WO2014007585A1 - 세포 이미징 방법 및 장치 - Google Patents

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WO2014007585A1
WO2014007585A1 PCT/KR2013/006011 KR2013006011W WO2014007585A1 WO 2014007585 A1 WO2014007585 A1 WO 2014007585A1 KR 2013006011 W KR2013006011 W KR 2013006011W WO 2014007585 A1 WO2014007585 A1 WO 2014007585A1
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신상모
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광주과학기술원
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Definitions

  • the present invention is made by the task number NN05790 under the support of the Ministry of Education, Science and Technology, the research management specialized organization of the task is the Korea Research Foundation, the research project name is “future-based technology development project”, the research title is "labeled bio-marker bio Framework R & D ”, the lead institution is Gwangju Institute of Science and Technology, and the research period is 2010.04.01 ⁇ 2011.03.31.
  • the present invention relates to a cell imaging method and apparatus. More specifically, the present invention relates to a method and apparatus for obtaining a realistic three-dimensional image of a cell.
  • a representative method for identifying the three-dimensional distribution of the molecules or elements constituting the cell is the fluorescence imaging technique.
  • Fluorescence imaging techniques attach fluorescent markers to specific molecules in cells or manipulate them to express fluorescence by genetic manipulation and then fluorescence Images allow us to identify the three-dimensional distribution of the target molecule.
  • a device to which the fluorescence imaging technique is applied there is a confocal laser microscope.
  • the fluorescence imaging technique has a drawback in that foreign substances such as fluorescent genes or fluorescent markers are introduced into the cells, thereby imaging in an artificial state rather than the natural state of the cells themselves.
  • a certain concentration or more must be present in the cell. Therefore, low-molecular weight molecules cannot be identified even by attaching markers or genetic manipulation.
  • the fluorescence image since the fluorescence image is viewed, whether the target molecule is attached to the marker cannot be confirmed.
  • One method that can be used when the concentration of a particular molecule is low is to overexpress it by giving a cell to the cell, or in the case of DNA or RNA, after increasing the concentration of the molecule through replication amplification, it is measured.
  • a cell is treated with a specific confectionery and then cultured simultaneously with an untreated control to increase the number of cells, separate them, and then cell lysis, followed by centrifugation and electrophoresis (using gel electrophoresis) or mass spec (mass spectroscope) 'by a method of comparison that any increase molecules decreases.
  • this method is time consuming and expensive reagents are used.
  • continuous observation is difficult because cells are observed by killing.
  • SEM Scanning Electron Microscope
  • TEM Transmission Electron Microscope
  • AFM Atomic Force Microscope
  • STM Scanning Tunneling Microscope
  • An electron scanning microscope detects secondary electrons or back scattered electrons with the highest probability of occurrence of various signals generated from a sample when an electron beam is scanned on a sample surface. Observe. However, in electron scanning microscopes, it is difficult to image molecules, and after freezing the specimen, There is a drawback to coating.
  • An electron transmission microscope observes the electron beam which permeate
  • electron transmission microscopes can image molecules, but require long imaging and analysis time, and have the disadvantage of thinning after freezing the specimen.
  • the atomic force microscope is a pyramid-shaped probe that scans in two dimensions while contacting the sample surface.
  • inorganic or metal specimens allow atomic imaging.
  • the resolution deteriorates rapidly.
  • the interatomic microscope may have a low resolution because the resolution is very small and the imaging area is very small, and the living cells change shape spontaneously or under the influence of a microscope probe.
  • Scanning tunnel microscope is a type of scanning probe microscope that analyzes the shape of the sample surface using tunnel current. Scanning tunnel microscopy allows atomic imaging, but there is a problem that imaging is not possible for cells containing large amounts of water because they operate in a vacuum.
  • many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
  • the present inventors made diligent research efforts to solve the above-described problems of the prior art, and as a result, have developed a three-dimensional cell imaging method and apparatus which enables the practical imaging of molecules and various organelles in cells.
  • the inventors of the present invention provides a cell imaging method capable of imaging the shape of a living cell and preventing distortion caused by chemical or physical stimulation to the cell in imaging the cell. The device was developed.
  • Another object of the present invention is to provide a cell imaging method. Another object of the present invention is to provide a cell imaging device. Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
  • the invention provides a cell imaging method comprising the following steps:
  • a solid specimen of (i) cells, (ii) virus, liquid containing (iii) cells or liquid containing (i v ) virus is prepared.
  • the present invention can be applied to a variety of cells and viruses, and solid specimens are prepared using these various cells, viruses, and liquids containing the same.
  • Cells that can be imaged by the present invention include prokaryotic or eukaryotic cells.
  • Prokaryotic cells that can be imaged by the present invention include bacteria (or eubacteria) and achibacteria.
  • bacteria that can be imaged by the present invention include Escherichia col i, Thermus thermophilics, Bacillus subtil is, Baci 1 his st earo thermoph / Jus, Salmonella typhi murium, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, Lactobaci 1 lus, Lactococcus and Streptococcus
  • bacteria or eubacteria
  • achibacteria examples include Escherichia col i, Thermus thermophilics, Bacillus subtil is, Baci 1 his st earo thermoph / Jus, Salmonella typhi murium, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, Lactobaci 1 lus, Lactococcus and Streptococcus
  • One is not limited
  • Examples of achibacteria that can be imaged by the present invention are Methanococcus jannaschii (Mj), Methanosarcina mazei (Mm), Me thanobac teriutn thermoautotrophicum (Mt), Methanococcus mar ipaludis, Methanopyrus kandleri, Halobacterium, Archaeoglobus ful hodurik irococ (Ph), Pyrobaculum aerophi lum, Pyrococcus abyss i, Sulfolobus solfataricus (Ss), Sulfolobus tokodaii, Aeuropynim per nix (Ap), Thermoplaswa acidophi lum and Therwoplasma volcanh.
  • Mj Methanococcus jannaschii
  • Mm Methanosarcina mazei
  • Eukaryotic cells that can be imaged by the present invention include, but are not limited to, fungal cells, yeast, plant cells (eg monocotyledonous plants, dicotyledonous plants and algae) and animal cells (eg, mammals, insect reptiles, birds). no.
  • the imaged copper cells can be human, mouse, rat, cow, pig, horse, sheep, rabbit, goat, algae, fish and stratum corneum.
  • the animal cells which can be imaged by the present invention include blood cells, immune cells, stem cells, somatic cells, sex cells, tumor cells, cancer cells and normal cells.
  • Viruses that can be imaged by the present invention include animal viruses, plant viruses, and bacteriophages, for example, HBV hepatitis B vir is (HCV), hepat it is C vir is (HCV), and hepat it is A vir is ), Human immunodeficiency virus (HIV), reovirus, Sendai virus, myxovirus, coronavirus, encephalomyelitis virus, rotavirus, cytomegalovirus, measles virus, vaccinia virus, rabies virus, Epstein ⁇ Barr virus, rhinovirus, polio virus and herpes virus, Limited to this no ⁇
  • HBV hepatitis B vir is (HCV)
  • C vir HCV
  • a vir vir is
  • C vir hepat it is C vir
  • a vir vir is
  • the preparation of the solid specimen is carried out by (i) cell, (ii) virus, (iii) a liquid comprising a cell or (iv) a liquid comprising a virus.
  • frozen samples can be obtained by freezing cells or viruses themselves.
  • a frozen specimen may be obtained by driving a liquid containing a virus or a liquid containing a virus.
  • Liquids containing cells or viruses include, but are not limited to, media or biological fluids used for culturing cells or viruses.
  • Freezing to obtain a frozen specimen can be carried out according to various refrigeration methods known in the art.
  • the refrigeration is a temperature range of -200 ° C to -15 ° C, a temperature range of -180 ° C to -20 ° C, a temperature range of -150 ° C to -35 ° C, -200 ° C It can be carried out in the temperature range of to -55 ° C.
  • the freezing may be performed by impregnating cells in a mixture of solid carbon dioxide and alcohol or liquid nitrogen.
  • the mixture of the solid carbon dioxide and alcohol or liquid nitrogen may be contained in a container.
  • the container may be located directly in a freezer, and the freezer may be set at a desired temperature (eg, _35 ° C or less).
  • the freezer may be a programmed freezer or a speed control freezer.
  • the copper specimen may be stored at a temperature below the temperature at which recrystallization occurs, such as at a temperature below the glass transition temperature of pure water (eg, 135 ° C.).
  • the driving is carried out at rapid driving.
  • the term “quick freezing” generally refers to the formation of ice crystals by passing a maximum ice crystal formation zone (eg, 5 ° C. to ⁇ 1 ° C., freezing rate of 80% or more) in a short time (eg, within 30 to 35 minutes). It is meant to reduce the size or to produce amorphous ice (or glass ice).
  • the freezing to obtain a frozen specimen is a rapid freezing to produce amorphous ice, a vitrification freezing method.
  • cryoprotectants such as dimethyl sulfoxide (DMS0) can be used for deep freezing.
  • solid specimens eg copper specimens
  • suitable imaging instruments Cell imaging at the atom / molecular level is possible, for example using AFM or STM.
  • AFM AFM
  • STM STM
  • room temperature it is preferable to image at a low temperature below the freezing point because amorphous ice melts.
  • imaging at atmospheric pressure and low temperature since the moisture in the air may be frozen in the cold portion of the imaging device, it is preferable to perform imaging in an environment where moisture is removed (for example, nitrogen atmosphere).
  • the surface of the solid specimens is removed and new surfaces removed to obtain a three-dimensional image of the solid specimen (eg, frozen specimens).
  • surface removal of the solid specimen is carried out by sublimation of ice on the surface of the solid specimen (eg, copper specimen).
  • Water accounts for more than 80% of the biological environment (e.g., cells, tissues, body fluids and blood), ice formed during the preparation of the solid state specimens (e.g., copper specimens), preferably amorphous ice Should be removed with minimal damage.
  • the surface of the specimen is removed by sublimating ice on the surface of the solid specimen (eg, copper specimen).
  • sublimation is carried out by adjusting the pressure at isothermal below the triple point.
  • sublimation for surface removal is carried out by controlling the temperature at isostatic pressure below the triple point.
  • the temperature control for the sublimation can be carried out using a heater or a cooler, for example, the pressure control can be carried out using a vacuum pump or a cold tram.
  • the pressure control can be carried out using a vacuum pump or a cold tram.
