JP6829867B2 - 測定方法、及び測定システム - Google Patents

測定方法、及び測定システム Download PDF

Info

Publication number
JP6829867B2
JP6829867B2 JP2016212608A JP2016212608A JP6829867B2 JP 6829867 B2 JP6829867 B2 JP 6829867B2 JP 2016212608 A JP2016212608 A JP 2016212608A JP 2016212608 A JP2016212608 A JP 2016212608A JP 6829867 B2 JP6829867 B2 JP 6829867B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
complex
measurement
dissociation
carrier
passing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016212608A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018072181A (ja
Inventor
達樹 松野
達樹 松野
伸一郎 比企
伸一郎 比企
朗弘 岡
朗弘 岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HU Group Research Institute GK
Original Assignee
HU Group Research Institute GK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HU Group Research Institute GK filed Critical HU Group Research Institute GK
Priority to JP2016212608A priority Critical patent/JP6829867B2/ja
Priority to EP17865465.3A priority patent/EP3534153A4/en
Priority to PCT/JP2017/039057 priority patent/WO2018079761A1/ja
Publication of JP2018072181A publication Critical patent/JP2018072181A/ja
Priority to US16/397,705 priority patent/US20190277840A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP6829867B2 publication Critical patent/JP6829867B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/12—Coulter-counters
    • G01N2015/1029—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)

