WO2014038622A1 - 自己免疫疾患のバイオマーカー - Google Patents

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WO2014038622A1
WO2014038622A1 PCT/JP2013/073915 JP2013073915W WO2014038622A1 WO 2014038622 A1 WO2014038622 A1 WO 2014038622A1 JP 2013073915 W JP2013073915 W JP 2013073915W WO 2014038622 A1 WO2014038622 A1 WO 2014038622A1
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WO
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disease
mtdna
behcet
mitochondrial dna
biomarker
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PCT/JP2013/073915
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English (en)
French (fr)
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漂太 高松
淳 熊ノ郷
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国立大学法人大阪大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker capable of accurately evaluating an autoimmune disease.
  • autoimmune diseases have been understood as diseases caused by tissue or organ injuries caused by autoreactive T cells and autoantibodies accompanying the failure of autoimmune tolerance.
  • Innate immunity is an immune system that is born by living bodies, and is composed of neutrophils, macrophages, natural killer (NK) cells, and the like.
  • NK natural killer
  • PAMPs pathogen-derived inflammatory substances
  • DAMPs self-derived inflammatory substances
  • PAMPs are substances that do not exist in humans and are ubiquitous in microorganisms, and phagocytic cells (macrophages, neutrophils), dendritic cells, etc. are detected by pattern recognition receptors (PRR) to eliminate microorganisms.
  • PRR pattern recognition receptors
  • DAMPs are also released from cells damaged by trauma, apoptosis, necrosis, etc., and cause innate immunity activation.
  • Stimulation with PAMPs and DAMPs promotes the production of inflammatory cytokines.
  • the host cells and the mitochondria existing in the cells are damaged, which causes mitochondrial degradation and cell death, and promotes the release of mitochondrial DNA (mtDNA) to the cytoplasm and extracellular (in the blood).
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • this mtDNA becomes DAMPs and further activates immune cells (see, for example, FIG. 1).
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • Non-Patent Document 1 Since it acts on cells, it is thought to develop pneumonia and systemic inflammatory response syndrome (SIRS) unrelated to trauma (see Non-Patent Document 1, for example).
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • the present inventors have been studying the onset mechanism of autoimmune diseases by paying attention to the abnormal immune response caused by the breakdown of mitochondrial homeostasis that functions as a platform of such innate immune system.
  • diagnosis of an autoimmune disease is performed by a specialist based on measurement of clinical symptoms and autoantibody titers.
  • the disease state is determined by measuring inflammatory markers such as C-reactive protein (CRP) and blood sedimentation, and the diagnosis of severity is performed based on the degree of organ lesions to be combined.
  • CRP C-reactive protein
  • CRP is a protein that appears in the blood when an inflammatory reaction or tissue destruction occurs in the body, and the amount of CRP produced usually correlates with the strength of the inflammatory reaction.
  • CRP C-reactive protein
  • Behcet's disease a biomarker that can accurately evaluate an autoimmune disease and can be easily measured has been demanded.
  • the main object of the present invention is to provide a biomarker that can accurately evaluate an autoimmune disease.
  • the present invention also provides a diagnostic kit containing a reagent capable of detecting the biomarker, a diagnostic method using the biomarker, and an agent for preventing or treating autoimmune diseases.
  • the present inventors have found that the serum of autoimmune disease patients contains about 50 to about 500 times more mtDNA than healthy people. Furthermore, the present inventors have found that this mtDNA is localized in an outer membrane vesicle composed of micro vesicles called exosomes and ectosomes in serum, particularly exosomes (vesicles). The present invention has been completed as a result of further research based on these findings.
  • Item 1 A biomarker for an autoimmune disease comprising mitochondrial DNA contained in a biological fluid.
  • Item 2. The biomarker according to Item 1, wherein the mitochondrial DNA is contained in an extracellular membrane vesicle in the biological fluid.
  • Item 3. The biomarker according to Item 1 or 2, wherein the mitochondrial DNA is contained in an exosome in the biological fluid.
  • Item 4. A biomarker for an autoimmune disease comprising mitochondrial DNA contained in a biological fluid.
  • Item 2. The biomarker according to Item 1, wherein the mitochondrial DNA is contained in an extracellular membrane vesicle in the biological fluid.
  • Item 3. Item 3.
  • the biomarker according to Item 1 or 2 wherein the mitochondrial DNA is contained in an exosome in the biological fluid.
  • Said autoimmune disease consists of Behcet's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma, polymyositis / dermatomyositis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD), Crohn's disease and ulcerative colitis Item 4.
  • An autoimmune disease diagnostic kit comprising a reagent capable of detecting mitochondrial DNA.
  • the reagent capable of detecting mitochondrial DNA is cytochrome b, COXI, COXII, COXIII, NADH dehydrogenase subunit 1, NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 3, NADH dehydrogenase subunit 4, NADH dehydrogenase subunit 4L, NADH dehydrogenase Item 7.
  • Item 8 is a reagent capable of detecting at least one selected from the group consisting of subunit 5, NADH dehydrogenase subunit 6, ATPase 6 subunit and ATPase 8 subunit.
  • Said autoimmune disease consists of Behcet's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma, polymyositis / dermatomyositis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD), Crohn's disease and ulcerative colitis
  • Item 9. Item 9.
  • Method for detecting presence or absence of autoimmune disease including the following steps: (I) obtaining a body fluid sample from the subject animal; (Ii) measuring mitochondrial DNA in the body fluid sample; and (iii) detecting the presence or absence of an autoimmune disease based on the result of the step (ii).
  • the step (iii) is performed by using the increase in the amount of mitochondrial DNA as an index, comparing the result of the step (ii) obtained for the test animal with the result of the step (ii) obtained for the normal control.
  • Said autoimmune disease consists of Behcet's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma, polymyositis / dermatomyositis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD), Crohn's disease and ulcerative colitis Item 12.
  • Item 13 An agent for preventing or treating autoimmune diseases, comprising as an active ingredient a substance that suppresses secretion of mitochondrial DNA into body fluids or suppresses the function of mitochondrial DNA.
  • Item 15 A substance that suppresses secretion of mitochondrial DNA into body fluids or suppresses the function of mitochondrial DNA, which is used for prevention or treatment of autoimmune diseases.
  • the present invention makes it possible to accurately evaluate an autoimmune disease by using a biomarker as an mtDNA that is stably present in a biological fluid, particularly an extracellular membrane vesicle of the biological fluid, particularly an exosome fraction, in a patient with an autoimmune disease.
  • a biomarker as an mtDNA that is stably present in a biological fluid, particularly an extracellular membrane vesicle of the biological fluid, particularly an exosome fraction, in a patient with an autoimmune disease.
  • mtDNA can also be the etiology of autoimmune diseases, it can directly reflect the pathology of autoimmune diseases. Therefore, according to the biomarker of the present invention having such characteristics, it is difficult to evaluate and diagnose the disease state because the symptom and the biochemical index are not linked in the conventional diagnosis or disease state evaluation method. It is possible to accurately evaluate the presence and severity of the disease.
  • the result obtained based on the biomarker of this invention contributes to optimization of the treatment method according to the patient's individual disease state.
  • the diagnostic kit of the autoimmune disease containing the said biomarker can be provided. Furthermore, since mtDNA in a biological body fluid can cause etiology of autoimmune diseases, by targeting this, it is possible to provide a pharmaceutical effective for preventing or treating autoimmune diseases.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an inflammatory cascade involving mitochondria.
  • FIG. It is the schematic which shows the secretion and metabolic pathway of exosome.
  • It is a graph which shows the DNA density
  • SLE indicates systemic lupus erythematosus
  • SSc indicates systemic scleroderma
  • PM / DM indicates polymyositis / dermatomyositis.
  • BD indicates Behcet's disease
  • RA indicates rheumatoid arthritis
  • SLE indicates systemic lupus erythematosus
  • Const indicates a healthy person. It is a graph which shows the DNA density
  • b) shows a comparison of the treatment group with no treatment or colchicine alone (Non), the treatment group with an immunosuppressive agent (Conv), and the treatment group with anti-TNF- ⁇ antibody (Mab).
  • A is a graph showing that most of mtDNA present in serum is localized in extracellular membrane vesicles, particularly exosomes.
  • B is a graph showing that more mtDNA is localized in the exosome fraction of Behcet's disease patients compared to the control group.
  • C shows that DNA fragments are localized in MVB of monocytes derived from peripheral blood of Behcet's disease patients.
  • FIG. 10 shows the relative expression level of mtDNA in an exosome.
  • a is a graph showing the results of evaluating the enhanced release of mtDNA by stimulating monocytes, lymphocytes, and neutrophils obtained from patients with Behcet's disease.
  • ATP is stimulation by ATP
  • Nig is stimulation by Nigericin
  • Pam is stimulation by Pam3CSK4
  • PMA / IONO is stimulation by PMA and ionomycin
  • fMLP Stimulation with fMLP is shown.
  • b is a graph showing the results of evaluating the enhanced release of mtDNA by stimulating CD14-positive monocytes derived from patients with Behcet's disease and CD14-positive monocytes derived from healthy subjects.
  • ATP indicates stimulation by ATP
  • Nig indicates stimulation by Nigericin
  • Pam indicates stimulation by Pam3CSK4.
  • a shows the results of stimulation of CD14 positive monocytes derived from patients with Behcet's disease and the expression of lipid-bound LC3 and Atg5 / Atg12 complex measured by Western blotting.
  • b shows the result of observing with a confocal microscope about the formation of reactive oxygen species (ROS) -producing mitochondria and LC3 puncta by stimulating CD14-positive monocytes derived from patients with Behcet's disease.
  • c shows the results of observation of CD14-positive monocytes stimulated with PMA and Rotenone with a transmission electron microscope. It is a graph which shows that the exosome and mtDNA derived from a patient with Behcet's disease (BD) enhance the neutrophil migration activity.
  • ROS reactive oxygen species
  • a is a graph showing the results of evaluating the induction effect of IL-17-producing cells by exosomes derived from Behcet's disease patients (the expression level of IL-17-related genes by RT-PCR).
  • b is a graph showing the results of evaluating the induction effect of IL-17-producing cells by Bechet disease patient-derived exosomes (induction differentiation of IL-17-producing cells in vivo).
  • c is a graph showing the results of testing the TLR dependency of differentiation induction of IL-17-producing cells by exosomes derived from Behcet's disease patients using TLR9-deficient mice and MyD88-deficient mice.
  • d is a graph showing that induction of differentiation of IL-17-producing cells by exosomes derived from Behcet's disease patients is dependent on IL-1 and IL-23.
  • (a) is a figure showing that infiltration of inflammatory cells was observed around the retina by the administration of Bechet's disease patient-derived exosome, and destruction of the retinal structure, formation of ulcers and granulation was observed.
  • BD represents a Behcet disease patient or a Behcet disease patient-derived sample
  • Const represents a healthy person or a healthy person-derived sample
  • Biomarker The biomarker for autoinflammatory diseases of the present invention is characterized by comprising mitochondrial DNA (mtDNA) contained in a biological fluid.
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • mtDNA is present in a high concentration in the body fluid (eg, serum, urine, spinal fluid) of patients with autoimmune diseases, and this is used as an evaluation index for autoimmune diseases.
  • MtDNA is a circular double-stranded DNA present in a mitochondrial matrix that is an organelle.
  • mtDNA includes cytochrome b, cytochrome c oxidase (COX) subunits I, II, III, II; NADH dehydrogenase (NADH) subunits 1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6; ATP synthase (ATPase).
  • COXIII, NADH dehydrogenase, cytochrome b, etc. can be suitably used for detecting mtDNA, which is the biomarker of the present invention.
  • the origin of the biological body fluid is not particularly limited and can be any animal. More specifically, humans and mammals other than humans can be mentioned. Examples of mammals other than humans include experimental animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs; domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, and sheep; pets such as dogs and cats; , Primates such as orangutans and chimpanzees.
  • the source of the biological body fluid is preferably a primate, more preferably a human.
  • the biological body fluid is not particularly limited as long as it is a liquid that can be collected in a living body and contains mtDNA.
  • Specific examples of the biological fluid include body fluids such as whole blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, saliva, and alveolar lavage fluid, and preferable examples include serum, urine, spinal fluid, and the like. Further, serum and urine are more preferable examples from the viewpoint of low invasiveness during collection.
  • the biological body fluid is serum in the present invention
  • it is obtained by removing blood cells and blood coagulation factors such as fibrinogen (factor I), prothrombin (factor II), factor V and factor VIII from blood (whole blood).
  • Serum can be obtained in accordance with methods employed in clinical tests and the like, and is not particularly limited.
  • supernatant obtained after allowing blood to stand or supernatant obtained by subjecting blood to centrifugation can be obtained as
  • filter filtration or pretreatment using a column may be performed as necessary to remove contaminants such as serum proteins.
  • serum proteins examples include albumin, transferrin, haptoglobin, transthyretin, ⁇ 1 antitrypsin, ⁇ 2 macroglobulin, ⁇ 1-acid glycoprotein, immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), and immunoglobulin M (IgM).
  • IgG immunoglobulin G
  • IgA immunoglobulin A
  • IgM immunoglobulin M
  • Complement C3 apolipoprotein AI, apolipoprotein AII and the like.
  • the body fluid is urine
  • early morning urine is used to correct the error due to the measurement time, and it is expected to stabilize the test result and improve the correlation with the disease state (ie, decrease the false positive rate).
  • an exosome is a vesicle composed of a lipid bilayer with a diameter of 50 to 200 nm, encapsulates mRNA, microRNA and various proteins present in the cytoplasm, and has various biological activities depending on donor cells. It is known.
  • the exosomes are budded toward secretory vesicles generated from late endosomes, form multibody bodily (MVB), and are transported to the cell surface. And MVB is membrane-fused with the cell membrane, and the exosome that is the contents is released out of the cell. In addition to being transported to the cell surface, MVB is also transported to lysosome and fused with lysosome to decompose its contents (see FIG. 2 for the above).
  • MVB multibody bodily
  • exosomes Since mtDNA is present in extracellular membrane vesicles having such lipid bilayer membranes, particularly exosomes, mtDNA is protected from degradation by extracellular DNA-degrading enzymes (DNases) and exists stably. it is conceivable that. Therefore, by using mtDNA present in exosomes as a biomarker, it is possible to more accurately evaluate autoimmune diseases.
  • exosomes are known to be contained in a large amount in serum and urine. By isolating exosomes from serum and urine and measuring mtDNA contained in the exosomes, it is minimally invasive or non-invasive. Opening up the possibility of establishing an invasive evaluation system.
  • the method for separating exosomes is not particularly limited as long as a sample that can be used as a sample for detecting mtDNA is obtained, and can be appropriately selected from conventionally known methods.
  • Exosome separation can be performed by ultracentrifugation, but more conveniently, exosomes can be separated using commercially available kits, specifically, ExoQuickTM Exosome Precipitation Solution, Exoquick-TC, etc. (Both are manufactured by System Biosciences).
  • the detection of mtDNA is carried out by preparing a polynucleotide from the biological fluid or exosome fraction and performing an amplification reaction with a primer using this as a template, or by performing a hybridization reaction on the polynucleotide using a probe.
  • the prepared polynucleotide is preferably DNA from the viewpoint of stability and accuracy of evaluation.
  • Preparation of polynucleotides from biological body fluids or exosome fractions can be carried out by appropriately using known methods, and examples thereof include methods using phenol extraction and ethanol precipitation, and methods using glass beads. More simply, it can be prepared using a commercially available DNA extraction reagent or DNA extraction kit.
  • DNA extraction kit specifically, DNA Extractor SP Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be mentioned.
  • Detection of DNA corresponding to the aforementioned protein encoded by mtDNA can be performed by appropriately selecting from conventionally known methods.
  • a polynucleotide serving as a probe or an oligonucleotide serving as a primer is used to measure or amplify the expression level.
  • the primer include an oligonucleotide having a unique sequence capable of specifically hybridizing to at least a part of a target gene and amplifying the gene.
  • the probe include a polynucleotide having a unique sequence that specifically hybridizes to at least a part of the target gene.
  • primers or probes can be designed and synthesized according to a conventionally known method based on the sequence information of the target gene obtained using a program and database such as BLAST and FASTA.
  • the base sequence length of the primer is usually 16 to 32 bp, preferably 18 to 30 bp, more preferably 20 to 24 bp.
  • the primer set represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 used in Examples described later can be specifically mentioned.
  • the primer represented by sequence number 3 and 4 used in the Example mentioned later is illustrated.
  • a primer specifically amplifying the cytochrome b gene specifically, 5′-ATGACCCCAAATACGCAAAAT-3 ′ (forward primer: SEQ ID NO: 5); 5′-CGAAGTTTCCATCATCGGGAG-3 ′ (reverse primer: SEQ ID NO: 6) Is exemplified.
  • MtDNA can be detected based on an amplification product obtained by a gene amplification reaction using the primer as described above or a hybrid product obtained by a hybridization reaction using a probe.
  • a conventionally known method can be adopted, and is not particularly limited. Examples thereof include amplification of DNA / RNA by polymerase chain reaction (PCR), more specifically RT-PCR, Examples include nested PCR, real-time PCR, competitive PCR, TaqMan PCR, Direct PCR, and the like.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR RT-PCR
  • examples include nested PCR, real-time PCR, competitive PCR, TaqMan PCR, Direct PCR, and the like.
  • LAMP Loop-Mediated Amplification
  • ICAN Isomal and Primer-initiated Amplification of Nucleic acids
  • RCA Rolling Amplification
  • the detection of the amplification product is not particularly limited as long as it can be determined whether or not it is a desired polynucleotide. For example, it is confirmed whether or not a polynucleotide of a predetermined size is amplified by agarose gel electrophoresis. be able to.
  • deoxynucleotide triphosphate (dNTP) incorporated into the amplification product during the amplification reaction can be labeled and detected by measuring the labeled substance of dNTP incorporated into the amplification product.
  • dNTP deoxynucleotide triphosphate
  • labeled substances include fluorescent substances such as fluorescein (FITC), sulforhodamine (SR), tetramethylrhodamine (TRITC); luminescent substances such as luciferin; and radioisotopes such as 32 P, 35 S, and 121 I. .