  • the sublimation occurs without passing the liquid from the solid state to the gas state.
  • the surface of the solid specimen eg, frozen specimen
  • a new surface to be collected for surface information is formed.
  • the surface removal of the solid specimen is carried out using a physical force or a pan.
  • physical forces or beams are used in surface removal to remove macromolecules or organelles within the cell membrane or cells.
  • a physical force is used to remove the surface, it is preferably pushed (pushed) or pulled (pulled) using a probe of an SPKScanning probe microscope.
  • SPM equipped with a suitable probe in the present invention is AFM (atomic force microscope), STM (scanning tunneling microscope), BEEMCbal 1 istic electron emission microscope (CFMC), C-AFM, (conductive atomic force microscope), electrostat ic force microscopy (EMF), electrochemical scanning tunneling microscope (ESTM), force modulation microscope (FMM), kelvin probe force microscope (KPFM), magnet ic force microscope (MFM), MRFKmagnet ic resonance force microscope, near-ield scanning optical microscope (NS0M), scanning near-field optical microscope (SN0M), Pizoresponse Force Microscope (PFM), PSTMC hoton scanning tunneling microscope, photot hernial microscope (PTMS), scanning electrochemical microscope (SECM), scanning capacitance microscope (SCM), scanning gate microscope (SGM), SICK scanning ion-conductance microscope (SSM), s in polarized scanning tunneling microscope (SSM), SSRM (scanning spreading resistance microscope), scanning thermal microscope (SThM),
  • AFM atomic force microscope
  • the surface removal of the solid specimen is preferably performed using an ion beam, more preferably an atomic ion beam.
  • an ion beam more preferably an atomic ion beam.
  • surface removal of the solid specimen using physical force or beam is performed to remove macromolecules, chromosomes, ribosomes or organelles remaining in the cells after surface removal by sublimation.
  • the atomic composition ratio of the target to be removed is measured by measuring at least one component selected from the group consisting of electrons, ions, light, and X-rays generated during the surface removal process after surface removal by the ion beam.
  • the method further includes the step of analyzing.
  • the atomic composition ratio analysis is performed using AES (Auger electron spectroscopy) XPS (x- ray photoelectron spectroscopy) or EDX (energy dispersive x-ray spectroscopy).
  • AES Alger electron spectroscopy
  • XPS x- ray photoelectron spectroscopy
  • EDX energy dispersive x-ray spectroscopy
  • SPM scanning probe microscope
  • the collection of information on the surface of the solid specimen is preferably performed using a scanning probe microscope (SPM).
  • SPM is a tool for measuring the physical properties of analytes on micrometer and / or nanometer scales.
  • the SPM uses a probe (probe), which is located very close to the surface of the analyte.
  • the probe can be mounted on a cantilever with a few hundred micrometers in length and a thickness of 0.5-5 micrometers.
  • SPM methods are described in Wang et al. , Amer. Chem. Soc. Lett. 12: 1697-98. 1996; Kim et al. , Appl. Surface Sci. 130, 230, 34 132: 602-609, 1998; Kobayashi et al. , Appl.
  • the SPM used for collecting surface information in the present invention is
  • Atomic force microscope AFM
  • scanning tunneling microscope STM
  • bal 1 ist ic electron emission microscope BEEM
  • chemical force microscope CFM
  • conductive atomic force microscope C-AFM
  • electrostatic force microscopy EMF
  • EMF electrostatic force microscopy
  • EMF Electrochemical scanning tunneling microscope
  • FMM force modulat ion microscope
  • MRFM magnet ic resonance force microscope
  • N0M near-ield scanning optical microscope
  • N0M Scanning near-field optical microscope
  • PFM Piezoresponse Force Microscope
  • PTM photon scanning tunneling microscope
  • PTMS photothermal microscope
  • SECM scanning electrochemical microscope
  • SECM scanning capacitance microscope
  • SCM scanning gate microscope
  • SPSM spin polarized scanning tunneling microscope
  • SPSM scanning spreading resistance microscope
  • SThM scanning thermal microscope
  • STM SVMC scanning voltage microscope
  • P scanning Hal 1 probe
  • AFM is U.S. Pat. No. 5,497,656; Moller et al. , Biophys. J., 77: 115 8, 1999; Thundat et al., Scanning Microsc. 6: 911-8, 1992; Hansma et al. , Nucleic Acids Res. , 21: 505 '12, 1993; Murray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3811-4, 1993, which is incorporated herein by reference.
  • the collection of surface information is carried out by measuring the force (preferably van der Waals force) acting between the surface of the solid specimen and the probe.
  • the force preferably van der Waals force
  • the collection of surface information is carried out by measuring the force (preferably van der Waals force) acting between the surface of the solid specimen and the probe.
  • the method of the present invention further comprises repeating steps (c) and (d), by which the three-dimensional image of the cell or virus to be analyzed can be obtained.
  • the method of the present invention can provide an image (preferably three-dimensional image) of the interior of the cell and the cell membrane surface. More specifically, the method of the present invention includes receptors, channels, cell membrane proteins, cell surface carbohydrates, cell surface markers, intracellular organelles, chromosomes, proteins (eg, enzymes, antibodies, antigens, structural proteins, hormones). , Growth factors, serum proteins), nucleic acid molecules (eg, DNA, RNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA), carbohydrates and lipids can be provided.
  • the present invention can grasp the three-dimensional structure of the above-described biomolecules, particularly proteins.
  • the methods of the present invention can provide images (preferably three-dimensional images) of the interior and surface of the virus.
  • the present invention provides a cell imaging device comprising:
  • a liquid comprising (i) a cell, (ii) a virus, (iii) a cell, or
  • a temperature regulating means for regulating temperature (ii) a pressure regulating means for regulating pressure, or (iii) a temperature for regulating temperature Regulating means and pressure regulating means for regulating pressure;
  • image processing means for generating an image for the specimen by processing the surface information acquired by the surface measuring means.
  • the cell imaging device of the present invention is described in detail below.
  • the surface of the cell In addition to images, it is possible to obtain information about molecules, and even atoms, which make up various biomolecules and organelles present in cells. In addition, it is possible to grasp information about interactions between biomolecules and organic relationships between organelles.
  • frozen specimens will contain at least thousands or tens of thousands of cells, so the information obtained from each can be combined to obtain three-dimensional images of cell structures other than the water contained in the cells and to verify the relationship between each cell structure.
  • the cultured cells are treated with an anticancer agent.
  • Cultures containing anticancer drug treated cells are rapidly frozen to produce specimens of amorphous or glassy ice.
  • the pressure and temperature in the observation chamber are adjusted to sublimate the ice to remove the surface of the test specimen. After sublimation, remove the surface of the specimen to the desired level and stop the sublimation again by raising the pressure or raising the temperature.
  • intracellular mitochondria are of interest, the location of the intracellular mitochondria is confirmed using an optical microscope and the surface such as cell membranes are removed to expose the mitochondria to the surface of the specimen using surface removal means.
  • the surface measuring means then observes the surface irregularities to obtain information about the atoms and morphology of the specimen surface.
  • optical imaging may be added by attaching a fluorescent marker, which is a conventional technique, to the mitochondria to be observed, or by causing the mitochondria to fluoresce by genetic manipulation.
  • the effects of anticancer agents on mitochondria can be identified by repeatedly removing the surface layers of frozen specimens and obtaining surface images and atomic information.
  • the present invention can be widely used for basic research on cells, interaction between germs and cells, changes in cells, effects of chemicals and chemicals on cells, research on cell differentiation and replication, and the like.
  • the present invention provides a method for analyzing an analyte in a sample comprising the following steps: (a) solidifying a liquid containing a sample to prepare a solid specimen;
  • the inventors have developed an analytical technique and apparatus capable of performing qualitative and quantitative analysis of analytes in samples with improved sensitivity and accuracy.
  • analysis refers to determining whether an analyte is present in a sample (quantitative analysis), the amount of analyte (quantitative analysis), and the structure of an analyte in a sample (structural analysis). It has a comprehensive meaning.
  • a solid specimen of a liquid containing a sample is prepared.
  • liquid samples to which the present invention is applied include biological samples, chemical samples, and environmental samples.
  • the preparation of the solid specimen is carried out by freezing the liquid containing the sample.
  • the analyte in the sample By collecting surface information, it is possible to obtain information (eg, three-dimensional images) about the analyte in the sample, from which the presence or absence (quantitative analysis) and content (quantitative analysis) of the analyte in the sample can be determined. In addition, it is possible to determine the structure of the sample to be analyzed in the sample, such as the tertiary structure of the protein. In addition, the information may determine whether the analyte in the sample is combined with other substances.
  • information eg, three-dimensional images
  • the structure of the sample to be analyzed in the sample, such as the tertiary structure of the protein.
  • the information may determine whether the analyte in the sample is combined with other substances.
  • the method of the present invention comprises the steps (c)
  • the method may further include repeating (d), and may analyze the concentration or amount of the detection target by the repetition.
  • the method of the present invention comprises the step of (d) after the surface information collected in step (d) for known materials And comparing with reference surface information.
  • the sample used in the present invention is a biological sample.
  • Biological samples that can be used in the present invention include a variety of biological samples, preferably blood, plasma, serum, lymph, bone marrow fluid, saliva, milk, urine, feces, eye fluid, semen, brain extract, spinal fluid, joint fluid Thymic fluid, ascites fluid, amniotic fluid or cellular tissue fluid.
  • the analyte in the biological sample is a protein (eg, enzyme, receptor, cell membrane protein, antibody, antigen, structural protein, growth factor, hormone, serum protein, cancer marker), nucleic acid molecule (eg, DNA, RNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA), lipids, carbohydrates or small molecular weight compounds.
  • a protein eg, enzyme, receptor, cell membrane protein, antibody, antigen, structural protein, growth factor, hormone, serum protein, cancer marker
  • nucleic acid molecule eg, DNA, RNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA
  • lipids eg, carbohydrates or small molecular weight compounds.
  • the analyte is a protein-protein complex that interacts with each other in a biological sample. According to the present invention it is possible to accurately determine whether the binding between the proteins.
  • the analyte is a complex between the drug candidate and its target molecule. According to the present invention, it is possible to accurately determine whether a drug candidate is bound to its biological target (eg, a receptor).
  • the analyte is a disease marker substance in a biological sample, more preferably a cancer marker substance.
