WO2014033009A1 - Zellselektionsverfahren und daraus gewonnene zellen - Google Patents

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WO2014033009A1
WO2014033009A1 PCT/EP2013/067300 EP2013067300W WO2014033009A1 WO 2014033009 A1 WO2014033009 A1 WO 2014033009A1 EP 2013067300 W EP2013067300 W EP 2013067300W WO 2014033009 A1 WO2014033009 A1 WO 2014033009A1
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Lusine Danielyan
Christoph Gleiter
Matthias Schwab
Richard Schäfer
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Lusine Danielyan
Christoph Gleiter
Matthias Schwab
Schaefer Richard
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Definitions

  • the present invention relates to a method for in vitro selection of at least one Zeli subpopulation from an original cell population of eukaryotic cells and the cells selected by this method and their use.
  • the cell-based therapy of degenerative diseases has recently been found to be an interesting and potent therapeutic method with which, inter alia, neurodegenerated diseases of the central nervous system (CNS), chronic liver diseases, heart disease, arthritis, or tumors are to be treated.
  • the cell-based therapy is based on the replacement of injured, damaged and / or in their ability to regenerate or normal activity of disabled or degenerated cells by transplanted cells, either natural, that is unchanged, are native cells, or are genetically modified cells.
  • the replacement of these degenerate cells by native or genetically modified cells can be supported, for example, by trophic factors.
  • new cells are introduced into a diseased or degenerated tissue to regenerate the tissue suffering from degeneration or inoperable cells, thereby treating specific diseases.
  • the cells currently used in the course of cell therapy are stem cells or progenitor cells of stem cells that are either autologous, that is, derived from the patient to be treated or aliogenic, and thus cells obtained from a donor .
  • the stem cells or progenitor cells of stem cells usually differentiate in the tissue into which they are introduced to the cells originally present in the tissue, precisely because of the influences of the surrounding tissue.
  • mature, functional cells are also currently used, or genetically modified cells that have been genetically engineered to produce a particular substance that is needed or absent in the tissue of interest.
  • stem cells when using stem cells, it is desirable to select those stem cells which are particularly active or have an increased potency to differentiate into the mature cells of the tissue into which the stem cells are introduced.
  • mesenchymal stem cells are multipotent adult stem cells and have immunomodulatory properties, and can proliferate rapidly. Therefore, they can be used for a wide range of treatments including immunomodulatory therapy, bone and cartilage regeneration, yokard regeneration, and neurological or skeletal muscular diseases.
  • the mesenchymal stem cells can either be introduced into the affected tissue before their differentiation, or they can be differentiated into the desired cells in vitro, and after differentiation they can be introduced into the injured or degenerated tissue.
  • the cells, either the differentiated cells or mesenchymal stem cells then integrate at the site of degeneration and replace either the injured or degenerated tissue, or counteract progression of injury / degeneration through their trophic and immunomodulatory effects, thereby partially or wholly restoring the function of the organ or tissue.
  • cell therapy can also use cells for the regeneration of degenerated tissue that have immunomodulatory effects in order to secrete soluble factors, such as cytokines, chemokines or growth factors, that are present in the environment Cells develop their effectiveness.
  • soluble factors such as cytokines, chemokines or growth factors
  • the therapy with adult stem cells represents an important milestone.
  • the aim of the therapy is to counteract the sinking, that is the degeneration, of neurons by targeted protection or new formation.
  • cell-based therapy has been used in almost every type of neurodegenerative disease (see, for example, Lee et al., 2010, Stern Cells 28: 329-343; Wang et al., 2006, Journal of Medical Investigation 53: 61-69), as well as in a number of acute CNS diseases, such as traumatic brain injury, stroke, and moreover, in tumors.
  • the cell implantation approaches have a number of problems: the implantation of stem cells often carries the risk that not the desired phenotype of graft cells is obtained and obtained, or that the transplanted cells in do not stably survive a therapeutic concentration in the central nervous system, or that the recipient tissue is immunologically responsive. In addition, there is also the danger that the transplanted cells emigrate from the transplant area and thus also a regeneration of the degenerated tissue does not come about.
  • the present invention has for its object to provide a new means with which cells that can be successfully used in cell therapy, can be selected, or even provide such cells.
  • this object is achieved by a method for the in vitro selection of at least one therapeutic cell subpopulation from an original cell population of eukaryotic cells, wherein the therapeutic cell subpopulation can be used for the therapy of diseases of tissues or organs, and wherein the A method comprising the following steps: a) applying an original cell population in an output reservoir, which is connected via at least one selection means having at least one opening with at least one selection reservoir, wherein the at least one opening of the at least onewisemitteis a diameter of between 3 m to 500 m; b) applying at least one cell culture medium into the at least one selection reservoir, c) culturing the original cell population for a period of between 15 minutes and 48 hours, within which period of time a cell subpopulation moves the at least one opening of the selection agent in the direction of at least traverses a selection reservoir; d) selecting and obtaining a row selected from at least one of the cells which have traversed the at least one opening of the selection means as the first to one hundred thousandth
  • the object underlying the invention is further achieved by the cells obtained by the method according to the invention with increased migration potential or a tropism to a particular cell type, in particular to a cell type of the potentially to be treated organ or tissue, and their use in therapy of diseases, or their use in the manufacture of a medicament for the treatment of diseases.
  • the cell culture medium to be prepared in step b) can be used with or without the addition of one of the following: a cytokine / chemokine or growth factor, and / or a cell population from at least one cell type such as neurons, astrocytes, immunocompetent cells and Tumor cells of the brain, perivascular or vascular or parenchymal cells of various organs such as the liver, lung, spleen, gastrointestinal and urogenital tract organs, skin, muscle, isolated from one or more specific tissues / regions of an organ, in particular of the organism Brain, such as hippocampus, olfactory bulb.
  • a cytokine / chemokine or growth factor and / or a cell population from at least one cell type such as neurons, astrocytes, immunocompetent cells and Tumor cells of the brain, perivascular or vascular or parenchymal cells of various organs such as the liver, lung, spleen, gastrointestinal and urogenital tract organs, skin, muscle, isolated from
  • a "reservoir” is understood to mean any container or chamber which is suitable for receiving and culturing cells.
  • a container selected from petri dishes, microtiter plates or multiwell plates which are currently commonly used in the field of cell culture and cell examination can be used for the present method.
  • the "initial reservoir” is understood to mean that reservoir into which the original cell population is introduced or applied, and under at least one “selection reservoir” that reservoir (s) into which the cell subpopulation (s) migrates / migrate.
  • the original cell population is given according to the inventive method in the output reservoir, from which the cell subpopulation (s) on the at least one opening of the selection means within a certain period of time of the respective cell subpopulation and the Conditions in the initial reservoirs into which at least one selection reservoir migrates / migrates.
  • the steps a) and b) can be carried out successively or simultaneously; the remaining steps are consecutive.
  • a "selection means having at least one opening” is understood to mean any element which has at least one, preferably a plurality, opening (s) with the diameter defined as defined above of between 3 pm and 500 pm With the aid of which a selection of the original cell population can be achieved by migrating cells of the original cell population through the at least one opening.
  • the at least one opening can be selected from at least one channel with a defined diameter of between 3 ⁇ to 500pm, or at least one opening with a diameter of between 3pm to ⁇ .
  • a plurality of openings and a plurality of channels are provided, which may have the same or different diameter within the defined range.
  • the selection agent is a pore-containing membrane.
  • the at least one opening is a pore, or several pores, via which the cell subpopulation migrates into the selection reservoirs.
  • the selection means having at least one opening is at least one channel with the defined diameter, via which the outlet reservoir and the at least one selection reservoir are in fluid communication with each other.
  • the output reservoir is connected to each of these via respective channels.
  • a “therapeutic Zeli subpopulation” or “therapeutic cell” is understood to mean any subpopulation or cell which can be used specifically and effectively for use in the cell therapist as explained in the introduction, and thus a regeneration of the cell tissue or organ to be treated, for example an injured or degenerated tissue or organ.
  • a “therapeutic cell subpopulation” or “therapeutic cell” therefore includes at least one cell or cell type, such as adult mesenchymal or neuronal stem cells, that are brought or migrated to the degenerate or injured tissue or organ that is in contact with the therapeutic cell. Cell subpopulation should be treated.
  • the therapeutic cell / cell subpopulation can be separated from any eukaryotic origin, especially of mammals, and preferably a human cell / cell subpopulation, and are in different stages of differentiation, provided that they are able to prevent or alleviate the disease to be treated, to their cell therapy they should be used. It is understood that the therapeutic cell / cell subpopulation may be autologous, ie derived from the patient to be treated, or heterologous, ie, derived from a donor. Autologous cells are usually obtained from the patient, manipulated ex vivo and reintroduced into the patient to be treated.
  • the eukaryotic original cell population and / or the cell subpopulation can be obtained from any organ or tissue, preferably a human organ or tissue, adult or fetal, including bone marrow, neural tissue, including hippocampal tissue, and tissue of the present invention subventricular zone, cerebellum, cortex, basal forebrain, ventral mesencephalon and locus ceruleus.
