WO2014023288A1 - Verfahren zur einbringung biologisch aktiver substanzen ins gehirn - Google Patents

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Roman Goldstein
Alexandr TERTEROV
Dimitry TERTEROV
Sergei TERTEROV
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Naum Goldstein
Roman Goldstein
Terterov Alexandr
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Definitions

  • the invention relates to the development of a medical-biological method for the direct delivery of synthetic and natural biologically active and medicinal substances from the nasal cavity to the brain due to the interaction of these substances and membrane-active products of free-radical nature and / or the sources of these products with nerve and vascular structures the nasal cavity.
  • the environment represents a source of various biologically active molecules arriving in an organism with foodstuffs or from an air environment.
  • the other important sources of biologically active molecules are the internal sources of the organism, such as blood and interstitial fluid.
  • the biologically active molecules from the external and internal milieu must penetrate the biological membranes, for example the membrane structures of the brain.
  • biologically active molecules of the external and internal environment of the organism are useful and necessary for the normal functioning of organs and tissues, including the brain.
  • the biologically active molecules include, in particular, the majority of drugs and many biochemical compounds - the products of metabolism that form in the organism in the metabolic processes.
  • the authors see an important element of the successful solution of the problem in the presence in the pharmaceutical formula of cytokines or their sources.
  • the method used by the authors represents only one possible route for nasal delivery of the drugs into the peripheral circulation and / or the brain and a means of immunization, and can only serve as a pharmacological and technological platform for further improving the nasal delivery of the drugs to serve for the treatment of brain diseases.
  • the simultaneous detection at the wavelengths of 254 nm and 220 nm were carried out on the Beckman spectrophotometer (model 165, Altex), the sample volume was 100 ⁇ .
  • the fractions of brain extracts from each animal of the Experimental and control groups to which separate [ 3 H] -DA and [ 3 H] -DOPAC were added were quantitatively analyzed by liquid scintillation counter.
  • Figure 1 shows the typical chromatograms of the extracted solution, the hypothalamic and striatum extracts containing dopamine and DOPAC.
  • Fig. 1 The radioactivity of [ 3 H] -DA and [ 3 H] -DOPAC in chromatographic extract fractions of rat brain hypothalamus and striatum.
  • Rat catalepsy was developed by single intraperitoneal (ip) administration of the haloperidol ("ratiopharm") at the dose of 0.25 mg / kg. The catalepsy state and absence of response to external stimuli was determined as an 85% decrease in spontaneous motor activity. Thereafter, the animals of the three secreted rat group was administered 2 nasal nasal administration of the solutions of 10 -2 M dopamine, 0 "5 M H2O2 or mixture DA + H 2 O. The volume of the administered solutions was 50 ⁇ in each nose running The single dose of dopamine administered was 0.8 mg / kg, the dose of H 2 O 2 was 34 ng / animal, and the open field test was used to assess the spontaneous activity of the rats.
  • haloperidol in the physiological experiments has significantly suppressed spontaneous activity of the rats.
  • the latent period of catalepsy development after ip introduction of the haloperidol was 9.4 [8.9; 9.8] minutes; the catalepsy time was 57.1 [54.8; 59.4].
  • the nasal initiation of the DA + H 2 0 2 mixture elicited significant recovery of spontaneous motor activity within 90 s.
  • the separate introduction in the control animals of the isotonic water solutions of dopamine or H 2 0 2 did not restore the motor activity of the animals throughout the period of catalepsy (Fig. 2).
  • the invention has for its object to provide a method which overcomes the disadvantages of the prior art and the biological and pharmaceutical active substances in the form of drugs after nasal administration by temporal, quantitative and in intended order of success directly into the brain effectively and be introduced advantageous.
  • the criterion of evaluation the change of motor spontaneous activity as the sum of the movements of rats in different groups of animals in the test "open field".
  • mice control group: “intact control” (group I), “haloperidol ip” (group II), “haloperidol ip + dopamine” (group III) and “haloperidol ip + H 2 O 2 " in different concentrations (groups IV and V).
  • Experimental group “Haloperidol ip + dopamine + H 2 0 2 " in different concentrations (groups VI-IX), Tab. 2).
  • V haloperidol ip + L-arginine (10 "& M), nasal (n 5) 4.8 ⁇ 2.7 ** '
  • the maximum effective concentration of L-Arginine in nasal discharge is 10 " 1 M, as in the higher concentrations, the side effects of L-arginine are possible.
  • the physiological reaction of the receptors of the nasal cavity depends strongly on the duration of the stimulus. During continuous stimulation, a reduction in response is associated with physiological adaptation. This poses a significant problem because the receptor adaptation to the stimulus acting, for example caused by H 2 O 2 - or ⁇ ⁇ , greatly reduces the sensitivity of the receptors as well as the dependent biological response (FR Schmidt, G. Thews, 1983 Human Physiology, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York).
  • This adaptation can reduce a therapeutic efficiency of drug substances.
  • a method for maintaining the sensitivity of nasal receptors during the action of H 2 0 2 and » NO is not yet known.
  • the method we develop consists of short-term intermittent (interrupted) action of neuroactive substances, for example H 2 O 2 or ⁇ , in a pharmaceutical composition with biologically and therapeutically active substances on the nasal cavity mucous membrane.