  • fluorescent substances such as fluorescein (FITC), sulforhodamine (SR), tetramethylrhodamine (TRITC); luminescent substances such as luciferin; and radioisotopes such as 32 P, 35 S, and 121 I.
  • the detection may be performed quantitatively by an intercalator method using Syber Green or the like.
  • the base sequence length of the probe used for detecting mtDNA is usually 20 to 250 bp, preferably 20 to 100 bp, more preferably 20 to 50 bp.
  • the probe that hybridizes to the polynucleotide only needs to be capable of being detected and hybridized to at least a part of the polynucleotide, and does not have to have a complete complementary sequence.
  • the probe specifically hybridizes to the target polynucleotide (stringent conditions), for example, DNA having 90% or more homology. It is possible to appropriately set conditions under which DNAs hybridize with each other and DNAs with lower homology do not hybridize with each other.
  • Stringent conditions include, for example, conditions of washing at a temperature of 40 ° C. to 70 ° C. with a sodium concentration of 150 to 900 mM, pH 6 to 8, more specifically 50 ° C., 2 ⁇ SSC (300 mM NaCl, 30 mM). And citric acid), and conditions for washing with 0.1% by volume SDS.
  • the probe may be a fluorescent substance such as fluorescein (FITC), sulforhodamine (SR) or tetramethylrhodamine (TRITC); a luminescent substance such as luciferin; a radioisotope such as 32 P, 35 S or 121 I. Body; enzyme such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase; and labeling using a labeling substance such as biotin.
  • FITC fluorescein
  • SR sulforhodamine
  • TRITC tetramethylrhodamine
  • a luminescent substance such as luciferin
  • a radioisotope such as 32 P, 35 S or 121 I.
  • body enzyme
  • enzyme such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase
  • labeling using a labeling substance such as biotin.
  • the amount of mtDNA contained in the biological body fluid (or exosome), which is the biomarker of the present invention is significantly increased compared to the normal control group.
  • the amount of mtDNA contained in a biological body fluid is larger than that in a normal control group.
  • the amount of mtDNA in the serum of a test animal is 10 times or more that of a normal control group, more preferably 50 times or more. The case where it is 100 times or more especially preferably is pointed out.
  • the normal control group refers to a healthy test animal (preferably a human) who does not suffer from an autoinflammatory disease and does not have inflammatory symptoms.
  • an autoimmune disease means that the immune system becomes dysfunctional, abnormal antibodies called autoantibodies or self-reactive immune cells are produced, and recognizes and attacks specific cells and tissues as foreign bodies. It is a group of diseases that develop due to Autoimmune diseases are systemic diseases that cause inflammation and tissue damage due to immune responses to the self, and are accompanied by fever, pain, organ damage and joint destruction.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis (RA), polymyositis / dermatomyositis (PM / DM), systemic lupus erythematosus (SLC), systemic scleroderma (SSc), Sjogren's syndrome, mixed connective tissue So-called collagen diseases such as Behcet's disease (MCTD); Behcet's disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, familial Mediterranean fever (FMF), Cryopyin related periodic fever syndrome (CAPS), TNF receptor related periodic fever syndrome (TRAPS), Mevalonate Kinase-related periodic fever syndrome (MAPS: also known as high IgG syndrome), periodic fever with aphthous stomatitis, pharyngitis, lymphadenitis (PFAPA), so-called self-inflammatory syndrome such as Blau syndrome (also known as juvenile sarcoidosis); Castle Mann's disease and the like are exemplified.
  • RA rheumato
  • Autoimmune diseases to which the biomarker of the present invention is applied preferably include collagen disease and autoinflammatory syndrome, and more specifically, Behcet's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma, multiple sclerosis Myositis / dermatomyositis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD), Crohn's disease, ulcerative colitis.
  • the autoimmune disease to which the biomarker of the present invention is applied is more preferably autoinflammatory syndrome, more specifically Behcet's disease.
  • bacterial cell components such as bacteria and host-derived components (DAMPs) released by cell injury promote the production of mitochondrial-derived reactive oxygen species (mROS), which activates inflammasomes and produces IL- Promotes production of inflammatory cytokines such as 1 ⁇ and IL-18.
  • mROS mitochondrial-derived reactive oxygen species
  • IL-18 inflammatory cytokines
  • mitochondria are damaged by mROS and their contents are released into the cytoplasm. When they go out of the cell by apoptosis or necrosis, they act as DAMPs and further enhance inflammation. Injured mitochondria are isolated and decomposed (autophagy) by autophagy, which suppresses inflammation.
  • the mitochondrion contains mtDNA encoding information such as mitochondrial proteins.
  • mtDNA is released along with other contents.
  • the present invention is characterized in that an autoimmune disease is evaluated by using, as a biomarker, mtDNA released into a biological fluid that directly reflects an abnormality in the inflammatory cascade. Therefore, according to the biomarker of the present invention, it is possible to accurately evaluate a disease for which a biomarker that accurately reflects a disease state has not been found.
  • the inflammation marker used in the conventional evaluation method is not necessarily linked to the actual disease state and the behavior of the substance used as the marker. And accurate evaluation was difficult. Therefore, Behcet's disease is exemplified as a particularly suitable target disease to which the biomarker of the present invention is applied.
  • the amount of mtDNA in biological fluid tends to be high, and the degree of symptoms is diagnosed according to the amount of mtDNA in biological fluid You can also.
  • the amount of mtDNA in biological fluid tends to be high in patients with difficult treatment requiring TNF- ⁇ antibody therapy, and the choice of treatment intensity and prognosis are dependent on the amount of mtDNA in biological fluid. It is also possible to make a guess.
  • the diagnostic kit for autoimmune diseases of the present invention contains a reagent capable of detecting the mtDNA.
  • a reagent capable of detecting mtDNA when detecting mtDNA based on a gene or gene fragment encoded by mtDNA, a primer that specifically amplifies the gene or gene fragment, or the gene Alternatively, a probe that specifically hybridizes to a gene fragment is included as a reagent.
  • Specific examples of the reagent contained in the kit of the present invention include the primers shown in SEQ ID NOs: 1 to 6. These primers and probes are as described in “Biomarkers” above.
  • the reagent capable of detecting mtDNA may contain a buffer solution, salt, stabilizer, preservative, etc., and may be formulated according to a conventionally known method.
  • the diagnostic kit of the present invention may contain a labeling substance, a labeling substance detection agent, a reaction diluent, a standard antibody, a buffer, and a lysing agent that may be required for carrying out mtDNA detection. , Cleaning agents, reaction stop solutions, control samples, and the like.
  • a probe for detecting mtDNA can be immobilized on an insolubilizing carrier and used.
  • the insolubilized carrier can also be included in the diagnostic kit of the present invention.
  • the material of the insolubilizing carrier is not particularly limited as long as it does not prevent the detection of mtDNA.
  • the shape of the insolubilized carrier may be any shape such as a microplate, a tray shape, a spherical shape, a fiber shape, a rod shape, a disk shape, a container shape, a cell, and a test tube.
  • a DNA chip used for detection of an autoimmune disease can be obtained.
  • Immobilization of the probe to the insolubilized carrier can be performed according to a conventionally known method.
  • mtDNA can be detected semi-quantitatively by immobilizing probes for mtDNA at different concentrations on a carrier at equal intervals and hybridizing with mtDNA.
  • the present invention provides a method for detecting the presence or absence of an autoimmune disease using the mtDNA in biological body fluid, which is the aforementioned biomarker, including the following steps. (I) obtaining a body fluid sample from the subject animal; (Ii) measuring mitochondrial DNA in the body fluid sample; and (iii) detecting the presence or absence of an autoimmune disease based on the result of the step (ii).
  • the preparation of the body fluid sample from the test animal and the measurement of mtDNA in the body fluid sample described in the steps (i) and (ii) can be performed according to the description in the “Biomarker” column. Further, in the detection step described in the step (iii), the amount of mitochondrial DNA is increased by comparing the result of the step (ii) obtained for the test animal with the result of the step (ii) obtained for the normal control. Can be performed as an index.
  • the normal control group is as described in the “Biomarker” column.
  • test animals include humans and mammals other than humans.
  • mammals other than humans include experimental animals such as rodents and rabbits such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs; domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, and sheep; pets such as dogs and cats; , Primates such as orangutans and chimpanzees.
  • the test animal is preferably a primate, more preferably a human.
  • the evaluation based on the biomarker of the present invention is not limited to the detection of the presence or absence of an autoimmune disease, but also a method for predicting susceptibility to autoimmune disease, a method for detecting severity, a method for predicting prognosis, and a therapeutic drug. It can be used for screening methods and differential diagnosis of autoimmune diseases.
  • a test is performed in the same manner as the method for detecting the presence or absence of autoimmune disease. Based on the result of obtaining an animal body fluid sample and measuring the mitochondrial DNA in the body fluid sample, when the amount of mitochondrial DNA is higher than that of the normal control group, Susceptibility is predicted.
  • the severity of an autoimmune disease is determined based on the criterion Detection is performed.
  • the biomarker value detected from the test animal is higher than the standard value of the biomarker in the disease, the severity is detected based on the criterion that the disease is severe.
  • the prognosis of an autoimmune disease When evaluating the prognosis of an autoimmune disease based on the biomarker of the present invention (a method for predicting the prognosis of an autoimmune disease), as well as the method for detecting the presence or absence of the autoimmune disease, a body fluid sample of a test animal Based on the result of measuring mitochondrial DNA in the body fluid sample, the prognosis is predicted based on the criterion that the prognosis of autoimmune disease is poor when the amount of mitochondrial DNA is larger than that of the normal control group. Is done.
  • the biomarker value detected from the test animal is higher than the standard value in the disease, the prognosis is evaluated based on the criterion that the prognosis of the disease is poor.
  • a step of administering a contribution substance to a test animal suffering from an autoimmune disease a step of obtaining a body fluid sample from the test animal Measuring the amount of mitochondrial DNA in the body fluid; if the amount of mitochondrial DNA is small compared to a test animal suffering from an autoimmune disease that has not been administered the test substance, the test substance is effective for autoimmune disease
  • the steps of selecting as a suitable therapeutic agent are performed sequentially.
  • a body fluid sample of a test animal is obtained in the same manner as the method for detecting the presence or absence of the autoimmune disease. Based on the results of measuring mitochondrial DNA in the body fluid sample, if the amount of the mitochondrial DNA is higher than the standard value of the biomarker in the disease to be compared, it is said that the patient is suffering from a specific autoimmune disease A distinction is made between similar diseases based on criteria.
  • a correlation diagram is prepared in advance for the amount of mtDNA in the serum and the presence or absence, severity, susceptibility, prognosis, etc. of autoimmune disease, and the amount of mtDNA in the serum of the test animal You may evaluate by applying to a correlation diagram.
  • the disease can be evaluated at the individual level based on these evaluation methods, and the treatment method can be optimized according to each disease state.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for an autoimmune disease comprising a substance that suppresses secretion of mitochondrial DNA into body fluids or suppresses the function of mitochondrial DNA as an active ingredient.
  • suppressing secretion of mitochondrial DNA into body fluids means, for example, inhibiting mtDNA from being taken into exosomes, inhibiting exosomes from being released from donor cells, and exosomes to acceptor cells in the cell membrane. It refers to inhibiting uptake by fusion or endocytosis.
  • Suppressing the function of mitochondrial DNA refers to directly or indirectly inhibiting the induction of an inflammatory reaction by mtDNA. For example, mtDNA is cleaved by hydrolysis or the like, and exosomes containing mtDNA are destroyed. And a signal pathway activated by mtDNA (for example, inhibiting a signal pathway via G protein-coupled receptor or IL-1 receptor, Toll-like receptor or inflammasome).
  • Examples of the active ingredient of the preventive or therapeutic agent for autoimmune diseases of the present invention include, for example, DNA-degrading enzymes, active oxygen chelating agents, antioxidants, G protein-coupled receptor inhibitors, anti-IL-1 ⁇ antibodies, anti-IL-1 Examples include receptor antibodies, Toll-like receptor antagonists, and the like.
  • antisense DNA, nucleic acid aptamer, mROS chelating agent, exosome membrane synthesis inhibitor, etc. that selectively hybridize to mtDNA and suppress the induction of inflammatory reaction by mtDNA are also exemplified as useful substances.
  • the dose of the preventive or therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a therapeutically effective amount for autoimmune diseases, and is appropriately set based on the age, weight, symptoms, etc. of the patient.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention includes conventionally known carriers, excipients, suspending agents, dispersing agents, pH adjusting agents, antioxidants, preservatives and the like as long as the effects of the active ingredients are not impaired. May be included.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention is supported on a carrier such as nano-robot designed to open capsules selectively, nano-particles that selectively bind to mtDNA or exosomes, and transported to target cells. May be.
  • the administration form of the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be appropriately selected from conventionally known ones according to the age, symptoms, and type of disease of the patient.
  • intravenous administration, intraarterial administration, oral administration, tissue Examples include internal administration, transdermal administration, transmucosal administration, and respiratory tract administration.
  • preparation form of the preventive or therapeutic agent of the present invention is not limited, and may be appropriately selected depending on the administration form adopted. For example, injections, instillations, oral preparations, eye drops, inhalants, ointments, lotions Agents and the like.
  • the disease to which the preventive or therapeutic agent of the present invention is applied is an autoimmune disease, and specific examples thereof are as described above.
  • Preferred autoimmune diseases to which the preventive or therapeutic agent of the present invention is applied include collagen disease and autoinflammatory syndrome, and more specifically, Behcet's disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis Disease, polymyositis / dermatomyositis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD), Crohn's disease, ulcerative colitis, more preferably autoinflammatory syndrome, more specifically Behcet's disease Is mentioned.
  • Samples include diagnostic criteria from the Japanese Ministry of Health, Labor and Welfare Behcet's Disease Research Group, American Rheumatology Association, Systemic Lupus Erythematosus (SLE) diagnostic criteria, revised rheumatoid arthritis (RA) diagnostic criteria from the American College of Rheumatology, Japan's Ministry of Health, Labor and Welfare Serum collected from patients diagnosed on the basis of the diagnostic criteria for dermatosis (SSc) and the polymyositis / dermatomyositis (PM / DM) diagnostic criteria by the Ministry of Health and Welfare Specific Disease Investigation Research Group was used.
  • SSc dermatosis
  • PM / DM polymyositis / dermatomyositis
  • the mitochondrial DNA used in the following test examples and comparative test examples was collected from 36 Behcet's disease patients, 22 SLE patients, 28 RA patients, 14 SSc patients, and 8 PM / DM patients. Used. As controls, those collected from 10 healthy volunteers (sometimes referred to as healthy persons or controls) were used. However, for Reference Test Example 1, evaluation was performed using exosomes collected from 75 Behcet's disease patients and 9 healthy volunteers. The blood cell fraction used in the following test examples was evaluated using samples collected from 6 Behcet's disease patients and 6 healthy volunteers.
  • Serum DNA was prepared from serum (100 ⁇ l) using DNA Extractor SP Kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the attached protocol. Specifically, 100 ⁇ l of serum sample was digested with 5 ⁇ l of proteolytic enzyme (56 ° C., 10 minutes) and treated with 300 ⁇ l of sodium iodide solution to remove proteins from the serum. DNA was precipitated using 100% ethanol, and the supernatant was removed to purify the DNA pellet by adding 70% ethanol. The obtained serum DNA was resuspended in water (20 ⁇ l) not containing DNase.
  • DNA Extractor SP Kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a real-time standard curve was prepared using purified DNA derived from a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) whole cell lysate of a healthy person.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • a sample in which no PCR product was produced even after 40 cycles of the PCR reaction was judged as “undetectable”.
  • Exosome separation (separation using commercial kit) Exosomes were separated from plasma (100 ⁇ l) using ExoQuick TM Exosome Precipitation Solution (System Biosciences) according to the attached protocol. Specifically, serum (100 ⁇ l) and ExoQuick solution (25 ⁇ l) were mixed gently, cooled for 30 minutes, and then centrifuged at 1500 ⁇ g for 30 minutes. Thereafter, the supernatant was completely removed to obtain a pellet (an outer membrane vesicle containing an exosome fraction). The supernatant was used as a non-exosome fraction in Test Example 3 below. For use in the following test examples, this pellet was resuspended in 100 ⁇ l of PBS solution to obtain an exosome suspension. From the obtained exosome suspension, 2. The mtDNA was isolated according to the method described in 1.
  • Exosomes were isolated by ultracentrifugation. Specifically, 1.5 ml of serum was centrifuged at 2000 ⁇ g for 10 minutes to remove cell fragments, and then the supernatant was removed by centrifugation at 10000 ⁇ g for 30 minutes at 4 ° C. . Thereafter, the supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and the filtrate was further centrifuged at 110000 ⁇ g at 4 ° C. for 2.5 hours. The obtained pellet was dissolved in 9 ml of PBS, layered on a 30% sucrose solution, and centrifuged at 100000 ⁇ g at 4 ° C. for a further 2.5 hours.
  • sucrose solution containing the exosome was recovered and centrifuged at 100000 ⁇ g for 2.5 hours at 4 ° C. to obtain a exosome pellet.
  • this pellet was suspended in a PBS solution to obtain a highly pure exosome suspension.
  • ELISA 4 above.
  • the exosome suspension prepared in (1) was suspended at a 5000-fold dilution in an exosome binding buffer of ExoELISA Kit (System Bioscience). This suspension (100 ⁇ l) was coated on a 96-well plastic plate at 37 ° C. for 16 hours (immobilization). After blocking with 5% by volume BSA (solvent: PBS), anti-rabbit IgG labeled with 0.5 ⁇ g / ml anti-human CD9 monoclonal antibody at 37 ° C. for 2 hours and then labeled with HRP (horseradish peroxidase) (100 ⁇ l at a 10,000-fold dilution) was added and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • BSA solvent: PBS
  • HRP horseradish peroxidase
  • Human CD9 is known as a marker protein present in exosomes. 100 ⁇ l of R & D substrate reagent kit was added as a substrate, and luminescence by enzyme reaction was detected at 425 nm using ARVO manufactured by Perkinelmer.