  • organ or tissue preferably a human organ or tissue, adult or fetal, including bone marrow, neural tissue, including hippocampal tissue, and tissue of the present invention subventricular zone, cerebellum, cortex, basal forebrain, ventral mesencephalon and locus ceruleus.
  • populations of mesenchymal or neuronal stem cells, progenitor cells, genetically modified cells, or T cells are also suitable.
  • the original cell population is selected from an original population of adult stem cells and progenitors from the bone marrow, in particular mesenchymal, hematopoietic stem cells, adipose tissue, umbilical cord blood, neural tissue, skin, blood, connective tissue, Liver, kidney, lung, spleen, pancreas; somatic cells with the potential to be related to induced pluripotent stem cells, such as skin, brain, liver, pancreas fibroblasts; from somatic cells of therapeutic potential, such as astroglia, hepatic stellate cells, microglia, lymphocytes, macrophages, natural Kiiler cells, T lymphocytes, renal mesangial cells, endothelial cells, neurons.
  • embryonic cells are not included.
  • ⁇ mesenchymal stem cells are precursor cells of the connective tissue and have a high potential for differentiation; they contribute to the maintenance and regeneration of supporting and connective tissue, such as bone, cartilage, muscle, ligaments, tendons, and adipose tissue, and supporting growth and development of blood progenitor cells in the bone marrow.
  • MSC from different tissues bone marrow, cartilage, adipose tissue, muscle, liver tissue, blood, amniotic fluid
  • Differentiated MSCs are also able to transform into another tissue and adapt to novel environmental conditions.
  • Astroglia are characteristic star-shaped glial cells of the brain and spinal cord. Their tasks include the biochemical support of endothelial cells, which form the blood-brain barrier, as well as the supply of nutrients to the neuronal tissue, the maintenance of extracellular ion balance and they have a role in repairing the brain after traumatic injuries.
  • the at least one opening of the Seietechnischsmitteis have a pore size of between 8 and 12 pm.
  • step c) it is preferred if the period in step c) is between 15 minutes and 6 hours.
  • the term "migration potential” is understood to mean the ability of cells to move in specific directions to specific locations. Accordingly, cells with increased migration potential move / migrate faster than cells with an average or lower migration potential. Regardless of the respective migration ability or of the respective migration potential - these terms are used synonymously in the present case - the migration of the cells can also be influenced by specific external signals; This process is also known as chemotaxis.
  • the migration direction of the cell may be predetermined by tropism (a targeted migration to specific cell and tissue types).
  • This cell resp. Tissue types can be in both normal physiological and pathological states.
  • the pathological conditions may include pathology-spreading, such as, inflammation, cell death, including apoptosis or necrosis, hypoxia, ischemia, degeneration, neoplasm, edema, mechanical damage, as well as specific markers of the disease, such as amyloid beta in Alzheimer's disease , Collagen I, III, IV and VI in liver diseases.
  • those cells are selected which move in a certain period of time as the first through the at least one opening of the selection agent in the cell culture medium of the reservoir, wherein preferably at least one of the cells is selected, located in one of the first to one hundred thousandth cell , Preferably, one hundredth cell, which have moved through the at least one opening of the selection means is selected. Accordingly, it is not a specific time period relevant, but the order in which the cells move through the at least one opening of the selection means: The cells that are among the first one hundred or one hundred thousand cells, through the opening of the selection means, so the Channels or the pores of the membrane are, are of particular interest for the selection.
  • cells are preferred that are among the first fifty cells that have migrated through the at least one opening of the selection agent.
  • those cells are also provided for selection, which migrate within a period of the first thirty minutes through the at least one opening of the4.smitteis.
  • the presently used material of the selection means ie, for example, the membrane or the channel, is a material that can be used in the field of cell biology or, in the in vitro biotechnology, and which is inert to the cells, Consequently, therefore, the cell is influenced neither by its nature nor by its chemical composition, but merely has at least one opening, in particular pores / channels with a specific or different size, through which cells can migrate.
  • Membranes which can be used in the present inventive method as a selection agent are, for example, commercially available from Greiner Bio-one, Germany, and consist essentially of materials such as polyethylene terephthalate or polycarbonate.
  • the channels as an alternative to membranes may consist of or include glass, quartz glass, plastics (e.g., polystyrene) or similar materials whose structure allows optical observation of living cells by microscopy.
  • the membrane serves as a kind of separating layer to at least the first and the second reservoir.
  • the at least one channel serves as a connection between the two reservoirs.
  • two, three, four, five or six or more selection reservoirs which in each case by a at least one opening exhibiting selection means of the first output reservoir into which the Onginal cell population is introduced , are separated.
  • At least 2, 3, 4, 5, or 6 series in series reservoirs are used for selection.
  • the cell selection takes place by migration from the Outgoing reservoir into the other by an intermediate reservoir, from which the cell is selected before it reaches the destination reservoir.
  • the above-mentioned embodiments have the advantage that by means of the provision of a plurality of selection reservoirs, which are optionally provided with certain substances or other cells, cell subpopulations are directed by the content of the selection reservoirs specifically for migration into these reservoirs can or cell subpopulations - and from these cells - can be selected, which can assert themselves in different selection reservoirs under disease-mimicking conditions.
  • the phenomenon of tropism is selected for specific cell type and / or disease condition for the selection of cell populations.
  • the tropism of some stem cells to specific areas of the brain is also used, as described, for example, for certain neurons (see, for example, Wray et al., 1989 and Lois er a /., 1996). , or the lesion / inflammation or degeneration-directed migration of stem cells in many neurodegenerative models as well as tumor models (Kelly et al, 2004, Park et al., 2009).
  • the cell culture medium present in the at least one reservoir in particular in the at least one selection reserovir, selected from tissue or cell type-specific culture media with or without specific additives, the can affect the growth or differentiation, activation and migration / chemotaxis of the cells, such as, for example, SDF-1 a / CXCL12, Cdc42, integrins, activators of the Wnt signaling cascade, components of the extracellular matrix).
  • cytokines include, in particular, hormones, cytokines, nerve growth factor [NGF], basic fibroblast growth factor [bFGF], epidermal growth factor [EGF], brain-derived neurotrophic factor [BDNF], insulin-like growth factor [IFG-1 ], platelet derived growth factor (PDGF), transforming growth factor-b [TGF-b]), and other molecules that can affect cells in their activation state, such as inflammatory mediators, eg, interleukins such as IL-1, 2,6, or Peptides with inflammatory / toxic or anti-inflammatory or anti-apoptotic action such as IL-10, 4,5, erythropoietin.
  • inflammatory mediators eg, interleukins such as IL-1, 2,6, or Peptides with inflammatory / toxic or anti-inflammatory or anti-apoptotic action such as IL-10, 4,5, erythropoietin.
  • the cell culture medium DMEM (Dulbecco's Modified Analogs Medium), which is available from a number of different suppliers on the market, can be used.
  • DMEM is a commonly used medium in the field of cell cultivation, which in addition to amino acids and salts usually also contains glucose and vitamins.
  • the cell culture medium may also be, for example, DMEM without glucose or with LPS (lipopolysaccharides).
  • the culture medium present in the at least one selection reservoir also has cell types which are selected from native or genetically modified cell types.
  • the culture medium in the at least one restriction reservoir into which the cell subpopulations migrate, are already present before the migration of the cell subpopulation in the at least one selection reservoir.
  • these cell types may be selected such that their presence in the at least one dissection reservoir mimics conditions that are specific for certain degenerative diseases.
  • the cells are selected from at least one of the following: cells with which in vitro models for neurodegenerative diseases can be mimicked; Cells with which in vitro models for tumors can be imitated; Cells with which in vitro models for inflammatory diseases can be mimicked; Cells with which in vitro models for traumatic or oxidative stress states can be mimicked.
  • Alzheimer's disease can be mimicked with alpha- synculein-expressing cells the conditions of Parkinson's disease, or generally tumor or trauma conditions characterized by hypoxia (oxygen deficiency), oxidative stress and / or inflammation.
  • hypoxia oxygen deficiency
  • oxidative stress oxidative stress
  • Various cell models for diseases of mammals, particularly humans, are known in the field of cell culture research and can be appropriately adapted for use in the present process.
  • the cell mixture or originai cell population is applied to the original reservoir such that the original cell population is present a plurality of different cell types and / or substances in respectively different selection reservoirs, which are separated by means of openings selection means from the output reservoir, have the choice between several "final targets.”
  • the cell subpopulations can thereby be specifically selected, since with form subpopulations of the method according to the invention, which migrate to different selection reservoirs and thereby have different specificities.
  • At least one further substance selected from chemoattractants, pharmacologically active substances, hormones or growth factors is added to the cell culture medium for inducing the migration of the cells through the at least one opening of the selection means.
  • chemoattractants for the CNS tissue in M. Alzheimer's, HIF1, inflammatory mediators (interleukins) for tumor and ischemic lesions of the CNS and other organs.
  • organ-specific and tissue-specific cell types of mammals can be selected as cell populations with a high migration potential.
  • composition of Zellkuiturmediums - on the other hand particularly robust cell subpopulations, eg. MSC, selected become.