  • cancer markers are detected through EL ISA (Enzyme ⁇ 1 inked immunosorbent assay) and PCR (Polymerase chain reaction) using antigen-antibody reaction.
  • EL ISA Enzyme ⁇ 1 inked immunosorbent assay
  • PCR Polymerase chain reaction
  • these detection methods have a problem in accuracy, but also have a big problem in sensitivity.
  • cancer markers can hardly be detected in biological samples (for example, blood).
  • biological samples for example, blood.
  • cancer markers not detected by the conventional method can be detected, which can lead to a breakthrough in cancer diagnosis.
  • the invention provides an analytical device for analysis in a sample comprising: (a) a temperature control means for controlling temperature dispersion, ( ⁇ ) a pressure control means for adjusting pressure, or (iii) a temperature for controlling temperature Regulating means and pressure regulating means for regulating pressure;
  • the present invention provides a method for analyzing an analyte in a gas sample, comprising the following steps:
  • the structure of the analysis target in the sample can be determined from the information.
  • the method further comprises repeating steps (c) and (d) and analyzing the concentration or amount of the detection target by the repetition.
  • the method further comprises the step of comparing the surface information collected in step (d) with reference surface information for a known material.
  • the analyte is a gas in the atmosphere, Viruses, fungi, bacteria, volatile compounds, or radioactive materials.
  • the atmosphere is the atmosphere of the street or hospital, factory, school, park, home, company or laboratory, or the atmosphere of the discharge of the vehicle.
  • the atmosphere is the exhalation of an animal.
  • the present invention provides an analytical device for analyte in a gas sample comprising:
  • image processing means for generating an image for the specimen by processing the surface information acquired by the surface measuring means.
  • the present invention is a cell imaging method that provides information to grasp the actual state of the cell.
  • the present invention can obtain information about molecules and atoms that make up various biomolecules and organelles present in cells as well as surface images of cells.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a cell imaging apparatus and cell imaging method of the present invention according to a specific embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a cell imaging device of the present invention according to a specific embodiment of the present invention. [Specific contents to carry out invention]
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a cell imaging method according to a preferred embodiment of the present invention.
  • the device of the present invention comprises (i) a cell
  • the solidification means is a freezing means.
  • the cells 12 to be analyzed are frozen, preferably flash frozen, for cell imaging according to the present invention.
  • the freezing means is a rapid pulsing means and the quick freezing means produces water on the inside, outside or surface of the cell or virus as amorphous ice.
  • the biological fluid or culture solution containing the cell 12 will be rapidly driven.
  • the biological fluid or culture solution containing the cell 12 will be rapidly driven.
  • the culture solution containing the cells 12 may be rapidly driven.
  • Obtain the passive specimen (10) by quick freezing. The rapid pulsation of liquid water does not result in damage to the cells 12 because it does not become crystalline ice but becomes vitrified ice or amorphous ice. As a result, observations of real cells 12 in the intact state It becomes possible.
  • rapidly pulsing a biological liquid or a culture medium containing the cells 12 it may be considered to rapidly freeze the biological liquid or the culture medium in a tray shaped like a petri dish.
  • the rapidly frozen specimen 10 obtained in FIG. 1A is moved to the observation chamber 20 as shown in FIG.
  • the inside of the observation chamber 20 is preferably kept below the freezing point to prevent thawing of the specimen 10.
  • the water vapor may be freeze-attached to the inside of the observation chamber 20 or to an apparatus for imaging, and the inside of the observation chamber 20 may be free of water vapor, for example, in a nitrogen atmosphere. It is preferred to remain at.
  • An optical microscope 32 may be provided above the observation chamber 20.
  • the optical microscope 32 performs the function of acquiring an optical image of the specimen 10 including the cells. It is also possible to obtain an upper image of the specimen 10 with an electron microscope instead of an optical microscope. The reason for having an optical microscope or an electron microscope is to check the image of the specimen 10 to determine the position of the cell or cell structure to be observed.
  • amorphous ice is solid, it can be imaged at the molecular or atomic level using atomic force microscopy (AFM) or scanning tunnel microscope (STM). Accordingly, surface measuring means 34 are preferably provided in the observation chamber 20 for measuring the upper surface of the specimen and thus producing an image.
  • a scanning probe microscope SPM: Scanning Probe Microscope
  • AFM atomic force microscopy
  • the atomic force microscope is divided into a contact mode and a non-contact mode, depending on whether the specimen 10 and the probe 36 are in contact.
  • Information about the surface of the specimen 10 is obtained by measuring the attractive force (van der Waals force) between the surface of the specimen 10 and the probe 36 for measuring the curvature in the contact mode and the repulsive force in the non-contact mode.
  • the contact mode may damage the specimen 10 due to the nature of the detection method.
  • a tapping mode AFM may be used in a manner that overcomes this disadvantage.
  • the surface measuring means 34 may also be a scanning tunnel microscope (STM).
  • the surface measuring means 34 such as an atomic force microscope or a scanning tunnel microscope
  • imaging microcellular components or molecules such as membrane proteins or receptors present in the cell membrane can be imaged. It is also possible to image cancer markers, etc., which are present in very small amounts in the blood and could not be detected by conventional techniques.
  • an atomic force microscope, a scanning tunnel microscope, or the like it is also possible to image a minute three-dimensional shape.
  • the image obtained in the above process can be said to be substantially a two-dimensional image, not a three-dimensional image of the cell.
  • the pulverized specimen 10 As a method of removing the surface of the pulverized specimen 10, it may be considered to sublimate and remove amorphous ice on the surface of the specimen 10 by adjusting the temperature and pressure in the observation chamber 20. Only solid ice and gas water vapor are present at temperatures or pressures below the triple point in the phase equilibrium of water. Therefore, when the temperature is raised while maintaining a constant pressure below the triple point, the solid state ice sublimes into gaseous water vapor. Alternatively, when the pressure is lowered at a temperature below the triple point, the solid state ice sublimes into gaseous water vapor. Of course, it is also possible to sublimate the solid ice into water vapor by controlling the temperature and pressure together below the triple point.
  • the temperature and pressure can be adjusted to remove the surface of the frozen specimen 10.
  • the heater 22 and the recess 24 are attached to the observation chamber 20.
  • a vacuum pump 30 connected to the inside of the observation chamber 20 for pressure control is provided.
  • the observation chamber is provided with a gas outlet 28 and a gas supply port for supplying a gas such as nitrogen 26 is provided.
  • the gas outlet 28 may be connected with the vacuum pump 30.
  • Figure 1 (c) shows a state in which the surface layer of the specimen 10 is removed to a small thickness in the same manner as above.
  • an optical microscope 32 and / or surface measuring means 34 are used to acquire an image of a cell or elements constituting the cells.
  • the probe 36 of an interatomic microscope (AFM) or a follow-up tunnel microscope (STM) can be directly removed by pushing or pulling the cell walls, cell membranes, macromolecules or organelles that have already been imaged. have.
  • AFM interatomic microscope
  • STM follow-up tunnel microscope
  • a separate removal probe may be provided in the chamber and the removal probe may be used to remove a structure protruding to the upper portion of the specimen.
  • the SPM equipped with the probe as the surface measuring means is used as the surface removing means for removing the surface of the solid specimen with a physical force.
  • the atomic analyzer is provided in the observation chamber 20.
  • the apparatus of the present invention further comprises a spectroscope for collecting the chemical composition of the test specimen, more preferably, an auger electron spectroscope (AES) x-ray photoelectron spectroscope (XPS) or Includes energy dispersive x-ray spectroscope (EDX).
  • AES auger electron spectroscope
  • XPS x-ray photoelectron spectroscope
  • EDX energy dispersive x-ray spectroscope
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration of a cell imaging apparatus according to a preferred embodiment of the present invention.
  • the cell imaging device of the present invention comprises ( a ) a temperature control means for regulating the temperature of a solid specimen, (ii) a pressure regulating means for regulating pressure, or (iii) a temperature regulating means and pressure for regulating temperature. Pressure adjusting means for adjusting the pressure; (b) surface measuring means for acquiring surface information of the solid specimen; And (c) image processing means for processing the surface information acquired by the surface measuring means to generate an image for the specimen.
  • the temperature / pressure adjusting means and the surface measuring means may be located in various ways.
  • the temperature regulating means and / or the pressure regulating means and the surface measuring means may be located in one chamber.
  • the temperature extruding means and / or the pressure regulating means and the surface measuring means may be located in one chamber separately from the solidifying means (for example, the refrigerating means), and the L-ignifying means, the silver adjusting means and / or the pressure regulating means
  • the means and the surface measuring means may each be located in separate chambers.
  • the silver adjusting means and / or the pressure adjusting means and the surface measuring means are located in one chamber separately from the solidifying means (eg the freezing means).
  • the chamber in which the surface measuring means is located is called the observation chamber.
  • the observation chamber 20 houses a frozen specimen 10 of rapidly pulsating cells or cell-containing biological or culture fluids.
  • the observation chamber 20 is provided at one side with a gas supply port 26 in communication with a dehumidifying gas supply unit 27 for maintaining in a dehumidified air or nitrogen atmosphere in order to maintain the atmosphere from which water vapor has been removed.
  • a gas outlet 28 for discharging the gas inside the observation chamber 20 to the outside is provided at one side of the observation chamber 20, for example, at the bottom of the observation chamber 20.
  • a specimen table 38 may be provided for positioning the frozen specimen 10 in the center of the observation chamber 20.
  • the temperature control means 23 for adjusting the temperature of the observation chamber 20 is provided in the observation chamber 20, the temperature control means 23 includes a cooling unit 24 and the heating unit 22 The temperature inside the observation chamber 20 can be increased or decreased.
  • the observation chamber 20 is connected to the pressure adjusting means 30 to adjust the pressure of the observation chamber 20.
  • the pressure regulating means 30 may be a vacuum pump.
  • the temperature or pressure can be adjusted to sublimate the upper ice of the copper specimen 10 by steam.
  • the gas inside the observation chamber 20 including the sublimed water vapor is discharged through the gas outlet 28, and supplies the dehumidified gas back into the observation chamber 20 through the gas supply port 26.
  • Observation chamber 20 is provided with a surface measuring means 34, the surface The measuring means 34 can be an atomic force microscope or a scanning tunnel microscope.
  • the probe of an atomic force microscope or a scanning tunnel microscope is located inside the observation chamber 20 and measures the surface of the upper specimen.
