WO2014016816A2 - Malha polímerica com permeabilidade seletiva, para a regeneraçâo/reparação de tecidos - Google Patents

Malha polímerica com permeabilidade seletiva, para a regeneraçâo/reparação de tecidos Download PDF

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Marta Luísa SOUSA DIAS ALVES DA SILVA
Rui Luís GONÇALVES DOS REIS
Nuno João MELEIRO ALVES DAS NEVES
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Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies And Therapies - A4Tec
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Definitions

  • the present application describes a slow degrading and selective permeability biocompatible semi-porous mesh which may be used as a membrane or an implantable biomedical device.
  • This mesh may be applied over the tissue defect in combination with routine surgical procedures such as the microfracture surgical procedure, promoting the repair and regeneration of tissues such as cartilage, skin, esophageal mucosa, among other trauma or disease-damaged articular cartilage. , in humans or other animals.
  • tissue engineering is to design new functional components that can regenerate living tissues, completely restoring their function.
  • Tissue engineering comprises 3 basic premises: the use of a three-dimensional or scaffold polymeric structure that supports cell growth and subsequent tissue formation, a cell source, and growth factors that induce these same cells to differentiate into target tissue.
  • These scaffolds can be developed for various purposes, such as tissue adhesion and fixation, shape maintenance, as tissue regeneration guides or as temporary support for tissue development.
  • Biodegradable materials have been widely used in tissue engineering because of their ability to be degraded and metabolized by the body after repair of tissue damage. Thus, as cells grow and organize in living tissue, the scaffold slowly degrades as it is no longer needed as a support structure. Therefore, the degree of scaffold degradation is very important in the context of tissue engineering.
  • An implantable scaffold should recap most of the essential features of the native extracellular matrix of the tissue to be repaired, thus promoting optimal conditions. for its regeneration.
  • a very important feature of scaffoids is their porosity. High porosity levels are desirable, maximizing opportunities for cell colonization, which allows for faster tissue development. However, high porosity levels imply lower mechanical stability of the scaffold. Thus, an optimal balance between these contradictory requirements must be obtained for each specific application.
  • Pore size is another critical issue in scaffoids' cell performance, as they should have pores that allow cell adhesion and proliferation while allowing nutrients and molecules to pass through the medium. Specifically, if the pores are too small, they can prevent internal colonization of scaffoids by cells. In fact, this is a common problem of electrospinning meshes or membranes, which can be circumvented by applying some strategies proposed in the literature.
  • Scaffoids can have various shapes, one of which is the mesh or membrane shape.
  • tissue regeneration membranes on the market, including skin, esophagus or cartilage. Most of these membranes are based on natural polymers, and therefore biodegradable. They provide a solution for the regeneration of some defects, but have not yet been reported in literature a complete regeneration and recovery of function of the tissues for which they are used.
  • Total arthroplasty also called total joint replacement
  • arthroplasty is one of the most successful surgical interventions for the treatment of cartilage diseases, namely osteoarthritis, with obvious disadvantages such as its propensity to cause chronic pain.
  • partial arthroplasty does not alter the progression of osteoarthritis and its use may lead to prolonged pain due to instability of the prosthesis, erosion of its components or arthro- fibrosis.
  • Arthroscopic debridement and lavage removes debris from degenerative cartilage by irrigating the joint with a salt and lactate solution. This method provides temporary pain relief but does not contribute significantly to new cartilage formation.
  • the microfracture procedure involves the puncture of small holes in the subchondral bone, inducing bleeding. A clot is formed when blood and bone marrow infiltrate damaged cartilage, releasing stem cells for cartilage repair and regeneration. As with arthroscopic debridement, the microfracture procedure results in the formation of fibrocartilage tissue that tends to degenerate over time, although it may produce temporary relief of symptoms.
  • the ICA technique later evolved with the use of porous three-dimensional structures, resulting in the technique called MACI - "Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Implantation".
  • the function of these structures or matrices is to support cellular colonization, growth and differentiation, leading to cellular medical implants to replace or regenerate tissue damaged by trauma or disease.
  • MACI in addition to chondrocytes, other sources of autologous cells may also be used, namely mesenchymal stem cells, periosteum derived cells or synovial fibroblasts.
  • a report describing the evolution of patients 5 years after implantation using the MACI technique also showed positive results: 8 out of 11 patients rated their knee function as better or much better than before surgery.
  • this method involves two surgical interventions, as well as several limitations on patient mobility and quality of life.
  • the present application describes an implantable mesh for the repair and regeneration of human or other animal tissues such as articular cartilage, skin, among others, damaged by trauma or disease.
  • the semi-porous mesh described in the present invention is tear-resistant, resilient, biocompatible and of slow degradation, may be combined with the microfracture surgical procedure and allows rapid tissue formation.
  • This new mesh allows the cells of the tissue to be regenerated / repaired to be confined to a given space, to develop slowly allowing the new tissue to have similar characteristics to the existing tissue.
  • the tissue to be regenerated by the polymeric mesh for tissue regeneration may be cartilage tissue, periodontal ligament tissue, or esophageal submucosa.
  • the stem cells present in the bone marrow exposed to the site of injury by the microfracture surgical technique will be responsible for the restoration and regeneration process of the damaged joint cartilage through spatial confinement.
  • conferred by the mesh described in the present invention in the form of membrane or biomedical device described in the present application ie the slow degrading biocompatible elastic semi-porous mesh.
  • the mesh described in this application is porous, the pores are smaller than the size of a human blood cell or another animal, while allowing the selective passage of biologically active molecules from the bone marrow, synovial fluid or the membrane itself.
  • the use of the mesh described in this application can further prevent, among others, the progression of traumatic injuries and early forms of osteoarthritis that would otherwise lead to severe osteoarthritis with persistent pain and loss of joint function, leading to probable resection and injury. joint replacement.
  • This application describes a polymeric tissue repair or regeneration mesh of an organism comprising:
  • Pores wherein at least 70% of the pores of said mesh are smaller than required to confine the cells of said tissues, and wherein at least 70% of the pores of said mesh are larger than required for fluid passage. interstitials of said tissues; preferably 80% of the pores of said mesh are smaller than required to confine the cells of said tissues, more preferably 90%, 95%, or 100% of the pores;
  • the degradation time of said polymeric mesh in the body is at least 8 weeks, preferably the degradation may range from 8-26 weeks, more preferably 8-15 weeks;
  • the polymeric mesh has an apparent modulus of elasticity between 0.1 - 100 MPa, preferably between 5-30 MPa;
  • said polymeric mesh has an apparent tensile strength of greater than 1 MPa, preferably the mechanical strength may range from 2-30 MPa; preferably 3-20 MPa.
  • pores in the mesh which are smaller than the size of a human cell or other animal, allows bi-directional passage of biologically active molecules such as bone marrow, synovial fluid or other interstitial fluid.
  • This mesh allows the "new fabric” to have properties very similar to the injured fabric.
  • the stem cells present in the bone marrow exposed to the site of injury by the surgical technique of microfracture will be spatially confined to the space of the cartilage defect by fixation of the biomedical device. It consists of a slowly degrading biocompatible elastic semi-porous mesh at the surface of the adjacent normal cartilage. The presence of pores in this mesh, whose dimensions should be smaller than the size of a human cell or other animal, will allow bi-directional passage of biologically active molecules from the bone marrow, synovial fluid or the mesh itself.
  • the implantable biomedical device may act as a delivery system for biologically active molecules that control the inflammatory process, regenerative process and / or cartilage homeostasis.
  • the described tissue regeneration polymeric mesh has improved results with the following feature
  • tissue regeneration mesh This mechanical characteristic allows the tissue regeneration mesh to have better results in the permeability of the liquids adjacent to the tissue to be regenerated, resistance to the forces exerted and confinement of the "regenerative" cells to the lesion area, thus allowing the formation of a tissue. fabric with characteristics very close to the existing one. These features are relevant for example in clinical application in joint cartilage regeneration, as the mesh is intended to function as a partition between two compartments in the knee. It will separate bone marrow cells from fluid in the synovial cavity, which will induce chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
  • said described tissue regeneration polymeric mesh may comprise a polymer selected from the following list polycaprolactone, polyglycolic acid, polylactic acid, chitosan, alginate, dextran, or combinations thereof, these polymers may enhance the repair / regeneration of fabrics. Using these polymers allows cells to be supported longer so that they form It is a denser extracellular matrix, giving greater opportunity to the formation of tissue to be treated such as neo-cartilage and, consequently, to repairing the defect.
  • tissue regeneration polymeric mesh may further comprise a natural polymer, in particular a polymer selected from starch, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, or combinations thereof, this combination acts synergistically in tissue repair allowing greater cell proliferation.
  • a natural polymer in particular a polymer selected from starch, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, or combinations thereof, this combination acts synergistically in tissue repair allowing greater cell proliferation.
  • polymers polycaprolactone, or polycaprolactone and starch, or polycaprolactone and hyaluronic acid, or polycaprolactone and chondroitin sulfate, or polyglycolic acid, or polylactic acid, or combinations thereof, among others.
  • tissue repair / regeneration polymeric mesh may comprise 60-80% (w / v) polycaprolactone and 20-40% (w / v) of a natural polymer, or any other proportion as for example 70% (w / v) polycaprolactone and 30% (w / v) of a natural polymer, wherein the weight of the polycaprolactone may range from 70000 - 90000 Da.
  • tissue repair / regeneration polymeric mesh comprises, wherein preferably the degree of chitosan deacetylation ranges from 50-100%, preferably 87.7-95%.
  • This mesh allows you to confine tissue cells to treat the desired zone, and permeable to growth factors that enhance communication between cells, without letting them "escape” from the desired zone allowing for effective and part-like tissue regeneration. not injured.
  • tissue regeneration polymeric mesh for tissue regeneration allows the tissue regeneration polymeric mesh for tissue regeneration to have better results in the permeability of the liquids adjacent to the tissue to be regenerated, resistance to stresses. exercises and confinement of the "regenerative" cells to the lesion area, thus allowing the formation of a tissue with characteristics very close to the existing one.
  • These features are relevant for example in clinical application in joint cartilage regeneration, as the mesh is intended to function as a partition between two compartments in the knee. It will separate bone marrow cells from fluid in the synovial cavity, which will induce chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
  • tissue regeneration polymeric mesh it may further comprise active substances selected from the following list: anti-inflammatory agents, antibiotics, rheumatic disease-modifying biological agents, inhibitors, growth factors.
  • active substances selected from the following list: anti-inflammatory agents, antibiotics, rheumatic disease-modifying biological agents, inhibitors, growth factors.
