WO2014024598A1 - 生体分子検出方法、生体分子検出装置、および分析用デバイス - Google Patents

生体分子検出方法、生体分子検出装置、および分析用デバイス Download PDF

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biomolecule
pore
solution tank
charge
biomolecule detection
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俊郎 齋藤
健太 今井
今井　恭子
今井　一成
至 柳
善光 柳川
安藤　正彦
板橋　直志
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株式会社 日立ハイテクノロジーズ
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Definitions

  • the present invention relates to a biomolecule detection method and apparatus using current measurement.
  • Quantifying the amount of cytokines, hormones, proteins, nucleic acids, and other biomolecules contained in body fluids such as plasma, lymph, and tissue fluids, or detecting trace amounts of biomolecules contained in body fluids is an early diagnosis of disease. Or it is indispensable for accurate understanding of the pathology.
  • Non-patent document 1 In the case of cancer (Non-patent document 1), nervous system disease (Non-patent document 2), and infectious disease at the early stage of infection (Non-patent document 3), proteins present in serum are 10-16 to 10 It is thought to be a concentration of 12M.
  • the ELISA method, chemiluminescence method, or bead assay using a flow cytometer is mainly used for the quantification or detection of biomolecules, but the detection sensitivity is about 10-12M at the lowest (non-patent) Reference 4), application to early diagnosis of diseases was very limited.
  • Patent Document 1 discloses a method for determining the number of fine particles that have captured an antigen using flow cytometry.
  • Non-patent Document 5 a digital ELISA method has been proposed that can detect even a sample (concentration: 10-19M) in which only 10-20 molecules exist in 100 ul using an antigen-antibody reaction.
  • a sample concentration: 10-19M
  • an antigen-antibody reaction Non-patent Document 5
  • a second antibody with biotin is reacted, and further a galactosidase with streptavidin is reacted to introduce the enzyme onto the magnetic fine particles.
  • the fine particles are put into an array of minute holes formed by etching the ends of a bundle of optical fibers, and a chemiluminescent substrate is allowed to act on this to obtain the number of chemiluminescent bright spots through the optical fiber. It is to count the number of antigen molecules.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and provides a method for counting biomolecules to be detected one molecule at a time, and in particular, a detection method that does not require prior adjustment of sample concentration and is simple in operation. Is to provide.
  • the inventors of the present invention have developed a method for counting the number of molecules for each biomolecule to be detected and a method for limiting the number of molecules to be counted.
  • a biomolecule is captured on a charge holding body on which a large number of detection antibodies are immobilized, and then reacted with a second antibody immobilized on the charge holding body.
  • a charge holding body aggregate is formed by connecting two charge holding bodies through a device, and the charge holding body aggregates are arranged in parallel using a device in which a large number of detectors combining field effect transistors and pores are provided on the substrate.
  • the present invention provides a method for detecting a biomolecule to be detected by counting the number of molecules one by one, which cannot be realized by a conventional detection method.
  • a field effect transistor and a pore can be easily formed on a 1 mm square substrate with a 1 um pitch.
  • the sample is, for example, 50 ul of serum, it can be measured by the same method over a wide range from 1 uM as a high concentration to 1 aM (30 molecules / 50 ul) as a low concentration.
  • the field effect transistor in order to detect a current change caused by the charge holding body passing through the pore, no optical system is required, and the device can be easily downsized as compared with the conventional fluorescence detection. Moreover, it can be manufactured at low cost.
  • the charge retention is carried out by reacting a biomolecule to be detected, a charge carrier having a first antibody against the biomolecule on the surface, and a charge carrier having a secondary antibody against the biomolecule on the surface.
  • a method for detecting a biomolecule characterized by detecting a complex of the charge carrier by measuring an individual charge amount of the body and evaluating the abundance of the biomolecule.
  • the evaluation of the abundance of biomolecules means counting the number of molecules. Therefore, when the object to be measured is a liquid and the total volume and amount are known, this is equivalent to the measurement of the concentration.
  • a biomolecule to be detected a charge carrier having a first antibody against the biomolecule on the surface, and a charge carrier having a secondary antibody against the biomolecule on the surface are reacted.
  • the obtained reaction solution is flowed through the through-hole from one side to the other side with respect to the substrate provided with two electrodes opposed to each other on the substrate surface and provided with a pore penetrating the substrate between the electrodes.
  • a method for detecting a biomolecule characterized in that a complex of the charge carrier is detected by measuring a current between the electrodes and the abundance of the biomolecule is evaluated.
  • the insulating film, the control gate, the source, the drain, and the channel on the surface of the substrate and the plane on which the control gate, the source, the drain, and the channel are placed from one side of the plane.
  • a pore penetrating to one side is provided, and is a field effect transistor that exerts a field effect on the channel by the control gate, and the penetrating pore includes a side surface on the channel side of the control gate and a channel side of the channel.
  • a biomolecule detection method characterized by evaluating the abundance of a biomolecule.
  • a biomolecule detection method is disclosed, wherein the charge carrier is selected from magnetic fine particles, polymer fine particles, proteins, and nucleic acids.
  • a biomolecule to be detected a charge carrier having a first antibody against the biomolecule on the surface, and a means for reacting the charge carrier having a secondary antibody against the biomolecule on the surface;
  • a biomolecule detection device comprising means for measuring the individual charge amount of the charge carrier.
  • a biomolecule detection apparatus wherein a device having a field effect transistor and a through hole is used as means for measuring the individual charge amount of the charge holding body.
  • the first solution tank, the second solution tank, the membrane separating the first solution tank and the second solution tank, and a through hole is provided in the membrane.
  • a reaction solution obtained by reacting a charge carrier having one antibody on the surface with a charge carrier having a secondary antibody against the biomolecule on the surface is placed in the first solution tank, and the first A biomolecule characterized by detecting a change in the current flowing between the solution tank and the second solution tank to detect the complex of the charge carrier and evaluating the abundance of the biomolecule.
  • a detection method is disclosed.
  • the biomolecule detection method is characterized in that the diameter of the penetrating pore is larger than the diameter of the charge carrier used and smaller than twice the diameter. Further, it is more preferable that the thickness of the film is not more than twice the diameter of the charge holding body.
  • a biomolecule detection method is disclosed, wherein, in the biomolecule detection method, the charge carrier is selected from magnetic fine particles, polymer fine particles, proteins, and nucleic acids.
  • the first solution tank, the second solution tank, the membrane separating the first solution tank and the second solution tank, and a through hole is provided in the membrane.
  • a facility in which electrodes for measuring a current generated by the movement of a substance through the penetrating pores are provided in the first solution tank and the second solution tank, a biomolecule to be detected, and a first for the biomolecule
  • a biomolecule detection device comprising means for detecting a change in current flowing between two solution tanks is disclosed.
  • FIG. 1A shows a sandwich complex 105 produced by reacting a first antibody 102 and a second antibody 104 that specifically bind to a biomolecule 101 to be detected.
  • a functional group 103 is bonded to the first antibody 102 and the second antibody 104 in advance.
  • FIG. 1 (b) shows the dimer 109 produced by the sandwich complex 105 and the charge complex 107 produced in FIG. 1 (a).
  • a binding molecule 108 that specifically binds to the functional group 103 is bound to the charge carrier 107 in advance.
  • biotin can be used for the functional group 103
  • avidin or streptavidin can be used for the binding molecule 108.
  • the dimer 109 of the charge carrier 107 sandwiching the biomolecule 101 in a sandwich shape can be obtained.
  • the sandwich complex 105 it is preferable to react the first antibody 102 and the second antibody 104 at a concentration 10 times, more preferably 100 times or more the concentration of the biomolecule 101.
  • the concentration of the charge holding body 107 is 10 times or more, more preferably 100 times or more higher than the concentration of the sandwich complex 105, It is preferable that a plurality of sandwich composites 105 per one charge holding member 107 can be kept sufficiently low. As described above, after obtaining the dimer 109 of the charge carrier 107 sandwiching the biomolecule 101 in a sandwich shape, the number of molecules present in the biomolecule 101 is measured using the detection device 114.
  • a plurality of detection devices 114 are arranged on the support 113 in accordance with the detection throughput.
  • the support 113 is disposed with the first solution tank 111 and the second solution tank 112 separated from each other.
  • a source 116, a drain 117, a control gate 115, and a channel 121 are provided on a substrate 119.
  • the pore 118 is a hole penetrating the substrate 119 and is provided between the control gate 115 and the channel 121 on the substrate 119 or at a location including all or part of the channel 121.
  • a dimer 109 of the charge carrier 107 sandwiching the biomolecule 101 in a sandwich shape and a reaction liquid containing a reactant 110 other than the dimer are put into the first solution tank 111, the first solution tank 111 and the second solution
  • the reactant including the charge holding body 107 is moved from the first solution tank 111 to the second solution tank 112 via the pore 118.
  • the detection device 114 is a field effect transistor that exerts a field effect on the channel 121 by the control gate 115.
  • a pore 118 is provided in the vicinity of the channel 121, and the passage of the charge holding body 107 is detected by measuring a change in the current flowing from the source 116 to the drain 117 when the charge holding body 107 passes through the pore 118.
  • the charge carrier 107 passes in a single state or the dimer 109 of the charge carrier 107 sandwiching the biomolecule 101 in a sandwich shape is identified, and the dimer By counting 109, the number of biomolecules 101 can be evaluated.
  • the unreacted substance 106 and the reactant 110 other than the dimer can be sufficiently distinguished from the dimer 109 by measuring the amount of current change.
  • the charge carrier 107 fine particles made of a polymer such as polystyrene can be used.
  • the amount of negative charge charged on the surface can be controlled by introducing carboxyl groups on the surface and controlling the density.
  • an amino group is introduced into the surface of the polymer fine particle, a positive charge can be retained, and the amount of positive charge can be controlled by controlling the density of the amino group.
  • a protein can be used for the charge holding body 107.
  • BSA bovine serum albumin
  • it can be used as a negatively charged charge carrier.
  • fine particles made of a polymer it is necessary to sufficiently suppress aggregation or to sufficiently remove the aggregate in advance. Otherwise, it may be difficult to determine whether the dimer 109 of the charge carrier 107 sandwiching the biomolecule 101 in a sandwich shape or an aggregate.