  • peripheral blood fractions 30 ml of blood was collected from a subject, and separated into mononuclear cells and polynuclear cells using polymorphprep (Axis-Shield) according to the attached recommended protocol. Was evaluated as a neutrophil.
  • CD14 positive monocytes were further isolated using an anti-CD14 antibody with magnetic beads (Miltenyi Biotec). The remaining monocyte fraction was evaluated as a lymphocyte fraction.
  • the serum mtDNA level is not affected by either COXIII or NADH. Obviously high in patients with immune disease. As shown in the right column of FIG. 3, the serum of autoimmune disease patients contained about 50 to 500 times more mtDNA than healthy people.
  • Test Example 2 Increase in serum mitochondrial DNA in patients with Behcet's disease
  • Serum DNA concentration and amount of mtDNA in serum collected from patients with Behcet's disease or healthy volunteers (control group) were measured.
  • the measurement of serum DNA concentration and serum mtDNA value was performed in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in FIG.
  • the median serum DNA level is similar between patients with Behcet's disease and the control group, whereas the serum mtDNA level is Behcet's disease in both COXIII and NADH.
  • the patient showed a clearly higher value. That is, among the autoimmune diseases, it was shown that the mtDNA value in the serum was more significantly increased in patients with Behcet's disease, which is one of the autoinflammatory diseases.
  • the relative expression level shown on the vertical axis of FIG. 7 (b) is a template obtained by diluting a DNA extract obtained from PBMC (peripheral blood mononuclear cells) from healthy individuals into 6-fold dilutions in 6 steps. As a result, a calibration curve is prepared by performing PCR, and is indicated by a relative value.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a calibration curve is prepared by performing PCR, and is indicated by a relative value.
  • localization of DNA fragments in MVB of monocytes derived from peripheral blood of Behcet's disease patients was examined by immunoelectron microscopic analysis using an anti-DNA antibody.
  • the cyclic structure shown in FIG. 7 (c) represents MVB, and the vesicles therein represent exosomes.
  • the black dot at the end of the arrow indicates a DNA fragment stained with the anti-DNA antibody, and the white bar is 500 nm.
  • FIG. 7 (a) shows that mtDNA in serum is localized in the outer membrane vesicle represented by exosome.
  • FIG. 7 (b) shows that mtDNA present in the outer membrane vesicle represented by exosome is higher in Behcet's disease patients than in mtDNA present free in blood.
  • FIG. 7 (c) shows that DNA fragments are contained in vesicles in MVB of peripheral blood-derived monocytes, and that DNA fragments that are considered to be mtDNA are present in exosomes. It was also confirmed at the electron microscope level. Based on the knowledge so far, it was considered that free mtDNA alone acted as DAMPs (see, for example, Non-Patent Document 1). However, from the above results, it was shown that high mtDNA values localized in exosomes are associated with these diseases, not free mtDNA released with cell injury.
  • Table 1 shows that there is no difference in exosome levels between healthy subjects and patients with Behcet's disease.
  • THP-1 cells ATCC Cat. No. TIB-202
  • a human monocyte cell line The day after transfection of a mito-GFP vector (manufactured by Invitrogen) that expresses 2 ⁇ 10 4 cells in a glass bottom dish (manufactured by IWAKI), and in order to differentiate into macrophage-like cells, it contains 10% FCS. 100 nM PMA (phorbol myristate acetate) was added to RPMI 1640 medium and cultured for 3 days. Thereafter, 5 mM ATP and 15 ⁇ M Nigericin were added and stimulated for 30 minutes.
  • PMA phorbol myristate acetate
  • ATP acts as DAMPs and nigericin acts as PAMPs.
  • the cells were fixed with 4% by volume paraformaldehyde (PFA).
  • PFA paraformaldehyde
  • NGS Normal Goat Serum
  • anti-CD63 antibody manufactured by abcam
  • NGS Normal Goat Serum
  • anti-CD63 antibody manufactured by abcam
  • 1000-fold diluted solution of fluorescently labeled anti-rabbit IgG antibody manufactured by invitrogen
  • THP-1 cells pretreated for 1 hour with 500 ⁇ M of mROS chelating agent, mito-TEMPO (manufactured by Alexis), in order to investigate whether changes in intracellular localization are due to mitochondria-derived reactive oxygen species (mROS).
  • mito-TEMPO manufactured by Alexis
  • mROS mitochondria-derived reactive oxygen species
  • Extraction of DNA from the exosome fraction was carried out using the DNA Extractor SP Kit (sum) from the exosome fraction prepared in “4. Exosome separation (separation using a kit)” according to the method of “2. Separation of serum DNA”. This was carried out using Kojun Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the real-time PCR method was performed according to the method described in “3. Real-time PCR”. Similarly to (5-1), for the purpose of examining whether these changes were caused by mROS, a similar experiment was also performed on cells pre-treated for 1 hour by adding 500 ⁇ M of mito-TEMPO to the medium. The results are shown in FIG. The vertical axis in FIG. Similarly to the above, PCR is carried out using a solution obtained by serially diluting DNA derived from peripheral blood mononuclear cells derived from healthy subjects as a template, and the relative expression level is relative to that value.
  • FIG. 11a in lymphocytes and neutrophils derived from patients with Behcet's disease, mtDNA release was not enhanced by any stimulation, but in CD14-positive monocytes, mtDNA was markedly stimulated by stimulation with ATP and Pam3CSK4. Increased release was observed. Further, as shown in FIG. 11b, it was shown that CD14-positive cells derived from patients with Behcet's disease significantly enhanced mtDNA release by ATP, Nigericin and Pam3CSK4 as compared to CD14-positive cells derived from healthy subjects. These facts suggested that a lot of mtDNA was released in myeloid cells represented by peripheral blood CD14 positive monocytes in patients with Behcet's disease.
  • a CD14 positive monocyte fraction was isolated from peripheral blood, seeded with 1 ⁇ 10 5 cells in a 35 mm dish, and then stimulated with 100 nM PMA. Cultured for 16 hours. Thereafter, stimulation was performed with 5 mM ATP and 15 ⁇ M Nigericin as a representative of PAMPs / DAMPs for 60 minutes. Moreover, it stimulated for 60 minutes with Rapamycin (10 nM) which induces an effect equivalent to autophagy induced by starvation as a positive control. Thereafter, the medium was replaced with complete RPMI 1640 medium and cultured at 37 ° C. for 60 minutes.
  • induction of autophagy was examined by Western blotting. That is, the cells were suspended in a TNE buffer containing 1% NP40 (Nonidet P-40), heat-treated at 96 ° C. for 5 minutes, and then subjected to electrophoresis. After transferring to a nitrocellulose membrane, it was blocked with 1% skim milk. After reacting overnight with an anti-LC-3 antibody (manufactured by Cell signaling), an anti-ATG12 antibody (manufactured by Cell signaling), and an anti- ⁇ -actin antibody (manufactured by MBL), it was reacted with a secondary antibody bound with HRP.
  • NP40 Nonidet P-40
  • CD14-positive monocytes were stimulated with Rotenone (10 ⁇ M), an inhibitor of mitochondrial respiratory chain complex I, for 6 hours. After fixing with 4% PFA for 1 hour, it was prefixed with 1% glutaraldehyde for 10 minutes, and further fixed with 1% osmium tetroxide and 1.5% potassium ferrocyanide for 1 hour. After embedding the sample with a resin, a thin film having a thickness of 80 nm was prepared and observed with a transmission electron microscope.
  • the monocytic cells derived from Behcet's disease have small mitochondrial fragments that appear to have deformed crystal structures due to induction of mitochondrial stress. Many structures were observed in the cytoplasm.
  • Exosomes released from donor cells are taken into acceptor cells by cell membrane fusion or endocytosis, and various biological activities of donor cells are transmitted to acceptor cells. So far, in the immune system, peptide / MHC complexes are transported by exosomes and contribute to antigen transmission, and acceptor cells are genetically and epigenically controlled by mRNA and microRNA in exosomes. (See, eg, Clotilde Thery, Matias Ostrowski and Elodie Segura. Membrane vesicles as conveyors of immunity responses. Nat Rev Immunol, 9:58.
  • Test Example 5 suggested that mtDNA is incorporated into exosomes when stress is applied to mitochondria.
  • mtDNA is present in exosomes, so even if it is released outside the cell, it is not affected by DNase or the like, and it is expected that it can exist relatively stably in serum or the like. Accordingly, the hypothesis was made that “the exosome containing mtDNA and mtDNA may enhance the immune response”, and the following was examined.
  • FIG. 14 shows a representative example of the case where exosomes or mtDNA derived from healthy subjects and Behcet's disease patients are added to the results of tracking changes in neutrophil movement over time.
  • exosomes containing mtDNA derived from Behcet's disease patients significantly increased neutrophil migration speed and migration distance compared to healthy subject-derived exosomes.
  • mtDNA itself prepared from exosomes derived from Behcet's disease patients also showed enhanced neutrophil migration activity.
  • the neutrophil migration activity by the patient-derived exosome was inhibited by treatment with Bordetella pertussis toxin PTx (manufactured by SIGMA-ALDRICH), which is a G protein-coupled receptor inhibitor (containing 0.1% BSA).
  • PTx treatment was performed at a concentration of 50 ng / ml in RPMI medium), and it was also inhibited by the treatment against formyl peptide receptor 1 (FPR1), which is a G protein-coupled receptor (anti-FPR1 antibody: manufactured by R & D) (Anti-FPR1 antibody treatment was performed at a concentration of 100 ⁇ g / ml in RPMI medium containing 0.1% BSA).
  • FPR1 formyl peptide receptor 1
  • Anti-FPR1 antibody treatment was performed at a concentration of 100 ⁇ g / ml in RPMI medium containing 0.1% BSA).
  • exosomes prepared by ultracentrifugation from 100 ⁇ l of serum collected from patients with Behcet's disease (BD) or healthy subjects, or prepared using Exoquick from 70 ⁇ l of serum. After culturing for 24 hours, the production of IL-1 ⁇ , TNF ⁇ , IL-12p40 / IL-23p35, and IL-23p19 inflammatory cytokines in the culture supernatant was examined by ELISA.
  • mouse IL-1 ⁇ -Quantikine ELISA kit commercially available mouse IL-1 ⁇ -Quantikine ELISA kit, mouse TNF ⁇ -Quantikine ELISA kit, mouse IL-12p40 / IL-23p35-Quantikine ELISA kit, mouseQ19 , Human IL-12p40 / IL-23p35-Quantikine ELISA kit, human IL-1 ⁇ -Quantikine ELISA kit (both manufactured by R & D systems) were used according to the attached manual. That is, the plate attached to the kit on which the antibody against the cytokine is immobilized is blocked with 5% by volume BSA (solvent: PBS), and then a 2-fold to 5-fold dilution of the culture supernatant is added to the plate at room temperature.
  • BSA solvent: PBS
  • TLR9-deficient mice and MyD88-deficient mice are used to clarify the involvement of TLR9, a Toll-like receptor (TLR) that recognizes DNA, in the above reaction.
  • TLR9 a Toll-like receptor
  • the same experiment was conducted using the creation, oriental bioservice contract sales).
  • ODN2088 and ODN2088 control manufactured by Addgene
  • CpG oligo DNA which is an antagonist of TLR9. The results are shown in FIG.
  • NLRP3-deficient mice, ASC-deficient mice and caspase-1-deficient mice were used in the same manner. The experiment was conducted. The results are shown in FIG.
  • exosomes derived from Behcet's disease patients that is, exosomes containing mtDNA
  • both exosomes isolated by ultracentrifugation and Exoquick are inflammatory cytokines IL-1 ⁇ , TNF ⁇ , It was shown that IL-12p40 / IL-23p35, IL-23p19, etc. have a production enhancing action.
  • TLR9-deficient mouse-derived bone marrow-derived macrophages and bone marrow-derived dendritic cells cytokine production by patient-derived exosomes was partially reduced, and MyD88-deficient mouse-derived cells were almost completely reduced.
  • production of inflammatory cytokines by BD patient-derived exosomes was reduced by the TLR9 inhibitor. This suggests that BD-derived exosomes promote cytokine production via TLRs not only in mice but also in humans.
  • the BD patient-derived exosomes enhanced IL-1 ⁇ production enhancing action. This suggests that BD patient-derived exosomes promote IL-1 ⁇ production via NLRP3 inflamassome.
  • neutrophils contained in cells infiltrated into the abdominal cavity by staining some cells with 100-fold diluted anti-Gr-1 (Ly6G) antibody (BD Bioscience) and anti-Ly6C antibody (BD Bioscience)
  • the ratio of (Ly6G positive Ly6C positive) and inflammatory monocytes (Ly6G negative Ly6C positive) was analyzed by FACS (Canto II (manufactured by BD Bioscience)), and the number of neutrophils was calculated by multiplying the total number of cells. evaluated. The results are shown in FIG.
  • TLR9 receptor-deficient mice (Osaka University iFReC natural mice) were used to clarify the involvement of TLR9 and other major TLRs. Created by Immunology Laboratory, Oriental Bioservice Contract Sales), and MyD88-deficient mice involved in most TLR and IL-1 receptor signaling (Created by Osaka University iFReC Natural Immunology Laboratory, Oriental Bioservice Contract Sales) A similar experiment was performed. The results are shown in FIG. In addition, in order to clarify the involvement of NLRP3 inflamasome and IL-1 receptor, a similar experiment was performed using NLRP3-deficient mice and IL-1 receptor antagonist (Millipore). The results are shown in FIG.
  • the neutrophil infiltration activity by the patient-derived exosome is partially inhibited in TLR9-deficient mice, and MyD88 involved in signal pathways including other TLR receptors and IL-1 receptors.
  • mice deficient in A it was inhibited more than in mice lacking TLR9.
  • the neutrophil infiltration activity by the patient-derived exosome decreased in NLRP3-deficient mice.
  • administration of IL-1 receptor antagonist inhibited neutrophil infiltration activity by patient exosomes.
  • mtDNA induces an inflammatory response through TLR9 and NLRP3 so far. Based on these findings and the results of the analysis using the above gene-deficient mice, it was strongly suggested that mtDNA is the main responsible molecule for the inflammatory response elicited by exosomes derived from Behcet's disease patients.
  • IL-17 producing cells are involved in the pathogenesis of Behcet's disease.
  • the present inventor conducted the following examination on the hypothesis that Bexett disease patient-derived exosomes are also involved in differentiation into IL-17-producing cells.
  • exosomes derived from Behcet's disease patients and healthy subjects prepared according to the above “4. Isolation of exosomes” were administered intraperitoneally to 6 to 8 week-old C57BL / 6 mice (manufactured by CLEA Japan, Inc.) with an Exoquick equivalent to 70 ⁇ l of serum. 48 hours later, 5 ml of PBS was administered intraperitoneally, and cells infiltrated into the peritoneal cavity were washed and collected.
  • the collected cells are separated into a non-T cell fraction and a T cell fraction with an anti-CD3 antibody with magnetic beads (Millitainney), mRNA is extracted from each cell using RNeasy (manufactured by Qiagen), random primers and CDNA was obtained using reverse transcriptase (manufactured by Invitrogen).
  • RNeasy manufactured by Qiagen
  • random primers and CDNA was obtained using reverse transcriptase (manufactured by Invitrogen).
  • the expression of Il23 mRNA for GAPDH in non-T cell fractions, and the expression of Il17a, Il23r and Rorc mRNA for GAPDH in T cell fractions by real-time PCR using I7700 with a probe of TaqMan (manufactured by Applied BioScience) was examined. The results are shown in FIG.
  • exosomes derived from Behcet's disease patients and healthy subjects prepared according to the above “4. Isolation of exosomes” were administered intraperitoneally to 6 to 8 week-old C57BL / 6 mice (manufactured by CLEA Japan) (a serum equivalent to 70 ⁇ l of serum). Exosomes prepared with Exoquick), and 72 hours later, 5 ml of PBS was administered intraperitoneally, and cells infiltrated into the peritoneal cavity were washed and collected. After centrifuging the solution, the total number of cells was counted using GUAVA (Millipore).
  • some cells were stimulated with 50 ng / ml PMA and 250 ng / ml ionomycin for 4 hours in the presence of Golgi-stop (manufactured by BD Bioscience), and then 100-fold diluted anti-CD3 antibody and anti-CD4 antibody ( After staining with BD Bioscience) and anti-TCR ⁇ antibody (BD Bioscience), the cells were fixed with 4% PFA. Thereafter, cytoplasmic cytokine staining was performed with an anti-IL-17 antibody (BD Bioscience).
  • Th17 IL-17-producing helper T cells
  • ⁇ T17 IL-17-producing ⁇ T cells
  • Il17a mRNA is enhanced by Bexet disease patient-derived exosomes, and is involved in the expression of Rorc mRNA, which is a transcription factor of IL-17, and differentiation induction of IL-17-producing cells. It was shown that the expression of Il23 and Il23r mRNA, which are known to be increased, is enhanced. Further, as shown in FIG. 22b, increase in the number of Th17 cells and ⁇ T17 cells in the peritoneal cavity was observed by intraperitoneal administration of the Bechet disease patient-derived exosome. From these results, it was shown that exosomes derived from Behcet's disease patients promote the induction of differentiation of IL-17-producing cells.
  • exosomes derived from Behcet's disease patients are involved in the induction of differentiation of IL-17-producing cells.
  • IL-23 is dependent on NLRP3 inflamassome from dendritic cells and macrophages in a TLR-dependent manner by exosomes containing a large amount of mtDNA derived from patients with Behcet's disease.
  • IL-1 ⁇ was produced and that the induction of differentiation of IL-17-producing cells was promoted.
  • IRBP-specific T cells were intravenously administered to C57BL / 6 mice to induce experimental autoimmune uveitis (EAU), one of the animal models of Behcet's disease. went.