  • the probe may be used for the purpose of removing the cell structure on the upper surface of the copper specimen if necessary.
  • the image processing means 50 processes the surface information of the frozen specimen 10 measured by the probe 26 of the surface measuring means 34 to generate a two-dimensional image of the surface of the specimen 10.
  • the image processor 50 is connected to a visual display device (not shown) to display a processed two-dimensional image.
  • the information obtained by the surface measuring means 34 may be a three-dimensional image having minute depth information.
  • the image processing means 50 forms a three-dimensional image of the cell or the elements constituting the cell by combining the plurality of layered images of the frozen specimen 10 thus obtained repeatedly.
  • test specimen solid specimen
  • cell cell
  • heater 23 temperature control means
  • Cooling part 26 Gas supply port
  • Image processing means 100 The specific part of the present invention has been described in detail above the cell imaging device, for those skilled in the art, such a specific technology is only a preferred embodiment, the scope of the present invention is limited It is obvious that it is not. Accordingly, the substantial scope of the invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

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Abstract

본 발명은 (a) (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 준비하는 단계; (b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계; (c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계를 포함하는 세포 이미징 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포의 표면 이미지뿐만 아니라 세포 내에 존재하는 다양한 생체분자 및 세포소기관을 이루는 분자와 원자에 대한 정보를 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 세포 내의 생체분자 사이의 상호작용에 대한 정보 및 세포소기관 사이의 유기적 관계에 대한 정보를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 생물학적 시료 내에 있는 분자(예컨대, 암 마커 분자)를 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다.

Description

[명세서 ]
【발명의 명칭】
세포 이미징 방법 및 장치 【기술분야]
본 발명은 대한민국 교육과학기술부의 지원 하에서 과제번호 NN05790에 의해 이루어진 것으로서， 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국연구재단, 연구사업명은 "미래기반기술개발사업"， 연구과제명은 "세포연구용 무표지 바이오틀 연구개발"， 주관기관은 광주과학기술원， 연구기간은 2010.04.01 ~ 2011.03.31이다.
본 특허출원은 2012년 07월 05일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2012-0073417 호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 세포 이미징 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는， 본 발명은 세포의 실제적인 3차원 이미지를 얻을 수 있는 방법 및 장치에 관한 것이다.
【배경기술】
현대 세포 생물학， 미생물학， 특히 분자 생물학에 있어서， 세포와 세포 내 각 기관이 어떤 분자들 또는 구성으로 이루어져 있고 각 기관에서 어떤 분자들이 만들어지고 어디로 이송되며 어떻게 변하고 분해되는지를 규명하는 것은 매우 중요한 연구 과제이다. 세포의 움직임과 성장은 정상적인 생리학적 과정에 있어서 핵심적인 사항이다. 만약 세포의 움직임과 성장이 제한받는 경우 종양의 형성과 같은 부정적인 결과가 초래된다.
한편, 세포를 구성하는 분자 또는 요소들의 3차원 분포와 그 변화를 아는 것은 세포의 구조와 세포 각 기관의 기능을 이해하는데 매우 중요하다. 세포를 구성하는 분자 또는 요소들의 3차원 분포를 확인하는 대표적인 방법은 형광 이미징 (fluorescence imaging) 기법이다.
형광 이미징 기법은 세포 내의 특정 분자에 형광 표지자를 붙이거나 유전자 조작을 통해 분자 그 자체가 형광을 발현하도록 처리한 후 형광 이미지를 통해 대상 분자의 3차원 분포를 확인할 수 있게 한다. 형광 이미징 기법을 적용한 장치로서, 공초점 레이저 현미경이 있다. 그러나， 형광 이미징 기술은 세포 내에 형광 유전자나 형광 마커와 같은 이물질이 도입되어 세포 그 자체의 자연스런 상태가 아닌 인위적인 상태에서 이미징을 한다는 단점이 있다. 또한 형광 이미징을 통해 특정 분자를 검출하기 위해서는 소정 농도 이상이 세포 내에 존재하여야 가능하다 . 따라서 농도가 낮은 분자들은 마커를 부착하거나 유전자 조작을 하여도 그 3차원 분포를 확인할 수 없다. 또한, 형광 이미지를 보는 것이기 때문에 마커에 대상 분자가 부착되어 있는지 여부를 확인할 수 없다.
특정 분자의 농도가 낮은 경우 사용될 수 있는 방법으로는 세포에 과자극을 주어서 과발현 (overexpression) 시키거나 DNA나 RNA의 경우 복제 증폭을 통해 분자의 농도를 높인 이후 측정을 하는 방법이 있다. 통상적으로 사용되는 방법으로서, 세포에 특정한 과자극을 주어 처리를 한 후 처리를 하지 않은 대조군과 동시에 배양을 하여 슷자를 늘리고 이를 분리한 후 세포 파괴 (cell lysis)를 시킨 후 원심분리하여 전기영동 (gel electrophoresis)이나 질량분석기 (mass spectroscope)를' 사용하여 어떤 분자들이 증가하고 감소했는지 비교하는 방법이 있다. 그러나， 이러한 방법은, 시간이 많이 소요되고 고가의 시약이 사용된다. 또한 세포를 사멸시켜 관찰 하기 때문에 연속 관찰이 어렵다. 더불어 과도한 자극을 주어야만 측정할 수 있는 분자가 있어서 분자 발현량에 차이가 날 수 있다. 상기한 광학적 방법 및 생화학적 방법 이외의 세포 이미징 방법으로서, 전자주사 현미경 (SEM: Scanning Electron Microscope), 전자투과 현미경 (TEM: Transmission Electron Microscope), 원자력간 현미경 (AFM: Atomic Force Microscope) 및 주사형 터널 현미경 (STM ： Scanning Tunneling Microscope) 등을 이용하여 세포나 소기관의 구조와 구성 분자를 연구하는 방법이 있다.
전자주사 현미경은 전자선이 시료면 위를 주사 (scanning)할 때 시료에서 발생되는 여러 가지 신호 중 그 발생확를이 가장 많은 이차전자 (secondary electron) 또는 반사전자 (back scattered electron)를 검출하는 것으로 대상 시료를 관찰한다. 그러나, 전자주사 현미경의 경우, 분자를 이미징하기 어렵고, 시편을 동결한 후 원자번호가 높은 금속물질로 코팅을 해야 하는 단점이 있다.
전자투과 현미경은 평광한 전자선을 사용하여 시료를 투과시킨 전자선을 전자렌즈로 확대하여 관찰한다. 그러나， 전자투과현미경의 경우 분자를 이미징할 수는 있지만 이미징과 분석시간이 오래 걸리고， 시편을 동결한 후 얇게 썰어야 하는 단점이 있다.
원자력간 현미경은 피라미드 형상의 탐침으로 시료 표면에 접촉하면서 2차원으로 주사하는 현미경이다. 원자력간 현미경의 경우， 무기물이나 금속 시편의 경우 원자 수준의 이미징이 가능하다. 그러나， 물이 75-80<¾를 차지하고 있는 세포 자체 또는 외부에 배양액이 있는 세포의 경우 분해능이 급격히 악화되는 문제점이 있다. 또한, 원자력간 현미경은 분해능이 좋은 대신 이미징 면적이 아주 좁고， 살아있는 세포의 경우 자발적으로 또는 현미경의 탐침의 영향으로 형상이 변하기 때문에 이미지의 신뢰도가 낮을 수 있다.
주사형 터널 현미경은 주사형 탐침 현미경의 일종으로 터널 전류를 이용하여 시료 표면의 형상올 분석한다. 주사형 터널 현미경의 경우 원자 수준의 이미징이 가능하나 진공에서 작동하기 때문에 수분이 다량 포함되어 있는 세포의 경우 이미징이 블가능하다는 문제점이 존재한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력하였고， 그 결과 세포 내의 분자와 각종 소기관 등에 대한 실제적인 이미징을 가능하게 하는 3차원 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다. 또한， 본 발명자들은 세포에 대한 이미징을 함에 있어서 세포에 화학적이거나 물리적인 자극을 주는 것에 의한 왜곡을 방지하고 실제 살아있는 세포의 형상을 이미징할 수 있는 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 이미징 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 세포 이미징 장치휼 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 이미징 방법을 제공한다:
(a) (i) 세포， (ii) 바이러스， (ΠΟ 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편올 수득하는 단계;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계 ; 및
(d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계. 본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 세포 내의 분자와 각종 소기관 등에 대한 실제적인 이미징을 가능하게 하는 3차원 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다. 또한， 본 발명자들은 세포에 대한 이미징을 함에 있어서 세포의 비조절 (uncontrolled) 외부 요인에 의한 영향을 방지하고 실제 살아있는 세포의 형상을 이미징할 수 있는 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다. 본 발명의 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다: (a) 고상시편의 준비
본 발명에 따르면， 우선 (i) 세포， (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 준비한다. 본 발명은 다양한 세포 및 바이러스에 적용될 수 있으며， 고상시편은 이러한 다양한 세포， 바이러스 및 이를 포함하는 액체를 이용하여 준비한다. 본 발명에 의해 이미징이 가능한 세포는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다.
본 발명에 의해 이미징이 가능한 원핵세포는 박테리아 (또는 유박테리아) 및 아키박테리아를 포함한다 . 본 발명에 의해 이미징이 가능한 박테리아의 예는 Escherichia col i , Thermus thermophilics, Bacillus subtil is, Baci 1 his s t earo thermoph /Jus, Salmonella typhi murium, Pseudomonas , Streptomyces, Staphylococcus , Lactobaci 1 lus , Lactococcus 및 Streptococcus를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 의해 이미징이 가능한 아키박테리아의 예는 Methanococcus jannaschii (Mj), Methanosarcina mazei (Mm) , Me thanobac teriutn thermoautotrophicum (Mt) , Methanococcus mar ipaludis , Methanopyrus kandleri , Halobacterium, Archaeoglobus fulgidus (Af), Pyrococcus horikoshi i (Ph) , Pyrobaculum aerophi lum, Pyrococcus abyss i , Sulfolobus solfataricus (Ss) , Sulfolobus tokodaii , Aeuropynim per nix (Ap) , Thermoplaswa acidophi lum 및 Therwoplasma volcanh 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의해 이미징이 가능한 진핵세포는 균류 세포， 이스트， 식물세포 (예컨대， 단자엽 식물， 쌍자엽 식물 및 앨지) 및 동물세포 (예컨대, 포유동물, 곤충 파충류, 조류)를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 이미징이 가능한 동불세포는 인간, 마우스， 래트, 소, 돼지， 말， 양， 토끼， 염소， 조류， 어류 및 곤층의 세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에 의해 이미징이 가능한 동물세포는 혈액세포， 면역세포， 줄기세포， 체세포， 성세포, 종양세포， 암세포 및 정상세포를 포함한다.