  • the number of inserted sub-doses and the breaks between successively inserted sub-doses are substance-specific or application-specific and thereby from 1 to 5 sub-doses resp. from 10 to 60 seconds.

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Abstract

Verfahren zur Einbringung biologisch aktiver Substanzen ins Gehirn durch nasale Einleitung einer pharmazeutischer Komposition, bestehend aus biologisch und therapeutisch aktiven Substanzen gemeinsam mit membranaktiven Substanzen, Wasserstoffperoxid und Stickstoffmonoxid und deren Quellen, die in der Nasenhöhle zersetzt zurückbleiben, wobei nur die pharmakologisch aktiven Substanzen weitergeleitet werden, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Komposition einmal oder mehrfach nasal in Voll- und Teildosen eingeleitet wird, und das Zeitintervall zwischen den Einleitungen von 3 bis 180 Sekunden, vorzugsweise 60 Sekunden beträgt, und eine Arzneimitteldosierung 2 mal bis 100 mal kleiner als die pharmazeutisch vorgegebene Dosierung beträgt.

Description

Verfahren zur Einbringung biologisch aktiver Substanzen ins Gehirn
Die Erfindung betrifft die Entwicklung eines medizinisch-biologischen Verfahrens zur direkten Zustellung von synthetischen und natürlichen biologisch aktiven und medikamentösen Substanzen aus der Nasenhöhle ins Gehirn auf Grund der Wechselwirkung dieser Substanzen und membranaktiver Produkte freiradikaler Natur und\oder den Quellen dieser Produkte mit Nerven- und Gefäßstrukturen der Nasenhöhle.
Die Umwelt stellt eine Quelle der vielfältigen biologisch aktiven Moleküle dar, die in den Organismus mit den Lebensmitteln oder aus der Luftumgebung gelangen. Die anderen wichtigen Quellen der biologisch aktiven Moleküle sind die inneren Quellen des Organismus, solche wie Blut und interstitielle Flüssigkeit. Für das Erreichen der Organstrukturen oder Gewebe müssen die biologisch aktiven Moleküle aus dem äußeren und inneren Milieu die biologischen Membranen durchdringen, zum Beispiel die Membranstrukturen des Gehirns.
Viele biologisch aktiven Moleküle der äußeren und der inneren Umgebung des Organismus sind nützlich und notwendig für das normale Funktionieren der Organe und Gewebe, darunter des Gehirns. Zu den biologisch aktiven Molekülen gehören insbesondere die Mehrheit der Medikamente sowie viele biochemische Verbindungen - die Produkte des Metabolismus, die sich im Organismus bei den Stoffwechselprozessen bilden.
Gleichzeitig stellt die Zustellung ins Gehirn vieler allgemein bekannter und neuer Medikamente, der Biotechnologieprodukte sowie die therapeutische Anwendung einer Reihe von Metaboliten für die Behandlung des zentralen Nervensystems (ZNS), insbesondere des Gehirns, ein ernsthaftes Problem dar. In der wissenschaftlichen und Patentliteratur des letzten Jahrzehntes sind Methoden der Zustellung aus der Nasenhöhle ins Gehirn einiger zentral wirkender Medikamente beschrieben worden {Ming Ming Wen (2011) http://www.discovervmedicine.com/Ming-ming- Wen/201 1/06/13/olfactorv-targeting-through-intranasal-delivery-of-biopharmaceutical- druqs-to-the-brain-current-development/; Costantino H.R. et al. (2007). Intranasal delivery - Physicochemical and therapeutic aspects. International Journal of Pharmaceutics 337: 1-24). ,
In den Arbeiten von Ming Ming Wen und Costantino et. al. sind die bekannten Maßnahmen für die Zustellung der medikamentösen Substanzen aus der Nasenhöhle ins Gehirn beschrieben. Dazu zählt insbesondere die Anwendung der mukoadhäsiven Hilfsstoffe, die das Eindringen durch die Membran verstärken, solchen wie Liposome, Nanopartikel und sogar die Anwendung von Vasokonstriktoren, was keine ausreichende wissenschaftliche Begründung hat.
Mehrere beschriebene Methoden lassen zwar einige kleinen Moleküle ins Gehirn durchdringen, dennoch stellen sie für ein breites Spektrum der medikamentösen Substanzen kein universelles Verfahren dar.
Eine naheliegende bekannte Lösung stellt das Verfahren des transnasalen Transportes medikamentöser Substanzen ins peripherische Blut und ins Gehirn für die Behandlung und Immunisierung dar (nach Patent EP 1 031 347 B1). Die Autoren stellen fest, dass die bis jetzt verwendeten Methoden des transnasalen Transportes nicht in der Lage sind, ein überzeugendes Prinzip für den bequemen und annehmbaren Transport pharmazeutisch aktiver Stoffe durch die Membranen der Nasenhöhle zu gewährleisten.
Die Autoren sehen ein wichtiges Element der erfolgreichen Lösung des Problems in der Anwesenheit in der pharmazeutischen Formel von Zytokinen oder deren Quellen. Das von den Autoren verwendete Verfahren stellt jedoch nur einen möglichen Weg für eine nasale Zustellung der Medikamente in den peripherischen Blutkreislauf und\oder ins Gehirn und ein Mittel der Immunisierung dar, und kann nur als pharmakologische und technologische Plattform einer weiteren Verbesserung der nasalen Zustellung der Medikamente für die Therapie der Gehirnerkrankungen dienen.
Die wesentlichen Mängel des beschriebenen Verfahrens bestehen in der Komplexität der Vorbereitung und der Anwendung des Medikaments, sowie eine bestimmte Begrenzung für wasserlösliche Verbindungen. Ein weiterer Mangel dieses Verfahrens besteht in einer komplexen Vorbereitung medikamentöser Komposition. Früher haben wir festgestellt, dass freiradikale Substanzen oder ihre Folgeprodukte, das Wasserstoffperoxid (H2O2) oder »NO-aktive Produkte, zum Beispiel L-Arginin in der Lage sind unter bestimmten Bedingungen eine Erhöhung der Durchdringlichkeit von Membranstrukturen der Nerven und Gefäße der Nasenhöhle zu gewährleisten und beim Durchdringen biologisch aktiver Substanzen ins Gehirn beizutragen (Patent DE Nr. 102 48 601 , Eurasisches Patent Nr. 010692).
Bislang wurden Formulierungen zur Lösung des technischen Problems vielseitig diskutiert, so auch in dem Artikel (Goldstein N., et al. 2012, Blood-Brain Barrier Unlocked. Biochemistry (Moscow), Vol. 77, No. 5, pp. 419-424). In diesem Artikel wurde zur Bestimmung der Effektivität der Einbringung ins Gehirn der biologisch aktiven Substanz Dopamins bei gleichzeitiger nasaler Einleitung zusammen mit dem mikromolaren Wasserstoffperoxid wurde ein Experiment mit Tritium-markiertem Dopamin (DA) durchgeführt. Es ist allgemein bekannt, dass Dopamin nicht dazu in der Lage ist, unter gewöhnlichen Bedingungen ins Gehirn einzudringen und dort ausgeprägte Effekte auszulösen.
Für die Bestätigung der spezifischen biologischen Aktivität des Dopamins in Gehirnstrukturen wurden tierexperimentellen Untersuchungen mit dem Isotop-Produkt [3H]-Dopamin und mit dem Neuroleptikum Haloperidol durchgeführt. Es ist anbei allgemein bekannt, dass Dopamin nicht in der Lage ist, unter gewöhnlichen Bedingungen ins Gehirn einzudringen und dort ausgeprägte physiologische oder therapeutische Effekte auszulösen. Für die Bestätigung der spezifischen physiologischen Aktivität des Dopamins in Gehirnstrukturen wurden tierexperimentellen Untersuchungen mit dem Jsotope-Produkt [3H]-Dopamin und mit dem Neuroleptikum Haloperidol durchgeführt.
Bei der Herstellung des mit Tritium markierten [3H]-Dopamins wurde eine Reaktion des hochtemperierten festphasigen katalytischen Isotopen-Austausches des Wasserstoffes gegen Tritium im Präparat des Dopamin-Hydrochlorids benutzt. Das entstehende Präparat [3H]-DA wurde in der Column Kromasil C18 (8x150 mm) in der Konzentration- Gradient der wässrigen Lösung des Acetonitrils in der Anwesenheit von 0,1 % Heptafluorbuttersäure gereinigt. Die quantitative Analyse des Präparates wurde durch HPLC unter der Verwendung des DA-Standarts («Sigma/Aldrich») durchgeführt. Die spezifische Radioaktivität des gleichmäßig markierten DA betrug 20 Ci/Mol. Die Stock- Lösung des Präparates enthielt 10~2 M des [3H]- Dopamins mit der Volumenaktivität von 0,75 mCi/ml.
Bei der Vorbereitung einer nasalen Einleitung der Dopamin-Lösung wurde ex tempore das Gemisch aus der [3H]-DA-Lösung (Konzentration 4x10~2 M; die Volumenaktivität 0,75 mCi/ml) mit isotonischer Lösung des stabilisierten Wasserstoffperoxids («Sigma- Aldrich») gemacht. Die Endkonzentrationen des Dopamins und H2O2 in nasal eingeführter Lösung betrugen entsprechend 10~2M und 10~5 M. In der experimentellen Tiergruppe wurde ein Gemisch von [3H]-DA- und H202-Lösungen eingeführt. Die Tiere in der Kontrollgruppe bekamen ein Gemisch von [3H]-DA+0,9% NaCI.
Bei der Vorbereitung des biologischen Materials von den Ratten, die drei Minuten nach der nasalen Einleitung von [3H]-DA-enthaltenden Lösungen dekapitiert wurden, wurde das Gehirn entfernt, Hypothalamus und beide Teile des Striatums wurden ausgeschnitten und auf die kalte Unterlage (+4°C) gebracht. Die herausgenommenen Strukturen des Gehirns wurden in Laufe von 35-40 s abgewogen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und in die Reagenzgläser Eppendorf untergebracht. Die eingefrorenen Proben wurden 48 Stunden lang liophiliziert und anschliessend extrahiert mit 200 μΙ 0, 1 M HCI04-Lösung. Danach wurden die Proben innerhalb von 15 Minuten bei 10000 g zentrifugiert und der Supernatant wurde für die Bestimmung von [3H-DA] und [3H- DOPAC] verwendet.
Da die Endkonzentrationen von DA und DOPAC in den Proben nicht ausreichend waren, um mit Hilfe der UV-Detektion die radioaktiven Derivate dieser Stoffe im Zusammenhang der Peaks des Plasmas des Blutes zu bestimmen, wurde aus diesem Grund vor der chromatographischen Trennung in den Extrakt des Gewebes jeweils 10 pg nichtmarkierten Standards von Dopamin und sein Metabolit 3,4- Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) hinzufügt. Die chromatografische Analyse des Extraktes in 0,1 M HCIO4 wurde in der Kromasil Column C18-5 pm (4x150 mm) bei 20° mit Hilfe gradienter Elution mit Acetonitril (4-24 %) in 0,1 % Heptafluorbuttersäure durchgeführt. Die gleichzeitige Detektion auf den Wellenlängen von 254 nm und 220 nm wurden auf dem Spektrophotometer Beckman (Modell 165, Altex) durchgeführt, das Probenvolumen betrug 100 μΙ. Die Fraktionen der Gehirnextrakte von jedem Tier der Experimentellen- und Kontrollgruppen, zu denen getrennt [3H]-DA und [3H]-DOPAC hinzugefügt wurden, wurde quantitativ mit Flüssigszintillationszähler analysiert.
Auf Abbildung 1 sind die typischen Chromatogramme der extrahierten Lösung, der Hypothalamus- sowie Striatumsextrakte, enthaltend Dopamin und DOPAC dargestellt.
Abb. 1. Die Radioaktivität von [3H]-DA und [3H]-DOPAC in chromatographischen Extraktensfraktionen von Hypothalamus und Striatum des Rattengehirns.
Bemerkungen: Die Radioaktivität von [3H]-DA und [3H]-DOPAC in chromatographischen Extraktensfraktionen von Hypothalamus und Striatum, die den Standards des Dopamins und DOPAC entsprechen, wurde mit Hilfe des flüssigen Szintillationszählers Tri-Carb 2900TR («PerkinElmer») gemessen. Die Radioaktivität der Extrakte von jeder der acht Ratten der Kontroll- und Experimentellgruppen wurde als Anzahl des radioaktiven Zerfalls pro Minute (DPM) gemessen; für die Umrechnung dieser Werte in Microcurie (pCi) hat man den Umrechnungsfaktor 2,22*106 verwendet. Die Effektivität des Zählers betrug durchschnittlich 49%. Die Umrechnung in die Menge des Dopamins basierte auf der Konzentration der Stock- Lösung [3H]-DA 0"2 M und der Volumenaktivität von 0,75 pCi/ml.
Die Katalepsie bei den Ratten wurde durch einmalige intraperitoneale (i.p.) Gabe des Haloperidols («Ratiopharm») in der Dosis von 0,25 mg/kg entwickelt. Der Katalepsiezustand und die Abwesenheit der Reaktion auf die äußerlichen Reize wurde als 85%-ige Senkung der spontanen motorischen Aktivität bestimmt. Danach wurde den Tieren der drei abgesonderter Ratten-Gruppen eine nasale Applikation der Lösungen von 10~2M Dopamins, 0"5M H2O2 oder die Mischung DA+H2O2 nasal verabreicht. Das Volumen der applizierten Lösungen betrug 50 μΙ in jeden Nasenlauf. Die einmalige Dosis des verabreichten Dopamins betrug 0,8 mg/kg; die Dosis von H2O2 betrug dabei 34 ng/Tier. Für die Einschätzung der spontanen Aktivität der Ratten wurde der Test «das offene Feld» verwendet. Der Test-Platz stellte eine runde Arena dar mit dem Durchmesser von 80 cm, mit dem Fußboden aus Holz, der auf 16 gleiche Sektoren und zwei konzentrische Kreise geteilt war. Die Höhe der Barriere betrug 40 cm. Zur Messung der spontanen motorischen Aktivität wurde das Tier ins Zentrum der Arena platziert, und im Laufe von 2 Minuten registrierte man die Anzahl der horizontalen Bewegungen zwischen den Sektoren. Die Beobachtungen fingen 90 s nach der nasalen Verabreichung der Präparate an. Die Forschung mit den Labortieren entsprach den Forderungen der Ethik-Kommission des Institutes. Ins Experiment wurden 51 Männchen der Ratten„Wistar" einbezogen mit der Masse von 220-250 g. Die Tiere wurden unter standardmäßigen Bedingungen des Vivariums behandelt mit dem unbeschränkten Zugang zu Nahrung und Wasser. Im Laufe von drei Tagen vor dem Experimentenbeginn zähmte man die Ratten zum Kontakt mit dem Forscher ("handling").
Die statistische Signifikanz (P) bei der Analyse der Anzahl radioisotopischen Zerfalls pro Minute wurde mit Hilfe des nicht parametrischen einseitigen Mann-Whitney-Tests berechnet. Die Ergebnisse galten als signifikant bei P<0,05. In der Forschung des Katalepsie-Modells der Ratten wurde die motorische Aktivität der Tiere als bedingte Einheiten der visualen Registrierung ausgedrückt. Das ließ eine nicht gauß'sche Verteilung der erhaltenen Ergebnisse vermuten.
Die im Hypothalamus und Striatum des Gehirns festgestellte Radioaktivität von [3H]-DA und [3H]-DOPAC war wesentlich höher in der experimentellen Gruppen der Ratten, denen nasal und gleichzeitig das Dopamin und H2O2 in Form eines Sprays aus der Wasserlösung der beiden Komponente appliziert wurde. In der Tabelle 1 sind die berechneten Konzentrationen von Dopamin und DOPAC im Hypothalamus und Striatum der Versuchs- und Kontrollratten dargestellt. Die Kontrolltiere erhielten im Spray das Dopamin und eine NaCI-Lösung anstatt H202 (Tab.1).
Tabelle 1. Die Wirkung des micromolaren H202 auf die nasale Zustellung von Dopamin in die Strukturen des Gehirns bei Ratten.
Hypothalamus Striatum
Tiergruppe
fHj- DA' DA' fHJ-DOPAC DOPAC" fHl-DA' DA ' ?H1- DOPAC" DOPAC"
14810 18.80 4653 6.31 24003 8.53 5327 1.73
1. Experiment (n=8);
Μ-ΟΑ + ,Ο, (9887:22558] 118.86:24.681 (4112:95231 15.84:10.76] 120150:28885] (7.43,9.99] 14478:6179] (1.49:2.11]
II. Konirolle (n=8); 285 0.41 111 0.15 887 0.31 214 0.07 fHhOA+NaCI-LOsung (289:3021 10.37:0.441 ■ 1108:123] 10.13:0.181 1872:1014] 10.29:0.331 (197:235] (0.08:0.08]
Uli 45.4 42.1 27.5 24.7
P 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 Bemerkungen: [3H]-DA - das mit Tritium markierte Dopamin; [3H]-DOPAC - die mit Tritium markierte 3,4-Dioxyphenylessigsäure; a - die Anzahl der Zerfalle pro Minute; b - pmol/mg der Gewebe. Die Werte sind als Medianen [ Quartile; 3.Quartile] dargestellt. Die P-Werte wurden mit Hilfe des einseitigen Mann -Whitney-Tests berechnet. Das Volumen der eingeführten Lösung = 2χ50μΙ. Die Dosis und die Anzahl der eingeführten Substanzen: DA - 0.8 mg/kg; H202 - 34 ng.
Die Injektion des Haloperidols in den physiologischen Experimenten hat eine Spontanaktivität der Ratten wesentlich unterdrückt. Die latente Periode der Katalepsie- Entwicklung nach der i.p. Einleitung des Haloperidols betrug 9,4 [8,9; 9,8] Minuten; die Katalepsiedauer betrug 57,1 [54,8; 59,4]. Die nasale Einleitung der Mischung DA+H202 rief innerhalb von 90 s eine bedeutende Wiederherstellung der spontanen motorischen Aktivität hervor. Die getrennte Einleitung bei den Kontrolltieren der isotonischen Wasserlösungen des Dopamins oder H202 hat die motorische Aktivität der Tiere im Laufe der ganzen Periode der Katalepsie nicht wiederhergestellt (Abb. 2).
Abbildung 2. Die Wirkung nasaler Einleitungen des Dopamins zusammen mit H202 auf die motorische Spontanaktivität der Ratten im Haloperidol-Katalepsie-Modell.
Bemerkungen: HP - Haloperidol; DA - Dopamin; H202 - Wasserstoffperoxid 10'5M. Eine relative Einheit entspricht der Durchquerung eines Sektors im Test «das offene Feld». Die motorische Spontanaktivität der Ratten: Gruppe (I) - intakte Kontrolle; (II) - nach i.p. Applikation von HP; (lll-IV) - nach der nasalen Einleitung der isotonischen Lösung DA oder H202; (V) - nach der Einleitung der Mischung DA+H202. Die Werte in den Gruppen (lll-V) wurden auf dem Hintergrund der HP-Wirkung gemessen. Die Anzahl der Ratten in jeder Gruppe n=7. Die Tiere in jeder Gruppe (I bis V) wurden getrennt getestet. Die Werte und der Fehler sind als Median [LQuartile; 3.Quartile] dargestellt. Die P-Werte wurden mit Hilfe des einseitigen Mann-Whitney-Tests berechnet.
Die Ergebnisse haben gezeigt, dass am Beispiel von Dopamin als Test-Substanz bewiesen wurde, dass micromolare Konzentrationen von H202, die nasal und gleichzeitig mit Dopamin appliziert worden sind, eine schnelle Zustellung des Dopamins in die Strukturen des Gehirns gewährleisten. So wurde schon 3 Minuten nach der nasalen Einleitung eine signifikante Erhöhung des Dopamingehalts und des Produktes seines Metabolismus - DOPAC im Hypothalamus und Striatum der Ratten beobachtet. Die Dopamin-Peaks auf den HPLC-Chromatogrammen der Extrakte stimmten exakt mit den Peaks des Dopamin-Standards überein. Nach der nasalen Einleitung des Dopamins in der Mischung mit H202 wurde im Haloperidol-Katalepsie-Modell eine Erhöhung des Dopamingenhalts im Zielorgan - Striatum gezeigt, so dass die charakteristischen motorischen Störungen bei den experimentellen Tieren wirksam verringert wurden.
Eine nasale Einleitung von [3H]-DA zusammen mit der physiologischen Lösung bei den Kontrolltieren wurde im Gegenteil weder mit der Erhöhung des Dopamininhalts in den Strukturen des Gehirns noch mit der Verminderung der Katalepsie-Merkmale begleitet.
Die kurze Lebensdauer des niedrigmolaren Wasserstoffperoxids H2O2 an der Oberfläche der Schleimhaut der Nasenhöhle sowie die Erhaltung der Effekte im Laufe der verhältnismäßig langen Zeit lassen eine Beteiligung eines biochemischen Verstärkers vermuten. Wir haben früher gezeigt (DE 102 48 601), dass der Kandidat für diese Rolle das Stickstoffoxid-Radikal (·ΝΟ) sein kann, und dass auch L-Arginin (der Substrat des 'NO-bildenden Enzyms NO-Synthase (eNOS), der zusammen mit dem Dopamin nasal eingeführt wird, in der Lage wie H2O2 ist, die motorische Spontanaktivität der Ratten wiederherzustellen. An dieser Stelle ist es wichtig anzumerken, dass L-Arginin in der Nasenhöhle wesentlich langsamer metabolisiert wird als kurzlebiges H2O2. Der genaue Mechanismus der Teilnahme von L-Arginin in der Zustellung des Dopamins ins Gehirn bleibt unklar.
Die Erfindung hat sich zur Aufgabe gestellt, ein Verfahren zu schaffen, das die Nachteile des Standes der Technik beseitigt und bei dem biologische und pharmazeutische aktive Stoffe in Form von Arzneimitteln nach der nasalen Applikation durch zeitliche, mengenmäßige und in vorgesehener Rethenfolge direkt ins Gehirn effektiv und vorteilhaft eingebracht werden.
In den folgenden Experimenten, die eine Fortsetzung beschriebener Untersuchungen darstellen, wurde der Bereich der wirksamen Konzentrationen des Wasserstoffperoxides und L-Arginins, sowie zeitliche und mengenmäßige Parameter des Verfahrens dargestellt.
Die Erfindung wird an Hand folgender Experimente erklärt und beschrieben: Experiment 1. Die nasale Einleitung der Mischung„Dopamin+H202" stellt die motorische Spontanaktivität der Ratten nach der intraperitonealen Einleitung des Haloperidols in der Dosis von 100 mg/kg des Körpergewichtes wieder her.
Die Substanzen (nasal): das Dopamin in der Konzentration 10"3M bei gleichzeitiger und gemeinsamer nasaler Einleitung mit Wasserstoffperoxid in verschiedenen Konzentrationen in beide Nasenläufe.
Das Kriterium der Bewertung: die Veränderung der motorischen Spontanaktivität als Summe der Bewegungen der Ratten in verschiedenen Gruppen der Tiere im Test „Offenes Feld".
Die Tiergruppen: Kontrollgruppe: „Intakte Kontrolle" (Gruppe I), „Haloperidol i.p." (Gruppe II), „Haloperidol i.p.+Dopamin" (Gruppe III) und „Haloperidol i.p.+H2O2" in verschiedenen Konzentrationen (Gruppen IV und V). Experimentelle Gruppe: „Haloperidol i.p.+Dopamin+H202" in verschiedenen Konzentrationen (Gruppen VlI-IX), Tab. 2).
Tabelle 2. Motorische Spontanaktivität der Ratten nach der intraperitonealen Einleitung des Haloperidols und nasaler Einleitung der Mischung„Dopamin+H202" .
Figure imgf000010_0001
Bemerkungen: = P(Gruppen ll-V) vs. Gruppe l <0,01; *) P(Gruppe VIII) vs. (Gruppe I) <0,05; **) = P(Gruppen VI und VII) vs. (Gruppen ll-V) <0,01; P(Gruppe IX) vs. (Gruppen ll-V) <0,1 = nicht Signifikant. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde gezeigt, dass die minimale wirksame Konzentration des endonasalen Wasserstoffperoxides H202 im Bereich zwischen 10"8 bis zu 10"10M liegt. Es wurde angenommen, dass die maximale wirksame Konzentration des nasalen Wasserstoffperoxids H202 beträgt 5χ1θΛ/Ι, da in höheren Konzentrationen Schädigungen der Nasenschleimhautstrukturen entstehen können.
Experiment 2. Die nasale Einleitung der Mischung „Dopamin+L-Arginin" stellt die motorische Spontanaktivität der Ratten nach intraperitonealer Einleitung des Haloperidols in der Dosis von 100 mg/kg des Körpergewichtes wieder her.
Die Substanzen (nasal): das Dopamin in der Konzentration 10"3 M bei der synchronen gemeinsamen Einleitung mit L-Arginin in einen Nasenlauf in verschiedenen Konzentrationen. Das Kriterium der Bewertung: die Veränderung der motorischen Spontaneaktivität als Summe der Bewegungen der Ratten in verschiedenen Gruppen der Tiere im Test „Offenes Feld". Die Tiergruppen: Kontrolltiere: „Intakte Kontrolle" (Gruppe I),„Haloperidol i.p." (Gruppe II),„Haloperidol i.p.+Dopamin nasal" (Gruppe III) und„Haloperidol i.p .+ L-Arginin nasal" in verschiedenen Konzentrationen (Gruppen IV und V). Experimentelle Gruppe: „Haloperidol i.p.+Dopamin+L-Arginin nasal" in verschiedenen Konzentrationen (Gruppen VI-VIII), (Tab. 3).
Tabelle 3. Motorische Spontanaktivität der Ratten nach der intraperitonealen Einleitung des Haloperidols und nasaler Einleitung der Mischung„Dopamin+L-Arginin".
No. Tiergruppen Spontanaktivität
I Intakte Kontrolle (n=8) 37±10
II Haloperidol i.p. (n=8) 3 ±3m
III Haloperidol i.p. + Dopamin nasal (n=6) 2,6±1 ,7**'
IV Haloperidol i.p. + L-Arginin (10"3 M), nasal (n=5) 6,4±3,4m)
V Haloperidol i.p. + L-Arginin (10"& M), nasal (n=5) 4,8±2,7**'
VI Haloperidol i.p. + (Dopamin+L-Arginin (10*1 M) nasal (n=5) 29±8**)
VII Haloperidol i.p. + (Dopamin+L-Arginin (10"a M) nasal (n=6) 19±6,1**)
VIII Haloperidol i.p. + (Dopamin+L-Arginin 10"7 M) nasal (n=6) 6,2±4,6 Bemerkungen: = P(GruPPen ii-vj vs. GruPPe ι <0,01 ; **) P(GruPPen vi, vii) vs. (GmPPen II-V) <0,01 ; ^(Gruppe viii) vs. (GmPPen ii-v) <0,1 = nicht signifikant.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurde angenommen, dass die minimale wirksame Konzentration des endonasalen L-Arginins im Bereich von 10*7M liegt.
Die maximale wirksame Konzentration des L-Arginins bei nasaler Einleitung liegt bei 10" 1M, da in den höheren Konzentrationen eine Entstehung der Nebeneffekte von L- Arginin möglich wird.
Ein weiterer wichtiger Parameter physiologischer Reaktion der Rezeptoren ist die Zeit. Die physiologische Reaktion von den Rezeptoren der Nasenhöhle hängt stark von der Dauer des Reizes ab. Während einer kontinuierlichen Stimulation ist eine Reduktion der Reaktion mit physiologischer Anpassung assoziiert. Dies stellt ein wesentliches Problem dar, weil durch die Rezeptor Adaptation gegenüber des einwirkenden Stimulus, zum Beispiel verursacht von H2O2- oder ·ΝΟ, wird die Empfindligkeit der Rezeptoren sowie abhängige biologische Reaktion stark verringert (F.R. Schmidt, G. Thews, 1983. Human Physiology. Springer-Verlag. Berlin-Heidelberg-New York).
Diese Adaptation kann eine therapeutische Effizienz medikamentöser Substanzen verringern. Ein Verfahren zur Aufrechterhaltung der Sensibilität nasaler Rezeptoren während der Wirkung von H202 und »NO ist bisher nicht bekannt. Das von uns entwickelndes Verfahren besteht in kurzzeitiger intermittierenden (unterbrochenen) Wirkung von neuroaktiven Substanzen, zum Beispiel H2O2 oder ·ΝΟ, in einer pharmazeutischen Komposition mit biologischen und therapeutisch aktiven Substanzen auf die Schleimhaut der Nasenhöhle.
Die Anwendung dieses Verfahrens hat in unseren Experimenten die Wirkung des Wirkstoffs Phenobarbitals nach der nasalen Verabreichung synchron mit H202 deutlich erhöht. Die orale Anwendung des Phenobarbitals ist für die Epilepsie-, bzw. Behandlung von Schlafstörungen seit längerer Zeit bekannt (P. Kwan, M. J. Brodie: Phenobarbital for the Treatment of Epilepsy in the 21 st Century: A Critical Review. Epilepsia 2004;45:1141-1149). Die Nachteile dieser Behandlung sind die unerwünschten Nebeneffekte, unter dessen Übelkeit, Schwindel, Erhöhung der P-450- Aktivität im Leber und Störungen beim Metabolismus vieler Arzneimittel.
Experiment 3. Die Wirkung des Phenobarbitals wurde experimentell auf geschlechtsreifen weißen Ratten unter einer nasalen Anwendung untersucht. Verglichen wurde die phenobarbital-bedingte Dauer des Schlafes nach der nasalen Applikation des Phenobarbitals mit und ohne vaso- bzw. neuroaktiver Substanz. Die typischen Ergebnisse einer Untersuchung sind in der Tab. 4 aufgeführt.
Tabelle 4. Vergleich der Schlafdauer bei Ratten nach einmaliger und fraktionierter nasalen Verabreichung von Phenobarbital in Verbindung mit dem neuroaktiven Substanz, Wasserstoffperoxid (H202).
Figure imgf000013_0001
Bemerkungen: Dosis von Phenobarbital = 90 mg/kg des Körpergewichts; Gesamtvolumen nasal applizierter Lösung = 2x100 μΙ; Konzentration von H2O2 = 10-5M, Intervall zwischen nacheinander folgenden nasalen Verabreichungen in der experimentellen Tiergruppe = 60 s.
Es ist denkbar, dass die Zahl eingefügten Teildosen und die Pausen zwischen nacheinander eingefügten Teildosen substanzspezifisch bzw. anwendungsspezifisch sind und dabei von 1 bis 5 Teildosen resp. von 10 bis 60 s erreichen können.
Die Erfindung hat nachstehende Vorteile:
• eine direkte Zustellung arzneilicher Substanzen ins Gehirn,
• eine Möglichkeit der Schaffung des breiten Spektrums an Medikamenten, um Erkrankungen des ZNS zu behandeln, eine Möglichkeit eines umfassenden und effektiven Einsatzes von generischen Substanzen (ein„drittes Leben" für Generika), erhöhte therapeutische Effizienz von Arzneistoffen im Vergleich zu den bisher bekannten Verfahren,
ein signifikanter Rückgang der effektiven Dosis des Medikaments und des Risikos von unerwünschten Nebenwirkungen,
eine Verringerung der Umweltbelastung von biologisch aktiven Substanzen und seiner Abbauprodukten.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Einbringung biologisch aktiver Substanzen ins Gehirn durch nasale Einleitung pharmazeutischer Komposition, bestehend aus biologisch und therapeutisch aktiven Substanzen gemeinsam mit membranaktiven Substanzen, Wasserstoffperoxid und Stickstoffmonoxid und deren Quellen, die in der Nasenhöhle zersetzt zurückbleiben, wobei nur die pharmakologisch aktiven Substanzen weitergeleitet werden, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Komposition einmal oder mehrfach nasal in Voll- und Teildosen eingeleitet wird, und ein Zeitintervall zwischen den Einleitungen von 3 bis 180 Sekunden, vorzugsweise 60 Sekunden beträgt, und eine Arzneimitteldosierung 2 mal bis 100 mal kleiner als die pharmazeutisch vorgegebene Dosierung beträgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die pharmakologisch aktiven Substanzen synchron und/oder abwechselnd in einen Nasenlauf und/oder in beide Nasenl ufe eingeleitet wird und die Anzahl der nasalen Einleitungen 1 bis 5, vorzugsweise 3 beträgt
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktive Substanz, die eine regulatorische und therapeutische Wirkung auf die Funktionen des zentralen Nervensystems ausübt, in Form von synthetischen und natürlichen Produkten und/oder einer Komposition dieser Stoffe mit membranaktiven Substanzen, Wasserstoffperoxid und Stickstoffmonoxid und deren Quellen eingeführt wird.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktive Substanzen aus der Gruppe der Regler des Neurotransmitter Systems des Gehirns ausgewählt wird, zum Beispiel, aus der Gruppe der Agonisten und/oder der Antagonisten von Rezeptoren des Dopamins, Serotonins, Histamins oder Acetylcholins.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktive Substanz aus der Gruppe der Modulatoren des Neurotransmitter Systems des Gehirns ausgewählt wird, zum Beispiel, die γ- Aminobuttersäure oder Akatinol-Memantin oder ihre Derivate.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktive Substanz aus der Gruppe der endogenen Metabolite ausgewählt wird, die eine regulatorische Einwirkung auf die Funktionen des Zentralnervensystem aufweisen, zum Beispiel, Induktoren der endogenen Substanzen, Hormone, Aminosäuren, Opioide und Eiweißstoffe.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktiven Substanzen, die auf das zentrale Nervensystem wirken, mit einer Molekularmasse kleiner als 1 kDa ausgewählt werden, zum Beispiel Dopamin, Venlafaxine, Amantadine oder Trimeperidine.
8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktiven Substanzen, die auf das zentrale Nervensystem wirken, mit einer Molekularmasse größer als 1 kDa ausgewählt werdenA zum Beispiel Insulin, Galanin-like Peptide, Leptin, L-Asparaginase, Interferone oder Bevacizumab.
9. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktiven Substanzen in der Zusammensetzung von Zellen oder Zellstrukturen, zum Beispiel Stammzellen, Immunkomplexe oder monoklonale Antikörper nasal eingeleitet werden.
10. Verfahren nach Patentansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktiven Substanzen aus generischen Substanzen ausgewählt werden.
11. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutisch aktiven Substanzen nasal in einer Dosis von 1 % bis 100% der allgemeingültigen Dosis verwendet werden.
12. Verfahren nach Patentansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die membranaktive Substanz Wasserstoffperoxid in der Konzentration von 10"9M bis zu 10"3M, bevorzugt in der Konzentration von 5 10" M bis zu 10"6M nasal verwendet wird.
13. Verfahren nach Patentansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die membranaktive Substanz Stickstoffoxid «NO in der Konzentration von 10"7M bis 10"1M, bevorzugt in der Konzentration von 10"4 bis 10 1 nasal verwendet wird.
14. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in einer nasal eingeführten pharmazeutischen Komposition eine oder mehrere pharmazeutisch aktiven Substanzen in Form von Gel, Salbe, öl, Suspension, Liposomen oder Nanosomen verwendet werden.
15. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Zusammensetzung für die nasal eingeführte pharmazeutische Komposition pharmazeutisch akzeptablen Stabilisatoren, Antioxidanten, Gel-bildenden Stoffen, pH-Reglern, osmotischen Reglern, Emulgatoren, Solubilisatoren oder antimikrobischen Stoffe verwendet werden.
16. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass für nasale Einleitung der pharmazeutischen Komposition Sprays verwendet werden.
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