  • the cell subpopulations can be selected for the different conditions or cell types, depending on which of the different selection reservoirs migrates the cell subpopulation.
  • the present invention also relates to the Zefl subpopulation obtained by the method according to the invention, or cell with increased migration potential, in particular for the therapy of diseases of mammals, or for the production of a medicament for the treatment of diseases of mammals, in particular of humans ,
  • the cells or the original cell populations are preferably of human origin, but can be selected with regard to each mammal and used for the mammal from which the original cell population was obtained.
  • the cells obtained by the method according to the invention with a high migration potential! can be used to treat diseases selected from tumors, traumas, lesions, brain degenerative diseases, liver, kidney, lung, heart, gastrointestinal tract, muscle, skin, blood and bone.
  • cells or Zeil subpopulations are characterized by a high migration ability or a high migration potential! These are particularly suitable for use in cell therapies in which the cell to be used in the context of cell therapy can not be used directly in the organ or tissue region to be treated, for example, for anatomical reasons. This is particularly advantageous in diseases where it is important that the cells also pass to peripheral regions or into the CNS to replace the degenerated tissue there. It is thus advantageously achieved that the cells used therapeutically are not used or applied to sites in the tissue which are near or adjacent to the diseased or degenerated cells (for example intravenous, intraarterial, intrathecal application in the case of CNS disorders).
  • the cells with a high migration potential selected via the method according to the invention can be used specifically for the therapy of the diseases mentioned above.
  • the adult high migration potential cell is selected from at least one of the following: mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural progenitor cells, somatic cells with the potential to transform into induced pluripotent stem cells, such as fibroblasts skin, brain, liver, pancreas, astroglia, hepatic stellate cells, microgia, lymphocytes, macrophages, natural Kilier cells, T lymphocytes, kidney mesangial cells, endothelial cells, neurons.
  • embryonic cells are not included.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising at least one of the above-described cells selected according to the invention, in combination with at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier any beneficial agent, adjuvant or pharmaceutical carrier commonly used in the field of medical cell therapy which facilitates or makes possible the administration of the selected cells.
  • the therapeutically effective or therapeutically effective amount of the cells with increased migration potential to be used in the context of the invention is the amount by which the regeneration of the degenerated or damaged tissue is effected.
  • the exact effective amount for a patient depends in particular on its size and health, the nature and extent of the disease.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a patient in a variety of forms adapted to the chosen route of administration, namely, parenteral, oral, intraperitoneal, transdermal, etc.
  • the cells are transplanted for cell therapy.
  • Non-invasive applications such as, for example, intranasal administration in diseases of the CNS, are preferred.
  • the pharmaceutical composition may also include pharmaceutically acceptable carriers, linking agents, diluents, excipients or adjuvants.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers are solvents, extenders or other liquid binders, such as dispersion suspending agents, surface-active agents Agents, isotonic agents, covering agents or emulsifiers, preservatives, wrapping agents, solid binders or lubricants can be used, depending on what is most suitable for the particular dosage and at the same time with the combination of the invention is compatible. An overview of such additional ingredients can be found, for example, in A. Kibbe: Handbook o Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutica! Press.
  • the present invention further relates to the use of a cell culture reservoir system which has an outlet reservoir, at least one selection means having at least one opening, and at least one selection reservoir, wherein the opening has a diameter of between 3 and 500 ⁇ m in the selection of at least one cell subpopulation with increased migration potential or a tropimus to a particular cell type.
  • FIG. 1 shows an embodiment of the use according to the invention of the reservoir system with an exemplary arrangement of cell cultivation reservoirs with channels (A and B) or membranes (C and D) as openings or selection means, for carrying out the method according to the invention; with a selection of the subpopulation with regard to specific brain regions (A and C), or with regard to toxic, disease-relevant conditions (B and D); and
  • Fig. 2 A diagram showing the migration capability of unselected MSC and astroglia, respectively, compared to a selected subpopulation.
  • a schematic reservoir system 10 is shown, with six selection reservoirs 12, 13, 1, 15, 6, 17, which are arranged in a circle around a central outlet reservoir 20.
  • various cell types are presented which, in the example shown in FIGS. 1A and C, are different types of ZeSI of the brain.
  • a membrane 18 is provided as the selection material, which has pores 29 as openings, which are represented in FIG. 1C and D by a punctiform filling pattern.
  • channels 19 are provided as selection means, via which the outlet reservoir 20 is connected to selection reservoirs 30.
  • the system 10 in FIGS. 1A and 1B also has intermediate reservoirs 21.
  • cells migrate from a cell mixture 25 from the outlet reservoir 20 in the direction of individual selection reservoirs 12, 13, 14, 15, 16, 17, so that after a certain time in different intermediate reservoirs 21 different subpopulations of, for example.
  • Mesenchymal stem cells are present, which have a specificity for the respective cell types of the brain. The cells thus selected from the intermediate reservoirs 21 can then be used specifically for diseases of the part of the brain for which they have been specifically proven.
  • a similar construction for a reservoir system is shown, wherein 30 different cytokines are presented in the different selection reservoirs in the embodiment shown in Fig. 1 B and D.
  • the cells 22 traveling through the pores of the membrane 18 in D or channels in B to the individual and different selection reservoirs 30 may, after their selection in the different selection reservoirs 30 (in D) and in the intermediate reservoirs 31 ⁇ in B ) then in With regard to the milieu with which a specific disease was mimicked.
  • FIG. 2 shows the results of investigations of the migration ability of different cell types. A distinction was made once between an original population of MSC and a selected MSC subpopulation, as well as between originai astroglia and a selected astroglial subpopulation.
  • the comparison of the migration rate over a period of 4 hours shows that the selected subpopulations of MSC and astrogia migrated faster to the primary culture than the respective original populations.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Selektion zumindest einer eukaryonatischen Zeil-Subpopulatton aus einer Original-Zellpopulation. Dabei wird ein Reservoirsystem (10) aus einem Ausgangs-Reservoir (20) und zumindest einem Selektions-Reservoir (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30) eingesetzt, sowie zumindest ein zumindest eine Öffnung (19; 29) aufweisendes Selektionsmittel (18; 19), durch welche die Zell-Subpopulationen in die mit Zellkulturmedium und ggf. weiteren Zusätzen ausgestatteten Selektions-Reservoire (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30) wandern. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der mit dem Verfahren gewonnenen Zeilen, sowie des Reservoirsystems.

Description

Zellselektionsverfahren und daraus gewonnene Zellen
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Selektion von zumindest einer Zeli-Subpopulation aus einer Original-Zeilpopulation eukaryontischer Zellen sowie die mit diesem Verfahren selektierten Zellen und deren Verwendung.
[0002] Die zeilbasierte Therapie von degenerativen Erkrankungen erwies sich in jüngerer Zeit als interessantes und potentes Therapieverfahren, mit dem unter anderem neurodegenerattve Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), chronische Lebererkrankungen, Herzkrankheiten, Arthritis, oder auch Tumoren behandelt werden sollen. Die zellbasierte Therapie basiert dabei auf dem Ersatz verletzter, geschädigter und/oder in ihrer Regenerationsfähigkeit bzw. normalen Aktivität behinderter oder degenerierter Zellen durch transplantierte Zellen, die entweder natürliche, das heißt unveränderte, native Zellen darstellen, oder aber gentechnisch modifizierte Zellen sind. Der Ersatz dieser degenerierten Zeilen durch native bzw. gentechnisch modifizierte Zellen kann dabei beispielsweise durch trophische Faktoren unterstützt werden. Wie bereits erwähnt, werden bei dem Verfahren der Zeiitherapie neue Zellen in ein erkranktes oder degeneriertes Gewebe eingeführt, um das aufgrund degenerierter bzw. nicht mehr funktionsfähiger Zellen erkrankte Gewebe zu regenerieren und um dadurch spezifische Krankheiten zu behandeln. Die im Zuge der Zelltherapie gegenwärtig eingesetzten Zellen stellen insbesondere Stammzellen oder Vorläuferzellen von Stammzellen dar, die entweder autolog sind, das heißt von dem Patienten gewonnen wurden, der behandelt werden soll, oder aber aliogen, und damit Zellen darstellen, die von einem Donor erhalten wurden. Die Stammzellen bzw. Vorläuferzellen von Stammzellen differenzieren sich in der Regel in dem Gewebe, in das sie eingeführt werden, zu den ursprünglich im Gewebe vorliegenden Zellen aus, und zwar gerade durch die Einflüsse des umgebenden Gewebes. Alternativ werden gegenwärtig auch reife, funktionale Zellen eingesetzt, oder gentechnisch modifizierte Zellen, die in der Regel zur Produktion einer bestimmten Substanz gentechnisch verändert wurden, welche in dem betreffenden Gewebe benötigt wird oder fehlt.
[0003] Insbesondere beim Einsatz von Stammzellen ist es wünschenswert, diejenigen Stammzellen zu selektieren, die besonders aktiv sind bzw. eine erhöhte Potenz besitzen, sich in die reifen Zellen des Gewebes zu differenzieren, in welches die Stammzellen eingeführt werden.
