WO2014017743A1 - 펩타이드의 타겟 친화도 개선방법 - Google Patents

펩타이드의 타겟 친화도 개선방법 Download PDF

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WO2014017743A1
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peptide
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bpb
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PCT/KR2013/005196
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전상용
김성현
김대진
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광주과학기술원
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the target affinity of a peptide or BPB bipodal peptide binder.
  • Antibodies are immunoglobulin proteins, a type of plasma protein produced by B cells, that specifically inactivate and inactivate antigens by specifically recognizing and binding to specific sites of antigens.
  • the specificity and high affinity of these antigen-antibody reactions and the diversity of antibodies capable of distinguishing tens of millions of antigens have led to the emergence of many types of antibody products, including diagnostics and therapeutics.
  • the FDA has approved 21 monoclonal antibodies, and such drugs as Rituximab and Herceptin have been effective in more than 50% of patients who have not responded to other treatments. Has demonstrated successful clinical treatment of lymphoma, colon cancer or breast cancer using monoclonal antibodies.
  • the overall market size of therapeutic antibodies is estimated to grow at an annual rate of 20% from $ 10 billion in 2004 to $ 30 billion in 2010, and the market is expected to grow exponentially.
  • the development of new drugs using antibodies is active because the drug development period is short, investment costs are low, and side effects can be easily predicted.
  • the antibody is a herbal medicine, the human body is hardly affected, and the half-life in the body is overwhelmingly long compared to low molecular weight drugs, so the patient is friendly. Despite this usefulness in humans Monoclonal antibodies are recognized as foreign antigens and can cause severe allergic reactions or reactions.
  • the production cost is high, and thus the price of the therapeutic agent is rapidly increased, and technologies in a wide range of fields such as the method of culturing the antibody and the purification method are protected by various intellectual property rights. You have to pay expensive licensing fees.
  • Antibody-replacement protein is a recombinant protein designed to have constant and variable regions like antibodies. It replaces a small, stable protein with a random sequence of amino acids to make a library and screens it for a high affinity. You can find a substance with good specificity. For example, avimer and afbody in antibody replacement proteins have been reported to have a picomol affinity for a target substance. It is reported that these antibody replacement proteins are small and stable, can penetrate deep into cancer cells, and generally produce less immune response.
  • peptides have been widely used in place of antibody therapeutics due to proper pharmacokinetics, mass productivity, low toxicity, antigenic inhibition and low production cost compared to antibodies.
  • the advantages of peptides as therapeutic drugs are low production costs, high safety and responsiveness, relatively low cost of patented Roalti, and less exposure to unwanted immune systems, which can inhibit the production of antibodies to the peptides themselves. Is easy and accurate will be.
  • most peptides exhibit low affinity and specificity for specific protein targets compared to antibodies, they cannot be used for various applications. Therefore, there is a need in the art for the development of new peptide-based antibody replacement proteins that can overcome the disadvantages of peptides.
  • the present inventors have sought to develop a method that can improve the target affinity of known target-binding peptides.
  • the inventors add the structural features of the bipodal peptide binder (BPB) previously developed by the present inventors to the known target-binding peptide, the target affinity of the known target-binding peptide is known.
  • the present invention has been completed.
  • the present inventors have tried to develop a technique capable of optimizing the target affinity of the bipodal peptide binder previously developed by the present inventors.
  • the present inventors have completed the present invention by developing a method for optimizing or maximizing the target affinity of BPB very effectively while maintaining the overall structure of BPB.
  • BPB KPI-bipodal peptide binder
  • an object of the present invention is to provide a method of increasing the target affinity of a bipodal peptide binder (BPB).
  • BBP bipodal peptide binder
  • Another object of the present invention is to provide a bipodal peptide binder (BPB) having increased target affinity.
  • BBP bipodal peptide binder
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding a bipodal peptide binder (BPB) having an increased target affinity.
  • BBP bipodal peptide binder
  • the invention provides a method of increasing the target affinity of a peptide that binds to a protein target comprising the following steps:
  • the present invention provides a KPI-bipodal peptide binder (BPB) having an increased target affinity by the above-described method of the present invention.
  • the inventors have sought to develop a method that can improve the target affinity of known target-binding peptides.
  • the target affinity of the known target-binding peptide is known. It was found that the degree greatly increased.
  • BPB is a target-affinity peptide originally proposed by the inventors, see WO 2010/047515 for details.
  • the present invention presents a new and innovative method of improving the affinity of known peptides.
  • the basic idea of the present invention is to connect a peptide that binds to a new binding site adjacent to a target protein to which a known peptide binds to a structural stabilization scaffold along with the known peptide, thereby improving a target-binding peptide substance having improved target affinity.
  • the method of the present invention is a technique for improving the affinity of known peptides (now Eeptide), in which case the structures of the present inventors are adopted. Accordingly, the technique of the present invention is named "KPI-bipodal peptide binder" or "KPI-BPB”.
  • a known peptide having a binding affinity for a protein target is first obtained.
  • obtaining a known peptide means obtaining a known peptide or synthesis of a nucleic acid sequence encoding a known peptide, or obtaining information about an amino acid sequence and a nucleic acid sequence of a known peptide.
  • Known peptides that can be used in the present invention are directed to protein targets. Any known peptide that binds is included.
  • Protein targets herein include any protein target known in the art.
  • the protein target may be an enzyme, a ligand, a receptor, a biomarker, a long transcription factor, a growth factor immunoglobulin, a signaling protein, a binding protein, an ion channel, an antigen, an adhesion protein, a structural protein, a regulatory protein, a toxin protein, But not limited to cytokines and blood coagulation factors.
  • the protein target may be Fibronectin extra domain B (ED-B), vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothel ial growth factor receptor (VEGFR), VCAMKvascular cell adhesion molecule-1 (VCAMK), and nicotinic acetylcholine receptor ), Human serum albumin (HSA), MyD88, Epi dermal Growth Factor Receptor (EGFR), HER2 / neu, CD20, CD33, CD52, Epipithelial Cell Adhesion Molecule (EPp), Immunglobulin E (IgE), CD11A ( ⁇ -chain of lymphocyte function—associated antigen 1), CD3, CD25, glycoprotein Ilb / IIIa, integrin, alpha-fetoprotein (AFP), beta2-microglobulin ( ⁇ 2M), Bladder Tumor Antigens (BTA), NMP22, cancer antigen 125, cancer Antigen 15-3, Calcitonin, Carcinoembryonic Antigen, Chromogranin A
  • Vascular endothelial growth factor receptor family HGF receptor family, Trk receptor family, Eph receptor family, AXL receptor family, LTK receptor family, TIE receptor family, R0R receptor family, DDR receptor family, RET receptor family, KLG receptor family and RYK receptor family , MuSK receptor family]; And transcription factors [e.g., API, AP-2, ARE, Brn-3, C / EBP, CBF, CDP, c-Myb, CREB, E2F-1, EFR, ERE, Ets, Ets-1 / PEA3, FAST- 1, GAS / I SRE, GATA, GRE, HNF-4, IRF-1, MEF-1, MEF-2, Myc-Max, NF-1, NFATc, NF-E1, NF-E2, NFKB, Oct-1 , p53, Pax-5, Pbxl, Pit 1, PPAR, PRE, RAR, RAR (DR-5), SIE, Smad SBE, Smad3 / 4,
  • the length of a known peptide used in the present invention is 4-100 amino acid residues, more preferably 4-50 amino acid residues, 5-30 amino acid residues, 5-20 amino acid residues or 5-10 amino acid residues.
  • the structure stabilization site allows the known peptide as the target binding site I and the target binding site ⁇ to efficiently and stably bind to the target protein.
  • the target binding site ⁇ is preferably a peptide that binds to a site adjacent to the site of the target protein to which a known peptide binds.
  • Structural stabilization sites available in the present invention include parallel, antiparallel or parallel and antiparallel amino acid strands, interstrand hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi Protein structure motifs in which non-covalent bonds are formed by interaction, cation-pi interaction, or a combination thereof.
  • the non-covalent bonds formed by hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions, cation-pi interactions, or a combination of these strands are the rigidity of the structural stabilization site. Contribute to.
  • interstrand non-covalent bonds at the structure stabilization site include hydrogen bonds, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, pi-pi interactions or combinations thereof.
  • disulfide bonds can be formed at the structured stabilization site to further increase the firmness of the structure stabilized site.
  • the increase in firmness by such covalent bonds is given in consideration of the specificity and affinity of the bipodal peptide binder for the target.
  • the amino acid strands of the structure stabilization site are linked by a linker.
  • linker as used to refer to the strands refers to the material that connects the strands.
  • the turn sequence on the ⁇ -hairpin serves as a linker
  • leucine zipper a substance connecting two C-terminus of leucine zipper (eg , Peptide linkers) serve as linkers.
  • the linker connects the parallel, antiparallel or parallel and antiparallel amino acid strands. For example, at least two arranged in parallel Strands (preferably two strands), at least two strands (preferably two strands) arranged in antiparallel fashion, at least three strands (preferably three strands) arranged in parallel and antiparallel fashion.
  • the linker will connect.
  • the linker is a turn sequence or peptide linker.
  • the turn sequence is ⁇ _turn, ⁇ -turn, ⁇ -turn, ⁇ -turn or 0) -100) ( ⁇ 6111 ⁇ : ⁇ 3 (: 1131 CM (1968), Biopolymers, 6, 1425-1436; Nemethy G and Printz MP. (1972), Macrowolecules, 5, 755-758; Lewis PN et al., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 303, 211-229; Toniolo C (1980) CRC Crit. Rev. Biochem., 9, 1-44; Richardson JS. (1981), Adv.
  • ⁇ -turn When ⁇ -turn is used as the turn sequence, it is preferably a type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ ', type m or type ⁇ turn sequence, more preferably type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ 'turn sequence, even more preferably type ⁇ or type ⁇ ' turn sequence, most preferably the type turn sequence (BL Sibanda et al., J. Mol. Biol., 1989, 206, 4, 759 777; BL Sibanda et al., Methods Enzymol., 1991, 202, 59-82).
  • the turn sequence in the present invention is H. Jane Dyson et al. , Eur. J. Biochem. 255: 462-471 (1998), which is incorporated herein by reference.
  • Available for the turn sequence include the following amino acid sequences: X-Pn) -Gly-Glu-Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X is selected from 20 amino acids).
  • the structural stabilization site when a ⁇ -sheet or leucine zipper is used as the structural stabilization site, two strands arranged in a parallel manner or Preferably, the peptide linker connects two strands aligned in an antiparallel manner.
  • Peptide linkers can be used in any known in the art.
  • the sequence of a suitable peptide linker may be selected in consideration of the following factors: (a) the ability to be applied to flexible extended conformation; (b) the ability not to create secondary structures that interact with biological target molecules; And (c) the absence of hydrophobic residues or residues with charges that interact with the biological target molecule.
  • Preferred peptide linkers include Gly ′ Asn and Ser residues. Other neutral amino acids such as Thr and Ala can also be included in the linker sequence.
  • Suitable amino acid sequences for linkers are Marat ea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al. , Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 8258-8562 (1986); US Pat. Nos. 4,935,233, 4,751,180 and G. 15, 990,275.
  • the peptide linker sequence may consist of 1-50 amino acid residues.
  • the structural stabilization site is a ⁇ -hairpin, a linker linked ⁇ -sheet or a linker leucine zipper, and more preferably the structural stabilization site is a ⁇ -hairpin or linker linked ⁇ -sheet. And most preferably ⁇ -hairpin.
  • ⁇ -hairpin refers to the simplest protein motif comprising two ⁇ strands, the two ⁇ strands representing an antiparallel alignment with each other. In this ⁇ -hairpin the two ⁇ strands are generally linked by turn sequences.
  • the turn sequence applied to the ⁇ -hairpin is a type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ ', type m or type m' turn sequence, more preferably type I, type ⁇ , type ⁇ , type ⁇ 'turn sequence, even more preferably a type ⁇ or type ⁇ ' turn sequence, and most preferably a type ⁇ turn sequence.
  • X-Pro-Gly-Glu-Val Or a turn sequence represented by Ala-X—Gly—Glu—Val (X is selected from 20 amino acids) can also be used for ⁇ -hairpins.
  • the type I turn sequence is Asp-Asp-
  • Ma-Thr-Lys-Thr, type ⁇ turn sequence is Glu-Asn—Gly-Lys, type ⁇ turn
  • the sequence is X-Pn) -Gly-Ghi-Val; or Ala-X-Gly-Glu-Val (X is selected from 20 amino acids), and the type ⁇ 'turn sequence is Glu-Gly-Asn-Lys or Glu -D-Pro-Asn-Lys.
  • Peptides with ⁇ _hairpin formulations are well known in the art. See, for example, US Pat. No. 6,914,123 and Andrea G. Cochran et al. , PNAS, tryptophan zipper disclosed in 98 (10): 5578-5583, template-fixed ⁇ -hairpin mimetic disclosed in WO 2005/047503, ⁇ - disclosed in US Pat. No. 5,807,979. Hairpin variants are well known.
  • peptides having a ⁇ -hairpin conformation include Smith & Regan (1995) Science 270: 980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47: 251-276; Kim & Berg
  • a tryptophan zipper is used.
  • the tryptophan zipper used in the present invention is represented by the following general formula (I):
  • 3 ⁇ 4 is Ser or Gly-Glu, and X ' 2 is independently of each other Thr, His, Val, lie, Phe or Tyr, 3 ⁇ 4 is Trp or Tyr, X4 is Type I, Type ⁇ Type ⁇ , Type ⁇ ' Or type m or type ⁇ turn sequence, 3 ⁇ 4 is Trp or Phe and X 6 are Trp or Val and X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • 3 ⁇ 4 is Ser or Gly-Glu
  • 3 ⁇ 4 and X'2 are independently of each other Thr, His or Val
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Tyr
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Phe
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Val
  • X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • 3 ⁇ 4 is s e r or Gly-Glu
  • 3 ⁇ 4 and X'2 are independently of each other Thr, His or Val
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • X 6 is Trp
  • X 7 is Lys or Thr-Glu.
  • X'2 is Thr
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • ⁇ 5 is Trp
  • 3 ⁇ 4 is Trp
  • X 7 is Lys.
  • 3 ⁇ 4 is Ser, and X'2 is Thr, 3 ⁇ 4 is Trp, is type ⁇ turn sequence (ENGK) or type ⁇ 'turn sequence (EGNK), 3 ⁇ 4 is Trp 3 ⁇ 4 is Trp and X 7 is Lys.
  • ENGK type ⁇ turn sequence
  • EGNK type ⁇ 'turn sequence
  • Exemplary amino acid sequences of tryptophan zippers suitable for the present invention are described in SEQ ID NOs: 1 to 3 and 5 to 10.
  • the ⁇ -haepin peptides usable as structural stabilization sites in the present invention are peptides derived from the B1 domain of protein G, ie GB1 peptides.
  • the structural stabilization site is preferably represented by the following general formula:
  • 3 ⁇ 4 is Arg, Gly-Glu or Lys-Lys and 3 ⁇ 4 is Gin or Thr 3 ⁇ 4 is type 1, type 1 ', type ⁇ , type ⁇ ' or type m or type m 'turn sequence, is Gin, Thr-Glu Or Gln-Glu.
  • the structure stabilization site of general formula ⁇ is represented by the following general formula ⁇ :
  • X 1 -Trp-Thr-Tyr-X 2 -Phe-Thr-Val-X 3 ⁇ is Gly-Glu or Lys-Lys
  • 3 ⁇ 4 is type I, type ⁇ , type ⁇ , Type ⁇ ′ or type m or type ⁇ turn sequence
  • 3 ⁇ 4 is Thr-Glu or Gln-Glu.
  • Exemplary amino acid sequences of GB1 ⁇ -hairpins suitable for the present invention are described in SEQ ID NO: 4 and 14 to 15 sequences.
  • ⁇ -hairpin peptides usable as structural stabilization sites in the present invention are HP peptides.
  • the structural stabilization site is preferably represented by the following general formula ⁇ :
  • 3 ⁇ 4 is Lys or Lys-Lys, X 2 is Trp or Tyr, 3 ⁇ 4 is Val or
  • X 4 is type I, type ⁇ ⁇ type ⁇ , type ⁇ 'or type m or type ⁇ turn sequence, X 5 is Trp or Ala, 3 ⁇ 4 is Trp or Val, X 7 is Glu or Gln- Glu.
  • ⁇ -hairpin peptide that can be used as a structural stabilization site in the present invention is represented by the following general formula IV:
  • 3 ⁇ 4 is Lys-Thr or Gly
  • 3 ⁇ 4 is Trp or Tyr
  • 3 ⁇ 4 is type I, type 1 ', type ⁇ , type ⁇ ' or type ⁇ or type ⁇ turn sequence, and is Thr-Glu or Gly.
  • Exemplary amino acid sequences of the ⁇ -hairpins of Formulas III and IV are described in SEQ ID NOs: 11-12, 15-15 and 16-19.
  • a ⁇ -sheet connected by a linker may be used as the structure stabilization site.
  • two amino acid strands, which are parallel or antiparallel, preferably antiparallel, are in an extended form, and hydrogen bonds are formed between the amino acid strands.
  • ⁇ -sheet structure two adjacent ends of two amino acid strands are connected by a linker.
  • linker various turn-sequences or peptide linkers described above may be used. If the turn-sequence is used as a linker, the ⁇ -turn sequence is most preferred.
  • leucine zippers or leucine zippers linked by linkers may be used as structural stabilization sites. Leucine zippers are conservative peptide domains that cause parallel dimerization of two ⁇ -chains, and are generally dimerization domains found in proteins involved in gene expression (“Leucine scissors”. Glossary of Biochemistry and Molecular Biology ( (1997) .Ed. David M.
  • Leucic acid zippers generally comprise a heptad repeat sequence, where the leucine residue is located at the fourth or fifth.
  • leucine zippers that may be used in the present invention comprise the amino acid sequence of LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LEDKVEE, LENEVAR or LLSK YH. Specific examples of leucine zippers used in the present invention are described in SEQ ID NO: 39. Each half of the leucine zipper consists of short ⁇ -chains with direct leucine contact between the ⁇ -chains.
