KR101440571B1 - 세포 이미징 방법 및 장치 - Google Patents
세포 이미징 방법 및 장치 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101440571B1 KR101440571B1 KR20120073417A KR20120073417A KR101440571B1 KR 101440571 B1 KR101440571 B1 KR 101440571B1 KR 20120073417 A KR20120073417 A KR 20120073417A KR 20120073417 A KR20120073417 A KR 20120073417A KR 101440571 B1 KR101440571 B1 KR 101440571B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell
- specimen
- solid
- present
- microscope
- Prior art date
Links
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 143
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 72
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 70
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 33
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 35
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 27
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 27
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 14
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 claims description 12
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 claims description 12
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 claims 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 10
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 abstract description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 22
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 description 15
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 8
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 8
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 7
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004578 scanning tunneling potentiometry Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 3
- 238000004667 electrostatic force microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000002149 energy-dispersive X-ray emission spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 3
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 3
- 238000000682 scanning probe acoustic microscopy Methods 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 2
- 238000000594 atomic force spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002102 hyperpolarization Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000205042 Archaeoglobus fulgidus Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 241000205062 Halobacterium Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 1
- 241001529871 Methanococcus maripaludis Species 0.000 description 1
- 241000204641 Methanopyrus kandleri Species 0.000 description 1
- 241000205274 Methanosarcina mazei Species 0.000 description 1
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000702244 Orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000736843 Pyrobaculum aerophilum Species 0.000 description 1
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 1
- 241000160715 Sulfolobus tokodaii Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000204667 Thermoplasma Species 0.000 description 1
- 241000204673 Thermoplasma acidophilum Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001473 dynamic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004574 scanning tunneling microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0028—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders specially adapted for specific applications, e.g. for endoscopes, ophthalmoscopes, attachments to conventional microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
- G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
- G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
- G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
- G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
- G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders
- G01Q60/42—Functionalisation
Abstract
본 발명은 (a) (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 준비하는 단계; (b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계; (c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계를 포함하는 세포 이미징 방법에 관한 것이다. 본 발명은 세포의 표면 이미지뿐만 아니라 세포 내에 존재하는 다양한 생체분자 및 세포소기관을 이루는 분자와 원자에 대한 정보를 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 세포 내의 생체분자 사이의 상호작용에 대한 정보 및 세포소기관 사이의 유기적 관계에 대한 정보를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 생물학적 시료 내에 있는 분자(예컨대, 암 마커 분자)를 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 세포 이미징 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 세포의 실제적인 3차원 이미지를 얻을 수 있는 방법 및 장치에 관한 것이다.
현대 세포 생물학, 미생물학, 특히 분자 생물학에 있어서, 세포와 세포 내 각 기관이 어떤 분자들 또는 구성으로 이루어져 있고 각 기관에서 어떤 분자들이 만들어지고 어디로 이송되며 어떻게 변하고 분해되는지를 규명하는 것은 매우 중요한 연구 과제이다. 세포의 움직임과 성장은 정상적인 생리학적 과정에 있어서 핵심적인 사항이다. 만약 세포의 움직임과 성장이 제한받는 경우 종양의 형성과 같은 부정적인 결과가 초래된다.
한편, 세포를 구성하는 분자 또는 요소들의 3차원 분포와 그 변화를 아는 것은 세포의 구조와 세포 각 기관의 기능을 이해하는데 매우 중요하다. 세포를 구성하는 분자 또는 요소들의 3차원 분포를 확인하는 대표적인 방법은 형광 이미징(fluorescence imaging) 기법이다.
형광 이미징 기법은 세포 내의 특정 분자에 형광 표지자를 붙이거나 유전자 조작을 통해 분자 그 자체가 형광을 발현하도록 처리한 후 형광 이미지를 통해 대상 분자의 3차원 분포를 확인할 수 있게 한다. 형광 이미징 기법을 적용한 장치로서, 공초점 레이저 현미경이 있다. 그러나, 형광 이미징 기술은 세포 내에 형광 유전자나 형광 마커와 같은 이물질이 도입되어 세포 그 자체의 자연스런 상태가 아닌 인위적인 상태에서 이미징을 한다는 단점이 있다. 또한 형광 이미징을 통해 특정 분자를 검출하기 위해서는 소정 농도 이상이 세포 내에 존재하여야 가능하다. 따라서 농도가 낮은 분자들은 마커를 부착하거나 유전자 조작을 하여도 그 3차원 분포를 확인할 수 없다. 또한, 형광 이미지를 보는 것이기 때문에 마커에 대상 분자가 부착되어 있는지 여부를 확인할 수 없다.
특정 분자의 농도가 낮은 경우 사용될 수 있는 방법으로는 세포에 과자극을 주어서 과발현(overexpression) 시키거나 DNA나 RNA의 경우 복제 증폭을 통해 분자의 농도를 높인 이후 측정을 하는 방법이 있다. 통상적으로 사용되는 방법으로서, 세포에 특정한 과자극을 주어 처리를 한 후 처리를 하지 않은 대조군과 동시에 배양을 하여 숫자를 늘리고 이를 분리한 후 세포 파괴(cell lysis)를 시킨 후 원심분리하여 전기영동 (gel electrophoresis)이나 질량분석기 (mass spectroscope)를 사용하여 어떤 분자들이 증가하고 감소했는지 비교하는 방법이 있다. 그러나, 이러한 방법은, 시간이 많이 소요되고 고가의 시약이 사용된다. 또한 세포를 사멸시켜 관찰 하기 때문에 연속 관찰이 어렵다. 더불어 과도한 자극을 주어야만 측정할 수 있는 분자가 있어서 분자 발현량에 차이가 날 수 있다.
상기한 광학적 방법 및 생화학적 방법 이외의 세포 이미징 방법으로서, 전자주사 현미경(SEM: Scanning Electron Microscope), 전자투과 현미경(TEM: Transmission Electron Microscope), 원자력간 현미경(AFM: Atomic Force Microscope) 및 주사형 터널 현미경(STM : Scanning Tunneling Microscope) 등을 이용하여 세포나 소기관의 구조와 구성 분자를 연구하는 방법이 있다.
전자주사 현미경은 전자선이 시료면 위를 주사(scanning)할 때 시료에서 발생되는 여러 가지 신호 중 그 발생확률이 가장 많은 이차전자(secondary electron) 또는 반사전자(back scattered electron)를 검출하는 것으로 대상 시료를 관찰한다. 그러나, 전자주사 현미경의 경우, 분자를 이미징하기 어렵고, 시편을 동결한 후 원자번호가 높은 금속물질로 코팅을 해야 하는 단점이 있다.
전자투과 현미경은 평광한 전자선을 사용하여 시료를 투과시킨 전자선을 전자렌즈로 확대하여 관찰한다. 그러나, 전자투과현미경의 경우 분자를 이미징할 수는 있지만 이미징과 분석시간이 오래 걸리고, 시편을 동결한 후 얇게 썰어야 하는 단점이 있다.