  • a protein is used for the charge carrier 107, there is an advantage that the presence of aggregates does not matter.
  • globular proteins are preferable from the viewpoint of solubility in water.
  • the charge amount can be either positive or negative, and the charge amount is preferably large. From this point, it is preferable to use fine particles made of a polymer such as polystyrene.
  • the diameter of the charge holding body 107 may be smaller than the diameter of the pore 118. More preferably, it is small from the viewpoint of dispersibility in the liquid and diffusion rate, and is preferably 10 ⁇ m or less, more preferably 2 ⁇ m or less.
  • the diameter of the pore 118 needs to be larger than the diameter of the charge holding body 107.
  • the current flowing through the channel 121 changes due to the change in the effective charge amount of the charge holding body 107 passing through the pore 118 and the electric field caused by the effective electric field, and whether the charge holding body 107 is a single body or a dimer by detecting the change. Identify It is necessary to reduce the thickness of the current layer flowing through the channel 121 as much as possible, and to detect a current derived from an electric field change caused by 1071 charge carriers. For this purpose, it is necessary to reduce the thickness of the channel 121. If the thickness of the channel 121 is smaller than the diameter of the charge holding body 107, it is possible to detect the charge holding bodies 107 passing through the pores 118 one by one. The dimer 119 and the reactant other than the dimer 110 can be identified.
  • FIG. 1 A detailed configuration diagram of the detection device 114 is shown in FIG.
  • An insulating film 200, a channel 201, a control gate 202, a source 203, a drain 204, a back gate 205, a wiring 206 207 serving as a contact with the pores 206 and 202-205 are provided.
  • the pore is in the channel between the side of the control gate on the channel side and the side of the channel on the control gate side (Fig. 2A), the end of the channel on the control gate side (Fig. 2B), or near the side of the channel on the control gate side. ( Figure 2C).
  • the channel 201 is non-doped silicon, P-type silicon or low-concentration N-type silicon
  • the control gate 202 and back gate 205 are N-type or P-type silicon
  • the source 203 and drain 204 are N-type silicon.
  • the device operates as a transistor by controlling the control gate voltage while applying a voltage so that the source voltage is less than the drain voltage.
  • This is a so-called side gate type transistor.
  • an inversion layer is induced on the channel side portion on the control gate side (pore side), so that current flows through the channel side portion on the control gate side.
  • the thickness of the inversion layer depends on the control gate voltage, but is very thin, about 2-3 nm or less.
  • a quasi-one-dimensional thinnest current path can be formed on the side wall of the thin film channel. . Because it is a quasi-one-dimensional thinnest current path, it reacts extremely sensitively to minute electric field changes caused by objects in the pores. Therefore, the change ratio (detection sensitivity) of the detection signal can be extremely increased.
  • the channel current is due to electrons induced by the electric field of the control gate. Therefore, the pore is preferably arranged between the control gate and the channel current path. By doing so, the potential change due to the object in the pore can very effectively modulate the electric field between the control gate and the channel, and the change can be reflected in the channel current.
  • the pores can improve detection sensitivity as they are closer to the side current path in the channel.
  • the current change due to the object in the pore is very small. This is because even if the pore is arranged on the back gate side, the electric field generated by the control gate in the channel cannot be substantially modulated.
  • the arrangement of the pores is preferably between the control gate and the channel side and in the quasi-one-dimensional thinnest current path on the channel side.
  • Fig. 2B and Fig. 2C when part of the channel is a pore region, very sensitive sensing is possible.
  • the channel and the pore are separated by an insulating film as shown in Fig. 2A, the channel does not directly touch the object or the solution containing the object, so there is a possibility of channel corrosion or channel surface state variation. And the reliability as a device is increased.
  • a voltage is applied to the back gate 205, and electrons are more concentrated on the control gate side.
  • Such electric field control is effective.
  • FIG. 4 is a diagram in which the portion separated by a broken line in this device is modeled as two capacities with a pore interposed therebetween.
  • C1 is the capacity of the part separated by the broken line between the control gate and the pore
  • C2 is the capacity of the part separated by the broken line between the pore and the channel.
  • the pore diameter is 20 nm
  • the distance between the control gate and the pore is 50 nm
  • the thickness of the channel and the control gate is 3 nm
  • the oxide film as the insulating film between the control gate and the pore (relative dielectric constant 3.9) If the pore is approximated by a quadrangular prism and its one side is 20 mm, C1 is about 2.76 x 10-19 mm.
  • the threshold voltage shift ⁇ Vth at the channel end in the vicinity of the pore is expressed as in equation (1).
  • ⁇ Vth ⁇ Q / C1 (1)
  • a spherical protein BSA bovine serum albumin, diameter: 7-8 nm
  • the surface charge amount of BSA at pH 7 is -18e according to Non-Patent Document 6, and therefore a pore with a diameter of 20 nm.
  • polystyrene beads having a diameter of about 40 nm are used as a charge carrier, for example, from the surface charge density (-3.2 ⁇ C / cm2) of polystyrene when potassium persulfate is used as an initiator from Non-Patent Document 7,
  • This device can achieve a value close to this ideal threshold voltage shift.
  • the reason is that a very thin one-dimensional electron conduction is formed at the end of the thin film channel as a current path, so that the electric field change (threshold change) at the end of the channel near the pore is almost the threshold of the transistor. (If the channel is thick and the width of the current path is wide, even if a single charge comes near, the current flows through the part far from the charge, so a large threshold value is reflected. This is the same even if current flows in the entire channel width direction, and a large threshold shift cannot be obtained because of the configuration and operation method of this device. Value close to can be realized).
  • the electric field that flows from the side of the pore to the channel out of the electric field between the control gate and the channel can be blocked.
  • the electric field modulation in the pore can be transmitted to the channel without fail, and a value close to an extremely large threshold shift as described above can be realized.
  • a large potential difference is detected by the detection device of the present invention when passing alone or when passing as a dimer. It can be seen that detection and identification can be performed with a high detection sensitivity.
  • the current change caused by the charge carrier passing through the pore can be adjusted by adjusting the distance between the pore and the channel and the distance between the pore and the control gate. If the distance is made longer, the current change caused by the charge carrier becomes larger.
  • the current change caused by the charge holding body also increases by reducing the dielectric constant between the pore and the control gate.
  • the pH it is possible to adjust the effective charge amount of the charge holding body and increase the current change.
  • the detection sensitivity can be improved. This is a characteristic obtained by arranging the pore between the channel current path and the control gate. Note that the distance between the pore and the control gate is set to a distance with the highest detection sensitivity in consideration of the usable voltage, withstand voltage, and the like.
  • the back gate is not always necessary in this device.
  • the effect of the back gate is that the current path can be more concentrated on the pore side and the threshold voltage can be adjusted.
  • the production method of the present invention is not limited to this process.
  • the process flow is shown in the form of (a), (b), and (c) for each figure.
  • (C) is a top view
  • (a) is an A-A 'sectional view in (c)
  • (b) is a B-B' sectional view in (c).
  • Process 1 A SiN film 209 and a SiO2 film 210 are deposited on a Si substrate 208. For example, a SiN film 15 nm and a SiO2 film 15 nm are deposited.
  • Process 2 N-type polysilicon 211 is deposited, and the control gate, back gate, source and drain regions are patterned. For example, the deposited film thickness of N-type polysilicon is 100 nm.
  • Process 3 A non-doped thin film polysilicon layer 212 is formed.
  • a forming method for example, there is a method in which amorphous silicon is deposited and then crystallized by annealing, or a method in which amorphous silicon or polysilicon is deposited and then oxidized to form a thin film.
  • a thin film silicon channel of 5 nm or less can be formed.
  • Process 4 A SiO2 film 210 is deposited.
  • the film thickness is 10 nm.
  • Process 5 A SiO2 film and non-doped polysilicon are patterned by dry etching to form a channel. Further, the non-doped silicon layer covering the gate, source and drain regions is also processed as shown in FIG. (FIG.
  • Process 6 SiO2 film 210, SiN film 209, SiO2 film 210, and SiN film 209 are sequentially deposited as interlayer films.
  • Process 7 Control gate, back gate, source and drain contacts are formed.
  • Al is used as the material of the wiring 207.
  • Process 8 An SiN film 209 is formed as an interlayer film on the wiring, and then a pad 215 for contacting the wiring is formed.
  • the deposited film thickness is, for example, 200 nm.
  • Process 9 The channel and the vicinity 213 are dug by dry etching.
  • Process 10 The Si wafer back surface is anisotropically etched using KOH or TMAH solution to form a thin film region. For example, a SiN film is preferably used as a mask during etching.
  • Process 11 The pore 214 is formed in the region as described above (the region between the control gate and the channel side and the region where the quasi-one-dimensional thinnest current path is formed on the channel side). .
  • the pores can be formed, for example, by forming a fine pore of 50 nm or less by pore opening with a TEM beam.
  • the pore diameter can be molded to any size with 50-1000nm (Fig. 15).
  • the desired pore diameter depends on the size of the charge carrier used in the analysis, but it must be larger than the diameter of the charge carrier so that the charge carrier can pass through.
  • the diameter of the pore is preferably smaller than twice the diameter of the charge holding body.
  • FIG. 15C includes a source 215A, a drain 215B, and a channel 215E.
  • the source 215A and the drain 215B may be reversed, and electrons flow in the channel 215E from the source 215A to the drain 215B.
  • the gate 215C and the back gate 215D are provided, the back gate 215D may not be provided.
  • the pore 214 is formed between the channel 215E and the gate 215C.
  • This device can be formed by the above process.
  • a transistor can be formed by using an SOI wafer to thin a portion corresponding to the channel region by repeating SOI oxidation and cleaning.
  • precise film thickness control is required, the detection current value is stabilized and increased because single crystal Si becomes a channel. Stabilization of the detection signal makes it possible to improve the identification accuracy, and an increase in the detection current value facilitates the detection signal processing, so that the detection signal processing can be speeded up.
  • FIG. 16 to FIG. 16 an example of a device of the present invention and a series of systems from the detection signal to the display of the abundance of the detection target molecule will be shown using FIG. 16 to FIG.
  • a signal processing circuit such as a single or array of a FET sensor with a pore of the present invention and an ADC unit for converting a signal detected by the sensor is provided, and the signal output there 2 is a block diagram of a system in which the number of charge carriers detected as a dimer, that is, the number of molecules to be detected is displayed on the PC is sent to a PC 601.