[0004] Die gegenwärtig eingesetzten mesenchymalen Stammzeilen stellen multipotente adulte Stammzellen dar und besitzen immun-modulatorische Eigenschaften, und können schnell proliferieren. Daher können diese für einen breiten Bereich an Behandlungen eingesetzt werden, einschließlich zum Zwecke einer immun-modulatorischen Therapie, zur Knochen- und Knorpelregeneration, zur yokardregeneration sowie von neurologischen oder skeleto-muskulären Erkrankungen. Die mesenchymalen Stammzellen können dabei entweder vor deren Differenzierung in das betroffene Gewebe eingeführt werden, oder aber in vitro in die betreffenden, erwünschten Zellen ausdifferenziert werden, und nach der Ausdifferenzierung in das verletzte bzw. degenerierte Gewebe eingebracht werden. Die Zellen, also entweder die ausdifferenzierten Zellen, oder aber mesenchymale Stammzellen, integrieren sich dann am Ort der Degeneration und ersetzen entweder das verletzte oder degenerierte Gewebe, oder wirken einem Voranschreiten der Verletzung/Degeneration durch ihre trophischen und immunmodulatorischen Effekte entgegen, wodurch die Funktion des Organs oder des Gewebes partiell oder gänzlich wiederhergestellt wird.
[OOOS] Wie ebenfalls bereits weiter oben erwähnt, können im Zuge der Zelltherapie auch Zellen zur Regeneration von degeneriertem Gewebe eingesetzt werden, die immunmodulatorisch wirken, um lösliche Faktoren wie beispielsweise Zytokine, Chemoki- ne oder Wachstumsfaktoren zu sekretieren, die in der Umgebung der eingesetzten Zellen ihre Wirksamkeit entfalten.
[0006] Insbesondere im Gebiet der Therapie von ZNS-Erkrankungen stellt die Therapie mit adulten Stammzellen einen wichtigen Meilenstein dar. Hierbei liegt das Ziel der Therapie darin, dem Untergang, das heißt also der Degeneration, von Neuronen durch gezielten Schutz oder durch Neubildung entgegenzuwirken.
[0007] So wurde die zeilbasierte Therapie mittlerweile in fast jeder Art von neuro- degenerativen Erkrankungen eingesetzt (siehe beispielsweise Lee et at., 2010, Stern Cells 28: 329-343; Wang et al. , 2006, Journal of Medical Investigation 53: 61 -69), sowie in einer Reihe von akuten ZNS-Erkrankungen, wie traumatische Hirnläsion, Schlaganfall, und darüber hinaus auch bei Tumorerkrankungen.
[0008] Trotz der in präklinischen Studien bewiesenen Therapieeffekte von Stammzelien sind die Zellimplantationsansätze mit einer Reihe von Problemen behaftet: So birgt die Implantation von Stammzellen oftmals die Gefahr, dass nicht der erwünschte Phänotyp von Transplantatzellen erlangt und erhalten wird, oder dass die transplantierten Zellen in einer therapeutischen Konzentration im zentralen Nervensystem nicht stabil überleben, oder dass das Empfängergewebe immunologisch reagiert. Darüber hinaus besteht auch die Gefahr, dass die transplantierten Zellen aus dem Transplantationsareal auswandern und somit eine Regeneration des degenerierten Gewebes ebenfalls nicht zustande kommt. [0009] Vor diesem Hintergrund wäre es wünschenswert, eine Subpopulation aus der jeweiligen Stammzellart und dem Entwicklungsstadium selektieren zu können, sowie diese für die zellbasierte Therapie degenerativer Erkrankungen dahingehend evaluieren zu können, ob sie ein besseres Wirksamkeits- und Unbedenklichkeitsprofii besitzen als unselektierte Populationen. Eine solche Selektion wäre sowohl für Tierexperimente als auch für die Therapie von Tier und Mensch, mithin von Säugetieren allgemein, wünschenswert
[0010] Entsprechend liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues Mittel bereitzustellen, mit welchem Zellen, die erfolgreich in der Zelltherapie eingesetzt werden können, selektiert werden können, bzw. solche Zellen überhaupt bereitzustellen.
[0011] Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur in vitro Selektion von zumindest einer therapeutischen Zell-Subpopulation aus einer Original- Zellpopulation eukaryontischer Zellen, wobei die therapeutische Zell-Subpopulation zur Therapie von Erkrankungen von Geweben oder Organen einsetzbar ist, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Aufbringen einer Original-Zellpopulation in ein Ausgangs-Reservoir, das über zumindest ein zumindest eine Öffnung aufweisendes Selektionsmittel mit zumindest einem Selektions-Reservoir verbunden ist, wobei die zumindest eine Öffnung des zumindest einen Selektionsmitteis einen Durchmesser von zwischen 3 m bis 500 m aufweist; b) Aufbringen von zumindest einem Zellkulturmedium in das zumindest eine Selektions-Reservoir, c) Kultivieren der Original-Zelipopulation für einen Zeitraum von zwischen 15 min und 48 Stunden, innerhalb welchem Zeitraum eine Zeil-Subpopulation die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittels in Richtung des zumindest einen Selektions-Reservoirs durchwandert; d) Auswählen und Gewinnen einer Zeile, die ausgewählt ist aus zumindest einer der Zellen, die die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittels als erste bis einhunderttausendste Zelle in das zumindest eine Selektions- Reservoir durchwandert haben, zur Gewinnung einer Zeli-Subpopulation mit einem im Vergleich zur Original-Zellpopulation erhöhten Migrationspotenzial bzw. einem Tropismus zu einer bestimmten Zellart.
[0012] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird ferner durch die mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Zellen mit erhöhtem Migrationspotenzial bzw. einem Tropismus zu einer bestimmten Zellart, insbesondere zu einer Zellart des potentiell zu behandelnden Organs oder Gewebes gelöst, sowie deren Verwendung in der Therapie von Erkrankungen, bzw. deren Verwendung in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen.
[0013] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
[0014] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Subpopulationen aus Original-Zellpopulationen zu selektieren, die ein erhöhtes Migrationspotenzial bzw. einen Tropismus zu bestimmter Zellart(en) des potentiell zu behandelnden Organs besitzen und die aufgrund dieses Potenzials therapeutisch besonders potent sind.
[0015] Durch das erfindungsgemäße Verfahren können damit bspw. gezielt Subpopulationen von therapeutischen Zellen selektiert und isoliert werden, die sich als besonders potent in der Regeneration von degeneriertem Gewebe, wie beispielsweise Nervengewebe, erwiesen haben.
[0016] Durch die Auswahl dieser Subpopulation wird gewährleistet, dass die einzusetzenden bzw. im Rahmen der Zelltherapie einzuführenden therapeutischen Zeilen schneller und zielgerichteter zum Zielgewebe migrieren, als dies unselektierte Zellen aus Original-Populationen derselben Zellart tun würden. Dadurch kann eine effektivere und schnellere Regeneration des degenerierten Gewebes bewirkt werden. [0017] Das in Schritt b) vorzulegende Zeilkulturmedium kann dabei mit oder ohne Zusatz eines der folgenden eingesetzt werden: eines Cyto-/Chemokins bzw. Wachstumsfaktors, und/oder einer Zellpopuiation aus mindestens einer Zellart wie Neuronen, Astro- zyten, immunkompetente Zellen und Tumorzellen des Gehirns, perivaskuläre oder vaskuläre bzw. Bindegewebe- oder Parenchymzellen verschiedener Organe wie Leber, Lunge, Milz, Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt-Organe, Haut, Muskel, isoliert aus einem oder mehreren spezifischen Gewebe/Region(en) eines Organs, insbesondere des Hirns, wie bspw. Hippocampus, Bulbus olfactorius.
[0018] Vorliegend wird dabei unter einem "Reservoir" jedes Behältnis oder jede Kammer verstanden, das bzw. die zur Aufnahme und Kultivierung von Zellen geeignet ist. Beispielhaft kann für das vorliegende Verfahren ein Behältnis eingesetzt werden, das ausgewählt ist aus Petrischalen, Mikrotiter- bzw. Multiwellplatten, die gegenwärtig üblicherweise im Bereich der Zellkuitur und Zelluntersuchung eingesetzt werden. Dabei wird unter dem„Ausgangs-Reservoir" dasjenige Reservoir verstanden, in das die Original- Zellpopulation ein- oder aufgebracht wird, und unter zumindest einem„Selektions- Reservoir" dasjenige/diejenigen Reservoire, in welche die Zell-Subpopulation(en) migriert /migrieren.
[0019] Die Original-Zellpopulation wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in das Ausgangs-Reservoir gegeben, von welchem aus die Zell-Subpopulation(en) über die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittels innerhalb eines bestimmten Zeitraums, der von der jeweiligen Zell-Subpopulation und den Bedingungen in den Ausgangs- Reservoiren abhängt, in das zumindest eine Selektions-Reservoir migriert/migrieren.
[0020] Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Schritte a) und b) nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden; die restlichen Schritte laufen aufeinanderfolgend ab.