원자력간 현미경은 피라미드 형상의 탐침으로 시료 표면에 접촉하면서 2차원으로 주사하는 현미경이다. 원자력간 현미경의 경우, 무기물이나 금속 시편의 경우 원자 수준의 이미징이 가능하다. 그러나, 물이 75-80%를 차지하고 있는 세포 자체 또는 외부에 배양액이 있는 세포의 경우 분해능이 급격히 악화되는 문제점이 있다. 또한, 원자력간 현미경은 분해능이 좋은 대신 이미징 면적이 아주 좁고, 살아있는 세포의 경우 자발적으로 또는 현미경의 탐침의 영향으로 형상이 변하기 때문에 이미지의 신뢰도가 낮을 수 있다.
주사형 터널 현미경은 주사형 탐침 현미경의 일종으로 터널 전류를 이용하여 시료 표면의 형상을 분석한다. 주사형 터널 현미경의 경우 원자 수준의 이미징이 가능하나 진공에서 작동하기 때문에 수분이 다량 포함되어 있는 세포의 경우 이미징이 불가능하다는 문제점이 존재한다.
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 세포 내의 분자와 각종 소기관 등에 대한 실제적인 이미징을 가능하게 하는 3차원 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다. 또한, 본 발명자들은 세포에 대한 이미징을 함에 있어서 세포에 화학적이거나 물리적인 자극을 주는 것에 의한 왜곡을 방지하고 실제 살아있는 세포의 형상을 이미징할 수 있는 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포 이미징 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포 이미징 장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 세포 이미징 방법을 제공한다:
(a) (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 수득하는 단계;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계.
본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 세포 내의 분자와 각종 소기관 등에 대한 실제적인 이미징을 가능하게 하는 3차원 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다. 또한, 본 발명자들은 세포에 대한 이미징을 함에 있어서 세포의 비조절(uncontrolled) 외부 요인에 의한 영향을 방지하고 실제 살아있는 세포의 형상을 이미징할 수 있는 세포 이미징 방법 및 장치를 개발하였다.
본 발명의 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 고상시편의 준비
본 발명에 따르면, 우선 (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 준비한다.
본 발명은 다양한 세포 및 바이러스에 적용될 수 있으며, 고상시편은 이러한 다양한 세포, 바이러스 및 이를 포함하는 액체를 이용하여 준비한다.
본 발명에 의해 이미징이 가능한 세포는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다.
본 발명에 의해 이미징이 가능한 원핵세포는 박테리아(또는 유박테리아) 및 아키박테리아를 포함한다. 본 발명에 의해 이미징이 가능한 박테리아의 예는 Escherichia coli , Thermus thermophilics, Bacillus subtilis , Bacillus stearothermophilus , Salmonella typhimurium , Pseudomonas, Streptomyces , Staphylococcus , Lactobacillus , Lactococcus 및 Streptococcus를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 의해 이미징이 가능한 아키박테리아의 예는 Methanococcus jannaschii ( Mj ), Methanosarcina mazei ( Mm ), Methanobacterium thermoautotrophicum ( Mt ), Methanococcus maripaludis , Methanopyrus kandleri , Halobacterium , Archaeoglobus fulgidus ( Af ), Pyrococcus horikoshii ( Ph ), Pyrobaculum aerophilum , Pyrococcus abyssi, Sulfolobus solfataricus ( Ss ), Sulfolobus tokodaii , Aeuropyrum pernix ( Ap ), Thermoplasma acidophilum 및 Thermoplasma volcanium를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의해 이미징이 가능한 진핵세포는 균류 세포, 이스트, 식물세포(예컨대, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물 및 앨지) 및 동물세포(예컨대, 포유동물, 곤충, 파충류, 조류)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 이미징이 가능한 동물세포는 인간, 마우스, 래트, 소, 돼지, 말, 양, 토끼, 염소, 조류, 어류 및 곤충의 세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 이미징이 가능한 동물세포는 혈액세포, 면역세포, 줄기세포, 체세포, 성세포, 종양세포, 암세포 및 정상세포를 포함한다.
본 발명에 의해 이미징이 가능한 바이러스는 동물바이러스, 식물바이러스 및 박테리오파아지를 포함하며, 예를 들어, HBV(hepatitis B viris), HCV(hepatitis C viris), HAV(hepatitis A viris), HIV(human immunodeficiency virus), reovirus, Sendai virus, myxovirus, coronavirus, encephalomyelitis virus, rotavirus, cytomegalovirus, measles virus, vaccinia virus, rabies virus, Epstein-Barr virus, rhinovirus, polio virus 및 herpes virus를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상시편의 준비는 (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 냉동하여 실시한다.
본 발명에 따르면, 세포 또는 바이러스 자체를 냉동하여 냉동시편을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 세포를 포함하는 액체 또는 바이러스를 포함하는 액체를 냉동하여 냉동시편을 얻을 수 있다. 세포 또는 바이러스를 포함하는 액체는 세포 또는 바이러스의 배양에 이용되는 배지 또는 생체액을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
냉동시편을 얻기 위한 냉동은 당업계에 공지된 다양한 냉동 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 냉동은 -200℃ 내지 -15℃의 온도범위, -180℃ 내지 -20℃의 온도범위, -150℃ 내지 -35℃의 온도범위, -200℃ 내지 -55℃의 온도범위에서 실시할 수 있다.
예를 들어, 상기 냉동은 고상의 이산화탄소와 알코올의 혼합물 또는 액체 질소에 세포를 함침시켜 실시할 수 있다. 상기 고상의 이산화탄소와 알코올의 혼합물 또는 액체 질소는 컨테이너에 담겨져 있을 수 있다. 상기 컨테이너는 냉동기(freezer)에 직접적으로 위치할 수 있으며, 상기 냉동기는 원하는 온도(예컨대, -35℃ 이하)에 세팅될 수 있다. 냉동기는 프로그램화된 냉동기 또는 속도-조절 냉동기일 수 있다. 상기 냉동시편은 재결정이 발생되는 온도 이하의 온도, 예컨대 순수한 물의 유리전이온도 이하의 온도(예컨대, 135℃)에서 보관할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 냉동은 급속 냉동으로 실시한다. 본 명세서에서 용어 “급속 냉동”은 일반적으로 최대 빙결정 생성대(예컨대, -5℃ 내지 -1℃, 빙결율 80% 이상)를 단시간(예컨대, 30-35분 이내)에 통과하여 빙결정의 크기를 작게 하거나 또는 비결정질 얼음(또는 유리질 얼음)이 생성되도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 냉동시편을 얻기 위한 냉동은 비결정질 얼음이 생성되도록 급속 냉동하는 것으로서, 유리화(vitrification) 동결방법이다. 선택적으로, 급속 냉동을 하는 경우 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 동결보호제를 사용할 수 있다.
고상시편(예컨대, 냉동시편)은 고체이기 때문에, 적합한 이미징 기기 예컨대 AFM 또는 STM을 사용하여 원자/분자 수준까지 세포 이미징이 가능하다. 상온에서는 비정질 얼음이 녹기 때문에 빙점 이하의 저온에서 이미징을 하는 것이 바람직하다. 또한, 상압저온에서 이미징을 할 경우, 공기 중의 습기가 이미징 기기의 저온부에서 동결될 수 있으므로, 습기가 제거된 환경(예컨대, 질소 분위기)에서 이미징을 하는 것이 바람직하다.