  • a sensor array By using a sensor array, molecules to be detected can be analyzed in parallel, so the number of detected signals increases, and as a result, the reliability of the analysis results can be improved. Since the sensor array, ADC, and other peripheral signal processing circuits are formed on a single chip, a small module can be formed, and the entire system can be downsized. Further, the manufacturing cost can be reduced by integration.
  • FIG. 17 a chip 603 in which a sensor with a pore or an array part and a part of a peripheral circuit are formed and a chip 604 in which an ADC or other signal processing circuit is formed are connected on a board 602, and an output signal is obtained.
  • FIG. 3 is a block diagram of a system that displays on a PC the number of detected charge carriers detected as dimers, that is, the number of molecules to be detected, that are sent to the PC.
  • the sensor part is made different from the main part of the sensor part and the signal processing circuit. It is recommended that only the chip be replaced. By doing so, the cost of analysis can be reduced.
  • FIG. 18 a single or small array of FETs with pores and a chip 605 on which an ADC or other signal processing circuit is formed are arranged on a board 602 to make a chip parallel, and the output signal is sent to a PC as a dimer.
  • a PC as a dimer.
  • a single or small array of FETs with pores and ADCs and peripheral signal processing circuits are formed on a single chip.
  • the manufacturing load can be reduced, the chip can be easily manufactured, and the yield is improved accordingly.
  • the parallel number of sensors can be determined according to the desired analysis, the cost for the analysis can be reduced.
  • FIGS. 19A and 19B are block diagrams of a system in which a chip 606 mainly composed of a single FET or a small array of pores and an ADC and peripheral signal processing circuit units 607 and 608 are separately formed and connected on a board.
  • the charge carrier 704 is bound to the nucleic acid molecule 701 to be detected.
  • the end of the nucleic acid molecule 701 is modified, and the second functional group 703 that specifically binds to the introduced first functional group 702 is previously bound to the charge carrier 704.
  • biotin can be used as the first functional group 702
  • avidin or streptavidin can be used as the second functional group 703.
  • a method of binding biotin to the terminal of the nucleic acid molecule for example, a method of binding biotinylated oligo to the terminal using an enzyme such as Terminal-deoxynucleotidyl-transferase can be used.
  • polystyrene beads coated with avidin or streptavidin are selected from commercially available products.
  • a commercial product of a product group such as Fluorosphere manufactured by Invitrogen Corporation can be used.
  • the charge carrier 704 (the second functional group 703 bound to the surface) in an amount 10 times, more preferably 100 times the amount of the nucleic acid molecule 701 to which the first functional group 702 has been added, As easily estimated from the Poisson probability, a plurality of nucleic acid molecules 701 are not fixed to 7041 charge carriers, and 90% or more of the charge carriers 704 to which the nucleic acid molecules 701 are fixed have one nucleic acid molecule 701. A charge carrier (708 in FIG. 20) in which only molecules are fixed can be obtained.
  • first functional group 702 and the second functional group 703 the combination of biotin and avidin or streptavidin described above can be easily used.
  • the dimer 707 can be obtained by hybridizing the charge carrier complex 705 prepared in advance with the charge carrier 708 to which only one molecule of the nucleic acid molecule 701 is fixed.
  • the charge carrier complex 705 it is not necessary that only one molecule of the nucleic acid probe molecule 706 is immobilized, and that a plurality of nucleic acid probe molecules 706 are immobilized on the charge carrier 704. This is preferable.
  • the charge carrier complex 705 is reacted in an excess amount, preferably about 10 times more than the charge carrier 708 in which only one molecule is immobilized, in hybridization. .
  • the obtained dimer 707 can be detected with high sensitivity as described in Example 1 using the method and detection device described in Example 1, and in particular based on the amount of charge passing through the pore.
  • the unreacted monomer and the dimer 707 reflecting the abundance of the nucleic acid molecule 701 to be detected can be clearly identified and detected based on the current change amount.
  • the charge carrier 804 is separately bonded to each of the first protein 801 and the second protein 802. Therefore, the first functional group 805 is bound to the proteins 801 and 802, and the second functional group 803 that specifically binds to the first functional group 805 is bound to the charge carrier 804.
  • biotin can be used for the first functional group 805, and when producing a protein in a cell-free expression system, it is preferable to express biotin together at the C-terminus or N-terminus.
  • biotin can be easily introduced by using a commercially available reagent (RTS AviTag E. coli biotinylation kit manufactured by Roche Diagnostics).
  • Avidin or streptavidin can be used as the second functional group 803.
  • polystyrene beads are used as the charge carrier 804
  • polystyrene beads having a surface coated with avidin or streptavidin can be selected from commercially available products.
  • a commercial product of a product group such as Fluorosphere manufactured by Invitrogen Corporation can be used.
  • the first protein complex 806 and the second protein complex 807 are obtained by separately fixing the first protein 801 and the second protein 802 to the charge carrier 804, respectively.
  • the dimer 808 is obtained by reacting both.
  • the obtained dimer 808 can be detected with high sensitivity as described in Example 1 using the method and detection device described in Example 1, and the first protein 801 and the second protein can be detected. Whether there is an interaction between 802 can be evaluated with high sensitivity.
  • This evaluation method can also be used as a method for simply screening whether a specific protein contains a protein having an interaction with a specific protein.
  • the first solution tank 901 and the second solution tank 902 are separated by a support 903, and the detection device is provided in contact with the first solution tank 901 on the support 903.
  • the support 903 is provided with a through hole (not shown), and the through hole and the pore of the detection device are aligned and fixed so as to be in close contact with the support.
  • the through hole is preferably larger than the diameter of the pore, and the through hole and the center of the pore are preferably aligned.
  • the support 903 is joined to the solution tank main body by a joint 904.
  • the detection device is provided with wiring for measuring a change in current generated between the source and the drain. Further, only one detection device may be disposed on the support 903, or a plurality of detection devices may be disposed. When a plurality of detection devices are provided, if each detection device can individually measure an electric signal generated between the source and the drain, measurement processing can be performed in parallel.
  • the sample solution containing the analysis object is supplied from the liquid supply unit 909 to the first solution tank 901 through the liquid supply port 906 via the valve 908.
  • the liquid feeding unit 909 includes means (not shown) for mixing, reacting and purifying the sample biomolecule and the charge carrier with antibody.
  • the reaction can be carried out at room temperature, but if it is necessary to maintain the temperature at 37 degrees, it is preferable to provide a temperature controller.
  • the purification when magnetic fine particles are used as the charge carrier, the purification can be easily performed by applying a magnetic field from the outside.
  • the sample solution is introduced into the first solution tank 901 in a state where the sample to be measured and the reagent are mixed.
  • the cleaning liquid is supplied from the cleaning liquid unit 910 to the second solution tank 902 through the liquid supply port 906 via the valve 908.
  • This washing solution is used to wash away the sample solution that has moved from the first solution vessel 901 to the second solution vessel 902 through the pores of the detection device.
  • Both the waste liquid of the sample and the cleaning liquid are drained from the waste liquid port 907 via the valve 908.
  • An electrode 905 is arranged in each solution tank, and a voltage generated by a voltage applying device 913 controlled by the PC 911 via a wiring 916 is passed through the electrode 905 to the first solution tank 901 and the second solution tank 902. Applied between. A dimer of charge holding bodies contained in the sample solution in the first solution tank 901 is detected on the support 903 from the first solution tank 901 to the second solution tank 902 by an applied electric field. Transported through device pore. An electrical signal generated when the charge holding member passes through the pore of the detection device is sent to the PC 911 through the wiring 914, and data processing is performed.
  • the wiring 914 is connected to the source and drain of the detection device, acquires an electric signal generated when the charge holding body passes through the pore, and transmits it to the PC 911. By distinguishing and detecting the difference in electrical signal between when the dimer passes and when the single substance passes, and counting the number of dimers passing through the pores, the measurement object contained in the sample solution is counted. Calculate the amount.
  • the temperature and pH of the solution tank are controlled by the control device 912 controlled by the PC 911 via the wiring 915.
  • Biomolecules are detected by the detection apparatus having the above configuration.
  • the physical size of the charge carrier is used instead of the charge amount, and the charge carrier dimer passes through the pore when the charge carrier complex through the biomolecule passes through the pore.
  • Formation of the dimer of the charge carrier via the biomolecule to be detected can be performed in the same manner as in the method described in Example 1.
  • the first solution tank 901 and the second solution tank 902 are separated by a support 903, and the thin film 917 having a pore is provided in contact with the first solution tank 901 on the support 903.
  • the support 903 is provided with a through hole, and is arranged in such a manner that the hole and the pore of the thin film 917 are aligned.
  • the diameter of the pore is larger than the diameter of the charge holding member to be used and smaller than twice the diameter. Further, the thickness of the film is preferably not more than twice the diameter of the charge holding body in order to clearly distinguish the charge holding body complex from the single charge holding body.
  • the support 903 is joined to the solution tank main body by the joint 904.
  • the sample solution is supplied from the liquid supply unit 909 to the first solution tank 901 through the liquid supply port 906 via the valve 908.
  • the liquid feeding unit 909 includes means (not shown) for mixing, reacting and purifying the sample biomolecule and the charge carrier with antibody.
  • the reaction can be carried out at room temperature, but if it is necessary to maintain the temperature at 37 degrees, it is preferable to provide a temperature controller.
  • the purification when magnetic fine particles are used as the charge carrier, the purification can be easily performed by applying a magnetic field from the outside.
  • polymer fine particles, proteins or nucleic acid molecules are used for the charge carrier, purification using a membrane is required, and it is preferable to use a suction device.
  • sodium chloride and potassium chloride are preferably adjusted to a concentration of 1 mM to 500 mM.
  • the cleaning liquid is supplied from the cleaning liquid unit 910 to the second solution tank 902 through the liquid supply port 906 via the valve 908.
  • the waste liquid of the sample solution and the cleaning liquid is discharged from the waste liquid port 907 via the valve 908.
  • An electrode 905 is arranged in each solution tank, and a voltage generated by a voltage applying device 913 controlled by the PC 911 via a wiring 916 is passed through the electrode 905 to the first solution tank 901 and the second solution tank 902. Applied between.