  • EAU experimental autoimmune uveitis
  • This model mouse was subjected to a total of four times (0, 1, exosomes prepared with Exoquix corresponding to 30 ⁇ l of serum) prepared from patients with Behcet's disease (BD) and healthy subjects prepared according to “4. Isolation of exosomes”. (Days 2 and 7) After intravenous administration, the mice were euthanized on day 13, and then the eyeballs were taken out and fixed with 4% PFA, followed by H & E staining. The results are shown in FIG. In addition, the paper (Agarwal, RK, Silver, PB & Caspi, RR Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 900, 443-69 (2012) ) was evaluated based on the evaluation method. The results are shown in FIG.
  • FIG. 23a administration of Bechet's disease patient-derived exosomes caused extensive infiltration of inflammatory cells around the retina, and destruction of the retinal structure, formation of ulcers and granulation was observed.
  • FIG. 23b an increase in histological severity score was shown in mice administered with exosomes derived from Behcet's disease patients.
  • the exosomes derived from Behcet's disease patients have a neutrophil migration enhancing effect.
  • the inflammation-inducing reaction by exosomes derived from patients with Behcet's disease is mediated by G protein-coupled receptors, TLRs including TLR9, NLRP3 inflamassome, and the produced IL-1 ⁇ , IL-23, etc.
  • mtDNA present in blood exosomes may be a major cause of autoimmune disease, which is thought to cause prolongation. That is, it was shown that mtDNA contained in the exosome fraction has higher accuracy as a biomarker of autoimmune disease, directly reflects the disease state and is useful as a therapeutic target.
  • SEQ ID NO: 1 is a forward primer for COXIII.
  • SEQ ID NO: 2 is a reverse primer for COXIII.
  • SEQ ID NO: 3 is a forward primer for NADH dehydrogenase.
  • SEQ ID NO: 4 is a reverse primer for NADH dehydrogenase.
  • SEQ ID NO: 5 is a forward primer for cytochrome b.
  • SEQ ID NO: 6 is a reverse primer for cytochrome b.

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Abstract

　本発明は、自己免疫疾患を正確に評価することが可能なバイオマーカーを提供することを主な課題とする。前記課題は、生体体液中に含まれるミトコンドリアＤＮＡからなる、自己免疫疾患のバイオマーカーにより解決される。また、本発明は、当該バイオマーカーを検出可能な試薬を含む診断キット、被検動物の血清中の当該バイオマーカー量に基づいて被検動物の自己免疫疾患を検出する方法等を提供する。

Description

自己免疫疾患のバイオマーカー
　本発明は、自己免疫疾患の正確な評価が可能なバイオマーカーに関する。
　自己免疫疾患は、これまで、自己免疫寛容の破綻に伴う自己反応性Ｔ細胞や自己抗体による組織又は臓器の傷害によって惹起される疾患と理解されてきた。自然免疫とは、生体が生まれつき備えている免疫システムであり、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等により構成されている。しかしながら、近年、自然免疫系に対する理解が進むにつれ、自然免疫系における免疫応答の破綻が自己免疫疾患の原因又は増悪因子である可能性が示唆されつつある。
　自然免疫系を刺激する物質としては、例えば病原体由来炎症性物質（ＰＡＭＰｓ：Ｐａｔｈｏｇｅｎ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐａｔｔｅｒｎｓ）や自己由来炎症性物質（ＤＡＭＰｓ：Ｄａｍａｇｅ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐａｔｔｅｒｎｓ）が知られている。ＰＡＭＰｓは、ヒト等には存在せず微生物に普遍的に存在する物質であり、食細胞（マクロファージ、好中球）、樹状細胞等はパターン認識レセプター（ＰＲＲ）によりこれらを感知して微生物排除のための反応を行う。また、ＤＡＭＰｓは、外傷、アポトーシス、ネクローシス等によるダメージを受けた細胞から放出され、自然免疫の活性化を引き起こす。
　ＰＡＭＰｓ及びＤＡＭＰｓによる刺激は、炎症性サイトカインの産生を促進する。また宿主の細胞及び細胞内に存在するミトコンドリアにダメージを与え、これがミトコンドリアの分解や細胞死を引き起こし、細胞質及び細胞外（血液中）にミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の放出を促す。更に、このｍｔＤＮＡがＤＡＭＰｓとなり、更に免疫細胞を活性化することが知られている（例えば、図１を参照）。例えば、多発性外傷の患者は肺炎や全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を併発することが多いが、これは外傷によってダメージを受けたミトコンドリア（あるいは細胞）がｍｔＤＮＡを放出し、これがＤＡＭＰｓとして更に免疫細胞に作用するため、一見外傷とは無関係の肺炎や全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を発症すると考えられている（例えば、非特許文献１を参照）。本発明者らは、このような自然免疫系のプラットフォームとして機能するミトコンドリアのホメオスターシスの破綻に起因する免疫応答の異常に着目し、自己免疫疾患の発症メカニズムについて研究を行っていた。
　一般的に、自己免疫疾患の診断は、専門医によって臨床症状及び自己抗体価の測定に基づいて行われる。また、病勢についてはＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）や血沈等の炎症マーカーの測定により実施され、重症度の診断は合併する臓器病変の程度に基づいて行われている。ＣＲＰは、体内で炎症反応や組織の破壊が起きているときに血中に現れるタンパク質であり、通常、ＣＲＰの産生量は炎症反応の強さに相関する。しかしながら、例えばベーチェット病のように疾患活動性とＣＲＰが連動しない自己免疫疾患も存在する。そのため、自己免疫疾患の正確な評価が可能であり、且つ簡便に測定することができるバイオマーカーが求められていた。
Ｑｉｎ　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４６４，４　Ｍａｃｈ　２０１０，ｐｇ．１０４－１０７
　本発明は、自己免疫疾患を正確に評価することができるバイオマーカーを提供することを主な目的とする。また、本発明は、当該バイオマーカーを検出することが可能な試薬を含む診断キット、当該バイオマーカーを利用した診断方法、及び自己免疫疾患の予防又は治療剤を提供する。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、自己免疫疾患患者の血清中には健康な人の約５０倍～約５００倍ものｍｔＤＮＡが含まれることを見出した。更に、本発明者らは、このｍｔＤＮＡが、血清中のエキソソーム及びエクトソームと呼ばれるマイクロベジクルからなる細胞外膜小胞、特にエキソソーム（小胞）中に局在していることを見出た。本発明は、これらの知見に基づいて更に研究を重ねた結果完成されたものである。
　即ち、本発明は下記態様の発明を提供する。
項１．　生体体液中に含まれるミトコンドリアＤＮＡからなる、自己免疫疾患のバイオマーカー。
項２．　ミトコンドリアＤＮＡが生体体液中の細胞外膜小胞内に含まれる、項１に記載のバイオマーカー。
項３．　ミトコンドリアＤＮＡが生体体液中のエキソソーム内に含まれる、項１又は２に記載のバイオマーカー。
項４．　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか１種である、項１～３のいずれかに記載のバイオマーカー。
項５．　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病である、項１～４のいずれかに記載のバイオマーカー。
項６．　ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬を含む、自己免疫疾患の診断キット。
項７．　前記ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬が、シトクロムｂ、ＣＯＸＩ、ＣＯＸＩＩ、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼブユニット２、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６、ＡＴＰａｓｅ第６サブユニット及びＡＴＰａｓｅ第８サブユニットからなる群より選択される少なくとも１種を検出することが可能な試薬である、項６に記載の診断キット。
項８．　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか１種である、項６又は７に記載の自己免疫疾患の診断キット。
項９．　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病である、項６～８のいずれかに記載の自己免疫疾患の診断キット。
項１０．　下記工程を含む自己免疫疾患の罹患の有無の検出方法：
（ｉ）被検動物から体液試料を得る工程；
（ｉｉ）前記体液試料中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の結果に基づいて自己免疫疾患の罹患の有無を検出する工程。
項１１．　前記工程（ｉｉｉ）が、被験動物について得られる工程（ｉｉ）の結果を、正常対照について得られる工程（ｉｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として行われる、項１０に記載の検出方法。
項１２．　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか１種である、項１０又は１１に記載の自己免疫疾患の検出方法。
項１３．　ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制する物質を有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
項１４．　ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制する物質の、自己免疫疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
項１５．　自己免疫疾患の予防又は治療に使用される、ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制する物質。
　本発明は、自己免疫疾患患者において生体体液、特に生体体液の細胞外膜小胞、特にエキソソーム画分に安定的に存在するｍｔＤＮＡをバイオマーカーとし、これにより自己免疫疾患の正確な評価を可能とする。ｍｔＤＮＡは自己免疫疾患の病因ともなり得ることから、自己免疫疾患の病態を直接的に反映することができる。従って、このような特徴を有する本発明のバイオマーカーによれば、従来の診断又は病態の評価方法では症状と生化学的な指標が連動しないために病態の評価や診断が困難であった疾患についても、罹患の有無や重症度を正確に評価することが可能である。そして、本発明のバイオマーカーに基づいて得られた結果は、患者個々の病態に応じた治療法の最適化に資するものである。また、本発明によれば、前記バイオマーカーを含む自己免疫疾患の診断キットが提供され得る。更に、生体体液中のｍｔＤＮＡは自己免疫疾患の病因となり得ることから、これをターゲットとすることにより、自己免疫疾患の予防又は治療に有効な医薬を提供することができる。
ミトコンドリアが関与する炎症カスケードを示す概略図である。 エキソソームの分泌、代謝経路を示す概略図である。 自己免疫疾患患者の血清中のＤＮＡ濃度及びｍｔＤＮＡ値を示すグラフである。図３中、「ＳＬＥ」は全身性エリテマトーデス、「ＳＳｃ」は全身性強皮症、「ＰＭ/ＤＭ」は多発性筋炎／皮膚筋炎を指す。 自己免疫疾患患者の血清中ｍｔＤＮＡの発現量を示すグラフである。図４中、「ＢＤ」はベーチェット病、「ＲＡ」は慢性関節リウマチ、「ＳＬＥ」は全身性エリテマトーデス、「Ｃｏｎｔ」は健常者を指す。 ベーチェット病患者及びコントロール群（健常者）における血清中のＤＮＡ濃度及びｍｔＤＮＡ値を示すグラフである。 各臨床的特徴を有するベーチェット病患者における血清ｍｔＤＮＡ値を示す図である。ａ）には、活動期ブドウ膜炎の臨床症状を呈しない症例（Ｎｏｎ）と、活動期ブドウ膜炎の臨床症状を呈する症例（Ｕｖｅｉｔｉｓ）の比較を示す。ｂ）には、無治療ないしコルヒチンのみによる治療群（Ｎｏｎ）、免疫抑制剤による治療群（Ｃｏｎｖ）、及び抗ＴＮＦ－α抗体による治療群（Ｍａｂ）の比較を示す。 （ａ）は血清中に存在するｍｔＤＮＡはほとんどが細胞外膜小胞、特にエキソソーム中に局在していることを示すグラフである。（ｂ）は、コントロール群と比較して、ベーチェット病患者のエキソソーム画分にはｍｔＤＮＡが多く局在していることを示すグラフである。（Ｃ）はベーチェット病患者末梢血由来単球のＭＶＢ内においてＤＮＡ断片が局在していることを示す図である。 ミトコンドリアストレスにより細胞質中に放出されたｍｔＤＮＡが、エキソソームに取り込まれて細胞外に放出されているとする仮説を示す概略図である。 ミトコンドリアストレスによりエキソソームとミトコンドリアが共局在することを示す写真である。 ミトコンドリアストレスによりエキソソーム中のｍｔＤＮＡ量が増加したことを示すグラフである。図１０の縦軸は、エキソソーム中のｍｔＤＮＡの相対的発現量を示す。 ａは、ベーチェット病患者から得られた単球、リンパ球、及び好中球に、刺激を行ってｍｔＤＮＡの放出亢進を評価した結果を示すグラフである。ａ中、「Ｎｏｎ」は刺激無し、「ＡＴＰ」はＡＴＰによる刺激、「Ｎｉｇ」はＮｉｇｅｒｉｃｉｎによる刺激、「Ｐａｍ」はＰａｍ３ＣＳＫ４による刺激、「ＰＭＡ/ＩＯＮＯ」はＰＭＡ及びイオノマイシンによる刺激、「ｆＭＬＰ」はｆＭＬＰによる刺激を示す。ｂは、ベーチェット病患者由来のＣＤ１４陽性単球と、健常者由来のＣＤ１４陽性単球に刺激を行ってｍｔＤＮＡの放出亢進を評価した結果を示すグラフである。ｂ中、「ＡＴＰ」はＡＴＰによる刺激、「Ｎｉｇ」はＮｉｇｅｒｉｃｉｎによる刺激、「Ｐａｍ」はＰａｍ３ＣＳＫ４による刺激を示す。 ａには、ベーチェット病患者由来のＣＤ１４陽性単球に刺激を行って、脂質結合型ＬＣ３、Ａｔｇ５／Ａｔｇ１２複合体の発現をウエスタンブロット法にて測定した結果を示す。ｂには、ベーチェット病患者由来のＣＤ１４陽性単球に刺激を行って、活性酸素種（ＲＯＳ）産生性のミトコンドリア及び、ＬＣ３のｐｕｎｃｔａ形成について、共焦点顕微鏡にて観察した結果を示す。ｃには、ＰＭＡとＲｏｔｅｎｏｎｅで刺激したＣＤ１４陽性単球を透過型電子顕微鏡にて観察した結果を示す。 ベーチェット病（ＢＤ）患者由来のエキソソーム及びｍｔＤＮＡが好中球の遊走活性を亢進させることを示すグラフである。 好中球の経時的運動変化をトラッキングしたタイムプラス観察の結果の代表例を示す図である。 ベーチェット病患者由来のエキソソームによる好中球遊走活性はＧタンパク質共役型受容体を介することを示すグラフである。 ベーチェット病患者由来エキソソームにより、マウス及びヒト由来マクロファージ又は樹状細胞において炎症性サイトカインの産生が誘導されたことを示す図である。 ベーチェット病患者由来エキソソームによる炎症性サイトカインの産生誘導はＴＬＲ９依存的であることを示す図である。 ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１βの産生誘導はｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ依存的であることを示す図である。 ベーチェット病患者由来エキソソームにより、Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ＋の好中球、及びＬｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ－の炎症性単球の浸潤が誘導されたことを示す図である。 ベーチェット病患者由来エキソソームによる好中球及び炎症性単球の浸潤の一部はＴＬＲ９依存的であることを示す図である。 ベーチェット病患者由来エキソソームによる好中球および炎症性単球の浸潤の一部はＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ及びＩＬ－１依存的であることを示す図である。 ａは、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞の誘導効果を評価した結果（ＲＴ－ＰＣＲによるＩＬ－１７関連遺伝子の発現量）を示す図である。ｂは、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞の誘導効果を評価した結果（ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩＬ－１７産生細胞の分化誘導）を示す図である。ｃは、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞の分化誘導のＴＬＲ依存性について、ＴＬＲ９欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスを用いて試験を行った結果を示す図である。ｄは、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞の分化誘導はＩＬ－１及びＩＬ－２３依存的であることを示す図である。 ａは、ベーチェット病患者由来エキソソームの投与により網膜周辺におびただしい炎症性細胞の浸潤が認められ、網膜構造の破壊、潰瘍や肉芽の形成が認められたことを示す図である。ｂは、ベーチェット病患者由来エキソソームを投与されたマウスにおいて、組織学的重症度スコアの亢進が示されたことを示す図である。　なお、図中、略号「ＢＤ」はベーチェット病患者又はベーチェット病患者由来サンプルを示し、略号「Ｃｏｎｔ」は健常者又は健常者由来サンプルを示す。
バイオマーカー
　本発明の自己炎症性疾患のバイオマーカーは、生体体液中に含まれるミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）からなることを特徴とする。本発明においては、ｍｔＤＮＡが自己免疫疾患患者の生体体液中（例えば血清、尿、髄液中）に高濃度で存在することに基づき、これを自己免疫疾患の評価指標として用いる。
　ｍｔＤＮＡは、細胞小器官であるミトコンドリアのマトリクス中に存在する環状二本鎖ＤＮＡである。ｍｔＤＮＡには、シトクロムｂ、シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）サブユニットＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＩ；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＨ）のサブユニット１、２、３、４、４Ｌ、５、６；ＡＴＰ合成酵素（ＡＴＰａｓｅ）第６サブユニット及び第８サブユニットがコードされている。本発明のバイオマーカーとしてのｍｔＤＮＡの検出は、ｍｔＤＮＡにコードされるこれらの遺伝子のＤＮＡを検出することにより行うことができる。前記具体的な遺伝子のいずれか１種を自己免疫疾患のバイオマーカーとして検出してもよく、２種以上を組合せて検出し、自己免疫疾患の評価に利用することもできる。例えば、本発明のバイオマーカーであるｍｔＤＮＡの検出には、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、シトクロムｂ等を好適に利用することができる。