(b) 고상시편의 표면 정보 수집
상기 세포를 포함하는 액체 등을 고상화 하여 준비된 고상시편(예컨대, 냉동시편)에 대하여 표면 정보를 수집한다. 표면 정보 수집은 아래에서 상세하게 설명된다.
(c) 고상시편의 표면 제거에 의한 새로운 표면의 형성
고상시편(예컨대, 냉동시편)에 대한 표면 정보를 수집한 다음, 고상시편(예컨대, 냉동시편)에 대한 3차원적인 이미지를 얻기 위하여 고상시편(예컨대, 냉동시편)의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상시편(예컨대, 냉동시편)의 표면 제거는 상기 고상시편(예컨대, 냉동시편)의 표면에 있는 얼음을 승화시켜 실시한다.
물은 생체 환경(예컨대, 세포, 조직, 체액 및 혈액)의 80% 이상을 차지하는데, 상기 고상시편(예컨대, 냉동시편)의 제작과정에서 형성된 얼음, 바람직하게는 비정질얼음을 세포 등의 시편에 손상을 최소화 하면서 제거하여야 한다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 독특하게 고상시편(예컨대, 냉동시편)의 표면에 있는 얼음을 승화시켜 시편의 표면을 제거한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 승화는 삼중점(triple point) 아래의 등온에서 압력을 조절하여 실시한다. 택일적으로, 표면 제거를 위한 승화는 삼중점 아래의 등압에서 온도를 조절하여 실시한다. 상기 승화를 위한 온도 조절은 예컨대, 히터 또는 냉각기를 이용하여 실시할 수 있고, 상기 압력 조절은 진공펌프 또는 콜드 트랩을 이용하여 실시할 수 있다. 물의 상평형도에서, 삼중점 이하의 온도나 압력에서는 고체 얼음 및 기체 수증기만 존재한다. 이때 삼중점 이하에서 압력을 일정하게 유지하면서 온도를 상승하면 고체 상태에서 기체 상태로 액체를 거치지 않고 승화한다. 또한, 삼중점 이하 온도에서 압력을 낮추면 고체 상태에서 기체 상태로 액체를 거치지 않고 승화한다. 이러한 방식으로 고상시편(예컨대, 냉동시편) 표면의 얼음을 승화시켜 제거함으로써, 고상시편(예컨대, 냉동시편)의 표면을 제거하고 표면정보 수집의 대상이 되는 새로운 표면을 형성시킨다.
고상시편(예컨대, 냉동시편)의 포면을 제거할 때 얼음은 승화로 제거되고, 분자량이 거대 분자들이나 세포막이나 소기관 등은 승화되지 않고 잔존한다. 이와 같이 잔존하는 거대 분자들을 이미징하면 이전 표면에 대한 이미징 보다 더 깊은 3차원 이미지를 얻을 수 있다. 그러나, 만일 잔존하는 거대 분자 또는 세포소기관의 깊이가 SPM(Scanning probe microscope)의 탐침보다 깊을 경우 이미징의 한계에 봉착한다. 이 경우, 이미 이미징이 끝난 거대 분자나 세포소기관을 제거하고 후속의 이미징을 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상시편의 표면 제거는 물리적 힘 또는 빔을 이용하여 실시한다. 특히, 세포막 또는 세포내에 있는 거대 분자 또는 세포소기관을 제거하기 위한 표면 제거 시에 물리적 힘 또는 빔을 이용한다.
상기 표면 제거에 물리적 힘이 이용되는 경우, 바람직하게는 SPM(Scanning probe microscope)의 탐침을 이용하여 푸싱(밀거나) 또는 풀링(끌어서)하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 적합한 탐침이 장착된 SPM은 AFM(atomic force microscope), STM(scanning tunneling microscope), BEEM(ballistic electron emission microscope), CFM(chemical force microscope), C-AFM, (conductive atomic force microscope), EFM(electrostatic force microscopy), ESTM(electrochemical scanning tunneling microscope), FMM(force modulation microscope), KPFM(kelvin probe force microscope), MFM(magnetic force microscope), MRFM(magnetic resonance force microscope), NSOM(near-field scanning optical microscope), SNOM(scanning near-field optical microscope), PFM(Piezoresponse Force Microscope), PSTM(photon scanning tunneling microscope), PTMS(photothermal microscope), SECM(scanning electrochemical microscope), SCM(scanning capacitance microscope), SGM(scanning gate microscope), SICM(scanning ion-conductance microscope), SPSM(spin polarized scanning tunneling microscope), SSRM(scanning spreading resistance microscope), SThM(scanning thermal microscope), SVM(scanning voltage microscope), STP(scanning tunneling potentiometry), SHPM(scanning Hall probe microscope), 또는 SXSTM(synchrotron x-ray scanning tunneling microscope)이며, 보다 바람직하게는 AFM 또는 STM이다.
상기 표면 제거에 빔이 이용되는 경우, 바람직하게는 고상시편의 표면 제거는 이온빔, 보다 바람직하게는 원자이온빔을 이용하여 실시한다.
이와 같이 물리적 힘 또는 빔을 이용한 고상시편의 표면 제거는, 승화에 의한 표면 제거 후 잔존하는 세포 내 거대분자, 염색체, 리보좀 또는 세포소기관을 제거하기 위하여 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 이온빔에 의한 표면 제거 후 표면 제거 과정에서 발생하는 전자, 이온, 빛 및 x-선으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1개의 component를 측정하여 제거 대상의 원자 구성비를 분석하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 원자 구성비 분석은 AES(Auger electron spectroscopy) XPS(x-ray photoelectron spectroscopy) 또는 EDX(energy dispersive x-ray spectroscopy)를 이용하여 실시한다.
(d) 고상시편의 표면에 대한 정보 수집
고상시편의 표면에 대한 정보 수집은 탐침을 이용하는 SPM(Scanning probe microscope)을 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. SPM은 마이크로미터 및/또는 나노미터 스케일로 분석대상의 물리적 특성을 측정하는 도구이다. SPM은 탐침(프로브)를 이용하며, 이 탐침은 분석대상의 표면에 매우 근접하여 위치한다. 탐침은 몇 백 마이크로미터 길이 및 0.5-5 마이크로미터의 두께를 가지는 칸티레러 상에 마운팅 될 수 있다. SPM 방법은 Wang et al., Amer. Chem. Soc. Lett., 12:1697-98. 1996; Kim et al., Appl. Surface Sci. 130, 230, 340-132:602-609, 1998; Kobayashi et al., Appl. Surface Sci. 157:228-32, 2000; Hirahara et al., Phys. Rev. Lett. 85:5384-87, 2000; Klein et al., Applied Phys. Lett. 78:2396-98, 2001; Huang et al., Science 291:630-33, 2001; Ando et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12468-72, 2001에 개시되어 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명에의 표면 정보 수집에 이용되는 SPM은 AFM(atomic force microscope), STM(scanning tunneling microscope), BEEM(ballistic electron emission microscope), CFM(chemical force microscope), C-AFM, (conductive atomic force microscope), EFM(electrostatic force microscopy), ESTM(electrochemical scanning tunneling microscope), FMM(force modulation microscope), KPFM(kelvin probe force microscope), MFM(magnetic force microscope), MRFM(magnetic resonance force microscope), NSOM(near-field scanning optical microscope), SNOM(scanning near-field optical microscope), PFM(Piezoresponse Force Microscope), PSTM(photon scanning tunneling microscope), PTMS(photothermal microscope), SECM(scanning electrochemical microscope), SCM(scanning capacitance microscope), SGM(scanning gate microscope), SICM(scanning ion-conductance microscope), SPSM(spin polarized scanning tunneling microscope), SSRM(scanning spreading resistance microscope), SThM(scanning thermal microscope), SVM(scanning voltage microscope), STP(scanning tunneling potentiometry), SHPM(scanning Hall probe microscope), 또는 SXSTM(synchrotron x-ray scanning tunneling microscope)이고, 보다 더 바람직하게는 AFM 또는 STM이고, 가장 바람직하게는 AFM이다.