본 발명에 의해 이미징이 가능한 바이러스는 동물바이러스, 식물바이러스 및 박테리오파아지를 포함하며， 예를 들어， HBV hepatitis B vir is) , HCV(hepat it is C vir is) , HAV(hepat it is A vir is) , HIV(human immunodeficiency virus) , reovirus , Sendai virus, myxovirus, coronavirus , encephalomyelitis virus, rotavirus , cytomegalovirus , measles virus, vaccinia virus, rabies virus, Epstein一 Barr virus , rhinovirus, polio virus 및 herpes virus를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다 ·
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상시편의 준비는 (i) 세포， (ii) 바이러스， (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 넁동하여 실시한다.
본 발명에 따르면， 세포 또는 바이러스 자체를 냉동하여 냉동시편을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면ᅳ 세포를 포함하는 액체 또는 바이러스를 포함하는 액체를 넁동하여 냉동시편을 얻을 수 있다. 세포 또는 바이러스를 포함하는 액체는 세포 또는 바이러스의 배양에 이용되는 배지 또는 생체액을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
냉동시편을 얻기 위한 냉동은 당업계에 공지된 다양한 냉동 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 냉동은 -200°C 내지 -15°C의 은도범위, -180°C 내지 -20°C의 온도범위， -150°C 내지 -35°C의 온도범위， -200 °C 내지 -55°C의 온도범위에서 실시할 수 있다.
예를 들어， 상기 냉동은 고상의 이산화탄소와 알코올의 흔합물 또는 액체 질소에 세포를 함침시켜 실시할 수 있다. 상기 고상의 이산화탄소와 알코을의 흔합물 또는 액체 질소는 컨테이너에 담겨져 있을 수 있다. 상기 컨테이너는 넁동기 (freezer)에 직접적으로 위치할 수 있으며， 상기 냉동기는 원하는 온도 (예컨대, _35°C 이하)에 세팅될 수 있다. 냉동기는 프로그램화된 냉동기 또는 속도ᅳ조절 냉동기일 수 있다. 상기 넁동시편은 재결정이 발생되는 온도 이하의 온도 예컨대 순수한 물의 유리전이온도 이하의 온도 (예컨대， 135°C)에서 보관할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 넁동은 급속 넁동으로 실시한다. 본 명세서에서 용어 □급속 냉동口은 일반적으로 최대 빙결정 생성대 (예컨대， 5°C 내지 ᅳ 1°C, 빙결율 80% 이상)를 단시간 (예컨대, 30- 35분 이내)에 통과하여 빙결정의 크기를 작게 하거나 또는 비결정질 얼음 (또는 유리질 얼음)이 생성되도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 냉동시편을 얻기 위한 냉동은 비결정질 얼음이 생성되도록 급속 냉동하는 것으로서， 유리화 (vitrification) 동결방법이다. 선택적으로， 급속 냉동을 하는 경우 DMS0(dimethyl sulfoxide)와 같은 동결보호제를 사용할 수 있다.
고상시편 (예컨대， 넁동시편)은 고체이기 때문에, 적합한 이미징 기기 예컨대 AFM 또는 STM을 사용하여 원자 /분자 수준까지 세포 이미징이 가능하다. 상온에서는 비정질 얼음이 녹기 때문에 빙점 이하의 저온에서 이미징을 하는 것이 바람직하다. 또한， 상압저온에서 이미징을 할 경우, 공기 중의 습기가 이미징 기기의 저온부에서 동결될 수 있으므로, 습기가 제거된 환경 (예컨대， 질소 분위기)에서 이미징을 하는 것이 바람직하다.
(b) 고상시편의 표면 정보 수집 .
상기 세포를 포함하는 액체 등을 고상화 하여 준비된 고상시편 (예컨대， 냉동시편)에 대하여 표면 정보를 수집한다. 표면 정보 수집은 아래에서 상세하게 설명된다.
(c) 고상시편의 표면 제거에 의한 새로운 표면의 형성
고상시편 (예컨대, 냉동시편)에 대한 표면 정보를 수집한 다음, 고상시편 (예컨대, 넁동시편)에 대한 3차원적인 이미지를 얻기 위하여 고상시편 (예컨대 냉동시편)의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시킨다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 고상시편 (예컨대， 냉동시편)의 표면 제거는 상기 고상시편 (예컨대, 넁동시편)의 표면에 있는 얼음을 승화시켜 실시한다 .
물은 생체 환경 (예컨대, 세포, 조직, 체액 및 혈액)의 80% 이상을 차지하는데， 상기 고상시편 (예컨대, 넁동시편)의 제작과정에서 형성된 얼음, 바람직하게는 비정질얼음을 세포 등의 시편에 손상을 최소화 하면서 제거하여야 한다. 이러한 목적을 달성하기 위하여， 본 발명에서는 독특하게 고상시편 (예컨대, 넁동시편)의 표면에 있는 얼음을 승화시켜 시편의 표면을 제거한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 승화는 삼중점 (triple point) 아래의 등온에서 압력을 조절하여 실시한다. 택일적으로， 표면 제거를 위한 승화는 삼중점 아래의 등압에서 온도를 조절하여 실시한다. 상기 승화를 위한 온도 조절은 예컨대， 히터 또는 냉각기를 이용하여 실시할 수 있고, 상기 압력 조절은 진공펌프 또는 콜드 트램을 이용하여 실시할 수 있다. 물의 상평형도에서， 삼중점 이하의 온도나 압력에서는 고체 얼음 및 기체 수증기만 존재한다. 이때 삼중점 이하에서 압력을 일정하게 유지하면서 온도를 상승하면 고체 상태에서 기체 상태로 액체를 거치지 않고 승화한다. 또한， 삼중점 이하 온도에서 압력을 낮추면 고체 상태에서 기체 상태로 액체를 거치지 않고 승화한다. 이러한 방식으로 고상시편 (예컨대， 넁동시편) 표면의 얼음을 승화시켜 제거함으로써 , 고상시편 (예컨대， 냉동시편)의 표면을 제거하고 표면정보 수집의 대상이 되는 새로운 표면을 형성시킨다.
고상시편 (예컨대, 냉동시편)의 포면을 제거할 때 얼음은 승화로 제거되고, 분자량이 거대 분자들이나 세포막이나 소기관 등은 승화되지 않고 잔존한다. 이와 같이 잔존하는 거대 분자들을 이미징하면 이전 표면에 대한 이미징 보다 더 깊은 3차원 이미지를 얻을 수 있다. 그러나， 만일 잔존하는 거대 분자 또는 세포소기관의 깊이가 SPM(Scanning probe microscope)의 탐침보다 깊을 경우 이미징의 한계에 봉착한다. 이 경우， 이미 이미징이 끝난 거대 분자나 세포소기관을 제거하고 후속의 이미징을 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 고상시편의 표면 제거는 물리적 힘 또는 범을 이용하여 실시한다. 특히, 세포막 또는 세포내에 있는 거대 분자 또는 세포소기관을 제거하기 위한 표면 제거 시에 물리적 힘 또는 빔을 이용한다.
상기 표면 제거에 물리적 힘이 이용되는 경우， 바람직하게는 SPKScanning probe microscope)의 탐침을 이용하여 푸싱 (밀거나) 또는 풀링 (끌어서 )하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 적합한 탐침이 장착된 SPM은 AFM( atomic force microscope) , STM( scanning tunneling microscope) , BEEMCbal 1 istic electron emission microscope) , CFMCchemical force microscope) , C-AFM, (conductive atomic force microscope) , EFM(electrostat ic force microscopy) , ESTM(electrochemical scanning tunneling microscope) , FMM( force modulation microscope) , KPFM(kelvin probe force microscope) , MFM ( magnet ic force microscope) , MRFKmagnet ic resonance force microscope) , NS0M(near-f ield scanning optical microscope) , SN0M( scanning near-field optical microscope) , PFM(Pi ezoresponse Force Microscope) , PSTMC hoton scanning tunneling microscope) , PTMS(photot hernial microscope) , SECM( scanning electrochemical microscope) , SCM( scanning capacitance microscope) , SGM(scanning gate microscope) , SICK scanning ion-conductance microscope) , SPSM(s in polarized scanning tunneling microscope) , SSRM(scanning spreading resistance microscope) , SThM( scanning thermal microscope) , SVM( scanning voltage microscope) , STP(scanning tunneling potent iometry) , SHPM( scanning Hal 1 probe microscope) , 또는 SXSTM( synchrotron x-ray scanning tunneling microscope)이며， 보다 바람직하게는 AFM 또는 STM이다.
상기 표면 제거에 빔이 이용되는 경우， 바람직하게는 고상시편의 표면 제거는 이온빔， 보다 바람직하게는 원자이온빔을 이용하여 실시한다. 이와 같이 물리적 힘 또는 빔을 이용한 고상시편의 표면 제거는， 승화에 의한 표면 제거 후 잔존하는 세포 내 거대분자， 염색체， 리보좀 또는 세포소기관을 제거하기 위하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 이온빔에 의한 표면 제거 후 표면 제거 과정에서 발생하는 전자， 이온, 빛 및 X-선으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1개의 component를 측정하여 제거 대상의 원자 구성비를 분석하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 원자 구성비 분석은 AES( Auger electron spectroscopy) XPS(x— ray photoelectron spectroscopy) 또는 EDX( energy dispersive x-ray spectroscopy)를 이용하여 실시한다.
