WO2014007074A1 - 核酸抽出用キット及び核酸抽出装置 - Google Patents

Abstract

　クロスコンタミネーションの可能性を低減した核酸抽出装置部および核酸増幅機能、検出機能を有する遺伝子解析装置を提供する。　カオトロピック剤存在下でシリカコーティングされた磁性ビーズを用いた核酸抽出用キットであって、内部に磁石４４を収容する磁石カバー部５２であり、磁石４４と反応容器２とを互いに仕切る、磁石カバー部５２と、磁石カバー部５２の少なくとも一部を反応容器に収容した状態で反応容器２の外側を覆う壁部５３と、磁石カバー部５２の少なくとも一部を反応容器２に収容した状態で反応容器２の上方を覆う壁部５３と、を備えることで、液体及びエアロゾルの飛散を防止し、クロスコンタミネーションの可能性を低減できる。

Description

核酸抽出用キット及び核酸抽出装置

　本発明は、細胞、細菌、ウイルス等を含む試料から、磁性ビーズまたは磁化可能なビーズを用いて核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）やタンパク質等の生物学的分子に対して、抽出、分離、精製等（以下、抽出とする）に関連する各種処理を実行する核酸抽出装置の核酸抽出用キット、および核酸抽出装置に関する。

　血液、血漿、組織片などの生物学的試料から核酸などの生物学的分子を抽出することは、生物学、生化学、医学などの生命現象の研究だけでなく、診断や農作物の品種改良、食品検査といった産業において検査物質を得るための基本的で重要な操作である。特に核酸の検査はＤＮＡやＲＮＡを増幅できるＰＣＲ（Polymerasechain reaction）法が普及しているため、ＰＣＲ法で増幅可能な精製された核酸を抽出する要求は高まっている。さらにＰＣＲ法の他にも、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法、３ＳＲ（self-sustained sequence replication）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplification）法、Qbeta replicase amplification法、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification）法など様々な核酸増幅法が開発されたことから、核酸検査の応用範囲は広がってきており、生物学的試料から核酸を抽出する要求はますます高まっていくと考えられている。

　生物学的試料からＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を抽出する方法として、フェノール／クロロホルム抽出法が知られている。しかしこの方法は有害な有機溶剤の使用や煩雑な操作から作業者の負担が大きいものであった。そこで、上記問題点を解決するためにカオトロピック剤の存在下でシリカやガラス繊維などと核酸が結合する性質を利用した方法（例えば非特許文献１）が提案され、核酸抽出を行う自動装置も開発された（例えば特許文献１）。

特表２００３－５０４１９５号公報 特開２００４－３３７１３７号公報

Boom, R.，Sol，C. J. A. Salimans，M. M. M.，Jansen，C. L.，Wertheimvan Dillien，P. M. E.，and van der Noordaa，J.，J. C1in. Microbiol.，28，495-503 (1990)

　自動装置で通常実施されている核酸抽出の流れは以下の（１）～（６）の通りである。（１）カオトロピック剤や界面活性剤を含む溶液によって細胞を破砕し、溶液中に核酸を溶出させる。（２）シリカを表面にコーティングした磁性ビーズ（磁性シリカ粒子）を溶液に加え、混合することにより、粒子表面に核酸を吸着させる。（３）反応容器の外部から磁石を接近させ、磁性ビーズを反応容器に捕捉しつつ、タンパク質などの不要物を含む溶液をポンプなどを使用して除去する。（４）反応容器に洗浄液を加え、不要物を溶液中へ移動させる。（５）再び反応容器の外部から磁石を接近させ、磁性ビーズを反応容器に捕捉しつつ、不要物を含む溶液を除去する。（６）洗浄液除去後、磁性ビーズを減菌水または低塩濃度のバッファーを加え、磁性ビーズ表面から核酸を溶離させる。

　上記（１）から（６）の工程での問題点は、ポンプなどに接続された液体吸引ラインにより細胞破砕に用いられる溶液や洗浄液を完全に除去することが難しいことである。細胞破砕に用いられる溶液に含まれるカオトロピック剤や界面活性剤、洗浄液に含まれるエタノールやイソプロパノールなどの薬剤は、ＰＣＲ法などの後に続く酵素反応を阻害する。そのため、なるべく除去することが望まれるが、排除後も同じ反応容器を使うため残存液が次の工程に持ち込まれてしまう問題があった。また、除去効率を上げようとするあまり磁性ビーズも排除してしまう問題が起こることもあった。

　この問題を解決するため、磁性ビーズを捕捉するための磁石を反応容器の外側に配置する方法や、磁石を液体吸引のための管の外側に配置する方法、カバーで覆われた集磁構造を反応容器の内側に配置させて磁性ビーズを捕捉し、磁力体を別の反応容器へ移動させ、磁力を遮断したり弱めたりすることで新しい反応容器へ磁性ビーズを移動させて、実質的に溶液の交換を行う方法（特許文献２）が提案されている。

　検査物質として生物学的試料から抽出した核酸は多くの場合、増幅反応の後に検出されるため、核酸抽出工程中の試料間のクロスコンタミネーションが極めて低いことが要求される。従来の核酸抽出自動化装置では、反応容器が開口しており、かつ試料を吸着した磁性ビーズを容器間で移動する時に遮蔽物が無いため、クロスコンタミネーションの可能性を排除できない問題があった。