  • the incorporation of the active substances may occur by mixing with the polymer (s) used in the mesh production, by physical confinement, or by coatings and / or adsorption to the surface of the meshes.
  • Said mesh may further act as a biologically active molecule release system which controls the inflammatory process, regenerative process and / or cartilage homeostasis.
  • tissue regeneration polymeric mesh it may further incorporate active substances involved in homeostasis and tissue regeneration, in particular cartilage such as TGF-Î ⁇ , TGF- ⁇ , TGF- ⁇ 2 and TGF-33, IGF-1, EGF, HIF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC and PDGF-DD, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C and VEGF-D, FGF-2, FGF- 18, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 / OP-1, CDMP-1 / GDF-5, CDMP-2 or equivalents.
  • the described polymeric tissue regeneration mesh may have a thickness ranging from 20-200 ⁇ , preferably 40-80 ⁇ , even more preferably 60 ⁇ .
  • the present application further describes the use of polymeric mesh for tissue regeneration in veterinary and human medicine, particularly in the treatment of diseases involving tissue regeneration.
  • the polymeric tissue regeneration mesh described above may be applied to the human or animal body by attachment to normal tissue adjacent to the affected tissue area by the preferential use of a binder such as sealing glue or its equivalent, or by fixation by standard minimally invasive surgery or by open surgery.
  • a binder such as sealing glue or its equivalent
  • the polymeric tissue regeneration mesh described above may be used for the regeneration of esophageal skin, cartilage, periodontal ligament or submocosas.
  • the polymeric mesh described may be obtained using the electrospinning technique, although other material processing techniques may be used provided that the meshes produced comply with the established prerequisites. Accordingly, the mesh described above may be woven or nonwoven.
  • the electrospinning strip, mesh, fiber bundle, mesh or mesh comprised of a polymer selected from the following list polycaprolactone, polyglycolic acid, polylactic acid, chitosan, alginate, or dextran, or combinations thereof, with a diameter of less than 2 ⁇ .
  • mesh, fiber bundle, mesh or membrane may contain an electrospinning fiber having a diameter ranging from 0.35 - 2 Mm.
  • the weight of the polycaprolactone may range from 70000 - 90000 Da.
  • the fibers and meshes described above may be obtained by electrospinnig, in particular when the polymer is selected from the following list polycaprolactone, polyglycolic acid, polylactic acid, chitosan, alginate, dextran, or combinations thereof, with a diameter of less than 2 ⁇ m. ⁇ , we can take the following steps:
  • the present application describes a biodegradable semi-porous polymeric mesh that can be used concomitantly with the preferred embodiment of a protocoled surgical method to allow better patient outcomes.
  • a surgical procedure in particular microfracture, may be used in conjunction with the polymeric mesh for tissue repair and regeneration.
  • This method has been applied clinically to induce tissue repair, particularly damaged joint cartilage, taking advantage of the body's own ability to regenerate.
  • a viable pathway to the bone marrow elements must be obtained, and therefore the bone bed must be properly prepared.
  • the subchondral bone should be fully exposed and the base of the defect should be cleaned of any soft tissue, particularly the remnants of fibrous tissue.
  • the calcified cartilage layer should be also removed from the surface of the subchondral bone with an arthroscopic scraper or curette to enhance restoration and regeneration of the defect.
  • the subchondral bone plate should be preserved as fully as possible.
  • the defect boundary must be intact articular cartilage.
  • the perimeter of the defect should ideally be perpendicular to the subchondral bone plate.
  • the microfracture is made with a pointed punch that will allow light drilling. These perforations will form channels that will allow the migration of biological elements from the medullary cavity to the defect.
  • the holes should preferably be drilled perpendicular to the subchondral bone, and it is therefore advisable to use sharp drillers rather than drill tips. Additionally, drilling with a drill may cause thermal necrosis of the subchondral bone.
  • the microfracture is performed on the periphery of the defect with perforations that penetrate approximately 3 to 4 mm into the subchondral bone. These holes in the periphery may provide an ideal anchor point of regenerated fibrocartilage to the transitional zone between the normal articular cartilage.
  • the perforations are subsequently evenly distributed along the defect with 3 to 4 mm subchondral bone bridges between each perforation. If the holes are positioned too close to each other, the fractures risk coalescing and spreading to the subchondral bone.
  • the tourniquet is released and the flow pressure is increased so that there is visual confirmation of drops of blood, bone marrow and fat flowing out of all microfracture holes. If this does not happen, the microfracture should be repeated to ensure bone marrow flow.
  • the microfracture causes the release of blood and bone marrow from the medullary cavity that crosses the subchondral bone plate. Initially, a blood clot is formed in the microfracture region. This clot, through mesenchymal stem cells and marrow growth factors bone, it becomes replacement or healing tissue called fibrocartilage.
  • a polymeric tissue repair or regeneration mesh of an organism comprising:
  • Pores wherein at least 70% of the pores of said mesh are smaller than required to confine the cells of said tissues, and wherein at least 70% of the pores of said mesh are larger than required for fluid passage. interstitials of said tissues; preferably 80% of the pores of said mesh are smaller than required to confine the cells of said tissues, more preferably 90%, 95%, or 100% of the pores; pore size can be determined by a variety of commonly known methods such as the mathematical model developed by Tomadakis and Robertson;
  • the degradation time of said polymeric mesh in the body is at least 8 weeks, preferably degradation may range from 8-26 weeks, more preferably 8-15 weeks;
  • the polymeric mesh has an apparent modulus of elasticity between 0.1 - 100 MPa, preferably between 5-30 MPa, which can be determined by various methods commonly known as for example tensile testing using a load cell of 1. kN at a temperature of 25 ⁇ €; And said polymeric mesh has a tensile strength of greater than 1 MPa, preferably a strength which may range from 2-30 MPa; preferably 3-20 MPa, which can be determined by various methods commonly known as for example in tensile tests using a 1 kN load cell at a temperature of 25 ° C.
  • the tissue repair / regeneration polymeric mesh described in the present application has a slow and semi-porous degradation, allowing the selective circulation of biologically active molecules between the blood clot confined to the cartilage lesion volume and the synovial cavity or vice versa.
  • the pore size should be sufficiently smaller than the minimum size of human cells or other animals, acting as a barrier to the passage of blood and bone marrow from induced microfractures, the polymer used having a degradation time in the For more than 8 weeks, the polymeric mesh also has sufficient mechanical stability to break (to resist, for example, surgical manipulation during the implantation and fixation process), as well as sufficient elasticity to withstand physiological mechanical stresses in the lesion area (as for example in the joint).
  • the synergies of these mesh characteristics allow the newly formed fabric to have characteristics very similar to the pre-existing fabric.
  • the implantable biomedical device in the form of slow degrading biocompatible mesh shall have sufficient mechanical stability for its surgical manipulation during the implantation and fixation process, as well as sufficient elasticity to withstand the physiological mechanical stresses present in the joint.
  • tissue conversion process to be regenerated such as the conversion of a clot into fibrocartilage
  • the polymeric mesh for regeneration should have a slow degradation in the body of at least 8 weeks, and the best results were obtained with the selected polymers from the following list:
  • Synthetic polymers such as polycaprolactone (PCL), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), and their copolymers;
  • Natural polymers such as chitosan, alginate, dextran;
  • polymers may also be added as a polymer selected from starch, hyaluronic acid, or chondroitin sulfate, or combinations thereof.
  • the described polymeric mesh can be obtained using the electrospinning technique, although other material processing techniques may be used provided that the meshes produced comply with the established prerequisites.
  • the present slow degrading biocompatible semi-porous polymeric mesh may further incorporate biologically active molecules. This incorporation may be by mixing with the biomaterials used in the fabrication of the mesh, by physical confinement, coating or adsorption of these molecules to the surface of the mesh.
  • Biologically active molecules include antiinflammatory drugs, namely non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) (ie aspirin, paracetamol, magnesium choline trisalicylate, diclofenac, diflunisal, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indomethacin, ketoprofen, ketoprofen , nabumetone, naproxen, oxaprozine, phenylbutazone, piroxicam, salsalate, sulindac and tolmetine) and cyclooxygenase-2 inhibitors (such as celecoxib), corticosteroids or glucocorticoids, the disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs) (ie methotrexate) , sulfasalazine, leflunomide, cyclosporine, minocycline, hydroxychloroquine, azathioprine, D-penicillamine and gold
  • Biologically active molecules involved in homeostasis and the regenerative process may also be incorporated, specifically transforming growth factors- ⁇ , - ⁇ 1, - ⁇ 2 and - ⁇ 3 (TGF- ⁇ , TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2 and TGF ⁇ 3), platelet-derived growth factors-AA, -AB, -BB, - CC and -DD (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC and PDGF-DD), insulin growth factor -1 (IGF-1), vascular endothelial growth factor-A, -B, -C and - D (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C and VEGF-D), hypoxia-inducing factor (HIF).
  • TGF- ⁇ , TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2 and TGF ⁇ 3 platelet-derived growth factors-AA, -AB, -BB, - CC and -DD
  • IGF-1 insulin growth factor -1
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF-2 and FGF-18 fibroblast growth factors-2 and -18
  • bone-2 -4, -6 and -7 morphogenic proteins / osteogenic protein -1 (BMP-2, BMP-4, BMP-6 and BMP-7 / OP-1), the morphogenic proteins derived from cartilage-1 / growth and differentiation factor-5 and -2 (CDMP-1 / GDF- 5 and CDMP-2).
  • fixation of this implantable biomedical device / polymeric mesh for tissue repair and regeneration should preferably occur by the use of binders, such as glue or sealant.
  • binders such as glue or sealant.
  • other methods of membrane fixation Surgical procedures may be considered, specifically the use of resorbable sutures, staples or pins.
  • the entire surgical procedure described above, including the microfracture surgical technique, implantation of the membrane-shaped biomedical device and its attachment to the cartilage area adjacent to the lesion can either be performed by the standard minimally invasive surgical method called arthroscopy or by surgery. open
  • Postoperative monitoring of the restoration and regeneration process of human or other animal articular cartilage when using the device described in this invention, may be performed by arthroscopic examination, X-ray imaging, magnetic resonance imaging and computed tomography. , biochemical analysis of synovial or blood fluid.
  • the mechanical properties of the mesh can be determined by commonly known methods such as a tensile test.
  • the analyzes were performed on a universal tensile testing machine [Series 5543, INSTRON] equipped with a 1 kN load cell and the crosshead speed set at 5 mm / min.