  • a sample charge carrier dimer prepared in the same manner as described in Example 1 is placed on the support 903 from the first solution tank 901 to the second solution tank 902 by an applied electric field.
  • the thin film 917 having pores is transported through the pores.
  • the current flowing between the first solution tank 901 and the second solution tank 902 is measured by an ammeter 918.
  • An electric signal generated from the ammeter 918 is sent to the PC 911 through the wiring 919, and data processing is performed.
  • the temperature and pH of the solution tank are controlled by the control device 912 controlled by the PC 911 via the wiring 915.
  • the ammeter 918 measures the current generated by the passage of electrolyte cations or anions through the pore.
  • the current value is decreased because the charge carriers physically block the pores.
  • the amount of decrease in the current value depends on the physical size of the charge carrier passing therethrough. Therefore, the amount of current decrease clearly differs depending on whether the charge carrier is a simple substance or a dimer.

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Abstract

　本発明の目的は、事前の試料の濃度調整の必要がなく、広いダイナミックレンジで、高感度、かつ、高スループットに生体分子を検出する方法及び装置を提供することにある。本発明は、検出対象の生体分子に電荷保持体を特異的に結合させ、その複合体が微小なポアを通過する際に生じる電流変化を計測し、検出対象の生体分子を一分子ずつ検出する。検出部をアレイ化することにより、高スループットに生体分子試料を検出することが可能となる。

Description

生体分子検出方法、生体分子検出装置、および分析用デバイス
　本発明は、電流計測を用いた生体分子検出方法及び装置に関する。
　血漿、リンパ液、組織液などの体液中に含まれるサイトカイン、ホルモン、タンパク質、核酸等の生体分子の量を定量すること、または体液中に含まれる微量の生体分子を検出することは、疾病の早期診断あるいは病態の正確な把握に必要不可欠である。
　がん（非特許文献１）、神経系の疾患（非特許文献２）、感染症の感染初期時（非特許文献３）の場合には、血清中に存在するタンパク質は10-16から10-12Mの濃度だと考えられている。通常、生体分子の定量または検出には主にＥＬＩＳＡ法、化学発光法あるいはフローサイトメーターを用いたビーズアッセイ等が行われているが、検出感度は低くても10-12M程度であり（非特許文献４）、疾病の早期診断への適用は非常に限られていた。
　例えば、通常の血液検査を想定し、被験者の血清試料を50ul程度だとすると、10-17M（10aM）のマーカーの場合、約300分子しか存在せず、濃度を測定するというよりも、分子の数を数える技術が必要であるが、そのような技術は、現時点では実用化されているものはなく、aMオーダーの検出感度を持つ検出技術の実用化が待たれていた。
　特許文献１にはフローサトメトリーを用いて抗原を捕捉した微粒子の数を求める方法が開示されている。
　また、近年、100ul中に10-20分子だけ存在する試料（濃度換算で10-19M）でも抗原-抗体反応を用いて検出可能なdigital ELISAの手法が提案された（非特許文献５）。この方法は、抗体を固定した磁気微粒子によって抗原（検出対象生体分子）を捕捉した後、ビオチン付き第二の抗体を反応させ、さらに、ストレプトアビジン付きガラクトシダーゼを反応させ、磁気微粒子上に酵素を導入する。次に、この微粒子を、光ファイバーの束の末端をエッチングしてアレイ状に微小な穴を設けたものに入れ、これに化学発光基質を作用させることで、光ファイバーを通してその化学発光輝点数を求め、抗原の分子数を数えるというものである。
特許第4748542号
Srinivas, P.R., Kramer, B.S. & Srivastava, S. Trends in biomarker research for cancer detection. Lancet Oncol. 2, 698-704 （2001）. Galasko, D. Biomarkers for Alzheimer’s disease - clinical needs and application.　　J. Alzheimers Dis. 8, 339-346 （2005）. Barletta, J.M., Edelman, D.C. & Constantine, N.T. Lowering the detection limits of HIV-1 viral load using real-time immuno-PCR for HIV-1 p24 antigen. Am. J. Clin. Pathol. 122, 20-27 （2004）. Giljohann, D.A. & Mirkin, C.A. Drivers of biodiagnostic development. Nature 462, 　　461-464 （2009）. David M Rissin et al, Nature Biotechnology, 28, 1641 （2010）. Fologea D.et al., Appl Phys Lett., 91, 053901-3 （2007）. Romero-Cano, M. S. et al., Journal of Colloid and Interface Science, 198, 266-272 （1998）.
　特許文献１に開示された方法では、光学系を考慮すると並列化は現実的ではなく、測定に時間を要する可能性がある　また、非特許文献５に開示された方法では、ある程度の並列処理は可能であるが、一度の検出で検知可能な分子数は、光ファイバーの数、つまりアレイ状の微小な穴の数によって制限される。そのため、試料濃度が低い場合には、濃縮が必要であり、逆に、濃度が高い場合には希釈する必要があるなど、検出前の濃度調整が必要になるという、実用上、処理が煩雑になるという問題点が残されていた。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、検出対象の生体分子を一分子ずつカウントする方法を提供し、特に、試料濃度の事前調整をする必要がなく、作業が簡便な検出方法を提供するものである。
　本発明の発明者らは、鋭意研究の結果、検出対象の生体分子に対して一分子ずつ分子数を数える方法で、かつ、その数える分子数に制限のない方法を開発した。
　具体的には、検出用の抗体を多数固定化した電荷保持体上に、生体分子を捕捉させた後、電荷保持体上に第二の抗体を固定化したものと反応させることにより、生体分子を介して二つの電荷保持体がつながった電荷保持体の会合体を作り、電界効果型トランジスタとポアを組合わせた検出部を基板上に多数設けたデバイスを用いて、電荷保持体会合体を並列的に検出する方法であり、検出部を多数設けることで、検出対象分子数が増えても十分に対応が可能となる。
　本発明では、従来の検出方法では実現できない、検出対象の生体分子を一分子ずつその分子数を数えることで検出する方法を提供するものである。
　特に、電界効果型トランジスタを用いて検出することで、検出部の並列化が容易であり、検出を容易に高速化できる。例えば、１mm角の基板上に、１umピッチで電界効果型トランジスタとポアを容易に作ることができ、例えば、ポアを通過する電荷保持体複合体を１秒間に10万個検出することは容易であるので、10分間に、平均的に6×1013個の電荷保持体複合体を検出できる。検体を例えば血清50ulとすれば、モル濃度として、高濃度として1uMから低濃度は1aM（30分子/50ul）まで広範囲に同じ方法で計測することができる。
　また、電界効果型トランジスタにおける、ポアを電荷保持体が通過することで生じる電流変化を検出するため、光学系は一切必要ではなく、従来の蛍光検出に比べて装置の小型化が容易であり、また、安価に製造できる。
本発明の検出方法の一例を説明するための図である。 本発明の検出デバイスの構成の一例を説明するための図である。 本発明の検出デバイスの構成の一例を説明するための図である。 本発明の検出デバイスのコンセプトを説明する図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの製法を示す図である。 本発明の検出デバイスの構成を説明する図である。 本発明の検出デバイスの構成を説明する図である。 本発明の検出デバイスの構成を説明する図である。 本発明の検出デバイスの構成を説明する図である。 本発明の検出方法の一例を説明するための図である。 本発明の検出方法の一例を説明するための図である。 本発明の検出装置の構成の一例を説明するための図である。 本発明の検出方法及び装置の構成の一例を説明するための図である。
　本実施例では、検出対象の生体分子と、前記生体分子に対する第一の抗体を表面に有する電荷保持体と、前記生体分子に対する２次抗体を表面に有する電荷保持体を反応させ、前記電荷保持体の個々の電荷量を測定することにより、前記電荷保持体の複合体を検出し、前記生体分子の存在量を評価することを特徴とする、生体分子検出方法を開示する。ここで、生体分子の存在量の評価とは、分子の個数を計数することを意味する。従い、測定対象が液体であって全体の容積や量が分かっている場合には、濃度の計測と同意義である。
　また、他の実施例では、検出対象の生体分子と、前記生体分子に対する第一の抗体を表面に有する電荷保持体と、前記生体分子に対する２次抗体を表面に有する電荷保持体を反応させて得られる反応液を、基板表面上に対抗する２つの電極を設け、前記電極の間に前記基板を貫通するポアを設けた基板に対して、片面側からもう片面側に前記貫通したポアを通して流し、前記電極間の電流測定により、前記電荷保持体の複合体を検出し、前記生体分子の存在量を評価することを特徴とする、生体分子検出方法を開示する。
　また、実施例では、基板表面上に絶縁膜、コントロールゲート、ソース、ドレイン、チャネル、そして前記コントロールゲート、前記ソース、前記ドレイン、前記チャネルがのる平面に対して、その平面の片面側からもう片面側へ貫通したポアを設けており、前記コントロールゲートにより前記チャネルに電界効果を及ぼす電界効果トランジスタであり、前記貫通したポアは、前記コントロールゲートのうち前記チャネル側の側面と、前記チャネルのうち前記コントロールゲート側の側面近傍の間に配置されており、前記貫通したポアに前記反応液を流し入れ、前記ソースから前記ドレインに流れる電流の変化で、前記電荷保持体の複合体を検出し、前記生体分子の存在量を評価することを特徴とする、生体分子検出方法を開示する。
　また、実施例では、前記電荷保持体が、磁気微粒子、高分子微粒子、タンパク質、核酸から選ばれたものであることを特徴とする、生体分子検出方法を開示する。
　また、実施例では、検出対象の生体分子と、前記生体分子に対する第一の抗体を表面に有する電荷保持体と、前記生体分子に対する２次抗体を表面に有する電荷保持体を反応させる手段と、前記電荷保持体の個々の電荷量を測定する手段を具備することを特徴とする、生体分子検出装置を開示する。
　また、実施例では、前記電荷保持体の個々の電荷量を測定する手段として、電界効果トランジスタと貫通したポアを具備したデバイスを用いることを特徴とする、生体分子検出装置を開示する。
　また、実施例では、第１の溶液槽と、第２の溶液槽と、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽とを区切る膜と、前記膜には貫通したポアが設けてあり、前記貫通したポアを物質が移動することで生じる電流を測定する電極が第１の溶液槽と第２の溶液槽に設けてある装置を用い、検出対象の生体分子と、前記生体分子に対する第一の抗体を表面に有する電荷保持体と、前記生体分子に対する２次抗体を表面に有する電荷保持体を反応させて得られる反応液を、前記第１の溶液槽に入れて、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽の間に流れる電流の変化を検出することで、前記電荷保持体の複合体を検出し、前記生体分子の存在量を評価することを特徴とする、生体分子検出方法を開示する。
　また、実施例では、前記生体分子検出方法において、前記貫通したポアの直径が、使用する電荷保持体の直径より大きく、直径の２倍よりも小さいことを特徴とする。さらに、膜の厚みが前記電荷保持体の直径の２倍以下であるとなお良い。
　また、実施例では、前記生体分子検出方法において、前記電荷保持体が、磁気微粒子、高分子微粒子、タンパク質、核酸から選ばれたものであることを特徴とする、生体分子検出方法を開示する。
　また、実施例では、第１の溶液槽と、第２の溶液槽と、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽とを区切る膜と、前記膜には貫通したポアが設けてあり、前記貫通したポアを物質が移動することで生じる電流を測定する電極が第１の溶液槽と第２の溶液槽に設けてある設備と、検出対象の生体分子と、前記生体分子に対する第一の抗体を表面に有する電荷保持体と、前記生体分子に対する２次抗体を表面に有する電荷保持体を反応させる手段と、前記第１の溶液槽に入れて、前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽の間に流れる電流の変化を検出する手段を具備することを特徴とする、生体分子検出装置を開示する。
　本実施の形態を説明するための全図において同一機能を有するものは同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。実施例に記載するデバイス構造および材料は、本発明の思想を具現化するための一例であり、材料および寸法などを厳密に特定するものではない。
　図１の模式図を使って、本発明の概念を説明する。
　図１（ａ）には、検出対象の生体分子101に対して、特異的に結合する第一の抗体102と第二の抗体104を反応させて生成される、サンドイッチ複合体105を示す。第一の抗体102と第二の抗体104には予め、官能基103を結合させておく。反応方法としては、第一の抗体102にモノクローナル抗体を、第二の抗体104にポリクローナル抗体を用い、それぞれを順次反応させることが、サンドイッチ複合体105を効率よく得るために、好ましい。
　図1（b）にには、上記図１（a）で生成されるサンドイッチ複合体105と電荷複合体107によって生成される二量体109を示す。電荷保持体107とサンドイッチ複合体105とを結合させるために、官能基103と特異的に結合する結合分子108を予め電荷保持体107に結合しておく。例えば、官能基103にはビオチンを、結合分子108にはアビジンあるいはストレプトアビジンを用いることができる。
　サンドイッチ複合体105に対して結合分子108を表面に修飾した電荷保持体107を反応させることで、生体分子101をサンドイッチ状に挟んだ電荷保持体107の二量体109を得ることができる。
　生体分子101の濃度に対して10倍、より好ましくは100倍以上の濃度の第一の抗体102と第二の抗体104を反応させることが、サンドイッチ複合体105を効率よく得るために好ましい。
　サンドイッチ複合体105に対して電荷保持体107を反応させる際には、電荷保持体107の濃度をサンドイッチ複合体105の濃度の10倍以上、より好ましくは100倍以上多い条件で反応させることで、電荷保持体107一つ当たりに複数のサンドイッチ複合体105が付くことを十分に低く抑えることができ好ましい。以上のように、生体分子101をサンドイッチ状に挟んだ電荷保持体107の二量体109を得た後、検出デバイス114を用いて生体分子101の存在する分子数を計測する。
　検出デバイス114は、検出のスループットに合わせて複数個を支持体113上に配置する。支持体113は、第一溶液槽111と第二溶液槽112を隔てて配置する。検出デバイス114には、基板119上にソース116、ドレイン117、コントロールゲート115、チャネル121が設けられている。ポア118は基板119を貫通する孔であり、コントロールゲート115とチャネル121の間の、基板119上あるいは、チャネル121を全部あるいは一部含む箇所に設けられている。
　生体分子101をサンドイッチ状に挟んだ電荷保持体107の二量体109と、二量体以外の反応物110を含む反応液を第一溶液槽111に入れ、第一溶液槽111と第二溶液槽112の間に、例えば、電場を印可することで電荷保持体107を含む反応物を、第一溶液槽111から第二溶液槽112へ、ポア118を経由させて移動させる。検出デバイス114は、コントロールゲート115によりチャネル121に電界効果を及ぼす電界効果トランジスタである。チャネル121近傍にポア118が設けてあり、ポア118を電荷保持体107が通過することで、ソース116からドレイン117に流れる電流の変化を測定することで、電荷保持体107の通過を検出する。
　本デバイスによれば、電荷保持体107が単体の状態で通過するのか、あるいは、生体分子101をサンドイッチ状に挟んだ電荷保持体107の二量体109で通過するのかを識別し、二量体109の個数を計数することで、生体分子101の存在数を評価することができる。未反応物106や二量体以外の反応物110と、二量体109は電流変化量を測定することで十分識別できる。
　電荷保持体107には、ポリスチレン等の高分子からなる微粒子を用いることができる。表面にカルボキシル基を導入しその密度を制御することで表面に帯電される負電荷量をコントロールできる。あるいは、高分子微粒子の表面にアミノ基を導入すれば、正電荷を保持することができ、そのアミノ基の密度を制御することで正の電荷量をコントロールできる。
　また、電荷保持体107には、タンパク質を用いることができる。例えば、BSA（ウシ血清アルブミン）を用いると負に帯電した電荷保持体として使用できる。高分子からなる微粒子を用いる場合には、凝集を十分抑制するか、または、凝集物を予め十分除去してから用いる必要がある。さもないと、生体分子101をサンドイッチ状に挟んだ電荷保持体107の二量体109か、凝集物かの判断が困難になる恐れがある。一方、電荷保持体107にタンパク質を用いる場合には、凝集物の存在は問題にならないという利点がある。中でも、球状タンパク質が水に対する溶解性などの点から好ましい。
　電荷量は正、負、どちらも用いることができ、電荷量は大きいことが好ましく、この点からは、ポリスチレン等の高分子からなる微粒子を用いることが好ましい。
　単独の一量体の電荷保持体107が連なってポアに侵入すると、二量体との識別が困難になる恐れがあるが、電荷保持体107の電荷量が大きくなるほど静電反発により電荷保持体107同士が二量体と同等な距離には存在しにくくなり、そのようなエラーの発生を抑えることができる。
　電荷保持体107の直径は、ポア118の直径よりは小さければよい。より好ましくは、液中での分散性、拡散の速度の点から小さいものが好ましく、10um以下、より好ましくは2um以下が好ましい。
　ポア118の直径は、電荷保持体107の直径よりも大きい径を有することが必要である。また、未反応の一量体と、生体分子と結合した二量体10を区別する必要があることから、電荷保持体107の直径の2倍以下の大きさを有することが好ましい。
　チャネル121を流れる電流は、ポア118を通過する電荷保持体107の実効電荷量や実効電界が引き起こす電界の変化によって変化し、その変化を検出することで電荷保持体107が単体か二量体かを識別する。チャネル121を流れる電流層の厚みを出来るだけ薄くして、電荷保持体107１個が引き起こす電界変化に由来した電流を検出する必要がある。そのためには、チャネル121の厚みを薄くする必要がある。チャネル121の厚みは、電荷保持体107の直径よりも薄ければ、ポア118を通過する電荷保持体107を一個ずつ検出することが可能であり、二量体119と二量体以外の反応物110を識別することができる。
　検出デバイス114の詳細な構成図を図2に示す。
　絶縁膜200、チャネル201、コントロールゲート202、ソース203、ドレイン204、バックゲート205、ポア206、202-205へのコンタクトとなる配線207を備える。
　ポアはコントロールゲートのチャネル側の側面と、チャネルのコントロールゲート側の側面の間（図2A）、もしくはチャネルのコントロールゲート側の端（図2B）、もしくはチャネルのコントロールゲート側の側面近傍でチャネル中にある（図2C）。
　たとえばチャネル201はノンドープのシリコンもしくはP型のシリコンもしくは低濃度のN型シリコンとし、コントロールゲート202,バックゲート205はN型またはP型のシリコン、ソース203,ドレイン204はN型のシリコンとする。
　ソース-ドレインに、ソース電圧＜ドレイン電圧となるように電圧をかけた状態で、コントロールゲート電圧を制御することで、本デバイスはトランジスタ動作をする。いわゆるサイドゲート型のトランジスタである。トランジスタがON状態のとき、コントロールゲート側（ポア側）のチャネル側部に反転層が誘起されるため、電流はコントロールゲート側のチャネル側部を流れる。反転層の厚みはコントロールゲート電圧にもよるが、きわめて薄く、2-3 nm程度以下である。
　以上のような構成のもと、反転層効果と厚み方向における量子井戸の閉じ込め効果を利用することで、薄膜のチャネルの側壁部に擬1次元的な最細の電流パスを形成することが出来る。擬1次元的な最細の電流パスであるため、ポア中の対象物による微小な電界変化に極めて敏感に反応する。そのため検出信号の変化比（検出感度）を極めて高くすることが出来る。
　チャネルの電流は、コントロールゲートの電界で誘起される電子によるものである。従ってポアはコントロールゲートとチャネルの電流パスの間に配置するのがよい。そうすることで、ポア中の対象物による電位変化が、コントロールゲートとチャネル間の電界を極めて効果的に変調し、その変化をチャネル電流に反映することが出来る。
　ポアは、チャネル中の側部の電流パスに近いほど検出感度を向上できる。その最たるものは、たとえば図2B,図2Cのように、チャネル側部の一部がポアの一部となっている構造、もしくはチャネル側部にきわめて近い場所にポアがある構造がそれである。一方で、たとえば、コントロールゲート側のチャネル側部の電流パスとバックゲートの間にポアを配置しても、ポア中の対象物による電流変化はきわめて小さい。バックゲート側にポアを配置しても、コントロールゲートがチャネルに作る電界は、ほぼ変調できないからである。
　以上よりポアの配置に望ましい領域を、図3の領域300に示す。ポアの配置は、コントロールゲートとチャネル側部の間およびチャネル側部の擬1次元的な最細の電流パスの中がよい。
　図2Bおよび図2Cのように、チャネルの一部がポア領域となっている場合、非常に高感度なセンシングが可能である。一方で、図2Aのようにチャネルとポアが絶縁膜で分離されている場合、チャネルが直接対象物や対象物を含む溶液に触れないため、チャネルの腐食やチャネル表面状態の変異などの可能性が低く、デバイスとしての信頼性が高くなる。
　また電流パスのチャネル幅方向の広がりをさらに押さえ、よりチャネル側部に安定した一次元的な電子伝導パスを形成するために、バックゲート205に電圧を印加し、電子がよりコントロールゲート側に集中するような電界制御が有効である。
　図４は、本デバイスにおいて破線で区切られた部分を、ポアを挟んだ2つの容量としてモデル化した図である。
　C1はコントロールゲートとポア間の破線で区切られた部分の容量、C2はポアとチャネル間の破線で区切られた部分の容量である。形成するデバイスとして例えば、ポア径を20 nm, コントロールゲートとポア間の距離を50 nm, チャネルとコントロールゲートの厚みを3 nm, コントロールゲートとポア間の絶縁膜として酸化膜（比誘電率3.9）をもちいた場合、ポアを四角柱で近似しその一辺を20 nmとすると、C1は約2.76×10-19 Fである。
　ポア中の電荷量変化をΔQとすると、ポア近傍のチャネル端のしきい値電圧シフトΔVthは式（１）のように表される。
ΔVth＝ΔQ/C1    ・・・式（1）
　電荷保持体として球状タンパクのBSA（ウシ血清アルブミン、直径：7～8nm）を用いるとすると、非特許文献６より、pH7でのBSAの表面電荷量は-18eであることから、直径20nmのポアをBSA１個が通過する場合と２個通過する場合の差分は、ΔVth = 10.4 Vとなり、非常に大きなしきい値シフトの差が得られる。
　また、電荷保持体として直径40nm程度のポリスチレンビーズを用いた場合、例えば、非特許文献7より過硫酸カリウムを開始剤に用いた場合のポリスチレンの表面電荷密度（-3.2μC/cm2）からビーズの表面電荷量は、凡そ1.6×10-16Cと見積もられ、ポア径を80nmとした前記デバイスの構成の場合には、ポリスチレンビーズ１個が通過する場合と２個通過する場合の差分として、ΔVth = 36.2Vとなり、非常に大きなしきい値シフトの差が得られる。
　本デバイスではこの理想的なしきい値電圧シフトに近い値を実現できる。その理由として、まず電流パスとして薄膜チャネルの端にきわめて細い一次元的電子伝導を形成しているため、ポア近傍のチャネルの端における電界変化（しきい値変化）は、ほぼトランジスタのしきい値変化に反映される（チャネルが厚く、電流パスの厚み方向の幅が広い場合には、単一電荷が近くに来ても、その電荷から遠い部分を電流が流れてしまうため、大きなしきい値シフトは得られない。またチャネルの幅方向全面に電流が流れていても同様であり、大きなしきい値シフトは得られない。本デバイスの構成と動作方式だからこそ、このような大きなしきい値シフトに近い値が実現できる）。
　また、ポアとチャネルを近づける、もしくはポアとチャネルを接触させることで、コントロールゲートとチャネル間の電界のうち、ポアの脇からチャネルへまわりこんで来る電界を遮断することが出来る。その結果、ポア中の電界変調をチャネルにもれなく伝えることができ、上記のようなきわめて大きいしきい値シフトに近い値を実現できる。
　以上のように、電荷保持体としてタンパクや高分子微粒子を用いることで、単体で通過する場合と二量体として通過する場合では、本発明の検出デバイスにより、大きな電位差が検出され、両者を十分な検出感度で検出・識別することができることが分かる。
　コントロールゲートを一定電圧にしての検出において、ポアを通過する電荷保持体が引き起こす電流変化は、ポア-チャネル間距離や、ポア-コントロールゲート間距離の調整で可能であり、ポア-コントロールゲート間の距離を長くすれば、電荷保持体が引き起こす電流変化は大きくなる。また、（1）式より、ポアとコントロールゲート間の誘電率をさげることでも、電荷保持体が引き起こす電流変化は大きくなる。さらに、pHを調整することで、電荷保持体の実効電荷量を調節し、電流変化を大きくすることも可能である。このように、検出感度を向上させられるのも本デバイスの特筆すべき利点である。これはポアが、チャネル電流パスとコントロールゲートの間に配置されることで得られる特徴である。なおポア-コントロールゲート間距離は、使用可能電圧や、耐圧なども総合的に考慮して、もっとも検出感度のよい距離に設定する。
　また、本デバイスにおいてバックゲートは、必ずしも必要というわけではない。バックゲートの効果は、電流パスをよりポア側に集中することが可能であることや、しきい値電圧の調整が行えることである。
　本実施例では、本発明に用いる検出デバイスを作製するプロセスの一例を、図５～図１４を用いて示す。
　当然ながら、本発明の製法を本プロセスに限定するものではない。プロセスフローは各図について、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）という形式で示す。（ｃ）は上面図、（ａ）は（ｃ）におけるA-A’断面図、（ｂ）は（ｃ）におけるB-B’断面図である。
　プロセス１：Si基板208上にSiN膜209、SiO2膜210を堆積する。たとえばSiN膜15 nm、SiO2膜15 nmを堆積する。（図5）　プロセス２：N型のポリシリコン211を堆積し、コントロールゲート、バックゲート、ソース、ドレイン領域をパターニングする。たとえばN型のポリシリコンの堆積膜厚は100 nmとする。（図6）　プロセス３：ノンドープの薄膜ポリシリコン層212を形成する。形成方法は例えば、アモルファスシリコンを堆積した後、アニ－ルすることで結晶化して形成する方法や、アモルファスシリコンもしくはポリシリコンを堆積した後、酸化することで薄膜を形成する方法がある。これらの方法で、5 nm以下の薄膜シリコンチャネルを形成することが出来る。
（図7）　プロセス４：SiO2膜210を堆積する。例えば膜厚は10 nmとする。（図8）　プロセス５：ドライエッチにより、SiO2膜とノンドープポリシリコンをパターニングし、チャネルを形成する。またゲート、ソース、ドレイン領域にかぶさったノンドープシリコン層も図９のように加工する。（図9）　プロセス６：層間膜として、SiO2膜210、SiN膜209、SiO2膜210、SiN膜209を順に堆積する。例えば膜厚は、下からSiO2/SiN/SiO2/SiN = 20 nm/10 nm/150 nm/ 200 nmとする。（図10）　プロセス７：コントロールゲート、バックゲート、ソース、ドレインのコンタクトを形成する。配線207の材料は、例えばAlを用いる。（図11）　プロセス８：配線上の層間膜としてSiN膜209を形成し、その後、配線へコンタクトするためのパッド215を形成する。堆積膜厚は例えば200 nmとする。（図12）　プロセス９：チャネル上および近傍213をドライエッチングにより掘り込む。（図13）　プロセス１０： Siウエハ裏面をKOHやTMAH液を用いて異方性エッチングし、薄膜領域を形成する。エッチング時のマスクは例えばSiN膜を用いるのがよい。（図14）　プロセス１１：先に述べたとおりの領域（コントロールゲートとチャネル側部の間およびチャネル側部の擬1次元的な最細の電流パスが形成される領域）にポア214を形成する。
ポアの形成は、例えばTEMビームによるポアあけにより50 nm以下の微細なポアが形成できる。またドライエッチでポアを形成することで、ポアの径を50-1000nmで任意の大きさに成形することが出来る（図15）。望ましいポアの直径としては、分析に使用する電荷保持体の大きさに依存するが、電荷保持体が通過できるよう電荷保持体の直径よりも大きく形成する必要がある。また、一度に２つ以上の電荷保持体がポアを通過できてしまうと計測誤差が生じる可能性があるため、ポアの直径は電荷保持体の直径の２倍よりも小さいことが望ましい。
　図１５（ｃ）においてソース２１５Ａ、ドレイン２１５Ｂ、チャネル２１５Ｅを備える。ソース２１５Ａとドレイン２１５Ｂは逆転していてもよく、チャネル２１５Ｅ内をソース２１５Ａからドレイン２１５Ｂの方向に電子が流れる。また、ゲート２１５Ｃ、バックゲート２１５Ｄを備えるが、バックゲート２１５Ｄは無くても良い。ポア２１４はチャネル２１５Ｅとゲート２１５Ｃの間に形成される。
　以上のプロセスによって、本デバイスを形成することが出来る。なお上記プロセスではポリシリコンによるチャネル形成の例を示したが、SOIウエハをもちいてチャネル領域に相当する部分を、SOIの酸化と洗浄を繰り返して薄膜化して、トランジスタを形成することが出来る。精密な膜厚管理が必要となるが、単結晶Siがチャネルとなるため検出電流値が安定し、かつ増大する。検出信号の安定化は識別精度の向上を可能にし、検出電流値の増大は検出信号処理を容易にするため、検出信号処理の高速化が可能となる。
　本実施例では、図16から図19を用いて、本発明のデバイスと、その検出信号から検出対象分子の存在量を表示するまでの一連のシステムの例を示す。
　図16では、半導体基板の1チップ600上に、本発明のポア付きFETセンサの単体もしくはアレイと、センサで検出された信号を変換するADCユニットなどの信号処理回路を設け、そこで出力された信号をPC601へおくり、二量体として検出された電荷保持体の検出数、すなわち、検出対象の分子数をPCで表示するシステムのブロック図である。