Description

本発明は、測定方法、及び測定システムに関する。
従来、試料中に含まれる生体分子の個数を測定する技術の一つとして、生体分子を磁気微粒子に特異的な反応によって結合させ、当該結合させた生体分子を蛍光標識したプローブ分子に特異的な反応によって結合させ、当該結合させたものを支持基体上に複数固定し、当該固定されたもの（具体的には、プローブ分子）から生じる蛍光の個数を検出し、当該検出した個数を生体分子の個数として測定する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
国際公開第２０１３／０５１６５１号
しかしながら、上記従来の方法においては、上記蛍光を検出する場合において、例えば磁気微粒子と非特異的な反応によって結合したプローブ分子が支持基体上に存在する場合には、このプローブ分子がノイズになることから、磁気微粒子及びプローブ分子と特異的な反応によって結合した生体分子の個数を正確に測定することが難しくなるので、測定の精度を向上させる観点から改善の余地があった。
本発明は、上記従来技術における課題を解決するためのものであって、測定の精度を向上させることが可能になる、測定方法及び測定システムを提供することを目的とする。
上述した課題を解決し、目的を達成するために、請求項１に記載の測定方法は、試料に含まれる測定対象を測定する測定方法であって、前記測定対象を所定の担体と反応させることにより得られる複合体を基板に設けられたポアに通過させる通過工程と、前記通過工程において前記複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記複合体の大きさを測定する測定工程と、前記測定工程において測定された前記複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する特定工程と、を含み、前記複合体は、前記測定対象と、前記測定対象と結合可能な第１担体と、前記測定対象と結合可能な第２担体とを有し、前記通過工程の前に、前記複合体から前記第１担体を解離することで解離複合体を生成する解離工程を含み、前記通過工程において、前記解離工程において生成された前記解離複合体を、前記ポアに通過させ、前記測定工程において、前記通過工程において前記解離複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記解離複合体の大きさを測定し、前記特定工程において、前記測定工程において測定された前記解離複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する。
請求項２に記載の測定システムは、試料に含まれる測定対象を測定する測定システムであって、ポアが形成された基板と、前記測定対象を所定の担体と反応させることにより得られる複合体を、前記ポアに通過させる通過手段と、前記通過手段にて前記複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記複合体の大きさを測定する測定手段と、前記測定手段にて測定された前記複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する特定手段と、を備え、前記複合体は、前記測定対象と、前記測定対象と結合可能な第１担体と、前記測定対象と結合可能な第２担体とを有し、前記複合体から前記第１担体を解離することで解離複合体を生成する解離手段を備え、前記通過手段は、前記解離手段にて生成された前記解離複合体を、前記ポアに通過させ、前記測定手段は、前記通過手段にて前記解離複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記解離複合体の大きさを測定し、前記特定手段は、前記測定手段にて測定された前記解離複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する。
請求項１に記載の測定方法及び請求項２に記載の測定システムによれば、複合体を電気泳動等によってポアに通過させる通過工程と、通過工程において複合体をポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、複合体の大きさを測定する測定工程と、測定工程において測定された複合体の大きさに基づいて、測定対象の個数を特定する特定工程と、を含むので、従来技術（蛍光標識したプローブ分子の蛍光を検出して測定対象の個数を測定する技術）に比べて、上記蛍光の個数を測定するのではなく、複合体の大きさに基づいて複合体の個数を測定するため、例えば、複数の複合体（すなわち、担体と特異的な反応によって結合した測定対象）やプローブ分子のみと非特異的に結合した複数の担体をポアに通過させた場合でも、複合体の個数のみを正確に測定することができる。よって、測定の精度を向上させることが可能となる。
また、請求項１に記載の測定方法及び請求項２に記載の測定システムによれば、複合体は、測定対象と、第１担体と、第２担体とを有し、通過工程の前に、複合体から第１担体を解離することで解離複合体を生成する解離工程を含み、通過工程において、解離工程において生成された解離複合体を、電気泳動等によってポアに通過させ、測定工程において、通過工程において解離複合体をポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、解離複合体の大きさを測定し、特定工程において、測定工程において測定された解離複合体の大きさに基づいて、測定対象の個数を特定するので、第２担体と特異的な反応によって結合した測定対象の個数のみを正確に測定でき、測定の精度を一層向上させることが可能となる。また、解離複合体の大きさが複合体の大きさに比べてばらつきにくいことから、特定工程において測定対象の個数を特定しやすくなるので、測定の精度をさらに一層向上させることが可能となる。
本発明の実施の形態１に係る測定システムを例示する概要図である。 複合体テーブルの構成例を示す図である。 第１反応工程の概要を示す概要図である。 第２反応工程の概要を示す概要図であり、（ａ）は第２担体側抗体と結合された第２担体を加える前の状態を示す図であり、（ｂ）は第２担体側抗体と結合された第２担体を加えた後の状態を示す図である。 通過工程の概要を示す概要図であり、（ａ）は複合体をポアに通過させる前の状態を示す図であり、（ｂ）は複合体をポアに通過させた後の状態を示す図である。 実施の形態２に係る解離工程の概要を示す概要図である。 図６のＡ領域の拡大図であり、（ａ）は、複合体から第１担体が解離する状況を示す図であり、（ｂ）は解離複合体が生成された状態を示す図である。 通過工程の概要を示す概要図であり、（ａ）は解離複合体をポアに通過させる前の状態を示す図であり、（ｂ）は解離複合体をポアに通過させた後の状態を示す図である。 実施例１（実施の形態１に係る測定方法）の実験結果を示すグラフであって、第１試験体に関する試験体の大きさ毎の実験結果と、第２試験体に関する試験体の大きさ毎の実験結果とを示すグラフである。 実施例２（実施の形態２に係る測定方法）の実験結果を示す表であって、第１試験体から第５試験体の実験結果を示す表である。
以下に添付図面を参照して、この発明に係る測定方法及び測定システムの実施の形態を詳細に説明する。まず、〔I〕実施の形態の基本的概念について説明した後、〔II〕実施の形態の具体的内容について説明し、最後に、〔III〕実施の形態に対する変形例について説明する。ただし、実施の形態によって本発明が限定されるものではない。
〔I〕実施の形態の基本的概念
まず、実施の形態の基本的概念について説明する。実施の形態は、概略的に、試料に含まれる測定対象を測定するための測定方法及び測定システムに関するものである。
ここで、「試料」とは、検査や分析の対象になる材料を意味し、実施の形態では、測定対象及び溶媒を含んで構成されている。また、「測定対象」とは、試料に含まれる物質のうち測定の目標となる物質を意味し、例えば、抗原、生体分子、タンパク質、核酸、低分子等を含む概念である。また、「溶媒」とは、試料に含まれる物質のうち分量（分子数）が最も多い物質を意味し、例えば、測定対象を所定の担体と反応させることが可能であり、且つ、電流を通すことが可能な反応液（一例として、抗原抗体反応液等）を含む概念である。ここで、「所定の担体」とは、測定対象を固定する土台となる粒子を意味し、実施の形態では、第１担体及び第２担体を含む概念である。このうち、「第１担体」とは、測定対象と結合可能な粒子を意味し、例えば、磁性粒子、樹脂、カーボン材料、無機物、有機物、合金等を含む概念である。また、「第２担体」とは、測定対象と結合可能な粒子であって、好ましくは第１担体よりも小さい粒子を意味し、例えば、金ナノ粒子、蛍光色素、磁性粒子、樹脂、カーボン材料、無機物、有機物、合金等を含む概念である。測定対象と第１担体（または第２担体）との結合は、測定対象と粒子との直接的な結合であってもよいが、好適には、第１担体（または第２担体）に予めプローブ分子、抗体、結合タンパク質等を固相化させ、該プローブ分子、抗体等を介して測定対象と結合させる、間接的な結合である。また、この測定方法の種類は任意であり、例えば、１ステップ競合法、１ステップサンドイッチ法、ディレイ１ステップ法、２ステップサンドイッチ法、あるいは希釈２ステップ法等をいずれも用いることができる。以下、実施の形態では、測定対象を抗原とし、溶媒を抗原抗体反応液とし、第１担体を抗体（以下、「第１担体側抗体」と称する）と予め結合された磁性粒子とし、第２担体を抗体（以下、「第２担体側抗体」と称する）と予め結合されたナノ粒子とし、複合体を第１担体、第１担体側抗体、測定対象、第２担体側抗体、及び第２担体によって生成された生成物として、２ステップサンドイッチ法を用いて測定対象を測定する場合を例示して説明する。
また、実施の形態１に係る測定方法については、概略的には、１）第１担体側抗体と結合された第１担体を試料に加えることにより、試料に含まれる測定対象を第１担体側抗体と反応（抗原抗体反応）させることで、この測定対象を第１担体に結合させる「第１反応工程」、２）第２担体側抗体と結合された第２担体を試料に加えることにより、第１反応工程において第１担体側抗体と結合された測定対象を第２担体側抗体と反応（抗原抗体反応）させることで、この測定対象を第２担体に結合させる「第２反応工程」、３）第２反応工程において生成された複合体（すなわち、第１担体、第１担体側抗体、測定対象、第２担体側抗体、及び第２担体）を後述するポアに通過させる「通過工程」、４）通過工程において後述するポアを通過した複合体の大きさを測定する「測定工程」、５）測定工程において測定された複合体の大きさに基づいて、測定対象の個数を特定する「特定工程」を順次行う。