  • the paper frame containing the mesh samples was initially secured by mechanical action jaws and manually adjusted by tightening the adjacent knurled screws. The faces sides of said paper frame were cut and the tensile test was started.
  • the density of the PCL (p P c L ) has the tabulated value of 1,145 g / ml at 25 ° C.
  • the apparent bulk density (PAPP) measured from the following mass to volume ratio:
  • the samples were prepared using a punch with an internal diameter of 20 mm. All measurements were performed in controlled environmental conditions, including a temperature of 25 Q C. The mass of the samples was determined by a precision balance [TP-214, Denver Instruments] by arithmetic average of three separate weighings. The thickness of each sample was determined by a micrometer [IP65, Mitutoyo], with flat points (0 6 mm) and a ⁇ 1 ⁇ by means of the arithmetic mean of six measurements at random positions of the sample.
  • the average pore size was calculated by establishing the relationship between the characteristic pore size (c / 3D ), the fiber diameter ( ⁇ ) and the porosity ( ⁇ ), according to the equation presented below, developed by Tomadakis MM and Robertson TJ (Chemical Physiscs 2003, volume 119):
  • This model was derived from a computer generated random fibrous structure in which a sphere of a defined diameter was fitted into a 3D portion.
  • the equation assumes a random structure consisting of a single fiber whose transverse sections assume perfect round shapes.
  • Fiber diameter ( ⁇ ) was measured in 5 independent scanning electron microscopy images at 10000X using AxioVision LE v4.8.2.0 software.
  • the mesh tested comprises:
  • This feature will be relevant for its clinical application in joint cartilage regeneration, since we want the mesh to function as a partition between two compartments in the knee. It will separate bone marrow cells from fluid in the synovial cavity, which will induce chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
  • the surface of these meshes may be subject to chemical modification in order to improve their biocompatibility and bioactivity characteristics.
  • chondroitin sulfate ie a polymer of natural surface
  • contact angle measurement, scanning electron microscopy, optical profilometry and FTIR, X-ray and photoelectron spectrometric analysis confirmed the successful immobilization of chondroitin sulfate on PCL mesh fibers.
  • meshes with chondroitin sulfate immobilization showed lower roughness and higher hydrophilicity compared to fibrous meshes produced in PCL and not modified.
  • polycaprolactone fibrous meshes Another advantageous feature of these polycaprolactone fibrous meshes is related to their biodegradation.
  • Polycaprolactone has a slower degradation rate (8-15 weeks) compared to commercially available meshes. This longer biodegradation time allows the cells to be supported longer so that they form a denser extracellular matrix, giving greater opportunity for neo-cartilage formation and, consequently, repair of the cartilage defect.
  • the mesh tested comprises:
  • a biodegradable fibrous mesh was implanted in the domestic pig animal model into a 4 cm circumferential esophageal defect induced by endoscopic dissection of the esophageal submucosa as a model of low grade premalignant and malignant esophageal lesions.
  • This in vivo implantation study demonstrated the ability of the biodegradable fibrous mesh to prevent stenosis following endoscopic esophageal submucosal (ESD) dissection.
  • ESD endoscopic esophageal submucosal
  • the implanted biodegradable fibrous mesh in addition to allowing epithelial cell culture, prevented bleeding and perforation of the esophagus. Additionally, the biodegradable fibrous mesh of polycaprolactone showed resistance to enzymatic degradation, namely degradation by the luminal content of the esophagus. The results of this preclinical survival study indicated that the implantable biodegradable fibrous mesh allows for remodeling and re-epithelialization of the lower fibrosis-forming esophageal mucosa, thus avoiding a decrease in esophageal luminal caliber.
  • the biodegradable fibrous mesh is easy to handle, considering the limitations of handling endoscopic material, presenting the necessary malleability, among other physical properties essential to its endoscopic application.
  • the biodegradable fibrous mesh When implanted, the biodegradable fibrous mesh showed good adaptability to gastrointestinal tissues, with high guarantee of defect positioning and maintenance of this position throughout the regenerative period, not neglecting the constant presence of luminal secretions and esophageal contractility.
  • the biodegradable fibrous mesh has structural sustainability that, theoretically, will allow to isolate fragile zones of the wall of tubular organs, such as the esophagus and the rectum.
  • the mesh tested comprises:
  • the biological functionality of the biodegradable fibrous mesh can be enhanced by culturing human periodontal ligament-derived cells (hPDLCs) prior to implantation.
  • hPDLCs human periodontal ligament-derived cells
  • Phenotypic characterization of hPDLCs by flow cytometry over 15 cell subculture passages demonstrated the expression of specific mesenchymal stem cell markers (MSCs), namely CD-29, -73, -90 and -105 antigens. and lack of expression of hematopoietic markers, namely CD-34 and -45 antigens.
  • biodegradable fibrous meshes produced from polycaprolactone and Bio-Gide® meshes (commercial porcine collagen meshes; Geistlich Biomaterials) in order to ascertain the biological behavior of hPDLCs on these substrates.
  • osteopontin a bone tissue-related RNA proteins and transcripts
  • osteocalcin a bone sialoprotein
  • biodegradable fibrous mesh represents an integrated solution for periodontal ligament regeneration.
  • This mesh allows for both local drug release and relevant cell culture, maximizing treatment efficiency and patient recovery time.
  • it is easier to apply and does not collapse during surgical treatment.
  • polycaprolactone fibrous meshes such as wound dressi ng / dermal cural
  • Polymeric composition chitosan (molecular weight: 270-416 kDa; degree of deacetylation (DD): 87.7-95%);
  • Nonwoven mesh composed of fibers randomly distributed or with preferential alignment orientations
  • Neutralization prevents mesh dissolution when immersed in aqueous medium.
  • This mesh acts as a barrier to unwanted cells (such as bacteria) and is permeable to nutrients and gases. It has adequate physical integrity and adaptability to the dermal defect, exhibiting easy handling both dry and wet. It has the ability to absorb large amounts of water and also to release absorbed water after adhering to the skin.
  • Chitosan has functional groups (specifically amine groups, -NH2) that allows the immobilization of bioactive agents and / or nanoparticles.
  • fibrous meshes may include one or more drugs and / or one or more desirable proteins and / or cells, reducing the side effects of the mentioned bioactive agents and the number of secondary surgical interventions.

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Abstract

O presente pedido descreve uma malha polimérica para reparação ou regeneração de tecidos de um organismo que compreende poros em que pelo menos 70% dos poros da referida malha têm tamanho inferior ao requerido para confinar as células dos referidos tecidos, e em que pelo menos 70% dos poros da referida malha tem um tamanho superior ao necessário para a passagem de fluídos intersticiais dos referidos; em que o tempo de degradação da referida malha polimérica no organismo é de pelo menos 8 semanas; a referida malha polimérica possui uma resistência à tensão superior a 1 MPa e um módulo de elasticidade aparente superior a 0.1 MPa. A malha descrita neste pedido permite que o "novo tecido" tenha propriedades muito semelhantes ao tecido lesado. Desta forma, a malha polimérica para a reparação/regeneração de tecidos descrita no presente pedido, pode ser utilizada em medicina em combinação ou não com métodos cirúrgicos, nomeadamente no tratamento de doenças que envolvem a reparação ou regeneração de tecidos em particular quando os tecidos a tratar são pele, cartilagem, ligamento periodontal ou submocosas do esófago.

Description

DESCRIÇÃO
MALHA POLÍMERICA COM PERMEABILIDADE SELETIVA, PARA A
REGENERAÇÃO/REPARAÇÃO DE TECIDOS
CAMPO DA TÉCNICA
[0001 ] O presente pedido descreve uma malha semi-porosa elástica biocompatível de degradação lenta e com permeabilidade seletiva, a qual poderá ser usada como uma membrana ou um dispositivo biomédico implantável. Esta malha poderá ser aplicada sobre o defeito tecidular em combinação com procedimentos cirúrgicos rotineiros como por exemplo o procedimento cirúrgico de microfratura, promovendo a reparação e regeneração de tecidos tais como cartilagem, pele, mucosa do esófago, entre outros cartilagem articular danificada por trauma ou doença, em humanos ou outros animais.
ESTADO DA TÉCNICA
[0002] O objetivo da engenharia de tecidos é desenhar novos componentes funcionais que possam regenerar tecidos vivos, restaurando completamente a sua função. A engenharia de tecidos compreende 3 premissas básicas: o uso de uma estrutura polimérica tridimensional ou scaffold que suporte o crescimento celular e posterior formação do tecido, uma fonte de células e factores de crescimento que induzam essas mesmas células a se diferenciarem no tecido alvo. Estes scaffolds podem ser desenvolvidos para vários fins, tais como a adesão e fixação de tecidos, manutenção de forma, como guias da regeneração de tecidos ou como suporte temporário para o desenvolvimento dos mesmos. Os materiais biodegradáveis têm vindo a ser grandemente usados em Engenharia de Tecidos pela sua capacidade de serem degradados e metabolizados pelo corpo, após reparação das lesões dos tecidos. Desta forma, à medida que as células crescem e se organizam num tecido vivo, o scaffold vai degradando lentamente, pois já não é necessário como estrutura de suporte. Portanto, o grau de degradação do scaffold é muito importante no contexto da Engenharia de Tecidos.
[0003] Um scaffold implantável deve recapitular a maioria das características essenciais da matriz extracelular nativa do tecido a reparar, promovendo assim as condições ideais para a regeneração do mesmo. Assim, uma característica muito importante dos scaffoids é a sua porosidade. Altos níveis de porosidade são desejáveis, maximizando as oportunidades de colonização celular, o que permite um desenvolvimento do tecido mais rápido. No entanto, elevados níveis de porosidade implicam menor estabilidade mecânica do scaffold. Deste modo, um equilíbrio otimizado entre estas exigências contraditórias deve ser obtido para cada aplicação específica. O tamanho dos poros é outra questão crítica no desempenho celular dos scaffoids, pois estes devem ter poros que permitam a adesão e proliferação celulares, e, ao mesmo tempo, permitam a passagem de nutrientes e moléculas presentes no meio. Especificamente, se os poros forem demasiado pequenos, eles podem impedir a colonização interna dos scaffoids pelas células. De facto, este é um problema comum das malhas ou membranas produzidas por electrospinning, o qual pode ser contornado mediante aplicação de algumas estratégias propostas na literatura.