　本発明の目的は、同一装置内に架設されている核酸抽出用試料のコンタミネーションの可能性を低減した、核酸抽出用キット及び核酸抽出装置を提供することである。

　上記課題を解決する核酸抽出用キットは、カオトロピック剤存在下でシリカコーティングされた磁性ビーズを用いた核酸抽出用キットであって、内部に磁力体を収容する磁力体収容部であり、磁力体と反応容器とを互いに仕切る、磁力体収容部と、磁力体収容部の少なくとも一部を反応容器に収容した状態で反応容器の外側を覆う外壁と、磁力体収容部の少なくとも一部を反応容器に収容した状態で反応容器の上方を覆う蓋部と、を備えている。

　本発明に係る核酸抽出用キットにより、反応容器付近における試料または試料を含む液体およびエアロゾルの飛散を防止し、同一装置内に架設されている核酸抽出用試料のコンタミネーションの可能性を低減する。

本発明を適用した磁力体カバーの斜視図及び平面図である。 磁力体カバーと反応容器の模式図である。 反応容器に液体が存在する場合の、磁力体カバーと反応容器の模式図である。 磁力体カバーに磁力体棒が格納され磁性ビーズを捕捉している模式図である。 磁性ビーズを捕捉している場合の磁力体カバーと磁力体棒の模式図である。 本発明を適用した遺伝子解析装置全体の一例を模式的に示す斜視図である。 反応容器の斜視図である。 反応容器の平面図である。 磁力体カバー着脱機構と反応容器を模式的に示す斜視図である。 磁力体カバー着脱機構と反応容器を模式的に示す上面図である。 ノズルの平面図である。 ディスポーザブルチップの平面図である。 磁力体棒の平面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において反応容器に各種液体を分注する段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において反応容器に磁性ビーズを分注する段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において磁性ビーズを捕捉する段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において磁性ビーズを移動する段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において捕捉した磁性ビーズを取り外す段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において捕捉した磁性ビーズを取り外す段階のノズルとカバー着脱機構を示す要部斜視図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において磁性ビーズを捕捉する段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において磁性ビーズを溶離液に移動する段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において磁性ビーズを溶離液に浸漬する段階を示す反応容器の断面図である。 本発明を適用した核酸抽出方法において溶離液中の磁性ビーズを回収する段階を示す反応容器の断面図である。 核酸抽出装置部の実施内容の動作の流れ図である。 ノズルから磁力体カバーを取り外す際の動作の流れ図である。 ノズルに磁力体カバーを取り付ける際の動作の流れ図である。 反応容器の斜視図である。 一体型容器の異なる二方向からの平面図である。 一体型容器を反応容器と磁力体カバーに分離する段階の噛み合わせ部を示す斜視図である。 一体型容器を反応容器と磁力体カバーに分離する際の動作の流れ図である。 反応部を磁力体カバーで閉栓した一体型容器を示す平面図である。

　以下、本発明に係る磁力体カバーおよびこれを用いた核酸抽出装置部、核酸抽出方法について、図面を参照して詳細に説明する。

　図１（Ａ）は、本発明を適用した磁力体カバー（核酸抽出用キット）の実施形態を示す斜視図（Ａ）であり、図１（Ｂ）はその平面図である。磁力体カバー５１は磁石カバー部５２と壁部５３を有し、これらが上部５４で連結した構造である。また磁力体カバー５１は上部外側にフリンジ部５５を有する。磁石カバー部５２と壁部５３との間は、空洞となっており、この間に反応容器２を収容することができる。

　図２は、磁力体カバー５１の磁石カバー部５２が反応容器２内に存在している場合について模式的に示したものである。磁力体カバー５１の磁石カバー部５２が反応容器２内に存在している際には、磁石カバー部５２と壁部５３との間に反応容器２が入り込む。磁力体カバー５１及び反応容器２をこのような構造とすることで、図３に模式的に示す通り、磁力体カバー５１が反応容器２内の液体７１と接触する際に発生する可能性のある、液滴７２や反応液のエアロゾル７３の飛散を壁部５３及び上部５４によって遮蔽し、隣接する核酸抽出用試料へのコンタミネーションを防止することが可能となる。なお、後述するが、核酸抽出を行うために、複数の反応容器が隣接して設けられている。

　図４は、磁力体カバー５１の磁石カバー部５２が磁性ビーズ８１を捕捉した状態で反応容器２の反応容器２の外側に存在する場合について模式的に示したものである。磁力体カバー５１の壁部５３は磁石カバー部５２より長さが長い構造を有する。このような長さの関係の構造とすることで、図５に模式的に示す通り、磁力体カバー５１の磁石カバー部５２が磁性ビーズ８１を捕捉した状態で反応容器２の外側に存在する場合に発生の可能性のある、液滴７２や反応液のエアロゾル７３の飛散を壁５３によって遮蔽し、隣接する核酸抽出用試料へのコンタミネーションを防止することが可能となる。

　図１では磁石カバー部５２と壁部５３が上部５４で連結した例が示されているが、磁力体カバー上部５４における液体及びエアロゾルの飛散を防止できれば良く、磁力体カバー５１の磁石カバー部５２と壁部５３は一体型でなくてもよい。

　図１では、磁石４４、磁石支持体４５、及び磁石カバー部５２の断面が円形である例を示したが、磁石４４、磁石支持体４５、及び磁石カバー部５２の断面は多角形でも構わない。また、図１では磁石４４及び磁石支持体４５、及び磁石カバー部５２の断面が相似形の場合を示したが、必ずしも相似形に限定されるものではない。

　図１では、磁石４４、磁石支持体４５、及び壁部５３の断面が円形である例を示したが、磁石４４、磁石支持体４５、及び壁部５３の断面は多角形でも構わない。また、図１では磁石４４及び磁石支持体４５、及び壁部５３の断面が相似形の場合を示したが、必ずしも相似形に限定されるものではない。

　磁力体カバー５１はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどの樹脂を使用して作製することができる。

　さて、本発明の磁力体カバー５１を有する核酸抽出装置部１０１は、図６に示すように、載置台１の一面に、核酸増幅調製部１０２、核酸増幅反応検出部１０３とともに設置される。

　核酸抽出装置部１０１は、図６に示すように、載置台１の一面における所定の位置に複数の反応容器２を取り付け、反応容器２を用いて生物学的試料に対して様々な処理を実施するものである。核酸抽出装置部は、複数の試薬瓶を収容できる試薬ラック３と、処理対象の生物学的試料を充填した試料容器を収容できる検体ラック４と、複数の磁力体棒を収容した磁力体棒ラック５と、複数の磁力体カバーを収容したカバーラック６と、複数のディスポーザブルチップを収容したチップラック７と、廃棄物を捨てるための廃棄物用容器８と、載置台１の一面に対向する位置において移動自在に配置されたノズル機構９と、ノズル機構９の移動及び位置決めを制御する駆動制御装置１０とを備えている。また、図示しないが、核酸抽出装置部は、処理条件や生物学的試料に関する情報、その他の各種情報を入力するためのコンピュータを備えている。

　ここで、生物学的試料とは、特に限定されないが、ヒトを含む動物から採取された血液、血漿、血清、組織片、体液及び尿といった生体試料；動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞といった細胞；細菌、真菌及び藻類等の微生物；ウイルス（ウイルス感染細胞を含む）を包含する意味である。また、生物学的試料とは、これら細胞、微生物及びウイルスを培養した培養液、これら細胞、微生物及びウイルスを懸濁した懸濁液を含む意味である。また、これら生物学的試料には、核酸抽出装置による分離抽出や精製の対象となる生物学的分子が含まれている。ここで、生物学的分子とは、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、酵素や抗体等のタンパク質、ペプチド断片を意味する。なお、核酸抽出装置は、分離抽出や精製の対象を核酸やタンパク質、ペプチド断片に限定するものではなく、細胞や微生物が生成する化合物（有機化合物や低分子化合物を含む）を生物学的分子として分離抽出や精製の対象とすることができる。

　核酸抽出装置部において反応容器２は、図７と図８に示すように、各種試薬を分注するための複数の反応部２ｌａ～２ｌｄが並んだ形状を有している。複数の反応部２ｌａ～２ｌｄは、所定の容積となるように窪み部として形成されている。なお、本例では、反応部２１ｄは、反応部２１ａ～２ｌｃの容積よりも小となるように、深さの浅い反応部として形成されている。なお、反応容器２において、反応部の数及び各反応部の容積は特に限定されず、生物学的試料に対する処理の内容に応じて適宜設定することができる。また、核酸抽出装置部には、生物学的試料に対する処理の内容に応じて、反応部の数や各反応部の容積が異なる種類の反応容器２を取り付けることができる。

　反応容器２は、反応部２１ａ～２１ｄの周囲は空間であり、磁力体カバー５１の壁部５３が入り込むことができる。反応容器２のこの形状により、液滴７２や反応液のエアロゾル７３の飛散を壁部５３によって遮蔽し、隣接する核酸抽出用試料へのコンタミネーションを低減する効果がある。

　反応容器２は、図２７に示すように、反応部外側に、反応部開口端より高い位置まで、反応容器の底面に接続した保護壁を有してもよい。反応容器２のこの形状により、磁力体カバー５１が反応部間を移動する際に発生する可能性のある、液滴７２の反応部間への落下や反応液のエアロゾル７３の飛散を遮蔽し、隣接する核酸抽出用試料や次回以降の核酸抽出用試料へのコンタミネーションを低減する効果がある。

　またメーカは、図２８で示すように、反応容器２と磁力体カバー５１の一体型容器９１を提供することも可能である。一体型容器９１では、反応容器２と磁力体カバー５１を一体化するための噛み合わせ部９２a～９２ｂと、反応部２１を閉栓するためのシール部９３を備えている。図２８では反応部２１ｂと磁力体カバー５１が噛み合った例を示すが、磁力体カバー５１を配置する反応部は反応部２１ｂに限定されない。また、噛み合わせ部９２は図２８に示すものとは異なる数や形状も可能である。
一体型容器９１の場合は、カバーラック６に、磁力体カバー５１の開口部が複数のノズル３１の先端部の中心間隔と等しくなるよう、一体型容器９１を配置することもできる。
反応容器２と磁力体カバー５１を一体型容器９１として提供する効果として、使用消耗品数削減によるユーザ作業の簡便性向上と、反応容器２廃棄時に閉栓することによるコンタミネーション低減がある。

　図７及び図２８では反応部２１ａ～２１ｄの断面が円形である例を示したが、反応部２１ａ～２１ｄの断面は多角形や楕円形でも構わない。楕円形の場合の効果として、磁力体カバー５１をカバー着脱機構２３に保持する際のＹ軸方向移動距離の増加がある。

　また、反応容器設置台１１は、複数の反応部２ｌａ～２ｌｄにおける開口端の上方に、ノズル機構９に取り付けられた磁力体カバー５１を保持するためのカバー保持部６１を備えている。

　反応容器設置台１１に備えられるカバー保持部６１はカバー着脱機構２３を有する。図９に示すように、カバー着脱機構２３は断面Ｌ字状の一対の側面６２と、一対の側面６２により所定の高際に位置する、磁力体カバーを保持するための上部押さえ板２４及び下部押さえ板２５を有している。上部押さえ板２４及び下部押さえ板２５は、所定の間隔をもって互いに略平行に配置されている。また、上部押さえ板２４及び下部押さえ板２５には、複数の反応部２ｌａ～２ｌｄのそれぞれに対向し、磁力体カバーの外形寸法に合わせた形状の切り欠き部２６が形成されている。切り欠き部２６は、反応容器２を上方から見たときに反応部２ｌａ～２ｌｄの開口部の内方に臨む位置に端面が位置するように形成されている。反応容器とカバー保持部の平面図を図１０に示す。

　核酸抽出装置部は、複数の反応容器２を設置する場合、各反応容器２に対応する複数のカバー保持部６１を備える。

　また、カバー保持部６１は、カバー着脱機構２３を上下方向（図１２に示したＺ軸方向）に移動、位置決めできるように構成しても良い。この場合、一対の側面６２の互いに対向する面に、上下方向に平行な複数の凹溝を形成し、凹溝に沿ってカバー着脱機構２３を上下方向に移動させることができる。また、この場合、カバー着脱機構２３を一対の側面６２に固定するため、ピン等の固定手段を有していることが好ましい。

　核酸抽出装置部においてノズル機構９は、図１１に示すようなノズル３１を１つあるいは複数備えている。ノズル機構９は、少なくとも反応容器２の数以上の数のノズル３１を備えている。言い換えれば、核酸抽出装置部において、ノズル３１の個数以下の反応容器２を配設することができる。より具体的には、ノズル３１は例えば８連～１２連程度までの並列化が可能である。ノズル３１を並列化することで、単位時間当たりの処理能力（スループット）を向上させることが可能となる。

　ノズル３１は、図示しないが、内部が筒状となっておりポンプ手段等の吸引・吐出駆動装置と接続されている。ノズル３１は、最も小径の先端部３２、先端部３２よりも大径の中途部３３を有している。

　ノズル３１の先端部３２には、図１２に示すディスポーザブルチップ３５及び図１３に示す磁力体棒４１を選択的に装着することができる。ディスポーザブルチップ３５及び磁力体棒４１は、それぞれ基端部の内径がノズル３１の先端部３２とほぼ同径となっており、また先端に向かって小径となるような形状となっている。よって、ディスポーザブルチップ３５及び磁力体棒４１は、基端部からノズル３１の先端部３２を挿入することでノズル３１に嵌め込むことができる。

　また、ディスポーザブルチップ３５は、基端部にフリンジ部３６を有している。磁力体棒４１は、先端に磁石４２を有しており、基端部にフリンジ部４３を有している。

　一方、ノズル３１の中途部３３には、図１に示す磁力体カバー５１を装着することができる。磁力体カバー５１は、磁石カバー部の内径がノズル３１の中途部３３とほぼ同径となっており、また先端に向かって小径となるような形状となっている。よって、磁力体カバー５１は、基端部からノズル３１の中途部を挿入することでノズル３１に嵌め込むことができる。また、磁力体カバー５１は、基端部にフリンジ部５５を有している。

　なお、ディスポーザブルチップ３５及び磁力体棒４１（磁石４２を除く部分）は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどの樹脂を使用して作製することができる。

　なお、ノズル機構９は、図示しないが、先端部３２や中途部３３に取り付けられたディスポーザブルチップ３５、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１を取り外すための取外し機構を備えていることが好ましい。取外し機構としては、例えば、ディスポーザブルチップ３５のフリンジ部３６、磁力体棒４１のフリンジ部４３及び磁力体カバー５１のフリンジ部５５を下方に押し下げる押圧部を採用することができる。

　核酸抽出装置部において試薬ラック３は、複数の試薬瓶を収容できる箱形を呈している。試薬ラック３には、生物学的試料に対して実施する具体的な処理内容によって異なる試薬瓶を収容することができる。例えば、生物学的試料から核酸成分を抽出する処理を実施する場合には、カオトロピック剤を含有する溶液の試薬瓶、洗浄液の試薬瓶、溶離液の試薬瓶等を試薬ラック３に収容することができる。また試薬ラック３には、同種の試薬瓶がノズル機構９に備わった複数のノズル３１の数と同数収容されていてもよい。この場合、同種の試薬瓶は、複数のノズル３１の間隔と合致するように配置される。

　核酸抽出装置部において検体ラック４は、異なる又は同一の生物学的試料を充填した複数の検体チューブを収容できる箱形を呈している。検体ラック４には、複数の検体チューブが複数のノズル３１の間隔と合致するように配置される。

　核酸抽出装置部において磁力体棒ラック５は、図１３に示した複数の磁力体棒４１を収容する複数の開口部を有している。この開口部は、磁力体棒４１の外径よりやや大であり、且つフリンジ部４３よりやや小となる径を有している。また、これら複数の開口部は、複数のノズル３１の間隔と合致するように配置されている。すなわち、複数の開口部の中心間隔が複数のノズル３１の先端部の中心間隔と略等しくなるよう、ノズルと同数又はその倍数の開口部が並列し、複数段にわたってこれら開口部の列が形成されている。

　核酸抽出装置部においてカバーラック６は、図１に示した複数の磁力体カバー５１を収容する複数の開口部を有している。この開口部は、磁力体カバー５１の外径よりやや大であり、且つフリンジ部５５よりやや小となる径を有している。また、これら複数の開口部は、複数のノズル３１の間隔と合致するように配置されている。すなわち、複数の開口部の中心間隔が複数のノズル３１の先端部の中心間隔と略等しくなるよう、ノズルと同数又はその倍数の開口部が並列し、複数段にわたってこれら開口部の列が形成されている。

　核酸抽出装置部においてチップラック７は、図１２に示した複数のディスポーザブルチップ３５を収容する複数の開口部を有している。この開口部は、ディスポーザブルチップ３５の外径よりやや大であり、且つフリンジ部３６よりやや小となる径を有している。また、これら複数の開口部は、複数のノズル３１の間隔と合致するように配置されている。すなわち、複数の開口部の中心間隔が複数のノズル３１の先端部の中心間隔と略等しくなるよう、ノズルと同数又はその倍数の開口部が並列し、複数段にわたってこれら開口部の列が形成されている。

　核酸抽出装置部において廃棄物用容器８は、使用済みのディスポーザブルチップ３５、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１や、処理後の生物学的試料、洗浄液等を廃棄する容器であり箱形を呈している。なお、廃棄物用容器８は、図示しないが、ノズル３１の先端部３２や中途部３３に取り付けられたディスポーザブルチップ３５、及び磁力体カバー５１を取り外すための取外し機構を備えていることが好ましい。取外し機構としては、例えば、ディスポーザブルチップ３５のフリンジ部３６及び磁力体カバー５１のフリンジ部５５に当接し、ノズル３１を上方に駆動することでこれらフリンジ部３６及び５５を下方に押し下げる押圧板を採用することができる。なお、取外し機構は、ノズル機構９及び廃棄物用容器８のうちいずれか一方に備わっていればよい。

　核酸抽出装置部において駆動制御装置１０は、図示しないが、モータ等の動力源、動力源からの動力を伝達するギア機構及びアーム等からなる駆動機構と、上述したノズル機構９を図１２中のＸ軸、Ｙ軸及びＺ軸に沿って移動及びＺ軸を中心として回動させる制御信号を当該駆動機構に出力する制御基板とを備えている。なお、制御基板には、図示しないコンピュータで操作者が設定した各種条件が入力される。

　以上のように構成された核酸抽出装置部は、生物学的試料に対する様々な処理を実施することができる。以下では、生物学的試料から核酸成分を抽出する処理を実施する形態を例として核酸抽出装置部を説明する。具体的には、核酸抽出装置部は、核酸及びその他の不純物を含有する試料にカオトロピック剤存在下でシリカコーティングされた磁性ビーズを混合し、当該磁性ビーズの表面へ核酸を吸着させ、核酸を吸着した磁性ビーズを分離し、洗浄した後に磁性ビーズから核酸を溶離する核酸抽出を実施する。

　核酸抽出装置部の実施内容を、動作の流れ図として図２４に示す。なお、全ての溶液及び検体の分注が終わったら、ディスポーザブルチップ３５廃棄ステップから、磁力体カバー５１取り付けステップへ進む。また、移動先の反応部が無い場合、磁性ビーズ８１捕捉ステップから廃棄物容器８に移動のステップへ移行する。

　より具体的には、先ず、図１４に示すように、反応部２１ａに処理対象の生物学的試料とカオトロピック剤や界面活性剤を含む溶液、反応部２１ｂ及び２１ｃに洗浄液、反応部２１ｄに溶離液を分注する。これら溶液を反応部２１ａ～２ｌｄに分注する際には、ノズル機構９のノズル３１にディスポーザブルチップ３５を取り付ける。ディスポーザブルチップ３５をノズル３１に取り付けるには、先ず、駆動制御装置１０による制御によりノズル機構９を、チップラック７に収容されたディスポーザブルチップ３５の基端部の中心とノズル３１の先端部３２とが正確に対向する位置に移動させる（Ｘ軸及びＹ軸方向の移動）。次に、駆動制御装置１０による制御によりノズル機構９を下方（Ｚ軸）に移動させることによって、ノズル３１の先端部３２にディスポーザブルチップ３５を取り付けることができる。以上の一連の動作により、ノズル機構９が有する複数のノズル３１の全てにディスポーザブルチップ３５を取り付けることができる。

　そして、ディスポーザブルチップ３５を取り付けた状態で、駆動制御装置１０による制御によりノズル機構９を試薬ラック３の上方に移動し、試薬瓶の内部にディスポーザブルチップ３５の先端を挿入し、図示しないポンプ手段等の吸引・吐出駆動装置により所定量の溶液を吸引する。このとき、所定の試薬瓶をノズル３１の数と同数準備して試薬ラックに並列させることで、複数のディスポーザブルチップ３５の全てに同時に溶液を吸引することができる。

　その後、駆動制御装置１０による制御によりノズル機構９を反応容器２の上方に移動し、ディスポーザブルチップ３５の先端を所定の反応部２１ａ～２ｌｄ上に位置決めする。この状態で吸引・吐出駆動装置が作動し、ディスポーザブルチップ３５に吸引した溶液を所定の反応部２１ａ～２ｌｄ内に分注することができる。溶液を分注し終わると、駆動制御装置１０による制御によりノズル機構９を廃棄物用容器８の上方に移動し、ノズル機構９又は廃棄物用容器８に取り付けられた取外し機構を作動させて、使用済みのディスポーザブルチップ３５を廃棄する。

　以上の一連の動作は、洗浄液や溶離液、カオトロピック剤や界面活性剤を含む溶液を分注する際に共通する動作である。なお、生物学的試料の分注については、検体ラック４に収容された検体チューブから所定量の生物学的試料を吸引する以外は、以上の一連の動作により実施される。また、洗浄液、溶離液、生物学的試料及びカオトロピック剤や界面活性剤を含む溶液を分注する際には、それぞれ異なるディスポーザブルチップ３５が使用される。

　次に、図１５に示すように、処理対象の生物学的試料が分注された反応部２１ａに対して、シリカコーティングされた磁性ビーズ８１を分注する。なお、磁性ビーズ８１は、予め反応部２１ａに分注されていても良いし、磁性ビーズを分散した溶液を上述したノズル機構９の動作と同様にして、反応部２１ａに分注しても良い。また、図１４に示した段階で生物学的試料を分注したが、生物学的試料は磁性ビーズ８１とともに或いは順次この段階で分注されても良い。

　また、核酸抽出装置部のユーザーやメーカーは、あらかじめ必要な試薬や洗浄液を反応容器中の複数の反応部に入れておくことも可能である。この場合は試薬ラック３の一部またはすべてが不要となることもある。

　ここで、磁性ビーズ８１とは、例えば、バイオテクノロジーの分野で従来使用されている磁力体としての特徴を有するビーズであれば如何なる材質、形状及び粒径のものを使用することもできる。また、核酸抽出装置において核酸抽出処理を実施する場合は、核酸吸着能を有する磁性ビーズ８１を使用する。核酸吸着能は、磁力体からなるビーズの表面をシリカコーティングすることによって付与することができる。

　この段階では、反応部２１ａにカオトロピック剤が存在するため、生物学的試料に含まれていた核酸成分がシリカコーティングされた磁性ビーズ８１の表面に吸着する。また、この段階では、反応部２１ａの内部を攪拌しても良い。反応部２１ａの内部を攪拌するには、例えば、反応容器２の外部から磁界を周期的に印加することで磁性ビーズ８１を内部で移動させる方法、又は、ノズル３１にディスポーザブルチップ３５や磁力体カバー５１を取り付け、駆動制御装置１０でノズル機構９を制御してノズル３１に取り付けたディスポーザブルチップ３５や磁力体カバー５１を反応部２１ａ内部で回転若しくは揺動させる方法を使用することができる。

　次に、図１６に示すように、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１をノズル３１に取り付け、反応部２１ａ内の磁性ビーズ８１を磁力体カバー５１の先端部に捕捉する。この段階において、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１をノズル３１に取り付けるには、上述した駆動制御装置１０でノズル機構９を制御してノズル３１にディスポーザブルチップ３５を取り付ける動作と同様である。また、磁力体カバー５１は、磁力体棒４１をノズル３１の先端部３２に取り付けた後、ノズル３１の中途部３３に取り付ける。また、この段階では、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１の先端部を反応部２１ａ内において回動、揺動若しくは上下動させることで、磁力体カバー５１の先端部に磁性ビーズ８１を確実に捕捉することができる。磁力体棒４１及び磁力体カバー５１の先端部を反応部２１ａ内において回動、揺動若しくは上下動させるには、駆動制御装置１０でノズル機構９を制御することで実施できる。

　次に、図１７に示すように、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御し、磁性ビーズ８１を捕捉した状態で、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１の先端部を反応部２１ａから反応部２１ｂに移動させる。このとき、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１は、クロスコンタミネーションをなるべく発生させないため、反応容器２の上方にほとんど隙間を持たずに移動することとなる。

　次に、図１８に示すように、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御し、カバー着脱機構２３を利用して、磁性ビーズ８１を磁力体カバー５１の先端部から取り外す。磁性ビーズ８１を捕捉した状態で磁力体カバー５１を反応部２１ｂに挿入する工程から、磁性ビーズ８１を磁力体カバー５１の先端部から取り外す動作を図１９（ａ）～（ｄ）に示す。

　先ず、図１９（ａ）に示すように、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御し、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１を取り付けたノズル３１の先端を反応部２１ｂ内部に挿入する（Ｚ軸の下方向）。

　次に、図１９（ｂ）に示すように、磁力体棒４１及び磁力体カバー５１を取り付けたノズル３１の先端を反応部２１ｂ内部から引き上げる（Ｚ軸の上方向）。

　次に、図１９（ｃ）に示すように、磁力体カバー５１のフリンジ部５５がカバー着脱機構２３の上部押さえ板２４及び下部押さえ板２５の間に位置するまでノズル３１を引き上げ、切り欠き部２６に磁力体カバー５１を嵌め込むように移動させる（Ｙ軸方向）。この移動により、磁力体カバー５１のフリンジ部５５は、上部押さえ板２４及び下部押さえ板２５の間に挿入されるとともに係止されることとなる。なお、切り欠き部２６は、反応容器２を上方から見たときに反応部２１ａ～２１ｄの開口部の内方に臨む位置に端面が位置するように形成されている。したがって、切り欠き部２６に磁力体カバー５１を嵌め込む動作において、磁力体カバー５１の周面が反応部２１ｂの側面に接触せず、安定して嵌め込むことができる。

　次に、図１９（ｄ）に示すように、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御し、ノズル３１を更に上方に引き上げる（Ｚ軸の上方向）。この引き上げ動作により、ノズル３１に取り付けられた磁力体カバー５１のフリンジ部５５上面が上部押さえ板２４により係止され、ノズル３１から磁力体カバー５１のみが離間することとなる。ノズル３１に取り付けられた磁力体棒４１は、ノズル３１とともに上方に引き上げられるため、磁力体カバー５１の先端に捕捉された磁性ビーズは先端から外れ、反応部２１ｂの底面へと沈降していく（図１８）。このように、カバー着脱機構２３を使用することによって、上記磁力体カバー５１の先端部が反応部２１ａ～２１ｄに挿入された状態で、ノズル３１から磁力体カバー５１を取り外すとともに磁力体カバー５１を保持することができる。

　駆動制御装置１０による駆動制御でノズル３１から磁力体カバー５１を取り外す際の実施内容を、動作の流れ図として図２５に示す。

　磁力体カバー５１の磁石カバー部５２先端部が反応部２１ａ～２１ｄに挿入された状態で保持することにより、液体及び磁性ビーズ８１の滴下およびエアロゾルの飛散を低減し、隣接する核酸抽出用試料へのコンタミネーションを低減することが可能となる。

　以上のように、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御するだけで、反応部２１ａ内の磁性ビーズ８１を反応部２１ｂへと移動させることができる。この動作では、反応部２１ａからの溶液の抜き取りといった工程が不要であり、非常に簡便に磁性ビーズ８１を移動できる。

　なお、図１８に示した状態で、磁性ビーズ８１は、反応部２１ｂに分注された洗浄液により洗浄することができ、生物学的試料に由来するタンパク質等の不純物を磁性ビーズ８１の表面から除去することができる。この段階で、洗浄効果をより高めるため反応部２１ｂ内部の洗浄液を攪拌しても良い。反応部２１ｂの内部を攪拌するには、例えば、反応容器２の外部から磁界を周期的に印加することで磁性ビーズ８１を内部で移動させる方法、又は、ノズル３１に取り付けられた磁力体棒４１を取り外した後、カバー着脱機構２３に保持された磁力体カバー５１をノズル３１に再び装着し、磁力体カバー５１を反応部２１ｂ内部で回転若しくは揺動させる方法を使用することができる。なお、磁力体カバー５１をノズル３１に取り付ける動作は、図１９（ａ）～（ｄ）に示した一連の動作の逆の動作を実施すればよい。

　駆動制御装置１０による駆動制御でノズル３１に磁力体カバー５１を取り付ける際の実施内容を、動作の流れ図として図２６に示す。

　次に、図２０に示すように、反応部２１ｂにて洗浄された磁性ビーズ８１を再び磁力体棒カバー５１の先端に捕捉する。この段階は、図１６に示した段階と同様に、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御することで実施できる。

　次に、磁力体カバー５１の先端に捕捉した磁性ビーズ８１を反応部２１ｃにおいて２回目の洗浄を実施し（図示せず）、図２１に示すように、磁力体カバー５１の先端に捕捉された磁性ビーズ８１を溶離液が分注された反応部２１ｄへ移動させる。この段階は、図１７に示した段階と同様に、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御することで実施できる。

　次に、図２２に示すように、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御し、カバー着脱機構２３を利用して、磁性ビーズ８１を磁力体カバー５１の先端部から取り外す。この段階は、図１９に示した段階と同様に、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御することで実施できる。この段階では、磁性ビーズ８１の表面に吸着した核酸成分を溶離液中に溶離させることができる。

　最後に、図２３に示すように、溶離液中の磁性ビーズ８１を、図２０に示した段階と同様に、磁性ビーズ４０を再び磁力体カバー５１の先端に捕捉する。そして、駆動制御装置１０による制御によりノズル機構９を廃棄物用容器８の上方に移動し、ノズル機構９又は廃棄物用容器８に取り付けられた取外し機構を作動させて、先端に磁性ビーズ８１を捕捉した状態で磁力体カバー５１を廃棄する。

　次に、駆動制御装置１０による制御によりノズル機構９を磁石体棒ラック５の上方に移動し、ノズル機構９に取り付けられた取り外し機構を作動させて、ノズル３１に装着した磁力体棒４１を磁石体棒ラック５に収容する。磁石体棒ラック５に収容された磁力体棒４１は異なる検体に対して繰り返し使用することが可能であり、検体当たりの処理費用を低減することができる。

　一体型容器９１を用いる場合、反応容器２に溶液を分注する前に磁力体カバー５１と反応容器２を分離する。具体的には、駆動制御装置１０の制御によりノズル機構９を、カバーラック６に収容された一体型容器９１の磁力体カバー５１の開口部の中心と、ノズル３１の先端部３２とが正確に対向する位置に移動させる（Ｘ軸及びＹ軸方向の移動）。次に、駆動制御装置１０の制御によりノズル機構９を下方（Ｚ軸）に移動させることによって、ノズル３１の先端部３２に一体型容器９１を取り付けることができる。そして一体型容器９１を取り付けた状態で、駆動制御装置１０の制御によりノズル機構９を反応容器設置台１１の上方に移動し、ノズル機構９を下方（Ｚ軸）に移動させて一体型容器９１を反応容器設置台１１に配置する。その後、ノズル３１の先端部３２に一体型容器９１を取り付けた状態のまま、駆動制御装置１０の制御によりノズル機構９をＸ軸及びＹ軸方向に移動させることによって反応容器２と磁力体カバー５１の噛み合わせを解除する。そしてノズル３１の先端部３２に磁力体カバー５１を取り付けた状態のままノズル機構９を上方（Ｚ軸）に移動させて、磁力体カバー５１を反応容器２から分離する。反応容器２と磁力体カバー５１の噛み合わせを解除する一連の動作を図２９（Ａ）（Ｂ）に示す。また、駆動制御装置１０による駆動制御で一体型容器９１から磁力体カバー５１を分離する際の実施内容を、動作の流れ図として図３０に示す。

　一体型容器９１を反応容器２と磁力体カバー５１に分離する方法は、噛み合わせを解除する方法に限定しない。また、噛み合わせを解除する方法は、駆動制御装置１０の制御によりノズル機構９をＸ軸及びＹ軸方向に移動させる方法に限定するものではなく、ノズル機構９を１軸方向のみまたは３軸方向に移動させる方法も可能である。