AFM은 U.S. Pat. No. 5,497,656; Moller et al., Biophys. J., 77:1150-8, 1999; Thundat et al., Scanning Microsc. 6:911-8, 1992; Hansma et al., Nucleic Acids Res., 21:505-12, 1993; Murray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:3811-4, 1993에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표면 정보의 수집은 고상시편의 표면과 탐침 사이에 작용하는 힘(바람직하게는, 반데르발스 힘)을 측정하여 실시한다.
표면 정보 수집에 의해 분석 대상의 세포표면 및 세포내의 상태, 세포표면 및 세포내에 있는 분자나 세포소기관들에 대한 정보(예컨대, 3차원 이미지)를 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c)와 (d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 분석 대상의 세포 또는 바이러스에 대한 3차원 이미지를 얻을 수 있다.
본 발명의 방법은 세포의 내부 및 세포막 표면에 대한 이미지(바람직하게는, 3차원 이미지)를 제공할 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법은 세포막 표면의 수용체, 채널, 세포막 단백질, 세포막 표면 탄수화물, 세포 표면마커, 세포 내부의 세포소기관, 염색체, 단백질(예컨대, 효소, 항체, 항원, 구조 단백질, 호르몬, 성장인자, 혈청 단백질), 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA), 탄수화물 및 지질에 대한 이미지를 제공할 수 있다. 본 발명은 상술한 생체분자들, 특히 단백질의 3차원 구조를 파악할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 바이러스의 내부 및 표면에 대한 이미지(바람직하게는, 3차원 이미지)를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 세포 이미징 장치를 제공한다:
(a) (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단, (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단.
본 발명의 세포 이미징 장치는 아래에서 상세하게 설명된다.
본 발명의 세포 이미징 방법 및 장치를 활용하여 세포를 이미징 하는 활용예를 설명하면 다음과 같다:
본 발명에 따른 세포 이미징 방법 및 장치를 이용하면 세포의 표면 이미지뿐만 아니라 세포 내에 존재하는 다양한 생체분자 및 세포소기관을 이루는 분자, 더 나아가 원자에 대한 정보를 얻을 수 있다. 또한, 생체분자 사이의 상호작용에 대한 정보 및 세포소기관 사이의 유기적 관계를 파악할 수 있다. 실제적으로 냉동시편에는 최소 수천 또는 수만 개 이상의 세포가 포함될 것이므로 각각으로부터 얻어진 정보를 종합하면 세포 내에 포함된 물을 제외한 세포 구조물의 3차원 이미지 획득 및 각 세포 구조물간의 관계를 확인할 수 있다.
예를 들어, 항암제가 세포 내 미토콘드리아에 미치는 영향 및 효과를 본 발명에 따른 세포 이미징 방법 및 장치를 이용하여 확인하는 경우를 살펴보도록 한다. 먼저, 배양된 세포에 항암제 처리를 한다. 항암제 처리된 세포를 포함한 배양액을 급속 냉동하여 비결정질 또는 유리질 얼음의 시편을 생성한다. 냉동시편을 관찰 챔버(표면 측정 수단을 포함하는 챔버) 내에 위치한 상태에서 관찰 챔버 내의 압력 및 온도를 조절하여 얼음을 승화시킴으로써 냉동시편의 표면을 제거한다. 승화를 통해 원하는 정도로 시편의 표면을 제거한 후, 다시 압력을 상승시키거나 온도를 높여 승화를 중단시킨다.
세포 내 미토콘드리아가 관심의 대상이므로, 광학 현미경을 이용하여 세포 내 미트콘드리아의 위치를 확인하고 표면 제거 수단을 이용하여 시편의 표면에 미트콘드리아가 노출되도록 세포막 등의 표면을 제거한다. 이후, 표면 측정수단은 표면의 요철을 관찰하여 시편 표면의 원자 및 형태에 대한 정보를 얻는다. 필요한 경우, 기존의 기술인 형광 마커를 관찰대상인 미토콘드리아에 붙이거나 유전자 조작으로 미토콘드리아가 형광 발현하게 해서 광학 이미징을 추가적으로 할 수도 있다. 냉동 시편의 표면층을 제거하는 과정과 표면 이미지 및 원자 정보 등을 반복 획득함으로써 항암제가 미토콘드리아에 미치는 영향을 확인할 수 있다.
본 발명은 상기한 예 이외에도, 세포에 대한 기초 연구, 병균과 세포의 상호 작용, 세포의 변화, 약품이나 화학물질이 세포에 미치는 영향, 세포의 분화나 복제 등의 연구 등에 광범위하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 시료 내 분석대상의 분석 방법을 제공한다:
(a) 시료를 포함하는 액체를 고상화 하여 고상시편을 준비하는 단계;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계.
본 발명의 방법은 상술한 세포 이미징 방법과 거의 동일하며 단지 분석의 대상이 상이하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명자들은 시료 내 분석대상을 보다 개선된 민감도 및 정확도로 정성적 분석 및 정량적 분석을 할 수 있는 분석 기술 및 장치를 개발하였다.
본 명세서에서 용어 “분석”은 분석대상이 시료 내에 존재하는 지 여부를 판단하는 것(정성적 분석), 시료 내에 분석대상의 양(정량적 분석) 및 시료 내 분석 대상의 구조(구조적 분석)을 모두 포괄하는 의미를 갖는다.
본 발명에 따르면, 우선 시료를 포함하는 액체의 고상시편을 준비한다.
본 발명은 다양한 액상 시료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명이 적용되는 액상 시료는 생물학적 시료, 화학적 시료 및 환경학적 시료를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상시편의 준비는 시료를 포함하는 액체를 냉동하여 실시한다.