[0004] A maioria dos métodos de processamento não permitem especificar o tamanho, a forma ou a distribuição espacial dos poros. Frequentemente, os métodos permitem um controlo apertado das matérias-primas a utilizar e podem permitir a obtenção de rotinas de processamento estáveis, que resultam em scaffoids com níveis similares de porosidade e de propriedades macroscópicas. A maioria dos métodos pode também permitir a obtenção de um certo controlo ao nível da interconectividade dos poros. No entanto, a eventual distribuição não uniforme da interconectividade implica que algumas partes do scaffold não sejam capazes de ser colonizadas por células. Especificamente, uma interconectividade baixa dificulta a difusão local de fluídos, assim como a hidrólise do biomaterial, resultando em cinéticas de degradação irregulares.
[0005] Os scaffoids podem ter várias formas, sendo que uma delas é a forma de malha ou membrana. Actualmente existem no mercado vários tipos de membranas para regeneração de tecidos, entre os quais pele, esófago ou cartilagem. A maioria destas membranas é baseada em polímeros naturais, e, portanto, biodegradáveis. Elas conferem uma solução para a regeneração de alguns defeitos, mas ainda não foi reportada na literatura uma completa regeneração e recuperação de função dos tecidos para os quais elas são utilizadas.
[0006] A regeneração de traumas ou defeitos na cartilagem articular continuam a ser um grande desafio no campo da ortopedia. A natureza avascular deste tecido tem vinda a ser apontada como umas das principais razões da sua fraca capacidade inata de auto- regeneração. Existe uma grande variedade de condições patológicas que envolvem a perda de cartilagem articular, como, por exemplo, a osteoartrite.
[0007] As estratégias existentes para restaurar ou regenerar a cartilagem articular incluem a artroplastia total ou parcial da articulação, o desbridamento artroscópico, a técnica de microfratura, e ainda estratégias de engenharia de tecidos. A artroplastia total, também denominada substituição total da articulação, é uma das intervenções cirúrgicas com maior sucesso para o tratamento de doenças cartilagíneas, nomeadamente a osteoartrite, apresentando óbvias desvantagens como, por exemplo, a propensão para causar dor crónica. Por sua vez, a artroplastia parcial não altera a progressão da osteoartrite e a sua utilização pode conduzir a dor prolongada, devido à instabilidade da prótese, à erosão dos seus componentes ou à artrofibrose. O desbridamento artroscópico e lavagem remove os detritos da cartilagem degenerativa mediante irrigação da articulação com uma solução de sal e lactato. Este método proporciona um alívio temporário da dor, mas não contribui significativamente para a formação de nova cartilagem. O procedimento de microfratura envolve a punção de pequenos orifícios no osso subcondral, induzindo sangramento. Um coágulo é formado quando o sangue e a medula óssea se infiltram na cartilagem danificada, libertando células estaminais para a reparação e regeneração da cartilagem. Assim como no desbridamento artroscópico, o procedimento de microfratura resulta na formação de tecido fibrocartilagíneo que tende a degenerar com o tempo, embora possa produzir alívio temporário dos sintomas.
[0008] Na última década alguns procedimentos de engenharia de tecido cartilagíneo foram transpostos para a clínica, através da utilização de células autólogas combinadas ou não com estruturas tridimensionais porosas. A primeira aproximação de engenharia de cartilagem, designada de "Implantação de Condrócitos Autólogos" (ACI), transformou-se na terapia celular dominante para reparação da cartilagem articular, nas últimas duas décadas. Nesta técnica, os condrócitos autólogos expandidos são implantados sob uma dobra do periósteo após a raspagem cirúrgica da lesão. A técnica de ACI demonstrou resultados excelentes na reparação do tecido a curto e médio prazo, mas a avaliação dos resultados a longo prazo tornou o uso desta terapia controverso. A técnica de ACI evoluiu posteriormente com a utilização de estruturas tridimensionais porosas, resultando na técnica denominada de MACI - "Implantação de Condrócitos Autólogos assistida por uma Matriz". A função dessas estruturas ou matrizes é de suportar a colonização, o crescimento e a diferenciação celulares, originando implantes médicos celularizados para substituição ou regeneração do tecido danificado por trauma ou doença. Na técnica de MACI, para além dos condrócitos, outras fontes de células autólogas podem também ser utilizadas, nomeadamente células estaminais mesenquimais, células derivadas do periósteo ou fibroblastos sinoviais. Um relatório onde se descreve a evolução dos pacientes ao final de 5 anos após a implantação, usando a técnica MACI, também demonstrou resultados positivos: 8 em 1 1 pacientes avaliaram a função dos seus joelhos como melhores ou muito melhores do que antes da cirurgia. No entanto, este método envolve duas intervenções cirúrgicas, bem como várias limitações na mobilidade e na qualidade de vida dos pacientes.
DESCRIÇÃO GERAL
[0009] O presente pedido descreve uma malha implantável para a reparação e regeneração de tecidos humanos ou de outro animal como, por exemplo, cartilagem articular, pele, entre outros, danificado por trauma ou doença. A malha semi-porosa descrita na presente invenção é resistente à rutura, elástica, biocompatível e de degradação lenta, poderá ser combinada com o procedimento cirúrgico de microfratura e permitindo uma rápida formação do tecido. Esta nova malha permite que as células do tecido a regenerar/reparar estejam confinadas a um determinado espaço, que se desenvolvam lentamente permitindo que o novo tecido tenha características semelhantes ao tecido pré existente [0010] O tecido a regenerar pela malha polimérica para a regeneração de tecidos pode ser tecido de cartilagem, tecido do ligamento periodontal, ou submucosas do esófago.
[001 1 ] Na regeneração de tecidos nomeadamente na cartilagem articular do joelho, as células estaminais presentes na medula óssea, expostas ao local da lesão pela técnica cirúrgica de microfratura, serão responsáveis pelo processo de restauração e regeneração da cartilagem articular danificada, mediante confinamento espacial conferido pela malha descrita na presente invenção na forma de membrana ou dispositivo biomédico descrito no presente pedido isto é a malha semi-porosa elástica biocompatível de degradação lenta.
[0012] A malha descrita no presente pedido é porosa, os poros tem dimensões inferiores ao tamanho de uma célula sanguínea humana ou de outro animal, e permite, ao mesmo tempo, a passagem seletiva de moléculas biologicamente ativas, provenientes da medula óssea, do líquido sinovial ou da própria membrana. O uso da malha descrita neste pedido pode prevenir ainda, entre outros, a progressão de lesões traumáticas e das formas iniciais de osteoartrite que, de outro modo, conduziriam a osteoartrite grave com dor persistente e perda de função da articulação, levando à provável ressecção e substituição da articulação.
[0013] O presente pedido descreve uma malha polimérica para reparação ou regeneração de tecidos de um organismo que compreende:
• Poros, em que pelo menos 70% dos poros da referida malha têm tamanho inferior ao requerido para confinar as células dos referidos tecidos, e em que pelo menos 70% dos poros da referida malha tem um tamanho superior ao necessário para a passagem de fluídos intersticiais dos referidos tecidos; de preferência 80% dos poros da referida malha têm tamanho inferior ao requerido para confinar as células dos referidos tecidos, mais de preferência 90%, 95%, ou 100% dos poros; • o tempo de degradação da referida malha polimérica no organismo é de pelo menos 8 semanas, de preferência a degradação pode variar entre 8- 26 semanas, mais de preferência 8-15 semanas;
• a malha polimérica possui um módulo de elasticidade aparente entre 0.1 - 100 MPa, de preferência entre 5-30 MPa;
• e a referida malha polimérica possui uma resistência à tração aparente superior a 1 MPa, de preferência a resistência mecânica pode varia entre 2-30 MPa; de preferência 3-20 MPa.
A presença de poros na malha, cujas dimensões são inferiores ao tamanho de uma célula humana ou de outro animal, permite a passagem bidirecional de moléculas biologicamente ativas, como por exemplo as provenientes da medula óssea, do líquido sinovial ou de outro fluido intersticial. Esta malha permite que o "novo tecido" tenha propriedades muito semelhantes ao tecido lesado.
[0014] As sinergias destas características da malha permitem que o novo tecido formado tenha características muito semelhantes ao tecido pré-existente.
[0015] Numa realização da malha polimérica para reparação ou regeneração de tecidos descrita, as células estaminais presentes na medula óssea, expostas ao local da lesão pela técnica cirúrgica de microfratura, serão confinadas espacialmente ao espaço do defeito cartilagíneo mediante fixação do dispositivo biomédico, que consiste numa malha semi-porosa elástica biocompatível de degradação lenta à superfície da cartilagem normal adjacente. A presença de poros nessa malha, cujas dimensões deverão ser inferiores ao tamanho de uma célula humana ou de outro animal, permitirá a passagem bidirecional de moléculas biologicamente ativas, provenientes da medula óssea, do líquido sinovial ou da própria malha. Adicionalmente, o dispositivo biomédico implantável poderá atuar como um sistema de libertação de moléculas biologicamente ativas, que controlem o processo inflamatório, o processo regenerativo e/ou a homeostasia da cartilagem. [0016] Nuna outra realização da malha polimérica para a regeneração de tecidos descrita tem resultados melhorados com a seguinte característica
• uma porosidade média entre 83 - 91%, a qual poderá ser determinada por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo pelo método de gravimetria;
• 80-90% dos poros com um tamanho entre 1 .2 - 13.37 μηη, o qual pode ser determinado por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo pelo modelo matemático desenvolvido por Tomadakis e Robertson (2003);
• um módulo de elasticidade aparente entre 8.58 - 27.87 MPa;e uma resistência à tração aparente entre 2.15-4.38 MPa, os quais podem ser determinados por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo em testes de tração, recorrendo por exemplo a uma célula de carga de 1 kN e a uma temperatura de 25 3 C.
[0017] Esta característica mecânica permite que a malha para a regeneração de tecidos tenha melhores resultados na permeabilidade dos líquidos adjacentes ao tecido a regenerar, resistência as forças exercidas e confinamento das células "regenerativas" à área da lesão, permitindo assim que se forme um tecido com características muito próximas do já existente. Estas características são relevante por exemplo na aplicação clínica na regeneração de cartilagem articular, uma vez que se pretende que a malha funcione como uma divisória entre dois compartimentos no joelho. Ela irá separar as células provenientes da medula óssea do líquido presente na cavidade sinovial, o que permitirá a indução da diferenciação condrogénica das células estaminais mesenquimais da medula óssea.