  • the leucine zipper in the transcription factor generally consists of a hydrophobic leucine zipper site and a basic site (site that interacts with the main groove of the DNA molecule).
  • the basic site is not necessarily required.
  • two adjacent ends of two amino acid strands ie, two ⁇ -chains
  • linker various turn-sequences or peptide linkers described above may be used and / or preferably a peptide linker that does not affect the structure of the leucine zipper.
  • target binding region ⁇ comprising a known peptide as the target binding site I and a random amino acid sequence is bound.
  • One of the greatest features of the present invention is to prepare a ⁇ —bipodal peptide binder by binding a target-binding known peptide to one end of the structure stabilization site and to the other end of the random amino acid sequence.
  • the known peptide target binding site I as target binding site I and the target binding site ⁇ of the random amino acid sequence bind to the target cooperatively with each other, thereby greatly increasing the affinity for the target.
  • the number of amino acids of the target binding site ⁇ is not particularly limited. Preferably 4-100 amino acid residues, more preferably 4-50 amino acid residues, 5-30 amino acid residues, 5-20 amino acid residues or 5-10 amino acid residues.
  • the target binding site I and the target binding site ⁇ may each contain different or the same number of amino acid residues.
  • the amino acid sequence contained in target binding site I and / or target binding site ⁇ is a linear amino acid sequence or a cyclic amino acid sequence.
  • at least one amino acid residue among the amino acid sequences included in the target binding site I and / or the target binding site ⁇ is an acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmi It may be modified into a toyl group, myristyl group stearyl group or polyethylene glycol (PEG).
  • the KPI-bipodal peptide binders of the present invention bound to biological target molecules can be used to modulate in vivo physiological responses, detect in vivo materials, in vivo molecular imaging, in vitro cell imaging and drug delivery targeting. It can also be used as an escort molecule.
  • a functional molecule is additionally bound to the structure stabilization site, the target binding site I or the target binding site ⁇ (more preferably, the structure stabilization site, even more preferably the linker of the structure stabilization site) have.
  • functional molecules include, but are not limited to, labels, chemicals, biopharmaceuticals, sepo transmembrane peptides (CPPs) or nanoparticles that generate detectable signals.
  • Labels that generate the detectable signal may include (i) contrast media (e.g. Gd chelate compounds), T2 contrast materials (e.g. superparamagnetic materials (e.g. magnetite, Fe 3 0 4 , Fe 2 0 3 , manganese ferrite, cobalt ferrite and Nickel ferrite)), radioisotopes (e.g., U C, 15 0, 13 N, P 32 , S 35 , 44 Sc, 45 Ti, 118 I, 136 La, 198 T1, 200 T1 ( 205 Bi and 206 Bi) , Including, but not limited to, fluorescent materials (fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, and Cy3 and Cy5), chemilumines, magnetic particles, mass labels, or electron dense particles It doesn't happen.
  • contrast media e.g. Gd chelate compounds
  • T2 contrast materials e.g. superparamagnetic materials (e.g. magnetite, Fe 3
  • the chemicals include, for example, anti-inflammatory drugs, analgesics, anti-arthritis agents, antispasmodics, antidepressants, antipsychotics, neurostabilizers, anti-anxiety agents, drug antagonists, Antiparkin's disease drugs, cholinergic agonists, anticancer agents, antiangiogenic agents, immunosuppressants, antiviral agents, antibiotics, appetite suppressants, analgesics, anticholinergic agents, antihistamines, antimigraine drugs, hormones, coronary vessels, cerebrovascular or peripheral blood vessels Dilators, contraceptives, antithrombicides, diuretics, antihypertensives, cardiovascular diseases treatment agents, cosmetic ingredients (eg, wrinkle improvement agents, skin aging inhibitors and skin lightening agents) and the like, but are not limited thereto.
  • cosmetic ingredients eg, wrinkle improvement agents, skin aging inhibitors and skin lightening agents
  • the biopharmaceutical is insulin, IGF-K insulin-like growth factor 1), growth hormone, erythropoietin, G-CSFs (gr anu 1 ocyt e-col ony stimulating factors), GM-CSFs (gr anu 1 ocyt e / macr ophage-co 1 ony stimulating factors, interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, interleukin-1 alpha and beta, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-6, interleukin-2, epidermal growth factors (EGFs) , Calcitonin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), tumor necrosis factor (TNF), atobisban, buserel in, cetrorel ix, deslorel in , Desmopressin, dynorphin A (1-13), elcatonin, eleidosin, epitif ibatide, GHRH-I I
  • the KPI-bipodal peptide binder of the present invention may bind to a biomolecule (eg, a protein) exposed to the cell surface, but may be in vivo in the cell. It can also bind to molecules (eg proteins) to modulate the activity of biological molecules.
  • a biomolecule eg, a protein
  • molecules eg proteins
  • the KPI-bipodal peptide binder targets intracellular proteins, preferably the KPI-bipodal peptide binder further comprises a cell transmembrane peptide (CPP).
  • CPP cell transmembrane peptide
  • the CPP includes various CPPs known in the art, for example
  • HIV-1 Tat protein Tat peptide analog (eg, ligoarginine), ANTP peptide, HSV VP22 transcriptional regulator protein, MTS peptide derived from vFGF, Penetratin, Transport an or Pep-1 peptide It is not.
  • Tat peptide analog eg, ligoarginine
  • ANTP peptide HSV VP22 transcriptional regulator protein
  • MTS peptide derived from vFGF vFGF
  • Penetratin Transport an or Pep-1 peptide It is not.
  • the CPP covalently binds the lysine residue of the loop portion at the structural stabilization site of the KPI-bipodal peptide.
  • CPP-bound KPI-bipodal peptide binders enter the cell to bind to and regulate (eg, inhibit) activity of the target protein.
  • the KPI-bipodal peptide binder of the present invention is typically "a strand of known peptide as a N-target binding site I-a strand of structural stabilization site-the other strand of a structural stabilization site-target binding site nc '' Has a construct of
  • target binding site I and one strand of the structure stabilization site and / or between the other strand-target binding site ⁇ of the structure stabilization site target binding It includes a structure influence inhibiting region that blocks the interstructural effects between the site and the structure stabilization site.
  • amino acids are located which are relatively free of rotation of ⁇ and ⁇ in the peptide molecule.
  • the amino acids with relatively free rotation of ⁇ and ⁇ are glycine, alanine and serine. 1-10, preferably 1-8, more preferably 1-3 amino acid residues may be located in the structure influence inhibitory site.
  • the library of KPI-bipodal peptide binders of the present invention having the constructs described above can be obtained by various methods known in the art.
  • the target binding site ⁇ of the PI-bipodal peptide binder is It will have a random sequence, meaning that there is no sequence preference or no designated (or fixed) amino acid residue at any position of the target binding site ⁇ .
  • a library of KPI-bipodal peptide binders can be used in the split-synthesis method (Lam et al. (1991) Nature 354: 82; WO 92/00091) performed on solid phase supports (eg, polystyrene or polyacrylamide resins).
  • solid phase supports eg, polystyrene or polyacrylamide resins.
  • the library of KPI-bipodal peptide binders is constructed in a cell surface display manner (eg, phage display, bacterial display or yeast display).
  • the library of PI-bipodal peptide binder may be prepared through a display method based on plasmids, bacteriophages, phagemids, yeasts, bacteria, mRNA or ribosomes.
  • Phage display is a technique for displaying various polypeptides in the form of proteins fused to coat proteins on the surface of the phage (SCOU, J.
  • Random peptides are displayed by fusing the gene to be expressed in gene ⁇ or gene VI of filamentous phage (eg, M13).
  • Phageimide may be used for the fiji display.
  • Phageimide is a plasmid vector with a copy of the bacterial origin (eg, ColEl) and one copy of the intergenic site of the bacteriophage. DNA fragments cloned in this phagemid are propagated like plasmids.
  • a preferred embodiment of the present invention comprises the following steps: (i) phage coat protein (eg, gene m of filamentous phage such as M13 or A fusion gene in which a gene coding for the gene free coat protein) and a gene encoding a KPI-bipodal peptide binder are fused; And transcriptional regulatory sequences operably linked to the fusion gene (eg lac Preparing a library of expression vectors (promoter); (ii) introducing said expression vector library into a suitable host cell; () Culturing the host cell to form recombinant phage or phagemid virus particles so that the fusion protein is displayed on the surface; (iv) contacting a biological target molecule with the viral particle to bind the particle to the target molecule; And (V) separating particles not bound to the target molecule.
  • phage coat protein eg, gene m of filamentous phage such as M13 or A fusion gene in which a gene coding for the gene free coat protein
  • the method of constructing an expression vector comprising a KPI-bipodal peptide binder gene may be performed according to methods known in the art.
  • known phagemid or phage vectors e.g. pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd-CAT1, IT1663, fdtetDOG, pHENl, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM54, PM54, PM54, PM54 Expression vectors can be constructed by inserting the KPI-bipodal peptide binder gene into fdH and p8V5).
  • phage display methods are performed using filamentous phage, but lambda phage display (W0 95/34683; US Pat. No. 5,627,024), T4 phage display (Ren et al. (1998) Gene 215: 439; Zhu (1997) CAN 33: 534) and T7 phage display (US Pat. No. 5,766,905) can also be used to build a library of KPI-bipodal peptide binders.
  • Suitable hosts for the present invention are cells that are Gram-negative bacterial cells such as E.
  • suitable E. coli hosts include JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-lBlue (Stratagene).
  • JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-lBlue (Stratagene).
  • JM101 JM101
  • E. coli K12 strain 294 E. coli strain W3110
  • E. coli XL-lBlue (Stratagene).
  • It is recommended that host cells be prepared as competent cells prior to transformation (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)).
  • step (c) may be carried out through various 10 methods known in the art. First, clones that bind to targets are selected from a library of KPI-bipodal peptide binders, in which case they can be selected through a biopanning process (Sambrook, J.
  • Target affinity can be determined by various methods known in the art, such as bimolecular interact ion analysis (BIA) (e.g. BIAcore TM ) (Sjo lander & Urbaniczky, Anal. Chew. 63: 23382345 (1991)). , Szabo et al., Curr. Opin.Struct. Biol.
  • BIA bimolecular interact ion analysis
  • the KPI-25 bipodal peptide binder selected in step (c) has a target affinity which is 2- 10000 times increased compared to the known peptide, more preferably 2-5000 times, 2- 4000 times, 2-3000 times, 2-2000 times, 50-10000 times, 50-5000 times, 50-4000 times, 50-3000 times or 50-2000 times, even more preferably 10 (3-2000 times, 200-2000 times, 500-2000 times, 70-1500 times or 500-1300 times.
  • the target affinity increase by the present invention is very thirty and unexpected.
  • the KPI- selected in step (c) The bipodal peptide binder has a dissociation constant () value of 0.1-10000 nM for the protein target.
  • the KPI-bipodal peptide binder selected in step (c) is the original bipodal peptide binder (original BPB), and the method further comprises the following steps after step (c)
  • the target affinity of the original BPB is increased by the following steps: (a 1 )
  • the sequence of any one of the target binding site I and the target binding site ⁇ of the original BPB is randomized to give the first affinity.
  • the KPI-bipodal peptide binder of the present invention not only has a use as a medicament, but also can be used for the detection of substances in vivo, in vivo molecular imaging, in vitro cell imaging and drug delivery, and as an escort molecule. Can be used.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the KPI-bipodal peptide binder described above.
  • the present invention provides a vector for expressing a bipodal peptide binder comprising a nucleic acid molecule encoding a KPI-bipodal peptide binder.
  • the present invention provides a transformant comprising a vector for expressing a KPI VB bipodal peptide binder.
  • nucleic acid molecule is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and is a basic component in nucleic acid molecules.
  • Nucleotide as a unit includes not only natural nucleotides but also analogs in which sugar or base sites are modified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543- 584 (1990).
  • the vector of the present invention is a powerful promoter capable of transferring transcription to the nucleic acid molecule in addition to the nucleic acid molecule encoding the PI-bipodal peptide binder (e.g., tac promoter, lac promoter, / 3dJV5).
  • promoter Ipp promoter, ⁇ promoter, ⁇ ⁇ ⁇ promoter, rac5 promoter, VIII promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • ribosomal binding site and transcription / detox termination sequence for initiation of translation include.
  • the vector of the present invention may further comprise a signal sequence (eg, pelB) on the 5'-direction of the nucleic acid molecule encoding the KPI-bipodal peptide binder.
  • the vector of the present invention further comprises a tagging sequence (eg, myc tag) for confirming that the KPI-bipodal peptide binder is well expressed on the surface of the phage.
  • the vector of the invention comprises a phage coat protein, preferably a gene encoding a filamentous phage gene m or gene VI coat protein.
  • the vector of the present invention comprises an origin of replication of bacteria (eg ColEl) and / or a bacteriophage.
  • the vector of the present invention may include antibiotic resistance genes commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo Resistance genes for mycin and tetracycline.
  • the transformants of the present invention are preferably Gram-negative bacterial cells such as E., and suitable E. coli hosts are JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 and E. coli XL-lBlue (Stratagene). It includes, but is not limited to.
  • the method for carrying the vector of the present invention into a host cell is described by CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110- 2114 (1973)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., /. Mo J.
  • the KPI-bipodal peptide binder of the present invention improves or improves known peptides in terms of target affinity, resulting in very low levels (e.g., n level) of values (dissociation constants), resulting in very high affinity to biological target molecules. It provides a peptide that represents.
  • the KPI-bipodal peptide binder technology of the present invention can greatly improve the utility of known peptides.
  • the present invention provides a method of increasing the target affinity of a bipodal peptide binder (BPB) comprising the following steps:
  • the present invention provides a bipodal peptide binder (BPB) having an increased target affinity by the above-described method of the present invention.
  • BBP bipodal peptide binder
  • the present inventors sought to develop a technique capable of optimizing the target affinity of the bipodal peptide binder previously developed by the present inventors. As a result, the inventors have developed a method that can optimize or maximize the target affinity of BPB very effectively while maintaining the overall structure of BPB.
  • BPB is an affinity peptide originally proposed by the present inventors, which may be referred to WO 2010/047515 for a detailed description.
  • the BPB target affinity optimization method of the present invention has many parts in common with the above-described method for improving the target affinity of the peptide, and the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • BPB BPB Specific examples of BPB are described in SEQ ID NO: 20-38 and 40-41.
  • the sequence of any one of the target binding site I and the target binding site ⁇ is randomized to construct a first affinity BPB library.
  • the method of constructing the first affinity BPB library can be carried out using various methods known in the art.
  • the first affinity BPB library will have a random sequence, which has no sequence preference or designated (or fixed) amino acid residue at any position of target binding site I and / or target binding site ⁇ . It means no.
  • a first affinity BPB library is disclosed in the split-synthesis method (Lam et al. (1991) Nature 354: 82; WO 92/00091) carried out on a solid support (eg, polystyrene or polyacrylamide resin). Can be built accordingly.
  • the library of bipodal peptide binders is constructed in a cell surface display manner (eg phage display, bacterial display or yeast display).
  • the library of bipodal peptide binders may be prepared through a display method based on plasmids, bacteriophages, phagemids, yeasts, bacteria, mRNA or ribosomes.
  • a preferred embodiment of the present invention comprises the following steps: (i) a phage coat protein (eg, gene m or gene of filamentous phage such as M13) A fusion gene in which a gene encoding a coat protein) and a gene encoding a bipodal peptide binder are fused; And constructing a library of expression vectors comprising transcriptional regulatory sequences (eg, lac promoters) operably linked to the fusion gene; ( ⁇ ) introducing the expression vector library into a suitable host cell; (Hi) culturing the host cell to form a recombinant phage or phagemid virus particle so that the fusion protein is displayed on the surface; (iv) contacting a biological target molecule with the viral particle to bind the particle to the target molecule; And (V) separating the particles that do not bind to the target molecule.
  • a phage coat protein eg, gene m or gene of filamentous phage such as M13
  • the method of constructing an expression vector comprising the gene of the first affinity BPB library can be carried out according to methods known in the art.
  • known phagemids or phage vectors eg, pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd-CAT1, m663, fdtetDOG, pHENl, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia)
  • Expression vectors can be prepared by inserting a bipodal peptide binder gene into LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH and p8V5).
  • the first affinity optimized BPB molecule is selected from the first affinity BPB library with an increased target affinity than the original BPB.
  • clones with increased target affinity are selected from the first affinity BPB library, which can be selected through biopanning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press (2004).
  • the target affinity of the peptides produced from the selected clones is analyzed through the biopanning process.
  • Target affinity is a variety of methods known in the art, for 'example bimolecular interaction analysis (bimolecular interact ion analysis: BIA) (e.g.,
  • the construction of the crab 2 affinity BPB library can be carried out according to the method for constructing the crab 1 affinity BPB library described above.
  • the number of added random amino acids is 1-10, preferably 1-5, more preferably 1-3, even more preferably 1-2.
  • a second affinity optimized BPB molecule with a higher target affinity than the first affinity optimized BPB molecule is selected from the second affinity BPB library.
  • the second affinity optimized BPB molecule can be carried out in the same manner as the selection of the first affinity optimized BPB molecule described above.
  • the second affinity optimized BPB molecule exhibits a 2-40 fold increase in target affinity compared to the original BPB. More preferably, the second affinity optimized BPB molecule exhibits an increased target affinity of 5-40 times, even more preferably 10-35 times, even more preferably 2-25 times compared to the original BPB. .
  • the second affinity optimized BPB molecule has a dissociation constant (K D ) value of 0.1-20 nM relative to the target. More preferably, the second affinity optimized BPB molecule has a dissociation constant () value of 0.1-10 nM, even more preferably 1 ⁇ 8 nM relative to the target.
  • the BPB optimized for the target affinity by the method of the present invention may have a very high affinity for the target.
  • the present invention provides a bipodal peptide binder (BPB) having an increased target affinity by the above-described method of the present invention.