また、実施の形態２に係る測定方法については、概略的には、上記実施の形態１に係る測定方法と同様に、１）「第１反応工程」、２）「第２反応工程」を順次行った後、３）第２反応工程において生成された複合体から第１担体を解離することで解離複合体を生成する「解離工程」、４）解離工程において生成された解離複合体を後述するポアに通過させる「通過工程」、５）通過工程において後述するポアを通過した解離複合体の大きさを測定する「測定工程」、６）測定工程において測定された解離複合体の大きさに基づいて、測定対象の個数を特定する「特定工程」を順次行う。ここで、「解離複合体」は、例えば、第１担体側抗体、測定対象、第２担体側抗体、及び第２担体から構成されるもの（以下、「第１解離複合体」と称する）や、第１担体側抗体のみから構成されるもの（以下、「第２解離複合体」と称する）等を含む概念である。
〔II〕実施の形態の具体的内容
次に、実施の形態の具体的内容について説明する。
〔実施の形態１〕
まず、実施の形態１について説明する。この実施の形態１は、複合体の大きさに基づいて測定対象の個数を特定する形態である。
（構成）
最初に、実施の形態１に係る測定システムの構成について説明する。図１は、本発明の実施の形態１に係る測定システムを例示する概要図である。図１に示すように、測定システム１は、概略的に、後述する図３の反応槽１０、検出機構２０、及び制御装置５０を備えて構成されている。また、これら構成要素のうち、検出機構２０の後述する第１電極部、後述する第２電極部、及び後述する検出部の各々と制御装置５０とは、配線（図示省略）を介して電気的に接続されている。
（構成−反応槽）
後述する図３の反応槽１０は、後述する図４（ｂ）の複合体７８を生成するための容器であり、例えば、ガラス材料、樹脂材料、セラミックス（窒化ケイ素、塩化ケイ素等）、金属材料、無機材料や有機材料等にて形成された公知の反応槽等を用いて構成されており、検出機構２０の近傍位置に設けられている。
（構成−検出機構）
図１に戻り、検出機構２０は、後述する図５の収容部３０内の電気的変化（例えば、電流の変化等）を検出する機構であり、載置台（図示省略）、収容部３０、後述する図５の基板４０、通過部（図示省略）、及び検出部（図示省略）を備えている。
（構成−検出機構−載置台）
載置台は、収容部３０を載置するための台であり、例えば、公知の載置台等を用いて構成されており、図示しない設置面上に載置されている。
（構成−検出機構−収容部）
図５の収容部３０は、基板４０を収容するための収容手段であり、下側収容部３１及び上側収容部３２を備えている。下側収容部３１は、上面が開放された中空形状で形成されており、載置台の上面に載置されている。上側収容部３２は、下面が開放された中空形状で形成されており、上側収容部３２の開放部分（上側収容部３２の下端部）が下側収容部３１によって覆われるように設けられている。
（構成−検出機構−基板）
基板４０は、収容部３０の下側収容部３１と上側収容部３２とを仕切るための板である。この基板４０は、例えば任意の平面形状（例えば、十字状、矩形状、円形状等）を有する板状体にて形成されており、当該基板４０の少なくとも一部が収容部３０に収容されるように、略水平に設けられている。当該基板４０の厚さは、後述するポア４１の直径と同等かそれ以下であることが好ましい。例えば、Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ ＮＡＮＯ Ｖｏｌ．６， Ｎｏ．４， ｐｐ．３４９９−３５０５（２０１２）に記載の低アスペクト比ポアのように、ポアの直径と比して厚みの薄い基板を用いてもよい。基板４０の厚さを低減することで、通過する粒子の状態（大きさ、形状等）をより精細に解析することができ、粒子上に存在する測定対象の個数をより高精度で測定することができる。
また、後述する図５に示すように、基板４０にはポア４１が形成されている。ポア４１は、複合体７８を通過させるための貫通孔である。このポア４１は、例えば略円形状にて形成されており、例えば基板４０の中央部分に配置されている。また、このポア４１の具体的な形状及び大きさについては任意であるが、実施の形態１では、複合体７８を確実に通過させることができると共に、検出部の検出感度を所定値以上に維持できるように、複合体７８の最大径と略同一又は若干大きな形状に設定されている。
また、この基板４０の材質については、耐薬品性に優れ、且つ電気を通さない材質である限り任意に形成することができ、例えば、ガラス材料、樹脂材料、セラミックス（窒化ケイ素、塩化ケイ素等）、金属材料、無機材料や有機材料等にて形成されている。
（構成−検出機構−通過部）
通過部は、複合体７８をポア４１に通過させる通過手段である。通過部は、好適には、複合体７８を電気泳動によってポア４１に通過させる構成を有し、第１電極部及び第２電極部を備える（いずれも図示省略）。
第１電極部は、例えば公知の電極部材等を用いて構成されており、基板４０よりも上方に設けられ、収容部３０の上側収容部３２内の溶液に接するように配置されている。
第２電極部は、第１電極部がプラス極の場合はマイナス極またはグランド極、第１電極部がマイナス極の場合はプラス極またはグランド極、第１電極部がグランド極の場合はプラス極またはマイナス極となる電極部である。第２電極部は、例えば公知の電極部材等を用いて構成されており、基板４０よりも下方に設けられ、下側収容部３１内の溶液に接するように配置されている。
（構成−検出機構−検出部）
検出部は、収容部３０内の電気的変化（実施の形態では、電流の変化等）を検出する検出手段である。この検出部は、例えば公知の電流計測センサ等を用いて構成されており、収容部３０の内部又は収容部３０の外部であって収容部３０近傍位置に設けられており、収容部３０（又は図示しない支持部材）に対して固定具等によって固定されている。
（構成−制御装置）
図１に戻り、制御装置５０は、測定システム１を制御する装置であり、図１に示すように、操作部５１、出力部５２、電源部５３、制御部５４、及び記憶部５５を備えている。なお、この制御装置５０は、例えば公知のパーソナルコンピュータ等によって構成することができるので、その詳細な説明は省略する。
（構成−制御装置−操作部）
操作部５１は、各種の情報に関する操作入力を受け付けるための操作手段である。この操作部５１は、例えば、タッチパッド、リモートコントローラの如き遠隔操作手段、あるいはハードスイッチ等、公知の操作手段を用いて構成されている。
（構成−制御装置−出力部）
出力部５２は、制御部５４の制御に基づいて各種の情報を出力する出力手段であり、例えば液晶ディスプレイや有機ＥＬディスプレイの如きフラットパネルディスプレイ等の公知の表示手段やスピーカー等の公知の音声出力手段等を用いて構成されている。
（構成−制御装置−電源部）
電源部５３は、商用電源（図示省略）から供給された電力又は当該電源部５３に蓄電された電力を、検出機構２０の通過部及び検出部、並びに制御装置５０の各部に供給する電力供給手段である。
（構成−制御装置−制御部）
制御部５４は、制御装置５０の各部を制御する制御手段である。この制御部５４は、具体的には、ＣＰＵ、当該ＣＰＵ上で解釈実行される各種のプログラム（ＯＳなどの基本制御プログラムや、ＯＳ上で起動され特定機能を実現するアプリケーションプログラムを含む）及びプログラムや各種のデータを格納するためのＲＡＭの如き内部メモリを備えて構成されるコンピュータである。
また、この制御部５４は、図１に示すように、機能概念的に、測定部５４ａ及び特定部５４ｂを備えている。測定部５４ａは、図５の系において複合体７８をポア４１に通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、複合体７８の大きさ（具体的には、複合体７８の体積）を測定する測定手段である。特定部５４ｂは、測定部５４ａにて測定された複合体７８の大きさに基づいて、後述する図３の測定対象７１の個数を特定する特定手段である。なお、この制御部５４によって実行される処理の詳細については後述する。また、「測定部５４ａ」及び検出機構２０の「検出部」は、特許請求の範囲における「測定手段」に対応する。
（構成−制御装置−記憶部）
記憶部５５は、制御装置５０の動作に必要なプログラム及び各種のデータを記録する記録手段であり、例えば、外部記録装置としてのハードディスク（図示省略）を用いて構成されている。ただし、ハードディスクに代えてあるいはハードディスクと共に、磁気ディスクの如き磁気的記録媒体、ＤＶＤやブルーレイディスクの如き光学的記録媒体、又はＦｌａｓｈ Ｒｏｍ、ＵＳＢメモリ、ＳＤカードの如き電気的記録媒体を含む、その他の任意の記録媒体を用いることができる。
また、図１に示すように、この記憶部５５は、複合体テーブル５５ａを備えている。複合体テーブル５５ａは、複合体７８を特定する情報（以下、「複合体情報」と称する）を格納する複合体情報格納手段である。
図２は、複合体テーブル５５ａの構成例を示す図である。図２に示すように、複合体テーブル５５ａは、項目「複合体の大きさ」、及び項目「測定対象の個数」と、各項目に対応する情報とを、相互に関連付けて構成されている。ここで、項目「複合体の大きさ」に対応する情報は、複合体７８の大きさを示す複合体大きさ情報であり、例えば、図２に示す複合体７８の大きさである「０−１３０」（これは、「０ｎｍ以上１３０ｎｍ未満」であることを示す）等が該当する。項目「測定対象の個数」に対応する情報は、測定対象７１の個数を示す測定対象個数情報であり、例えば、図２に示す測定対象７１の個数である「０」、「１」、「２」等が該当する。このような測定対象個数情報において、複合体７８の大きさに応じた測定対象７１の個数を設定している理由は、例えば、後述する図４（ａ）に示すように、１つの第１担体７３に対して１つの測定対象７１が結合されている複合体７８の大きさと、１つの第１担体７３に対して２つ（又は３つ）の測定対象７１が結合されている複合体７８の大きさとが異なることから、複合体７８の大きさに応じて第１担体７３に対して結合されている測定対象７１の個数を特定できるようにするためである。
（測定方法）
次に、このように構成された測定システム１を用いて行われる測定方法について説明する。図３は、第１反応工程の概要を示す概要図である。図４は、第２反応工程の概要を示す概要図であり、（ａ）は第２担体側抗体７５と結合された第２担体７６を加える前の状態を示す図であり、（ｂ）は第２担体側抗体７５と結合された第２担体７６を加えた後の状態を示す図である。図５は、通過工程の概要を示す概要図であり、（ａ）は複合体７８をポア４１に通過させる前の状態を示す図であり、（ｂ）は複合体７８をポア４１に通過させた後の状態を示す図である。以下の説明では、図３のＸ方向を測定システム１の左右方向（−Ｘ方向を測定ステムの左方向、＋Ｘ方向を測定システム１の右方向）、図３のＹ方向を測定システム１の上下方向（＋Ｙ方向を測定システム１の上方向、−Ｙ方向を測定システム１の下方向）、Ｘ方向及びＹ方向に直交する方向を前後方向（図３の紙面の手前側に至る方向を測定システム１の前方向、図３の紙面の奥側に至る方向を測定システム１の後方向）と称する。実施の形態１に係る測定方法は、上述したように、第１反応工程、第２反応工程、通過工程、測定工程、及び特定工程を含んでいる。以下では、各工程の詳細な内容について説明する。
（測定方法−第１反応工程）
