct att cca act act 48 Met Ser Thr Ile Ile Ala Ile Gln Val Leu Leu Pro Ile Pro Thr Thr 1 5 10 15 aaa aca tac cct agt cat gac ttg gag aag tcc tct tcg cgg tgt cgc 96 Lys Thr Tyr Pro Ser His Asp Leu Glu Lys Ser Ser Ser Arg Cys Arg 20 25 30 tcc tcc tcc act cct cgc cct aga ctg tgt tgc tcg ttg cag gtg agt 144 Ser Ser Ser Thr Pro Arg Pro Arg Leu Cys Cys Ser Leu Gln Val Ser 35 40 45 gat ccg atc cca acg ggc cgg cga tcc gga ggc tac ccg ccc gcc cta 192 Asp Pro Ile Pro Thr Gly Arg Arg Ser Gly Gly Tyr Pro Pro Ala Leu 50 55 60 tgg gat ttc gac act att caa tcg ctc aac acc gag tat aag gga gag 240 Trp Asp Phe Asp Thr Ile Gln Ser Leu Asn Thr Glu Tyr Lys Gly Glu 65 70 75 80 agg cac atg aga agg gaa gaa gac cta att ggg caa gtt aga gag atg 288 Arg His Met Arg Arg Glu Glu Asp Leu Ile Gly Gln Val Arg Glu Met 85 90 95 ctg gtg cat gaa gta gag gat ccc act cca cag ctg gag ttc att gat 336 Leu Val His Glu Val Glu Asp Pro Thr Pro Gln Leu Glu Phe Ile Asp 100 105 110 gat ttg cat aag ctt ggc ata tct tgc cat ttt gag aat gaa atc ctc 384 Asp Leu His Lys Leu Gly Ile Ser Cys His Phe Glu Asn Glu Ile Leu 115 120 125 caa atc ttg aaa tcc ata tat ctt aat caa aac tac aaa agg gat ttg 432 Gln Ile Leu Lys Ser Ile Tyr Leu Asn Gln Asn Tyr Lys Arg Asp Leu 130 135 140 tac tca aca tct cta gca ttc aga ctc ctc aga caa tat ggc ttc atc 480 Tyr Ser Thr Ser Leu Ala Phe Arg Leu Leu Arg Gln Tyr Gly Phe Ile 145 150 155 160 ctt cca caa gaa gta ttt gat tgt ttc aag aat gag gag ggt acg gat 528 Leu Pro Gln Glu Val Phe Asp Cys Phe Lys Asn Glu Glu Gly Thr Asp 165 170 175 ttc aag cca agc ttc ggc cgt gat atc aaa ggc ttg tta caa ttg tat 576 Phe Lys Pro Ser Phe Gly Arg Asp Ile Lys Gly Leu Leu Gln Leu Tyr 180 185 190 gaa gct tct ttc cta tca aga aaa gga gaa gaa act tta caa cta gca 624 Glu Ala Ser Phe Leu Ser Arg Lys Gly Glu Glu Thr Leu Gln Leu Ala 195 200 205 aga gag ttt gca aca aag att ctg caa aaa gaa gtt gat gag aga gag 672 Arg Glu Phe Ala Thr Lys Ile Leu Gln Lys Glu Val Asp Glu Arg Glu 210 215 220 ttt gca acc aag atg gag ttc cct tct cat tgg acg gtt caa atg ccg 720 Phe Ala Thr Lys Met Glu Phe Pro Ser His Trp Thr Val Gln Met Pro 225 230 235 240 aat gca aga cct ttc atc gat gct tac cgt agg agg ccg gat atg aat 768 Asn Ala Arg Pro Phe Ile Asp Ala Tyr Arg Arg Arg Pro Asp Met Asn 245 250 255 cca gtt gtg ctc gag cta gcc ata ctt gat aca aat ata gtt caa gca 816 Pro Val Val Leu Glu Leu Ala Ile Leu Asp Thr Asn Ile Val Gln Ala 260 265 270 caa ttt caa gaa gaa ctc aaa gag acc tca agg tgg tgg gag agt aca 864 Gln Phe Gln Glu Glu Leu Lys Glu Thr Ser Arg Trp Trp Glu Ser Thr 275 280 285 ggc att gtc caa gag ctt cca ttt gtg agg gat agg att gtg gaa ggc 912 Gly Ile Val Gln Glu Leu Pro Phe Val Arg Asp Arg Ile Val Glu Gly 290 295 300 tac ttt tgg acg att gga gtg act cag aga cgc gag cat gga tac gaa 960 Tyr Phe Trp Thr Ile Gly Val Thr Gln Arg Arg Glu His Gly Tyr Glu 305 310 315 320 aga atc atg acc gca aag gtt att gcc tta gta aca tgt tta gac gac 1008 Arg Ile Met Thr Ala Lys Val Ile Ala Leu Val Thr Cys Leu Asp Asp 325 330 335 ata tac gat gtt tat ggc acg ata gaa gag ctt caa ctt ttc aca agc 1056 Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr Ile Glu Glu Leu Gln Leu Phe Thr Ser 340 345 350 aca atc caa aga tgg gat ttg gaa tca atg aag caa ctc cct acc tac 1104 Thr Ile Gln Arg Trp Asp Leu Glu Ser Met Lys Gln Leu Pro Thr Tyr 355 360 365 atg caa gta agc ttt ctt gca cta cac aac ttt gta acc gag gtg gct 1152 Met Gln Val Ser Phe Leu Ala Leu His Asn Phe Val Thr Glu Val Ala 370 375 380 tac gat act ctc aag aaa aag ggc tac aac tcc aca cca tat tta aga 1200 Tyr Asp Thr Leu Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Ser Thr Pro Tyr Leu Arg 385 390 395 400 aaa acg tgg gtg gat ctt gtt gaa tca tat atc aaa gag gca act tgg 1248 Lys Thr Trp Val Asp Leu Val Glu Ser Tyr Ile Lys Glu Ala Thr Trp 405 410 415 tac tac aac ggt tat aaa cct agt atg caa gaa tac ctt aac aat gca 1296 Tyr Tyr Asn Gly Tyr Lys Pro Ser Met Gln Glu Tyr Leu Asn Asn Ala 420 425 430 tgg ata tca gtc gga agt atg gct ata ctc aac cac ctc ttc ttc cgg 1344 Trp Ile Ser Val Gly Ser Met Ala Ile Leu Asn His Leu Phe Phe Arg 435 440 445 ttc aca aac gag aga atg cat aaa tac cgc gat atg aac cgt gtc tcg 1392 Phe Thr Asn Glu Arg Met His Lys Tyr Arg Asp Met Asn Arg Val Ser 450 455 460 tcc aac att gtg agg ctt gct gat gat atg gga aca tca ttg gct gag 1440 Ser Asn Ile Val Arg Leu Ala Asp Asp Met Gly Thr Ser Leu Ala Glu 465 470 475 480 gtg gag aga ggg gac gtg ccg aaa gca att caa tgc tac atg aat gag 1488 Val Glu Arg Gly Asp Val Pro Lys Ala Ile Gln Cys Tyr Met Asn Glu 485 490 495 acg aat gct tct gaa gaa gaa gca aga gaa tat gta aga aga gtc ata 1536 Thr Asn Ala Ser Glu Glu Glu Ala Arg Glu Tyr Val Arg Arg Val Ile 500 505 510 cag gaa gaa tgg gaa aag ttg aac aca gaa ttg atg cgg gat gat gat 1584 Gln Glu Glu Trp Glu Lys Leu Asn Thr Glu Leu Met Arg Asp Asp Asp 515 520 525 gat gat gat gat ttt aca cta tcc aaa tat tac tgt gag gtg gtt gct 1632 Asp Asp Asp Asp Phe Thr Leu Ser Lys Tyr Tyr Cys Glu Val Val Ala 530 535 540 aat ctt aca aga atg gca cag ttt ata tac caa gat gga tcg gat ggc 1680 Asn Leu Thr Arg Met Ala Gln Phe Ile Tyr Gln Asp Gly Ser Asp Gly 545 550 555 560 ttc ggc atg aaa gat tcc aag gtt aat aga ctg cta aaa gag acg ttg 1728 Phe Gly Met Lys Asp Ser Lys Val Asn Arg Leu Leu Lys Glu Thr Leu 565 570 575 atc gag cgc tac gaa taa 1746 Ile Glu Arg Tyr Glu 580 <210> 8 <211> 581 <212> PRT <213> Lavandula angustifolia <400> 8 Met Ser Thr Ile Ile Ala Ile Gln Val Leu Leu Pro Ile Pro Thr Thr 1 5 10 15 Lys Thr Tyr Pro Ser His Asp Leu Glu Lys Ser Ser Ser Arg Cys Arg 20 25 30 Ser Ser Ser Thr Pro Arg Pro Arg Leu Cys Cys Ser Leu Gln Val Ser 35 40 45 Asp Pro Ile Pro Thr Gly Arg Arg Ser Gly Gly Tyr Pro Pro Ala Leu 50 55 60 Trp Asp Phe Asp Thr Ile Gln Ser Leu Asn Thr Glu Tyr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg His Met Arg Arg Glu Glu Asp Leu Ile Gly Gln Val Arg Glu Met 85 90 95 Leu Val His Glu Val Glu Asp Pro Thr Pro Gln Leu Glu Phe Ile Asp 100 105 110 Asp Leu His Lys Leu Gly Ile Ser Cys His Phe Glu Asn Glu Ile Leu 115 120 125 Gln Ile Leu Lys Ser Ile Tyr Leu Asn Gln Asn Tyr Lys Arg Asp Leu 