[0021] Vorliegend wird unter einem„zumindest eine Öffnung aufweisendes Selektionsmittel" jedes Element verstanden, das zumindest eine, vorzugsweise mehrere, Öffnung(en) mit dem wie oben definierten Durchmesser von zwischen 3pm bis 500pm aufweist, mit Hitfe dessen eine Selektion der Original-Zeiipopulation erreicht werden kann, indem Zellen der Original-Zellpopulation durch die zumindest eine Öffnung migrieren.
[0022] Erfindungsgemäß kann die zumindest eine Öffnung dabei ausgewählt sein aus zumindest einem Kanal mit einem definierten Durchmesser von zwischen 3μηι bis 500pm, oder zumindest einer Öffnung mit einem Durchmesser von zwischen 3pm bis δΟΌμιη. Vorzugsweise sind dabei mehrere Öffnungen und mehrere Kanäle vorgesehen, die den gleichen bzw. unterschiedliche Durchmesser innerhalb des definierten Bereiches aufweisen können.
[0023] Gemäß einer Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das Selektionsmittel eine Poren-aufweisende Membran ist. Bei dieser Ausführungsform des Selektionsmittels ist die zumindest eine Öffnung eine Pore, bzw. mehrere Poren, über welche die Zell- Subpopulation in die Selektions-Reservoire migriert.
[0024] Gemäß einer anderen Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das zumindest eine Öffnung aufweisende Selektionsmittel zumindest ein Kanal mit dem definierten Durchmesser ist, über welchen das Ausgangs-Reservoir und das zumindest eine Selektions-Reservoir miteinander in Fluidverbindung stehen. Bei Vorliegen meherer Selektsons- Reservoire ist das Ausgangs-Reservoir mit diesen jeweils über entsprechende Kanäle verbunden.
[0025] Ferner wird vorliegend unter„therapeutische Zeli-Subpopulation" oder unter„therapeutische Zelle" jede Subpopulation bzw. jede Zelle verstanden, die gezielt und effektiv für den Einsatz in der Zell-Therapte wie eingangs erläutert eingesetzt werden kann und somit eine Regeneration des zu behandelnden Gewebes oder Organs, bspw. eines verletzten oder degenerierten Gewebes oder Organs bewirkt. Definitionsgemäß umfasst eine„therapeutische Zell-Subpopulation" oder„therapeutische Zelle" daher zumindest eine Zelle oder Zelftyp, wie bspw. adulte mesenchymale oder neuronale Stammzellen, die an das degenerierte oder verletzte Gewebe oder Organ gebracht werden oder migrieren, das mit der therapeutischen Zelle/Zell-Subpopulation behandelt werden soll. Die therapeutische Zelle/Zell-Subpopulation kann dabei von jeder eukaryon- tischen Quelle stammen, insbesondere von Säugetieren, und vorzugswiese eine menschliche Zelle/Zell-Subpopulation sein, und sich in unterschiedlichen Differenzierungs-Stadien befinden, unter der Voraussetzung, dass sie dazu in der Lage sind, die zu behandelnde Erkrankung zu verhindern oder zur lindern, zu deren Zell-Therapie sie eingesetzt werden sollen. Es versteht sich, dass die therapeutische Zelle/Zell-Subpopulation autolog sein kann, d.h. von dem Patienten stammen kann, der behandelt werden soll, oder aber heterolog, d.h. von einem Spender gewonnen wurde. Autologe Zellen werden in der Regel von dem Patienten gewonnen, ex vivo manipuliert und in den zu behandelnden Patienten wieder eingebracht.
[0026] Die eukaryontische Original-Zellpopulation und/oder die Zell-Subpopulation kann von jedem Organ oder Gewebe, vorzugsweise eines humanem Organs oder Gewebes, adult oder fötal, gewonnen werden, einschließlich Knochenmark, neurale Gewebe, einschließlich Hippocampus-Gewebe, und Gewebe der subventrikulären Zone, des Zerebellums, des Kortex, des basalen Vorderhirns, des ventralen Mesencephalon und des Locus ceruleus. Darüber hinaus kommen auch Populationen von mesenchymalen oder neuronalen Stammzellen, Vorläuferzellen, genetische modifizierten Zellen, oder T- Zellen in Frage.
[0027] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Original-Zellpopulation ausgewählt aus einer Original-Population von adulten Stammzellen und Progenitoren aus dem Knochenmark, insbesondere mesenchymale, hämatopoietische Stammzellen, dem Fettgewebe, Nabelschnurblut, neuralem Gewebe, Haut, Blut, Bindegewebe, Leber, Niere, Lunge, Milz, Pankreas; aus somatischen Zellen mit dem Potential, sich in induzierte pluripotente Stammzellen zu verwandein, wie bspw. Fibroblasten der Haut, des Gehirns, der Leber, des Pankreas; aus somatischen Zellen mit therapeutischem Potential wie Astroglia, Hepatische Sternzellen, Mikroglia, Lymphozyten, Makrophagen, natürliche Kiiler-Zellen, T-Lymphozyten, Mesangiumzellen der Niere, Endothelzellen, Neuronen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind embryonale Zellen nicht umfasst.
[0028] Adulte mesenchymale Stammzeilen sind Voriäuferzelien des Bindegewebes und besitzen ein hohes Differenzierungspotenzial; sie tragen zur Aufrechterhaltung und Regeneration des Stütz- und Bindegewebes, wie Knochen, Knorpel, Muskel, Bändern, Sehnen und Fettgewebe bei und unterstützen Wachstum und Entwicklung der Vorläuferzellen des Blutes im Knochenmark. MSC aus unterschiedlichen Geweben (Knochenmark, Knorpel, Fettgewebe, Muskel, Lebergewebe, Blut, Amnionflüssigkeit) lassen sich kultivieren und in vitro in unterschiedliche Gewebe ausdifferenzieren. Ausdifferenzierte MSC sind darüber hinaus in der Lage, sich in ein anderes Gewebe zu transformieren und sich an neuartige Umgebungsbedingungen anzupassen.
[0029] Astroglia stellen charakteristische Sternen-förmige Gliazellen des Gehirns und Rückenmarks dar. Zu Ihren Aufgaben zählen die biochemische Unterstützung von Endotheizellen, die die Blut-Hirn-Schranke bilden, ferner die Bereitstellung von Nährstoffen an das neuronale Gewebe, die Aufrechterhaltung der extrazellulären lonenbilanz, und sie besitzen eine Rolle bei der Reparatur des Gehirns nach traumatischen Verletzungen.
[0030] Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist dabei bevorzugt, wenn die zumindest eine Öffnung des Seiektionsmitteis eine Porengröße von zwischen 8 und 12 pm aufweisen.
[0031] Bei der Auswahl dieser Porengröße bzw. Kanäle mit diesem Durchmesser werden besonders migrationsaktive Zellen isoliert.
[0032] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist bevorzugt, wenn der Zeitraum in Schritt c) zwischen 15 min und 6 Stunden beträgt.
[0033] Innerhalb dieses Zeitraums konnten in eigenen Versuchen Zellarten mit erhöhtem Migrationspotenzial selektiert werden.
10034] Dabei wird vorliegend unter "Migrationspotenzial" die Eigenschaft von Zellen verstanden, sich in bestimmte Richtungen an spezifische Orte bewegen zu können. Entsprechend bewegen sich/wandern Zellen mit erhöhtem Migrationspotenzial schneller als Zellen mit einem durchschnittlichen oder niedrigeren Migrationspotenzial. [0035] Unabhängig von der jeweiligen Migrationsfähigkeit bzw. von dem jeweiligen Migrationspotenzial - diese Begriffe werden vorliegend auch synonym benutzt - kann die Migration der Zellen auch durch spezifische externe Signale beeinflusst werden; dieser Prozess wird auch als Chemotaxis bezeichnet.
[0036] Die Migrationsrichtung der Zelle kann durch Tropismus (eine zielgerichtete Migration zu spezifischen Zell- und Gewebearten) vorgegeben sein. Diese Zell-bzw. Gewebearten können sich sowohl im normalen physiologischen als auch im pathologischen Zustand befinden. Die pathologische Zustände können sowohl Pathologieübergreifend, wie bspw, Entzündung, Zelltod, inklusive Apoptose oder Nekrose, Hypoxie, Ischämie, Entartung, Neubildung, Ödeme, mechanische Schädigung, als auch durch spezifische Marker der jeweiligen Erkrankung, wie bspw. Amyloid-beta bei Morbus Alzheimer, Kollagen I, III, IV and VI bei Lebererkrankungen, gekennzeichnet sein.
[0037] Erfindungsgemäß werden dabei diejenigen Zellen selektiert, die sich in einem bestimmten Zeitraum als erste durch die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittels in das Zellkulturmedium des Reservoirs bewegen, wobei bevorzugt zumindest eine der Zellen ausgewählt wird, die sich in einer der ersten bis hunderttausendsten Zelle, vorzugswiese hundertste Zelle, die sich durch die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittel bewegt haben, ausgewählt wird. Entsprechend ist dabei nicht ein bestimmter Zeitraum relevant, sondern die Reihenfolge, in der sich die Zellen durch die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittels bewegen: Die Zellen, die zu den ersten einhundert bzw. einhundertausend Zellen zählen, die durch die Öffnung des Selektionsmittels, also den Kanälen oder der Poren der Membran gewandert sind, sind dabei von besonderem Interesse für die Selektion.