[0018] Numa realização a referida malha polimérica para a regeneração de tecidos descrita pode compreender um polímero selecionado da seguinte lista policaprolactona, ácido poliglicólico, ácido polilático, quitosano, alginato, dextrano, ou suas combinações, estes polímeros permitem melhorar a reparação/regeneração de tecidos. A utilização destes polímeros permite suportar as células durante mais tempo, para que estas formem uma matriz extracelular mais densa, dando maior oportunidade à formação de tecido a tratar como por exemplo a neo-cartilagem e, consequentemente, à reparação do defeito.
[0019] Numa outra realização da malha polimérica para a regeneração de tecidos descrita poderá ainda compreender um polímero natural, em particular um polímero selecionado entre amido, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, ou suas combinações, esta combinação atua sinergicamente na reparação dos tecidos permitindo uma maior proliferação celular. Em particular a combinação dos seguintes polímeros: policaprolactona, ou policaprolactona e amido, ou policaprolactona e ácido hialurónico, ou policaprolactona e sulfato de condroitina, ou ácido poliglicólico, ou ácido polilático, ou suas combinações, entre outras.
[0020] Numa outra realização preferencial da malha polimérica para a reparação/regeneração de tecidos descrita pode compreende 60-80% (p/v) policaprolactona e 20-40% (p/v) de um polímero natural, ou qualquer outra proporção como por exemplo 70% (p/v) policaprolactona e 30% (p/v) de um polímero natural, em que o peso da policaprolactona poderá varia entre 70000 - 90000 Da.
[0021 ] Numa outra realização preferencial da malha polimérica para a reparação/regeneração de tecidos descrita compreende, em que de preferência o grau de desacetilação de quitosano varia entre 50-100%, de preferência 87.7-95%.
[0022] Esta malha permite confinar as células do tecido a tratar a zona desejada, e permeável a fatores de crescimento que potenciam a comunicação entre células, sem deixar que estas "escapem" da zona pretendida permitindo uma regeneração de tecido eficaz e semelhante a parte não lesada.
[0023] Estas características mecânicas permitem que a malha polimérica para a regeneração de tecidos para a regeneração de tecidos tenha melhores resultados na permeabilidade dos líquidos adjacentes ao tecido a regenerar, resistência as forças exercidas e confinamento das células "regenerativas" à área da lesão, permitindo assim que se forme um tecido com características muito próximas do já existente. Estas características são relevante por exemplo na aplicação clínica na regeneração de cartilagem articular, uma vez que se pretende que a malha funcione como uma divisória entre dois compartimentos no joelho. Ela irá separar as células provenientes da medula óssea do líquido presente na cavidade sinovial, o que permitirá a indução da diferenciação condrogénica das células estaminais mesenquimais da medula óssea.
[0024] Numa outra realização da malha polimérica para a regeneração de tecidos descrita, pode compreender adicionalmente substâncias ativas selecionadas da seguinte lista: anti-inflamatórios, antibióticos, agentes biológicos modificadores da doença reumática, inibidores, fatores de crescimento. A incorporação das substâncias ativas pode ocorrer por mistura com o(s) polímero(s) utilizado(s) na produção da malha, por confinamento físico, ou por revestimentos e/ou por adsorção à superfície das malhas.
[0025] A referida malha poderá ainda atuar como um sistema de libertação de moléculas biologicamente ativas, que controla o processo inflamatório, o processo regenerativo e/ou a homeostasia da cartilagem. Numa outra realização da malha polimérica para a regeneração de tecidos descrita, pode incorpora ainda substâncias ativas envolvidas na homeostasia e no processo regenerativo de tecidos, em particular cartilagem como por exemplo TGF-a, TGF-βΙ , TGF- β2 e TGF-33, IGF-1 , EGF, HIF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC e PDGF-DD, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D, FGF-2, FGF- 18, BMP-2, BMP-4, BMP-6,BMP-7/OP-1 , CDMP-1/GDF-5, CDMP-2 ou equivalentes.
[0026] A malha polimérica para a regeneração de tecidos descrita poderá ter uma espessura que varia entre 20-200 μηη, de preferência 40-80 μηη, ainda mais de preferência 60 μηη. [0027] O presente pedido descreve ainda o uso da malha polimérica para a regeneração de tecidos em medicina veterinária e humana, nomeadamente no tratamento de doenças envolvendo regeneração de tecidos.
[0028] A malha polimérica para a regeneração de tecidos anteriormente descrita, poderá ser aplicada no corpo humano ou animal, por fixação no tecido normal adjacente à área de tecido afetada mediante o uso preferencial de um ligante, tal como cola selante ou seu equivalente, ou por fixação mediante cirurgia minimamente invasiva padrão ou por cirurgia aberta.
[0029] A malha polimérica para a regeneração de tecidos anteriormente descrita poderá ser utilizada na regeneração de pele, cartilagem, ligamento periodontal ou submocosas do esófago.
[0030] A malha polimérica descrita pode ser obtida recorrendo-se à técnica de electrospinning, embora outras técnicas de processamento de matérias possam ser utilizadas, desde que as malhas produzidas obedeçam aos pré-requisitos estabelecidos. Assim sendo, a malha anteriormente descrita poderá ser tecida ou não tecida.
[0031 ] Numa outra realização preferencial a tira, rede, feixe de fibras, malha ou malha obtenível por electrospinning compreendida por um polímero selecionado da seguinte lista policaprolactona, ácido poliglicólico, ácidoe polilático, quitosano, alginato, ou dextrano, ou suas combinações, com um diâmetro inferior a 2 μηι.
[0032] Numa outra realização da tira, rede, feixe de fibras, malha ou membrana descrita poderá conter uma fibra obtenível por electrospinning com um diâmetro que varia entre 0,35 - 2 Mm. [0033] Numa outra realização da fibra polimérica da tira, rede, feixe de fibras, malha ou membrana o peso da policaprolactona poderá varia entre 70000 - 90000 Da.
[0034] As fibras e malhas anteriormente descritas, poderão ser obtidas por electrospinnig, em particular quando o polímero é selecionado da seguinte lista policaprolactona, ácido poliglicólico, ácidoe polilático, quitosano, alginato, dextrano, ou suas combinações, com um diâmetro inferior a 2 μηι, poderemos ter os seguintes passos:
• preparação de uma solução do polímero selecionado com uma mistura de solventes adequada; por exemplo misturar uma solução com uma concentração de 13-17% (p/v) de policaprolactona, com a mistura de solventes Clorofórmio:Dimetilformamida numa razão de 1 :1 - 7:3
• ejetar a solução resultante do passo anterior com uma taxa de fluxo que pode variar entre 0.9 - 1 ml/h; tensão aplicada que pode variar entre 9-12 kV; a uma temperatura que pode variar entre 19 - 22,5 eC; humidade relativa que pode variar entre: 32 - 43 %.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0035] O presente pedido descreve uma malha polimérica semi-porosa biodegradável, que poder ser usada concomitantemente com a forma preferencial de concretização dum método cirúrgico protocolado, de modo a permitir melhores resultados para o paciente.
[0036] Numa outra realização poderá ser usado em conjunto com a malha polimérica para reparação e regeneração de tecidos um procedimento cirúrgico, em particular a microfratura. Este método tem sido aplicado clinicamente para indução da reparação de tecidos, em particular cartilagem articular danificada, tirando partido da própria capacidade do organismo se regenerar. Na preparação do defeito para a intervenção deve obter-se um caminho viável para os elementos da medula óssea, e portanto o leito ósseo deve ser preparado adequadamente. O osso subcondral deve ser totalmente exposto e a base do defeito deve ser limpa de todo e qualquer tecido mole, particularmente os restos de tecido fibroso. A camada de cartilagem calcificada deve ser também removida da superfície do osso subcondral com um raspador ou cureta artroscópicos para potenciar a restauração e regeneração do defeito. A placa óssea subcondral deve ser preservada o mais inteiramente possível. Em segundo lugar, o limite do defeito deve ser composto por cartilagem articular intacta. O perímetro do defeito deverá ser, idealmente, perpendicular à placa óssea subcondral.
[0037] Após esta preparação inicia-se a perfuração do defeito. A microfratura é realizada com um perfurador pontiagudo que permitirá obter perfurações ligeiras. Estas perfurações vão formar canais que permitirão a migração dos elementos biológicos da cavidade medular para o defeito. Os furos devem de preferência ser feitos perpendicularmente ao osso subcondral, e portanto é aconselhado o uso de perfuradores pontiagudos em vez de pontas de broca. Adicionalmente, a perfuração com broca pode causar necrose térmica do osso subcondral.
[0038] A microfratura é efetuada na periferia do defeito com perfurações que penetram aproximadamente 3 a 4 mm no osso subcondral. Estes furos na periferia podem providenciar um ponto de ancoragem ideal da fibrocartilagem regenerada à zona transicional entre a cartilagem articular normal. As perfurações são posteriormente distribuídas uniformemente ao longo do defeito com pontes de osso subcondral de 3 a 4 mm entre cada perfuração. Se os furos ficarem posicionados muito próximos uns dos outros corre-se o risco de as fraturas coalescerem e se propagarem para o osso subcondral. O garrote é solto e a pressão de fluxo é aumentada, para existir uma confirmação visual de gotas de sangue, medula óssea e gordura a escoar-se de todos os furos da microfratura. Se tal não acontecer, a microfratura deverá ser repetida de forma a assegurar o escoamento de medula óssea.
[0039] A microfratura causa a libertação de sangue e medula óssea proveniente da cavidade medular que atravessa a placa óssea subcondral. Inicialmente é observada a formação de um coágulo sanguíneo na região da microfractura. Este coágulo, através das células estaminais mesenquimais e dos fatores de crescimento provenientes da medula óssea, transforma-se em tecido de reposição ou cicatrização denominado de fibrocartilagem.
[0040] O não confinamento do coágulo sanguíneo ao espaço da lesão cartilagínea induz a sua disseminação pelo líquido sinovial, diminuindo a eficiência do tratamento. Adicionalmente, este coágulo é bastante frágil, necessitando de ser protegido dos esforços mecânicos fisiológicos. Este problema é resolvido pela aplicação de uma malha polimérica semi-porosa que permite a reparação/regeneração do tecido, está malha poderá ser utilizada ma forma de dispositivos biomédicos/ membranas biodegradáveis.