　センサアレイとすることで、検出対象分子を並列で解析できるため、検出される信号の数が増え、その結果、解析結果の信頼性を向上することが出来る。1チップ上にセンサアレイとADC、ほか周辺信号処理回路を形成するため、小さなモジュールを形成することが出来、システム全体を小型化することが出来る。また集積化による製造コストの低コスト化が出来る。
　図17では、ポア付きセンサの単体もしくはアレイ部分と周辺回路の一部を形成したチップ603と、ADCやその他信号処理回路を形成したチップ604とを、ボード602上でつなぎ、出力される信号をPCへおくり、二量体として検出された電荷保持体の検出数、すなわち、検出対象の分子数をPCで表示するシステムのブロック図である。
　計測精度を向上させるためにポアつきFETセンサ部分を取り替える頻度が多い場合は、このようにセンサ部分が主となるチップと、信号処理の回路が主となる部分を作り分けることで、センサ部分のチップのみを取り替えられるようにしておくとよい。そうすることで解析にかかる費用を低減することが出来る。
　図18では、ポア付きFETの単品もしくは少数のアレイと、ADCやその他信号処理回路を形成したチップ605をボード602上に並べてチップパラレルとし、そこで出力される信号をPCへおくり、二量体として検出された電荷保持体の検出数、すなわち、検出対象の分子数をPCで表示するシステムのブロック図である。
　ポア付きFETの大規模なアレイとADCや周辺信号処理回路を１チップ上に集積するのに比べて、ポア付きFETの単品もしくは少数のアレイとADCや周辺信号処理回路を1チップ上に形成するほうが、製造負荷の低減ができ、チップ製造が容易となり、それに伴って歩留まりも向上する。また所望の解析に応じて、センサの並列数を決めることが出来るため、解析にかかる費用を低減することが出来る。
　図19Aおよび図19Bは、ポア付きFETの単品もしくは少数のアレイが主であるチップ606と、ADCや周辺信号処理回路部607,608を別に形成し、ボード上で接続するシステムのブロック図である。
　ポア付きFETの単品もしくは少数のアレイと、ADCや周辺信号処理回路を別に形成するため、製造負荷の低減ができ、個々のチップの製造がさらに容易となり、それに伴って歩留まりも向上する。またポアつきFETセンサ部分のチップのみ取替えができる。その場合、特に劣化した一部のみのセンサ部分の交換が可能となるため、より解析費用の低減に貢献できる。
　検出対象の生体分子として、核酸を対象とした、本発明の検出方法について図20の模式図を使って説明する。
　検出対象の核酸分子701に対して、電荷保持体704を結合させる。その方法の一つとして、核酸分子701の末端を修飾し、導入した第一の官能基702と特異的に結合する第二の官能基703を予め電荷保持体704に結合させておく。例えば、第一の官能基702としてビオチン、第二の官能基703としてアビジンあるいはストレプトアビジンを用いることができる。核酸分子の末端にビオチンを結合する方法には、例えば、Terminal deoxynucleotidyl transferaseなどの酵素を用いてビオチン化オリゴを末端に結合する方法を用いることができる。第二の官能基703としてアビジンあるいはストレプトアビジンを用いる方法としては、例えば、電荷保持体704としてポリスチレンビーズを用いる場合には、アビジンあるいはストレプトアビジンを表面にコートしたポリスチレンビーズを市販品の中から選ぶことができる。例えば、インビトロジェン社製フルオロスフィアなどの製品群の市販品を用いることができる。
　第一の官能基702を付加した核酸分子701に対して10倍量、より好ましくは100倍量の電荷保持体704（第二の官能基703を表面に結合したもの）を反応させることで、ポアソン確率から容易に推測されるように、電荷保持体704１個に複数の核酸分子701が固定されることなく、核酸分子701が固定された電荷保持体704の90％以上が核酸分子701が一分子だけ固定された電荷保持体（図20の708）を得ることができる。
　検出対象の核酸分子701と相補の塩基配列を有する核酸プローブ分子706を第一の官能基702及び第二の官能基703を介して結合した電荷保持体704を予め作製しておく。第一の官能基702及び第二の官能基703には、先述したビオチンとアビジンあるいはストレプトアビジンの組合せを用いることが容易にできる。
　この予め作製しておいた、電荷保持体の複合体705を、核酸分子701が一分子だけ固定された電荷保持体708とハイブリさせることによって、二量体707を得ることができる。
　電荷保持体の複合体705においては、核酸プローブ分子706は一分子だけ固定されている必要はなく、電荷保持体704に対して複数の核酸プローブ分子706が固定されていることが、ハイブリの効率の点で好ましい。二量体707を効率よく得るために、ハイブリに際して、電荷保持体の複合体705は、一分子だけ固定された電荷保持体708に比べて過剰量、好ましくは10倍程度多く反応させることが好ましい。
　得られた二量体707は、実施例1に述べた方法及び検出デバイスを用いて、実施例１に述べたように感度良く、検出することができ、特に、ポアを通過する電荷量に基づく電流変化量により、未反応の一量体と、検出対象の核酸分子701の存在量を反映した二量体707を明確に識別して検出することができる。
　タンパク質間の相互作用の有無を調べる、本発明の検出方法について図21の模式図を使って説明する。
　第一のタンパク質801と第二のタンパク質802の各々に対して、別々に電荷保持体804を結合させる。そのため、第一の官能基805をタンパク質801,802に結合させ、第一の官能基805と特異的に結合する第二の官能基803を電荷保持体804に結合させる。
　例えば、第一の官能基805にはビオチンを用いることができ、タンパク質を無細胞発現系で作る際に、ビオチンをＣ末端あるいはＮ末端に一緒に発現させることが良い。例えば、市販の試薬（Roche Diagnostic社製RTS AviTag E. coliビオチン化キット）を使うことにより、容易にビオチンを導入することができる。
　第二の官能基803としてアビジンあるいはストレプトアビジンを用いることができる。例えば、電荷保持体804としてポリスチレンビーズを用いる場合には、アビジンあるいはストレプトアビジンを表面にコートしたポリスチレンビーズを市販品の中から選ぶことができる。例えば、インビトロジェン社製フルオロスフィアなどの製品群の市販品を用いることができる。
　第一のタンパク質801と第二のタンパク質802の各々を別々に電荷保持体804に固定することで、第一のタンパク複合体806と第二のタンパク複合体807を得る。両者を反応させることで、二量体808を得る。
　得られた二量体808は、実施例1に述べた方法及び検出デバイスを用いて、実施例１に述べたように感度良く、検出することができ、第一のタンパク質801と第二のタンパク質802の間に相互作用があるかどうか、感度良く評価することができる。
　この評価方法は、特定のタンパク質に対して、それと相互作用を有するタンパク質が特定のライブラリに含まれているかどうかを簡便にスクリーニングする方法として用いることもできる。
　本発明の検出装置の構成について、図22を用いて説明する。
　第一溶液槽901と第二溶液槽902は支持体903で隔てられており、検出デバイスは支持体903上の第一溶液槽901に接する配置で設けられている。支持体903には図示していない貫通孔が設けてあり、その貫通孔と検出デバイスのポアとの位置が合い、支持体に密着するように固定されている。なお、貫通孔はポアの直径よりも大きく、貫通孔とポアの中心は一致するように設けられていることが望ましい。支持体903は溶液槽本体と接合部904によって接合している。
　検出デバイスには、図示しないが、ソースとドレイン間に生じる電流の変化を計測するような配線が設けられている。また、支持体903上に一つの検出デバイスのみを配置してもよいし、複数の検出デバイスを配置しても良い。複数の検出デバイスを設ける場合には、夫々の検出デバイスについて個別にソースとドレイン間に生じる電気信号を計測可能にしておけば、同時並行的に計測処理することが可能となる。
　分析対象物を含む試料溶液は送液ユニット909からバルブ908を介して送液口906を通して第一溶液槽901に供給される。送液ユニット909には、試料の生体分子と抗体付き電荷保持体を混合・反応・精製する手段（図示せず）が具備されている。混合には、攪拌子を用いたものや超音波を用いたものなどを用いることができる。反応は常温で行うことができるが、37度に保持する必要がある場合には温調機を具備することが好ましい。精製では、電荷保持体に磁気微粒子を用いた場合には、外部から磁場を与えることで精製が容易に可能である。高分子微粒子、タンパクや核酸分子を電荷保持体に用いた場合には、メンブレンを用いた精製が必要になり、吸引装置を用いることが好ましい。試料溶液は、測定対象の試料と試薬を混合した状態で第一溶液槽901に導入される。
　洗浄液は洗浄液ユニット910からバルブ908を介して送液口906を通して第二溶液槽902に供給される。この洗浄液は、検出デバイスのポアを通じて第一溶液槽901から第二溶液槽902に移動した試料溶液を洗い流すために使用される。試料および洗浄液の廃液はいずれも、バルブ908を介して廃液口907から廃液される。
　各溶液槽には電極905が配置されており、配線916を介してＰＣ911でコントロールされた電圧印可装置913で作られた電圧が電極905を介して、第一溶液槽901と第二溶液槽902の間に印可される。第一溶液槽901中の試料溶液内に含まれる電荷保持体の二量体は、印可された電場によって、第一溶液槽901から第二溶液槽902へ、支持体903上に配置された検出デバイスのポアを介して輸送される。電荷保持体が検出デバイスのポアを通過することにより生じる電気信号は配線914を通じてＰＣ911に送られ、データ処理が行われる。
　なお、配線914は検出デバイスのソース、ドレインに接続されており、電荷保持体がポアを通過することにより生じる電気信号を取得し、PC911に送信する。二量体が通過した場合と単体が通過した場合の電気信号の違いを識別して検出し、二量体がポアを通過した数をカウントすることで、試料溶液中に含まれる測定対象物の量を算出する。
　配線915を介してＰＣ911でコントロールされた制御装置912によって溶液槽の温度、pHは制御される。以上の構成を有する検出装置によって、生体分子の検出が実施される。
　本発明の検出方法及び装置の他の構成について、図23を用いて説明する。
　本実施例では、電荷保持体の電荷量の代わりにその物理的な大きさを利用して、生体分子を介した電荷保持体複合体がポアを通過する際に、電荷保持体の二量体が物理的にポアを塞ぐことにより生じる、ポア中を流れる電流の変化を検出することで、生体分子の存在を検知し、その存在量を求める方法を開示する。
　検出対象の生体分子を介する電荷保持体の二量体の形成は、実施例１に記載した方法と同様に行うことができる。