(d) 고상시편의 표면에 대한 정보 수집
고상시편의 표면에 대한 정보 수집은 탐침을 이용하는 SPM(Scanning probe microscope)을 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. SPM은 마이크로미터 및 /또는 나노미터 스케일로 분석대상의 물리적 특성을 측정하는 도구이다. SPM은 탐침 (프로브)를 이용하며， 이 탐침은 분석대상의 표면에 매우 근접하여 위치한다. 탐침은 몇 백 마이크로미터 길이 및 0.5-5 마이크로미터의 두께를 가지는 칸티레러 상에 마운팅 될 수 있다. SPM 방법은 Wang et al . , Amer . Chem. Soc. Lett. , 12:1697-98. 1996； Kim et al . , Appl . Surface Sci. 130, 230, 34으 132 :602-609， 1998； Kobayashi et al . , Appl . Surface Sci . 157:228-32， 2000； Hirahara et al . , Phys. Rev. Lett. 85:5384-87, 2000； Klein et al . , Applied Phys. Lett. 78:2396-98， 2001； Huang et al., Science 291:630-33, 2001； Ando et al .， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12468-72, 20이에 개시되어 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명에의 표면 정보 수집에 이용되는 SPM은
AFM( atomic force microscope) , STM( scanning tunneling microscope) , BEEM(bal 1 ist ic electron emission microscope) , CFM(chemical force microscope) , C-AFM , (conductive atomic force microscope) , EFM(electrostat ic force microscopy) , ESTM(electrochemical scanning tunneling microscope) , FMM( force modulat ion microscope) , KPFMCkelvin probe force microscope) , MFM (magnet ic force microscope) , MRFM( magnet ic resonance force microscope) , NS0M(near-f ield scanning optical microscope) , SN0M( scanning near-field optical microscope) , PFM(Piezoresponse Force Microscope) , PSTM(photon scanning tunneling microscope) , PTMS (photothermal microscope) , SECM( scanning electrochemical microscope) , SCM( scanning capacitance microscope) , SGM( scanning gate microscope) , SICM(scanning ion-conductance microscope) , SPSM(spin polarized scanning tunneling microscope) , SSRM( scanning spreading resistance microscope) , SThM( scanning thermal microscope) , SVMCscanning voltage microscope) , STP(scanning tunneling potent iometry) , SHPM( scanning Hal 1 probe microscope) , 또는 SXSTM( synchrotron x-ray scanning tunneling microscope)이고, 보다 .더 바람직하게는 AFM또는 STM이고, 가장 바람직하게는 AFM이다.
AFM은 U.S. Pat. No. 5,497,656； Moller et al . , Biophys. J. , 77:115으 8， 1999； Thundat et al., Scanning Microsc. 6： 911-8, 1992； Hansma et al . , Nucleic Acids Res. , 21:505ᅳ 12, 1993； Murray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3811-4， 1993에 개시되어 있으며， 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표면 정보의 수집은 고상시편의 표면과 탐침 사이에 작용하는 힘 (바람직하게는, 반데르발스 힘)을 측정하여 실시한다. 표면 정보 수집에 의해 분석 대상의 세포표면 및 세포내의 상태, 세포표면 및 세포내에 있는 분자나 세포소기관들에 대한 정보 (예컨대，
3차원 이미지)를 앋을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c)와 (d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 분석 대상의 세포 또는 바이러스에 대한 3차원 이미지를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법은 세포의 내부 및 세포막 표면에 대한 이미지 (바람직하게는, 3차원 이미지)를 제공할 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법은 세포막 표면의 수용체， 채널, 세포막 단백질, 세포막 표면 탄수화물， 세포 표면마커， 세포 내부의 세포소기관， 염색체, 단백질 (예컨대， 효소， 항체， 항원， 구조 단백질, 호르몬， 성장인자， 혈청 단백질), 핵산분자 (예컨대， DNA, RNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA), 탄수화물 및 지질에 대한 이미지를 제공할 수 있다. 본 발명은 상술한 생체분자들， 특히 단백질의 3차원 구조를 파악할 수 있다. 또한， 본 발명의 방법은 바이러스의 내부 및 표면에 대한 이미지 (바람직하게는， 3차원 이미지)를 제공할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음을 포함하는 세포 이미징 장치를 제공한다:
(a) (i) 세포, (ii) 바이러스， (iii) 세포를 포함하는 액체 또는
(iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단, (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단.
본 발명의 세포 이미징 장치는 아래에서 상세하게 설명된다.
본 발명의 세포 이미징 방법 및 장치를 활용하여 세포를 이미징 하는 활용예를 설명하면 다음과 같다:
본 발명에 따른 세포 이미징 방법 및 장치를 이용하면 세포의 표면 이미지뿐만 아니라 세포 내에 존재하는 다양한 생체분자 및 세포소기관을 이루는 분자, 더 나아가 원자에 대한 정보를 얻을 수 있다. 또한， 생체분자 사이의 상호작용에 대한 정보 및 세포소기관 사이의 유기적 관계를 파악할 수 있다. 실제적으로 냉동시편에는 최소 수천 또는 수만 개 이상의 세포가 포함될 것이므로 각각으로부터 얻어진 정보를 종합하면 세포 내에 포함된 물을 제외한 세포 구조물의 3차원 이미지 획득 및 각 세포 구조물간의 관계를 확인할 수 있다.
예를 들어， 항암제가 세포 내 미토콘드리아에 미치는 영향 및 효과를 본 발명에 따른 세포 이미징 방법 및 장치를 이용하여 확인하는 경우를 살펴보도록 한다. 먼저, 배양된 세포에 항암제 처리를 한다. 항암제 처리된 세포를 포함한 배양액을 급속 냉동하여 비결정질 또는 유리질 얼음의 시편을 생성한다. 넁동시편을 관찰 챔버 (표면 측정 수단을 포함하는 챔버) 내에 위치한 상태에서 관찰 챔버 내의 압력 및 온도를 조절하여 얼음을 승화시캄으로써 넁동시편의 표면을 제거한다. 승화를 통해 원하는 정도로 시편의 표면을 제거한 후, 다시 압력을 상승시키거나 온도를 높여 승화를 중단시킨다.
세포 내 미토콘드리아가 관심의 대상이므로 , 광학 현미경을 이용하여 세포 내 미트콘드리아의 위치를 확인하고 표면 제거 수단을 이용하여 시편의 표면에 미트콘드리아가 노출되도록 세포막 등의 표면을 제거한다. 이후, 표면 측정수단은 표면의 요철을 관찰하여 시편 표면의 원자 및 형태에 대한 정보를 얻는다. 필요한 경우， 기존의 기술인 형광 마커를 관찰대상인 미토콘드리아에 붙이거나 유전자 조작으로 미토콘드리아가 형광 발현하게 해서 광학 이미징을 추가적으로 할 수도 있다. 냉동 시편의 표면층을 제거하는 과정과 표면 이미지 및 원자 정보 등을 반복 획득함으로써 항암제가 미토콘드리아에 미치는 영향을 확인할 수 있다.
본 발명은 상기한 예 이외에도， 세포에 대한 기초 연구， 병균과 세포의 상호 작용, 세포의 변화， 약품이나 화학물질이 세포에 미치는 영향， 세포의 분화나 복제 등의 연구 등에 광범위하게 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면 본 발명은 다음 단계를 포함하는 시료 내 분석대상의 분석 방법을 제공한다: (a) 시료를 포함하는 액체를 고상화 하여 고상시편을 준비하는 단계;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및
. (d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계. 본 발명의 방법은 상술한 세포 이미징 방법과 거의 동일하며 단지 분석의 대상이 상이하기 때문에， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다.
본 발명자들은 시료 내 분석대상을 보다 개선된 민감도 및 정확도로 정성적 분석 및 정량적 분석을 할 수 있는 분석 기술 및 장치를 개발하였다. 본 명세서에서 용어 口분석口은 분석대상이 시료 내에 존재하는 지 여부를 판단하는 것 (정성적 분석)， 시료 내에 분석대상의 양 (정량적 분석) 및 시료 내 분석 대상의 구조 (구조적 분석)을 모두 포괄하는 의미를 갖는다. 본 발명에 따르면， 우선 시료를 포함하는 액체의 고상시편을 준비한다 .
본 발명은 다양한 액상 시료에 적용될 수 있다. 예를 들어， 본 발명이 적용되는 액상 시료는 생물학적 시료, 화학적 시료 및 환경학적 시료를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 고상시편의 준비는 시료를 포함하는 액체를 냉동하여 실시한다.
표면 정보 수집에 의해 시료 내 분석대상에 대한 정보 (예컨대， 3차원 이미지)를 얻을 수 있으며, 이로부터 시료 내 분석대상의 존재 여부 (정성적 분석) 및 함량 (정량적 분석)을 결정할 수 있다. 또한， 상기 정보로부터 시료 내 분석 대상의 구조， 예컨대 단백질의 3차 구조를 결정할 수 있다. 또한， 상기 정보로부터 시료 내 분석 대상이 다른 물질과 결합하였는지 여부를 결정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 방법은 단계 (c)와
(d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 상기 검출대상의 농도 또는 양을 분석할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (d) 이후에 상기 단계 (d)에서 수집한 표면 정보를 기지 (旣知)의 물질에 대한 레퍼런스 표면 정보와 비교하는 단계를 추가적으로 포함한다ᅳ 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 이용되는 시료는 생물학적 시료이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 생물학적 시료는 다양한 생물학적 시료를 포함하며， 바람직하게는 혈액, 혈장， 혈청, 림프, 골수액， 타액， 우유, 소변， 분변， 안구액， 정액, 뇌 추출물， 척수액, 관절액， 흉선액, 복수， 양막액 또는 세포 조직액이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 생물학적 시료 내 분석대상은 단백질 (예컨대， 효소， 수용체， 세포막 단백질, 항체, 항원, 구조 단백질， 성장인자， 호르몬， 혈청 단백질， 암 마커), 핵산분자 (예컨대， DNA, RNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA), 지질， 탄수화물 또는 소분자량 화합물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 분석대상은 생물학적 시료 내 서로 상호작용 (interaction) 하는 단백질-단백질 복합체이다. 본 발명에 따르면 단백질들 상호간의 결합 여부를 정확하게 파악할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 분석대상은 의약후보물질과 그의 타겟 분자 사이의 복합체이다. 본 발명에 따르면, 의약후보물질과 그의 생물학적 타겟 (예컨대， 수용체) 간의 결합 여부를 정확하게 파악할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 분석대상은 생물학적 시료 내 질환 마커 물질이며， 보다 바람직하게는 암 마커 물질이다.