  • BPB bipodal peptide binder
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding a bipodal peptide binder (BPB) having an increased target affinity as described above.
  • BBP bipodal peptide binder
  • the present invention is a method that can significantly improve the target affinity of a known peptide, which is very efficient and simple.
  • the present invention can increase the target affinity of known peptides, for example, by 1000 times.
  • the KPI-bipodal peptide binder technology of the present invention can greatly improve the utility of known peptides.
  • the present invention is a method of increasing the target affinity of a bipodal peptide binder (BPB), which is very efficient and simple.
  • BPB bipodal peptide binder
  • BPBs with increased target affinity by the present invention and methods exhibit very low levels (eg, nM levels) of values (dissociation constants), resulting in very high affinity to the target.
  • Figure 1 is a schematic diagram of the KPI-bipodal peptide binder technology of the present invention to increase the target affinity of conventional known peptides.
  • Figure 3a-3b is a colony ELISA results after affinity improvement for the target streptavidin by the KPI-BPB technology of the present invention.
  • Figures 4a-4b is the result of analyzing the target specificity of Strep_optil and Strep opt i2 KPI-BPB against streptavidin selected by the KPI-BPB technology of the present invention.
  • FIG. 8 shows the results of analyzing target specificities of VEGFRl_optil, VEGFRl_opti2 and VEGFRl_opti3, which are KPI-BPBs, for VEGFR1 selected by KPI-BPB technology.
  • Figure 9 shows KPI—BPB for VEGFR1 screened by KPI-BPB technology.
  • FIG. 10 is a schematic of the original bipodal peptide binder (original BPB).
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing an optimization process of BPB according to the present invention.
  • 12 shows colony ELISA results after BPB1 EDB optimization.
  • FIG. 13 shows target affinity measurement results for three crab 1 affinity optimized BPB molecules selected from the first affinity BPB library constructed after the first optimization.
  • FIG. 14 is a graph showing the output / input phage ratio of biopanning using the second affinity BPB library, BPB3 optimization library constructed after the second optimization.
  • FIG. 15 is a graph showing the output / input phage ratio of biopanning using the second affinity BPB library, BPB4 optimization library constructed after the second optimization.
  • FIG. 17 is a multiple alignment of amino acid sequences obtained through target affinity screening for the peptides in the C2 affinity BPB library, BPB4 optimization library constructed after the second optimization.
  • 18 shows affinity measurement results of the second affinity optimized BPB molecule BPB3.
  • 19 shows affinity measurement results of the crab 2 affinity optimized BPB molecule, BPB4.
  • 20 is target binding kinetic data for BPB1, BPB2, BPB3 and BPB4 at 250 nM.
  • BPB2 EDB _F1 4 ⁇ final concentration
  • BPB2 EDB _B1 4 ⁇ final concentration
  • 2.5 mM dNTP complex 4 ⁇ 1 Ex TaqDNA polymerase 1 ⁇ 1 (10 U) (Takara, Seoul , Korea)
  • 5 ⁇ l of 10 ⁇ PCR buffer and 25 mixtures of distilled water were added to a total of 50 ⁇ 1.
  • This mixture was double-stranded with PCR reaction (94 0 C 5 min, 60 cycle: 30 ° C 30 sec and 72 ° C 30 sec, 72 0 C 7 min), followed by PCR purification kit (GeneAU, Seoul, Korea Purified using).
  • the streptavidin binding peptide WSHPQFEK has affinity of 72 ⁇ M in 1996 and is known to specifically bind to streptavidin protein.
  • VEGFRK Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Binding Peptide GNQWFI was reported to bind specifically to the VEGFR1 protein in 2005. Here, the affinity is enhanced to improve the affinity of these peptides.
  • the library was designed and built.
  • This mixture was double stranded by PCR reaction (94 0 C 5 min, 60 cycle: 30 ° C 30 sec and 72 0 C 30 sec, 72 0 C 7 min), followed by PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea). Purified using).
  • restriction enzyme treatment was performed on the insert gene and the pIGT2 phagemid vector.
  • About 10yg of insert DNA was reacted with Sfil (NEB) and Notl (NEB) for 4 hours and purified using a PCR purification kit.
  • about 40 pIGT2 phagemid vectors were reacted with Sfil (NEB) and Notl (NEB) for 4 hours each, followed by 1 hour reaction with CIP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (NEB, Ipswich) and purified using a PCR purification kit. .
  • Streptavidin (10 / ig / O and BSA 10 wg /) was added to each well of a 96-well ELISA plate (Corning) by 50 ⁇ , then allowed to stand overnight at 4 ° C., followed by 3 with 0.1% PBST. After washing twice, using 2% BSA diluted with PBS and blocking for 2 hours at room temperature, the solution was discarded and washed three times with 0.1% PBST.
  • Streptavidin maturation was mixed with 800 ⁇ L of recombinant phage containing solution and 200% of 10% BSA 200 ⁇ into BSA-coated wells to remove BSA-binding phages and placed at 27 ° C for 1 hour. The supernatant was recovered and reacted with the straptavidin protein at 27 ° C for 1 hour. After 10 washes with 0.05% PBST, add 50 wells of 0.2 M glycine / HCKpH 2.2) 1 ⁇ to elute the phages for 20 minutes, collect 1 into the tube, and add 150 ⁇ of 2 M Tris-base (pH 9.0). The solution was neutralized.
  • OD 0.7
  • Ampicillin (50 ⁇ & / ⁇ ) and 20 mM glucose were mixed and then 2> ⁇ 10 10 pfu of Ex helper phage was added and incubated at 37 ° C for 1 hour at 200 rpm.
  • the culture solution was centrifuged at l, 000Xg for 10 minutes, the supernatant was removed, and the precipitated cells were resuspended in 1 LB medium containing ampicillin (50 ig / m ⁇ ) and kanamycin (25 g / m). Incubated for one day at 30 ° C. at 200 rpm. The supernatant was recovered by centrifuging the culture at 10,000 ⁇ g, 20 min and 4 ° C., and then 2% skim milk was added and used for phage peptide search.
  • Each 100 cloned amplified phage peptide solution was dispensed into the wells to which streptavidin protein was attached and the wells to which BSA protein was attached, and left at 27 0 C for 1 hour 30 minutes.
  • HRP-conjugate anti-M13 antibody (GE Healthcare) was diluted 1: 1,000 and reacted for 1 hour at 27 ° C.
  • 100 ⁇ aliquots of the TMB solution were used to induce a color reaction, and then reaction was stopped by the addition of 100 M 1 M HC1. The absorbance was measured at 450 nm to select clones 20 times more absorbent than streptavidin.
  • Plaques were inoculated into 4 m £ LB-Ampicillin (50 ⁇ g / O medium) using sterile tip After shaking culture at 37 ° C for one day, the plasmid was purified using a plasmid flap kit and commissioned for sequencing (Genotech, Dae j eon, Korea). Sequencing primers were used in the vector sequence 5'-GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3 '. VEGFR1 was performed in the same manner as above. Specificity experiment of phage binding to streptavidin protein
  • the recombinant phages 800 ⁇ and 10% BSA 200 / ⁇ of Strep_optil and Strep_opti2 were mixed well, and 100 ⁇ were dispensed into streptavidin, BSA, ovalbumin, and VEGF wells and allowed to stand at 27 0 C for 1 hour.
  • the HRP-conjugated anti-M13 antibody (GE Healthcare) was diluted 1: 1,000 and reacted for 1 hour at 27 0 C.
  • 100 ⁇ TMB solution was dispensed to induce color reaction, and then the reaction was stopped by adding 100 ⁇ of 1 M HC1. Absorbance was measured at 450 nm.
  • VEGFRl_optil VEGFRl_opt i 2, VEGFR1FRopti3
  • recombinant phages expressing these peptides were used for VEGFRl, VEGFR2, streptavidin, HSA, TF and VEGF.
  • Specificity was investigated. First, 50 g of 5 g / ml VEGFRl, VEGFR2, streptavidin, HSA, TNF and VEGF were placed in a 96-well ELISA plate at 4 0 C overnight, and the next day all wells were washed three times with 0.1% PBST and washed with PBS.
  • VEGFRl_optil here Recombinant phage 800 ⁇ and 10% BSA 200 ⁇ of VEGFRl_opti2 and VEGFRl_op 3 were well mixed and dispensed into streptavidin, BSA, ovalbumin, and VEGF wells by 100 ⁇ and left at 27 0 C for 1 hour.
  • HRP-conjugated anti-M13 antibody (GE Healthcare) was diluted 1: 1,000 and reacted at 27 0 C for 1 hour.
  • 100 ⁇ of TMB solution was dispensed to induce a color reaction, and then reaction was stopped by adding 100 M of 1 M HC1. Absorbance was measured at 450 nm.
  • the present invention provides a new method of improving the affinity of existing peptides.
  • Figure 1 known After finding a peptide that binds to a new binding site adjacent to a binding site on a target of a peptide (Reported linear peptide, Known peptide), the known peptide and the new binding site—the binding peptide are linked to the structure stabilization scaffold 100-1000 times. This can lead to the improvement of affinity.
  • phage libraries were prepared using known peptides, streptavidin-binding peptaad (WSHPQFEK) and peptides binding to VEGFR1 (GNQWFI).
  • the phage recovered in the last panning step of the affinity enhancing library of the peptide binding to straptavidin was obtained in plaque form. After amplifying 60 phages from each plaque, ELISA was performed for streptavidin and BSA (FIGS. 3A-3B). DNA sequencing was performed on 16 clones that showed absorbance three times greater than streptavidin. Two duplicate peptide sequences were obtained: Strep_optil: WSHPQFEKGGGSWTWENGKWTW G AHPQVR (SEQ ID NO: 42); Strep_opti2: WSHPQFEKGGGSWTWENGKWTWKG TLIHPM (SEQ ID NO: Sequence 43)
  • Optimized peptide Strep_optil control peptide WSHPQFEKol was synthesized and affinity was measured using the SPR Biacore system. As a result of measuring the affinity, the control peptide WSHPQFEK showed a 3 ⁇ 4 value of 82 ⁇ and the affinity-optimized Strep_optil showed 67 nM of 1223 times the affinity (FIG. 5).
  • the phage recovered in the last panning step of the affinity enhancing library of peptides binding to VEGFR1 was obtained in plaque form. After amplifying 30 phages from each plaque, ELISA was performed on VEGFR1 and BSA (FIG. 7). DNA cloning was performed on 12 clones that showed more than three times more absorbance than VEGFR1.
  • VEGFRl_opt i 1 GNQWFIGGGSWTWENGKWTWKGRIPKNR SEQ ID NO: 44
  • VEGFRl_opti2 GNQWFIGGGSWTWENGKWTWKGKLQNPM
  • VEGFRl_opti3 GNQQFI ⁇ GS
  • VEGFRl_optil Specificity of VEGFRl_optil, VEGFRl_opti2 and VEGFRl_opti3
  • BPB3 ⁇ 4 DB _F1 4 ⁇ final concentration
  • BPB2 EDB _B1 4 ⁇ final concentration
  • 2.5 mM dNTP complex 4 ⁇ Ex TaqDNA polymerase 1 ⁇ 1 (10 U) (Takara, Seoul, Korea)
  • 10 25 PCR mixtures were prepared by mixing 5 ⁇ l of PCR complete solution and adding distilled water to a total of 50 ⁇ . This mixture was double-stranded using PCR reaction (94 ° C 5 minutes, 60 cycles: 30 ° C 30 seconds and 72 ° C 30 seconds, 72 ° C 7 minutes), followed by PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea Purified using).
  • BPB2 EDB maturation was mixed in a solution containing 800 ⁇ and 10% BSA 200 ⁇ in 20 wells that were BSA-coated with straptavidin to remove phages that bind to straptavidin and BSA. Place at 27 ° C. The supernatant was recovered and mixed with 100 g / m ⁇ BPBIEDB for competitive biopanning. In other words, the solution was transferred to 20 wells combined with ED-B and reacted at 27 ° C. for 30 minutes to bind to EDB, although the affinity was better than that of BPB1 EDB .
  • BPB3 EDB _F1 4 ⁇ M final concentration
  • BPB3EDB-B1 4 ⁇ final concentration
  • eu 2.5 mM dNTP common compound 4 ⁇ 1 Ex TaqDNA jeunghap enzyme 1 ⁇ 1 (10 U) ( Takara, Seoul, Korea)
  • 10 ⁇ PCR complete solution 5 ⁇ 1 was mixed and 10 mixtures were added to the distilled water to add a total of 50 ⁇ .
  • BPB4 EDB _F1 4 ⁇ final concentration
  • BPB4 EDB _B1 4 ⁇ final concentration
  • 2.5 mM dNTP common compound 4 ⁇ 1 Ex TaqDNA polymerase 1 ⁇ 1 (10 U) to make the BPB4 EDB double-stranded insert (Takara, Seoul, Korea)
  • 10 x PCR buffer 5 ⁇ 1 was mixed and 10 mixtures with distilled water added to make a total of 50 ⁇ 1.
  • CIP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
  • the culture was centrifuged at l, 000Xg for 10 minutes, then the supernatant was removed and the cells were precipitated with 1 m LB medium containing ampicillin (50 / g / m ⁇ ) and kanamycin (25 / g /). Resuspend and incubate for one day at 30 ° C. at 200 rpm. The supernatant was recovered by centrifuging the culture at 10,000 ⁇ g, 20 min and 4 ° C., and then 2% skim milk was added and used for phage peptide search.
  • Bipodal tide binders found in BPB2 EDB , BPB3 ⁇ 4 DB and BPB4 EDB maturation libraries were synthesized (Anigen, Korea). Affinity was measured using BIAcore XCBiacore AB, Uppsala, Sweden). Biotin-EDB was immobilized on the straptavidin SA chip (Biacore) by as much as 2,000 RU. PBS (pH 7.4) was used as the running buffer, and the flow was measured at various concentrations while holding at 30 ⁇ per minute, and then the affinity was calculated using BIAevaluation software (Biacore AB, Uppsala Sweden). Experiment result
  • Stable beta-hairpin motifs were used as scaffolds of the BPB (Bipodal-peptide binder).
  • Trpzip was used to stabilize the beta-hairpin motif structure by the interaction of tryptophan-tryptophan amino acids.
  • Two regions of variable regions were generated by randomly arranging six amino acids in each of the N ′ and C-terminal portions of the skeleton Trpzip (FIG. 10).
  • the process of creating an affinity optimization library of BPB is shown in FIG. First, we find a BPB2 by screening the target by making a library that fixes one binding portion of the bipodal-peptide binder (BPB1) found for one target and randomizes the other binding portion again. Then, libraries can be screened by adding one or two random sequences to both binding portions of BPB2 to screen BPB3 and BPB4 to optimize BPB1.
  • the phage recovered in the last panning step of the ⁇ 2 affinity optimization library was obtained in plaque form. After amplifying 54 phages from each plaque, ELISA was performed on ED-B and streptavidin (see FIG. 12). Most of ED-B showed higher absorbance than streptavidin and DNA sequencing of 24 clones showed 20 times more absorbance than streptavidin. A total of three duplicate peptide sequences were obtained:
  • ADGRVRGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ (SEQ ID NO: 48);
  • Peptides 1, 2 and 3 were synthesized and measured for affinity using the SPR biacore system. As a result, peptide 1 showed 115 nM, peptide 2 showed 35 nM, and peptide 3 showed 16 nM (see FIG. 13). Build and screen a second optimized library
  • the bio-panning was carried out four times for the ED-B protein and the phage recovered at each panning step.
  • the output phage / input phage ratio of the peptides was determined (FIGS. 14-15). Phage ELISA after second optimization
  • the phage recovered in the last panning step of the BPB3 and BPB4 optimization libraries was obtained in plaque form. After amplifying 60 phages from each plaque, EL-ISA was performed on ED-B and straptavidin, and DNA was sequenced to clones showing 20 times more absorbance than streptavidin. This yielded the sequence shown in FIGS. 16-17. Affinity measurement
  • BPB3 and BPB4 peptides were synthesized and affinity was measured using the SPR biacore system.
  • affinity was measured using the SPR biacore system.
  • BPB3 showed 5.7 nM and ⁇ 4 showed a K D value of 3.5 ⁇ , which is an improved affinity value compared to BPB2 (FIGS. 18-19).

Abstract

본 발명은 단백질 타겟에 결합하는 펩타이드의 타겟 친화도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 공지 펩타이드의 타겟 친화도를 획기적으로 향상시킬 수 있는 방법으로서, 매우 효율적이면서도 간단하다. 본 발명에 의하여, 공지 펩타이드의 타겟 친화도를 예컨대 1000배 증가킬 수 있다. 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더 기술은 공지의 펩타이드의 응용성을 크게 향상시킬 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭]
펩타이드의 타겟 친화도 개선방법
【기술분야】
본 특허출원은 2012년 07월 27일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0082696호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 펩타이드 또는 BPB bipodal peptide binder)의 타겟 친화도 개선방법에 관한 것아다.
【배경기술]
항체는 B 세포가 생산하는 혈장단백질의 일종인 면역글로불린 단백질로써 외부에서 들어온 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 항원을 비활성화하거나 무력화시킨다. 이러한 항원 -항체 반웅의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원을 구별할 수 있는 항체의 다양성을 웅용하여 오늘날 진단제와 치료제 등올 포함하는 많은 종류의 항체 제품이 출현하게 되었다. 현재 FDA에서는 21개의 단일클론항체를 승인하였으며 리턱시맵 (Rituximab) 및 헤르셉틴 (Herceptin)과 같은 항쎄는 다른 치료에서 전혀 반웅을 보이지 않던 환자들의 50% 이상에서 효과를 보인바 있으며 실질적으로 여러 연구에서 단일클론항체를 이용하여 림프종， 대장암 또는 유방암 등에 성공적인 임상치료를 보여주고 있다. 치료용 항체의 전체 시장 규모는 2004년 100억 달러 규모에서 2010년에는 300억 달러로 연평균 20%의 성장률을 보일 것으로 추정하고 있으며, 그 시장 규모는 기하급수적으로 증가할 것으로 추정되고 있다. 항체를 이용한 신약개발이 활발해지는 이유는 약품의 개발기간이 짧으며 투자비용이 작고 부작용을 쉽게 예측할 수 있기 때문이다. 또한 항체는 생약이어서 인체가 거의 영향을 받지 않으며 체내에서의 반감기가 저 분자량 약품에 비하여 압도적으로 길어서 환자에게 친화적이다. 이러한 유용성에도 불구하고 인간에서 단일클론항체는 외래 항원으로 인식하여 심한 알레르기 반응 또는 과민반웅을 일으키기도 한다. 또한， 이러한 항암 기능의 단클론 항체를 임상적으로 사용할 경우 생산 단가가 높기 때문에 치료제로서의 가격이 급격히 상승한다는 단점이 있으며， 항체를 배양하는 방법 및 정제 방법 등 광범위한 분야의 기술들이 각종 지적 소유권에 의해 보호받고 있기 때문에 비싼 라이센싱비를 지불해야 한다.
따라서 이 문제를 해결하기 위해서 미국올 중심으로 유럽연합에서 항체 대체 단백질 개발이 태동기에 있다. 항체 대체 단백질은 항체와 같이 불변영역과 가변영역을 가질 수 있도특 만든 재조합 단백질로 크기가 작고 안정한 단백질의 일정부분을 무작위 서열의 아미노산으로 바꾸어 라이브러리를 만들고 이를 표적물질에 대해 스크리닝을 하여 높은 친화력과 좋은 특이성을 가진 물질을 찾을 수 있다. 예를 들어 항체 대체 단백질중 아비머 (avimer)와 아피바디 (af f ibody)는 표적물질에 대해 피코몰 (picomole) 정도의 친화력올 가진 예시가 보고되어 있다. 이런 항체 대체 단백질은 크기가 작고 안정해서 암세포에 깊이 침투 가능하며 일반적으로 면역반웅을 적게 일으킨다고 보고되어 있다. 그리고 무엇보다도 광범위한 항체 특허 문제에서 벗어 날 수 있으며 박테리아에서 쉽게 대량정제 할 수 있기 때문에 생산단가가 낮아 경제적으로 항체보다 큰 장점을 가진다. 현재 개발된 항체 대체 단백질은 40개가 있으나 이 중 벤처 회사나 다국적 제약회사에서 상용화를 시도하고 있는 항체 대체 단백질은 피브로넥틴 타입 ΠΙ 도메인, 리포칼린， LDLR-A 도메인， 크리스탈린， 프로테인 A, 안키린 리피트 (Ankyrin repeat), BPTI 라는 단백질을 이용하고 있으며 타겟에 대한 피코몰에서 수 나노몰정도의 높은 친화력을 가지고 있다. 그 중 애드넥틴 (Adnectin), 아비머, 쿠니츠 (Kunitz) 도메인은 현재 FDA 임상 실험이 진행 중이다.
한편， 펩타이드는 항체에 비해 적절한 약물동력학， 대량생산성， 낮은 독성, 항원성 억제 및 낮은 생산 단가 등으로 인해 현재 항체 치료제를 대체하여 다양하게 활용되고 있다. 치료용 약으로서의 펩타이드의 장점은 생산 단가가 낮고， 안전성 및 반웅성이 높으며， 특허 로알티가 상대적으로 저렴하고， 원하지 않는 면역시스템에 덜 노출되어 펩타이드 자체에 대한 항체 생산을 억제 할 수 있으며, 합성을 통한 변형이 쉽고 정확하다는 것이다. 그러나 대부분의 펩타이드는 항체에 비해 특정 단백질 타켓에 대해 낮은 친화력 및 특이성을 보이기 때문에 여러 응용분야에 사용되지 못하는 단점이 있다. 따라서， 펩타이드의 단점을 극복할 수 있는 새로운 펩타이드 기반 항체 대체 단백질 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다.
이에 본 발명자들은 생물학적 타겟 분자에 높은 친화성으로 특이적 결합이 가능한 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 독특한 구조적 전략이 내포된 "바이포달 펩타이드 바인더 (BPB)"를 제안한 바 있다 (참조: W0 2010/047515) . 이 BPB는 분자량이 비교적 매우 작지만， 타겟에 대한 친화도가우수하여 항체 대체 물질로서 개발 가능성이 매우 큰 물질이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 공지의 타켓 -결합 펩타이드의 타겟 친화도를 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 공지의 타겟 -결합 펩타이드에 본 발명자들에 의해 종래 개발된 바이포달 펩타이드 바인더 (Bipodal Peptide Binder: BPB)의 구조적 특징을 부가하는 경우에는， 공지의 타겟 -결합 펩타이드의 타겟 친화도가 크게 증가함을 규명함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
또한， 본 발명자들은 본 발명자들에 의해 종전에 개발된 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟 친화도를 최적화할 수 있는 기술을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 BPB의 전체적인 구조는 유지하면서 매우 효과적으로 BPB의 타겟 친화도를 최적화 또는 최대화할 수 있는 방법을 개발함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 단백질 타겟에 결합하는 펩타이드의 타겟 친화도를 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 증가된 타겟 친화도 (target affinity)를 갖는 KPI-바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)를 제공하는 데 있다.
따라서 본 발명의 목적은 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)의 타겟 친화도 (target affinity)를 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 증가된 타겟 친화도 (target affinity)를 갖는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder： BPB)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 증가된 타¾ 친화도 (target affinity)를 갖는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
[과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 단백질 타겟에 결합하는 펩타이드의 타겟 친화도를 증가시키는 방법을 제공한다:
(a) 상기 단백질 타겟에 대하여 결합 친화도를 갖는 공지 펩타이드 (known peptide)를 수득하는 단계;
(b) (i) 가닥간 (interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴 (parallel), 안티패러럴 (antiparal lei ) 또는 패러럴 (paral lei)과 안티패러럴 (antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위 (structure stabilizing region); (ii) 상기 구조 안정화 부위의 한쪽 말단에 결합된 타겟 결합 부위 I (target binding region I)으로서의 상기 공지 펩타이드， 상기 구조 안정화 부위의 다른 쪽 말단에 n개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π )를 포함하는 ΚΡΙ- 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 제공하는 단계 ;
(b) 상기 라이브러리와 타겟을 접촉시키는 단계 ; 그리고， (c) 상기 타켓과 결합된 KPI-바이포달 펩타이드 바인더를 선택하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 증가된 타겟 친화도 (target affinity)를 갖는 KPI-바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)를 제공한다. 본 발명자들은 공지의 타겟 -결합 펩타이드의 타겟 친화도를 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 공지의 타겟 -결합 펩타이드에 본 발명자들에 의해 종래 개발된 바이포달 펩타이드 바인더 (Bipodal Peptide Binder: BPB)의 구조적 특징을 부가하는 경우에는, 공지의 타겟 -결합 펩타이드의 타겟 친화도가 크게 증가함을 규명하였다.
본 발명은 기본적으로 BPB의 구조를 웅용한다. BPB는 본 발명자들에 의해 최초로 제안된 타겟-친화성 펩타이드로서 이에 대한 상세한 설명은 W0 2010/047515를 참조할 수 있다.
공지의 펩타이드들은 대부분 낮은 타겟 친화력 때문에 여러 가지 웅용에 한계점을 가지고 있다. 본 발명은 공지의 펩타이드의 친화력을 개선하는 새롭고 획기적인 방법을 제시한다. 본 발명의 기본적인 사상은 공지의 펩타이드가 결합하는 타겟 단백질의 부위에 인접한 새로운 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 상기 공지 펩타이드와 함께 구조안정화 스케폴드에 연결하여 타겟 친화도가 개선된 타겟 -결합 펩타이드 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법은 공지 펩타이드 ( now Eeptide)의 친화력을 개선 (Improving)하는 기술이며 이 경우 본 발명자들의 구조가 채택된다. 따라서， 본 발명의 기술은 "KPI-바이포달 펩타이드 바인더 " 또는 "KPI- BPB"라 명명된다.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 단백질 타켓에 대하여 결합 친화도를 갖는 공지 펩타이드 (known peptide)를 수득한다.
본 명세서에서 용어 "공지 펩타이드 (known peptide) 수득"은 공지 펩타이드 또는 공지 펩타이드를 코딩하는 핵산서열의 합성， 또는 공지 펩타이드의 아미노산 서열 및 핵산서열에 대한 정보를 얻는 것을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 공지 펩타이드는 단백질 타겟에 결합하는 어떠한 공지 펩타이드도 포함한다.
본 명세서에서 단백질 타겟은 당업계에 공지된 어떠한 단백질 타겟도 포함한다. 예를 들어 , 상기 단백질 타겟은 효소 , 리간드， 수용체， 바이오마커， 호르은 전사인자， 성장인자 면역글로블린， 신호전달단백질, 결합단백질, 이온채널， 항원， 부착단백질， 구조단백질， 조절단백질， 독소단백질， 사이토카인 및 혈액 응고 인자를 포함하나， 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 상기 단백질 타겟은 ED-B(Fibronectin extra domain B) , VEGF( vascular endothelial growth factor) , VEGFR(vascular endothel ial growth factor receptor) , VCAMKvascular cell adhesion molecule-1) , nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor) , HSA( Human serum albumin) , MyD88 , EGFR(Epi dermal Growth Factor Receptor) , HER2/neu , CD20, CD33, CD52, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), IgE (Immunoglobulin E) , CD11A ( α -chain of lymphocyte function—associated antigen 1)， CD3, CD25, 당단백질 Ilb/IIIa, 인테그린， AFP(Alpha- fetoprotein) , β 2M(Beta2-microglobul in) , BTA( Bladder Tumor Antigens), NMP22, 암항원 125, 암항원 15-3， 칼시토닌， Carcinoembryonic Antigen, 크로모그라닌 A, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체， hCGCHuman Chorionic Gonadotro in), 뉴런ᅳ특이 에놀라아제， PSA(Prostate-Specif ic Antigen), PAP(Prostatic Acid Phosphatase), 타이로글로블린; 사이토카인 [TNF( tumor necrosis factor) alpha, TNF beta, 인터루킨 -10(IL- 10), 인터페론 beta(IFNP)， 인터페론 alpha(IFNa), 인터페론 ga画 a (IFN γ ) , granulocyte colony stimulating factor (G—CSF)， leukemia inhibitory factor (LIF) , 인간성장호르몬 (hGH)， ciliary neurotrophic factor (CNTF), 렙틴， oncostatin M, 인터루킨 -6 (IL-6), 인터루킨 -12 (IL- 12) , EPO(erythropoietin) , granulocyte一 macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), 인터루킨 -2 (IL-2), 인터루킨 -3 (IL— 3), 인터루킨 -4 (IL- 4), 인터루킨 -5 (IL-5), 인터루킨 -13 (IL-13), F1U3 ligand 및 줄기세포인자 (SCF)]; G-단백질 커플드 수용체 (GPCR) [바람직하게는 Class A (or 1) (Rhodopsin-1 ike) , Class B (or 2) (Secret in receptor family), Class C (or 3) (Metabotro ic g 1 ut amat e/ Her omone ) , Class D (or 4) (Fungal mating pher omone receptors) , Class E (or 5) (Cyclic AMP receptors) 및 Class F (or 6) (Fr izzled/Smoothened) GPCRs를 포함하며， 보다 바람직하게는 a luteinizing hormone 수용체, a follicle stimulating hormone 수용체， a thyroid .stimulating hormone 수용체， a calcitonin 수용체， a glucagon 수용체, a glucagon-1 ike peptide 1 수용체 (GLP-1), a metabotro ic glutamate 수용체, a parathyroid hormone 수용체, a vasoactive intestinal peptide 수용체, a secret in 수용체, a growth hormone releasing factor (GRF) 수용체, protease— activated 수용체 (PARs), cholecystokinin 수용체 , somatostat in '수용체 , melanocort in 수용체， ADP 수용체， adenosine 수용체， thromboxane 수용체, platelet activating factor 수용체， adrenergic 수용체, 5-HT 수용체, CXCR4, CCR5, chemokine 수용체， neuropeptide 수용체, opioid 수용체, parathyroid hormone (PTH) 수용체, ghrelin 수용체 및 vasoactive intestinal peptide (VIP) 수용체， formyl peptide 수용체， sex peptide 수용체]; RTKCReceptor tyrosine kinase) [예컨대， Epidermal growth factor 수용체 패밀리， Insulin 수용체 패밀리, Platelet derived groowth factor 수용체 패밀리, Fibroblast growth factor 수용체 .패밀리， . Vascular endothelial growth factor 수용체 패밀리, HGF 수용체 패밀리, Trk 수용체 패밀리， Eph 수용체 패밀리， AXL 수용체 패밀리， LTK 수용체 패밀리, TIE 수용체 패밀리, R0R 수용체 패밀리， DDR 수용체 패밀리 , RET 수용체 패밀리 , KLG 수용체 패밀리 및 RYK 수용체 패밀리, MuSK 수용체 패밀리]; 그리고 전사인자 [예컨대， API, AP-2, ARE, Brn-3, C/EBP, CBF, CDP, c-Myb, CREB, E2F-1, EFR, ERE, Ets, Ets-1/PEA3, FAST-1, GAS/ I SRE, GATA, GRE, HNF-4, IRF-1, MEF-1, MEF-2, Myc-Max, NF-1, NFATc , NF-E1, NF-E2, NFKB, Oct-1, p53, Pax-5, Pbxl, Pit 1, PPAR, PRE, RAR, RAR (DR-5), SIE, Smad SBE, Smad3/4, SPl, SRE, Statl, Stat3, Stat4, Stat4, Stat5, Stat6, TFIID, TR, TR(DR-4), USF-1, VDR (DR-3), HSE, 및 MRE]를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 이용되는 공지 펩타이드는 타겟 단백질에 대하여 친화도를 갖는 범위 내에서, 특별한 서열 및 길이가 요구되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 공지 펩타이드의 길이는 4-100 아미노산 잔기， 보다 바람직하게는 4-50 아미노산 잔기 , 5-30 아미노산 잔기, 5-20 아미노산 잔기 또는 5-10 아미노산 잔기이다. KPI-바이포달 펩타이드 바인더에서， 구조 안정화 부위는 타겟 결합 부위 I으로서의 공지 펩타이드와 타겟 결합 부위 Π가 효율적으로 안정되게 타겟 단백질에 결합하도록 한다. 타겟 결합 부위 Π는 바람직하게는， 공지 펩타이드가 결합하는 타겟 단백질의 부위에 인접한 부위에 결합하는 펩타이드이다.
본 발명에서 이용 가능한 구조안정화 부위는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며， 가닥간 (interstrand) 수소결합， 정전기적 상호작용, 소수성상호작용， 반데르 발스 상호작용， 파이 -파이 상호작용， 양이온 -파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다. 가닥간 수소결합, 정전기적 상호작용， 소수성상호작용， 반데르 발스 상호작용， 파이—파이 상호작용， 양이온 -파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성 (rigidity)에 기여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위에서의 가닥간 (interstrand) 비공유결합은 수소결합, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용， 파이 -파이 상호작용 또는 이들의 조합을 포함한다.
선택적으로， 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 본 명세서에서 가닥을 언급하면서 사용되는 용어 "링커 "는 가닥과 가닥을 연결시켜 주는 물질을 의미한다. 예컨대， 구조안정화 부위로서 β-헤어핀이 이용되는 경우에는 β-헤어핀에 있는 턴 서열이 링커의 역할을 하며, 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 루이신 지퍼의 두 C-말단을 연결하는 물질 (예컨대, 펩타이드 링커)이 링커의 역할을 한다.
링커는 패러럴， 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대， 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥 (바람직하게는 2개의 가닥)， 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥 (바람직하게는 2개의 가닥)， 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3개의 가닥 (바람직하게는 3개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 턴 서열은 β_턴, Υ-턴， α-턴， π-턴 또는 0)-100)이다(¥6111<:^3(:1131 CM (1968), Biopolymers, 6， 1425-1436； Nemethy G and Printz MP. (1972), Macrowolecules, 5, 755- 758； Lewis PN et al . , (1973), Biochim. Biophys. Acta, 303, 211-229； Toniolo C. (1980) CRC Crit. Rev. Biochem., 9， 1-44； Richardson JS. (1981), Adv. Protein Chew. , 34, 167-339； Rose GD et al . , (1985), Adv. Protein Che . , 37, 1-109； Milner-White EJ and Poet R. (1987), TIBS, 12, 189-192； Wilmot CM and Thornton JM. (1988)， J. Mol. Biol. , 203, 221- 232； Milner-White EJ. (1990), J. Mol. Biol. , 216， 385-397； Pavone V et al. (1996)， Biopolymers, 38, 705-721； Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996)， Protein Sci . , 5, 932-946). 가장 바람직하게는， 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 _턴이다.
턴 서열로서 β-턴이 이용되는 경우， 바람직하게는 타입 I， 타입 Γ , 타입 Π, 타입 Π', 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I， 타입 Γ , 타입 Π , 타입 π' 턴 서열이고， 보다 더 바람직하게는 타입 Γ 또는 타입 π' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 턴 서열이다 (B. L. Sibanda et al . , J. Mol. Biol. , 1989， 206, 4, 759- 777； B. L. Sibanda et al. , Methods Enzymol. , 1991, 202, 59-82).
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 턴 서열로서 이용될 수 있는 것은 H. Jane Dyson et al. , Eur. J. Biochem. 255 :462-471 (1998)에 개시되어 있으며， 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 턴 서열로 이용될 수 있는 것은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: X-Pn)-Gly-Glu-Val； Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다).
본 발명의 일 구현예에 따라, 구조안정화 부위로서 β-쉬트 또는 루이신 지퍼가 이용되는 경우, 패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥 또는 안티패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥을 펩타이드 링커가 연결하는 것이 바람직하다.
펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션 (flexible extended conformation)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Glyᅳ Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Marat ea et al .， Gene 40： 39-46 ( 1985)； Murphy et al. , Proc. Natl. Acad Sci . USA 83:8258-8562(1986)； 미국 특허 제 4,935,233호， 제 4，751，180호 및 거 15, 990 ,275호에 개시되어 있다. 펩타이드 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 구조안정화 부위는 β-헤어핀， 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게는 구조안정화 부위는 β-헤어핀 또는 링커로 연결된 β- 쉬트이며， 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다.
본 명세서에서 용어 "β-헤어핀 "은 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며 , 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴한 정렬을 나타낸다. 이 β-헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다.
바람직하게는， β-헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I， 타입 Γ , 타입 π, 타입 π', 타입 m 또는 타입 m' 턴 서열이고， 보다 바람직하게는 타입 I， 타입 Γ , 타입 Π， 타입 Π' 턴 서열이고， 보다 더 바람직하게는 타입 Γ 또는 타입 π' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 Γ 턴 서열이다. 또한， X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X—Gly— Glu—Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-
Ma-Thr-Lys-Thr이고， 타입 Γ 턴 서열은 Glu-Asn—Gly-Lys이며， 타입 Π 턴 서열은 X-Pn)-Gly-Ghi-Val； 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)이고， 타입 Π' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn-Lys이다.
β_헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어， 미국 특허 제 6,914,123호 및 Andrea G. Cochran et al. , PNAS, 98(10) :5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼， W0 2005/047503에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱， 미국 특허 게 5, 807,979호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도 β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 Smith & Regan (1995) Science 270： 980-982； Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47 :251-276； Kim & Berg
(1993) Nature 362:267-270； Minor & Kim (1994) Nature 367:660—663; Minor & Kim (1993) Nature 371:264-267； Smith et al. Biochemistry
(1994) 33:5510-5517； Searle et al . (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999- 1006； Haque & Gel 1 man (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2303—2304; Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1： 133-144； de Alba et al. (1997) Protein Sci. 6:2548-2560； Rami rez-Alvar ado et al . (1996) Nat. Struct. Biol . 3:604-612； St anger & Gel 1 man (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237； Maynard & Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298； Griffiths-Jones et al . (1998) Chem. Co隱 un. 789-790； Maynard et al . (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996- 2007； 및 Blanco et al . (1994) Nat. Struct. Biol. 1:584-590에 개시되어 있으며， 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
β-해어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼를 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 이용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I로 표시된다:
일반식 I
X厂 Trp(X2)¾-X4-X5(X'2)X6-X7
¾은 Ser 또는 Gly-Glu이고， 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, lie, Phe 또는 Tyr이며， ¾는 Trp 또는 Tyr이고， X4는 타입 I， 타입 Γ 타입 Π， 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， ¾는 Trp또는 Phe이며 X6는 Trp또는 Val이고， X7는 Lys또는 Thr-Glu이다.
보다 바람직하게는， 상기 일반식 I에서 ¾은 Ser 또는 Gly-Glu이고， ¾ 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며， ¾는 Trp 또는 Tyr이고, 는 타입 I， 타입 1'， 타입 Π 또는 타입 Π' 턴 서열이고, ¾는 Trp또는 Phe이며， ¾는 Trp또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 더 바람직하게는， 일반식 I에서 ¾은 ser 또는 Gly-Glu이고, ¾ 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며， ¾는 Trp이고, 는 타입 I， 타입 1'， 타입 Π 또는 타입 Π' 턴 서열이고， ¾는 Trp이며， X6는 Trp이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 더욱 더 바람직하게는， 일반식 I에서 은 Ser이고， 및
X'2는 Thr이며， ¾는 Trp이고, 는 타입 Γ 또는 타입 Π' 턴 서열이고， Χ5는 Trp이며, ¾는 Trp이고， X7는 Lys이다.
가장 바람직하게는， 일반식 I에서 ¾은 Ser이고, 및 X'2는 Thr이며， ¾는 Trp이고, 는 타입 Γ 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 Π' 턴 서열 (EGNK)이고， ¾는 Trp이며， ¾는 Trp이고, X7는 Lys이다.
본 발명에 적합한 트립토판 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 게 1서열 내지 제 3서열 및 제 5서열 내지 제 10서열에 기재되어 있다. 본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용가능한 β-해어핀 펩타이드는 단백질 G의 B1 도멘인으로부터 유래된 펩타이드， 즉 GB1 펩타이드이다.
본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Π로 표시된다:
일반식 Π
Xi-Trp-X2-Tyr-¾— Phe-Thr-Va 1 -
¾은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고 ¾는 Gin 또는 Thr이몌 ¾는 타입 1, 타입 1'， 타입 π, 타입 π' 또는 타입 m 또는 타입 m' 턴 서열이고， 는 Gin, Thr-Glu또는 Gln-Glu이다.
보다 바람직하게는， 일반식 Π의 구조안정화 부위는 다음 일반식 ΙΓ으로 표시된다:
일반식 Π
X1-Trp-Thr-Tyr-X2-Phe-Thr-Val-X3 ¬은 Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, ¾는 타입 I, 타입 Γ, 타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， ¾는 Thr-Glu또는 Gln- Glu이다.
본 발명에 적합한 GB1 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 계 4서열 및 제 14서열 내지 제 15서열에 기재되어 있다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 β-헤어핀 펩타이드는 HP 펩타이드이다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우， 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 ΠΙ으로 표시된다:
일반식 m
X厂 X2— ¾-Trp— X4-X5-Thr-X6-X7
¾은 Lys 또는 Lys-Lys이고， X2는 Trp 또는 Tyr이고， ¾는 Val 또는
Thr이며， X4는 타입 I， 타입 Γᅳ타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 m 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， X5는 Trp 또는 Ala이며， ¾는 Trp 또는 Val이고， X7은 Glu 또는 Gln-Glu이다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β-헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 IV로 표시된다:
일반식 IV
Xi-X2-X3- rp-X4
¾은 Lys-Thr 또는 Gly이고， ¾는 Trp 또는 Tyr이고, ¾는 타입 I， 타입 1'， 타입 Π, 타입 Π' 또는 타입 ΙΠ 또는 타입 ΠΓ 턴 서열이고， 는 Thr-Glu또는 Gly이다.
일반식 III 및 IV의 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제 11서열 내지 제 12서열， 제 15서열 및 제 16서열 내지 제 19서열에 기재되어 있다.
본 발명에 따르면， 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 이용할 수 있다. β-쉬트 구조에서 패러럴 또는 안티패러럴한， 바람직하게는 안티패러럴한 두 개의 아미노산 가닥이 뻗은 구조 (extended form)로 되어 있으며, 아미노산 가닥 사이에 수소 결합이 형성된다.
β-쉬트 구조에서 두 개의 아미노산 가닥의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결된다. 링커로서는 상술한 다양한 턴 -서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있다. 턴-서열이 링커로 이용되는 경우， β—턴 서열이 가장 바람직하다. 본 발명의 다른 변형예에 따르면， 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼가 이용될 수 있다. 루이신 지퍼는 패러럴한 2개의 α-사슬의 다이머화를 야기하는 보존성 펩타이드 도메인이며， 일반적으로 유전자 발현에 관여하는 단백질에 발견되는 다이머화 도메인이다 ("Leucine scissors" . Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London: Portland Press; Lands chulz H, et al. (1988) Science 240:1759-1764). 루이산 지퍼는 일반적으로 헵태드 (heptad) 반복 서열을 포함하며, 루이신 잔기가 4번째 또는 5번째에 위치해 있다. 예를 들어， 본 발명에 이용될 수 있는 루이신 지퍼는 LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LEDKVEE, LENEVAR 또는 LLSK YH의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 루이신 지퍼의 구체적인 예를 서열목록 제 39서열에 기재되어 있다. 루이신 지퍼의 각각의 반은 짧은 α-사슬로 이루어져 있으며, α-사슬간의 직접적인 루이신 접촉이 있다. 전사인자에 있는 루이신 지퍼는 일반적으로 소수성 루이신 지퍼 부위 및 염기성 부위 (DNA 분자의 주 그루브와 상호작용하는 부위)로 이루어져 있다. 본 발명에서 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 염기성 부위는 반드시 필요로 하지 않는다. 루이신 지퍼 구조에서 두 개의 아미노산 가닥 (즉, 두 개의 α-사슬)의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커로서는 상술한 다양한 턴 -서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있으며/바람직하게는 루이신 지퍼의 구조에 영향을 미치지 않는 펩타이드 링커가 이용된다.
상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 타겟 결합 부위 I으로서의 공지 펩타이드 및 무작위 아미노산 서열을 포함하는 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π)이 결합되어 있다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 타겟 -결합 공지 펩타이드를 구조안정화 부위의 한쪽 말단에 결합시키고 무작위 아미노산 서열올 다른 쪽 말단에 결합시켜 ΚΡΙ—바이포달 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 타겟 결합 부위 I으로서의 공지 펩타이드 타겟 결합 부위 I 및 무작위 아미노산 서열의 타겟 결합 부위 Π는 서로 협동적으로 (cooperatively) 타켓에 결합함으로써, 타겟에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.
타겟 결합 부위 Π의 아미노산 개수는 특별하게 제한되지 않으며， 바람직하게는 4-100 아미노산 잔기， 보다 바람직하게는 4-50 아미노산 잔기， 5-30 아미노산 잔기， 5-20 아미노산 잔기 또는 5-10 아미노산 잔기이다.
타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다.
타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π에 포함되는 아미노산 서열은 선형의 아미노산 서열 또는 환형의 아미노산 서열이다. 타겟 결합 부위의 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여, 타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기， 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기， 팔미토일기， 미리스틸기 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 변형될 수 있다.
생물학적 타겟 분자에 결합되는 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더는 생체 내 생리학적 반응의 조절， 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징， 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며， 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 구조 안정화 부위， 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Π (보다 바람직하게는， 구조안정화 부위， 보다 더 바람직하게는 구조안정화 부위의 링커)에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있다. 상기 기능성 분자의 예는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물， 바이오약물, 쎄포막투과 펩타이드 (CPP) 또는 나노입자를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 ΊΊ 조영물질 (예컨대， Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질 (예컨대, 초상자성 물질 (예: 마그네타이트， Fe304, Fe203, 망간 페라이트， 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)) , 방사성 동위 원소 (예컨대， UC, 150, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198T1 , 200T1( 205Bi 및 206Bi), 형광물질 (플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin)， 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자， 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제 항정신병약물， 신경안정제, 항불안제， 마약길항제， 항파킨스질환 약물， 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제， 면역억제제， 항바이러스제， 항생제， 식욕억제제， 진통제， 항콜린제， 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제， 관상혈관， 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제， 피임약, 항혈전제, 이뇨제， 항고혈압제, 심혈관질환 치료제， 미용성분 (예컨대， 주름개선제， 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바이오약물은 인슐린, IGF-K insulin-like growth factor 1), 성장호르몬， 에리쓰로포이에틴， G-CSFs ( gr anu 1 ocyt e-col ony stimulating factors) , GM-CSFs (gr anu 1 ocyt e/ macr ophage-co 1 ony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타， 인터페론 감마, 인터루킨 -1 알파 및 베타, 인터루킨 -3， 인터루킨 -4， 인터루킨 -6， 인터루킨 -2, EGFs (epidermal growth factors) , 칼시토닌 (calcitonin) , ACTH (adrenocorticotropic hormone) , TNF (tumor necrosis factor) , 아토비스반 (atobisban)， 부세레린 (buserel in)， 세트로렉릭스 (cetrorel ix), 데스로레린 (deslorel in)， 데스모프레신 (desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌 (elcatonin), 엘레이도신 (eleidosin)， 엡티피바타이드 (eptif ibatide), GHRH-I I (growth hormone releasing hormone-II) , 고나도레린 (gonadorel in) ,■ 고세레린 (goserel in) , 히스트레린 (histrelin), 류프로레린 (leuprorelin)， 라이프레신 ( lypressin)， 옥트레오타이드 (octreotide), 옥시토신 (oxytocin) , 피트레신 (pitressin)， 세크레틴 (secret in), 신칼라이드 (sincal ide) , 테르리프레신 (terl ipressin) , 티모펜틴 (thymopentin), 티모신 (thymosine) α 1, 트리프토레린 (triptorelin), 바이발리루딘 (bivalirudin) , 카르베토신 (carbetocin 사이클로스포린， 액세딘 (exedine) , 란레오타이드 (lanreotide)， LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone) , 나파레린 (nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드 (pramlint ide) , T-20 (enfuvirtide), 타이말파신 (thymalfasin)， 지코노타이드, RNA, DNA, cDNA, 안티센스 을리고뉴클레오티드 및 siRNA가 될 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더는 세포 표면에 노출된 생체 분자 (예컨대， 단백질)에 결합할 수도 있지만, 세포 내 생체 분자 (예컨대， 단백질)에도 결합하여 생체 분자의 활성을 조절할 수 있다.
KPI-바이포달 펩타이드 바인더가 세포 내 단백질을 타겟팅 하는 경우， 바람직하게는 KPI-바이포달 펩타이드 바인더는 추가적으로 세포막투과 펩타이드 (CPP)를 포함한다.
상기 CPP는 당업계에 공지된 다양한 CPP를 포함하며, 예를 들어
HIV-1 Tat 단백질, Tat 펩타이드 유사체 (예컨대, 을리고알지닌), ANTP 펩타이드， HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유래된 MTS 펩타이드, Penetratin, Transport an 또는 Pep-1 펩타이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CPP를 KPI-바이포달 펩타이드에 결합시키는 방법은 다양한 방법이 있으며， 예를 들어 KPI-바이포달 펩타이드의 구조 안정화 부위에 있는 루프 부분의 라이신 잔기와 CPP를 공유결합 시킨다.
세포 내에는 생리 활성에 중요한 역할을 하는 많은 타겟 단백질이 있으며， CPP가 결합된 KPI-바이포달 펩타이드 바인더는 세포 내로 유입되어 이 타겟 단백질에 결합하여 활성을 조절 (예컨대, 억게)한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더는 전형적으로 "N-타켓 결합 부위 I으로서의 공지 펩타이드 -구조안정화 부위의 한 가닥 -링커 -구조안정화 부위의 다른 가닥 -타겟 결합 부위 n-c' '의 컨스트럭트를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더에서 타겟 결합 부위 I과 구조안정화 부위의 한 가닥 사이 및 /또는 구조안정화 부위의 다른 가닥 -타겟 결합 부위 Π 사이에는, 타겟 결합 부위와 구조안정화 부위 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 구조영향 억제부위 (structure influence inhibiting region)를 포함한다. 희전 부위에는 펩타이드 분자에서 ^와 ^의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 위치한다. 바람직하게는, ^와 ^의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신, 알라닌 및 세린이다. 구조영향 억제부위에는 1-10개 바람직하게는 1-8개, 보다 바람직하게는 1-3개의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다.
상술한 컨스트럭트를 갖는 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서 PI-바이포달 펩타이드 바인더의 타겟 결합 부위 Π는 무작위 서열을 갖게 되며， 이는 타겟 결합 부위 Π의 어떤 위치에서도 서열 선호도 (sequence preference)가 없거나 또는 지정 (또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다.
예를 들어， KPI-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 고상지지체 (예컨대, 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스플리트 -합성 방법 (Lam et al. (1991) Nature 354： 82； WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， KPI-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 세포 표면 전시 (cell surface display)방식 (예컨대, 파아지 디스플레이, 박테리아 디스플레이 또는 이스트 디스플레이)으로 구축된다. 바람직하게는， PI-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 플라스미드, 박테리오파아지, 파아지미드, 이스트， 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이방법을 통하여 제작될 수 있다.
파아지 디스플레이는 파아지의 표면 상의 코트 단백질에 융합된 단백질 형태로 다양한 폴리펩타이드를 디스플레이하는 기술이다 (SCOU, J.
K. and Smith, G. P. (1990) Science 249： 386； Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman , Phage Display, Oxford University Press(2004)). 필라멘트성 파아지 (예컨대， M13)의 유전자 ΠΙ 또는 유전자 VI에 발현하고자 하는 유전자를 융합시켜 무작위 펩타이드를 디스플레이한다.
파이지 디스플레이에는 파아지미드가 이용될 수 있다. 파아지미드는 박테리아의 복제원점 (예컨대, ColEl) 및 박테리오파아지의 인터제닉 (intergenic) 부위의 한 카피를 갖는 플라스미드 백터이다. 이 파아지미드에 클로닝된 DNA 단편은 플라스미드처럼 증식된다.
KPI-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우, 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (i) 파아지 코트 단백질 (예컨대， M13과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 m 또는 유전자 珊 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 KPI-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열 (예컨대， lac 프로모터)을 포함하는 발현 백터의 라이브러리를 제작하는 단계; (ii) 상기 발현 백터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 단계; ( ) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계; (iv) 생물학적 타겟 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타켓 분자에 결합시키는 단계; 및 (V) 타겟 분자에 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계 .
파아지 디스플레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리를 구축하고 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 제 5， 723， 286호, 제 5 ,432 ,018호， 제 5 ,580,717호， 제 5 ,42그 908호, 거 ]5 ,498， 530호, 게 5, 770,434호, 제 5，734，018호, 게 5,698,426호， 게 5, 763， 192호 및 제 5, 723,323호에 개시되어 있다.
KPI-바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 포함하는 발현 백터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 공지의 파아지미드 또는 파아지 백터 (예컨대， pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd- CAT1, IT1663, fdtetDOG, pHENl, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 KPI-바이포달 펩타이드 바인더 유전자를 삽입시켜 발현 백터를 제작할 수 있다,
대부분의 파아지 디스플레이 방법이 필라멘트성 파아지를 이용하여 실시되지만， 람다 파아지 디스플레이 (W0 95/34683； 미국 특허 제 5,627,024호), T4 파아지 디스플레이 (Ren et al. (1998) Gene 215： 439； Zhu (1997) CAN 33:534) 및 T7 파아지 디스플레이 (미국 특허 제 5，766，905호)도 KPI-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 구축하는 데 이용될 수 있다.
백터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 다양한 형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며， 가장 바람직하게는 전기천공 (electroporation) 방법에 따라 실시된다 (참조: 미국 특허 제 5ᅳ 186,800호, 게 5，422，272호， 제 5, 750,373호). 본 발명에 적합한 숙주는 세포는 E. 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며， 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-lBlue (Stratagene)을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포는 형질전환 전에 컴피턴스 세포로 준비하는 것이 ϋ}람직하다 (Sambrook, J. et al .， Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001) ) . 형질전환된 세포의 선별은 일반적으로 항생제 (예컨대, 테트라사이클린 및 암피실린)를 포함하는 5 배지에서 배양하여 실시된다. 선별된 형질전환 세포를 헬퍼 파아지의 존재 하에서 추가적으로 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 생성시킨다. 상기 헬퍼 파아지 파아지로 적합한 것은， Ex 헬퍼 파아지， M13-K07, M13-VCS 및 R408을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 있어서， 단계 (c)는 당업계에 공지된 다양한 10 방법을 통하여 실시할 수 있다. 우선， KPI-바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리에서 타겟과 결합하는 클론을 선별하며, 이 경우 바이오패닝 과정을 통하여 선별할 수 있다 (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman , Phage Display, Oxford University Press(2004)) . 이어， 15 바이오패닝 과정을 통하여 선별된 클론에서 생산되는 펩타이드들의 타겟 친화도를 분석한다. 타켓 친화도는 당업계에 공지된 다양한 방법， 예를 들어 아분자 상호작용 분석 (bimolecular interact ion analysis: BIA) (예컨대， BIAcoreTM)(Sjo lander & Urbaniczky, Anal. Chew. 63:23382345(1991), Szabo et al. , Curr. Opin. Struct. Biol.
•20 5:699705(1995)； Smith EA, et al. , Appl. Spectroscopy, 57:320A- 332A(2003))에 따라 실시할 수 있으며, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반웅에 대한 지시자 (indicator)로 이용될 수
、 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 단계 (c)에서 선택된 KPI- 25 바이포달 펩타이드 바인더는 상기 공지 펩타이드와 비교하여 2- 10000배 증가된 타겟 친화도, 보다 바람직하게는 2-5000배， 2-4000배, 2-3000배, 2- 2000배, 50-10000배， 50-5000배, 50-4000배, 50-3000배 또는 50-2000배， 보다 더 바람직하게는 10(3-2000배， 200-2000배， 500-2000배, 70으1500배 또는 500-1300배를 갖는다. 본 발명에 의한 타겟 친화도 증가는 매우 30 획기적이며 예상치 못한 수준이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 선택된 KPI- 바이포달 펩타이드 바인더는 상기 단백질 타켓에 대하여 0.1-10000 nM의 해리상수 ( ) 값을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 단계 (c)에서 선택된 KPI- 바이포달 펩타이드 바인더는 최초 바이포달 펩타이드 바인더 (original BPB)이고， 상기 방법은 상기 단계 (c) 이후에 다음의 단계를 추가적으로 포함하며, 다음의 단계에 의해 최초 BPB의 타겟 친화도 (target affinity)가 증가된다: (a1) 최초 BPB의 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π 중에서 어느 한 부위의 서열을 랜덤화 하여 제 1 친화도 BPB 라이브러리를 구축하는 단계; (b') 상기 제 1 친화도 BPB 라이브러리에서 최초 BPB보다 타겟 친화도가 증가된 제 1 친화도 최적화 BPB 분자를 선별하는 단계; (c') 제 1 친화도 최적화 BPB 분자의 타겟 결합 부위 I， 타겟 결합 부위 Π 또는 타겟 결합 부위 I와 타겟 결합 부위 Π의 말단에 1-10개의 랜덤 아미노산을 추가하여 게 2 친화도 BPB 라이브러리를 구축하는 단계; 및 (d') 제 2 친화도 BPB 라이브러리에서 제 1 친화도 최적화 BPB 분자보다 타겟 친화도가 증가된 계 2 친화도 최적화 BPB 분자를 선별하는 단계.
BPB의 타겟 친화도를 증가시키는 방법은 아래에서 상세하게 설명된다.
본 발명의 KPI—바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라， 생체 내 물질의 검출， 인 비보 분자 이미징， 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 KPI-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 KPI-바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 백터를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 KPIᅳ바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 백터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며， 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라， 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980)； Uhlman 및 Peyman , Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백터는 PI- 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자 이외에 상기 핵산 분자에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대， tac 프로모터， lac 프로모터, /3dJV5 프로모터， Ipp 프로모터， λ프로모터， ρκ λ프로모터, rac5 프로모터， 卿프로모터， recA 프로모터， SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 KPI- 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자의 5ᄆ-방향쪽에 시그널 서열 (예컨대， pelB)를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백터는 KPI-바이포달 펩타이드 바인더가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열 (예컨대， myc tag)을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 파아지 코트 단백질, 바람직하게는 M13과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 m 또는 유전자 VI 코트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 박테리아의 복제원점 (예컨대, ColEl) 및 /또는 박테리오파아지의 복제원점을 포함한다. 한편， 본 발명의 백터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신， 카베니실린， 클로람페니콜， 스트렙토마이신， 카나마이신， 게네티신， 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 형질전환체는 바람직하게는 E. 와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며 , 적합한 E. coli숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-lBlue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은， CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al. , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D. , /. Mo J. Biol. , 166:557- 580(1983)) 및 전기 천공 방법 (미국 특허 제 5, 186,800호， 제 5, 422,272호, 제 5 ,750， 373호) 등에 의해 실시될 수 있다. 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더는 공지의 펩타이드를 타겟 친화도 측면에서 개선 또는 개량하여 매우 낮은 수준 (예컨대， n 수준)의 값 (해리상수)을 나타내어， 생물학적 타겟 분자에 매우 높은 친화도를 나타내는 펩타이드를 제공한다.
따라서， 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더 기술은 공지의 펩타이드의 웅용성을 크게 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)의 타겟 친화도 (target affinity)를 증가시키는 방법을 제공한다:
(a) (i) 가닥간 (interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴 (parallel), 안티패러럴 (antiparal lei) 또는 패러럴 (parallel)과 안티패러럴 (antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위 (structure stabilizing region); (ii) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 랜덤하게 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I (target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π)를 포함하는 최초 바이포달 펩타이드 바인더 (original BPB)의 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π 중에서 어느 한 부위의 서열을 랜덤화 하여 제 1 친화도 ΒΡΒ 라이브러리를 구축하는 단계;
(b) 상기 제 1 친화도 BPB 라이브러리에서 최초 BPB보다 타겟 친화도가 증가된 게 1 친화도 최적화 BPB 분자를 선별하는 단계;
(c) 제 1 친화도 최적화 BPB 분자의 타겟 결합 부위 I, 타겟 결합 부위 Π 또는 타겟 결합 부위 I와 타켓 결합 부위 Π의 말단에 1-10개의 랜덤 아미노산을 추가하여 제 2 친화도 BPB 라이브러리를 구축하는 단계; 및 (d) 제 2 친화도 BPB 라이브러리에서 제 1 친화도 최적화 BPB 분자보다 타겟 친화도가 증가된 제 2 친화도 최적화 BPB 분자를 선별하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 증가된 타겟 친화도 (target affinity)를 갖는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)를 제공한다.
본 발명자들은 본 발명자들에 의해 종전에 개발된 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟 친화도를 최적화할 수 있는 기술을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 BPB의 전체적인 구조는 유지하면서 매우 효과적으로 BPB의 타겟 친화도를 최적화 또는 최대화할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 명세서에서 타겟 친화도를 언급하면서 사용되는 용어 "최적화"는 다른 특별한 언급이 없으면 최대화와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명은 기본적으로 BPB의 구조를 채택한다. BPB는 본 발명자들에 의해 최초로 제안된 친화성 펩타이드로서 이에 대한 상세한 설명은 W0 2010/047515를 참조할 수 있다.
본 발명의 BPB 타겟 친화도 최적화 방법은 상술한 펩타이드의 타겟 친화도 개선방법과 공통되는 부분이 많으며， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 이용되는 최초 바이포달 펩타이드 바인더 (original
BPB)의 구체적인 예는 서열목록 제 20서열-제 38서열 및 제 40서열-제 41서열에 기재되어 있다.
본 발명에 따르면， 상술한 최초 바이포달 펩타이드 바인더 (original BPB) 구조에서， 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Π 중에서 어느 한 부위의 서열을 랜덤화 하여 제 1 친화도 BPB 라이브러리를 구축한다.
제 1 친화도 BPB 라이브러리를 구축하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있다.
이 라이브러리에서 제 1 친화도 BPB 라이브러리는 무작위 서열을 갖게 되며， 이는 타겟 결합 부위 I 및 /또는 타겟 결합 부위 Π의 어떤 위치에서도 서열 선호도 (sequence preference)가 없거나 또는 지정 (또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, 제 1 친화도 BPB 라이브러리는 고상지지체 (예컨대， 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스플리트 -합성 방법 (Lam et al . (1991) Nature 354:82; WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 세포 표면 전시 (cell surface display) 방식 (예컨대， 파아지 디스플레이， 박테리아 디스플레이 또는 이스트 디스플레이)으로 구축된다. 바람직하게는, 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 플라스미드， 박테리오파아지， 파아지미드， 이스트， 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이방법을 통하여 제작될 수 있다.
제 1 친화도 BPB 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우， 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (i) 파아지 코트 단백질 (예컨대, M13과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 m 또는 유전자 舊 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열 (예컨대， lac 프로모터)을 포함하는 발현 백터의 라이브러리를 제작하는 단계; (Π) 상기 발현 백터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 단계; (Hi) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계; (iv) 생물학적 타겟 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타겟 분자에 결합시키는 단계; 및 (V) 타켓 분자에 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계.
파아지 디스플레이를 이용하여 제 1 친화도 BPB 라이브러리를 구축하고 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 제 5, 723, 286호, 제 5,432,018호， 제 5，580，717호, 제 5, 427,908호， 제 5,498, 530호, 제 5，770，434호， 제 5，734，018호, 제 5, 698,426호, 제 5, 763,192호 및 제 5,723, 323호에 개시되어 있다.
제 1 친화도 BPB 라이브러리의 유전자를 포함하는 발현 백터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어， 공지의 파아지미드 또는 파아지 백터 (예컨대, pIGT2, fUSE5, fAFFl, fd- CAT1, m663, fdtetDOG, pHENl, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 삽입시켜 발현 백터를 제작할 수 있다.
거 U 친화도 BPB 라이브러리를 구축한 다음， 제 1 친화도 BPB 라이브러리에서 최초 BPB보다 타겟 친화도가 증가된 게 1 친화도 최적화 BPB 분자를 선별한다. 우선， 제 1 친화도 BPB 라이브러리에서 최초 BPB보다 타켓 친화도가 증가된 클론을 선별하며， 이 경우 바이오패닝 과정을 통하여 선별할 수 있다 (Sambrook, J . et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Clackson and Lowman , Phage Display, Oxford University Press(2004)) . 이어， 바이오패닝 과정을 통하여 선별된 클론에서 생산되는 펩타이드들의 타겟 친화도를 분석한다. 타겟 친화도는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 '들어 이분자 상호작용 분석 (bimolecular interact ion analysis： BIA) (예컨대，
BIAcore™)(Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chew. 63:23382345(1991),
Szabo et al., Curr. Op in. Struct. Biol. 5:699705(1995); Smith EA, et al. , Appl. Spectroscopy, 57:320A-332A(2003))에 따라 실시할 수 있으며， 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에서의 변화는 분자들 사이의 실시간 반웅에 대한 지시자 (indicator)로 이용될 수 있다.
게 1 친화도 최적화 BPB 분자의 선별 후, 계 1 친화도 최적화 BPB 분자의 타겟 결합 부위 I， 타겟 결합 부위 Π 또는 타겟 결합 부위 I와 타겟 결합 부위 Π의 말단에 1-10개의 랜덤 아미노산을 추가하여 제 2 친화도 BPB 라이브러리를 구축한다.
게 2 친화도 BPB 라이브러리의 구축은 상술한 게 1 친화도 BPB 라이브러리를 구축하는 방법에 따라 실시될 수 있다.
거 12 친화도 BPB 라이브러리의 구축에서, 추가되는 랜덤 아미노산의 개수는 1-10개이며， 바람직하게는 1-5개， 보다 바람직하게는 1-3개, 보다 더 바람직하게는 1-2개이다.
겨 12 친화도 BPB 라이브러리를 구축한 다음， 제 2 친화도 BPB 라이브러리에서 제 1 친화도 최적화 BPB 분자보다 타겟 친화도가 증가된 제 2 친화도 최적화 BPB 분자를 선별한다. 제 2 친화도 최적화 BPB 분자는 상술한 제 1 친화도 최적화 BPB 분자의 선별과 동일한 방법으로 실시할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 제 2 친화도 최적화 BPB 분자는 최초 BPB와 비교하여 2-40배 증가된 타겟 친화도를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 제 2 친화도 최적화 BPB 분자는 최초 BPB와 비교하여 5-40배, 보다 더 바람직하게는 10-35배, 보다 더욱 더 바람직하게는 2으25배 증가된 타겟 친화도를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 제 2 친화도 최적화 BPB 분자는 타겟에 대하여 0.1-20 nM의 해리상수 (KD) 값을 갖는다. 보다 바람직하게는, 제 2 친화도 최적화 BPB 분자는 타겟에 대하여 0.1-10 nM, 보다 더 바람직하게는 1ᅳ8 nM의 해리상수 ( ) 값을 갖는다.
즉， 본 발명의 방법에 의해 타겟 친화도가 최적화 된 BPB는 타겟에 대하여 매우 높은 친화도를 가질 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 증가된 타겟 친화도 (target affinity)를 갖는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 증가된 타겟 친화도 (target affinity)를 갖는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
a) 본 발명은 공지 펩타이드의 타겟 친화도를 획기적으로 향상시킬 수 있는 방법으로서, 매우 효율적이면서도 간단하다.
(b) 본 발명에 의하여 공지 펩타이드의 타겟 친화도를 예컨대 1000배 증가킬 수 있다.
(c) 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더 기술은 공지의 펩타이드의 웅용성을 크게 향상시킬 수 있다.
(d) 본 발명은 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB)의 타겟 친화도 (target affinity)를 증가시키는 방법으로서， 매우 효율적이면서도 간단하다. (e) 본 발명의 방법에 의하여， 예컨대 BPB의 타겟 친화도를 2으25배 증가시킬 수 있다.
(f) 본 발명와 방법에 의하여 증가된 타켓 친화도를 갖는 BPB는 매우 낮은 수준 (예컨대， nM 수준)의 값 (해리상수)을 나타내어， 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 종래의 공지 펩타이드의 타겟 친화도를 증가시키는 본 발명의 KPI-바이포달 펩타이드 바인더 기술에 대한 모식도이다.
도 2는 스트템타비딘에 결합하는 공지 펩타이드의 친화력 향상을 위한 스크리닝 결과이다.
도 3a-3b는 본 발명의 KPI-BPB 기술에 의하여 타겟 스트렙타비딘에 대하여 친화도 개선을 한 후의 콜로니 ELISA결과이다.
도 4a-4b는 본 발명의 KPI-BPB 기술에 의하여 선별된 스트렙타비딘에 대한 KPI— BPB인 Strep_optil과 Strepᅳ opt i2의 타겟 특이성을 분석한 결과이다.
도 5는 KPI-BPB 기술에 의하여 선별된 스트렙타비딘에 대한 KPI- BPB인 Strepᅳ optil의 타켓 친화도에 대한 분석 결과이다.
도 6은 VEGFR1에 결합하는 공지 펩타이드의 친화력 향상을 위한 스크리닝 결과이다.
도 7은 KPI-BPB 기술에 의하여 타겟 VEGFR1에 대하여 친화도 개선을 한 후의 콜로니 ELISA 결과이다.
도 8은 KPI-BPB 기술에 의하여 선별된 VEGFR1에 대한 KPI-BPB인 VEGFRl_optil, VEGFRl_opti2 및 VEGFRl_opti3의 타겟 특이성을 분석한 결과이다.
도 9는 KPI-BPB 기술에 의하여 선별된 VEGFR1에 대한 KPI— BPB인
VEGFRl_optil의 타겟 친화도에 대한 분석 결과이다.
도 10은 최초 바이포달 펩타이드 바인더 (original BPB)의 모식도이다.
도 11는 본 발명에 따른 BPB의 최적화 과정을 보여주는 모식도이다. 도 12은 BPB1EDB 최적화 후의 콜로니 ELISA결과이다. 도 13은 첫 번째 최적화 후 구축된 제 1 친화도 BPB 라이브러리에서 선택된 게 1 친화도 최적화 BPB 분자 세 개에 대한 타켓 친화도 측정 결과이다.
도 14는 두 번째 최적화 후 구축된 제 2 친화도 BPB 라이브러리， BPB3 최적화 라이브러리를 이용한 바이오패닝의 아웃풋 /인풋 파아지 비율올 보여주는 그래프이다.
도 15는 두 번째 최적화 후 구축된 제 2 친화도 BPB 라이브러리， BPB4 최적화 라이브러리를 이용한 바이오패닝의 아웃풋 /인풋 파아지 비율을 보여주는 그래프이다.
도 16은 두 번째 최적화 후 구축된 제 2 친화도 BPB 라이브러리,
BPB3 최적화 라이브러리에 있는 펩타이드들에 대하여 타겟 친화도 스크리닝을 통해 얻은 아미노산서열들에 대한 멀티플 얼라인먼트이다.
도 17은 두 번째 최적화 후 구축된 게 2 친화도 BPB 라이브러리， BPB4 최적화 라이브러리에 있는 펩타이드들에 대하여 타겟 친화도 스크리닝을 통해 얻은 아미노산서열들에 대한 멀티플 얼라인먼트이다.
도 18은 제 2 친화도 최적화 BPB 분자 BPB3의 친화력 측정 결과이다. 도 19는 게 2 친화도 최적화 BPB 분자, BPB4의 친화력 측정 결과이다. 도 20은 250nM에서의 BPB1, BPB2, BPB3 및 BPB4에 대한 타겟 결합 속도론적 데이터이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 , 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 1(친화력 최적화 펩타이드의 제조) 실험 방법
BPB2m의 최적화 라이브러리 제작
BPB2EDB 최적화 라이브러리를 만들기 위해 두 개의 올리고뉴클레오타이드 (5' -TTC TAT GCG GCC CAG CTG GCC (NNK)6 GGA TCT TGG ACA TGG GAA AAC GGA AAA-3' ； 및 5' -AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC TTG CTC C CCT AAT AAT TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT-3' ) (BPB2EDB_F1)와 (5'— AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC TTG CTC CM CCT AAT AAT TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT-3' ) (BPB2EDB_B1) , (N =A, T, G, or C); (R =G or T); (M= C or A) 합성하였다. 이중가닥을 만들기 위하여 , BPB2EDB_F1 4 μΜ (최종 농도)， BPB2EDB_B1 4 μΜ (최종 농도)， 2.5 mM dNTP 흔합물 4 μ 1, Ex TaqDNA 중합효소 1 μ 1 (10 U)(Takara, Seoul, Korea), 10 x PCR 완충액 5μ1를 섞고 총 50 μ 1가 되도록 증류수를 추가한 흔합액을 25개를 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반웅 (940C 5분, 60 cycle: 30°C 30초와 72°C 30초， 720C 7분)을 하여 이중가닥으로 만든 후 PCR 정제 키트 (GeneAU, Seoul , Korea)를 이용하여 정제하였다. BPB2EDB 의 인서트 유전자를 pIGT2 phagemid 백터 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)에 연결하기 위해 인서트 유전자와 PIGT2 phagemid 백터에 제한효소처리를 시행하였다. 약 llyg의 인서트 DNA를 Sfil (NEB)와 Notl (NEB)로 각각 4시간씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 그리고 약 40 /g의 pIGT2 phagemid 백터를 Sfil (NEB)와 Notl (NEB)로 각각 4시간씩 반응시킨 후 CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 1시간 반웅한 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기 (UUrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 백터 12 / 과 18°C에서 15시간 동안 연결한 후， 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 μί로 DNA를 용해시켰다. 이를 E.coli XL-1 competent 세포에 전기천공으로 형질전환시켜 최종적으로 8 X 107 의 라이브러리를 만들었다. 스트랩타비딘 결합 펩타이드 (WSHPQFEK) 및 VEGFRl(GNQ I)의 친화력 향상 라이브러리 제작
스트렙타비딘 결합 펩타이드 WSHPQFEK는 1996년에 72 μΜ의 친화력을 가지며 스트렙타비딘 단백질에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다. VEGFRK Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1) 결합 펩타이드 GNQWFI는 2005년에 VEGFR1 단백질에 특이적으로 결합한다고 보고되었다. 여기서는 이들의 펩타이드의 친화력을 향상시키기 위해서 친화력 향상 라이브러리를 디자인 및 제작하였다. 스트렙타비딘 성숙화 라이브러리를 만들기 위해 두 개의 올리고뉴클레오타이드 (5' -TTC TAT GCG GCC CAG CTG GCC TGG AGC CAT CCG CAG ΊΤΤ GAA AAA GGC GGA GGA TCT TGG ACA TGG GAA AAC GGA AAA-3' ) (Fl)와 (5'- AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCG MNN 誦 讓 丽 N匪 匪 TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT -3' ) (Bl), (N =A, T, G, or C); (K =G or T) ; (M= C or A)를 합성하였다. VEGFR1 성숙화 라이브러리를 만들기 위해 두 개의 올리고뉴클레오타이드 (5' -TTC TAT GCG GCC CAG CTG GCC GGC AAC CAG TGG TTT ATT GGA GGA GGA TCT TGG ACA TGG GAA AAC GGA AAA-3' ) (F1) 과 (5'-AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC MNN丽 薩 顺 N丽 N MNN TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT -3' ) (Bl), (N =A, T, G, or C); (K =G or T)； (M= C or A)를' 합성하였다. 각각의 이중가닥을 만들기 위하여， F1 4 μΜ (최종 농도), B1 4 μΜ (최종 농도), 2.5 mM dNTP 흔합물 4 μ 1， Ex TaqDNA 중합효소 1 μ 1 (10 U)(Takara, Seoul , Korea) , 10 x PCR 완층액 5μ1를 섞고 총 50 μ 1가 되도록 증류수를 추가한 흔합액을 25개를 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반응 (940C 5분, 60 cycle: 30°C 30초와 720C 30초， 720C 7분)을 하여 이중가닥으로 만든 후 PCR 정제 키트 (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 정제하였다. 성숙화 라이브러리를 위한 두 개의 각각 다른 인서트 유전자를 pIGT2 phagemid 백터 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)에 연결하기 위해 인서트 유전자와 pIGT2 phagemid 백터에 제한효소처리를 시행하였다. 약 10yg의 인서트 DNA를 Sfil (NEB)와 Notl (NEB)로 각각 4시간씩 반웅시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 그리고 약 40 의 pIGT2 phagemid 백터를 Sfil (NEB)와 Notl (NEB)로 각각 4시간씩 반웅시킨 후 CIP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 1시간 반웅한 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기 (Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 3 //g의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제 (Bioneer , Dae j eon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 백터 12 과 18°C에서 15시간 동안 연결한 후， 에탄을로 침전시켜 TE 버퍼 100 ^로 DNA를 용해시켰다. 이를 E.coH XL-1 competent 세포에 전기천공으로 형질전환시켜 최종적으로 각각 6 X 107 와 5 X 107의 라이브러리를 만들었다. 스트랩타비딘에 결합하는 펩타이드 및 VEGFR1에 결합하는 펩타이드를 찾기 위한 바이오패닝
스트렙타비딘 (10 /ig/ O 및 BSA 10 wg/ )을 각각 96-웰 ELISA 플레이트 (Corning)의 웰에 50 ^씩 넣은 후， 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였고， 다음 0.1%의 PBST로 3회 세척한 후， PBS로 희석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다.
여기에 스트렙타비딘 성숙화 (maturation) 재조합 파아지 포함용액 800 μΐ 및 10% BSA 200 ^을 혼합하여 BSA에 결합하는 파아지들을 제거하기 위해 BSA 코팅했던 웰에 넣어 1시간 동안 27°C에 두었다. 상층액을 회수하여 1시간 동안 스트랩타비딘 단백질과 27°C에서 반응시켰다. 그런 다음, 0.05% PBST로 10회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2) 1 ^을 50 웰 넣어 20분간 파아지를 용리시키고 1 을 튜브에 모아 여기에 2 M Tris-base(pH 9.0) 150 峰 넣어 용액을 중화시켰다.
각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E.coli ER 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 의 E.coli ER 세포와 섞어 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 암피실린 (50 μ&/ι ) 및 20 mM 글루코오스를 흔합한 후, 2><1010 pfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 등안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l,000Xg로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린 (50 μg/ ί) 및 카나마이신 (25 zg/mO이 포함된 40 mi LB 액체 배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하며 하룻밤 동안 배양하였다. 배양액을 4,000Xg, 20분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ^의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4°C에서 1시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 0.1% PBST 10회， 20회, 30회로 단계별로 증가시켰다. VEGFR1 에 관한 바이오패닝도 위와 같은 과정으로 진행했다. 각 패닝 단계마다 위와 같은 똑같은 방법을 사용했으며， 단 세척과정만 0.1% PBST 10회， 20회, 30희로 단계별로 증가시켰다. 스트렙타비딘 및 VEGFR1 단백질에 특이적안파아지 펩타이드 검색 (파아지 ELISA)
스트렙타비딘 성숙화 라이브러리에서 네 번째 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 E.coli ER cell 세포에 감염시킨 후 폴라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 60개를 2 m의 LB-암피실린 (50 μg/v^i) 배양액에 접종한 후 37°C에서 5시간 동안 진탕 배양하여 0D=0.8-1에서 5X109 pfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l,000Xg로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린 (50 ig/m^) 및 카나마이신 (25 g/m )이 포함된 1 의 LB 액체배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 10,000Xg, 20분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2%의 탈지 우유를 넣고 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다.
96웰 ELISA 플레이트에 10 g/\ii 스트렙타비딘을 각 웰당 50 ^씩 30개의 웰에 넣고， 또한 10 g/m의 BSA을 각 웰당 50 ^씩 30개의 웰에 넣어 4°C에서 하룻밤 동안 방치하였다. 그런 다음, 모든 웰을 0.1¾ PBST로 3회 세척하고 PBS로 회석한 2% 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블톡캉 한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 100 ^씩을 스트렙타비딘 단백질이 부착된 웰과 BSA 단백질이 부착된 웰에 분주하고 270C에서 1시간 30분 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1: 1,000으로 희석하여 27°C에서 1시간 동안 반웅시켰다. 0.1% PBST로 5회 세척한 후 TMB용액 100 ≠ 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ^의 1 M HC1를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 스트렙타비딘의 흡광도가 20배 이상 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도특 도말하였다. 멸균된 팁올 이용하여 플라크를 4 m£의 LB-암피실린 (50 ^g/ O 배양액에 접종한 후 37°C에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프랩 키트을 이용하여 플라스미드를 정제하여 시뭔싱을 의뢰하였다 (Genotech, Dae j eon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 백터 시뭔스인 5'-GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3'을 사용하였다. VEGFR1도 위와 같은 방법으로 똑같이 진행하였다. 스트렙타비딘 단백질에 결합하는 파아지의 특이성 실험
시뭔성을 통해 찾은 펩타이드 (Strep_optil과 Strepᅳ opti2)의 스트렙타비딘에 대한 특이성을 조사하기 위해서 이 펩타이드들을 발현하는 재조합 파지들을 이용하여 스트랩타비딘, BSA, 오브알부민 및 VEGF에 대해서 특이성을 조사하였다. 먼저 96-웰 ELISA 플레이트에 5 g/ml 스트랩타비딘， BSA, 오브알부민 및 VEGF 을 50 웰씩 넣고 40C에서 하룻밤 방치하였고, 다음날 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 회석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블특킹한 뒤， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 Strep_optil과 Strep_opti2의 각각의 재조합 파지 800 ^과 10% BSA 200 /Λ을 잘 흔합하여 100 ^씩 스트렙타비딘, BSA, 오브알부민 및 VEGF 웰에 분주하고 270C에서 1시간 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 5번 세척한 다음 HRP-접합 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000으로 회석하여 270C에서 1시간 반웅시켰다. 0.1% PBST로 5번 세척한 후 TMB용액 100 ^를 분주하여 발색반웅을 유도한 다음 100 ^의 1 M HC1를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
VEGFR1 단백질에 결합하는 파아지의 특이성 실험
시퀀싱을 통해 찾은 펩타이드 (VEGFRl_optil, VEGFRl_opt i 2 , VEGFR1ᅳ opti3)의 VEGFR1에 대한 특이성을 조사하기 위해서 이 펩타이드들을 발현하는 재조합 파지들을 이용하여 VEGFRl, VEGFR2, 스트렙타비딘, HSA, T F 및 VEGF 에 대해서 특이성을 조사하였다. 먼저 96-웰 ELISA 플레이트에 5 g/ml VEGFRl, VEGFR2, 스트렙타비딘， HSA, TNF 및 VEGF 을 50 웰씩 넣고 40C에서 하룻밤 방치하였고, 다음날 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 VEGFRl_optil VEGFRl_opti2, VEGFRl_op 3의 각각의 재조합 파지 800 ^과 10% BSA 200 ^을 잘 흔합하여 100 ^씩 스트렙타비딘， BSA, 오브알부민， VEGF 웰에 분주하고 270C에서 1시간 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 5번 세척한 다음 HRP-접합 항ᅳ M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 270C에서 1시간 반웅시켰다. 0.1% PBST로 5번 세척한 후 TMB 용액 100 峰 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ^의 1 M HC1를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Strep_optil 및 대조군 펩타이드의 결합분석 (SPR)
스트렙타비딘에 결합하는 펩타이드를 최적화한 펩타이드와 기존의 펩타이드를 합성 (Anygen)하였다. 친화도의 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. CM5 칩 (Biacore)에 스트렙타비딘을 2000 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고， 플로우는 분당 30 ^로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.
VEGFRLoptil 및 대조군 펩타이드의 결합분석 (SPR)
VEGFR1에 결합하는 펩타이드를 최적화한 펩타이드와 기존의 펩타아드를 합성 (Anygen)하였다. 친화도의 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. CM5 칩 (Biacore)에 VEGFR1을 7000 RU 만큼 홀려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고， 플로우는 분당 30 ιΛ로 홀리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다. 실험 결과
기존의 펩타이드의 친화력을 향상시키는 방법 디자인
기존 공지의 펩타이드는 대부분 낮은 타겟 친화력 때문에 여러 가지 웅용에 한계점을 가지고 있다. 본 발명은 기존의 펩타이드의 친화력을 개선하는 새로운 방법을 제시한다. 도 1에 도시된 바와 같이， 공지의 펩타이드 (Reported linear peptide, Known peptide)의 타겟 상 결합 부위에 인접한 새로운 결합 부위에 결합하는 펩타이드를 찾은 다음， 상기 공지 펩타이드와 신규 결합부위—결합 펩타이드를 구조 안정화 스케폴드에 같이 연결하면 100-1000 배 이상의 친화력 향상을 이끌어 낼 수 있다.
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스트렙타비딘 성숙화 및 VEGFR1 성숙화 라이브러리 제작
실시예로서 공지의 펩타이드인 스트렙타비딘 -결합 펩타아드 (WSHPQFEK) 및 VEGFR1에 결합하는 펩타이드 (GNQWFI)를 이용하여 파지 라이브러리를 제작하였다.
스트랩타비딘 -결합 펩타이드의 최적화 라이브러리:
WSHPQFEKGGGSWTWENGKWTWKGXXXXXX (X=랜덤 아미노산); VEGFR1-결합 펩타이드의 최적화 라이브러리: GNQWFIGGGSWTWENGKWWKGXXXXXX (X=랜덤 아미노산). 스트렙타비딘에 결합하는 펩타이드의최적화스크리닝
스트렙타비딘에 결합하는 펩타이드 (WSHPQFEK)의 친화력 향상을 유도하기 위해서 위와 같은 파지 라이브러리를 제작하였고 이를 통해 스크리닝을 하였다. 도 2는 스트템타비딘에 결합하는 펩타이드의 친화력 향상을 위한 스크리닝 과정으로써 아웃풋 파아지 /인풋 파아지의 수를 비교한 것이다. 4번째 바이오패닝이 끝나고 관찰한 결과 첫 번째 바이오패닝에 비해서 30배 정도 아웃풋 파아지 /인풋 파아지 비 (ratio)가 증가함을 보였다. 스트렙타비딘에 결합하는 펩타이드의 친화력 최적화 후의 파아지 ELISA
스트랩타비딘에 결합하는 펩타이드의 친화력 향상 라이브러리의 마지막 패닝단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 60개의 파아지를 증폭시킨 후 스트렙타비딘과 BSA에 대해 ELISA를 시행하였다 (도 3a-3b). 스트렙타비딘 보다 3배 이상 흡광도를 보이는 클론 16개에 대하여 DNA 시퀀싱을 하였다. 2개의 중복된 펩타이드 서열을 얻었다: Strep_optil: WSHPQFEKGGGSWTWENGKWTW G AHPQVR (서열목록 제 42서열) ; Strep_opti2: WSHPQFEKGGGSWTWENGKWTWKG TLIHPM (서열목록 제 43서열)
Strep_optil과 Strep_opti2의 특이성조사
최적화된 펩타이드인 Strep_optil과 Strep_opti2의 특이성을 조사하기 위해서 스트렙타비딘， BSA， 오브알부민 및 VEGF에 대해서 ELISA를 하였다. 도 4a-4b에서 보듯이， 두 개의 펩타이드들은 스트렙타비딘에 대해서 특이적으로 결합함을 알 수 있다. 친화도 측정
최적화된 펩타이드 Strep_optil 대조군 펩타이드인 WSHPQFEK올 합성하여 SPR Biacore system을 이용하여 친화도를 측정하였다. 친화도를 측정한 결과， 대조군 펩타이드인 WSHPQFEK는 ¾ 값이 82 μΜ 그리고 이를 친화력 최적화한 Strep_optil은 67 nM로 친화도가 1223 배 증가함을 보였다 (도 5).
따라서, 본 발명에서 제시된 방법을 통해 1000배 이상의 친화력을 쉽게 최적화 할 수 있음을 알 수 있다.
VEGFR1에 결합하는 펩타이드의최적화스크리닝
VEGFR1에 결합하는 펩타이드 (GNQWFI)를 친화력 향상을 유도하기 위해서 위와 같은 파지 라이브러리를 제작하였고 이를 통해 스크리닝을 하였다. 도 6은 VEGFR1에 결합하는 펩타이드의 친화력 향상을 위한 스크리닝 과정으로써 아웃풋 파아지 /인풋 파아지의 수를 비교한 것이다. 4번째 바이오패닝이 끝나고 관찰한 결과 첫번째 바이오패닝에 비해서 2배 정도 아웃풋 파아지 /인풋 파아지 비 (ratio)가 증가함을 보였다.
VEGFR1에 결합하는 펩타이드의 친화력최적화후의 파지 ELISA
VEGFR1에 결합하는 펩타이드의 친화력 향상 라이브러리의 마지막 패닝 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 30개의 파아지를 증폭시킨 후 VEGFR1과 BSA에 대해 ELISA를 시행하였다 (도 7). VEGFR1 보다 3배 이상 흡광도를 보이는 클론 12개에 대하여 DNA 시¾성을 하였다. 3개의 중복된 펩타이드 시뭔스를 얻었다: VEGFRl_opt i 1 GNQWFIGGGSWTWENGKWTWKGRIPKNR (서열목록 제 44서열 )； VEGFRl_opti2 GNQWFIGGGSWTWENGKWTWKGKLQNPM (서열목록 제 45서열 )； VEGFRl_opti3 GNQWFI∞GS ¥ENGKWTWKGQQAIQP (서열목톡 제 46서열 ) . VEGFRl_optil, VEGFRl_opti2및 VEGFRl_opU3의 특이성 조사
최적화된 펩타이드의 특이성을 조사하기 위해서 VEGFRl, VEGFR2, 스트렙타비딘, HSA, T F 및 VEGF에 대해서 ELISA를 하였다. 도 8에서 보듯이 세 개의 펩타이드들이 VEGFR1에 대해서 특이적으로 결합함을 알 수 있다.
VEGFRl_optil, VEGFRl_opti2그리고 VEGFRl_opti3의 특이성
최적화된 펩타이드 VEGFRl_optil 그리고 대조군 펩타이드인 GNQWFI을 합성하여 SPR Biacore system을 이용하여 친화력를 측정하였다. 친화도를 측정한 결과, 대조군 펩타이드인 WSHPQFEK는 200 μΜ 에서 5 RU 증가한 것에 비해 VEGFRl_optil은 5 μΜ에서 45 RU 증가하였다 (도 9). 이를 통해 대략 360배 정도의 친화력이 증가함을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에서 제시한 방법에 의해 공지의 펩타이드에 대하여 수 백 배 이상의 친화력을 쉽게 최적화 할 수 있음을 알 수 있다. 실시예 11(친화력 최적화 ΒΡΒ의 제조)
실험 방법
ΒΡΒ2匪의 최적화 라이브러리 제작
BPB2EDB 최적화 라이브러리를 만들기 위해 두 개의 올리고뉴클레오타이드 (5' -TTC TAT GCG GCC CAG CTG GCC (NNK)6 GGA TCT TGG ACA TGG GAA AAC GGA AAA-3' ； 및 5'-AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC TTG CTC C CCT AAT AAT TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT-3' ) (BPB¾DB_F1)와 (5'-AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC TTG CTC C CCT AAT AAT TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT—3' ) (BPB2EDB_B1) , (N =A, T, G, or C); (K =G or T)； (M= C or A) 합성하였다. 이중가닥을 만들기 위하여， BPB¾DB_F1 4 μΜ (최종 농도), BPB2EDB_B1 4 μΜ (최종 농도)， 2.5 mM dNTP 흔합물 4 μΐ, Ex TaqDNA 중합효소 1 μ 1 (10 U)(Takara, Seoul, Korea), 10 x PCR 완층액 5μ 1를 섞고 총 50 μ ΐ가 되도록 증류수를 추가한 흔합액을 25개를 만들었다. 이 흔합액을 PCR 반웅 (94°C 5분， 60 cycle: 30°C 30초와 72°C 30초， 72°C 7분)을 하여 이중가닥으로 만든 후 PCR 정제 키트 (GeneAll, Seoul , Korea)를 이용하여 정제하였다. BPB2EDB 의 인서트 유전자를 pIGT2 phagemid 백터 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)에 연결하기 위해 인서트 유전자와 PIGT2 phagemid 백터에 제한효소처리를 시행하였다. 약 llyg의 인서트 DNA를 Sfil (NEB)와 Notl (NEB)로 각각 4시간씩 반웅시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 그리고 약 40 //g의 pIGT2 phagemid 백터를 SHI (NEB)와 Λ¾ / (NEB)로 각각 4시간씩 반웅시킨 후 CIPCCaH Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 1시간 반웅한 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기 (Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 IGT2 파아지미드 백터 12 /g과 18°C에서 15시간 동안 연결한 후， 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 ^로 DNA를 용해시켰다. 이를 E.coli XL-1 competent 세포에 전기천공으로 형질전환시켜 최종적으로 8 X 107 의 라이브러리를 만들었다.
BPB2EDB 을 찾기 위한 바이오패닝
2 m£의 스트랩타비딘 (10 «g/m£)을 96웰 ELISA 플레이트 (Corning)의 40개의 웰에 50 ^씩 넣은 후， 4 °C에서 하룻밤 동안 방치하였고， 다음날 20개의 웰에만 0.1 )의 PBST(tween-20)로 3회 세척한 후， 바이오틴 ED-BU0 /g/m 를 넣고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이후 40개의 웰 모두를 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후， 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다.
여기에 BPB2EDB 성숙화 (maturation) 재조합 파아지 포함용액 800 ≠ 및 10% BSA 200 ^을 흔합하여 스트랩타비딘 및 BSA에 결합하는 파아지들을 제거하기 위해 스트랩타비딘에 BSA 코팅했던 20개의 웰에 넣어 1시간 동안 27°C에 두었다. 상층액을 회수하여 100 g/m\ BPBIEDB 와 흔합하여 경쟁적 바이오패닝을 진행하였다. 즉, 이 용액을 ED-B가 결합된 20개의 웰에 옮겨 27°C에서 30분간 반웅하면 BPB1EDB 보다 친화력이 더 우수한 파아지만이 EDB에 결합할 수 있다. 20개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.5% PBST로 15회 세척한 뒤 0.2 M 글리신 /HCKpH 2.2) 1 을 각 웰당 50 ^씩 넣어 20분간 파아지를 용리시키고 1 ιι 을 류브에 모아 여기에 2Μ Tris-base(pH 9.0) 150 u 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 0E V7인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 ^의 E. coil XL1-BLUE 세포와 섞어 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 암피실린 (50 β /ml) 및 20 mM 글루코오스를 흔합한 후， 2X1010 pfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l,000Xg로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린 (50 μg/ ί) 및 카나마이신 (25 ug/mt)o) 포함된 40 mi LB 액체 배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000Xg, 20분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 의 5x PEG/NaCl [20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4°C에서 1시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 m£의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며， 세척과정만 단계별로 각각 25회 및 35회 (0.5% PBST) 증가시켰다. BPB3EDB 와 BPB4EDB^ 최적화 라이브러리 제작 및 스크리닝
BPB3EDB 최적화 라이브러리를 만들기 위해 두 개의 올리고뉴클레오타이드 (5' -TTC TAT GCG GCC CAG CTG GCC NNK TGT GTT CTC CTA TTC AGG GAT CTT GGA CAT GGG AAA ACG GAA AA-3' ) (BPB3EDB— Fl)와 (5' -AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC MNN TTG CTC CM CCT AAT AAT TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT-3' ) (BPB3EDB_B1) , (N =A, T, G, or C)； (K =G or T); (M= C or A) 합성하였다.
BPB4EDB 최적화 라이브러리를 만들기 위해 두 개의 을리고뉴클레오타이드 (5' -TTC TAT GCG GCC CAG CTG GCC NNK NNK TGT GTT CTC CTA TTC AGG GAT CTT GGA CAT GGG AAA ACG GAA AA-3' ) (BPB4EDB_F1)와 (5' -AAC AGT TTC TGC GGC CGC TCC TCC TCC MNN MNN TTG CTC C CCT AAT AAT TCC CTT CCA TGT CCA TTT TCC GTT-3' ) (BPB4EDB_B1) , (N =A, T, G, or C); (K =G or T); (M= C or A) 합성하였다.
BPB3EDB 이중가닥을 만들기 위해서 BPB3EDB_F1 4 μ M (최종 농도)， BPB3EDB-B1 4μΜ (최종 농도)ᅳ 2.5 mM dNTP 흔합물 4 μ 1, Ex TaqDNA 증합효소 1 μ 1 (10 U)(Takara, Seoul , Korea) , 10 x PCR 완층액 5μ1를 섞고 총 50 μΐ가 되도록 증류수를 추가한 흔합액을 10개 만들었다. 또한 BPB4EDB 이중가닥 인서트를 만들기 위해서 BPB4EDB_F1 4μΜ (최종 농도)， BPB4EDB_B1 4μΜ (최종 농도)， 2.5 mM dNTP흔합물 4 μ 1, Ex TaqDNA 중합효소 1 μ 1 (10 U)(Takara, Seoul , Korea) , 10 x PCR 완충액 5μ1를 섞고 총 50 μ 1가 되도록 증류수를 추가한 흔합액을 10개 만들었다.
이 흔합액을 PCR 반응 (940C 5분， 60 cycle: 30°C 30초와 Ί2Χ 30초，
72°C 7분)을 하여 이증가닥으로 만든 후 PCR 정제 키트 (GeneAll, Seoul , Korea)를 이용하여 정제하였다. BPB3EDB 와 BPB4隱의 인서트 유전자를 pIGT2 phagemid 백터 (Ig therapy, Chuncheon, Korea)에 연결하기 위해 인서트 유전자와 pIGT2 phagemid 백터에 제한효소처리를 시행하였다. 약 10yg의 인서트 DNA를 Sfil (NEB)와 Notl (NEB)로 각각 4시간씩 반웅시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 그리고 약 40 의 pIGT2 phagemid 백터를 Sfil (NEB)와 Notl (NEB)로 각각 4시간씩 반응시킨 후 CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 1시간 반웅한 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기 (Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Dae j eon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 백터 12 //g과 18°C에서 15시간 동안 연결한 후， 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 βί로 DNA를 용해시켰다. 이를 E.coli XL-1 competent 세포에 전기천공으로 형질전환시켜 최종적으로 각각 1 X 106 의 BPB3EDB 와 BPB4EDB maturation 라이브러리를 만들었다.
ED-B 단백질에 특이적인 파아지 펩타이드 검색 (파아지 ELISA)
BPB2EDB, BPB3EDB 와 BPB4EDB 최적화 라이브러리에서 네 번째 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 60개를 2 의 LB-암피실린 (50 /m 배양액에 접종한 후 37°C에서 5시간 동안 진탕 배양하여 0D=0.8-1에서 5><109 pfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 흔합하며 배양하였다. 배양액을 l,000Xg로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들올 암피실린 (50 /g/m^) 및 카나마이신 (25 /g/ )이 포함된 1 m의 LB 액체배지로 재현탁하여 30°C에서 200 rpm의 속도로 흔합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 10,000Xg, 20분 및 4°C의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2%의 탈지 우유를 넣고 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다.
96웰 ELISA 플레이트에 5 ^g/m^ 스트렙타비딘을 각 웰당 50 씩 30개의 웰에 넣고, 또한 10 /g/ 의 BSA을 각 웰당 50 ^씩 30개의 웰에 넣어 4°C에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 스트렙타비딘 30 웰만 0.1% PBST(tween-20)로 3회 세척하고 Biotin ED-B (10 //g/m«)을 넣고 상온에서 1시간 동안 두었다.
모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 회석한 2¾ 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 100 ^씩을 ED-B 단백질이 부착된 웰과 BSA 단백질이 부착된 웰에 분주하고 270C에서 1시간 30분 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항 -M13 항체 (GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 27°C에서 1시간 동안 반웅시켰다. 0.1% PBST로 5회 세척한 후 TMB용액 100 峰 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ^의 1 M HC1를 첨가하여 반웅을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 ED-B의 흡광도가 20배 이상 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도톡 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 ^의 LB-암피실린 (50 iig/iwi) 배양액에 접종한 후 37Ό에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프랩 키트을 이용하여 플라스미드를 정제하여 시뭔싱을 의뢰하였다 (Genotech, Dae j eon, Korea). 시뭔성 프라이머는 백터 시뭔스인 5'- GAT ACGCCAAGCn GGAGC-31을 사용하였다. 결합력 분석 (SPR)
BPB2EDB, BPB¾DB 와 BPB4EDB 성숙화 라이브러리에서 찾은 바이포달 타이드 바인더를 합성 (애니젠, 한국) 하였다. 친화도의 측정은 BIAcore XCBiacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. 스트랩타비딘 SA 칩 (Biacore)에 바이오틴 -EDB을 2,000 RU 만큼 홀려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 ^로 홀리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어 (Biacore AB, Uppsala Sweden)로 친화도를 계산하였다. 실험 결과
BPB최적화 라이브러리 제작방법
BPB(Bipodal-peptide binder)의 스캐폴드로서 안정한 베타-헤어핀 모티프를 사용하였다. 특히 트립토판-트립토판 아미노산의 상호 작용에 의해 베타-헤어핀 모티프 구조를 안정하게 이루어 주는 Trpzip을 이용하였다. 뼈대인 Trpzip의 Nᅳ말단 및 C-말단 부분에 각각 6개 아미노산을 무작위로 배열함으로써 두 부분의 가변적 부위를 생성하였다 (도 10). BPB의 친화력 최적화 라이브러리를 만드는 과정은 도 11과 같다. 우선 한 타겟에 대해서 찾은 바이포달-펩타이드 바인더 (BPB1)의 한 쪽 결합 부분을 고정시키고 다른 쪽 결합 부분을 다시 무작위 (random)로 만드는 라이브러리를 만들어 타겟에 대해서 스크리닝하여 BPB2를 찾는다. 그 다음에 BPB2의 양쪽 결합 부분 끝에 하나 또는 두 개의 무작위 (random) 서열을 추가하는 라이브러리를 만들어 스크리닝을 하여 BPB3와 BPB4를 찾아 BPB1을 최적화할 수 있다. BPB2최적화 라이브러리 제작 및 스크리닝
BPB2 최적화 라이브러리 (XXXXXXGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ, X= 무작위 아미노산)를 8 X 107 을 만들었다. 이를 이용하여 ED-B단백질에 대해 3차에 걸쳐 바이오패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파아지 /인풋 파아지 비 (ratio)를 결정하였다. 【표 1】
ED-B도메인에 대한 바이오패닝
Figure imgf000046_0001
첫 번째 친화력 최적화 후의 파아지 ELISA
ΒΡΒ2 친화력 최적화 라이브러리의 마지막 패닝 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 54개의 파아지를 증폭시킨 후 ED-B와 스트렙타비딘에 대해 ELISA를 시행하였다 (참조: 도 12). 대부분 ED-B가 스트렙타비딘 보다 흡광도가 높았고 스트렙타비딘 보다 20배 이상 흡광도를 보이는 클론 24개를 DNA 시퀀싱 하였다. 총 3개의 중복된 펩타이드 시뭔스를 얻었다:
1： W VRGSWTWENGK rWKGIIRLEQ (서열목록 제 47서열);
2： ADGRVRGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ (서열목록 제 48서열);
3: CSSPIQGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ (서열목록 제 49서열). 친화도 측정
펩타이드 1， 2 및 3을 합성하여 SPR biacore system을 이용하여 친화도를 측정하였다. 측정 결과 펩타이드 1은 115 nM, 펩타이드 2는 35 nM, 펩타이드 3은 16 nM의 값을 나타내었다 (참조: 도 13). 두 번째 최적화 라이브러리 제작 및 스크리닝
첫 번째 최적화 후 얻은 BPB2 중에서 가장 우수한 친화도를 나타내는 펩타이드 3 CSSPIQGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ)을 다시 최적화하기 위하여 양쪽 끝에 하나 또는 두 개의 가변 부위를 추가하는 라이브러리를 106 만들었다. BPB3 최적화 라이브러리 (XCSSPIQGSWTWENGKWTWKGIIRLEQX, X= 무작위 아미노산)와 BPB4 최적화 라이브러리 (XXCSSPIQGSWTWENGKWTWKGIIRLEQXX, X= 무작위 아미노산)를 각각 106 을 만들었다. 이를 이용하여 ED-B 단백질에 대해 4차에 걸쳐 바이오패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파아지 /인풋 파아지 비 (ratio)를 결정하였다 (도 14- 15). 두 번째최적화후의파아지 ELISA
BPB3와 BPB4 최적화 라이브러리의 마지막 패닝 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 60개의 파아지를 증폭시킨 후 ED-B와 스트랩타비딘에 대해 ELISA를 시행하여 스트렙타비딘 보다 20배 이상 흡광도를 보이는 클론에 대하여 DNA 시뭔싱을 하였다. 이를 통해 도 16- 17과 같은 서열을 얻었다. 친화도 측정
BPB3와 BPB4 펩타이드를 합성하여 SPR biacore system을 이용하여 친화도를 측정하였다. 친화도 측정 결과 BPB3는 5.7 nM, ΒΡΒ4는 3.5 ηΜ의 KD 값을 나타내었으며， 이는 BPB2와 비교하여 개선된 친화도 값이다 (도 18-19). 친화도 비교
250 nM BPBIEDB, BPB2 EDB, BPB3 EDB 및 BPB4 EDB에 대하여 SPR biacore system을 이용하여 친화도를 비교하였다 (도 20). 도 20에서 보듯이， 최적화 과정을 통해 친화력이 향상됨을 볼 수 있다. 최종적으로 이 최적화 시스템을 통해 BPB1에 비해 BPB4의 친화도가 21배 증가되어 수 nM의 친화도를 나타내는 BPB를 쉽게 얻을 수 있음을 증명하였다 (표 2).
【표 2】
BPB1, BPB2, BPB3 및 ΒΙ 4의 타겟 결합에 대한 kinetics
Figure imgf000047_0001
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다ᅵ고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 단백질 타겟에 결합하는 펩타이드의 타겟 친화도를 증가시키는 방법 :
(a) 상기 단백질 타겟에 대하여 결합 친화도를 갖는 공지 펩타이드 (known peptide)를 수득하는 단계；
(b) (i) 가닥간 (interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴 (parallel), 안티패러럴 (antiparallel) 또는 패러럴 (parallel)과 안티패러럴 (antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위 (structure stabilizing region); ( ii ) 상기 구조 안정화 부위의 한쪽 말단에 결합된 타겟 결합 부위 Ktarget binding region I)으로서의 상기 공지 펩타이드， 상기 구조 안정화 부위의 다른 쪽 말단에 n개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 Π (target binding region Π )를 포함하는 ΚΡΙ- 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 제공하는 단계;
(b) 상기 라이브러리와 타겟을 접촉시키는 단계 ; 그리고,
(c) 상기 타겟과 결합된 KPI-바이포달 펩타이드 바인더를 선택하는 단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서 선택된 KPI-바이포달 펩타이드 바인더는 상기 공지 펩타이드와 비교하여 2- 10000배 증가된 타겟 친화도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c)에서 선택된 KPI—바이포달 펩타이드 바인더는 상기 단백질 타겟에 대하여 0.1—10000 nM의 해리상수 (KD) 값을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
상기 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 증가된 타겟 친화도 (target affinity)를 갖는 바이포달 펩타이드 바인더 (bipodal peptide binder: BPB) . 【청구항 5】
상가제 4 항의 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자.
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