표면 정보 수집에 의해 시료 내 분석대상에 대한 정보(예컨대, 3차원 이미지)를 얻을 수 있으며, 이로부터 시료 내 분석대상의 존재 여부(정성적 분석) 및 함량(정량적 분석)을 결정할 수 있다. 또한, 상기 정보로부터 시료 내 분석 대상의 구조, 예컨대 단백질의 3차 구조를 결정할 수 있다. 또한, 상기 정보로부터 시료 내 분석 대상이 다른 물질과 결합하였는지 여부를 결정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c)와 (d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 상기 검출대상의 농도 또는 양을 분석할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (d) 이후에 상기 단계 (d)에서 수집한 표면 정보를 기지(旣知)의 물질에 대한 레퍼런스 표면 정보와 비교하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 시료는 생물학적 시료이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 생물학적 시료는 다양한 생물학적 시료를 포함하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 또는 세포 조직액이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 생물학적 시료 내 분석대상은 단백질(예컨대, 효소, 수용체, 세포막 단백질, 항체, 항원, 구조 단백질, 성장인자, 호르몬, 혈청 단백질, 암 마커), 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, siRNA), 지질, 탄수화물 또는 소분자량 화합물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분석대상은 생물학적 시료 내 서로 상호작용(interaction) 하는 단백질-단백질 복합체이다. 본 발명에 따르면, 단백질들 상호간의 결합 여부를 정확하게 파악할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분석대상은 의약후보물질과 그의 타겟 분자 사이의 복합체이다. 본 발명에 따르면, 의약후보물질과 그의 생물학적 타겟(예컨대, 수용체) 간의 결합 여부를 정확하게 파악할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분석대상은 생물학적 시료 내 질환 마커 물질이며, 보다 바람직하게는 암 마커 물질이다.
종래기술에 따르면, 암 마커는 항원-항체 반응을 이용한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 및 PCR(Polymerase chain reaction) 등을 통하여 검출하고 있다. 그러나 이들 검출 방법은 정확도에도 문제가 있지만, 민감도에서 큰 문제가 있어, 초기 암의 경우에서는 암 마커를 생물학적 시료(예컨대, 혈액)에서 거의 검출할 수 없다. 그러나 본 발명의 경우에는 시료 내에 존재하는 하나의 분자도 검출할 수 있기 때문에, 종래의 방법에 의해 검출되지 않는 암 마커를 검출할 수 있으며, 이에 암 진단에서 획기적인 발전을 가져올 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 시료 내 분석대상의 분석 장치를 제공한다:
(a) 시료를 포함하는 액체의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단, (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 기체시료 내 분석대상의 분석 방법을 제공한다:
(a) 기체시료를 액체시료로 전환시키는 단계;
(b) 상기 액체시료를 고상화 하여 고상시편을 준비하는 단계;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계.
본 발명의 방법은 상술한 세포 이미징 방법과 거의 동일하며 단지 분석의 대상이 기체시료라는 점에서 차이기 있기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
표면 정보 수집에 의해 기체시료 내 분석대상에 대한 정보(예컨대, 3차원 이미지)를 얻을 수 있으며, 이로부터 기체시료 내 분석대상의 존재 여부(정성적 분석) 및 함량(정량적 분석)을 결정할 수 있다. 또한, 상기 정보로부터 시료 내 분석 대상의 구조도 결정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)와 (d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 상기 검출대상의 농도 또는 양을 분석한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (d) 이후에 상기 단계 (d)에서 수집한 표면 정보를 기지(旣知)의 물질에 대한 레퍼런스 표면 정보와 비교하는 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분석대상은 대기 중의 기체, 바이러스, 균류(fungi), 박테리아, 휘발성 화합물(volatile compound) 또는 방사능 물질이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대기는 거리, 병원, 공장, 학교, 공원, 집, 회사 또는 연구실의 대기 또는 운송수단의 배출대기의 대기이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대기는 동물의 날숨이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 기체시료 내 분석대상의 분석 장치를 제공한다:
(a) 고상화된 기체시료의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단, (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 실제적인 세포의 상태를 파악할 수 있는 정보를 제공하는 세포 이미징 방법이다.
(b) 본 발명은 세포의 표면 이미지뿐만 아니라 세포 내에 존재하는 다양한 생체분자 및 세포소기관을 이루는 분자와 원자에 대한 정보를 얻을 수 있다.
(c) 본 발명에 따르면, 세포 내의 생체분자 사이의 상호작용에 대한 정보 및 세포소기관 사이의 유기적 관계에 대한 정보를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 본 발명의 세포 이미징 장치 및 세포 이미징 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 본 발명의 세포 이미징 장치에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따른 본 발명의 세포 이미징 장치에 대한 모식도이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 세포 이미징 방법을 도식화한 도면이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 고상화시켜 고상시편을 제조하기 위한 고상화 수단을 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 고상화 수단은 냉동 수단이다.
본 발명에 따른 세포 이미징을 위하여 분석하고자 하는 세포(12)를 냉동, 바람직하게는 급속 냉동한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 냉동 수단은 급속 냉동 수단이며 급속 냉동 수단은 세포 또는 바이러스의 내부, 외부 또는 표면에 있는 물을 비결정질 얼음으로 생성시킨다.
세포(12) 자체만을 냉동시키는 것이 가능하면 세포 자체만을 냉동시키면 되나, 실질적으로는 세포(12)를 포함한 생체액 또는 배양액을 급속 냉동시키는 경우가 더 많을 것이다. 예컨대, 적혈구나 백혈구 또는 혈소판을 대상으로 하여 세포 이미징을 하고자 하는 경우에는 이들을 포함한 혈장을 급속 냉동시킨다. 또는 세포(12)를 포함하는 배양액을 급속 냉동시킬 수도 있다. 급속 냉동을 통해 냉동 시편(10)을 획득한다. 액상의 물을 급속 냉동하는 경우 결정성 얼음이 되지 않고 유리화 얼음(vitrified ice) 또는 비정질 얼음이 되기 때문에 세포(12)에 대한 손상이 발생하지 않는다. 이에 따라 손상되지 않은 상태의 실제 세포(12)에 대한 관찰이 가능해진다. 세포(12)를 포함한 생체액 또는 배양액을 급속 냉동시킬 때, 상기 생체액 또는 배양액을 페트리디쉬와 같은 형상의 트레이에 담아 급속 냉동시키는 것을 고려할 수 있다.
도 1의 (a)에서 얻어진 급속 냉동된 시편(10)은 도 1의 (b)와 같이 관찰 챔버(20)로 이동시킨다. 관찰 챔버(20) 내부는 빙점 이하로 유지되어 시편(10)의 해동을 방지하는 것이 바람직하다. 또한, 관찰 챔버(20) 내부에 수증기가 존재하는 경우 수증기가 관찰 챔버(20) 내부 또는 이미징을 위한 기기에 동결 부착될 수 있는 바, 관찰 챔버(20) 내부는 수증기가 제거된 상태, 예컨대 질소 분위기로 유지되는 것이 바람직하다.
관찰 챔버(20)의 상부에는 광학 현미경(32)이 구비될 수 있다. 광학 현미경(32)은 세포를 포함한 시편(10)의 광학적 이미지를 취득하는 기능을 수행한다. 또한, 광학 현미경 대신 전자 현미경을 구비하여 시편(10)의 상부 이미지를 취득하는 것도 가능하다. 광학 현미경 또는 전자 현미경을 구비하는 이유는 시편(10)에 대한 이미지를 확인하여 실제 관찰하고자 하는 세포 또는 세포 구조물의 위치를 파악하기 위함이다.