종래기술에 따르면， 암 마커는 항원 -항체 반웅을 이용한 EL ISA (Enzymeᅳ 1 inked immunosorbent assay) 및 PCR(Polymerase chain reaction) 등을 통하여 검출하고 있다. 그러나 이들 검출 방법은 정확도에도 문제가 있지만， 민감도에서 큰 문제가 있어， 초기 암의 경우에서는 암 마커를 생물학적 시료 (예컨대， 혈액)에서 거의 검출할 수 없다. 그러나 본 발명의 경우에는 시료 내에 존재하는 하나의 분자도 검출할 수 있기 때문에， 종래의 방법에 의해 검출되지 않는 암 마커를 검출할 수 있으며， 이에 암 진단에서 획기적인 발전을 가져을 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음을 포함하는 시료 내 분석대상의 분석 장치를 제공한다: (a) 시료를 포함하는 액체의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도흩 조절하기 위한 온도 조절 수단， (Π) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음 단계를 포함하는 기체시료 내 분석대상의 분석 방법을 제공한다:
(a) 기체시료를 액체시료로 전환시키는 단계;
(b) 상기 액체시료를 고상화 하여 고상시편을 준비하는 단계 ;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계. 본 발명의 방법은 상술한 세포 이미징 방법과 거의 동일하며 단지 분석의 대상이 기체시료라는 점에서 차이기 있기 때문에， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다.
표면 정보 수집에 의해 기체시료 내 분석대상에 대한 정보 (예컨대， 3차원 이미지)를 얻을 수 있으며， 이로부터 기체시료 내 분석대상의 존재 여부 (정성적 분석) 및 함량 (정량적 분석)올 결정할 수 있다. 또한， 상기 정보로부터 시료 내 분석 대상의 구조도 결정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)와 (d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 상기 검출대상의 농도 또는 양을 분석한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d) 이후에 상기 단계 (d)에서 수집한 표면 정보를 기지 (旣知)의 물질에 대한 레퍼런스 표면 정보와 비교하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 분석대상은 대기 중의 기체， 바이러스, 균류 (fungi), 박테리아, 휘발성 화합물 (volatile compound) 또는 방사능 물질이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 대기는 거리， 병원， 공장, 학교， 공원， 집， 회사 또는 연구실의 대기 또는 운송수단의 배출대기의 대기아다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 대기는 동물의 날숨이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 기체시료 내 분석대상의 분석 장치를 제공한다:
(a) 고상화된 기체시료의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단， (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 실제적인 세포의 상태를 파악할 수 있는 정보를 제공하는 세포 이미징 방법이다.
(b) 본 발명은 세포의 표면 이미지뿐만 아니라 세포 내에 존재하는 다양한 생체분자 및 세포소기관을 이루는 분자와 원자에 대한 정보를 얻을 수 있다.
(c) 본 발명에 따르면， 세포 내의 생체분자 사이의 상호작용에 대한 정보 및 세포소기관 사이의 유기적 관계에 대한 정보를 얻을 수 있다.
[도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 본 발명의 세포 이미징 장치 및 세포 이미징 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 본 발명의 세포 이미징 장치에 대한 모식도이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어， 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한， 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나， 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 세포 이미징 방법을 도식화한 도면이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 (i) 세포,
(ii) 바이러스， (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 고상화시켜 고상시편을 제조하기 위한 고상화 수단을 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 고상화 수단은 냉동 수단이다.
본 발명에 따른 세포 이미징을 위하여 분석하고자 하는 세포 (12)를 냉동, 바람직하게는 급속 냉동한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 냉동 수단은 급속 넁동 수단이며 급속 냉동 수단은 세포 또는 바이러스의 내부， 외부 또는 표면에 있는 물을 비결정질 얼음으로 생성시킨다.
세포 (12) 자체만을 넁동시키는 것이 가능하면 세포 자체만을 냉동시키면 되나, 실질적으로는 세포 (12)를 포함한 생체액 또는 배양액을 급속 넁동시키는 경우가 더 많을 것이다. 예컨대, 적혈구나 백혈구 또는 혈소판을 대상으로 하여 세포 이미징을 하고자 하는 경우에는 이들을 포함한 혈장을 급속 냉동시킨다. 또는 세포 (12)를 포함하는 배양액을 급속 넁동시킬 수도 있다. 급속 냉동을 통해 넁동 시편 (10)을 획득한다. 액상의 물을 급속 넁동하는 경우 결정성 얼음이 되지 않고 유리화 얼음 (vitrified ice) 또는 비정질 얼음이 되기 때문에 세포 (12)에 대한 손상이 발생하지 않는다. 이에 따라 손상되지 않은 상태의 실제 세포 (12)에 대한 관찰이 가능해진다. 세포 (12)를 포함한 생체액 또는 배양액을 급속 넁동시킬 때， 상기 생체액 또는 배양액을 페트리디쉬와 같은 형상의 트레이에 담아 급속 냉동시키는 것을 고려할 수 있다.
도 1의 (a)에서 얻어진 급속 냉동된 시편 (10)은 도 1의 (b)와 같이 관찰 챔버 (20)로 이동시킨다. 관찰 챔버 (20) 내부는 빙점 이하로 유지되어 시편 (10)의 해동을 방지하는 것이 바람직하다. 또한 관찰 챔버 (20) 내부에 수증기가 존재하는 경우 수증기가 관찰 챔버 (20) 내부 또는 이미징을 위한 기기에 동결 부착될 수 있는 바， 관찰 챔버 (20) 내부는 수증기가 제거된 상태, 예컨대 질소 분위기로 유지되는 것이 바람직하다.
관찰 챔버 (20)의 상부에는 광학 현미경 (32)이 구비될 수 있다. 광학 현미경 (32)은 세포를 포함한 시편 (10)의 광학적 이미지를 취득하는 기능을 수행한다. 또한， 광학 현미경 대신 전자 현미경을 구비하여 시편 (10)의 상부 이미지를 취득하는 것도 가능하다. 광학 현미경 또는 전자 현미경을 구비하는 이유는 시편 (10)에 대한 이미지를 확인하여 실제 관찰하고자 하는 세포 또는 세포 구조물의 위치를 파악하기 위함이다.
비정질 얼음은 고체 상태이기 때문에 원자력간 현미경 (AFM)이나 주사형 터널 현미경 (STM)을 이용하여 분자나 원자 수준까지 이미징이 가능하다. 따라서, 바람직하게는 관찰 챔버 (20) 내에 시편의 상부 표면을 측정하고 이에 따른 이미지를 생성하기 위한 표면 측정수단 (34)이 구비된다. 표면 측정수단 (34)은 시편 (10)의 표면을 원자 단위까지 측정할 수 있는 주사 프로브 현미경 (SPM ： Scanning Probe Microscope)이 사용될 수 있으며， 그 중에서도 각기 다른 모드의 원자력간 현미경 (AFM)이 사용될 수 있다. 원자력간 현미경은 시편 (10)과 탐침 (36)의 접촉 유무에 따라, 접촉 모드와 비접촉 모드로 나뉜다. 접촉 모드의 경우 시편 (10) 표면과 굴곡을 측정하기 위한 탐침 (36) 사이의 인력 (반데르발스 힘 )을, 비접촉 모드의 경우 척력을 측정함으로써， 시편 (10) 표면에 대한 정보를 얻는다. 접촉 모드는 검출 방식의 특성상 시편 (10)에 손상을 남길 수 있는데， 이러한 단점을 극복한 방식으로 태핑 모드 원자간력 현미경 (Tapping Mode AFM)이 사용될 수 있다. 또한, 표면 측정수단 (34)은 주사형 터널 현미경 (STM)일 수 있다.
위와 같이 급속 넁동된 세포를 포함한 시편에 대하여 원자력간 현미경 또는 주사형 터널 현미경과 같은 표면 측정수단 (34)을 이용하여 이미징을 하는 경우， 세포막에 존재하는 막단백질 또는 수용체와 같은 미소한 세포 구성요소 또는 분자를 이미징할 수 있다. 또한 혈액 속에 극소량 존재하여 기존의 기술로 검출할 수 없었던 암 마커 (cancer marker) 등을 이미징하는 것도 가능하다. 또한， 원자력간 현미경이나 주사형 터널 현미경 등을 이용하여 시편 표면을 측정하는 경우， 미소한 3차원 형상을 이미징하는 것도 가능하다.
다만, 이상의 과정에서 얻어진 이미지는 실질적으로는 세포에 대한 3차원 이미지가 아닌 2차원 이미지라고 할 수 있다. 3차원 이미지를 얻기 위해서는 단층 촬영 (tomography) 영상을 조합하여 3차원 이미지를 획득하는 것처럼 이미 이미징이 완료된 층을 냉동된 시편 (10)에서 제거한 후 다음 층에 대한 이미지를 획득하는 것이 필요하다.
넁동된 시편 (10)의 표면을 제거하는 방법으로서， 관찰 챔버 (20) 내부의 온도 및 압력올 조절하여 시편 (10) 표면의 비정질 얼음을 승화시켜 제거하는 것을 고려할 수 있다. 물의 상평형도에서 삼중점 이하의 온도나 압력에서는 고체 얼음과 기체 수증기만이 존재한다. 따라서， 삼중점 이하에서 압력을 일정하게 유지하면서 온도를 상승시키면 고체 상태의 얼음은 기체 상태의 수증기로 승화한다. 또는 3중점 이하의 온도에서 압력을 낮추면 고체 상태의 얼음은 기체 상태의 수증기로 승화한다. 물론 3중점 이하에서 온도와 압력을 함께 조절하여 고체 상태의 얼음을 수증기로 승화시키는 것도 가능하다. 이러한 방식으로 온도와 압력을 조절하여 냉동된 시편 (10)의 표면을 제거할 수 있다. 온도 조절을 위해서는 관찰 챔버 (20)에 히터 (22) 및 넁각기 (24)를 부착한다. 또한， 압력 조절을 위하여 관찰 챔버 (20) 내부와 연결된 진공 펌프 (30)를 구비한다. 한편， 승화된 수증기를 포함한 관찰 챔버 (20) 내 가스를 제거하고 수증기를 포함하지 않은 가스를 공급하기 위하여， 관찰 챔버에는 가스 배출구 (28)가 구비되고 질소와 같은 가스를 공급하기 위한 가스 공급구 (26)가 구비된다. 일 실시 형태로서， 가스 배출구 (28)는 진공 펌프 (30)와 연결될 수 있다.