最初に、第１反応工程について説明する。第１反応工程は、試料７０に含まれる測定対象７１を第１担体７３に結合させるために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、図３に示すように、測定対象７１と溶媒７２から構成される試料７０が収容されている反応槽１０の中に、第１担体側抗体７４と結合された第１担体７３を加えた後、この第１担体７３が加えられた試料７０を攪拌する。ここで、上記第１担体７３を加える量については任意であるが、例えば、試料７０に含まれる測定対象７１のすべてが第１担体側抗体７４と反応（抗原抗体反応）することが可能な量に設定しており、一例として、上記反応の効率を向上させるために、測定対象７１の量に対して上記第１担体７３の量を過剰な量（例えば、測定対象７１の量に対して１００倍の量等）に設定している（なお、後述する第２反応工程の第２担体７６を加える量についても同様とする）。次に、上記第１担体７３が加えられてから所定時間が経過するまで、上記攪拌した試料７０を所定温度（例えば、３７℃）で放置する。この所定時間については、具体的には、測定対象７１を第１担体側抗体７４と反応させるまでに要すると一般的に想定される時間以上の時間に設定している。続いて、上記所定時間が経過した後、試料７０のうち上記第１担体７３と反応しなかった物質を除去するために洗浄を行う。この洗浄方法については任意であるが、例えば、上記第１担体７３として磁性粒子を用いる場合には、反応槽１０の一部（一例として反応槽１０の側面部等）に設置された磁石（図示省略）によって、当該反応槽１０の一部に測定対象７１と反応した上記第１担体７３及び測定対象７１と反応しなかった上記第１担体７３を集磁させた状態で、溶媒７２等によって試料７０のうち上記第１担体７３と反応しなかった物質を洗い流す（なお、後述する第２反応工程の洗浄方法についても同様とする）。
（測定方法−第２反応工程）
次に、第２反応工程について説明する。第２反応工程においては、第１反応工程において反応された測定対象７１を第２担体７６に結合させるために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、図４（ａ）に示すように、反応槽１０の中に第２担体側抗体７５と結合された第２担体７６を加えた後、この第２担体７６が加えられた試料７０を攪拌する。次に、上記第２担体７６が加えられてから所定時間が経過するまで、上記攪拌した試料７０を所定温度（例えば、３７℃）で放置する。この所定時間については、具体的には、測定対象７１を第２担体側抗体７５と反応させるまでに要すると一般的に想定される時間以上の時間に設定している。続いて、上記所定時間が経過した後、測定対象７１と反応しなかった上記第２担体７６を除去するために洗浄を行う。
（測定方法−通過工程）
次に、通過工程について説明する。通過工程は、第２反応工程において生成された図４（ｂ）に示す複合体７８（第１担体７３、第１担体側抗体７４、測定対象７１、第２担体側抗体７５、及び第２担体７６）を基板４０のポア４１に通過させるために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、図示しない送液管（例えばピペット等）によって反応槽１０内から所定量の複合体７８及び溶媒７２を取り出し、当該取り出した複合体７８及び溶媒７２を検出機構２０の収容部３０内（具体的には、図５（ａ）に示す上側収容部３２内）に注入する。この場合において、例えば、試料７０の溶媒７２と略同一の成分を有する溶媒７２を収容部３０の下側収納部３１内にあらかじめ入れておくことが望ましい。次に、図５（ｂ）に示すように、制御装置５０の測定部５４ａによって、第１電極部及び第２電極部を介して収容部３０内に電流Ｃを所定時間流すことで上記注入された複合体７８を下方に移動させることにより（すなわち、電気泳動により）、当該複合体７８をポア４１に通過させる。この所定時間については、具体的には、上記注入された複合体７８の所定個数がポア４１を通過するまでに要すると一般的に想定される時間以上の時間に設定することが好ましい。この場合、上述した作業を、第２反応工程において生成された複合体７８の所定個数をポア４１に通過させるまで繰り返し行う。あるいは、通過する複合体７８の個数にかかわらず予め時間を設定しておき（例えば１０分間）、該設定時間内にポア４１を通過する複合体７８を解析する手法もとり得る。
（測定方法−測定工程）
次に、測定工程について説明する。測定工程は、複合体７８の大きさを測定するために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、制御装置５０の測定部５４ａによって、公知の電気的検出方法（例えば、電気的ナノパルス法等）を用いて、通過工程において電流Ｃを流し始めたタイミングで検出部による収容部３０内を流れる電流Ｃの検出を行わせ、当該電流Ｃが流れる上記所定時間が経過するまで電流Ｃの検出を続けさせる（なお、この作業は、通過工程が終了するまで繰り返し行われる）。ここで、「電気的ナノパルス法」とは、電気を通した液体中でナノ粒子がポア４１を通過する際に生じる電気抵抗の変化をパルス信号として得る方法である。また、「パルス信号」とは、ナノ粒子の大きさ（具体的には、ナノ粒子の体積）を示す信号であり、例えばパルス信号が高いほど大きな粒子であることを示す。次いで、制御装置５０の測定部５４ａによって、記憶部５５にあらかじめ記憶された関係データであって複合体７８の大きさと電流Ｃの大きさとの関係を示す関係データ（例えば、複合体７８の大きさと電流Ｃの大きさとの比例関係を示すデータ等）を参照しながら、上記検出した電流Ｃの変化（電流Ｃの時刻歴変化）に基づいて、通過工程においてポア４１を通過した複合体７８毎の大きさを特定させる。
（測定方法−特定工程）
続いて、特定工程について説明する。特定工程は、試料７０に含まれる測定対象７１の個数を特定するために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、制御装置５０の特定部５４ｂによって、複合体テーブル５５ａに格納されている複合体情報及び測定工程において測定された複合体７８の大きさに基づいて、通過工程においてポア４１を通過した複合体７８毎の測定対象７１の個数を特定させる。この測定対象７１の個数の特定方法については任意であるが、実施の形態１においては、上記複合体情報の測定対象個数情報の中から、測定工程において測定された複合体７８の大きさに対応する測定対象個数情報を抽出し、当該抽出した測定対象個数情報の値を複合体７８の測定対象７１の個数として特定する。例えば、測定工程において特定された複合体７８の大きさ＝１６０ｎｍである場合に、図２に示す測定対象個数情報＝１が抽出されると、複合体７８の測定対象７１の個数＝１が特定される。次に、制御装置５０の特定部５４ｂによって、上記特定した複合体７８毎の個数の合算値を試料７０に含まれる測定対象７１の個数として特定させる。続いて、制御装置５０の制御部５４によって、上記特定された試料７０に含まれる測定対象７１の個数を出力部５２に出力させる。この上記測定対象７１の個数の出力方法については任意であるが、例えば、出力部５２（表示手段）の画面上に上記測定対象７１の個数を表示させる。あるいは、上記測定対象７１の個数を示す音声データ（一例として、「試料７０に含まれる測定対象の個数が×××個でした」との定型メッセージを含む音声データ等）を出力部５２（音声出力手段）を介して音声出力してもよい。
以上のような測定方法により、従来技術（蛍光標識したプローブ分子の蛍光を検出して測定対象７１の個数を測定する技術）に比べて、上記蛍光の個数を測定するのではなく、複合体７８の大きさに基づいて複合体７８の個数を測定するため、例えば、複数の複合体７８や複数の担体（一例として第１担体７３と結合された第２担体７６等）をポア４１に通過させた場合でも、複合体７８（すなわち、第１担体７３及び第２担体７６と特異的な反応によって結合した測定対象７１）の個数のみを正確に測定することができる。よって、測定の精度を向上させることが可能となる。また、各工程において特殊且つ煩雑な作業を必要としないことから、測定作業の迅速化及び簡易化を図ることが可能となる。
実施の形態１によれば、複合体７８をポア４１に通過させる通過工程と、通過工程において複合体７８をポア４１に通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、複合体７８の大きさを測定する測定工程と、測定工程において測定された複合体７８の大きさに基づいて、測定対象７１の個数を特定する特定工程と、を含むので、従来技術（蛍光標識したプローブ分子の蛍光を検出して測定対象の個数を測定する技術）に比べて、上記蛍光の個数を測定するのではなく、複合体７８の大きさに基づいて複合体７８の個数を測定するため、例えば、複数の複合体７８（すなわち、担体と特異的な反応によって結合した測定対象７１）やプローブ分子のみと非特異的に結合した複数の担体をポア４１に通過させた場合でも、複合体７８の個数のみを正確に測定することができる。よって、測定の精度を向上させることが可能となる。
また、複合体７８は、測定対象７１と、第１担体７３と、第２担体７６とを含み、特定工程において、測定工程において測定された複合体７８の大きさに基づいて、通過工程においてポア４１を通過した複合体７８毎の測定対象７１の個数を特定し、当該特定した個数の合算値を測定対象７１の個数として特定するので、第１担体７３及び第２担体７６と特異的な反応によって結合した測定対象７１の個数のみを正確に測定でき、測定の精度を一層向上させることが可能となる。また、各工程において特殊且つ煩雑な作業を必要としないことから、測定作業の迅速化及び簡易化を図ることが可能となる。
〔実施の形態２〕
次に、実施の形態２について説明する。この実施の形態２は、解離複合体の大きさに基づいて測定対象の個数を特定する形態である。実施の形態２において、好適には、第１担体７３は、所定のリンカーが固相化され、該リンカーを介して（必要に応じてプローブ分子、抗体等を更に介して）測定対象と結合可能な粒子である。その余の構成については、特記する場合を除いて、実施の形態１の構成と略同一であり、実施の形態１の構成と略同一の構成についてはこの実施の形態１で用いたものと同一の符号及び／又は名称を必要に応じて付して、その説明を省略する。
（構成）
まず、実施の形態２に係る測定システムの構成について説明する。実施の形態２に係る測定システムは、概略的に、後述する図６の反応槽１０、検出機構（図示省略）、後述する図６の解離部８０、及び制御装置（図示省略）を備えて構成されている（ただし、制御装置の複合体テーブルを省略している）。また、これら構成要素のうち、検出機構の第１電極部、電極部、検出部、及び解離部８０の各々と制御装置とは、配線を介して電気的に接続されている。
（構成−解離部）
解離部８０は、複合体７８から第１担体７３を解離することで後述する図７（ｂ）の解離複合体９０を生成する解離手段である。この解離部８０は、第１担体７３に固相化された所定のリンカーが光切断リンカーである場合、該リンカーを切断して複合体７８から第１担体７３を解離させることが可能な後述する図６の光ＤＬ（以下、「解離光ＤＬ」と称する）を照射する光照射装置等を用いて構成されており、反応槽１０の近傍に設けられている。ここで「解離光ＤＬ」は、例えば、第１担体７３と第２担体側抗体７５との相互間で光切断反応を引き起こすことが可能な波長を有する光（一例として、極端紫外線、真空紫外線、近紫外線、可視光、近赤外線、中赤外線、遠赤外線等）等を含む概念である。前記光切断リンカーとしては、例えば２−ニトロベンジル基、ｐ−ヒドロキシフェナシル基、（２−ニトロフェニル）エチル基、（クマリンー４−イル）メチル基等、公知の光切断リンカーをいずれも使用できる。