　また、上記一連のタンパク質は環状のｍｔＤＮＡ上にコードされていることから、いずれのタンパク質をコードするＤＮＡを指標として使用してもｍｔＤＮＡの挙動を正確に検出することが可能である。
　生体体液の由来は特に限定されず、任意の動物とすることができる。より具体的には、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられる。ヒトを除く哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類が挙げられる。本発明において生体体液の由来として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
　本発明において生体体液は、生体内に存在する採取可能な液体であって、ｍｔＤＮＡが含まれるものであれば特に限定されない。生体体液として具体的には、全血、血清、血しょう、尿、髄液、唾液、肺胞洗浄液等の体液が挙げられ、血清、尿、髄液等が好適な例として挙げられる。更に、採取に際し侵襲性が低いという観点から血清や尿がより好ましい例として挙げられる。
　例えば、本発明において生体体液が血清である場合、血液（全血）から血球と、フィブリノーゲン（Ｉ因子）、プロトロンビン（ＩＩ因子）、Ｖ因子、ＶＩＩＩ因子等の血液凝固因子を除去して得られる。血清の取得については臨床検査等で採用されている方法に従って行うことができ、特に限定されないが、例えば、血液を静置した後に得られる上清、あるいは血液を遠心分離に供して得られる上清として得ることができる。また、本発明のバイオマーカーの検出に先立ち、必要に応じて血清タンパク質等の夾雑物を除去するため、フィルター濾過やカラムを利用した前処理を行ってもよい。血清タンパク質としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、トランスサイレチン、α１アンチトリプシン、α２マクログロブリン、α１－アシドグリコプロテイン、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、補体Ｃ３、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ等が挙げられる。
　また、生体体液が尿である場合、例えば早朝尿を用いることによって測定時間による誤差が是正され、検査結果の安定化、病勢との相関性の向上（即ち、偽陽性率の減少）が期待される。
　本発明のバイオマーカーとしては、生体体液中の細胞外膜小胞画分に局在するｍｔＤＮＡを使用することがより好ましい。細胞外膜小胞は、エキソソームと、エクトソームと呼ばれるマイクロベジクルとを含んでいるが、エキソソーム画分に局在するｍｔＤＮＡを本発明のバイオマーカーとして使用することがより好ましい。エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、直径５０～２００ｎｍの脂質二重膜からなる小胞であり、ｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡ、細胞質内に存在する様々なタンパク質を内包し、ドナー細胞に依存して様々な生物活性を有することが知られている。エキソソームは、後期エンドソームから発生する分泌小胞に向かって出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）し、ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｂｏｄｙ（ＭＶＢ）を形成して細胞表面まで運ばれる。そしてＭＶＢが細胞膜と膜融合することにより内容物であるエキソソームが細胞外へ放出される。ＭＶＢは通常、細胞表面に運ばれる以外にｌｙｓｏｓｏｍｅにも輸送され、ｌｙｓｏｓｏｍｅと融合してその内容物が分解される（以上について、図２を参照）。
　ｍｔＤＮＡは、このような脂質二重膜を有する細胞外膜小胞、特にエキソソーム中に存在することによって、細胞外に存在するＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）による分解から保護され、安定に存在していると考えられる。そのため、エキソソーム中に存在するｍｔＤＮＡをバイオマーカーとして利用することにより、より一層正確な自己免疫疾患の評価が可能である。また、エキソソームは、血清や尿中に多く含まれていることが知られており、血清や尿からエキソソームを単離し、その中に含まれているｍｔＤＮＡを測定することにより、低侵襲的又は非侵襲的な評価系の樹立への可能性が開かれる。
　エキソソームの分離方法は、ｍｔＤＮＡの検出用の試料として使用可能なものが得られる限り特に限定されず、従来公知の方法から適宜選択して行うことができる。エキソソームの分離は超遠心により行うことができるが、より簡便には、商業的に入手可能なキットを用いてエキソソームの分離を行うことができ、具体的にはＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ溶液、Ｅｘｏｑｕｉｃｋ－ＴＣ等（いずれもＳｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）が例示される。
　ｍｔＤＮＡの検出は、前記生体体液又はエキソソーム画分からポリヌクレオチドを調製し、これを鋳型としてプライマーにより増幅反応を行うか、または当該ポリヌクレオチドにプローブを用いてハイブリダイゼーション反応を行うことで実施される。調製されるポリヌクレオチドは、安定性や評価の正確性の観点からはＤＮＡが好ましいものとして挙げられる。生体体液又はエキソソーム画分からのポリヌクレオチドの調製は、公知の方法を適宜使用して実施することができ、例えば、フェノール抽出及びエタノール沈殿による方法、ガラスビーズを用いる方法等が挙げられる。より簡便には、市販のＤＮＡ抽出試薬又はＤＮＡ抽出キットを使用して調製することが可能である。例えば、ＤＮＡ抽出キットとして具体的にはＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ　ＳＰ　Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）が挙げられる。
　ｍｔＤＮＡにコードされる前述のタンパク質に対応するＤＮＡの検出は、従来公知の方法から適宜選択して行うことができる。検出には、通常、その発現量の測定や増幅を行うためにプローブとなるポリヌクレオチド又はプライマーとなるオリゴヌクレオチドを使用する。プライマーとしては、標的の遺伝子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズして当該遺伝子を増幅することが可能な特有の配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、プローブとしては、標的の遺伝子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする特有の配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
　これらのプライマー又はプローブは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のプログラム及びデータベースを利用して標的とする遺伝子の配列情報を取得し、これに基づいて従来公知の方法に従って設計、合成することができる。プライマーの塩基配列長としては、通常１６～３２ｂｐ、好ましくは１８～３０ｂｐ、更に好ましくは２０～２４ｂｐが挙げられる。例えば、ＣＯＸＩＩＩ遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーセットとして、具体的には後述する実施例において使用される配列番号１及び２で表わされるプライマーセットが挙げられる。また、ＮＡＤＨ遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとして、具体的には後述する実施例において使用される配列番号３及び４で表わされるプライマーが例示される。更に、シトクロムｂ遺伝子を特異的に増幅するプライマーとしては、具体的には５’－ＡＴＧＡＣＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣＡＡＡＡＴ－３’（フォワードプライマー：配列番号５）；５’－ＣＧＡＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＧＡＧ－３’（リバースプライマー：配列番号６）が例示される。
　ｍｔＤＮＡの検出は、前述のようなプライマーを用いた遺伝子の増幅反応によって得られる増幅産物、又はプローブを用いたハイブリダイゼーション反応により得られるハイブリッド産物に基づいて行うことができる。
　標的遺伝子の増幅については、従来公知の方法を採用することができ、特に限定されないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ／ＲＮＡの増幅が挙げられ、より具体的にはＲＴ－ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、競合ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ、Ｄｉｒｅｃｔ　ＰＣＲ等が例示される。また、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等のＰＣＲの変法を利用してもよい。
　増幅産物の検出は、所望のポリヌクレオチドであるか否かが判別できる方法であれば特に限定されないが、例えば、アガロースゲル泳動法により所定のサイズのポリヌクレオチドが増幅されているか否かを確認することができる。また、増幅反応の過程で増幅産物に取り込まれるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を標識化しておき、増幅産物中に取り込まれたｄＮＴＰの標識物質を測定することにより検出することができる。標識物としては、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）等の蛍光物質；ルシフェリン等の発光物質；32Ｐ、35Ｓ、121Ｉ等の放射性同位体が例示される。あるいは、Ｓｙｂｅｒ　Ｇｒｅｅｎ等を用いたインターカレーター法等により定量的に検出を行ってもよい。
　また、ｍｔＤＮＡの検出に使用されるプローブの塩基配列長としては、通常２０～２５０ｂｐ、好ましくは２０～１００ｂｐ、更に好ましくは２０～５０ｂｐが挙げられる。また、前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブは、当該ポリヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズし、検出され得るものであればよく、完全な相補的配列を有するものでなくてもよい。
　前述のプローブを用いたハイブリダイゼーション反応についても従来公知の条件に基づいて、標的のポリヌクレオチドに特異的にプローブがハイブリダイズする条件（ストリンジェントな条件）、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を適宜設定することが可能である。ストリンジェントな条件としては、例えば、温度４０℃～７０℃において、ナトリウム濃度１５０～９００ｍＭ、ｐＨ６～８により洗浄する条件が挙げられ、より具体的には５０℃、２×ＳＳＣ（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸）、０．１容量％ＳＤＳにより洗浄する条件が挙げられる。
　また、必要に応じてプローブを、フルオロセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）等の蛍光物質；ルシフェリン等の発光物質；32Ｐ、35Ｓ、121Ｉ等の放射性同位体；アルカリホスファターゼ、ホースラディシュパーオキシダーゼ等の酵素；ビオチン等の標識物質を用いて標識化しておいてもよい。ハイブリダイゼーション反応後にこれらの標的物質を各標識物質の種類に基づいて従来公知の方法に従って検出することにより、ハイブリダイゼーション産物を検出することができる。
　自己免疫疾患に罹患した動物（好ましくはヒト）では、本発明のバイオマーカーである生体体液中（又はエキソソーム中）に含まれるｍｔＤＮＡ量が正常対照群に比較して顕著に上昇している。本発明において生体体液中に含まれるｍｔＤＮＡ量が正常対照群に比較して多いとは、好ましくは被検動物の血清中のｍｔＤＮＡ量が正常対照群の１０倍以上、更に好ましくは５０倍以上、特に好ましくは１００倍以上である場合を指す。ここで、正常対照群とは、自己炎症性疾患に罹患しておらず、且つ炎症症状の認められない、健康な被検動物（好ましくはヒト）を指す。
　本発明において自己免疫疾患とは、免疫システムが機能不全を生じ、自己抗体と呼ばれる異常な抗体や自己反応性の免疫細胞が産生され、自身の特定の細胞や組織を異物と認識し、攻撃してしまうことにより発症する疾患群である。また、自己免疫疾患は、自己に対する免疫反応により、炎症や組織の損傷を招き、発熱や疼痛、臓器障害や関節破壊などを伴う全身性疾患である。自己免疫疾患として具体的には、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性筋炎／皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＣ）、全身性強皮症（ＳＳｃ）、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）などのいわゆる膠原病；ベーチェット病、クローン病、潰瘍性大腸炎、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、Ｃｒｙｏｐｙｉｎ関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ　Ｋｉｎａｓｅ関連周期熱症候群（ＭＡＰＳ：別名　高ＩｇＧ症候群）、アフタ性口内炎・咽頭炎・リンパ節炎を伴う周期熱（ＰＦＡＰＡ）、Ｂｌａｕ症候群（別名：若年性サルコイドーシス）等のいわゆる自己炎症性症候群；キャッスルマン氏病等が例示される。本発明のバイオマーカーが適用される自己免疫疾患として好ましくは膠原病及び自己炎症性症候群が挙げられ、より具体的には、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎が挙げられる。本発明のバイオマーカーが適用される自己免疫疾患としてより好ましくは、自己炎症性症候群、更に具体的にはベーチェット病が挙げられる。
　本発明の限定的な解釈を望むものではないが、図１に示されるミトコンドリアが関与する炎症カスケードに異常が生じ、これに起因して自己免疫疾患（とりわけ自己炎症性疾患）を発症すると推定される。
　即ち、細菌などの菌体成分（ＰＡＭＰｓ）や細胞傷害により放出された宿主由来成分（ＤＡＭＰｓ）が、ミトコンドリア由来活性酸素種（ｍＲＯＳ）の産生を促し、それがインフラマソームを活性化してＩＬ－１βやＩＬ－１８などの炎症性サイトカインの産生を促す。さらにｍＲＯＳによりミトコンドリアは傷害を受けその内容物を細胞質に放出する。それらがアポトーシスやネクローシス等により細胞外に出るとＤＡＭＰｓとして作用し、炎症をさらに増強する。また傷害を受けたミトコンドリアはオートファジーによって隔離・分解（ミトファジー）され、これにより炎症は抑制されている。しかし、このミトコンドリアが関与する炎症カスケードに障害を認めると、過剰な炎症が惹起されたり、炎症が収束されずに遷延化するものと考えられる（以上について図１を参照）。ミトコンドリア内には、ミトコンドリアのタンパク質等の情報をコードするｍｔＤＮＡが含まれている。従って、ミトコンドリアが傷害された場合には他の内容物と共にｍｔＤＮＡも放出される。
　このように、本発明は、炎症カスケードの異常を直接的に反映する生体体液中に放出されたｍｔＤＮＡをバイオマーカーとすることによって自己免疫疾患の評価を行うことを特徴とする。従って、本発明のバイオマーカーによれば、従来は病態を正確に反映するバイオマーカーが見出されていなかった疾患についても正確に評価することが可能である。前述の具体的な自己免疫疾患の中でも、特にベーチェット病等は、従来の評価方法で使用されている炎症マーカーでは、実際の病態とマーカーとして使用される物質の挙動が必ずしも連動していないことがあり、正確な評価が困難であった。従って、ベーチェット病は本発明のバイオマーカーが適用される対象疾患として特に好適なものとして例示される。
　また、ベーチェット病患者の中でも、活動期ブドウ膜炎の臨床症状を呈する患者において、生体体液中のｍｔＤＮＡ量が高くなる傾向があり、生体体液中のｍｔＤＮＡ量に応じて症状の程度を診断することもできる。また、ベーチェット病患者の中でも、ＴＮＦ－α抗体療法が必要な治療難渋例において、生体体液中のｍｔＤＮＡ量が高くなる傾向があり、生体体液中のｍｔＤＮＡ量に応じて、治療強度の選択や予後の推測を行うことも可能である。
診断キット
　本発明の自己免疫疾患の診断キットは、上記ｍｔＤＮＡを検出可能な試薬を含む。ｍｔＤＮＡを検出することが可能な試薬としては、ｍｔＤＮＡの検出をｍｔＤＮＡにコードされる遺伝子又は遺伝子断片に基づいて行う場合であれば、当該遺伝子又は遺伝子断片を特異的に増幅するプライマー、又は当該遺伝子又は遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするプローブが試薬として含まれる。本発明のキットに含まれる試薬として具体的には、配列番号１～６に示されるプライマーが例示される。これらのプライマー及びプローブについては、上記「バイオマーカー」に記載の通りである。
　更に、ｍｔＤＮＡを検出可能な試薬は、緩衝液、塩、安定化剤、防腐剤等を含んでいてもよく、従来公知の方法に従い、製剤化されていてもよい。また、本発明の診断キットには、前記試薬の他に、ｍｔＤＮＡの検出を実施するために必要とされ得る、標識物質、標識物質の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、溶解剤、洗浄剤、反応停止液、コントロール試料等を含んでいてもよい。
　本発明のキットにおいて、例えばｍｔＤＮＡを検出するためのプローブを不溶化担体上に固定化して用いることもできる。従って、本発明の診断キットには、不溶化担体も包含され得る。不溶化担体の素材としては、ｍｔＤＮＡの検出を妨げない限り特に限定されないが、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、ポリビニルクロライド、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、紙、シリコン、ガラス、金属、アガロース等を例示することができる。また、これらの材料を２種以上組合せて用いてもよい。不溶化担体の形状としては、例えばマイクロプレート、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等のいずれの形状であってもよい。
　例えば、前述の不溶化担体上にｍｔＤＮＡにコードされる遺伝子と特異的にハイブリダイズし得るプローブを固定化することにより、自己免疫疾患の検出に使用されるＤＮＡチップとすることもできる。プローブの不溶化担体への固定化は従来公知の方法に従って行うことができる。また、ｍｔＤＮＡに対するプローブを異なる濃度で等間隔に担体へ固定化して、ｍｔＤＮＡとハイブリダイズさせることにより半定量的にｍｔＤＮＡを検出することができる。
生体体液中のｍｔＤＮＡ量に基づく評価方法
　本発明は、前述のバイオマーカーである生体体液中のｍｔＤＮＡを利用した、下記工程を含む自己免疫疾患の罹患の有無の検出方法を提供する。
（ｉ）被検動物から体液試料を得る工程；
（ｉｉ）前記体液試料中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の結果に基づいて自己免疫疾患の罹患の有無を検出する工程。
　前記工程（ｉ）及び（ｉｉ）に記載される、被検動物からの体液試料の調製、及び体液試料中のｍｔＤＮＡの測定については、前記「バイオマーカー」欄の記載に従って実施することができる。また、前記工程（ｉｉｉ）に記載される検出工程は、被験動物について得られる工程（ｉｉ）の結果を、正常対照について得られる工程（ｉｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として行うことができる。ここで、正常対照群については、前記「バイオマーカー」欄に記載の通りである。
　また、被検動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられる。ヒトを除く哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類が挙げられる。本発明において被検動物として、好ましくは霊長類、更に好ましくはヒトである。
　更に、本発明のバイオマーカーに基づく評価は、自己免疫疾患の罹患の有無の検出以外にも、自己免疫疾患に対する易罹患性の予測方法、重症度の検出方法、予後の予測方法、治療薬のスクリーニング方法、自己免疫疾患の鑑別診断に利用することができる。
　本発明のバイオマーカーに基づいて自己免疫疾患に対する易罹患性を評価する場合（自己免疫疾患に対する易罹患性の予測方法）、前記自己免疫疾患の罹患の有無を検出する方法と同様に、被検動物の体液試料を得て、当該体液試料中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には自己免疫疾患に対して罹患しやすいという基準に基づいて易罹患性の予測が行われる。
　本発明のバイオマーカーに基づいて自己免疫疾患の重症度を評価する場合（自己免疫疾患の重症度の検出方法）、前記自己免疫疾患の罹患の有無を検出する方法と同様に、被検動物の体液試料を得て、当該体液試料中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には自己免疫疾患が重症であるという基準に基づいて重症度の検出が行われる。あるいは、当該疾患におけるバイオマーカーの標準値に対して、被検動物より検出されたバイオマーカー値が高い場合には当該疾患が重症であるという基準に基づいて重症度の検出が行われる。
　本発明のバイオマーカーに基づいて自己免疫疾患の予後を評価する場合（自己免疫疾患の予後の予測方法）、前記自己免疫疾患の罹患の有無を検出する方法と同様に、被検動物の体液試料を得て、当該体液試料中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が正常対照群に比べて多い場合には自己免疫疾患の予後が不良であるという基準に基づいて予後の予測が行われる。あるいは、当該疾患における標準値に対して、被検動物より検出されたバイオマーカー値が高い場合には当該疾患の予後が不良であるという基準に基づいて予後の評価が行われる。
　本発明のバイオマーカーに基づいて自己免疫疾患に有効な治療薬をスクリーニングする場合、被献物質を自己免疫疾患に罹患した被検動物に投与する工程、前記被検動物からの体液試料を得る工程、前記体液中のミトコンドリアＤＮＡ量を測定する工程、前記ミトコンドリアＤＮＡ量が、被験物質を投与されていない自己免疫疾患に罹患した被検動物に比べて少ない場合、当該被験物質を自己免疫疾患に有効な治療薬として選択する工程を、順次実施することによって行われる。
　本発明のバイオマーカーに基づいて自己免疫疾患における鑑別診断、即ち類似の疾患の区別を行う場合、前記自己免疫疾患の罹患の有無を検出する方法と同様に、被検動物の体液試料を得て、当該体液試料中のミトコンドリアＤＮＡを測定した結果に基づき、当該ミトコンドリアＤＮＡ量が比較対照となる疾患におけるバイオマーカーの標準値に比べて多い場合には、特定の自己免疫疾患に罹患しているという基準に基づいて類似する疾患との区別が行われる。
　いずれの方法においても、血清中のｍｔＤＮＡ量と自己免疫疾患の罹患の有無、重症度、易罹患性、予後等について予め相関図を作成しておき、被検動物における血清中のｍｔＤＮＡ量をその相関図に当てはめて評価を行ってもよい。
　これらの評価方法に基づいて疾患を個体レベルで評価することができ、個々の病態に応じて治療法を最適化することができる。
自己免疫疾患の予防又は治療剤
　本発明は、ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制する物質を有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤を提供する。
　ここで、ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制するとは、例えば、ｍｔＤＮＡがエキソソームに取り込まれることを抑制すること、エキソソームがドナー細胞から放出されることを抑制すること、エキソソームがアクセプター細胞に細胞膜融合又はエンドサイトーシスにより取り込まれることを抑制すること等を指す。また、ミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制するとは、直接的又は間接的にｍｔＤＮＡによる炎症反応の誘導を阻害することを指し、例えば、加水分解等によりｍｔＤＮＡが切断されること、ｍｔＤＮＡを含むエキソソームを破壊すること、ｍｔＤＮＡにより活性化されるシグナル経路（例えば、Ｇ蛋白質共役型受容体あるいはＩＬ－１受容体、Ｔｏｌｌ様受容体又はインフラマソームを介するシグナル経路を阻害すること）等を指す。
　本発明の自己免疫疾患の予防又は治療剤の有効成分としては、例えばＤＮＡ分解酵素、活性酸素キレート剤、抗酸化剤、Ｇ蛋白質共役型受容体阻害剤、抗ＩＬ－１β抗体、抗ＩＬ－１受容体抗体、Ｔｏｌｌ様受容体アンタゴニスト等が例示される。更に、ｍｔＤＮＡに選択的にハイブリダイズしてｍｔＤＮＡによる炎症反応の誘導を抑制するアンチセンスＤＮＡ、核酸アプタマー、ｍＲＯＳのキレート剤、エキソソーム膜の合成阻害剤等も有用な物質として例示される。
　本発明の予防又は治療剤の投与量としては、自己免疫疾患の治療有効量であれば特に限定されず、患者の年齢、体重、症状等に基づいて適宜設定される。
　また、本発明の予防又は治療剤には、前記有効成分の効果を損なわない限り、従来公知の担体、賦形剤、懸濁剤、分散剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、防腐剤等が含まれてもよい。また、細胞選択的にカプセルが開くように設計されたｎａｎｏ－ｒｏｂｏｔ、選択的にｍｔＤＮＡ又はエキソソームに結合するｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅ等のキャリアに本発明の予防又は治療剤を担持させて標的細胞に輸送してもよい。
　本発明の予防又は治療剤の投与形態は、患者の年齢、症状、疾患の種類に応じ、従来公知のものから適宜選択することができるが、例えば静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与、経気道投与等が挙げられる。また、本発明の予防又は治療剤の製剤形態についても限定されず、採用される投与形態によって適宜選択され得るが、例えば注射剤、点滴剤、経口剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等が挙げられる。
　本発明の予防又は治療剤が適用される疾患は、自己免疫疾患であり、その具体例については、前述の通りである。本発明の予防又は治療剤の適用対象となる自己免疫疾患として、好ましくは膠原病及び自己炎症性症候群が挙げられ、より具体的には、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎が挙げられ、より好ましくは自己炎症性症候群が挙げられ、更に具体的にはベーチェット病が挙げられる。
　以下、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
１．サンプル調製
　全ての試験は、大阪大学大学院医学研究科治験審査委員会の承認を得て行われた。試料として、日本厚生労働省ベーチェット病研究班による診断基準、アメリカリウマチ学会による全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）診断基準、アメリカリウマチ学会による改訂慢性関節リウマチ（ＲＡ）診断基準、日本厚生労働省研究班による全身性強皮症（ＳＳｃ）診断基準、ならびに厚生省特定疾患調査研究班による多発性筋炎／皮膚筋炎（Ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ／Ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ：ＰＭ／ＤＭ）診断基準に基づいて診断された患者から採取された血清を用いた。下記試験例及び比較試験例において使用されたミトコンドリアＤＮＡは、３６名のベーチェット病患者、２２名のＳＬＥ患者、２８名のＲＡ患者、１４名のＳＳｃ患者、８名のＰＭ／ＤＭ患者から採取されたものを使用した。コントロールとして、１０名の健康なボランティア（健常者又はコントロールと表記することがある）から採取されたものを使用した。但し、参考試験例１に関しては、ベーチェット病患者７５名、健康なボランティア９名より採取されたエキソソームを用いて評価を行った。また、下記試験例おいて使用した血球画分は、ベーチェット病患者６名、健常ボランティア６名より採取されたものを用いて評価を行った。
２．血清ＤＮＡの分離
　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ　ＳＰ　Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）を用いて、添付のプロトコルに従って血清（１００μｌ）から血清ＤＮＡを調製した。具体的には、１００μｌの血清試料を５μｌのタンパク質分解酵素で消化（５６℃、１０分間）し、３００μｌのヨウ化ナトリウム溶液で処理して血清中からタンパク質を除去した。ＤＮＡを１００容量％エタノールを用いて沈殿させ、上清を除去して得られたＤＮＡペレットに７０容量％エタノールを添加して精製した。得られた血清ＤＮＡを、ＤＮａｓｅを含まない水（２０μｌ）に再度懸濁した。
３．リアルタイムＰＣＲ
　ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ（株）製）を使用し、添付のプロトコルに従ってＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｊａｐａｎ）により、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉを用いたインターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
Ｓｔａｇｅ　１（１サイクル）：９５℃　３０秒；
Ｓｔａｇｅ　２（４０サイクル）：９５℃　５秒、６０℃　３０秒；
Ｓｔａｇｅ　３（１サイクル）：９５℃　１５秒、６０℃　１分、９５℃　１５秒
　ｍｔＤＮＡ濃度を定量するため、健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）全細胞溶解液に由来する精製ＤＮＡを用いて、リアルタイム標準曲線を作成した。また、上記ＰＣＲ反応を４０サイクル終了後でもＰＣＲ産物が産生されなかった試料（即ち、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎによる蛍光発光が認められなかった試料）については、「検出不可」と判断した。
　ミトコンドリアＤＮＡの検出のため使用したプライマーを以下に示す。
（ヒトチトクロームＣオキシダーゼサブユニットＩＩＩ：ＣＯＸＩＩＩ）
フォワードプライマー（配列番号１）：
５’－ＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＣ－３’
リバースプライマー（配列番号２）：
５’－ＡＴＣＡＣＡＴＧＧＣＴＡＧＧＣＣＧＧＡＧ－３’
（ヒトＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ：ＮＡＤＨ）
フォワードプライマー（配列番号３）：
５’－ＡＴＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴ－３’
リバースプライマー（配列番号４）：
５’－ＧＧＧＣＣＴＴＴＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＡＴ－３’
４．エキソソーム分離
（市販キットを用いた分離）
　ＥｘｏＱｕｉｃｋＴＭ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ溶液（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、添付のプロトコルに従って、血漿（１００μｌ）からエキソソームを分離した。具体的には、血清（１００μｌ）及びＥｘｏＱｕｉｃｋ溶液（２５μｌ）を穏やかに混合し、３０分間冷却した後、１５００×ｇで３０分間遠心分離に供した。その後、完全に上清を除去し、ペレット（エキソソーム画分を含んだ細胞外膜小胞）を得た。また、上清は下記試験例３において非エキソソーム画分として使用した。下記試験例に使用するため、このペレットを１００μｌのＰＢＳ溶液に再懸濁してエキソソーム懸濁液を得た。得られたエキソソーム懸濁液より、上記２．に記載の方法に準じてｍｔＤＮＡを分離した。
（超遠心を用いた分離）
　エキソソームは超遠心法により単離した。具体的には、１．５ｍｌの血清を２０００×ｇで１０分間遠心し細胞断片を除去した後、上清を４℃のもと１００００×ｇにて３０分間の遠心により細胞破砕断片を除去した。その後上清を０．２２μmのフィルターにて濾過し、その濾過液を４℃のもと１１００００×ｇにて更に２．５時間遠心した。得られたペレットを９ｍｌのＰＢＳに溶解し、３０％スクロース溶液の上にレイヤーし、4℃のもと１０００００×ｇにて更に２．５時間遠心に供した。エキソソームを含んだスクロース溶液を回収し、４℃のもと１０００００×ｇにて更に２．５時間遠心に供し、エキソソームからなるペレットを得た。下記試験例に使用するため、このペレットをＰＢＳ溶液に懸濁して高純度のエキソソーム懸濁液を得た。
５．ＥＬＩＳＡ
　前記４．において調製されたエキソソーム懸濁液をＳｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＥｘｏＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔのエキソソーム結合緩衝溶液（ｅｘｏｓｏｍｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）に５０００倍希釈になるように懸濁した。この懸濁液（１００μｌ）を用いて３７℃の条件下で１６時間に亘って９６ウェルプラスチックプレートにコーティングした（固相化）。５容量％ＢＳＡ（溶媒：ＰＢＳ）によるブロッキングの後、０．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ９モノクローナル抗体を用いて３７℃で２時間インキュベートし、その後ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）で標識された抗ウサギＩｇＧ（１万倍希釈で１００μｌ）を添加して室温で３０分間インキュベートした。ヒトＣＤ９はエキソソームに存在するマーカータンパク質として知られている。基質としてＲ＆Ｄ社のｓｕｂｓｒａｔｅ　ｒｅｇｅｎｔ　ｋｉｔを１００μｌ添加し、酵素反応による発光を、ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社製ＡＲＶＯを用いて４２５ｎｍで検出した。
６．血球分画の単離
　末梢血液画分に関しては、被験者より３０ｍｌの血液を採取し、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｅｉｌｄ）を用いて添付の推奨プロトコールに従って単核球及び多核球に分離し、多核球分画は好中球として評価した。単核球分画は更に磁気ビーズ付き抗ＣＤ１４抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１４陽性単球を単離した。残りの単球分画をリンパ球分画として評価した。
７．統計
　ｍｔＤＮＡに関しては、検量線に基づいて得られた相対値を対数処理した後、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにより統計学的検討を行った。エキソソームに関しては、検量線に基づいて得られた相対値に対しｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにより統計学的検討を行った。その以外のｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける炎症反応に関する検討は、Ｍａｎｎ―Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ－ｔｅｓｔにより統計学的検討を行った。
［試験例１：血清ミトコンドリアＤＮＡ値と自己免疫疾患の関係］
　ベーチェット病患者、ＳＬＥ患者、ＳＳｃ患者及びＰＭ／ＤＭ患者の自己免疫疾患の患者における血清ＤＮＡ濃度については上記「２．血清ＤＮＡの分離」に記載の方法で得られた懸濁液を、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ：Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用い測定し、血清ｍｔＤＮＡ値を上記「３．リアルタイムＰＣＲ」に記載の方法に従って測定した。結果を図３及び４に示す。
　図３及び４に示されるように、自己免疫疾患の患者とコントロール群間において血清ＤＮＡ濃度の中央値は同程度であるのに対し、血清ｍｔＤＮＡ値については、ＣＯＸＩＩＩ及びＮＡＤＨのいずれをみても自己免疫疾患の患者で明らかに高い値を示した。図３右欄に示されるように、自己免疫疾患患者の血清中には健康な人の約５０倍から５００倍ものｍｔＤＮＡが含まれていた。
［試験例２：ベーチェット病患者における血清中のミトコンドリアＤＮＡの上昇］
　ベーチェット病患者又は健康なボランティア（コントロール群）から採取された血清ＤＮＡ濃度と血清中のｍｔＤＮＡ量を測定した。血清ＤＮＡ濃度及び血清ｍｔＤＮＡ値の測定については、前記試験例１と同様に行った。結果を図５に示す。
　図５に示されるように、ベーチェット病患者とコントロール群間において血清ＤＮＡ値の中央値（ｍｅｄｉａｎ）は同程度であるのに対し、血清ｍｔＤＮＡ値については、ＣＯＸＩＩＩ及びＮＡＤＨのいずれをみてもベーチェット病患者の方が明らかに高い値を示した。即ち、自己免疫疾患の中でも、自己炎症性疾患の１つであるベーチェット病患者においてより顕著に血清中のｍｔＤＮＡ値が上昇していることが示された。
[試験例３：ベーチェット病患者における、血清ｍｔＤＮＡ値と臨床的特徴］
　医療記録によりベーチェット病患者の臨床症状を調査し、血清ｍｔＤＮＡ値と臨床的特徴について後ろ向き検討により検討した。図６のａ）に示されるように、ベーチェット病患者の中でも、検査時に活動期ブドウ膜炎の臨床症状を呈する症例（Ｕｖｅｉｔｉｓ）でｍｔＤＮＡ値が高いことが示された。また、患者を無治療ないしコルヒチンのみによる治療群（Ｎｏｎ）、ステロイド等の標準的な免疫抑制剤による治療群（Ｃｏｎｖ）、及び抗ＴＮＦ－α抗体による治療群（Ｍａｂ）に分類し、血清ｍｔＤＮＡ値を比較すると、図６のｂ）に示すように、抗ＴＮＦ－α抗体投与群で血清ｍｔＤＮＡ値の上昇が認められた。このことから、急性活動期及び治療難渋例において血清ｍｔＤＮＡが高い可能性が示唆され、ベーチェット病の疾患活動性のモニタリングや予後予測に有効である可能性が示された。
［試験例４：ベーチェット病患者血清におけるミトコンドリアＤＮＡの局在］
　ベーチェット病患者におけるｍｔＤＮＡが血清中のどの画分に局在するかを評価するため、ベーチェット病患者又はコントロール群から採取された血清を用い、「上記４．エキソソーム分離（市販キットを用いた分離）」に記載の方法に従って、エキソソーム画分と非エキソソーム画分をそれぞれ得た。各画分について、「上記３．リアルタイムＰＣＲ」に記載の方法に従って、ＣＯＸＩＩＩ及びＮＡＤＨを検出した。結果を図７（ａ）及び（ｂ）に示す。図７（ａ）の縦軸の単位は％であり、（各分画に含まれるｍｔＤＮＡ量）／（血清中（両分画の和）に含まれるｍｔＤＮＡ量）×１００より与えられる。また、図７（ｂ）の縦軸に記載される相対的発現量は、健常者のＰＢＭＣ（末梢血単核球）から得られたＤＮＡ抽出液を５倍ずつ６段階希釈したＤＮＡ溶液をテンプレートとしてＰＣＲを行って検量線を作成し、それに対する相対値により示される。また、ベーチェット病患者末梢血由来単球のＭＶＢ内におけるＤＮＡ断片の局在を、抗ＤＮＡ抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析により検討した。図７（ｃ）に示される環状構造がＭＶＢを、その中の小胞がエキソソームを示す。また、矢印の先の黒点が抗ＤＮＡ抗体により染色されるＤＮＡ断片を示し、白バーは５００ｎｍである。
　図７（ａ）より、血清中におけるｍｔＤＮＡがエキソソームに代表される細胞外膜小胞に局在していることが示された。また、図７（ｂ）より、血液中にフリーで存在しているｍｔＤＮＡではなく、エキソソームに代表される細胞外膜小胞中に存在しているｍｔＤＮＡがベーチェット病患者で高いことが示された。また、図７（ｃ）により、末梢血由来単球のＭＶＢ内の小胞中にＤＮＡ断片が含まれていることが示され、ｍｔＤＮＡと思われるＤＮＡ断片がエキソソーム中に存在していることが電子顕微鏡レベルでも確認された。これまでの知見では、フリーのｍｔＤＮＡはそれだけでＤＡＭＰｓとして作用すると考えられていた（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、上記結果より、細胞傷害に伴い放出されたフリーのｍｔＤＮＡではなく、エキソソーム中に局在するｍｔＤＮＡの値が高いことがこれらの疾患と関連していることが示された。
［参考試験例１］
　ベーチェット病患者の血清中のエキソソーム画分の量が、コントロール群（健康なボランティア）に比べて上昇しているかどうかを確認した。ベーチェット病患者又はコントロール群から採取された血清を用い、「上記５．ＥＬＩＳＡ」に記載される方法に従ってＣＤ９タンパク質を検出した。結果を表１に示す。相対的発現量については、健常者の血清から得られたエキソソーム懸濁液を３倍ずつ１０段階希釈した溶液を用いて検量線を作成し、これに基づく相対値として表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より、エキソソームレベルは、健常者とベーチェット病患者で差がないことが示された。
［試験例５：エキソソームによるｍｔＤＮＡ取り込み］
　上記試験例１～４より、ベーチェット病患者では血清中（より具体的にはエキソソーム中）のｍｔＤＮＡが異常高値を示すことが明らかとなった。そこで、本発明者らは、ミトコンドリアストレスにより細胞質中に放出されたｍｔＤＮＡは、エキソソームに取り込まれることにより細胞外に放出されているのではないかとの仮説（例えば図８を参照）を立て、以下について検討した。
（５－１）ＰＡＭＰｓやＤＡＭＰｓ刺激によるミトコンドリアとエキソソームの細胞内における局在の変化
　ヒトの単球系細胞株であるＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ　Ｃａｔ.  Ｎｏ．ＴＩＢ－２０２）にミトコンドリア特異的にＧＦＰを発現するｍｉｔｏ－ＧＦＰ　ｖｅｃｔｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）をトランスフェクションした翌日、ガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ製）に２×１０4個の細胞を播種し、マクロファージ様細胞に分化させるために、１０％ＦＣＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地に１００ｎＭのＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）を加えて３日間培養した。その後、５ｍＭのＡＴＰ及び１５μＭのナイジェリシン（Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ）を添加して、３０分間刺激した。ここで、ＡＴＰはＤＡＭＰｓとして作用し、ナイジェリシンはＰＡＭＰｓとして作用する。その後、細胞を４容量％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。そして、３０容量％ＮＧＳ（Ｎｏｒｍａｌ　Ｇｏａｔ　Ｓｅｒｕｍ）でブロッキングを行い、１００倍希釈したエキソソームのマーカーである抗ＣＤ６３抗体（ａｂｃａｍ製）と、蛍光標識した抗ラビットＩｇＧ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）の１０００倍希釈液を用いて染色し、共焦点レーザ顕微鏡で観察した。また、細胞内局在の変化がミトコンドリア由来活性酸素種（ｍＲＯＳ）によるかを検討する目的で、あらかじめｍＲＯＳのキレート剤であるｍｉｔｏ－ＴＥＭＰＯ（Ａｌｅｘｉｓ製）５００μＭで１時間前処理したＴＨＰ－１細胞でも同様の実験を行った。結果を図９に示す。
　図９に示されるように、ＡＴＰ及びナイジェリシンによるミトコンドリアストレスにより、ミトコンドリアとエキソソームが共局在することが示された。また、ｍＲＯＳのキレート剤であるｍｉｔｏ－ＴＥＭＰＯ処理により、共局在は認められなくなったことから、ストレス負荷のかかったミトコンドリアから放出されたｍＲＯＳによりミトコンドリアとエキソソームの共局在が生じていることが示された。
（５－２）ＰＡＭＰｓやＤＡＭＰｓ刺激によるエキソソーム中のｍｔＤＮＡ量の変化
　２×１０6個のヒトの単球系細胞株であるＴＨＰ－１を６ウェルディッシュに播種し、１００ｎＭのＰＭＡ存在下で３日間培養した後、５ｍＭのＡＴＰ及び１５μＭのナイジェリシンを培地に添加して６０分間刺激した。細胞上清中に放出されたエキソソームをＥｘｏｑｕｉｃｋ－ＴＣ（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を用いて回収し、エキソソーム画分よりＤＮＡを抽出して、リアルタイムＰＣＲ法によりｍｔＤＮＡの量を検討した。エキソソーム画分からのＤＮＡの抽出は、「４．エキソソーム分離（キットを用いた分離）」で調製されたエキソソーム画分より、「２．血清ＤＮＡの分離」の方法に準じてＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ　ＳＰ　Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）を用いて行った。また、リアルタイムＰＣＲ法は、「３．リアルタイムＰＣＲ」に記載の方法に従って行った。また、前記（５－１）と同様に、これらの変化がｍＲＯＳによるかを検討する目的で、５００μＭのｍｉｔｏ－ＴＥＭＰＯを培地に添加して１時間前処理した細胞でも同様の実験を行った。結果を図１０に示す。また、図１０の縦軸は、試験例１．と同様、健常者由来の末梢血単核球由来のＤＮＡを段階希釈した溶液をテンプレートとしてＰＣＲを行い、その値に対する相対的発現量である。
　図１０に示されるように、ミトコンドリアストレスにより、エキソソーム内のｍｔＤＮＡの増加が認められた。また、ｍＲＯＳのキレート剤であるｍｉｔｏ－ＴＥＭＰＯ処理を行った細胞ではｍｔＤＮＡの増加が認められなかったことから、ミトコンドリアストレスによりエキソソーム中のｍｔＤＮＡが増加し、それらはｍＲＯＳにより担われていることが示された。
　上記（５－１）及び（５－２）の結果から、ミトコンドリアにストレスが生じると、ダメージを受けたミトコンドリアの近傍にエキソソームが局在し、細胞内に放出されたｍｔＤＮＡはエキソソームに取り込まれることが示唆された。また、これらはＭＶＢにより細胞表面まで運ばれ、ｍｔＤＮＡを含むエキソソームとして細胞外に放出されているものと推測された。そこで、本発明者らは、ベーチェット病患者より得た末梢血液を用いて、もっとも多くｍｔＤＮＡを放出する細胞について検討した。「上記．サンプル調整：血球分画」に示した方法により、末梢血液よりＣＤ１４陽性単球分画、リンパ球分画、好中球分画を単離し、１０００００個の細胞を１％タイプＩコラーゲン溶液に懸濁して３７℃で３０分間の培養によりコラーゲンの縮合反応を誘導した後、ＰＡＭＰｓ/ＤＡＭＰｓの代表として５ｍＭのＡＴＰ、５００ｎｇ/ｍｌのＰａｍ３ＣＳＫ４、５０ｎＭのＰＭＡ及び２５０ｎｇ/ｍｌイオノマイシン、又は１ｎＭのｆＭＬＰにて３０分間刺激した。その後、培養上清中のエキソソームをＥｘｏｑｕｉｃｋにて単離した後、エキソソーム中のＤＮＡを抽出してｍｔＤＮＡの値をｑＰＣＲにて求めた。
　得られた結果を図１１に示す。図１１ａに示すようにベーチェット病患者由来のリンパ球や好中球では、いずれの刺激においてもｍｔＤＮＡの放出亢進は認められなかったが、ＣＤ１４陽性単球では、ＡＴＰ及びＰａｍ３ＣＳＫ４の刺激によりｍｔＤＮＡの著しい放出の亢進が認められた。また、図１１ｂに示すように、ベーチェット病患者由来のＣＤ１４陽性細胞では健常者由来のＣＤ１４陽性細胞に比し、ＡＴＰ、Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ及びＰａｍ３ＣＳＫ４によるｍｔＤＮＡの放出が著しく亢進していることが示された。これらのことから、ベーチェット病患者において、末梢血ＣＤ１４陽性単球に代表されるｍｙｅｌｏｉｄ系の細胞で多くのｍｔＤＮＡが放出されていることが示唆された。
［試験例６：ベーチェット病患者における血清ｍｔＤＮＡ量増加の要因の検討］
　以上の試験例及び参考試験例の結果を総合すると、ベーチェット病患者において血清ｍｔＤＮＡ値が高いのはエキソソームの量そのものが多いのではなく、エキソソーム中に取り込まれているｍｔＤＮＡ量がコントロールに比べて多いことが示された。そこで本発明者らは、ベーチェット病患者においてエキソソーム中のｍｔＤＮＡ量が多い理由に関して、ベーチェット病由来単球では、ＰＡＭＰｓ/ＤＡＭＰｓ刺激によりダメージを受けたミトコンドリアの分解処理過程に障害を認めるのではないか、との仮説を立て、ベーチェット病患者及び健常者から末梢血単球を得て比較検討によりその検証を行った。
　上記「６．血球分画の単離」に示した方法により、末梢血液よりＣＤ１４陽性単球分画を単離し、３５ｍｍディッシュに１×１０5個の細胞を播種した後１００ｎＭのＰＭＡ刺激下に１６時間培養した。その後、ＰＡＭＰｓ／ＤＡＭＰｓの代表として５ｍＭのＡＴＰ、１５μＭのＮｉｇｅｒｉｃｉｎで６０分間刺激した。また、ポジティヴコントロールとして飢餓により誘導されるオートファジーと同等の効果を誘導するＲａｐａｍｙｃｉｎ（１０ｎＭ）にて６０分間刺激した。その後、ｃｏｍｐｌｅｔｅのＲＰＭＩ１６４０メディウムに置換して３７℃にて６０分間培養した。それらの試料を用いて、ウエスタンブロッティング法によりオートファジーの誘導について検討した。即ち、１％ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０）含有ＴＮＥバッファーにて細胞を懸濁し、９６℃、５分間熱処理した後、電気泳動を行った。ニトロセルロース膜にトランスファーした後１％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋでブロッキングした。抗ＬＣ-３抗体（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）、抗ＡＴＧ１２抗体（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）、及び抗β－ａｃｔｉｎ抗体（ＭＢＬ製）と一晩反応させた後、ＨＲＰが結合した２次抗体と反応させた。
　また、共焦点顕微鏡を用いて、ｍＲＯＳを産生するダメージを受けたミトコンドリアとオートファゴソームとの共局在について検討した。即ち、２ｍＭのＭｉｔｏＳＯＸ存在下で前記と同様にＡＴＰ、Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ及びＲａｐａｍｙｃｉｎで刺激した後、ｃｏｍｐｌｅｔｅのＲＰＭＩメディウムに置換した。その後、４％ＰＦＡにて１時間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ含有ＰＢＳにて数回洗浄した後、抗ＬＣ３抗体（ＭＢＬ製）と一晩反応させた。洗浄後Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７が結合した２次抗体と反応させ、共焦点顕微鏡にて観察した。
　更に電子顕微鏡を用いて、ミトコンドリアストレス下におけるミトコンドリアをはじめとする細胞内小器官の構造について検討した。すなわち、ＣＤ１４陽性単球を、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉの阻害剤であるＲｏｔｅｎｏｎｅ（１０μＭ）にて６時間刺激した。４％ＰＦＡにて１時間固定後、１％グルタールアルデヒドにて１０分間前固定し、さらに１％四酸化オスミウム及び１．５％フェロシアン化カリウムにて１時間後固定した。サンプルを樹脂包埋した後８０ｎｍ厚の薄膜を作成し、透過型電子顕微鏡にて観察した。
　得られた結果を図１２に示す。図１２ａに示すように、健常者由来ＣＤ１４陽性単球細胞では、ＡＴＰ、Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ及びＲａｐａｍｙｃｉｎ刺激により、脂質結合型ＬＣ３（ＬＣ３ ＩＩ）の発現誘導がウエスタンブロット法にて認められたのに対し、ベーチェット病患者由来単球細胞では、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ刺激によるＬＣ３ ＩＩの発現誘導は認められたが、ＡＴＰ及びＮｉｇｅｒｉｃｉｎ刺激によるＬＣ３ ＩＩの発現誘導は認められなかった。一方、脂質結合型ＬＣ３の誘導に関与するＡｔｇ５／Ａｔｇ１２複合体の発現誘導については、健常者及びベーチェット病由来単球細胞とで違いは認められなかった。
　また図１２ｂに示すように、健常者由来単球細胞ではｍＲＯＳを産生するミトコンドリアの周囲にＬＣ３抗体によって染色されるオートファゴソームの形成が認められたのに対し、ベーチェット病由来単球細胞では、オートファゴソームの形成が障害されていた。また興味深いことに、ベーチェット病由来単球細胞においてもＲａｐａｍｙｃｉｎにより誘導されるオートファゴソームの形成は健常者由来検体と同様に認められた。
　更に、図１２ｃに示す電子顕微鏡写真から明らかなように、健常者由来単球細胞と異なり、ベーチェット病由来単球細胞では、ミトコンドリアストレスの誘導により、変形したクリスタ構造を呈するミトコンドリア断片と思われる小構造物が細胞質内に多数認められた。
　以上の結果から、ベーチェット病では、飢餓等により誘導される通常のオートファジーに障害は認められないが、ミトコンドリア特異的なオートファジー（ミトファジー）の誘導に異常を認める可能性が示唆された。通常、ミトコンドリアストレスによりミトコンドリアがダメージを受けると、ミトコンドリア特異的オートファジーが誘導されて、傷害されたミトコンドリアが分解・処理さることが知られている。しかしベーチェット病では、感染や細胞傷害などを契機にＰＡＭＰｓやＤＡＭＰｓに暴露されると、ミトファジーが障害されていることにより、ダメージを受けたミトコンドリアの分解処理が停滞し、ミトコンドリアからのＲＯＳの産生亢進、ｍｔＤＮＡの細胞質への放出、更にＲＯＳを介したｍｔＤＮＡのＭＶＢへの取込が増加し、それらがエキソソームとして細胞外に放出されているものと推測された。それゆえ、ベーチェット病では血清ｍｔＤＮＡ値が高値になるものと思われる。
［試験例７：ベーチェット病患者由来のエキソソームによる炎症反応の誘導］
　ドナー細胞から放出されたエキソソームは、細胞膜融合やエンドサイトーシスによりアクセプター細胞に取り込まれ、ドナー細胞の様々な生物学的活性がアクセプター細胞に伝えられる。免疫系においてもこれまでに、ペプチド／ＭＨＣ複合体がエキソソームにより運ばれ抗原の伝播に寄与していることや、エキソソーム中のｍＲＮＡやｍｉｃｒｏＲＮＡにより、アクセプター細胞がジェネティック、エピジェネティックな制御を受けていることが報告されている（例えば、Ｃｌｏｔｉｌｄｅ　Ｔｈeｒｙ，　Ｍａｔｉａｓ　Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ　ａｎｄ　Ｅｌｏｄｉｅ　Ｓｅｇｕｒａ．　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　ａｓ　ｃｏｎｖｅｙｏｒｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ：９，５８１－９３，２００９を参照）。また、上記試験例５の結果より、ミトコンドリアにストレス負荷がかかると、エキソソーム中へｍｔＤＮＡが取り込まれることが示唆された。自己免疫疾患患者においては、ｍｔＤＮＡがエキソソーム内に存在するため、細胞外に放出されてもＤＮａｓｅ等の影響を受けず、血清等で比較的安定に存在することができると予測される。そこで、「ｍｔＤＮＡ及びｍｔＤＮＡを含むエキソソームは免疫反応を亢進させるのではないか」との仮説を立て、以下について検討した。
（７－１）好中球遊走活性における患者由来エキソソームの効果の検討
　健常者からｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＡＫＩＳ製）を用いて濃度勾配を利用して調製した２×１０4個のヒト好中球を、０．１％ＢＳＡ入りＲＰＭＩ１６４０メディウムに懸濁してガラスボトムディッシュ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ製）に播種し、ベーチェット病（ＢＤ）患者及び健常者由来の血清７０μｌ相当量のエキソソーム又はｍｔＤＮＡを加え、好中球の運動能についてＮＩＫＯＮ蛍光顕微鏡Ｂｉｏｓｔａｔｉｏｎを用いて１時間にわたり経時的観察行った。ｍｔＤＮＡ及びエキソソームの調製はそれぞれ、上記「２．血清ＤＮＡの分離」及び「４．エキソソーム分離」に従って行った。好中球の移動速度、移動距離についてソフトウェアＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｉｖｉｃｅｓ製）を用いて評価した。結果を図１３に示す。また、好中球の経時的運動変化をトラッキングした結果について、図１４に健常者とベーチェット病患者由来のエキソソーム又はｍｔＤＮＡを添加した場合の代表例を示す。
　図１３に示されるように、健常者由来エキソソームに比べ、ベーチェット病患者由来のｍｔＤＮＡを含むエキソソームにより好中球の移動速度、移動距離が著しく亢進した。また、ベーチェット病患者由来エキソソームから調製したｍｔＤＮＡそのものでも、好中球の遊走活性の亢進が認められた。また、図１５に示すように、患者由来エキソソームによる好中球遊走活性はＧ蛋白質共役型受容体阻害剤である百日咳菌毒素ＰＴｘ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）処理により阻害され（０．１％ＢＳＡ入りＲＰＭＩ培地において５０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＴｘ処理を行った）、また、Ｇ蛋白質共役型受容体であるｆｏｒｍｙｌペプチド受容体１（ＦＰＲ１）に対する抗体（抗ＦＰＲ１抗体：Ｒ＆Ｄ製）処理によっても阻害された（０．１％ＢＳＡ入りＲＰＭＩ培地で１００μｇ／ｍｌの濃度で抗ＦＰＲ１抗体処理を行った）。
（７－２）炎症性サイトカイン産生におけるベーチェット病患者由来エキソソームの効果の検討
　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー製）の骨髄を５０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ製）入りコンプリートＲＰＭＩ１６４０メディウムで５日間培養して得られた骨髄由来マクロファージ（１×１０6個）、Ｌ９２９細胞の培養上清を２０％含有したＤＭＥＭ培地で７日間培養して得られた骨髄由来マクロファージ、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ製）入りコンプリートＲＰＭＩ１６４０培地で６日間培養して得られた骨髄由来樹状細胞（１×１０6個）、又はｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｅｉｌｄ製）を用いて添付された使用方法に基づいて単離したヒト末梢血由来ＰＢＭＣ（１×１０6個）に、上記「４．エキソソーム分離」に記載の方法に従って、ベーチェット病（ＢＤ）患者又は健常者から採取した１００μｌ相当の血清から超遠心法によって調整されたエキソソーム、又は７０μｌ相当の血清からＥｘｏｑｕｉｃｋを用いて調製されたエキソソームをふりかけ、２４時間培養後、培養上清中のＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１２ｐ４０／ＩＬ－２３ｐ３５、及びＩＬ－２３ｐ１９の炎症性サイトカインの産生をＥＬＩＳＡ法により検討した。
　ＥＬＩＳＡについては、市販のｍｏｕｓｅ　ＩＬ－１β－Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ、ｍｏｕｓｅ　ＴＮＦα－Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ、ｍｏｕｓｅ　ＩＬ－１２ｐ４０／ＩＬ－２３ｐ３５－Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ、ｍｏｕｓｅ　ＩＬ－２３ｐ１９－Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ　ＴＮＦα－Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１２ｐ４０／ＩＬ－２３ｐ３５－Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ、ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１β－Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（いずれもＲ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、付属マニュアルに従って実施した。即ち、上記サイトカインに対する抗体が固相化されたキット付属のプレートを５容量％ＢＳＡ（溶媒：ＰＢＳ）でブロッキングした後、上記培養上清の２倍～５倍希釈液を添加して室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄後、付属の前記炎症性サイトカインに対するビオチン化抗体を加えて室温で２時間インキュベートして洗浄した後、ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）で標識されたストレプトアビジン（１万倍希釈で５０μｌ）を添加して室温で３０分間インキュベートした。基質としてＲ＆Ｄ社のｓｕｂｓｒａｔｅ　ｒｅｇｅｎｔ　ｋｉｔを５０μｌ添加し、酵素反応による発光を、ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社製ＡＲＶＯを用いて４２５ｎｍで検出した。結果を図１６に示す。
　また、ＤＮＡを認識するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）であるＴＬＲ９の上記反応における関与を明らかにする目的にＴＬＲ９欠損マウスおよびその下流のアダプター分子であるＭｙＤ８８欠損マウス（大阪大学ｉＦＲｅＣ　自然免疫学研究室作成、オリエンタルバイオサービス受託販売）を用いて同様の実験を行った。また、ヒトＴＬＲ９の上記反応における関与を明らかにする目的に、ＴＬＲ９のアンタゴニストであるＣｐＧオリゴＤＮＡのＯＤＮ２０８８およびＯＤＮ２０８８　ｃｏｎｔｒｏｌ（Ａｄｄｇｅｎｅ製）を用いて同様の実験を行った。結果を図１７に示す。
　更に、ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅの構成分子でｍｔＤＮＡを認識することが知られているＮＬＲＰ３およびｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅの上記反応における関与を明らかにする目的に、ＮＬＲＰ３欠損マウス、ＡＳＣ欠損マウスおよびＣａｓｐａｓｅ－１欠損マウスを用いて同様の実験を行った。結果を図１８に示す。