　第一溶液槽901と第二溶液槽902は支持体903で隔てられており、ポアを有する薄膜917は支持体903上の第一溶液槽901に接する配置で設けられている。支持体903には貫通孔が設けてあり、その孔と薄膜917のポアとの位置が合うような配置で設けられている。
　なお、ポアの直径は使用する電荷保持体の直径より大きく、直径の２倍よりも小さい。
また、前記膜の厚さは電荷保持体の直径の２倍以下であることが、電荷保持体の複合体と、単独の電荷保持体とを明確に識別する上で好ましい。
　支持体903は溶液槽本体と接合部904によって接合している。
　試料溶液は送液ユニット909からバルブ908を介して送液口906を通して第一溶液槽901に供給される。送液ユニット909には、試料の生体分子と抗体付き電荷保持体を混合・反応・精製する手段（図示せず）が具備されている。混合には、攪拌子を用いたものや超音波を用いたものなどを用いることができる。反応は常温で行うことができるが、37度に保持する必要がある場合には温調機を具備することが好ましい。精製では、電荷保持体に磁気微粒子を用いた場合には、外部から磁場を与えることで精製が容易に可能である。高分子微粒子、タンパクや核酸分子を電荷保持体に用いた場合には、メンブレンを用いた精製が必要になり、吸引装置を用いることが好ましい。
　試料溶液には予め、電解質を溶かしておく。例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを1mM-500mMの濃度に調整しておくことが好ましい。
　洗浄液は洗浄液ユニット910からバルブ908を介して送液口906を通して第二溶液槽902に供給される。
　試料溶液および洗浄液の廃液はバルブ908を介して廃液口907から廃液される。
　各溶液槽には電極905が配置されており、配線916を介してＰＣ911でコントロールされた電圧印可装置913で作られた電圧が電極905を介して、第一溶液槽901と第二溶液槽902の間に印可される。
　実施例１で説明した方法と同様に作製された試料の電荷保持体の二量体は、印可された電場によって、第一溶液槽901から第二溶液槽902へ、支持体903上に配置された、ポアを有する薄膜917のポアを介して輸送される。第一溶液槽901と第二溶液槽902の間に流れる電流は電流計918で計測される。電流計918より生じる電気信号は配線919を通じてＰＣ911に送られ、データ処理が行われる。配線915を介してＰＣ911でコントロールされた制御装置912によって溶液槽の温度、pHは制御される。
　電流計918では、電解質の陽イオンあるいは陰イオンがポアを通過することにより生じる電流が計測される。電荷保持体がポアを有する薄膜917のポアを通過する際、電荷保持体が物理的にポアを塞ぐため、電流値は減少することになる。その電流値の減少量は、通過する電荷保持体の物理的な大きさに依存する。そのため、電荷保持体が単体か二量体かによって明確に電流の減少量が異なる。
　したがって、その電流値の減少量を測定することで二量体が通過したか単体が通過したかを明確に識別できる。また、その電流減少は経時変化としてはスパイク状に生じることから、通過する二量体の数を明確に計数することができる。以上のような方法、構成を有する検出装置によって、生体分子の検出が実施できる。
101：生体分子、102：第一の抗体、103：官能基、104：第二の抗体、105：サンドイッチ複合体、106：未反応物、107：電荷保持体、108：結合分子、109：二量体、110：二量体以外の反応物、111：第一溶液槽、112：第二溶液槽、113：支持体、114：検出デバイス、115：コントロールゲート、116：ソース、117：ドレイン、118：ポア、119：基板、120：反応液の流れ、121：チャネル
200：絶縁膜、201：チャネル、202：コントロールゲート、203：ソース、204：ドレイン、205：バックゲート、206：ポア、207：コンタクト、配線、208：Si基板、209：シリコン窒化膜、210：シリコン窒化膜、211：ポリシリコン、212：ポリシリコン、214：ポア、215：パッド
300：ポア配置領域
600：半導体基板チップ、601：PC、602：ボード、603：ポア付きセンサの単体もしくはアレイ部分と周辺回路の一部を形成したチップ、604：ADCやその他信号処理回路、605：ポア付きFETの単品もしくは少数のアレイと、ADCやその他信号処理回路を形成したチップ、606：ポア付きFETの単品もしくは少数のアレイが主であるチップ、607：ADCや周辺信号処理回路部、608：ADCや周辺信号処理回路部
701：核酸分子、702：第一の官能基、703：第二の官能基、704：電荷保持体、705：電荷保持体複合体、706：核酸プローブ分子、707：二量体、708：電荷保持体、
801：第一のタンパク質、802：第二のタンパク質、803：第二の官能基、804：電荷保持体、805：第一の官能基、806：第一のタンパク複合体、807：第二のタンパク複合体、808：二量体
901：第一溶液槽、902：第二溶液槽、903：支持体、904：接合部、905：電極、906：送液口、907：廃液口、908：バルブ、909：送液ユニット、910：洗浄液ユニット、911：ＰＣ、
912：制御装置、913：電圧印可装置、914：配線、915：配線、916：配線
917：ポアを有する薄膜、918：電流計、919：配線

Claims (15)

  1. 検出対象の生体分子と、前記生体分子に対する第一の抗体を表面に有する電荷保持体および、前記生体分子に対する第二の抗体を表面に有する電荷保持体を前記生体分子と反応させて、前記電荷保持体を含む複合体を形成し、
    前記生体分子と複合体を生成した電荷保持体の電荷量を測定することで、前記複合体を検出することを特徴とする、生体分子検出方法。
  2. 請求項１に記載の生体分子検出方法において、
    対向する二つの電極を第一の平面上に有し、前記第一の平面から他の平面へと貫通するポアを有する基板を用いて、
    前記複合体を含む反応液を前記基板のポアを通して前記第一の平面と前記他の平面の間で移動させ、
    その際に前記電極間の電流を測定して前記電荷保持体の複合体を検出することを特徴とする、生体分子検出方法。
  3. 請求項２に記載の生体分子検出方法において、
    前記基板は、第一の平面上に、絶縁膜、コントロールゲート、ソース、ドレイン、チャネル、および、当該第一の平面側から他の平面側へ貫通したポアを有し、前記コントロールゲートにより前記チャネルに電界効果を及ぼす電界効果トランジスタであって、
    前記ポアは、前記コントロールゲートのうち前記チャネルに面した側の側面と、前記チャネルのうち前記コントロールゲートに面した側の側面近傍の間に配置されており、
    前記ポアに前記反応液を通過させ、
    前記ソースから前記ドレインに流れる電流の変化を計測することで、前記電荷保持体の複合体を検出し、前記生体分子の存在量を評価することを特徴とする、生体分子検出方法。
  4. 請求項１に記載の生体分子検出方法において、
    第１の溶液槽と第２の溶液槽との間に配置され、基板上にソース、ドレイン、チャネル、コントロールゲート、およびポアを有するデバイスを備え、
    前記複合体を含む試料溶液を前記第１の溶液槽に導入し、
    前記ポアを複合体が通過することにより生じる電気信号の変化を検出し、
    検出した電気信号変化から複合体を検出して前記生体分子の存在量を評価することを特徴とする、生体分子検出方法。
  5. 請求項４記載の生体分子検出方法において、
    前記ポアの直径が前記電荷保持体の直径よりも大きく、かつ、当該電荷保持体の直径の２倍以下であり、
    前記仕切りの厚みが前記電荷保持体の直径の２倍以下であることを特徴とする、生体分子検出方法。
  6. 請求項１に記載の生体分子検出方法において、
    前記電荷保持体が、磁気微粒子、高分子微粒子、タンパク質、核酸の少なくともいずれかであることを特徴とする、生体分子検出方法。
  7. 検出対象の生体分子と、前記生体分子に対する第一の抗体を表面に有する電荷保持体および前記生体分子に対する第二の抗体を表面に有する電荷保持体を反応させて生成した複合体の電荷量を１つずつ測定する測定手段として、電界効果トランジスタと貫通したポアを具備したデバイスを備えたことを特徴とする、生体分子検出装置。
  8. 請求項７に記載の生体分子検出装置において、
    前記電界効果トランジスタは基板上にソース、ドレイン、チャネル、およびコントロールゲートを備え、
    前記ポアは前記電界効果トランジスタのコントロールゲートとチャネルの間に配置されることを特徴とする、生体分子検出装置。
  9. 請求項７に記載の生体分子検出装置において、
    前記複合体を検出する生体分子検出装置であって、
    第１の溶液槽と、
    第２の溶液槽と、
    前記第１の溶液槽と前記第２の溶液槽との仕切りと、
    前記仕切りに設けられた貫通孔と、
    試料溶液を、前記貫通孔を介して前記第一の溶液槽から前記第二の溶液槽に移送する移送手段と、
    前記第一の溶液槽から前記第二の溶液槽に電荷保持体が移動することにより生じる電気信号の変化を検出する検出手段を具備することを特徴とする、生体分子検出装置。
  10. 請求項９記載の生体分子検出装置であって、
    前記検出手段は、基板の上に形成されたソース、ドレイン、チャネル、およびコントロールゲートを備え、
    前記貫通孔と前記ポアが同じ位置に配置するよう構成したことを特徴とする生体分子検出装置。
  11. 請求項１０に記載の生体分子検出装置において、
    前記ポアの直径が前記電荷保持体の直径よりも大きく、かつ、当該電荷保持体の直径の２倍以下であり、
    前記仕切りの厚みが前記電荷保持体の直径の２倍以下であることを特徴とする、生体分子検出装置。
  12. 請求項９記載の生体分子検出装置において、
    試料の生体分子と電荷保持体を混合して、前記複合体を含む試料溶液を作成する機構と、
    当該機構から試料溶液を前記第一の溶液槽に導入する試料溶液導入手段と、
    前記第一の溶液槽から前記第二の溶液槽に試料溶液中の複合体を移動させる移動手段と、
    を備えたことを特徴とする生体分子検出装置。
  13. 請求項１２記載の生体分子検出装置において、
    前記第二の溶液槽に洗浄液を導入する洗浄液導入手段と、
    前記第二の溶液槽から廃液を外部に排出する排出手段と、を備えたことを特徴とする生体分子検出装置。
  14. 請求項１０記載の生体分子検出装置において、
    前記移動手段は前記第一の溶液槽および前記第二の溶液槽に電界をかける電極であることを特徴とする生体分子検出装置。
  15. 電荷保持体に標的分子を保持させた複合体の存在量を測定する分析用デバイスであって、
    基板上に生成されたコントロールゲート、ソース、ドレイン、およびチャンネルと、
    基板を貫通するように形成されたポアを有し、
    前記ポアの直径は、前記電荷保持体の直径よりも大きく、当該電荷保持体の直径の２倍よりも小さいことを特徴とする分析用デバイス。
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