[0038] Insbesondere sind dabei Zellen bevorzugt, die sich unter den ersten fünfzig Zellen befinden, die durch die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittels migriert sind.
[0039] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind dabei ferner insbesondere diejenigen Zellen zur Selektion vorgesehen, welche innerhalb eines Zeitraums der ersten dreißig Minuten durch die zumindest eine Öffnung des Selektionsmitteis migrieren. [0040] Das vorliegend zu verwendende Material des Selektionsmittels, also bspw. der Membran bzw. des Kanals, ist dabei ein Material, das im Gebiet der Zellbioiogie bzw, in der in vitro Biotechnologie eingesetzt werden kann, und das gegenüber den Zellen inert ist, mithin also die Zelle weder durch ihre Beschaffenheit noch durch ihre chemische Zusammensetzung beeinflusst, sondern lediglich zumindest eine Öffnung, insbesondere Poren/Kanäle mit bestimmter bzw. unterschiedlicher Größe aufweist, durch welche Zellen migrieren können.
[0041] Membranen, die im vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren als Selektionsmittel eingesetzt werden können, sind beispielsweise käuflich erhältlich von der Firma Greiner Bio-one, Deutschland, und bestehen im Wesentlichen aus Materialien wie Poiyethylenterephthalat oder Polycarbonat. Die Kanäle als Alternative zu Membranen können aus Glas, Quarzglas, Kunststoffe (z.B. Polystyrol) oder ähnlichen Materialien bestehen oder diese Materialien aufweisen, deren Struktur die optische Beobachtung lebender Zellen durch Mikroskopie erlaubt. Erfindungsgemäß dient dabei die Membran als eine Art Trennschicht zu zumindest dem ersten und dem zweiten Reservoir.
[0042] Bei einem Einsatz zumindest eines Kanals als Selektionsmittels zwischen dem ersten und dem zweiten Reservoir, dient der zumindest eine Kanal als eine Verbindung zwischen den beiden Reservoiren.
[0043] Erfindungsgemäß können in bevorzugten Ausführungsformen auch zwei, drei, vier, fünf oder sechs oder mehr Selektions-Reservoire vorgesehen sein, welche jeweils durch ein zumindest eine Öffnung aufweisendes Selektionsmittel von dem ersten Ausgangs-Reservoir, in das die Onginal-Zellpopulation eingebracht wird, getrennt sind.
[0044] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zumindest 2, 3, 4, 5, oder 6 in Reihe nachgeschaltete Reservoire zur Selektion eingesetzt. Bei dieser Struktur, in der zwei oder mehrere Reservoire getrennt in einem Behältnis (z.B. Petri-Schale) eingebracht und bspw. über einen oder mehrere Kanälen verbunden sind, findet die Zellselektion durch Migration aus dem Ausgangs-Reservoir in die anderen durch ein Zwischenreservoir statt, aus welchem die Zelle selektiert wird, bevor sie das Zielreservoir erreicht.
[0045] Die oben erwähnten Ausführungsformen haben den Vorteil, dass mittels der Bereitstellung mehrerer Selektions-Reservoire, welche ggf. mit bestimmten Substanzen oder andere Zellen versehen sind, Zell-Subpopulationen durch den Inhalt der Selektions-Reservoire gezielt zur Migration in diese Reservoire dirigiert werden können, bzw. Zell-Subpopulationen - und hieraus Zellen - selektiert werden können, die sich in unterschiedlichen Selektions-Reservoiren unter Krankheits-nachahmenden Bedingungen behaupten können. Dabei wird das Phänomen des Tropismus zu bestimmter Zellart und/oder Krankheitsbedingung zur Selektion der Zellpopulationen gewählt.
[0046J Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird dabei auch der Tropismus mancher Stammzeilen zu bestimmten Hirnarealen zu Nutze gemacht, wie er bspw. für bestimmte Neuronen beschrieben wurde (siehe bspw. Wray et a/., 1989 und Lois er a/., 1996), oder die läsions-/inflammations- oder degenerationsgerichtete Migration von Stammzelien in vielen neurodegenerativen Modellen sowie Tumormodellen (Kelly et ai, 2004, Park ei a/, 2009).
[0047] Entsprechend ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dabei das Zellkulturmedium, das in dem zumindest einen Reservoir, insbesondere in dem zumindest einen Selektions-Reserovir vorliegt, ausgewählt aus Gewebe- bzw. Zellart-spezifischem Kultivierungsmedien mit oder ohne spezifische Zusätze, die das Wachstum bzw. Differenzierung, Aktivierung und Migrati- on/Chemotaxis der Zellen beeinflussen können, wie bspw. SDF-1 a/CXCL12, Cdc42, Integrine, Aktivatoren der Wnt-Signalkaskade, Komponenten der extrazellulären Matrix). Zu solchen gehören insbesondere Hormone, Zytokine, Wachstumsfaktoren (nerve growth factor [NGF], basic fibroblast growth factor [bFGF], epidermal growth factor [EGF], brain- derived neurotrophic factor [BDNF], insulin-like growth factor [IFG-1], platelet derived growth factor [PDGF], transforming growth factor-b [TGF-b]) und andere Moleküle, die Zellen in ihrem Aktivierungszustand beeinflussen können, wie z.B. Entzündungsmediatoren, bspw. Interleukine wie IL-1 ,2,6, oder Peptide mit entzündlicher/toxischer bzw. anti- inflammatorischer bzw. anti-apoptotischer Wirkung wie IL-10, 4,5, Erythropoietin. [0048] Beispielhaft kann das Zellkulturmedium DMEM (Dulbecco's Modified Ea- gle's Medium), eingesetzt werden, das bei einer Reihe verschiedener Anbieter auf dem Markt erhältlich ist. DMEM stellt im Gebiet der Zellkultivierung ein üblicherweise eingesetztes Medium dar, das neben Aminosäuren und Salzen in der Regel auch Glucose und Vitamine enthält.
[0049] Gemäß einer Alternative der erwähnten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Zellkulturmedium auch bspw. DMEM ohne Glucose oder mit LPS (Lipopolysacchariden) sein.
[0050] Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn das in dem zumindest einen Selektions-Reservoir vorliegende Kulturmedium noch Zeiltypen aufweist, die ausgewählt sind aus nativen oder genetisch modifizierten Zelltypen.
[0051] Bei dieser Ausführungsform liegen also im Kulturmedium in dem zumindest einen Seiektions-Reservoir, in das die Zell-Subpopulationen migrieren, bereits vor der Migration der Zell-Subpopulation in dem zumindest einen Selektions-Reservoir vor. Diese Zelltypen können dabei derart ausgewählt sein, dass durch deren Vorliegen in dem zumindest einen Seiektions-Reservoir Bedingungen nachgeahmt werden, wie sie für bestimmte degenerative Krankheiten spezifisch sind.
[0052] Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist dabei bevorzugt, wenn die Zellen ausgewählt sind aus zumindest einem der folgenden: Zellen, mit weichen in vitro Modelle für neurodegenerative Erkrankungen nachgeahmt werden können; Zellen, mit welchen in vitro Modelle für Tumore nachgeahmt werden können; Zellen, mit welchen in vitro Modelle für Entzündungserkrankungen nachgeahmt werden können; Zellen, mit welchen in vitro Modelle für traumatische oder oxidative Stresszustände nachgeahmt werden können.
[0053] So kann bspw, mit APP (Amyloid Precursor Protein)-überexprimierenden Zellen die Bedingungen der Alzheimer-Erkrankung nachahmt werden, mit alpha- synculein-exprimierenden Zellen die Bedingungen der Parkinson-Erkrankung, oder aber allgemein Tumor oder Traumata-Bedingungen, die durch einen Sauerstoffmangel (Hypoxie), oxidativen Stress und/oder Entzündungen charakterisiert sind. Verschiedene Zellmodelle für Krankheiten von Säugetieren, insbesondere des Menschen, sind im Gebiet der Zellkulturforschung bekannt, und können entsprechend zum Einsatz im vorliegenden Verfahren gebracht werden.
[0054] Durch das Vorlegen von Zellen in dem zumindest einen Selektions- Reservoir wird einerseits erreicht, dass diejenigen Zell-Subpopulationen aus der Original- Zellpopulation, welche von dem Ausgangs-Reservoir über das zumindest eine zumindest eine Öffnung aufweisende Selektionsmittel in das zumindest eine Selektions-Reservoir wandern, durch die durch die Zelltypen vorgegebenen Bedingungen in ihrer Differenzierung bzw. Aktivierung beeinfiusst werden können.
[0055] Dabei wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Auswahl einer auf eine ganz bestimmte Organ- bzw. Geweberegion spezialisierten Zell-Subpopulation die Zellmischung bzw. Originai-Zellpopulation derart in das Ausgangs-Reservoir aufgebracht, dass die Original-Zellpopulation durch Vorlage mehrerer unterschiedlicher Zelltypen und/oder Substanzen in jeweils unterschiedlichen Selektions-Reservoiren, die durch Öffnungen aufweisende Selektionsmittel von dem Ausgangs-Reservoir getrennt sind, die Wahl zwischen mehreren„Endzielen" haben. Die Zell-Subpopulationen lassen sich dadurch ganz spezifisch selektieren, da sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Subpopulationen bilden, die zu unterschiedlichen Selektions-Reservoiren migrieren und dadurch unterschiedliche Spezifitäten haben.