비정질 얼음은 고체 상태이기 때문에 원자력간 현미경(AFM)이나 주사형 터널 현미경(STM)을 이용하여 분자나 원자 수준까지 이미징이 가능하다. 따라서, 바람직하게는 관찰 챔버(20) 내에 시편의 상부 표면을 측정하고 이에 따른 이미지를 생성하기 위한 표면 측정수단(34)이 구비된다. 표면 측정수단(34)은 시편(10)의 표면을 원자 단위까지 측정할 수 있는 주사 프로브 현미경(SPM : Scanning Probe Microscope)이 사용될 수 있으며, 그 중에서도 각기 다른 모드의 원자력간 현미경(AFM)이 사용될 수 있다. 원자력간 현미경은 시편(10)과 탐침(36)의 접촉 유무에 따라, 접촉 모드와 비접촉 모드로 나뉜다. 접촉 모드의 경우 시편(10) 표면과 굴곡을 측정하기 위한 탐침(36) 사이의 인력(반데르발스 힘)을, 비접촉 모드의 경우 척력을 측정함으로써, 시편(10) 표면에 대한 정보를 얻는다. 접촉 모드는 검출 방식의 특성상 시편(10)에 손상을 남길 수 있는데, 이러한 단점을 극복한 방식으로 태핑 모드 원자간력 현미경(Tapping Mode AFM)이 사용될 수 있다. 또한, 표면 측정수단(34)은 주사형 터널 현미경(STM)일 수 있다.
위와 같이 급속 냉동된 세포를 포함한 시편에 대하여 원자력간 현미경 또는 주사형 터널 현미경과 같은 표면 측정수단(34)을 이용하여 이미징을 하는 경우, 세포막에 존재하는 막단백질 또는 수용체와 같은 미소한 세포 구성요소 또는 분자를 이미징할 수 있다. 또한 혈액 속에 극소량 존재하여 기존의 기술로 검출할 수 없었던 암 마커(cancer marker) 등을 이미징하는 것도 가능하다. 또한, 원자력간 현미경이나 주사형 터널 현미경 등을 이용하여 시편 표면을 측정하는 경우, 미소한 3차원 형상을 이미징하는 것도 가능하다.
다만, 이상의 과정에서 얻어진 이미지는 실질적으로는 세포에 대한 3차원 이미지가 아닌 2차원 이미지라고 할 수 있다. 3차원 이미지를 얻기 위해서는 단층 촬영(tomography) 영상을 조합하여 3차원 이미지를 획득하는 것처럼 이미 이미징이 완료된 층을 냉동된 시편(10)에서 제거한 후 다음 층에 대한 이미지를 획득하는 것이 필요하다.
냉동된 시편(10)의 표면을 제거하는 방법으로서, 관찰 챔버(20) 내부의 온도 및 압력을 조절하여 시편(10) 표면의 비정질 얼음을 승화시켜 제거하는 것을 고려할 수 있다. 물의 상평형도에서 삼중점 이하의 온도나 압력에서는 고체 얼음과 기체 수증기만이 존재한다. 따라서, 삼중점 이하에서 압력을 일정하게 유지하면서 온도를 상승시키면 고체 상태의 얼음은 기체 상태의 수증기로 승화한다. 또는 3중점 이하의 온도에서 압력을 낮추면 고체 상태의 얼음은 기체 상태의 수증기로 승화한다. 물론 3중점 이하에서 온도와 압력을 함께 조절하여 고체 상태의 얼음을 수증기로 승화시키는 것도 가능하다. 이러한 방식으로 온도와 압력을 조절하여 냉동된 시편(10)의 표면을 제거할 수 있다. 온도 조절을 위해서는 관찰 챔버(20)에 히터(22) 및 냉각기(24)를 부착한다. 또한, 압력 조절을 위하여 관찰 챔버(20) 내부와 연결된 진공 펌프(30)를 구비한다. 한편, 승화된 수증기를 포함한 관찰 챔버(20) 내 가스를 제거하고 수증기를 포함하지 않은 가스를 공급하기 위하여, 관찰 챔버에는 가스 배출구(28)가 구비되고 질소와 같은 가스를 공급하기 위한 가스 공급구(26)가 구비된다. 일 실시 형태로서, 가스 배출구(28)는 진공 펌프(30)와 연결될 수 있다.
도 1의 (c)는 위와 같은 방법으로 시편(10)의 표면층을 미소한 두께로 제거한 상태를 나타낸다. 도 1의 (c)와 같이 시편 표면(14)을 미소 두께로 제거한 후 광학 현미경(32) 및/또는 표면 측정수단(34)을 이용하여 세포 또는 세포를 구성하는 요소들의 이미지를 획득한다.
그런데, 승화 현상을 이용하여 시편(10)의 표면에 포함된 얼음을 제거하더라도, 세포막이나 세포 내의 각종 소기관 등은 제거되지 않고 시편에 남게 된다. 이를 제거하는 방법으로서, 원자력간 현미경(AFM) 또는 주사형 터널 현미경(STM)의 탐침(36)을 직접 이용하여 이미 이미징이 완료된 세포벽, 세포막, 거대 분자나 세포소기관을 밀거나 당김으로써 제거할 수 있다. 또는 별도의 제거 프로브를 챔버 내에 구비하고 이 제거 프로브를 이용하여 시편의 상부로 돌출된 구조물 등을 제거할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 표면 측정 수단으로서의 탐침이 장착된 SPM은 고상시편의 표면을 물리적 힘으로 제거하기 위한 표면 제거 수단으로 이용된다.
또 다른 방법으로서, 이온빔(40)을 이용하여 돌출된 구조물을 제거하는 것을 고려할 수 있다. 도 1의 (d)는 이온빔(40)을 이용하여 냉동시편 표면의 돌출된 구조물 등을 제거하는 상태를 도시한다.
이온빔(40)을 활용하는 경우 추가적으로 이온빔(40)에 의해 물질을 제거할 때 발생하는 전자, 이온, 빛, 또는 X-ray 등을 분석하여 제거된 물질의 원자 구성비를 분석하는 것도 가능하다. 이를 위해 원자 분석부가 관찰 챔버(20)에 구비된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 냉동시편의 화학적 구성을 수집하기 위한 분광기(spectroscope)를 추가적으로 포함하며, 보다 바람직하게는 AES(Auger electron spectroscope) XPS(x-ray photoelectron spectroscope) 또는 EDX(energy dispersive x-ray spectroscope)를 포함한다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 세포 이미징 장치의 구성을 도시한 도면이다.
본 발명의 세포 이미징 장치는 (a) 고상시편의 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단, (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단; (b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및 (c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단을 포함한다.
본 발명의 장치에서, 상기 온도/압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 다양한 방식으로 배치될 수 있다. 예를 들어, 온도 조절 수단 및/또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 하나의 챔버 내에 위치시킬 수 있다. 또한, 온도 조절 수단 및/또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 상기 고상화 수단(예컨대, 냉동 수단)과는 별도로 하나의 챔버에 위치시킬 수도 있고, 고상화 수단, 온도 조절 수단 및/또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단을 각각 별개의 챔버에 위치시킬 수도 있다.
가장 바람직하게는, 온도 조절 수단 및/또는 압력 조절 수단 및 표면 측정 수단은 고상화 수단(예컨대, 냉동 수단)과는 별도로 하나의 챔버에 위치시킨다. 표면 측정 수단이 위치하는 챔버를 관찰 챔버로 명명한다.