　一体型容器９１を用いる場合、溶離液中の磁性ビーズ８１を磁力体カバー５１の先端に捕捉した後に、反応部２１を閉栓することも可能である。具体的には、駆動制御装置１０によってノズル機構９を駆動制御し、磁性ビーズ８１を先端に捕捉した磁力体カバー５１を装着したノズル３１を反応部２１ａ上方に移動させる。次に、駆動制御装置１０の制御によりノズル機構９を下方（Ｚ軸）に移動させることによって、反応部２１ａ開口部に磁力体カバー５１のシール部９３を挿入し、閉栓する。その後、ノズル機構９の取り外し機構を作動させてノズル３１から磁力体カバー５１を取り外す。図３１に反応部２１ａを磁力体カバー５１で閉栓した一体型容器を示す。
磁性体カバー５１で反応部２１ａを閉栓することにより、何らかの理由で処理の不完全な生物学的試料や磁性ビーズ８１の表面に吸着しなかった核酸成分の拡散の可能性を低減し、次回以降の核酸抽出用試料へのコンタミネーションを低減する効果がある。

　一体型容器９１の磁力体カバー５１で閉栓する反応部２１は、反応部２１ａに限定されるものではない。

　以上で説明したように、核酸抽出装置部を用いた核酸抽出方法では、磁性ビーズ８１を磁力体カバー５１の先端に捕捉して各反応部２１ａ～２ｌｄへと移動させている。チップを用いて磁性ビーズ８１を含む溶液から不要な溶液を吸引したり、必要な溶液を吐出する従来の方法では、不要な溶液を吸引する際に磁性ビーズも一緒に吸引してしまう結果、磁性ビーズをロスしてしまうといった問題があった。しかし、上述した核酸抽出装置を用いた核酸抽出方法では、磁性ビーズ８１のロスといった問題が生ずることなく、抽出効率の高い核酸抽出処理を実現することができる。

　以上で説明したように抽出した核酸は、図６の核酸増幅調製部１０２において核酸増幅用の複数の試薬と共に調製されて核酸増幅用反応液となり、さらに図６の核酸増幅反応検出部１０３において核酸増幅反応と検出が実施される。

１　載置台
２　反応容器
３　試薬ラック
４　検体ラック
５　磁性体棒ラック
６　カバーラック
７　チップラック
８　廃棄物用容器
９　ノズル機構
１０　駆動制御装置
１１　反応容器設置台
２１ａ～２１ｄ　反応部
２３　カバー着脱機構
２４　上部押さえ板
２５　下部押さえ板
２６　切り欠き部
３１　ノズル
３２　先端部
３３　中途部
３５　ディスポーザブルチップ
３６、４３、５５　フリンジ部
４１　磁力体棒
４２　磁石
５１　磁力体カバー
５２　磁石カバー部
５３　壁部
５４　上部
６１　カバー保持部
６２　側面
７１　液体
７２　液滴
７３　エアロゾル
８１　磁性ビーズ
１０１　核酸抽出装置部
１０２　核酸増幅調製部
１０３　核酸増幅反応検出部
９１　一体型容器
９２　噛み合わせ部
９３　シール部

Claims (9)

1. 　カオトロピック剤存在下でシリカコーティングされた磁性ビーズを用いた核酸抽出用キットであって、
   　内部に磁力体を収容する磁力体収容部であり、磁力体と反応容器とを互いに仕切る、磁力体収容部と、
   　磁力体収容部の少なくとも一部を反応容器に収容した状態で反応容器の外側を覆う外壁と、
   　磁力体収容部の少なくとも一部を反応容器に収容した状態で反応容器の上方を覆う蓋部と、を備えたことを特徴とする核酸抽出用キット。
2. 　請求項１において、
   　上記外壁の下端は、上記磁力体収容部の下端よりも下方に位置することを特徴とする核酸抽出用キット。
3. 　請求項１において、
   　上記磁力体収容部と外壁は、蓋部を介して接続されていることを特徴とする核酸抽出用キット。
4. 　請求項１において、
   　上記磁力体収容部の断面形状は、円形であることを特徴とする核酸抽出用キット。
5. 　請求項１において、
   　上記外壁の断面形状は、円形であることを特徴とする核酸抽出用キット。
6. 　上記蓋部は、外側に延びたつば部を有していることを特徴とする核酸抽出用キット。
7. 　カオトロピック剤存在下でシリカコーティングされた磁性ビーズを用いた核酸抽出装置であって、
   　内部に磁力体を収容する磁力体収容部であり、磁力体と反応容器とを互いに仕切る、磁力体収容部と、磁力体収容部の少なくとも一部を反応容器に収容した状態で反応容器の外側を覆う外壁と、磁力体収容部の少なくとも一部を反応容器に収容した状態で反応容器の上方を覆う蓋部と、を備えた核酸抽出用キットと、
   　磁性ビーズを捕捉する磁力体と、
   　複数の反応容器と、
   　前記核酸抽出用キットを反応容器から別の反応容器へ搬送する搬送部と、
   を備えたことを特徴とする核酸抽出装置。
8. 　請求項７において、
   　前記蓋部は、外側に延びたつば部を有し、
   　このつば部に係合し、核酸抽出用キットを保持する保持部を有することを特徴とする核酸抽出装置。
9. 　請求項８において、
   　前記保持部は、前記つば部を挟み込む２枚の板状部材であることを特徴とする核酸抽出装置。

Images