[0056] Darüber hinaus ist gemäß einer weiteren Ausführungsform bevorzugt, wenn dem Zellkulturmedium zur Induktion der Wanderung der Zellen durch die zumindest eine Öffnung des Selektionsmittels zumindest eine weitere Substanz zugesetzt wird, die ausgewählt ist aus Chemoattraktanten, pharmakologisch wirksamen Substanzen, Hormonen oder Wachstumsfaktoren. [0057] Der Einsatz dieser Substanzen wird in Abhängigkeit des jeweils gewünschten Zell-Subpopulations-Typs ausgewählt werden, und im Hinblick auf das zu regenerierende Organ oder Gewebe. Z.B. Amyloid beta für das ZNS-Gewebe bei M. Alzheimer, HIF1 , Entzündungsmediatoren (Interleukine) für Tumor und ischämische Läsionen des ZNS und anderer Organe.
[0058] Damit können durch den Einsatz dieser Substanzen Organ-spezifische und Gewebe-spezifische Zellarten von Säugetieren als Zellpopulationen mit hohem Migrationspotenzial selektiert werden.
[0059] Durch die Anwendung von degenerativen Bedingungen in dem zumindest einen Selektions-Reservoir - sei es durch ein Zeilmodell oder durch eine entsprechende, ggf. ohne Zusatzstoffe versorgte, Zusammensetzung des Zellkuiturmediums - können andererseits besonders robuste Zell-Subpopulationen, bspw. MSC, selektiert werden.
[0060] Es versteht sich in diesem Zusammenhang, dass bei Vorliegen mehrerer Selektions-Reservoire in diesen unterschiedliche Bedingungen und/oder Zelltypen vorliegen können. Auf diese Weise können die Zell-Subpopulationen im Hinblick auf die Unterschiedlichen Bedingungen oder Zelltypen selektiert werden, je nach dem in welche der verschiedenen Selektions-Reservoire die Zell-Subpopulation migriert.
[0061] Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Zefl-Subpopulation, bzw. Zelle mit erhöhtem Migrationspotenzial, insbesondere zur Therapie von Erkrankungen von Säugetieren, bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen von Säugetieren, insbesondere des Menschen.
[0062] Die Zellen bzw. die Original-Zellpopulationen sind dabei vorzugsweise humanen Ursprungs, können aber im Hinblick auf jedes Säugetier ausgewählt werden und für das Säugetier eingesetzt werden, von dem die Original-Zellpopulation gewonnen wurde. [0063] Insbesondere ist bevorzugt, wenn die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Zellen mit hohem Migrationspotenzia! eingesetzt werden zur Therapie von Erkrankrungen, die ausgewählt sind aus Tumoren, Traumata, Läsionen, degenerative Erkrankungen des Gehirns, der Leber, Niere, Lungen, des Herzens, Gastrointestinalrak- tes, der Muskeln, Haut, Blut und Knochen.
[0064] Da die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren selektierten Zellen bzw. Zeil-Subpopulationen sich durch eine hohe Migrationsfähigkeit bzw. ein hohes Migrationspotenzia! auszeichnen, sind diese insbesondere für den Einsatz bei Zell-Therapien geeignet, bei denen die im Rahmen der Zell-Therapie einzusetzenden Zellen nicht unmittelbar in der zu behandelnden Organ- oder Gewebe-Region eingesetzt werden können, bspw. aus anatomischen Gründen. Dies ist insbesondere bei Erkrankungen vorteilhaft, wo es wichtig ist, dass die Zellen auch an periphere Regionen oder in das ZNS gelangen, um dort das degenerierte Gewebe zu ersetzen. Damit wird vorteilhafterweise erreicht, dass die therapeutisch eingesetzten Zellen nicht an Stellen im Gewebe eingesetzt bzw. appliziert werden, die in der Nähe oder neben den erkrankten bzw. degenerierten Zellen liegen (z.B. intravenöse, intraarterielle, intrathekale Applikation bei ZNS Erkrankungen).
[0065] Entsprechend können die über das erfindungsgemäße Verfahren selektierten Zellen mit hohem Migrationspotenzial gezielt für die Therapie der weiter oben erwähnten Erkrankungen eingesetzt werden.
[0066] Entsprechend ist vorliegend bevorzugt, wenn die adulte Zelle mit hohem Migrationspotenzial ausgewählt ist aus zumindest einer der Folgenden: mesenchymale Stammzellen, hämatopoietische Stamzeilen, neuronale Vorläuferzellen, somatische Zellen mit dem Potential, sich in induzierte pluripotente Stammzellen zu verwandeln, wie bspw. Fibroblasten der Haut, des Gehirns, der Leber, des Pankreas, Astroglia, Hepatische Sternzellen, Mikrogiia, Lymphozyten, Makrophagen, natürliche Kilier-Zellen, T- Lymphozyten, Mesangiumzellen der Niere, Endothelzeilen, Neuronen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind embryonale Zellen nicht umfasst. [0067J Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest eine der oben beschriebenen erfindungsgemäß selektierten Zellen aufweist, in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
[0068] Dabei wird unter einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger jeder Hiifsstoffe, Zusatz oder pharmazeutische Träger verstanden, der üblicherweise im Gebiet der medizinischen Zell-Therapie eingesetzt wird, und der die Verabreichung der selektierten Zellen vereinfacht oder möglich macht.
[0069] Die im Rahmen der Erfindung einzusetzende therapeutisch wirksame bzw. therapeutisch effektive Menge der einzusetzenden, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren selektierten Zellen mit erhöhtem Migrationspotenzial ist dabei diejenige Menge, durch welche die Regenerierung des degenerierten bzw. geschädigten Gewebe zu bewirken. Die genaue effektive Menge für einen Patienten hängt dabei insbesondere von dessen Größe und Gesundheitszustand, der Art und dem Ausmaß der Erkrankung ab.
[0070] Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einem Patienten in einer Vielzahl von Formen verabreicht werden, die den gewählten Weg der Verabreichung, nämlich parenteral, oral, intraperitoneal, transdermal etc. angepasst sind.
[0071] Üblicherweise werden die Zellen für die Zell-Therapie transplantiert. Bevorzugt sind dabei insbesondere nichtinvasive Applikationen, wie bspw. eine intranasale Applikation bei Erkrankungen des ZNS.
[0072] Wie ferner weiter oben erwähnt, kann die pharmazeutische Zusammensetzung auch pharmazeutisch akzeptierbare Träger, Verbindungsmittel, Verdünnungsmittel, Exzipienten oder Adjuvantien aufweisen. Die Wahl eines pharmazeutischen Trägers, Exzipienten oder anderen Hilfsmittels kann im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und die standardisierte pharmazeutische Praxis vorgenommen werden. Als pharmazeutisch akzeptierbare Träger können Lösungsmittel, Streckmittel oder andere flüssige Bindemittel wie Dispersions- der Suspensionshilfsmittel, oberflächenaktive Agentien, isotonische Wirkstoffe, Deckungsmittel oder Emulgatoren, Konservierungsmittel, Umhüllungsmittel, feste Bindestoffe oder Gleitmittel eingesetzt werden, je nachdem, was für die jeweilige Dosierung am besten geeignet ist und zugleich mit der erfindungsgemäßen Kombination kompatibel ist. Eine Übersicht über solche zusätzliche Inhaltsstoffe findet sich bspw. in A. Kibbe: Handbook o Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutica! Press.
[0073] Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Zelikul- tur-Reservoirsystems, das ein Ausgangs-Reservoir, zumindest ein zumindest eine Öffnung aufweisendes Selektionsmittel, sowie zumindest ein Selektions-Reservoir aufweist, wobei die Öffnung einen Durchmesser von zwischen 3 und 500 μηη aufweisen, in der Selektion von zumindest einer Zell-Subpopulation mit erhöhtem Migrationspotenzial bzw. einem Tropimus zu einer bestimmten Zellart.
[0074] Wie weiter oben erwähnt wurde im Zuge der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal die Eignung eines solchen Systems zur gezielten Selektion von Zellen getestet und erfolgreich eingesetzt.
[0075] Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung sowie den beigefügten Figuren.
[0076] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
[0077] Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:
[0078] Fig. 1 Eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung des Reservoir-Systems mit einer beispielhafte Anordnung von Zellkultivierungs-Reservoiren mit Kanälen (A und B) oder Membranen (C und D) als Öffnungen bzw. Selektionsmittel, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens; mit einer Selektion der Subpopula- tion im Hinblick auf bestimmte Hirnregionen (A und C), bzw. im Hinblick auf toxische, krankheitsrelevante Bedingungen (B und D); und
[0079] Fig. 2 Ein Diagramm, die die Migrationsfähigkeät von unselektierten MSC bzw. Astroglia im Vergleich zu eine selektierten Subpopulation zeigt.
[0080] In Fig. 1A ist eine schematische Reservoirsystem 10 gezeigt, mit sechs Selektions-Reservoiren 12, 13, 1 , 15, 6, 17, die kreisförmig um ein zentrales Ausgangs- Reservoir 20 angeordnet sind. !n den Selektions-Reservoirs sind verschiedene Zelltypen vorgelegt, die in dem in Fig. 1A und C gezeigten Beispiel verschiedene ZeSItypen des Gehirns sind. Als Selektionsmättel ist in Fig. 1C und 1 D eine Membran 18 vorgesehen, die als Öffnungen Poren 29 aufweist, die in der Fig. 1 C und D durch ein punktförmiges Füllungsmuster dargestellt sind. In Fig. 1A und 1 B sind als Selektionsmittel Kanäle 19 vorgesehen, über welche das Ausgangs-Reservoir 20 mit Selektions-Reservoiren 30 verbunden ist. Das System 10 in Fig. 1A und 1 B weist ferner Zwischenreservoire 21 auf.
[0081] Über die Poren 29 der Membran 18 oder Kanäle 9 wandern Zellen aus einer Zellmischung 25 aus dem Ausgangs-Reservoir 20 in Richtung einzelner Selektions- Reservoire 12, 13, 14, 15, 16, 17, so dass nach einem bestimmten Zeitpunkt in unterschiedlichen Zwischenreservoiren 21 verschiedene Subpopulationen von bspw. mesenchymalen Stammzelien vorliegen, die eine jeweilige Spezifität für die betreffenden Zelltypen des Gehirns haben. Die dadurch aus den Zwischenreservoiren 21 selektierten Zellen können dann spezifisch für Erkrankungen des Teil des Gehirns eingesetzt werden, für das sie sich spezifisch erwiesen haben.
[0082] In Fig. 1 B und D ist ein ähnlicher Aufbau für ein Reservoirsystem gezeigt, wobei bei der in Fig. 1 B und D gezeigten Ausführungsform in den verschiedenen Selektions-Reservoiren 30 unterschiedliche Zytokine vorgelegt sind. Die durch die Poren der Membran 18 in D bzw. Kanäle in B zu den einzelnen und unterschiedlichen Selektions- Reservoiren 30 wandernden Zellen 22 können nach deren Selektion in den unterschiedlichen Selektions-Reservoiren 30 (in D) bzw. in den Zwischenreservoiren 31 {in B) dann im Hinblick auf dasjenige Milieu zur Therapie ausgewählt werden, mit welchem eine spezifische Krankheiten nachgeahmt wurde.
[0083] in Fig. 2 sind die Ergebnisse zu Untersuchungen der Migrationsfähigkeit verschiedener Zelltypen dargestellt. Dabei wurde einmal zwischen einer Original- Population von MSC und einer selektierten MSC-Subpopulation unterschieden, sowie zwischen Originai-Astroglia und einer selektierten Astroglia-Subpopulation.
[0084] Der Vergleich der Migrationsgeschwindigkeit über einen Zeitraum von 4 Stunden zeigt, dass die selektierten Subpopulationen der MSC und der Astrogiia jeweils schneller zur Primärkultur migrierten als die jeweiligen Originalpopulationen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur in vitro Selektion von zumindest einer therapeutischen
Zell-Subpopulation aus einer Original-Zelipopulation eukaryontischer Zellen, wobei die therapeutische Zell-Subpopulation zur Therapie von Erkrankungen von Geweben oder Organen einsetzbar ist, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Aufbringen einer Original-Zellpopulation in ein erstes Ausgangs-Reservoir (20), das über zumindest ein zumindest eine Öffnung (19; 29) aufweisendes Selektionsmittel (18; 19) mit zumindest einem zweiten Selektions- Reservoir (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30) verbunden ist, wobei die zumindest eine Öffnung (19; 29) des zumindest einen Selektionsmittels (18; 19) einen Durchmesser von zwischen 3μηη bis 500μιη aufweist; b) Aufbringen von zumindest einem Zelikulturmedium in das zumindest eine Selektions-Reservoir (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30) , zu welchem die therapeutische Zell-Subpopulation migriert, c) Kultivieren der Original-Zelipopulation für einen Zeitraum von zwischen 15 min und 48 Stunden, innerhalb welchem Zeitraum eine Zell-Subpopulation die zumindest eine Öffnung (19; 29) des Selektionsmittels (18; 19) in Richtung des zumindest einen Selektions-Reservoirs (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30) durchwandert; d) Auswählen und Gewinnen einer Zelle, die ausgewählt ist aus zumindest einer der Zellen, welche die zumindest eine Öffnung (19; 29) des Selekti- onsmittels (18; 19) als erste bis einhunderttausendste Zelle in das zumindest eine Selektions-Reservoir (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30) durchwandert haben, zur Gewinnung einer Zell-Subpopulation mit einem im Vergleich zur Original-Zellpopulation erhöhten Migrationspotenzial bzw. einem Tropismus zu einer bestimmten Zellart. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die zumindest eine Öffnung (19; 29) des Selektionsmittels (18; 19) einen Durchmesser von zwischen 8 und 12 pm aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Zeitraum von zwischen 15 min und 6h ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Original-ZeNpopulation ausgewählt ist aus einer Population von adulten Stammzellen und Progenitoren aus dem Knochenmark, dem Fettgewebe, Nabelschnurblut, neuralem Gewebe, Haut, Blut, Bindegewebe, Leber, Niere, Lunge, Milz, Pankreas; aus somatischen Zellen mit dem Potential, sich in induzierte pluripotente Stammzellen zu verwandeln; aus somatischen Zellen mit therapeutischem Potential, nämlich Astroglia, Hepatische Sternzellen, Mikroglia, Lymphozyten, Makrophagen, natürliche Killer-Zellen, T-Lymphozyten, Mesangiumzellen der Niere, Endothelzellen, Neuronen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 2, 3, 4, 5, oder 6 Seiektions-Reservoire (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30) vorgesehen sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das ZeHkulturmedium in Schritt b) ferner noch zumindest eines der folgenden aufweist: ein Cytokin, Chemoattraktanten, Entzündungsmediatoren, pharmakologisch wirksamen Substanzen, Hormonen, Wachstumsfaktoren, und/oder eine Zellpopuiation aus mindestens einer nativen oder genetisch veränderten Zellart.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpopulation bzw. Zellart ausgewählt ist aus Neuronen, Astrozyten, immunkompetenten Zellen und Tumorzellen des Gehirns, perivaskuläre oder vaskuläre bzw. Bindegewebeoder Parenchymzellen von Organen der Leber, Lunge, Milz, Gastrointestinal- und Urogenitaltrakt-Organe, der Haut, der Muskeln, Zellarten, isoliert aus einer oder mehreren spezifischer Region(en) eines Organs, insbesondere des Hirns.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelltypen ausgewählt sind aus zumindest einem der folgenden: Zellen, mit welchen in vitro Modelle für neurodegenerative Erkrankungen nachgeahmt werden können; Zellen, mit welchen in vitro Modelle für Tumore nachgeahmt werden können; Zellen, mit welchen in vitro Modelle für Entzündungserkrankungen nachgeahmt werden können; Zellen, mit welchen in vitro Modelle für traumatische, hypoxische, ischämische oder oxidative Stresszustände nachgeahmt werden können.
9. Zelle mit erhöhtem Migrationspotenzia!, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ausgewählt und gewonnen wurde, zur Verwendung in der Therapie von Erkrankungen von Säugetieren.
10. Zelle mit erhöhtem Migrationspotenztal nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Therapie von Erkrankungen eingesetzt wird, die ausgewählt sind aus: Tumoren, Traumata, degenerative, entzündliche, bakterielle und virale, metabolische Erkrankungen die mindestens ein bzw. mehrere Organe, wie das Gehirn, die Leber, Niere, Lungen, das Herz, Gastrointestinalrakt, die Muskeln, Haut, das Blut und die Knochen betreffen.
1 1. Zelle mit erhöhtem Migrationspotenzial nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt ist aus zumindest einem der Folgenden: mesenchymale und hämatpopoietische Stammzellen bzw. Vorläuferzellen, somatische Zellen mit dem Potential, sich in induzierte pluripotente Stammzellen zu verwandeln, somatische Zellen mit therapeutischem Potential. 2. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend zumindest eine Zelle mit erhöhtem Migrationspotenzial bzw. Tropismus zu bestimmter Zel!-/Gewebeart nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger.
13. Reservoirsystem (10), aufweisend zumindest ein Ausgangs-Reservoir (20),
zumindest ein Selektions-Reservoir (12, 13, 14, 15, 16, 17; 30), sowie zumindest ein zumindest eine Öffnung (19; 29) aufweisendes Selektionsmittef (18; 19), wobei die zumindest eine Öffnung (19; 29) einen Durchmesser von zwischen 3 und 500 μιη aufweist, zur Verwendung in der Selektion von zumindest einer Zell- Subpopulation mit erhöhtem Migrationspotenzial und/oder Tropismus zur spezifischer Zell-/Gewebeart unter normalen oder pathologischen Bedingungen.
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