（測定方法）
次に、このように構成された測定システム１を用いて行われる測定方法について説明する。図６は、解離工程の概要を示す概要図である。図７は、図６のＡ領域の拡大図であり、（ａ）は、複合体７８から第１担体７３が解離する状況を示す図であり、（ｂ）は解離複合体９０が生成された状態を示す図である。図８は、通過工程の概要を示す概要図であり、（ａ）は解離複合体９０をポア４１に通過させる前の状態を示す図であり、（ｂ）は解離複合体９０をポア４１に通過させた後の状態を示す図である。実施の形態２に係る測定方法は、上述したように、第１反応工程、第２反応工程、解離工程、通過工程、測定工程、及び特定工程を含んでいる。なお、この測定方法のうち、第１反応工程及び第２反応工程は、実施の形態１に係る測定方法と同様であるので、説明を省略する。
（測定方法−解離工程）
まず、解離工程について説明する。解離工程は、通過工程の前に解離複合体９０を生成するために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、制御装置の制御部によって、図６に示すように第２反応工程において生成された複合体７８に対して解離光ＤＬを解離部８０から照射させて、図７（ａ）に示すように複合体７８から第１担体７３を解離させることにより、解離複合体９０（具体的には、図７（ｂ）に示す第１解離複合体９１及び第２解離複合体９２）を生成する。この解離光ＤＬの照射方法については任意であるが、解離工程にて生成されたすべての複合体７８から第１担体７３を解離できるように照射することが望ましいので、例えば、図６に示すように、反応槽１０に収容されている収容物（すなわち、解離複合体９０及び溶媒７２）の全体に対して解離光ＤＬを照射する。あるいは、これに限られず、この収容物を撹拌しながら収容物の一部に対して解離光ＤＬを照射してもよい。なお、このような解離は、不可逆的なものであるので、解離複合体９０が反応槽１０内の第１担体７３と再度結合することはない。次に、反応槽１０から解離後の第１担体７３を除去する。この解離後の第１担体７３の除去方法については任意であるが、例えば、反応槽１０の一部（一例として反応槽１０の側面部等）に設置された磁石（図示省略）によって、解離後の第１担体７３を集磁させた状態で、解離複合体９０及び溶媒７２を別の反応槽１０に移し変えることで除去する。
（測定方法−通過工程）
次に、通過工程について説明する。通過工程は、解離工程において生成された解離複合体９０を基板４０のポア４１に通過させるために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、送液管によって反応槽１０内から所定量の解離複合体９０及び溶媒７２を取り出し、当該取り出した解離複合体９０及び溶媒７２を検出機構の収容部３０内（具体的には、図８（ａ）に示す上側収容部３２内）に注入する。次に、図８（ｂ）に示すように、制御装置の測定部によって、第１電極部及び第２電極部を介して収容部３０内に電流Ｃを所定時間流すことで上記注入された解離複合体９０を下方に移動させることにより（すなわち、電気泳動により）、当該解離複合体９０をポア４１に通過させる。この所定時間については、所定個数の解離複合体９０がポア４１を通過するまでに要すると一般的に想定される時間以上の時間に設定することが好ましい。又は、通過する解離複合体９０の個数にかかわらず予め時間を設定しておき（例えば１０分間）、該設定時間内にポア４１を通過する解離複合体９０を解析する手法もとり得る。
（測定方法−測定工程）
次に、測定工程について説明する。測定工程は、解離複合体９０の大きさを測定するために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、制御装置の測定部によって、通過工程において電流Ｃを流し始めたタイミングで検出部による収容部３０内を流れる電流Ｃの検出を開始させ、当該電流Ｃが流れる上記所定時間が経過するまで電流Ｃの検出を続けさせる（なお、この作業は、通過工程が終了するまで繰り返し行われる）。次いで、制御装置の測定部によって、記憶部にあらかじめ記憶された関係データであって解離複合体９０の大きさと電流Ｃの大きさとの関係を示す関係データ（例えば、解離複合体９０の大きさと電流Ｃの大きさとの比例関係を示すデータ等）を参照しながら、上記検出した電流Ｃの変化に基づいて、通過工程においてポア４１を通過した解離複合体９０毎の大きさを特定させる（すなわち、解離複合体９０の大きさを測定する）。
（測定方法−特定工程）
続いて、特定工程について説明する。特定工程は、試料７０に含まれる測定対象７１の個数を特定するために、以下の手順で行われる。すなわち、まず、制御装置の特定部によって、測定工程において測定された解離複合体９０の大きさに基づいて、試料７０に含まれる測定対象７１の個数を特定させる。この試料７０に含まれる測定対象７１の個数の特定方法については任意であるが、実施の形態２においては、通過工程においてポア４１を通過した解離複合体９０の中から、測定工程において測定された解離複合体９０の大きさが記憶部にあらかじめ記憶された閾値以上（例えば、４０ｎｍ以上等）となる解離複合体９０（具体的には、第１解離複合体９１）を特定し、当該特定した第１解離複合体９１の個数の合計値を試料７０に含まれる測定対象７１の個数として特定することもできる。解離工程において生成される解離複合体９０の種類が２種類（すなわち、図７（ｂ）に示す第１解離複合体９１と第２解離複合体９２）であるので、実施の形態１に係る複合体テーブル５５ａを用いなくても、１つの閾値を用いることにより、第１解離複合体９１及び第２解離複合体９２の中から第１解離複合体９１を特定できるからである。次いで、制御装置の制御部によって、上記特定された試料７０に含まれる測定対象７１の個数を出力部に出力させる。
以上のような測定方法により、従来技術に比べて、上記蛍光の個数を測定するのではなく、解離複合体９０の大きさに基づいて解離複合体９０の個数を測定するため、例えば、複数の第１解離複合体９１や複数の第２解離複合体９２をポア４１に通過させた場合でも、第１解離複合体９１（すなわち、第２担体７６と特異的な反応によって結合した測定対象７１）の個数のみを正確に測定することができる。よって、測定の精度を向上させることが可能となる。また、解離複合体９０の大きさが複合体７８の大きさに比べてばらつきにくいことから、特定工程において測定対象７１の個数を特定しやすくなるので、測定の精度を一層向上させることが可能となる。
実施の形態２によれば、複合体７８は、測定対象７１と、第１担体７３と、第２担体７６とを有し、通過工程の前に、複合体７８から第１担体７３を解離することで解離複合体９０を生成する解離工程を含み、通過工程において、解離工程において生成された解離複合体９０を、ポア４１に通過させ、測定工程において、通過工程において解離複合体９０をポア４１に通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、解離複合体９０の大きさを測定し、特定工程において、測定工程において測定された解離複合体９０の大きさに基づいて、測定対象７１の個数を特定するので、従来技術に比べて、上記蛍光の個数を測定するのではなく、解離複合体９０の大きさに基づいて解離複合体９０の個数を測定するため、例えば、複数の解離複合体９０（すなわち、第２担体７６と特異的な反応によって結合した測定対象７１）やプローブ分子のみと非特異的に結合した複数の担体をポア４１に通過させた場合でも、解離複合体９１の個数のみを正確に測定することができる。よって、測定の精度を向上させることが可能となる。
〔III〕実施の形態に対する変形例
以上、本発明の実施の形態について説明したが、本発明の具体的な構成及び手段は、特許請求の範囲に記載した各発明の技術的思想の範囲内において、任意に改変及び改良することができる。以下、このような変形例について説明する。
（解決しようとする課題や発明の効果について）
まず、発明が解決しようとする課題や発明の効果は、前記した内容に限定されるものではなく、本発明によって、前記に記載されていない課題を解決したり、前記に記載されていない効果を奏することもでき、また、記載されている課題の一部のみを解決したり、記載されている効果の一部のみを奏することがある。例えば、本発明に係る測定方法の測定作業の迅速化及び簡易化が従来と同程度であっても、従来と異なる方法により従来と同程度の測定作業の迅速化及び簡易化を有している場合には、本願発明の課題は解決されている。
（分散や統合について）
また、上述した各電気的構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。すなわち、各部の分散や統合の具体的形態は図示のものに限られず、その全部または一部を、各種の負荷や使用状況などに応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散又は統合して構成できる。例えば、制御装置を、相互に通信可能に構成された複数の装置に分散して構成し、これら複数の装置の一部に制御部を設けると共に、これら複数の装置の他の一部に記憶部を設けてもよい。
（形状、数値、構造、時系列について）
実施の形態や図面において例示した構成要素に関して、形状、数値、又は複数の構成要素の構造若しくは時系列の相互関係については、本発明の技術的思想の範囲内において、任意に改変及び改良することができる。
（第２担体について）
上記実施の形態１、２では、第２担体７６が第１担体７３よりも小さく形成されていると説明したが、これに限られず、例えば、第１担体７３と同じ大きさ又はそれ以上の大きさであってもよい。
（通過部について）
上記実施の形態１では、通過部が、第１電極部及び第２電極部を備えていると説明したが、これに限られない。例えば、第１電極部及び第２電極部に代えて、若しくは、これに加えて、加圧部を備え、通過工程において、当該加圧部を用いて収容部３０の上側収容部３２内に収容された複合体７８及び溶媒７２を下方に向けて加圧させてもよい。または、これに代えて、もしくはこれに加えて、収容部３０と上側収容部３２との溶媒の塩濃度に差を持たせたり、キャピラリー電気泳動による濃縮および分離工程を加えたりしてもよい（なお、実施の形態２についても同様とする）。特に、上記の手段を組合せて使用することにより、複合体７８をポア４１に効果的に通過させることが可能となる。
（測定方法について）
上記実施の形態１、２では、第１反応工程及び第２反応工程が行われると説明したが、これに限られず、例えば、あらかじめ生成された複合体７８を用いる場合には、第１反応工程及び第２反応工程を省略してもよい。
（測定工程について）