관찰 챔버(20)는 급속 냉동된 세포 또는 세포 포함 생체액이나 배양액의 냉동 시편(10)을 수용한다. 이러한 관찰 챔버(20)는 수증기가 제거된 분위기를 유지하기 위하여 제습된 공기 또는 질소 분위기로 유지시키기 위한 제습 가스 공급부(27)와 연통된 가스 공급구(26)가 일측에 구비된다. 또한, 관찰 챔버(20) 내부 가스를 외부로 배출하기 위한 가스 배출구(28)가 관찰 챔버(20)에 일측, 예컨대 관찰 챔버(20)의 저부에 구비된다. 바람직하게는 관찰 챔버(20)의 중앙부에 냉동 시편(10)을 위치시키기 위한 시편 테이블(38)이 구비될 수 있다.
한편, 관찰 챔버(20)의 온도를 조절하기 위한 온도 조절수단(23)이 관찰 챔버(20)에 구비되는데, 온도 조절수단(23)은 냉각부(24)와 가열부(22)를 포함하여 관찰 챔버(20) 내부의 온도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또한 관찰 챔버(20)는 압력 조절수단(30)이 연결되어 관찰 챔버(20)의 압력을 조절한다. 일 실시예에 있어서 상기 압력 조절수단(30)은 진공 펌프로 구성될 수 있다.
이러한 구성에 의하여 관찰 챔버(20)의 내부에 냉동 시편(10)을 위치시킨 상태에서, 관찰 챔버(20)의 온도와 압력을 조절하여 냉동 시편(10)의 해빙을 방지할 수 있다. 한편, 관찰 챔버(20)의 온도와 압력이 3중점 이하로 유지된 상태에서 온도 또는 압력을 조절하여 냉동 시편(10)의 상부 얼음을 수증기로 승화시켜 제거할 수 있다. 승화된 수증기를 포함한 관찰 챔버(20) 내부 가스는 가스 배출구(28)를 통해 배출되고, 가스 공급구(26)를 통해 제습된 가스를 다시 관찰 챔버(20) 내부로 공급한다.
관찰 챔버(20)에는 표면 측정수단(34)이 구비되는데, 표면 측정수단(34)은 원자력간 현미경 또는 주사형 터널 현미경일 수 있다. 원자력간 현미경 또는 주사형 터널 현미경의 탐침은 관찰 챔버(20) 내부에 위치하며 냉동시편 상부의 표면을 측정한다. 한편, 상기 탐침은 냉동시편 상부의 표면을 측정하는 외에, 필요시에는 냉동시편 상부의 세포 구조물을 제거하는 용도로 사용되는 것도 가능하다.
영상 처리수단(50)은 표면 측정수단(34)의 탐침(26)에 의해 측정된 냉동시편(10)의 표면 정보를 처리하여 시편(10)의 표면에 대한 2차원 이미지를 생성한다. 바람직하게는 영상 처리부(50)는 시각 디스플레이 장치(미도시)와 연결되어 처리된 2차원 이미지를 디스플레이한다. 한편, 표면 측정수단(34)에 의해 획득된 정보는 미소한 깊이 정보를 갖는 3차원 이미지일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 실시에 있어서 냉동 시편(10)의 상부 얼음을 승화시키거나, 세포 구조물을 제거한 이후 새로운 층에 대한 이미지를 획득할 수 있다. 이렇게 반복하여 얻은 냉동시편(10)에 대한 복수의 층별 이미지를 조합하여 영상 처리수단(50)은 세포 또는 세포를 구성하는 요소들에 대한 3차원 이미지를 형성한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
10: 냉동시편(고상시편) 12: 세포
14: 고상시편 표면 20: 관찰 챔버
22: 히터 23: 온도조절수단
24: 냉각부 26: 가스 공급구
27: 가스공급부 28: 가스배출구
30: 진공 펌프(압력 조절수단) 32: 현미경
34: 표면 측정수단 36: 탐침
38: 시편 테이블 40: 이온빔
50: 영상 처리수단 100: 세포이미징 장치
14: 고상시편 표면 20: 관찰 챔버
22: 히터 23: 온도조절수단
24: 냉각부 26: 가스 공급구
27: 가스공급부 28: 가스배출구
30: 진공 펌프(압력 조절수단) 32: 현미경
34: 표면 측정수단 36: 탐침
38: 시편 테이블 40: 이온빔
50: 영상 처리수단 100: 세포이미징 장치
Claims (20)
- 다음 단계를 포함하는 세포 이미징 방법:
(a) (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 준비하는(prepare) 단계;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 수집하는 단계;
(c) 상기 고상시편의 표면을 제거하고 새로운 표면을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 고상시편의 새로운 표면에 대한 표면 정보를 수집하는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 상기 고상시편의 준비는 (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 냉동하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 냉동은 급속 냉동으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 급속 냉동은 비결정질 얼음이 생성되도록 실시하는 것을 특징을 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 고상시편의 표면 제거는 상기 고상시편의 표면에 있는 얼음을 승화시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 승화는 삼중점 아래의 등온에서 압력을 조절하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 승화는 삼중점 아래의 등압에서 온도를 조절하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 고상시편의 표면 제거는 물리적 힘 또는 빔을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제 8 항에 있어서, 상기 빔에 의한 표면 제거 후 표면 제거 과정에서 발생하는 전자, 이온, 빛 및 x-선으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1개의 component를 측정하여 제거 대상의 원자 구성비를 분석하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 표면 정보의 수집은 탐침을 이용하는 SPM(Scanning probe microscope)을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)와 (d)를 반복하는 단계를 추가적으로 포함하며 상기 반복에 의해 상기 세포 또는 바이러스의 3차원 이미지를 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 세포 내부 및 세포막 표면에 대한 이미지를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 방법은 세포막 표면의 수용체, 채널, 세포막 단백질, 세포막 표면 탄수화물, 세포 표면마커, 세포 내부의 세포소기관, 염색체, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질에 대한 이미지를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음을 포함하는 세포 이미징 장치:
(a) (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체의 고상시편을 고상으로 유지하기 위한 (i) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단, (ii) 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단 또는 (iii) 온도를 조절하기 위한 온도 조절 수단과 압력을 조절하기 위한 압력 조절 수단;
(b) 상기 고상시편의 표면 정보를 취득하는 표면 측정 수단; 및
(c) 상기 표면 측정 수단에서 취득된 표면 정보를 처리하여 상기 시편에 대한 이미지를 생성하는 영상 처리 수단.