도 1의 (c)는 위와 같은 방법으로 시편 (10)의 표면층을 미소한 두께로 제거한 상태를 나타낸다. 도 1의 (c)와 같이 시편 표면 (14)을 미소 두께로 제거한 후 광학 현미경 (32) 및 /또는 표면 측정수단 (34)을 이용하여 세포 또는 세포를 구성하는 요소들의 이미지를 획득한다. 그런데 승화 현상을 이용하여 시편 (10)의 표면에 포함된 얼음을 제거하더라도， 세포막이나 세포 내의 각종 소기관 등은 제거되지 않고 시편에 남게 된다. 이를 제거하는 방법으로서, 원자력간 현미경 (AFM) 또는 추사형 터널 현미경 (STM)의 탐침 (36)을 직접 이용하여 이미 이미징이 완료된 세포벽， 세포막， 거대 분자나 세포소기관을 밀거나 당김으로써 제거할 수 있다. 또는 별도의 제거 프로브를 챔버 내에 구비하고 이 제거 프로브를 이용하여 시편의 상부로 돌출된 구조물 등을 제거할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 표면 측정 수단으로서의 탐침이 장착된 SPM은 고상시편의 표면을 물리적 힘으로 제거하기 위한 표면 제거 수단으로 이용된다.
또 다른 방법으로서 , 이온빔 (40)을 이용하여 돌출된 구조물을 제거하는 것을 고려할 수 있다. 도 1의 (d)는 이온범 (40)을 이용하여 냉동시편 표면의 돌출된 구조물 등을 제거하는 상태를 도시한다.
이온범 (40)을 활용하는 경우 추가적으로 이온범 (40)에 의해 물질을 제거할 때 발생하는 전자， 이온， 빛, 또는 X— ray 등을 분석하여 제거된 물질의 원자 구성비를 분석하는 것도 가능하다. 이를 위해 원자 분석부가 관찰 챔버 (20)에 구비된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 장치는 넁동시편의 화학적 구성을 수집하기 위한 분광기 (spectroscope)를 추가적으로 포함하며 보다 바람직하게는 AES(Auger electron spectroscope) XPS(x-ray photoelectron spectroscope) 또는 EDX( energy dispersive x-ray spectroscope)를 포함한다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 세포 이미징 장치의 구성을 도시한 도면이다.
본 발명의 세포 이미징 장치는 (a) 고상시편의 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단， (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단; (b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및 (c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단올 포함한다.
본 발명의 장치에서， 상기 온도 /압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 다양한 방식으로 배치될 수 있다. 예를 들어, 온도 조절 수단 및 /또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 하나의 챔버 내에 위치시킬 수 있다. 또한, 온도 초절 수단 및 /또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 상기 고상화 수단 (예컨대， 냉동 수단)과는 별도로 하나의 챔버에 위치시킬 수도 있고, L상화 수단， 은도 조절 수단 및 /또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단을 각각 별개의 챔버에 위치시킬 수도 있다.
가장 바람직하게는， 은도 조절 수단 및 /또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 고상화 수단 (예컨대, 냉동 수단)과는 별도로 하나의 챔버에 위치시킨다. 표면 측정 수단이 위치하는 챔버를 관찰 챔버로 명명한다.
관찰 챔버 (20)는 급속 넁동된 세포 또는 세포 포함 생체액이나 배양액의 냉동 시편 (10)을 수용한다. 이러한 관찰 챔버 (20)는 수증기가 제거된 분위기를 유지하기 위하여 제습된 공기 또는 질소 분위기로 유지시키기 위한 제습 가스 공급부 (27)와 연통된 가스 공급구 (26)가 일측에 구비된다. 또한， 관찰 챔버 (20) 내부 가스를 외부로 배출하기 위한 가스 배출구 (28)가 관찰 챔버 (20)에 일측， 예컨대 관찰 챔버 (20)의 저부에 구비된다. 바람직하게는 관찰 챔버 (20)의 중앙부에 냉동 시편 (10)을 위치시키기 위한 시편 테이블 (38)이 구비될 수 있다.
한편, 관찰 챔버 (20)의 온도를 조절하기 위한 온도 조절수단 (23)이 관찰 챔버 (20)에 구비되는데， 온도 조절수단 (23)은 냉각부 (24)와 가열부 (22)를 포함하여 관찰 챔버 (20) 내부의 온도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또한 관찰 챔버 (20)는 압력 조절수단 (30)이 연결되어 관찰 챔버 (20)의 압력을 조절한다. 일 실시예에 있어서 상기 압력 조절수단 (30)은 진공 펌프로 구성될 수 있다.
이러한 구성에 의하여 관찰 챔버 (20)의 내부에 냉동 시편 (10)을 위치시킨 상태에서， 관찰 챔버 (20)의 온도와 압력을 조절하여 냉동 시편 (10)의 해빙을 방지할 수 있다. 한편， 관찰 챔버 (20)의 온도와 압력이 3중점 이하로 유지된 상태에서 온도 또는 압력을 조절하여 넁동 시편 (10)의 상부 얼음을 수증기로 승화시켜 제거할 수 있다. 승화된 수증기를 포함한 관찰 챔버 (20) 내부 가스는 가스 배출구 (28)를 통해 배출되고, 가스 공급구 (26)를 통해 제습된 가스를 다시 관찰 챔버 (20) 내부로 공급한다. 관찰 챔버 (20)에는 표면 측정수단 (34)이 구비되는데， 표면 측정수단 (34)은 원자력간 현미경 또는 주사형 터널 현미경일 수 있다. 원자력간 현미경 또는 주사형 터널 현미경의 탐침은 관찰 챔버 (20) 내부에 위치하며 넁동시편 상부의 표면을 측정한다. 한편, 상기 탐침은 냉동시편 상부의 표면을 측정하는 외에, 필요시에는 넁동시편 상부의 세포 구조물을 제거하는 용도로 사용되는 것도 가능하다.
영상 처리수단 (50)은 표면 측정수단 (34)의 탐침 (26)에 의해 측정된 냉동시편 (10)의 표면 정보를 처리하여 시편 (10)의 표면에 대한 2차원 이미지를 생성한다. 바람직하게는 영상 처리부 (50)는 시각 디스플레이 장치 (미도시)와 연결되어 처리된 2차원 이미지를 디스플레이한다. 한편， 표면 측정수단 (34)에 의해 획득된 정보는 미소한 깊이 정보를 갖는 3차원 이미지일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시에 있어서 넁동 시편 (10)의 상부 얼음을 승화시키거나， 세포 구조물을 제거한 이후 새로운 층에 대한 이미지를 획득할 수 있다. 이렇게 반복하여 얻은 냉동시편 (10)에 대한 복수의 층별 이미지를 조합하여 영상 처리수단 (50)은 세포 또는 세포를 구성하는 요소들에 대한 3차원 이미지를 형성한다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
【부호의 설명】
10: 넁동시편 (고상시편) 12: 세포
14： 고상시편 표면 20: 관찰 챔버
22： 히터 23: 온도조절수단
24： 냉각부 26: 가스 공급구
27： 가스공급부 28: 가스배출구
30： 진공 펌프 (압력 조절수단) 32: 현미경
34： 표면 측정수단 36: 탐침 38： 시편 테이블 40: 이온범
50： 영상 처리수단 100: 세포이미징 장치 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상와 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음 단계를 포함하는 세포 이미징 방법:
(a) (i) 세포, (ii) 바이러스， (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 준비하는 (prepare) 단계;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 고상시편의 준비는 (i) 세포， (ii) 바이러스， (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 냉동하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 냉동은 급속 냉동으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 4】
제 3 항에 있어서， 상기 급속 냉동은 비결정질 얼음이 생성되도록 실시하는 것을 특징을 하는 방법.
【청구항 5】
제 2 항에 있어서, 상기 고상시편의 표면 제거는 상기 고상시편의 표면에 있는 얼음을 승화시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서， 상기 승화는 삼중점 아래의 등온에서 압력을 조절하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 7】
제 5 항에 있어서, 상기 승화는 삼중점 아래의 등압에서 온도를 초절하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 고상시편의 표면 제거는 물리적 힘 또는 범을 이용하여 실시하는 것올 특징으로 하는 방법.
【청구항 9】
제 8 항에 있어서， 상기 물리적 힘 또는 범을 이용한 넁동시편의 표면 쎄거는 상기 승화에 의한 표면 제거 후 잔존하는 세포 내 거대분자， 염색체， 리보좀 또는 세포소기관을 제거하기 위하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 10】
게 8 항에 있어서， 상기 빔에 의한 표면 제거 후 표면 제거 과정에서 발생하는 전자， 이온， 빛 및 X-선으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1개의 component를 측정하여 제거 대상의 원자 구성비를 분석하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 11】
제 1 항에 있어서， 상기 표면 정보의 수집은 탐침을 이용하는 SPM(Scanning probe microscope)을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 12】
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (C)와 (d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 상기 세포 또는 바이러스의 3차원 이미지를 얻는 것올 특징으로 하는 방법.
【청구항 13】
제 1 항에 있어서， 상기 방법은 세포 내부 및 세포막 표면에 대한 이미지를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 14】
제 13 항에 있어서, 상기 방법은 세포막 표면의 수용체, 채널, 세포막 단백질， 세포막 표면 탄수화물， 세포 표면마커， 세포 내부의 세포소기관， 염색체, 단백질， 핵산， 탄수화물 및 지질에 대한 이미지를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 15】
다음을 포함하는 세포 이미징 장치:
(a) (i) 세포, (Π) 바이러스， (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단, (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단.
I청구항 16】
제 15 항에 있어서， 상기 장치는 (i) 세포， (ii) 바이러스， (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 고상화시켜 고상시편을 제조하기 위한 고상화 수단을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치 .
【청구항 17】
제 15 항에 있어서， 상기 장치는 고상시편의 표면을 물리적 힘으로 제거하기 위한 수단 또는 빔 발생장치를 표면 제거 수단을 추가적으로 포함하는 것올 특징으로 하는 장치.
【청구항 18】
제 15 항에 있어서， 상기 표면 측정 수단은 탐침이 장착된 SPM( Scanning probe microscope)인 것을 특징으로 하는 장치.
[청구항 19】
제 15 항에 있어서， 상기 장치는 광학현미경 또는 전자현미경을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
【청구항 20】
제 18 항에 있어서， 상기 표면 측정 수단으로서의 탐침이 장착된 SPM은 고상시편의 표면을 물리적 힘으로 제거하기 위한 표면 제거 수단으로 이용되는 것을 특징으로 하는 장치.
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