[0041 ] A malha polimérica para reparação ou regeneração de tecidos de um organismo que compreende:
• Poros, em que pelo menos 70% dos poros da referida malha têm tamanho inferior ao requerido para confinar as células dos referidos tecidos, e em que pelo menos 70% dos poros da referida malha tem um tamanho superior ao necessário para a passagem de fluídos intersticiais dos referidos tecidos; de preferência 80% dos poros da referida malha têm tamanho inferior ao requerido para confinar as células dos referidos tecidos, mais de preferência 90%, 95%, ou 100% dos poros; o tamanho dos poros pode ser determinado por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo pelo modelo matemático desenvolvido por Tomadakis e Robertson;
• em que o tempo de degradação da referida malha polimérica no organismo é de pelo menos 8 semanas, de preferência a degradação pode variar entre 8-26 semanas, mais de preferência 8-15 semanas;
• a malha polimérica possui um módulo de elasticidade aparente entre 0.1 - 100 MPa, de preferência entre 5-30 MPa, o qual pode ser determinado por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo em testes de tração, recorrendo a uma célula de carga de 1 kN a uma temperatura de 25<€; • e a referida malha polimérica possui uma resistência à tração superior a 1 MPa, de preferência uma resistência que pode varia entre 2-30 MPa; de preferência 3-20 MPa , o qual pode ser determinado por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo em testes de tração, recorrendo a uma célula de carga de 1 kN a uma temperatura de 25 °C.
[0042] Desta forma, a malha polimérica para a reparação/regeneração de tecidos descrita no presente pedido, tem uma degradação lenta é semi-porosa, permitindo a circulação seletiva de moléculas biologicamente ativas entre o coágulo sanguíneo confinado ao volume da lesão cartilagínea e a cavidade sinovial ou vice-versa. Isto pode ser explicado pela, a dimensão dos poros deverá ser suficientemente inferior à dimensão mínima de células humanas ou de outros animais, funcionando como uma barreira à passagem de sangue e medula óssea provenientes das microfraturas induzidas, o polímero utilizado ter um tempo de degradação no organismo superior a 8 semanas, a malha polimérica possui ainda estabilidade mecânica suficiente à rutura (para resistir por exemplo à manipulação cirúrgica, durante o processo de implantação e fixação), assim como elasticidade suficiente para suportar esforços mecânicos fisiológicos existente na zona da lesão (como por exemplo na articulação). As sinergias destas características da malha permitem que o novo tecido formado tenha características muito semelhantes ao tecido pré-existente.
[0043] Nuna outra realização da malha polimérica para a regeneração de tecidos descrita, obtemos resultados melhorados com as seguintes características
• uma porosidade média entre 83 - 91%, a qual poderá ser determinada por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo pelo método de gravimetria;
• 80-90% dos poros com um tamanho entre 1 .2 - 13.37 μηη, o qual pode ser determinado por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo pelo modelo matemático desenvolvido por Tomadakis e Robertson (2003);
• Um módulo de elasticidade aparente entre 8.58-27.87 MPa e uma resistência à tração aparente entre 2.15-4.38 MPa, os quais podem ser determinados por diversos métodos comummente conhecidos como por exemplo em testes de tração, recorrendo a uma célula de carga de 1 kN a uma temperatura de 25 °C.
[0044] O dispositivo biomédico implantável na forma de malha biocompatível e de degradação lenta deverá apresentar estabilidade mecânica suficiente à sua manipulação cirúrgica, durante o processo de implantação e fixação, assim como elasticidade suficiente para suportar esforços mecânicos fisiológicos existente na articulação.
[0045] Numa outra realização, para se obter, um processo de conversão do tecido a regenerar melhorada, como por exemplo a conversão de um coágulo em fibrocartilagem; a malha polimérica para a regeneração deverá ter uma degradação lenta no organismo de pelo menos 8 semanas, sendo que os melhores resultados foram obtidos com os polímeros selecionados da seguinte lista:
• Polímeros sintéticos como, por exemplo, a policaprolactona (PCL), o ácido poliglicólico (PGA), o ácido poliláctico (PLA), e seus co-polímeros;
• Polímeros naturais como, por exemplo, quitosano, alginato, dextrano;
• Combinações de polímeros de origem sintética com polímeros de origem natural, cuja degradação se estende até ao limite mínimo necessário à formação do tecido fibrocartilagíneo.
[0046] Poderão ainda ser adicionados outros polímeros como um polímero selecionado entre amido, ácido hialurónico, ou sulfato de condroitina, ou suas combinações.
[0047] A malha polimérica descrita pode ser obtida recorrendo-se a técnica de electrospinning, embora outras técnicas de processamento de matérias possam ser utilizadas desde que as malhas produzidas obedeçam aos pré-requisitos estabelecidos.
[0048] A presente malha polimérica semi-porosa biocompatível de degradação lenta poderá ainda incorporar moléculas biologicamente ativas. Esta incorporação poderá fazer- se por mistura com os biomateriais utilizados no fabrico da malha, por confinamento físico, através de um revestimento ou por adsorção dessas moléculas à superfície das malhas. Como moléculas biologicamente ativas referem-se os fármacos anti-inflamatórios, nomeadamente os anti-inflamatórios não-esteróides (NSAIDs) (i.e. aspirina, paracetamol, trissalicilato de colina magnésica, diclofenaco, diflunisal, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, quetoprofeno, meclofenamato, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, salsalato, sulindaco e tolmetina) e inibidores da ciclo-oxigenase-2 (como o celecoxib), corticosteróides ou glicocorticóides, os fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMARDs) (i.e. o metotrexato, a sulfasalazina, a leflunomida, a ciclosporina, a minociclina, a hidroxicloroquina, a azatioprina, a D- penicilamina e sais de ouro), e os agentes biológicos modificadores da doença, como os inibidores do fator de necrose tumoral α (como o etanercept, o infliximab, o adalimumab, o certolizumab e o golimumab), os inibidores de citocinas como a interleucina-1 a e -1 β (como, por exemplo, o anakinra) e -6 (como, por exemplo, o tocilizumab), os inibidores da co-estimulação de células T (como, por exemplo, o abatacept) e anticorpos contra células B (como, por exemplo, o rituximab). Também poderão ser incorporadas moléculas biologicamente ativas envolvidas na homeostasia e no processo regenerativo, especificamente os fatores de crescimento transformador-α, -β1 , -β2 e -β3 (TGF-a, TGF- β1 , TGF- β2 e TGF^3), os fatores de crescimento-derivados de plaquetas-AA, -AB,-BB, - CC e -DD (PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC e PDGF-DD), o fator de crescimento da insulina-1 (IGF-1 ), o fator de crescimento endotelial vascular-A, -B, -C e - D (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D), o fator indutor de hipoxia (HIF), o fator de crescimento epidermal (EGF), os fatores de crescimento fibroblástico-2 e -18 (FGF-2 e FGF-18), as proteínas morfogénicas do osso-2, -4, -6 e -7/proteína osteogénica-1 (BMP-2, BMP-4, BMP-6 e BMP-7/OP-1 ), as proteínas morfogénicas derivadas da cartilagem- 1 /fator de crescimento e diferenciação-5 e -2 (CDMP-1/GDF-5 e CDMP-2). A libertação dessas moléculas a partir da malha induzirá efeitos biológicos sobre o coágulo sanguíneo confinado ao volume da lesão cartilagínea e sobre a cavidade sinovial.
[0049] A fixação deste dispositivo biomédico implantável/malha polimérica para reparação e regeneração de tecidos deverá ocorrer preferencialmente mediante o uso de ligantes, nomeadamente cola ou selante. No entanto, outros métodos de fixação de membranas cirúrgicas poderão ser considerados, especificamente a utilização de suturas reabsorvíveis, agrafos ou pinos.
[0050] Todo o procedimento cirúrgico acima descrito, incluindo a técnica cirúrgica de microfratura, implantação do dispositivo biomédico em forma de membrana e sua fixação na área cartilagínea adjacente à lesão tanto pode ser realizado pelo método cirúrgico minimamente invasivo padrão denominado de artroscopia ou por cirurgia aberta.
[0051 ] A monitorização pós-operatória do processo de restauração e regeneração da cartilagem articular humana ou de outro animal, quando utilizado o dispositivo descrito nesta invenção, poderá realizar-se por exame artroscópico, por imagiologia de raio X, ressonância magnética e tomografia computorizada, análise bioquímica do líquido sinovial ou sanguínea.
Método de cálculo das propriedades mecânicas da malha - elasticidade e resistência à tração
[0052] As propriedades mecânicas da malha, tais como o módulo de elasticidade aparente, a resistência à tração aparente e a tensão máxima, podem ser determinados por métodos comummente conhecidos tal como um teste de tração.
[0053] Para a determinação da tração para determinação da elasticidade aparente, a resistência à tração aparente e a tensão máxima da malha efetuaram-se os seguintes passos:
• foram usadas seis amostras retangulares (30 x 6 mm) de cada malha e fixadas individualmente numa moldura de papel (30 mm x 25 mm) contendo uma janela de trabalho quadrangular de 15 milímetros.
• as análises foram realizadas numa máquina universal de ensaios de tração [Série 5543, INSTRON] equipada com uma célula de carga de 1 kN e definida a velocidade da cruzeta a 5 mm/min. A moldura de papel contendo as amostras da malha foi presa inicialmente por garras de ação mecânica e ajustadas manualmente mediante aperto dos parafusos serrilhados adjacentes. As faces laterais da referida moldura de papel foram cortados e o ensaio de tração foi iniciado.
• Todos os testes foram realizados sob condições ambientais controladas, nomeadamente a uma temperatura de 25 °C. O ensaio foi definido para terminar quando fosse alcançada a fratura da amostra. Os dados dos ensaios foram coletados pelo software Bluehill 2, sendo este previamente informado das dimensões de cada amostra, antes da execução dos ensaios. O módulo de elasticidade aparente foi definido como o declive da linha entre os pontos correspondentes a 1 % e 2% de deformação das curvas de tensão-deformação determinadas automaticamente. A resistência à tração aparente foi definida como a tensão de tração máxima desenvolvida no material durante o ensaio de tração. A tensão máxima refere-se ao alongamento máximo observado no ponto de ruptura do material.
Método de cálculo da porosidade - Gravimetria
[0054] A porosidade (ε) foi determinada por gravimetria, para três amostras de cada malha fibrosa, mediante aplicação da fórmula:
Figure imgf000019_0001
[0055] A densidade da PCL (pPcL) tem o valor tabelado de 1 .145 g/mL a 25 °C. A densidade aparente de amostra (PAPP) medida a partir da seguinte proporção de massa por volume:
[0056] As amostras foram preparadas mediante utilização de um punção com um diâmetro interno de 20 mm. Todas as medições foram realizadas em condições ambientais controladas, nomeadamente a uma temperatura de 25qC. A massa das amostras foi determinada por uma balança de precisão [TP-214, Denver Instruments] mediante média aritmética de três pesagens distintas. A espessura de cada amostra foi determinada por um micrometro [IP65, Mitutoyo], com pontas planas (0 6 mm) e uma precisão de ± 1 μηη, mediante média aritmética de seis medições em posições aleatórios da amostra.
Método de cálculo estimado do tamanho dos poros, diâmetro das fibras e porosidade
[0057] O tamanho médio de poro foi calculado mediante estabelecimento da relação entre o tamanho característico de poro (c/3D), o diâmetro da fibra (ω) e a porosidade (ε), conforme equação apresentada abaixo, desenvolvida por Tomadakis MM e Robertson TJ (Chemical Physiscs 2003, volume 1 19):
[0058] Este modelo foi derivado a partir de uma estrutura aleatória fibrosa, gerada por computador, na qual uma esfera com um diâmetro definido foi encaixada num poro 3D. A equação assume uma estrutura aleatória constituída por uma única fibra, cujas secções transversais assumem formas redondas perfeitas. O diâmetro das fibras (ω) foi medido em 5 imagens independentes de microscopia electrónica de varrimento a 10000X, através do software AxioVision LE v4.8.2.0.
Resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, na regeneração de cartilagem
[0059] Descrição dos resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, numa perspetiva de aplicação na regeneração de cartilagem.
[0060] A malha testada compreende:
• uma malha polimérica porosa de policaprolactona, com um peso molecular entre 70000-90000 Da,
• foi obtida por electrospinning, com diâmetro médio de fibras 0.35-2.0 μηη,
• espessura 40-70 μηη;
• tamanho médio dos poros - 1 .2 - 13.37 μηη
• porosidade - 83-91 % .
• resistência à tração aparente: 2.15-4.38 MPa • módulo de elasticidade aparente - 8.58-27.87 MPa
[0061 ] Considerando a cultura celular em sistema dinâmico, a capacidade das malhas fibrosas de PCL conseguirem suportar a força exercida pela perfusão de líquidos (entre 0.10 - 100 μΙ/min) confere-lhes uma característica única. Esta característica mecânica será importante aquando do seu implante na cavidade sinovial de joelho, pois irá permitir que o implante celularizado suporte as forças exercidas pelo líquido sinovial. Além disso, a cultura em sistema dinâmico permite evidenciar a permeabilidade destas malhas fibrosas a líquidos/fluidos mas não a células, o que lhe confere vantagens seletivas quanto a trocas de fatores solúveis libertados pelas células em cultura. Ao ser permeável a estes fatores, a malha vai permitir a comunicação entre células, sem deixar que estas "escapem" da malha. Esta característica será relevante para a sua aplicação clínica na regeneração de cartilagem articular, uma vez que pretendemos que a malha funcione como uma divisória entre dois compartimentos no joelho. Ela irá separar as células provenientes da medula óssea do líquido presente na cavidade sinovial, o que permitirá a indução da diferenciação condrogénica das células estaminais mesenquimais da medula óssea.
[0062] Para simularmos a divisão que a malha irá fazer quando implantada na cavidade sinovial de joelho, semeamos condrócitos articulares humanos e células estaminais humanas em lados distintos da malha fibrosa biodegradável. Resultados preliminares mostraram que os condrócitos, cultivados de um lado da malha, conseguem induzir a diferenciação condrogénica das células estaminais cultivadas do outro lado da malha fibrosa biodegradável, sem necessidade de adição de agentes bioactivos indutores de diferenciação condrogénica. Foi também possível observar a não existência de passagem efectiva de células condrocíticas ou estaminais através da malha fibrosa biodegradável, especificamente de um lado para o outro da malha.
[0063] A superfície destas malhas pode ser sujeita a modificação química, de forma a melhorar as suas características de biocompatibilidade e bioactividade. Num trabalho recentemente realizado, imobilizou-se sulfato de condroitina (i.e. um polímero de origem natural) à superfície das fibras da malha produzida em PCL, as quais foram previamente funcionalizadas por exposição a UV/03 e aminólise. A medição do ângulo de contacto, a observação por microscopia electrónica de varrimento, a perfilometria óptica e as análises por técnicas de FTIR, raio X e espectrometria de fotoelectrões confirmaram o sucesso da imobilização de sulfato de condroitina nas fibras da malha de PCL. Adicionalmente, as malhas com a imobilização de sulfato de condroitina mostraram uma rugosidade mais baixa e uma maior hidrofilicidade por comparação com as malhas fibrosas produzidas em PCL e não modificadas. Condrócitos articulares humanos foram depois cultivados nas malhas fibrosas produzidas em PCL com e sem imobilização de sulfato de condroitina. Resultados biológicos demonstraram que os condrócitos proliferaram ao longo da experiência, em ambos os tipos de malhas testados. Observou-se também a deposição de matriz extracelular cartilagínea nos dois tipos de malhas fibrosas biodegradáveis. A quantificação da expressão génica por PCR quantitativo demonstrou a sobre-expressão de genes relacionados com a cartilagem, nomeadamente de Agrecano, Colagénio tipo II, COMP e SOX9, nos dois tipos de malhas fibrosas biodegradáveis. As observações morfológicas realizadas através de microscopia confocal e microscopia electrónica de varrimento revelaram que os condrócitos mantiveram a sua forma redonda típica, bem como formaram agregados celulares exclusivamente nas malhas fibrosas produzidas em PCL com imobilização de sulfato de condroitina. Em conclusão, a imobilização de sulfato de condroitina à superfície das malhas fibrosas produzidas em PCL foi efectuada com sucesso, representando uma plataforma válida de funcionalização de superfície com vista a engenharia de cartilagem.
[0064] Outra característica vantajosa destas malhas fibrosas de policaprolactona está relacionada com a sua biodegradação. A policaprolactona tem uma velocidade de degradação mais lenta (de 8-15 semanas) quando comparada com as malhas comercialmente disponíveis. Este maior tempo de biodegradação permite suportar as células durante mais tempo, para que estas formem uma matriz extracelular mais densa, dando maior oportunidade à formação de neo-cartilagem e, consequentemente, à reparação do defeito cartilagíneo. Resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, na regeneração de esófago
[0065] Descrição dos resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, na regeneração de tecidos do esófago.
[0066] A malha testada compreende:
• uma malha polimérica porosa de policaprolactona (peso molecular 70000-9000 Da,
• foi obtida por electrospinning, com diâmetro médio de fibras 0.35-2.0 μηη,
• espessura 40-70 μηη;
• tamanho médio dos poros - 1 .2-13.37 μηη
• porosidade - 83-91 % .
• módulo de elasticidade aparente - 8.58-27.87 MPa
• resistência à tração aparente: 2.15-4.38 MPa
[0067] Uma malha fibrosa biodegradável foi implantada, no modelo animal porco doméstico, num defeito esofágico de 4 cm de diâmetro circunferencial, induzido por dissecção endoscópica da submucosa do esófago, como modelo de lesões esofágicas pré-malignas e malignas de baixo grau. Este estudo in vivo de implantação demonstrou a capacidade da malha fibrosa biodegradável prevenir a ocorrência de estenose após dissecção endoscópica da submucosa (ESD) do esófago. Decorridos 14 dias após a implantação da malha fibrosa biodegradável no defeito esofágico, uma avaliação endoscópica revelou sinais macroscópicos evidentes de re-epitelização da submucosa esofágica. A malha fibrosa biodegradável implantada, para além de permitir a cultura de células epiteliais, previniu o sangramento e a perfuração do esófago. Adicionalmente, a malha fibrosa biodegradável de policaprolactona apresentou resistência à degradação enzimática, nomeadamente à degradação pelo conteúdo luminal do esófago. Os resultados deste estudo pré-clínico, com sobrevida, indicaram que a malha fibrosa biodegradável implantável permite a remodelação e re-epitelização da mucosa esofágica com menor formação de fibrose, evitando a diminuição do calibre luminal do esófago. [0068] Tecnicamente, a malha fibrosa biodegradável é de fácil manipulação, considerando as limitações do manuseamento de material endoscopico, apresentando a necessária maleabilidade, entre outras propriedades físicas essenciais à sua aplicação endoscópica. Aquando da sua implantação, a malha fibrosa biodegradável apresentou boa adaptabilidade aos tecidos gastrointestinais, com elevada garantia de posicionamento no defeito e manutenção dessa posição ao longo do período regenerativo, não desprezando a presença constante de secreções luminais e contractilidade do esófago. Genericamente, a malha fibrosa biodegradável apresenta sustentabilidade estrutural que, teoricamente, permitirá isolar zonas de fragilidade da parede de órgãos tubulares, como por exemplo o esófago e o recto.
Resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, na regeneração de ligamento periodontal
[0069] Descrição dos resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, na regeneração de tecidos do ligamento periodontal
[0070] A malha testada compreende:
• uma malha polimérica porosa de policaprolactona, com um(peso molecular 70000-90000 Da,
• a malha foi obtida por electrospinning, com diâmetro médio de fibras 0.35-2.0 μηη
• espessura 40-70 μηη;
• tamanho médio dos poros - 1 .2-13.37 μηη -
• porosidade - 83-91% .
• módulo de elasticidade aparente - 8.58-27.87 MPa
• resistência à tração aparente: 2.15-4.38 MPa [0071 ] A funcionalidade biológica da malha fibrosa biodegradável pode ser melhorada mediante cultura de células humanas derivadas do ligamento periodontal (hPDLCs) previamente à implantação. A caracterização fenotípica das hPDLCs, realizada por citometria de fluxo durante 15 passagens de sub-cultura celular, demonstrou a expressão de marcadores específicos das células estaminais mesenquimais (MSCs), nomeadamente os antigénios CD-29, -73, -90 e -105, e ausência de expressão dos marcadores hematopoiéticas, nomeadamente os antigénios CD-34 e -45. Estas células foram cultivadas em malhas fibrosas biodegradáveis produzidas em policaprolactona e em malhas Bio-Gide® (malhas comerciais à base de colagénio porcino; Geistlich Biomaterials) com o objectivo de averiguar o comportamento biológico das hPDLCs nestes substratos.
[0072] Dados experimentais demostraram desempenho biológico semelhante em ambas as malhas estudadas, nomeadamente no que se refere à viabilidade e proliferação celulares, e síntese proteica, sob condições de cultura basal e indução de diferenciação osteogénica. Curiosamente, as hPDLCs cultivadas nas malhas fibrosas biodegradáveis em condições basais tendem a apresentar menor expressão de marcadores osteoblásticas, nomeadamente da enzima fosfatase alcalina. Esta observação é pertinente, considerando o facto desta malha fibrosa biodegradável favorecer a formação de um ligamento periodontal normal e impedir a ocorrência de anquilose com o osso alveolar, prevenindo o desenvolvimento de um tecido periodontal não funcional. Por outro lado, a expressão de proteínas e transcriptos de ARN relacionados com o tecido ósseo, nomeadamente a osteopontina, a osteocalcina e a sialoproteína óssea, corrobora a ocorrência de diferenciação osteogénica das hPDLCs cultivadas em condições induzidas, preferencialmente em malhas fibrosas biodegradáveis.
[0073] Concluindo, a malha fibrosa biodegradável representa uma solução integrada para a regeneração do ligamento periodontal. Esta malha permite, simultaneamente, a libertação local de fármacos e a cultura de células relevantes, maximizando a eficácia do tratamento e o tempo de recuperação do paciente. Tecnicamente, é mais fácil de aplicar e não colapsa durante o tratamento cirúrgico. Resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, como wound dressi ng/cural\vo dérmico
[0074] Descrição dos resultados obtidos in vitro para malhas fibrosas de policaprolactona, na regeneração da pele.
[0075] Caracterização da malha:
• Composição polimérica: quitosano (peso molecular: 270-416 kDa; grau de desacetilação (DD): 87.7-95%);
• Diâmetro médio das fibras: 65 nm - 6 μηη;
• Malha não tecida, composta por fibras distribuídas aleatoriamente ou com orientações preferenciais de alinhamento;
• Degradação: absorção de água: -300% ao final de 7 dias; perda de peso:
-30% ao final de 7 dias.
[0076] Descrição do método de obtenção da malha por electrospinning,:
• Concentração do Polímero: 5-6 % (peso/volume)
• Solventes: ácido trifluoracético:diclorometano (7:3)
• Taxa de Fluxo: 0.4 - 0.8 ml/h
• Tensão aplicada: 12-18 kV
• Distância entre a ponta da fieira e o coletor: 10-12 cm
• Diâmetro interno da fieira: 0.514 mm
• Temperatura ambiente: 19 - 22.5 eC
• Humidade Relativa: 32 - 43 %
[0077] Descrição do processo de neutralização
A neutralização previne a dissolução da malha quando imersa em meio aquoso. A malha é imersa numa solução de amónia 7N em metanol, durante 10 minutos, posteriormente lavada com água destilada ate atingir pH neutro (pH=7) e congelada à temperatura de - 180eC. A remoção da água é feita através do processo de liofilização de forma a preservar a estrutura das nanofibras.
[0078] Descrição Detalhada da Aplicação
Uma malha fibrosa biodegradável produzida em quitosano, para o tratamento de feridas dérmicas e queimaduras e/ou regeneração de pele. Esta malha atua como uma barreira a células indesejáveis (como, por exemplo, bactérias), sendo permeável a nutrientes e gases. Possui uma integridade física adequada e adaptabilidade ao defeito dérmico, exibindo fácil manuseamento tanto seca como molhada. Tem a capacidade de absorver grande quantidade de água e também de libertar a água absorvida depois de aderir à pele. O quitosano possui grupos funcionais (especificamente grupos aminas, -NH2) que permite a imobilização de agentes bioactivos e/ou nanopartículas. Daí as malhas fibrosas poderem incluir um ou vários fármacos e/ou uma ou várias proteínas e/ou células desejáveis, reduzindo os efeitos secundários dos agentes bioativos mencionados e o número de intervenções cirúrgicas secundárias.
[0079] Estudamos in vitro a capacidade dessas malhas fibrosas de quitosano em absorver e libertar antibióticos, nomeadamente a gentamicina. Também, estudamos a libertação da gentamicina a partir de nanopartículas (como, por exemplo, lipossomas) imobilizadas à superfície das fibras da malha. Para tal, as malhas de quitosano foram funcionalizadas com grupos tiól (-SH) e os lipossomas covalentemente imobilizados à superfície das fibras dessas malhas, apresentando-se distribuídos uniformemente. O estudo da cinética de libertação mostrou que a gentamicina é libertada dos lipossomas imobilizados à superfície das fibras da malha de uma forma sustentada, durante um período de tempo de 16 horas. Os testes de susceptibilidade mostraram que a gentamicina libertada das malhas fibrosas de quitosano, assim como dos lipossomas imobilizadas à superfície das fibras da malha, inibe o crescimento das bactérias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Os resultados mostram que estas malhas podem ser utilizadas com sucesso em aplicações dérmicas locais, na erradicação de agentes patogénicos comummente presentes nas infecções da pele e/ou orifícios dérmicos. [0080] A presente invenção não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral da invenção, tal como definido nas reivindicações.
[0081 ] As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1 . Malha polimérica para reparação ou regeneração de tecidos de um organismo que compreende poros em que pelo menos 70% dos poros da referida malha têm tamanho inferior ao requerido para confinar as células dos referidos tecidos, e em que pelo menos 70% dos poros da referida malha tem um tamanho superior ao necessário para a passagem de fluídos intersticiais dos referidos tecidos;
em que o tempo de degradação da referida malha polimérica no organismo é de pelo menos 8 semanas;
e a referida malha polimérica possui uma resistência à tração aparente superior a 1 MPa e um módulo de elasticidade aparente superior a 0.1 MPa.
2. Malha de acordo com a reivindicação anterior em que 80% dos poros da referida malha têm tamanho inferior ao requerido para confinar as células dos referidos tecidos, mais de preferência 90%, 95%, ou 100%.
3. Malha de acordo com as reivindicações anteriores em que o tempo de degradação da referida malha polimérica é de 8-26 semanas, de preferência 8-15 semanas.
4. Malha de acordo com as reivindicações anteriores em que a resistência à tração aparente varia entre 2-30 MPa; de preferência entre 3-20 MPa.
5. Malha de acordo com as reivindicações anteriores em que o módulo de elasticidade aparente varia entre 0.1 -100 MPa; de preferência entre 5-30 MPa.
6. Malha de acordo com as reivindicações anteriores que compreende:
• uma porosidade interconectada que varia entre 83 - 91%;
• em que 80-90% dos poros tem um tamanho que varia entre 1 ,2 - 13,37 μηη;
• um módulo de elasticidade aparente que varia entre 8.58 - 27.87 MPa;
• uma resistência à tração aparente varia entre 2.15 - 4.38 MPa
7. Malha de acordo com as reivindicações anteriores que compreende pelo menos um polímero selecionado entre policaprolactona, ácido poliglicólico, ácido polilático, quitosano, alginato, ou dextrano, ou suas combinações.
8. Malha de acordo com a reivindicação anterior que compreende ainda um polímero selecionado entre amido, ácido hialurónico, ou sulfato de condroitina, ou suas combinações.
9. Malha de acordo com as reivindicações 6-7 em que a malha polimérica é constituída pelos seguintes polímeros:
• policaprolactona, ou
• policaprolactona e amido, ou
• policaprolactona e ácido hialurónico, ou
• policaprolactona e sulfato de condroitina, ou
• ácido poliglicólico e ácido polilático, ou suas combinações.
10. Malha de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-8 em que a malha tem 80-60% (p/v) policaprolactona e 20-40% (p/v) de um polímero natural ou qualquer outra proporção.
1 1 . Malha de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-9 em que o peso da policaprolactona varia entre 70000 - 90000 Da.
12. Malha de acordo com a reivindicação 6 -7 em que o peso do quitosano varia entre 270-416 kDa.
13. Malha de acordo com a reivindicação 6 -7 em que o grau de desacetilação de quitosano varia entre 50-100%, de preferência 87.7-95%.
14. Malha de acordo com as reivindicações anteriores que compreende adicionalmente substâncias activas seleccionadas da seguinte lista: anti-inflamatórios, antibióticos, agentes biológicos modificadores da doença reumática, inibidores, factores de crescimento.
15. Malha de acordo com as reivindicações anteriores que compreende substâncias ativas selecionadas da seguinte lista ácido acetilsalicílico, paracetamol, trissalicilato de colina magnésica, diclofenaco, diflunisal, fenoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, quetoprofeno, meclofenamato, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, salsalato, sulindaco, tolmetina, corticosteróides glicocorticóides, metotrexato, a sulfasalazina, a leflunomida, a ciclosporina, a minociclina, a hidroxicloroquina, a azatioprina, a D-penicilamina etanercept, o infliximab, o adalimumab, o certolizumab, o golimumab, o anakinra, o tocilizumab, o abatacept, ou o rituximab.
16. Malha de acordo com as reivindicações anteriores, que incorpora ainda substâncias ativas envolvidas na homeostasia e no processo regenerativo de tecidos, em particular TGF-a, TGF-βΙ , TGF-32 ,TGF-33, EGF, HIF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D, IGF-1 , FGF-2, FGF-18, BMP-2, BMP-4, BMP-6,BMP-7/OP-1 , CDMP-1/GDF-5 ou CDMP-2.
17. Malha de acordo com as reivindicações anteriores caracterizada por o tecido a reparar/regenerar ser cartilagem, tecido do ligamento periodontal ou submucosas do esófago. Malha de acordo com as reivindicações anteriores em que a espessura da malha varia entre 20-200 μηη, de preferência 40-80 μηη.
18. Malha de acordo com as reivindicações anteriores para o uso em medicina veterinária e humana.
19. Malha de acordo com a reivindicação anterior para uso no tratamento de doenças que envolvem a reparação ou regeneração de tecidos.
20. Malha de acordo com a reivindicação anterior em que o tecido a tratar é pele, cartilagem, ligamento periodontal ou submocosas do esófago.
21 . Malha de acordo com a reivindicação anterior em que a referida malha é ser tecida ou não tecida.
22. Tira, rede, feixe de fibras, malha ou membrana obtenível por electrospinning compreendida por um conjunto de fibras cuja composição polímericas pode ser seleccionada da seguinte lista policaprolactona, ácido poliglicólico, ácido polilático, quitosano, alginato, ou dextrano, ou suas combinações, com um diâmetro inferior a 2 μηι.
23. Tira, rede, feixe de fibras, malha ou membrana de acordo com a reivindicação anterior o diâmetro da fibra polimérica obtenível por electrospinning varia entre 0,35 - 2 μηη.
24. Tira, rede, feixe de fibras, malha ou membrana de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-20 em que o peso da policaprolactona varia entre 70000 - 90000 Da.
25. Tira, rede, feixe de fibras, malha ou membrana de acordo com a qualquer uma das reivindicações 9-20 em que o peso do quitosano varia entre 270-416 kDa.
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