上記実施の形態１では、複合体７８の大きさと電流Ｃの大きさとの関係を示す関係データを参照しながら、検出部にて検出した電流Ｃの変化（電流Ｃの時刻歴変化）に基づいて、通過工程においてポア４１を通過した複合体７８毎の大きさを特定させると説明したが、これに限られない。例えば、同一の複合体７８であっても、複合体７８のポア４１の通過の仕方（例えば、複合体７８の通過方向が鉛直方向又は非鉛直方向であること、複数の複合体７８が連続的又は断続的に通過すること等）によって複合体７８の大きさが異なることから、例えば、検出部にて検出した電流Ｃの変化（電流Ｃの時刻歴変化）と、機械学習等によって得られたパターンデータであって複合体７８のポア４１の通過の仕方ごとの電流Ｃの変化のパターンデータとに基づいて、測定工程にて測定された複合体７８の大きさを補正してもよい。一例として、上記電流Ｃの変化のパターンデータのうち、通過工程においてポア４１を通過した所定の複合体７８に対応する電流Ｃの変化が、複合体７８の通過方向が鉛直方向であるパターンと一致する場合には、複合体７８の大きさを補正しないものの、複合体７８の通過方向が非鉛直方向であるパターンと一致する場合には、複合体７８の大きさを補正する。
（解離工程について）
上記実施の形態２では、第２反応工程において生成された複合体７８に対して解離光ＤＬを解離部８０から照射させることにより、光切断リンカーを切断して複合体７８から第１担体７３を解離させると説明したが、これに限られず、光切断リンカーに代えて、薬剤、酵素、タンパク変性剤（尿素等）、熱等で切断する各種リンカーを選択できる。そして、使用するリンカーに付随して、解離手段を適宜選択できる。例えば、解離部８０に代えて（あるいは、解離部８０と併用して）、リンカーを切断可能な薬剤（一例として、高濃度無機塩、還元剤のジチオトレイトールや２−メルカプトエタノール等）を複合体７８及び溶媒７２に加えてもよく、又は、リンカーを切断可能な酵素（一例として、タンパク質分解酵素、糖鎖切断酵素、脂肪酸分解酵素、核酸分解酵素等）又は尿素を複合体７８及び溶媒７２に加えてもよい。酵素で切断可能なリンカーとしては、例えば特許第３２８７２４９号に記載のリンカーなどが知られる。あるいは、解離部８０から解離光ＤＬを照射させることに代えて、複合体７８から第１担体７３を解離させることが温度に設定された熱を照射させてもよい。
[実施例]
実施例１：メチル化ＤＮＡのポアセンシングによる測定（実施の形態１）
（１）ストレプトアビジン結合磁性粒子（第１担体）の調製
５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ＝５．５）２００μＬに懸濁させた磁性粒子（ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製ｎａｎｏｍａｇ−Ｄ，ＣＯＯＨ，１３０ｎｍ、商品番号：０９−０２−１３２）６ｍｇに、５０ｍｇ／ｍＬ エチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド １００μＬおよび５０ｍｇ／ｍＬ N-ヒドロキシスクシンイミド １００μＬを加え、室温で３０分間転倒混和した。２００μＬの５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ＝５．５）で２回洗浄した後、５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ＝５．５）に１．０ｍｇ／ｍＬで溶解したストレプトアビジン（和光純薬製、商品番号：１４１−１２８５１）を１２０μＬ加え、室温で３０分間転倒混和することで、磁性粒子上にストレプトアビジンを結合させた。２００μＬの５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ＝５．５）で２回、４００μＬの２％ＢＳＡを含むＴＢＳで３回洗浄することで、ストレプトアビジン結合磁性粒子を得た。
（２）抗メチルシトシン抗体結合金ナノ粒子（第２担体）の調製
自社で取得した抗メチルシトシン抗体１Ｇ３について、Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品番号：ＣＧＮ５Ｋ−４０−１）を用いて、添付文書記載の方法により、抗体結合金ナノ粒子を調製した。
（３）メチル化ＤＮＡ（測定対象）の測定
測定対象としては、配列が５’−ＧＣＣ ＸＧＣ ＡＸＧ ＴＣＣ ＴＸＧ ＸＧＧ−３’（Ｘは５−メチルシトシン、５’末端はビオチン標識）であり、北海道システムサイエンス社により人工合成されたメチル化ＤＮＡを使用した。まず、ストレプトアビジン結合磁性粒子（６．２５μｇ）と測定対象核酸（５００ｆｍｏｌ）を７５μＬのＰＢＳに懸濁させた後、３７℃で３０分間反応させ、ストレプトアビジン結合磁性粒子と測定対象核酸の複合体を形成させた。２００μＬのルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、１００μＬの１．２×１０１１ＮＰＳ／ｍＬの抗メチルシトシン抗体結合金ナノ粒子溶液を加え、３７℃で２．５時間反応させた。２００μＬのルミパルス洗浄液（自社製）で洗浄した後、２５０μＬのＰＢＳに懸濁し、ナノ粒子マルチアナライザー（ＩＺＯＮ社製ｑＮａｎｏ）を用いて、粒径分布を測定した（第１試験体）。
また、測定対象核酸を含まない溶液を用い、複合体が形成されない試料も同様に測定した（第２試験体）。
（４）結果
図９は、第１試験体に関する試験体の大きさ毎の実験結果と、第２試験体に関する試験体の大きさ毎の実験結果とを示すグラフであり、横軸は試験体の大きさの測定値（図９では、「ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ（ｎｍ）」と示す）、縦軸は、試験体の大きさ毎の試験体の個数の合算値を試料７０に含まれる試験体の個数（総数）で除算した値（図９では、「ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（％）」と示す）を示す。図９に示すように、これらの実験結果から、試験体の大きさ毎の第１試験体の上記除算した値と第２試験体の上記除算した値とが異なることが確認された。また、第２試験体の上記除算した値が、試験体の大きさが大きくなるにしたがって、第１試験体の上記除算した値よりも高くなる傾向を示すことが確認された。以上のように、図９に示す実験結果から、磁気粒子の個数と複合体の個数とを区別して測定できることがわかり、実施の形態１に係る測定方法の有効性が確認できた。
実施例２：ＰＳＡのポアセンシングによる測定（実施の形態２）
（１）光切断リンカー結合抗ＰＳＡ抗体の調製
抗ＰＳＡ抗体（Ｎｏ．６２，自社製）にＮＨＳ−ＰＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ａｍｂｅｒｇｅｎ社製，商品番号ＰＣＢ-Ｎ−００５）を添付文書に記載の方法で結合させ、光切断リンカー結合抗ＰＳＡ抗体を得た。
（２）抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（光切断リンカー）（第１担体）の調製
実施例１（１）と同様の方法でストレプトアビジン結合磁性粒子を調製した。このストレプトアビジン結合磁性粒子１ｍｇに、２．７μｇの光切断リンカー結合抗ＰＳＡ抗体を加え、３７℃で３０分間転倒混和することで、磁性粒子上に光切断リンカー結合抗ＰＳＡ抗体を結合させた。１０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液で３回洗浄することで、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（光切断リンカー）を得た。
（３）抗ＰＳＡ抗体結合蛍光ナノ粒子（第２担体）の調製
蛍光ナノ粒子（ライフテクノロジーズ社製Ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓ，ＣＯＯＨ，４０ｎｍ、商品番号Ｆ８７８９）２．５ｍｇに、１０．０ｍｇ／ｍＬ ４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド ２．２μＬを加え、室温で１８０分間転倒混和した。１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液に３．０ｍｇ／ｍＬで溶解した抗ＰＳＡ抗体（Ｎｏ．３１，自社製)を４０μＬ加え、室温で６０分間転倒混和することで、蛍光ナノ粒子に抗ＰＳＡ抗体を結合させた。１００μＬの１９０ｍＭグリシン水溶液を加えた後、遠心分離により上精を除去することで、抗ＰＳＡ抗体結合蛍光ナノ粒子を得た。
（４）ＰＳＡ（測定対象）の測定
ルミパルスＰＳＡ標準液（富士レビオ社製）を必要に応じてＰＢＳで希釈し、０、１、１０、５０、１００ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ溶液（それぞれ第１、第２、第３、第４、第５試験体）を調製した。２０μＬの各試験体と、２５０μＬの００１５％の抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（光切断リンカー）を含有する溶液とを、３７℃で１０分間反応させ、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子（光切断リンカー）上にＰＳＡ抗原を捕捉した。７５０μＬのルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で未結合物質を洗浄した後、２５０μＬの３２μｇ／ｍＬ抗ＰＳＡ抗体結合蛍光ナノ粒子を含有する溶液を加え、３７℃で１０分間反応させた。５００μＬのルミパルス洗浄液で洗浄した後、１００μＬのＰＢＳに懸濁し、３６５ｎｍのＵＶ光（浜松ホトニクス社製Ｃ１１９２４−１１１およびＬ１１９２２−４０１）を１分間照射した（解離工程）。磁性粒子を除いた上清をナノ粒子マルチアナライザー（ＩＺＯＮ社製ｑＮａｎｏ）で計測し、１０分間の粒子カウント数を測定した。
（５）結果
図１０は、第１試験体から第５試験体の実験結果を示す表である。図１０の実験結果から、第１試験体（ＰＳＡ（測定対象）なし)の個数（カウント数）と、第２試験体から第５試験体（ＰＳＡあり）のカウント数とに有意な差が生じていることが確認された。また、ＰＳＡのカウント数が、ＰＳＡの濃度が高くなるにつれて、高くなる傾向を示すことが確認された。以上のように、図１０に示す実験結果から、測定対象のカウント数が測定対象の濃度に依存して変化することがわかり、実施の形態２に係る測定方法の有効性が確認できた。
１ 測定システム
１０ 反応槽
２０ 検出機構
３０ 収容部
３１ 下側収容部
３２ 上側収容部
４０ 基板
４１ ポア
５０ 制御装置
５１ 操作部
５２ 出力部
５３ 電源部
５４ 制御部
５４ａ 測定部
５４ｂ 特定部
５５ 記憶部
５５ａ 複合体テーブル
７０ 試料
７１ 測定対象
７２ 溶媒
７３ 第１担体
７４ 第１担体側抗体
７５ 第２担体側抗体
７６ 第２担体
７８ 複合体
８０ 解離部
９０ 解離複合体
９１ 第１解離複合体
９２ 第２解離複合体
Ｃ 電流
ＤＬ 解離光