　図１６に示すようにベーチェット病患者由来エキソソーム（即ち、ｍｔＤＮＡを含むエキソソーム）は、超遠心法およびＥｘｏｑｕｉｃｋにより単離したエキソソームともに、マウスおよびヒト由来細胞において炎症性サイトカインであるＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１２ｐ４０／ＩＬ－２３ｐ３５、ＩＬ－２３ｐ１９等の産生亢進作用を有することが示された。
　また図１７に示すように、ＴＬＲ９欠損マウス由来骨髄由来マクロファージや骨髄由来樹状細胞では、患者由来エキソソームによるサイトカイン産生が部分的に減少し、ＭｙＤ８８欠損マウス由来細胞でほぼ完全に減少した。また、ヒト末梢血由来ＰＢＭＣにおいても、ＴＬＲ９阻害剤によりＢＤ患者由来エキソソームによる炎症性サイトカイン産生が減少した。このことから、マウスのみならずヒトにおいても、ＢＤ由来エキソソームはＴＬＲを介してサイトカイン産生を促していることが示唆された。
　また、図１８に示すように、ＮＬＲＰ３欠損マウス、ＡＳＣ欠損マウスおよびＣａｓｐａｓｅ－１欠損マウスより調整した骨髄由来マクロファージにおいて、ＢＤ患者由来エキソソームによるＩＬ－１βの産生亢進作用は消失した。このことから、ＢＤ患者由来エキソソームは、ＮＬＲＰ３　ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅを介してＩＬ－１βの産生を促していることが示唆された。
（７－３）ｉｎ　ｖｉｖｏでの好中球浸潤におけるベーチェット病患者由来エキソソームによる効果
　上記「４．エキソソームの分離」に従って調製されたベーチェット病（ＢＤ）患者及び健常者由来のエキソソームを６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア製）の腹腔内に投与（血清１００μｌ相当量の超遠心法にて調整したエキソソーム、および血清７０μｌ相当量のＥｘｏｑｕｉｃｋで調製したエキソソーム）し、３時間後に５ｍｌのＰＢＳを腹腔内に投与して腹腔内に浸潤してくる細胞を洗浄回収した。溶液を遠心後、総細胞数をＧＵＡＶＡ（ミリポア製）を用いて数えた。また、一部の細胞を１００倍希釈した抗Ｇｒ－１（Ｌｙ６Ｇ）抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）及び抗Ｌｙ６Ｃ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で染色して、腹腔内に浸潤した細胞に含まれる好中球（Ｌｙ６Ｇ陽性Ｌｙ６Ｃ陽性）および炎症性単球（Ｌｙ６Ｇ陰性Ｌｙ６Ｃ陽性）の割合をＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製））にて解析し、総細胞数との積にて好中球の細胞数を評価した。結果を図１９に示す。
　また、好中球及び炎症性単球の浸潤に関して（７－２）の結果を踏まえて、ＴＬＲ９及びほかの主要なＴＬＲの関与を明らかにする目的に、ＴＬＲ９受容体欠損マウス（大阪大学ｉＦＲｅＣ　自然免疫学研究室作成、オリエンタルバイオサービス受託販売）、及び殆どのＴＬＲおよびＩＬ－１受容体のシグナル伝達に関与するＭｙＤ８８欠損マウス（大阪大学ｉＦＲｅＣ自然免疫学研究室作成、オリエンタルバイオサービス受託販売）を用い同様の実験を行った。結果を図２０に示す。
　また、ＮＬＲＰ３　ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ及びＩＬ－１受容体の関与を明らかにする目的に、ＮＬＲＰ３欠損マウス及びＩＬ－１受容体アンタゴニスト（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて同様の実験を行った。結果を図２１に示す。
　図２０に示されるように、健常者由来エキソソームに比し、ベーチェット病患者由来のｍｔＤＮＡを含むエキソソームを投与したマウスでは腹腔に浸潤する好中球および炎症性単球の数について顕著な増加が認められた。
　また、図２１に示されるように、患者由来エキソソームによる好中球浸潤活性はＴＬＲ９欠損マウスで部分的に阻害され、他のＴＬＲ受容体やＩＬ－１受容体も含めたシグナル経路に関与するＭｙＤ８８を欠損したマウスにおいては、ＴＬＲ９を欠損したマウス以上に阻害された。
　また、図２１に示されるように、患者由来エキソソームによる好中球浸潤活性はＮＬＲＰ３欠損マウスで減少した。また、ＩＬ－１受容体アンタゴニストの投与により、患者エキソソームによる好中球浸潤活性は阻害された。
　ｍｔＤＮＡは、これまでにＴＬＲ９及びＮＬＲＰ３を介して炎症反応を誘導することが報告されている。それらの知見、及び上記遺伝子欠損マウスを用いた解析の結果を踏まえると、ベーチェット病患者由来エキソソームによって惹起される炎症反応の主たる責任分子は、ｍｔＤＮＡであることが強く示唆された。
（７－４）ＩＬ－１７産生細胞の分化におけるベーチェット病患者由来エキソソームによる効果。
　近年、ＩＬ－１７産生性細胞への分化誘導に、ＩＬ－１βとＩＬ－２３が重要であることが示されている（Sutton, C. E. et al. Interleukin-1 and IL-23 induce innate IL-17 production from gammadelta T cells, amplifying Th17 responses and autoimmunity. Immunity 31, 331-41 (2009)、Martin, B., Hirota, K., Cua, D. J., Stockinger, B. & Veldhoen, M. Interleukin-17-producing gammadelta T cells selectively expand in response to pathogen products and environmental signals. Immunity 31, 321-30 (2009)）。また、ベーチェット病の病因としてＩＬ－１７産生細胞の関与が示唆されている。前記（７－２）の結果から、本発明者は、ベーチェット病患者由来エキソソームはＩＬ－１７産生性細胞への分化にも関与するとの仮説を立てて以下の検討を行った。
　上記「４．エキソソームの分離」に従って調製されたベーチェット病患者及び健常者由来のエキソソームを６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア製）の腹腔内に投与（血清７０μｌ相当量のＥｘｏｑｕｉｃｋで調製したエキソソーム）し、４８時間後に５ｍｌのＰＢＳを腹腔内に投与して腹腔内に浸潤してくる細胞を洗浄回収した。回収した細胞を磁気ビーズ付き抗ＣＤ３抗体（Ｍｉｌｌｉｔｅｎｅｙ）にて、非Ｔ細胞分画とＴ細胞分画との分け、それぞれの細胞からＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーおよび逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）によりｃＤＮＡを得た。それらをテンプレートにして、非Ｔ細胞分画におけるＧＡＰＤＨに対するＩｌ２３　ｍＲＮＡ，Ｔ細胞分画におけるＧＡＰＤＨに対するＩｌ１７ａ、Ｉｌ２３ｒ及びＲｏｒｃ　ｍＲＮＡの発現を、ＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｄ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）のプローブにより、Ｉ７７００を用いたリアルタイムＰＣＲにより検討した。結果を図２２のａに示す。
　また、上記「４．エキソソームの分離」に従って調製されたベーチェット病患者及び健常者由来のエキソソームを６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア製）の腹腔内に投与（血清７０μｌ相当量のＥｘｏｑｕｉｃｋで調整したエキソソーム）し、７２時間後に５ｍｌのＰＢＳを腹腔内に投与して腹腔内に浸潤してくる細胞を洗浄回収した。溶液を遠心後、総細胞数をＧＵＡＶＡ（ミリポア製）を用いてカウントした。また、一部の細胞を、Ｇｏｌｇｉ－ｓｔｏｐ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）存在下で、５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡと２５０ｎｇ／ｍｌのｉｏｎｏｍｙｃｉｎで４時間刺激した後、１００倍希釈した抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）及び抗ＴＣＲγδ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で染色した後、４％ＰＦＡにて固定した。その後、抗ＩＬ－１７抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で細胞質内サイトカイン染色を行った。腹腔内に浸潤した細胞に含まれるＩＬ－１７産生性ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）及びＩＬ－１７産生性γδＴ細胞（γδＴ１７）の割合をＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製））にて解析し、総細胞数との積にてＴｈ１７及びγδＴ１７細胞の細胞数を評価した。結果を図２２のｂに示す。
　更に、（７－２）及び（７－３）の結果を踏まえ、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞の分化誘導のＴＬＲ依存性について、ＴＬＲ９欠損マウス及びＭｙＤ８８欠損マウスを用いて同様の検討を行った。結果を図２２のｃに示す。
　また、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞の分化誘導が、ＩＬ－１β及びＩＬ－２３依存的か否か、ＩＬ－１受容体アンタゴニストと抗ＩＬ－２３受容体抗体を用いて同様の検討を行った。結果を図２２のｄに示す。
　図２２のａに示されるように、ベーチェット病患者由来エキソソームにより、Ｉｌ１７ａ　ｍＲＮＡの発現が亢進し、ＩＬ－１７の転写因子であるＲｏｒｃ　ｍＲＮＡの発現、ＩＬ－１７産生細胞の分化誘導に関与することが知られているＩｌ２３及びＩｌ２３ｒ　ｍＲＮＡの発現が亢進することが示された。また、図２２のｂに示されるように、ベーチェット病患者由来エキソソームの腹腔内投与により、腹腔内のＴｈ１７細胞及びγδＴ１７細胞数の増加が認められた。これらの結果から、ベーチェット病患者由来エキソソームはＩＬ－１７産生細胞の分化誘導を促進することが示された。
　また、図２２のｃに示されるように、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞への効果は、ＴＬＲ９及びＭｙＤ８８欠損マウスで消失し、ＴＬＲ依存的であることが示された。更に、ＩＬ－１受容体アンタゴニストと抗ＩＬ－２３受容体抗体の投与実験から、ベーチェット病患者由来エキソソームによるＩＬ－１７産生細胞への効果が、ＩＬ－１及びＩＬ－２３依存性であることが示唆された。
　これらの結果から、ベーチェット病患者由来エキソソームはＩＬ－１７産生細胞の分化誘導に関与することが示された。（７－２）及び（７－３）の結果を踏まえて総合すると、ベーチェット病患者由来のｍｔＤＮＡを多く含んだエキソソームにより、樹状細胞やマクロファージからＴＬＲ依存的にＩＬ－２３が、ＮＬＲＰ３　ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ依存的にＩＬ－１βが産生され、それらによりＩＬ－１７産生細胞の分化誘導が促されているものと推察された。
　（７－５）実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）モデルにおけるベーチェット病患者由来エキソソームによる効果。
　Ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｒｅｔｉｎｏｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＲＢＰ）特異的Ｔ細胞を得るために、コンプリートアジュバンドであるＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ製）とＩＲＢＰ1-20ペプチド（ＡＮＡＳＰＥＣ製）を混ぜ合わせたエマルジョン液２００μｌを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア製）のマウスの皮下に免疫し、同時に０．２μｇの百日咳毒素を腹腔内投与した。１２日後に脾臓及びリンパ節から細胞を調整し磁気ビーズ付きＣＤ４抗体（ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ４細胞を単離した。それらを、１０μｇ／ｍｌのＩＲＢＰ1-20ペプチド及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２３存在下に、放射線照射した脾臓細胞と供に７２時間共培養した。増殖した細胞から、磁気ビーズ付きＣＤ１１ｃ抗体（ＭＡＣＳ）により陰性分画を単離し、ＩＲＢＰ特異的Ｔ細胞を得た。その後、ＩＲＢＰ特異的Ｔ細胞１×１０7個の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に投与し、ベーチェット病の動物モデルの一つである実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）の誘導を行った。このモデルマウスに、上記「４．エキソソームの分離」に従って調製されたベーチェット病（ＢＤ）患者及び健常者由来のエキソソーム（血清３０μｌ相当量のＥｘｏｑｕｉｃｋで調整したエキソソーム）を合計４回（０，１、２、７日目）静脈内投与し、１３日目にマウスを安楽死させた後、眼球を取り出して４％ＰＦＡにて固定し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。結果を図２３のａに示す。また、ブドウ膜炎の組織学的重症度について、論文（Agarwal, R. K., Silver, P. B. & Caspi, R. R. Rodent models of experimental autoimmune uveitis. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 900, 443-69 (2012)）の評価方法に基づいて評価した。結果を図２３のｂに示す。
　図２３のａに示されるように、ベーチェット病患者由来エキソソームの投与により、網膜周辺におびただしい炎症性細胞の浸潤が認められ、網膜構造の破壊、潰瘍や肉芽の形成が認められた。また、図２３のｂに示されるように、ベーチェット病患者由来エキソソームを投与されたマウスにおいて、組織学的重症度スコアの亢進が示された。
　この結果から、ベーチェット病患者由来エキソソームにはブドウ膜炎を悪化させる作用も有することが示され、ＢＤ患者由来のｍｔＤＮＡを多く含んだエキソソームは病気の増悪に関与していることが示唆された。
　（７－１）、（７－２）、（７－３）及び（７－４）の結果より、ベーチェット病患者由来エキソソーム（即ち、ｍｔＤＮＡを含むエキソソーム）には、好中球の遊走亢進作用、およびサイトカイン産生作用を認め、更に生体内において好中球や炎症性単球の浸潤、ＩＬ－１７産生細胞の分化誘導を亢進させる効果を有していることが示された。また、ベーチェット病患者由来エキソソームによる炎症誘導反応は、Ｇ蛋白質共役型受容体、ＴＬＲ９をはじめとするＴＬＲ、ＮＬＲＰ３　ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅを介していることが示唆され、産生されたＩＬ－１βやＩＬ－２３等のサイトカインを通じてＩＬ－１７産生細胞の分化誘導を亢進させるなど、病的な炎症反応を連鎖的に誘導していることが示唆された。更に、（７－５）の結果より、ベーチェット病由来エキソソームは、ベーチェット病の動物実験モデルである実験的自己免疫性ブドウ膜炎の増悪に関与することが示され、病気の増悪に直接関与することが示唆された。
（まとめ）
　自己免疫疾患患者においては、健常者に比べて血清中のｍｔＤＮＡ量が顕著に高く、これをバイオマーカーとして疾患の検出に利用することができることが示された。更に、自己免疫疾患患者においては、血清中の細胞外膜小胞、とりわけエキソソーム画分に特に多くのｍｔＤＮＡが含まれていることが示された。また、ｍｔＤＮＡを多く含む患者由来エキソソームは炎症反応を亢進させることが示された。これらの知見により、ネクローシスやアポトーシスによらない新しいＤＡＭＰｓの伝播様式が示唆されたとともに、エキソソームの脂質二重膜によってｍｔＤＮＡがＤＮａｓｅ等の影響を受けずに安定に存在するために、免疫反応の増強又は遷延化をもたらすと考えられ、血中エキソソームに存在するｍｔＤＮＡが自己免疫疾患の主たる病因である可能性が示された。即ち、エキソソーム画分に含まれるｍｔＤＮＡは自己免疫疾患のバイオマーカーとしてより一層高い精度を有し、病態を直接的に反映するとともに治療ターゲットとして有用であることが示された。
配列番号１はＣＯＸＩＩＩに対するフォワードプライマーである。
配列番号２はＣＯＸＩＩＩに対するリバースプライマーである。
配列番号３はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼに対するフォワードプライマーである。
配列番号４はＮＡＤＨデヒドロゲナーゼに対するリバースプライマーである。
配列番号５はシトクロムｂに対するフォワードプライマーである。
配列番号６はシトクロムｂに対するリバースプライマーである。

Claims (15)

  1. 　生体体液中に含まれるミトコンドリアＤＮＡからなる、自己免疫疾患のバイオマーカー。
  2. 　ミトコンドリアＤＮＡが生体体液中の細胞外膜小胞内に含まれる、請求項１に記載のバイオマーカー。
  3. 　ミトコンドリアＤＮＡが生体体液中のエキソソーム内に含まれる、請求項１又は２に記載のバイオマーカー。
  4. 　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか１種である、請求項１～３のいずれかに記載のバイオマーカー。
  5. 　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病である、請求項１～４のいずれかに記載のバイオマーカー。
  6. 　ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬を含む、自己免疫疾患の診断キット。
  7. 　前記ミトコンドリアＤＮＡを検出可能な試薬が、シトクロムｂ、ＣＯＸＩ、ＣＯＸＩＩ、ＣＯＸＩＩＩ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼブユニット２、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット３、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット４Ｌ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６、ＡＴＰａｓｅ第６サブユニット及びＡＴＰａｓｅ第８サブユニットからなる群より選択される少なくとも１種を検出することが可能な試薬である、請求項６に記載の診断キット。
  8. 　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか１種である、請求項６又は７に記載の自己免疫疾患の診断キット。
  9. 　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病である、請求項６～８のいずれかに記載の自己免疫疾患の診断キット。
  10. 　下記工程を含む自己免疫疾患の罹患の有無の検出方法：
    （ｉ）被検動物から体液試料を得る工程；
    （ｉｉ）前記体液試料中のミトコンドリアＤＮＡを測定する工程；及び
    （ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）の結果に基づいて自己免疫疾患の罹患の有無を検出する工程。
  11. 　前記工程（ｉｉｉ）が、被験動物について得られる工程（ｉｉ）の結果を、正常対照について得られる工程（ｉｉ）の結果と対比して、ミトコンドリアＤＮＡ量が増加していることを指標として行われる、請求項１０に記載の検出方法。
  12. 　前記自己免疫疾患が、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるいずれか１種である、請求項１０又は１１に記載の自己免疫疾患の検出方法。
  13. 　ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制する物質を有効成分とする、自己免疫疾患の予防又は治療剤。
  14. 　ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制する物質の、自己免疫疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
  15. 　自己免疫疾患の予防又は治療に使用される、ミトコンドリアＤＮＡの体液中への分泌を抑制する又はミトコンドリアＤＮＡの機能を抑制する物質。
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