130 135 140 Tyr Ser Thr Ser Leu Ala Phe Arg Leu Leu Arg Gln Tyr Gly Phe Ile 145 150 155 160 Leu Pro Gln Glu Val Phe Asp Cys Phe Lys Asn Glu Glu Gly Thr Asp 165 170 175 Phe Lys Pro Ser Phe Gly Arg Asp Ile Lys Gly Leu Leu Gln Leu Tyr 180 185 190 Glu Ala Ser Phe Leu Ser Arg Lys Gly Glu Glu Thr Leu Gln Leu Ala 195 200 205 Arg Glu Phe Ala Thr Lys Ile Leu Gln Lys Glu Val Asp Glu Arg Glu 210 215 220 Phe Ala Thr Lys Met Glu Phe Pro Ser His Trp Thr Val Gln Met Pro 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435 440 445 Phe Thr Asn Glu Arg Met His Lys Tyr Arg Asp Met Asn Arg Val Ser 450 455 460 Ser Asn Ile Val Arg Leu Ala Asp Asp Met Gly Thr Ser Leu Ala Glu 465 470 475 480 Val Glu Arg Gly Asp Val Pro Lys Ala Ile Gln Cys Tyr Met Asn Glu 485 490 495 Thr Asn Ala Ser Glu Glu Glu Ala Arg Glu Tyr Val Arg Arg Val Ile 500 505 510 Gln Glu Glu Trp Glu Lys Leu Asn Thr Glu Leu Met Arg Asp Asp Asp 515 520 525 Asp Asp Asp Asp Phe Thr Leu Ser Lys Tyr Tyr Cys Glu Val Val Ala 530 535 540 Asn Leu Thr Arg Met Ala Gln Phe Ile Tyr Gln Asp Gly Ser Asp Gly 545 550 555 560 Phe Gly Met Lys Asp Ser Lys Val Asn Arg Leu Leu Lys Glu Thr Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Tyr Glu 580 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 9 gcgggccata tgagttcttt ggttcttcaa tg 32 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 10 gcccgcgaat tctcaatatg tgtgtccacc aaaac 35 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 11 gcgggcccat ggtagttggc tatagaagca c 31 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 12 ggccgcggat ccttaatgat tgagtggttt gtaaaag 37 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 13 gcgggccata tgctattcac caggagtgtt gc 32 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 14 gcccgcgaat tctcacttgt ttctggtgat gac 33 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 15 gcgggccata tgtctaccat tattgcgata c 31 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 16 gcccgcgaat tcttattcgt agcgctcgat caac 34 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 17 gcgggcggat ccaccatggg ttctttggtt cttcaatg 38 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 18 gcccgcggat cctcaatatg tgtgtccacc aaaac 35 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 19 gcgggcggat ccaccatggt agttggctat agaagcac 38 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 20 gcccgcggat ccttaatgat tgagtggttt gtaaaag 37 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 21 gcgggcggat ccaccatggt attcacgagg agtgttgc 38 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 22 gcccgcggat cctcacttgt ttctggtgat gac 33 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 23 gcgggcgaat tcaccatggc taccattatt gcgatac 37 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 24 gcccgcgaat tcttattcgt agcgctcgat caac 34 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 25 aggaggcata tgagttcttt ggttcttcaa tg 32 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 26 tcctccggat cctcaatatg tgtgtccacc aaaac 35 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 27 accatggctc ttccgacctc ggtgg 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR <400> 28 tgaattctca gcacgctcgg tagag 25 <210> 29 <211> 6441 <212> DNA <213> Streptomyces griseolosporeus <400> 29 gttgactctt ccgacctcgg tggaggaggg atcgaaggcc caccgggctc gcgccgtcgg 60 caccggtcgc gctcatgcca aggccattct gctgggagag cacgcggtcg tgtacggaac 120 cccggcgctc gcgatgccca ttccccaact cgcggtcacg gcaagcgccg gctggtccgg 180 ccgatccgcc gagagccggg gcggtccgac cttcaccatg accgggtcgg cttcccgcgc 240 ggtcacggca caggccttgg acggtctgcg acgtctgacc gcctcggtca 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gactctggac atcttcccga cgaccacccg ggtccagctc gcgcccggcg ccgggcagga 1200 cacggtggcc ttcaacggcg agcccgcgac gggagaggcc gagcggcgca tcaccgcatt 1260 cctccggctg gtgcgggagc ggtcggggcg caccgaacgg gcccgcgtcg agacggagaa 1320 caccgtcccc accggggccg gcctggcctc gtcggccagc ggtttcgctg ccctcgccgt 1380 cgccgccgcc gcggcgtacg ggctcggtct cgacgcgcgg ggcctgtccc ggctggcccg 1440 acgcggctcc gggtcggcct cccggtcgat cttcgacggg ttcgccgtgt ggcacgccgg 1500 ccacgccggc ggcactcccg aggaggccga tctcggctcg tacgccgaac cggtgccggc 1560 cgtggacctg gagccggcgc tggtggtcgc ggtggtcagc gccgccccca aggcggtgtc 1620 cagccgggag gccatgcgga ggaccgtgga cacctcaccg ctgtacgagc cgtgggcggt 1680 gtccagccgg gccgacctgg cggacatcgg agccgcgctc gcccgcggca acctgccggc 1740 ggtgggcgag atcgcggagc gcaacgccct cggcatgcac gccaccatgc tggccgcacg 1800 ccccgccgtg cgctacctgt caccggcctc gctcgccgtg ctcgacggcg ttctgcagtt 1860 gcggcgggac ggcgtgccgg cctacgcgac gatggacgcc ggtcccaacg tgaaggtgct 1920 ctgcccgcgt tcggacgccg agcgggtcgc ggaagccctg cgcgccgccg cgccggtcgg 1980 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ggattcctca gctacggttc cggcagcgtc gccgagttct tcggcgggat cgtcgtcgcc 6240 ggataccggg accggctgcg gacggcggcg aacatcgagg ccgtctcccg gcgacggccc 6300 atcgactacg ccggctaccg cgagctgcac gagtgggcct tccccgcccg acggggagcc 6360 cactccaccc cgcagcagac cacgggaccg ttccggctgt ccggtatcag cggccacaag 6420 cgcctctacc gagcgtgctg a 6441 <210> 30 <211> 2710 <212> DNA <213> Solanum laciniatum <400> 30 catatgagtt ctttggttct tcaatgttgg aaattatcat ctccatctct gattttacaa 60 caaaatacat caatatccat gggtgcattc aaaggtattc ataaacttca aatcccaaat 120 tcgcctctga cagtgtctgc tcgtggactc aacaagattt catgctcact caacttacaa 180 accgaaaagc tttgttatga ggataatgat aatgatcttg atgaagaact tatgcctaaa 240 cacattgctt tgataatgga tggtaatagg agatgggcaa aggataaggg tttagaagta 300 tatgaaggtc acaaacatat tattccaaaa ttaaaagaga tttgtgacat ttcttctaaa 360 ttgggaatac aaattatcac tgcttttgca ttctctactg aaaattggaa acgatccaag 420 gaggaggttg atttcttgtt gcaaatgttc gaagaaatct atgatgagtt ttcgaggtct 480 ggagtaagag tgtctattat aggttgtaaa tccgacctcc caatgacatt 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1380 aagggatttg tactcaacat ctctagcatt cagactcctc agacaatatg gcttcatcct 1440 tccacaagaa gtatttgatt gtttcaagaa tgaggagggt acggatttca agccaagctt 1500 cggccgtgat atcaaaggct tgttacaatt gtatgaagct tctttcctat caagaaaagg 1560 agaagaaact ttacaactag caagagagtt tgcaacaaag attctgcaaa aagaagttga 1620 tgagagagag tttgcaacca agatggagtt cccttctcat tggacggttc aaatgccgaa 1680 tgcaagacct ttcatcgatg cttaccgtag gaggccggat atgaatccag ttgtgctcga 1740 gctagccata cttgatacaa atatagttca agcacaattt caagaagaac tcaaagagac 1800 ctcaaggtgg tgggagagta caggcattgt ccaagagctt ccatttgtga gggataggat 1860 tgtggaaggc tacttttgga cgattggagt gactcagaga cgcgagcatg gatacgaaag 1920 aatcatgacc gcaaaggtta ttgccttagt aacatgttta gacgacatat acgatgttta 1980 tggcacgata gaagagcttc aacttttcac aagcacaatc caaagatggg atttggaatc 2040 aatgaagcaa ctccctacct acatgcaagt aagctttctt gcactacaca actttgtaac 2100 cgaggtggct tacgatactc tcaagaaaaa gggctacaac tccacaccat atttaagaaa 2160 aacgtgggtg gatcttgttg aatcatatat caaagaggca acttggtact acaacggtta 2220 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Claims

게라닐이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산 및 네릴이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1개의 핵산과, β-펠란드렌(β-phellandrene) 합성 효소를 코딩하는 핵산이 숙주 세포에 도입되어 이루어지고, 또한 이들 핵산이 숙주 세포 내에서 발현되는, β-펠란드렌 생산능을 갖는 재조합 세포.
제1항에 있어서, 숙주 세포는 메탄 모노옥시게나제를 갖지 않는 것인 재조합 세포.
제2항에 있어서, 숙주 세포는 대장균 또는 효모인 재조합 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 세포의 습윤 균체 1g당 10mg 이상의 β-펠란드렌을 생산 가능한 재조합 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 게라닐이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산은, 하기 (a), (b) 또는 (c)의 단백질을 코딩하는 것인 재조합 세포.
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 20개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 게라닐이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질,
(c) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고, 또한 게라닐이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 네릴이인산 합성 효소를 코딩하는 핵산은, 하기 (d), (e) 또는 (f)의 단백질을 코딩하는 것인 재조합 세포.
(d) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(e) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 20개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 네릴이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질,
(f) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고, 또한 네릴이인산 합성 효소의 활성을 갖는 단백질
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, β-펠란드렌 합성 효소를 코딩하는 핵산은, 하기 (g), (h) 또는 (i)의 단백질을 코딩하는 것인 재조합 세포.
(g) 서열 번호 6 또는 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(h) 서열 번호 6 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 20개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 β-펠란드렌 합성 효소의 활성을 갖는 단백질,
(i) 서열 번호 6 또는 8로 표시되는 아미노산 서열과 60％ 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고, 또한 β-펠란드렌 합성 효소의 활성을 갖는 단백질
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이소펜테닐이인산의 합성 경로에서 작용하는 적어도 1개의 효소를 코딩하는 핵산이 더 도입되고, 당해 핵산이 숙주 세포 내에서 발현되는 재조합 세포.
제8항에 있어서, 이소펜테닐이인산의 합성 경로는 메발론산 경로인 재조합 세포.
제9항에 있어서, 상기 메발론산 경로는 효모 또는 방선균의 메발론산 경로인 재조합 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 세포를 배양함으로써, 당해 재조합 세포에 β-펠란드렌을 생산시키는 β-펠란드렌의 생산 방법.
제11항에 있어서, 재조합 세포의 습윤 균체 1g당 10mg 이상의 β-펠란드렌을 생산시키는 β-펠란드렌의 생산 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 재조합 세포의 세포 외로 방출된 β-펠란드렌을 회수하는 β-펠란드렌의 생산 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 세포의 배양계의 기상으로부터 β-펠란드렌을 회수하는 β-펠란드렌의 생산 방법.