Claims (2)

  1. 試料に含まれる測定対象を測定する測定方法であって、
    前記測定対象を所定の担体と反応させることにより得られる複合体を、基板に設けられたポアに通過させる通過工程と、
    前記通過工程において前記複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記複合体の大きさを測定する測定工程と、
    前記測定工程において測定された前記複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する特定工程と、を含み、
    前記複合体は、前記測定対象と、前記測定対象と結合可能な第１担体と、前記測定対象と結合可能な第２担体とを有し、
    前記通過工程の前に、前記複合体から前記第１担体を解離することで解離複合体を生成する解離工程を含み、
    前記通過工程において、前記解離工程において生成された前記解離複合体を、前記ポアに通過させ、
    前記測定工程において、前記通過工程において前記解離複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記解離複合体の大きさを測定し、
    前記特定工程において、前記測定工程において測定された前記解離複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する、
    測定方法。
  2. 試料に含まれる測定対象を測定する測定システムであって、
    ポアが形成された基板と、
    前記測定対象を所定の担体と反応させることにより得られる複合体を、前記ポアに通過させる通過手段と、
    前記通過手段にて前記複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記複合体の大きさを測定する測定手段と、
    前記測定手段にて測定された前記複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する特定手段と、を備え、
    前記複合体は、前記測定対象と、前記測定対象と結合可能な第１担体と、前記測定対象と結合可能な第２担体とを有し、
    前記複合体から前記第１担体を解離することで解離複合体を生成する解離手段を備え、
    前記通過手段は、前記解離手段にて生成された前記解離複合体を、前記ポアに通過させ、
    前記測定手段は、前記通過手段にて前記解離複合体を前記ポアに通過させる際に生じる電気的変化に基づいて、前記解離複合体の大きさを測定し、
    前記特定手段は、前記測定手段にて測定された前記解離複合体の大きさに基づいて、前記測定対象の個数を特定する、
    測定システム。
JP2016212608A 2016-10-31 2016-10-31 測定方法、及び測定システム Active JP6829867B2 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016212608A JP6829867B2 (ja) 2016-10-31 2016-10-31 測定方法、及び測定システム
EP17865465.3A EP3534153A4 (en) 2016-10-31 2017-10-30 MEASURING METHOD AND MEASURING SYSTEM
PCT/JP2017/039057 WO2018079761A1 (ja) 2016-10-31 2017-10-30 測定方法、及び測定システム
US16/397,705 US20190277840A1 (en) 2016-10-31 2019-04-29 Measuring method and measuring system

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016212608A JP6829867B2 (ja) 2016-10-31 2016-10-31 測定方法、及び測定システム

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018072181A JP2018072181A (ja) 2018-05-10
JP6829867B2 true JP6829867B2 (ja) 2021-02-17

Family

ID=62023586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016212608A Active JP6829867B2 (ja) 2016-10-31 2016-10-31 測定方法、及び測定システム

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20190277840A1 (ja)
EP (1) EP3534153A4 (ja)
JP (1) JP6829867B2 (ja)
WO (1) WO2018079761A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020184482A1 (ja) * 2019-03-12 2020-09-17 国立大学法人東北大学 エンドトキシン検出装置、及びエンドトキシンの検出方法
JPWO2021060496A1 (ja) * 2019-09-26 2021-04-01
CN111999490B (zh) 2019-12-19 2021-07-30 瑞芯智造(深圳)科技有限公司 一种检测样品体系中微量蛋白的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100075439A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules by capture-and-release using reducing agents followed by quantification
JP6033602B2 (ja) * 2012-08-08 2016-11-30 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子検出方法、生体分子検出装置、および分析用デバイス
JP6054758B2 (ja) * 2013-01-31 2016-12-27 シスメックス株式会社 免疫測定方法および免疫測定装置
JP5951527B2 (ja) * 2013-03-07 2016-07-13 株式会社東芝 検体検出装置及び検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018072181A (ja) 2018-05-10
WO2018079761A1 (ja) 2018-05-03
US20190277840A1 (en) 2019-09-12
EP3534153A1 (en) 2019-09-04
EP3534153A4 (en) 2020-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200191779A1 (en) Methods for conducting assays
Ding et al. Electrochemical and electrochemiluminescence determination of cancer cells based on aptamers and magnetic beads
JP6829867B2 (ja) 測定方法、及び測定システム
JP5943927B2 (ja) アッセイデバイスにおける試薬貯蔵
Dutta et al. Reactivity mapping of luminescence in space: Insights into heterogeneous electrochemiluminescence bioassays
US20090170212A1 (en) Rapid magnetic biosensor
JPH06509412A (ja) 改良されたルミネセンス検定の方法と装置
WO2008094198A2 (en) Devices and methods for performing receptor binding assays using magnetic particles
JPH10509798A (ja) 磁性粒子ベースの電気化学発光検出装置と方法
JP2011516832A (ja) 磁性粒子によるアッセイ用カートリッジ
JP2009544033A (ja) センサ表面に対する磁性物体又は磁化可能物体の引き付け及び引き離し
Tanner et al. Multiplex bio-assay with inductively coupled plasma mass spectrometry: towards a massively multivariate single-cell technology
EP2725358A1 (en) Release system for cell-antibody-substrate conjugates containing a polyethylene glycol spacer unit
JP2010506190A (ja) 磁気及び／又は電気ラベル補助検出システム並びに方法
Ding et al. Electrochemiluminescent determination of cancer cells based on aptamers, nanoparticles, and magnetic beads
EP2073016A1 (en) Magnetic label based detection
US10768174B2 (en) Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection
Ding et al. Recent advances in single cell analysis by electrochemiluminescence
US20100003678A1 (en) Sensitive magnetic assay through amplication of a label signal
JP2010538253A (ja) センサ
WO2012010251A1 (en) Method of performing an assay
Li et al. Ultrasensitive and fast fluorescent bioassay based on fluorescence enhancement of silver nanoparticles
JP2006247535A (ja) 回転磁場を利用した反応促進方法
JP4680456B2 (ja) 分析部材及びその製造方法
JP2009085840A (ja) 単一プローブ分子素子及び単一プローブ分子素子の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20181115

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20181115

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20191015

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201104

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201214

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210105

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210108

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6829867

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250