- 제 15 항에 있어서, 상기 장치는 (i) 세포, (ii) 바이러스, (iii) 세포를 포함하는 액체 또는 (iv) 바이러스를 포함하는 액체를 고상화시켜 고상시편을 제조하기 위한 고상화 수단을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 15 항에 있어서, 상기 장치는 고상시편의 표면을 물리적 힘으로 제거하기 위한 수단 또는 빔 발생장치를 표면 제거 수단을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 15 항에 있어서, 상기 표면 측정 수단은 탐침이 장착된 SPM(Scanning probe microscope)인 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 15 항에 있어서, 상기 장치는 광학현미경 또는 전자현미경을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제 18 항에 있어서, 상기 표면 측정 수단으로서의 탐침이 장착된 SPM은 고상시편의 표면을 물리적 힘으로 제거하기 위한 표면 제거 수단으로 이용되는 것을 특징으로 하는 장치.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20120073417A KR101440571B1 (ko) | 2012-07-05 | 2012-07-05 | 세포 이미징 방법 및 장치 |
| EP13813681.7A EP2871242A4 (en) | 2012-07-05 | 2013-07-05 | CELL IMAGING METHOD AND DEVICE |
| PCT/KR2013/006011 WO2014007585A1 (ko) | 2012-07-05 | 2013-07-05 | 세포 이미징 방법 및 장치 |
| US14/412,918 US9632017B2 (en) | 2012-07-05 | 2013-07-05 | Method and apparatus for imaging cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20120073417A KR101440571B1 (ko) | 2012-07-05 | 2012-07-05 | 세포 이미징 방법 및 장치 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140005620A KR20140005620A (ko) | 2014-01-15 |
| KR101440571B1 true KR101440571B1 (ko) | 2014-09-17 |
Family
ID=49882273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR20120073417A KR101440571B1 (ko) | 2012-07-05 | 2012-07-05 | 세포 이미징 방법 및 장치 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9632017B2 (ko) |
| EP (1) | EP2871242A4 (ko) |
| KR (1) | KR101440571B1 (ko) |
| WO (1) | WO2014007585A1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170084706A (ko) | 2016-01-12 | 2017-07-20 | 한밭대학교 산학협력단 | 액상 용매 내 존재하는 고분자 용질 물질의 3차원 이미지를 생성하는 장치 및 방법 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109900764B (zh) * | 2019-03-29 | 2020-08-18 | 西安交通大学 | 一种用于seccm的微环境控制平台及其扫描方法 |
| KR102277511B1 (ko) * | 2019-11-19 | 2021-07-15 | 울산과학기술원 | 급속 정밀 냉각과 연계하여 세포의 신호를 측정할 수 있는 세포 실험 방법, 장치, 및 시스템 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040140427A1 (en) | 2001-03-22 | 2004-07-22 | Korchev Yuri Evgenievich | Patch-clamping and its use in analysing subcellular features |
| KR20110079516A (ko) * | 2009-12-30 | 2011-07-07 | 한국기초과학지원연구원 | 다이아몬드쏘를 활용한 나노/바이오 시료의 ｃｒｙｏ 시편 준비방법 및 처리장치 |
| US20110182494A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-07-28 | Clarkson University | Method Of Identification Of Cancerous And Normal Cells |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2459218C3 (de) * | 1974-03-29 | 1978-09-07 | C. Reichert Optische Werke Ag, Wien | Vorrichtung zum Transferieren eines tiefgekühlten Präparatschnittes von einem Mikrotom o.dgl. zu einem Mikroskop, insbesondere Elektronenmikroskop |
| US4967825A (en) * | 1988-07-08 | 1990-11-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | High resolution replicas |
| JPH0642953A (ja) | 1992-07-24 | 1994-02-18 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 原子間力顕微鏡 |
| DE10258104B4 (de) * | 2002-12-11 | 2005-11-03 | Leica Mikrosysteme Gmbh | Präparathalter mit Entnahmehilfe für die Mikrotomie und die AFM-Mikroskopie |
| US8941057B2 (en) | 2007-09-05 | 2015-01-27 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Probe and method for obtaining three-dimensional compositional maps of a biological sample |
| EP2416165A1 (en) * | 2010-08-04 | 2012-02-08 | FEI Company | Method of forming a 3D reconstruction of a sample using a scanning probe microscope |
-
2012
- 2012-07-05 KR KR20120073417A patent/KR101440571B1/ko active IP Right Grant
-
2013
- 2013-07-05 EP EP13813681.7A patent/EP2871242A4/en not_active Withdrawn
- 2013-07-05 US US14/412,918 patent/US9632017B2/en active Active
- 2013-07-05 WO PCT/KR2013/006011 patent/WO2014007585A1/ko active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040140427A1 (en) | 2001-03-22 | 2004-07-22 | Korchev Yuri Evgenievich | Patch-clamping and its use in analysing subcellular features |
| KR20110079516A (ko) * | 2009-12-30 | 2011-07-07 | 한국기초과학지원연구원 | 다이아몬드쏘를 활용한 나노/바이오 시료의 ｃｒｙｏ 시편 준비방법 및 처리장치 |
| US20110182494A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-07-28 | Clarkson University | Method Of Identification Of Cancerous And Normal Cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 권은영, "원자력 현미경을 이용한 살아있는 세포의 기계적 특성 연구", 연세대학교 석사학위논문(2006) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170084706A (ko) | 2016-01-12 | 2017-07-20 | 한밭대학교 산학협력단 | 액상 용매 내 존재하는 고분자 용질 물질의 3차원 이미지를 생성하는 장치 및 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20150160114A1 (en) | 2015-06-11 |
| WO2014007585A1 (ko) | 2014-01-09 |
| KR20140005620A (ko) | 2014-01-15 |
| EP2871242A4 (en) | 2016-03-02 |
| US9632017B2 (en) | 2017-04-25 |
| EP2871242A1 (en) | 2015-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Plitzko et al. | Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes | |
| US8394625B2 (en) | Lab-on-a-pipette | |
| US20070210253A1 (en) | Methods for SEM inspection of fluid containing samples | |
| Amarouch et al. | AFM and FluidFM technologies: recent applications in molecular and cellular biology | |
| KR101440571B1 (ko) | 세포 이미징 방법 및 장치 | |
| Smith et al. | Liquid-phase electron microscopy imaging of cellular and biomolecular systems | |
| Heiligenstein et al. | HPM live μ for a full CLEM workflow | |
| Kiyoi | Bone resorption activity in mature osteoclasts | |
| Winey et al. | Cytological analysis of Tetrahymena thermophila | |
| Di Bucchianico et al. | Atomic force microscope nanolithography on chromosomes to generate single-cell genetic probes | |
| IWABUCHI et al. | Atomic force microscope-based dissection of human metaphase chromosomes and high resolutional imaging by carbon nanotube tip | |
| Kolovou et al. | A new method for cryo-sectioning cell monolayers using a correlative workflow | |
| de Boer et al. | Correlative Light-and Electron Microscopy in Peroxisome Research | |
| McEwen et al. | Using electron microscopy to understand functional mechanisms of chromosome alignment on the mitotic spindle | |
| Guérin et al. | It's a small, small world: A brief history of biological correlative microscopy | |
| US10740948B2 (en) | Apparatus and method for generating three-dimensional image of polymer solute substance which exists in liquid solvent | |
| Panté | Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies | |
| Polito et al. | Human solid tumors: cytogenetic techniques | |
| John Morgan et al. | X-ray microanalysis techniques | |
| Nolin et al. | Targeted nano analysis of water and ions in the nucleus using cryo-correlative microscopy | |
| Allen et al. | Scanning electron microscopy of nuclear structure | |
| Yamanaka et al. | AFM picking-up manipulation of the metaphase chromosome fragment by using the tweezers-type probe | |
| Kiseleva et al. | Imaging yeast NPCs: from classical electron microscopy to Immuno-SEM | |
| KR101362076B1 (ko) | 주사 탐침 현미경을 이용하는 전기 천공법 및 전기 천공 장치 | |
| Zabeo et al. | Exosomes purified from a single cell type have diverse morphology and composition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |