WO2014006262A1 - Composición basada en polipéptidos para el tratamiento de miasis - Google Patents

Composición basada en polipéptidos para el tratamiento de miasis Download PDF

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WO2014006262A1
WO2014006262A1 PCT/ES2013/070481 ES2013070481W WO2014006262A1 WO 2014006262 A1 WO2014006262 A1 WO 2014006262A1 ES 2013070481 W ES2013070481 W ES 2013070481W WO 2014006262 A1 WO2014006262 A1 WO 2014006262A1
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peptide
pharmaceutical composition
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veterinary
seq
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PCT/ES2013/070481
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Antonio OSUNA CARRILLO DEL ALBORNOZ
Gloria Maribel GONZÁLEZ GONZÁLEZ
Argentina YING
Gilberto ESKILDSEN
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Universidad De Granada
Universidad De Panamá
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • compositions for use as vaccines comprising polypeptide fragments for the treatment of myiasis.
  • Flies that do not bite often feed on secretions of the eyes, nose and any small wound of cattle, this distracts the animals from the grass, causing a reduction in growth and productivity.
  • Flies that do not bite are not biological vectors of any specific pathological organism, but due to their feeding and reproduction habits and the structure of their legs and mouth apparatus, they can act as mechanical vectors for a wide range of pathogens, from viruses to helminths .
  • Itchy flies can cause irritation to pets, and are also vectors for disease transmission. However, because they feed on blood, they can also cause anemia and hypersensitivity. Therefore some consider that itchy flies are an even more serious problem in livestock production than flies that do not bite.
  • Myiasis It is a disease that affects animals and humans, caused by larvae of insects of the Diptera order, in particular flies and among them Dermatobia hominis, commonly known as torsal. Climatic conditions, such as temperature and humidity at levels found in tropical and equatorial regions, particularly in certain seasons of the year, favor the proliferation of insects, particularly diptera or flies, in large quantities and therefore in cases of myiasis . There is, therefore, the need to produce new improved formulations useful in the treatment and prevention of myiasis.
  • the invention provides a peptide that can generate a protective immune response against infection by larvae of diptera insects capable of causing myiasis comprising:
  • a second aspect relates to polynucleotides (hereinafter polynucleotide of the invention) having a sequence selected from:
  • a third aspect of the invention relates to antibodies or fragments thereof that can bind to any one of the aforementioned peptide sequences.
  • a fourth aspect of the invention relates to a veterinary or pharmaceutical composition (hereinafter "pharmaceutical composition") comprising any of the peptides and / or antibodies or fragments thereof mentioned above. Another embodiment relates to the pharmaceutical composition for use in therapy. Another embodiment relates to the pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of myiasis disease caused by larvae of diptera insects capable of causing said disease.
  • the pharmaceutical composition is a composition useful as a vaccine, in which this vaccine composition can be used to protect mammals, preferably a human being, more preferably a mammal belonging to the bovine, caprine biological subfamily, ovine or equine, against infection caused by larvae of diptera insects capable of causing myiasis.
  • the invention provides a vaccine composition comprising any of the aforementioned peptides together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention provides the vaccine composition comprising antibodies or fragments thereof capable of binding to any one of the aforementioned peptide sequences together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • myiasis disease is caused by larvae of diptera insects belonging to any one of the following families: Calliphor ⁇ dae (blue flies), Oestridae (moscardón), Sarcophagidae (meat flies) or Gasterophilidae.
  • myiasis is caused by diptera insects belonging to the Oestridae family, preferably to the genus Oestrus, Dermatobia or Hypoderma; more preferably to the species Oestrus ovis Linnaeus, Dermatobia hominis, Hypoderma spp (rezno) or Gasterophilus spp.
  • myiasis is caused by diptera insects belonging to the Calliphoridae family, preferably to the genus Cochliomyia, Lucilla or Chrysomya.
  • myiasis is caused by diptera insects belonging to the Calliphoridae family, preferably to the genus Cordylobia or Chrysomya; more preferably, to the species Cordylobia anthropophaga or Chrysomya bezziana.
  • the invention also relates to a recombinant vector, such as an expression vector, comprising a polynucleotide of the invention operably linked to a regulatory sequence, for example a promoter; a host cell that is transformed with a polynucleotide of the invention; and a method of producing a polypeptide suitable for use as a pharmaceutical composition, preferably as a vaccine, comprising maintaining a host cell transformed with a polynucleotide of the invention under conditions to provide peptide expression.
  • a recombinant vector such as an expression vector, comprising a polynucleotide of the invention operably linked to a regulatory sequence, for example a promoter; a host cell that is transformed with a polynucleotide of the invention; and a method of producing a polypeptide suitable for use as a pharmaceutical composition, preferably as a vaccine, comprising maintaining a host cell transformed with a polynucleotide of the invention under conditions to provide peptide expression.
  • the invention provides a method of vaccination of a human subject or an animal against an infection caused by a diptera larvae capable of causing myiasis, in which the animal is preferably a mammal belonging to the bovine biological subfamily. , goat, sheep or horse.
  • Figure 1 This figure shows the number of larvae found in 6 calves tested, 3 of which were vaccinated with two intradermal doses of 1 mg / kg of SEQ ID NO 1 using Montanide ISA 51 as adjuvant. The 3 unvaccinated control animals were only inoculated with adjuvant (Montanide).
  • Figure 2 This figure shows the antibody titer against a total Dermatobia larval antigen measured in a group of rabbits immunized intradermally with the SEQ ID NO 1 antigenic sequence using Montanide as adjuvant.
  • the triangles represent immunized animals and the control animal diamonds.
  • the axis of abscissa represents the days elapsed since immunization and that of ordinates the logarithm of the antibody titer.
  • Figure 3 This figure shows an alignment of the peptides identified as SEQ ID NO 1 and 2 with the arginine kinase isoform of Dermatobia hominis (gi
  • Figure 4 This figure shows an immunoblot analysis using the sera of naturally infected animals at different dilutions as primary antibodies.
  • Figure 5 This figure shows an alignment of multiple sequences between peptide sequences of SEQ ID NO 3 to SEQ ID NO 10 with arginine kinase isoform of Dermatobia hominis (gi
  • Figure 6 Title of antibodies against the synthetic peptide after the challenge with Dermatobia hominis.
  • the ordinate axis represents the Optical Density at 490 nm. .
  • the symbols represent: ⁇ Group inoculated with the adjuvant; ⁇ Group inoculated with PBS; ⁇ Vaccinated group
  • Figure 7 Number of larvae recovered in calves evaluated after the challenge with Dermatobia hominis. The symbols represent: ⁇ Group inoculated with the adjuvant; ⁇ Group inoculated with PBS; ⁇ Vaccinated group
  • Arginine kinase is a crucial enzyme for the metabolism of insects and other invertebrates that has been proposed as a pesticide drug target.
  • novel peptide fragments homologous to those present in the arginine kinase sequence are presented that can confer protective immunity in mammals against infection by larvae of diptera insects capable of causing myiasis.
  • a first aspect of the present invention relates to peptides suitable for conferring protective immunity in mammals against an infection caused by larvae of diptera insects capable of causing myiasis (hereinafter “peptides of the invention”), in which said Peptides comprise a sequence selected from the following group:
  • the peptide is selected from any one of the following sequences:
  • the peptide of the invention is selected from any one of the following sequences:
  • the peptides of the invention were identified as indicated in Example 1, subjecting a homogenate of L2 and L3 larvae of Dermatobia hominis to 12% SDS-PAGE (in duplicate) and Western blot according to the conventional methodology (Towbin et al., 1979) using sera from naturally infected animals at different dilutions as primary antibodies. Bands with the highest immunogenic potential were digested, compared to positive sera, with trypsin and then analyzed with MALDI TOF MS / MS.
  • the peptides of the invention were finally identified by aligning the experimental masses obtained by MALDI TOF EM / EM (peptide fingerprint) against the theoretical digestion of the entire database using the Mascot search engine (www.matrixscience.com; Matrix Science Ltd. , London, UK). Additionally, the authors of the present invention confirmed, as illustrated in Example 3, that these peptides, specifically SEQ ID NO 1, could significantly reduce the lesions caused by Dermatobia hominis in infected animals and therefore, that these peptides can confer immunity in mammals against myiasis disease caused by larvae of diptera insects capable of causing myiasis, particularly disease caused by larvae of diptera insects belonging to the Dermatobia hominis species. In this regard, reference is made to Figure 1 in which the number of larvae of diptera insects in vaccinated animals compared to the control group (infected animals without vaccination) has been significantly reduced.
  • myiasis disease is defined as an animal or human disease caused by larvae of parasitic diptera insects that feed on the host's living or necrotic tissue.
  • Diptera insects (larvae of diptera insects) that can cause myiasis belong to any of the following families: Calliphoridae (blue flies), Oestridae (moscardón), Sarcophagidae (meat flies) or Gasterophilidae. Be they consider that these are the four main families capable of causing myiasis in cattle and also, occasionally, in human beings.
  • arginine kinase is a crucial enzyme for the metabolism of insects and other invertebrates and certainly shared by all species of the aforementioned families of diptera insects.
  • all peptides of the invention preferably the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 10, more preferably SEQ ID NO 1 or 2, share a significant percentage of identity with certain fragments.
  • the larvae that can produce myiasis belong to the Oestridae family and belong to any one of the following genus group: Oestrus, Dermatobia, Hypoderma or Gasterophilus; more preferably to the species Oestrus ovis Linnaeus, Dermatobia hominis, Hypoderma spp (rezno) or Gasterophilus spp.
  • the present invention relates to larvae of the Dermatobia hominis species.
  • the larvae that can produce myiasis belong to the Calliphoridae family, preferably to the genus Cordylobia or Chrysomya; more preferably to the species Cordylobia anthropophaga or Chrysomya bezziana.
  • a peptide for use in the present invention consists essentially of the amino acid sequence set forth in any of the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 10 or a variant thereof, or in a fragment of any of these sequences.
  • the amino acid sequence set forth is SEQ ID NO 1 or a variant or fragment thereof.
  • a variant will preferably be homologous at least 70% to that sequence based on amino acid identity. More preferably homologous at least 85 or 90% and more preferably at least 95, 97, 98 or 99% to any one of the sequences of SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 10 with respect to the region whole, based on the identity of amino acids. Fragments of the peptides of the invention preferably include any region of 6 amino acids in length of any one of the sequences of SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 10. The variants of these regions will preferably be homologous at least 70%, preferably at least 80% or 90% and more preferably 95% to these regions, based on the identity of amino acids.
  • the peptides of the invention can be modified for example by the addition of histidine residues to aid in their identification or purification or by the addition of a signal sequence to promote their secretion from a cell.
  • a peptide of the invention can be labeled with a developing marker.
  • the development marker can be any suitable marker that allows the peptide to be detected. Suitable markers include radioisotopes, enzymes, antibodies, polynucleotides and linkers such as biotin.
  • the labeled peptides of the invention can be used in cell-mediated or serological immune assays for the detection of immune reactivity against said polypeptides in animals and humans using conventional protocols.
  • the labeled peptide can be used to identify and / or isolate "auxiliary" proteins that are involved in the binding of the peptides of the invention.
  • a labeled peptide or peptide of the invention or fragment thereof can also be fixed to a solid phase, for example the surface of a test strip or immunoassay well.
  • Such immobilized and / or labeled peptides can be packaged in kits in a suitable container optionally including additional suitable reagents, controls or instructions and the like. The kits can be used to identify components that interact with the peptides.
  • the peptides of the invention can be prepared by synthetic means or recombinantly as described below.
  • the peptides of the invention can be introduced into a cell by in situ expression of the peptide from a recombinant expression vector.
  • the expression vector optionally carries an inducible promoter to control peptide expression.
  • Such cell culture systems in which the peptides of the invention are expressed can be used in assay systems.
  • the antibodies or fragments thereof that can bind to any of the peptides of the invention can also be used to confer protective immunity in a mammal against myiasis caused by a diptera insect. These antibodies or fragments thereof can easily be obtained from antisera.
  • the antisera against the peptides of the invention can be generated by conventional techniques, for example, by injection of any of the peptides of the invention into an appropriate animal and collection and purification of animal antisera.
  • Antibodies that bind to any one of the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 10 or a variant or fragment thereof according to the invention can be identified by conventional immunoassays.
  • the antibodies thus obtained can be used to isolate or purify peptides for incorporation into the pharmaceutical compositions of the invention. Next, these antibodies or fragments thereof will be referred to as antibodies of the invention.
  • a polynucleotide of the invention can selectively hybridize with the coding sequence (hereinafter "coding sequence of the invention") of any one of the peptide sequences of the invention or with the sequence complementary to the coding sequence.
  • Polynucleotides of the invention include variants of the coding sequence of the invention that encode the peptides of the invention due to the degeneracy of the genetic code and variants that are the coding sequence of the invention or its complement along a region of at least 20 or more contiguous nucleotides such as along the entire length of the coding sequence or its complement.
  • Polynucleotides of the invention may also be those that include synthetic or modified nucleotides within them.
  • polynucleotides include major phosphorothioate and methyl phosphate structures, adding acridine or polylysine chains to the 3 'and / or 5' ends of the molecule.
  • modifications include major phosphorothioate and methyl phosphate structures, adding acridine or polylysine chains to the 3 'and / or 5' ends of the molecule.
  • polynucleotides described herein can be modified by any method available in the art.
  • the polynucleotides of the invention can be used to produce a primer, for example a PCR primer, a primer for an alternative amplification reaction, a probe for example labeled with a developing label by conventional means using radioactive or non-radioactive markers, or they can
  • a primer for example a PCR primer, a primer for an alternative amplification reaction, a probe for example labeled with a developing label by conventional means using radioactive or non-radioactive markers, or they can
  • the polynucleotides are cloned into vectors.
  • Such primers, probes and other fragments will be at least 15, preferably at least 20, for example at least 25 or 30 nucleotides in length and are also encompassed by the term polynucleotides of the invention as used herein.
  • Polynucleotides such as a DNA polynucleotide and primers according to the invention can be produced recombinantly, synthetically or by any means available to those skilled in the art. They can also be cloned by conventional techniques. Typically polynucleotides are provided in isolated and / or purified form. In general, the primers will be produced by synthetic means that involve stepwise manufacturing of the desired nucleic acid sequence of a nucleotide in a nucleotide. The techniques to achieve this, using automatic techniques are readily available in the art.
  • the polynucleotides or primers of the invention can carry a developing marker.
  • Suitable markers include radioisotopes, enzymatic markers or other protein markers such as biotin. Such markers can be added to polynucleotides or primers of the invention and can be detected using techniques known per se.
  • the polynucleotides of the invention can be incorporated into a vector.
  • the vector can be used to replicate the nucleic acid in a compatible host cell.
  • a method of preparing polynucleotides is provided by introducing a polynucleotide of the invention into a vector that can be replicated, introducing the vector into a compatible host cell and growing the host cell under conditions in which cause vector replication.
  • the vector can be recovered from the host cell.
  • a polynucleotide of the invention in a vector is operably linked to a control sequence that can provide expression of the coding sequence by the host cell.
  • operably linked refers to a juxtaposition in which the components described are in a relationship that allows them to function in their intended manner.
  • a control sequence "operably linked" to a coding sequence is linked in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • Such vectors can be transformed into a suitable host cell to provide the expression of a polypeptide or polypeptide fragment of the invention.
  • a further aspect of the invention provides a method for preparing a peptide or peptide fragment according to the invention, a method comprising culturing a host cell transformed or transfected with an expression vector as described above under conditions to provide expression. of the polypeptide or fragment and recover the expressed peptide or fragment.
  • the vectors can be, for example, plasmid, virus or phage vectors endowed with an origin of replication, optionally a promoter for the expression of said polynucleotide and optionally a promoter regulator.
  • the vectors may contain one or more selectable marker genes, for example an ampicillin resistance gene in the case of a bacterial plasmid.
  • a further embodiment of the invention provides host cells transformed or transfected with the polynucleotides or vectors for replication and expression of polynucleotides of the invention.
  • the cells will be chosen to be compatible with said vector and will preferably be bacterial.
  • the host cells can also be cells of a non-human animal or a plant transformed with a polynucleotide of the invention.
  • Promoters and other expression regulation signals may be selected to be compatible with the host cell for which the expression vector is designed.
  • the present invention also relates to a veterinary or pharmaceutical composition (pharmaceutical composition of the invention) comprising any of the peptides, polynucleotides or antibodies of the invention.
  • the present invention relates to the pharmaceutical composition of the invention for use in therapy. More particularly, it refers to the pharmaceutical composition of the invention for use in the treatment or prevention of myiasis disease caused by larvae of diptera insects in mammals, preferably by flies, preferably in a human being, more preferably in a mammal that It belongs to the bovine, caprine, sheep or equine biological subfamily. More particularly, against myiasis caused by larvae of diptera insects that belong to the species Dermatobia hominis.
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a peptide, an antibody or fragment thereof that can be linked to said peptide or a sequence encoding said peptide, wherein the peptide sequence is selected from one any of the following group:
  • the pharmaceutical composition of the invention comprises a peptide, an antibody or fragment thereof that can bind to said peptide or a sequence encoding said peptide, in which the peptide sequence comprises SEQ ID NO 1 or a sequence consisting essentially of SEQ ID NO 1 or a sequence consisting of SEQ ID NO 1.
  • SEQ ID NO 1 was able to significantly reduce the number of diptera larvae in vaccinated animals compared to the control group as shown in Figure 1. Therefore, this peptide is an excellent candidate for a veterinary or pharmaceutical composition, specifically for a vaccine composition.
  • compositions of the invention take the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release formulations or powders and contain from 10% to 95% active ingredient, preferably from 25% to 70%.
  • the peptides, antibodies or polynucleotides of the invention can be formulated as vaccines (below vaccine composition of the invention).
  • the vaccine composition of the invention can be used in therapy, particularly for the treatment or prevention of myiasis disease caused by larvae of diptera insects.
  • a particular aspect of the present invention relates to a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising any of the peptides, antibodies or polynucleotides of the invention for use in the treatment or prevention in a mammal, preferably a human being, more preferably a mammal that belongs to the bovine, caprine, sheep or equine biological subfamily, against the infection of diptera insect larvae capable of causing myiasis; more particularly, against myiasis disease caused by larvae belonging to the Dermatobia hominis species.
  • the vaccine composition of the invention comprises a peptide, an antibody or fragment thereof that can bind to said peptide or a sequence encoding said peptide, wherein the peptide sequence is selected from one any of the following group:
  • the vaccine composition comprises a peptide, an antibody or fragment thereof that can bind to said peptide or a sequence encoding said peptide, wherein the peptide sequence is SEQ ID NO 1 .
  • vaccines are prepared as an injectable product, either as liquid solutions or suspensions; Solid forms suitable for dissolution or suspension in liquid can also be prepared before injection.
  • the preparation can also be emulsified or the protein encapsulated in liposomes or in other vehicles such as ISCOM suitable for immunization.
  • the active immunogenic principle can be mixed with an excipient that is pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient. Suitable excipients are by for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like and combinations thereof.
  • the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents and / or adjuvants that enhance the efficacy of the vaccine.
  • adjuvants examples include Montanide, Freund's adjuvant of alumina, chitosen, chitin, LPS, muramyl dipeptide, liposomes or ISCOM. Other adjuvants alternative to those mentioned above will be apparent to those skilled in the art.
  • Vaccines are conventionally administered parentally by injection, for example, either subcutaneously or intramuscularly. Additional formulations that are suitable for other modes of administration include suppositories and in some cases oral formulations.
  • the lyophilized material can be reconstituted before administration, for example as a suspension. Reconstitution is preferably performed in buffer.
  • the peptides of the invention can be formulated in the vaccine or composition of the invention as neutral or salt forms.
  • Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with free amino groups of the peptide) and which are formed with inorganic acids such as, for example, hydrochloric or phosphoric acids or organic acids such as acetic, oxalic, tartaric and maleic acids.
  • the salts formed with the free carboxyl groups can also be derived from inorganic bases such as, for example, sodium, potassium, ammonium, calcium or ferric hydroxides, and organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine and procaine
  • the vaccines and pharmaceutical compositions of the invention are administered in a manner compatible with the dosage formulation and in such an amount that it will be prophylactically effective.
  • the amount of antigen per dose to be administered that is generally in the range of 10 ug to 1 mg per kg of weight, particularly for the vaccine composition of the invention, depends on the subject to be treated, the ability of the subject's immune system to synthesize antibodies, and the degree of protection desired.
  • the precise amounts of active ingredient that are required to be administered may depend on the physician's criteria and may be different for each subject.
  • the vaccines and pharmaceutical compositions of the invention can be administered in a single dose schedule, or preferably in a multiple dose schedule.
  • a multi-dose schedule is one in which a main vaccination cycle can be with 1 -10 separate doses, followed by other doses administered at subsequent time intervals required to maintain and / or strengthen the immune response, for example at 1 at 4 months for a second dose and if necessary a subsequent dose (s) after several months.
  • the dosage regimen will also be determined, at least, in part by the individual's need and will depend on the physician's criteria.
  • Example 1 Serological recognition of Dermatobia hominis antigens using immunoblot.
  • a homogenate of L2 and L3 larvae of Dermatobia hominis was subjected to 12% SDS-PAGE (in duplicate) and Western blot according to conventional methodology (Towbin et al., 1979) using sera from naturally infected animals to different dilutions as primary antibodies. Serums from uninfected animals were used as a negative control. The peroxidase-labeled secondary anti-cow antibody was used at a dilution indicated by the company; Development was carried out with 3'3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride and H 2 0 2 . The second gel was stained with Coomassie blue and the bands with the highest immunogenic potential were selected compared to the positive sera to identify the proteins of interest.
  • the gel slices containing the proteins of interest were subjected to trypsin digestion and then analyzed by MS / MS. Proteins were identified by aligning the experimental masses obtained by MALDI (peptide footprint) against the theoretical digestion of the entire database using the Mascot search engine (www.matrixscience.com; Matrix Science Ltd., London, UK).
  • Example 2 Selection of the SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 peptide sequences The antigen epitopes were identified with the EMBOSS ANTIGENIC tool (http://liv.bmc.uu.se/cgi-bin/emboss/antigenic). Once the peptide sequences (from seq 1 to seq 10) were identified, they were aligned with Bos taurus creatinine kinase AAD30974.1 to rule out possible homologies.
  • Synthetic peptides were synthesized using solid phase chemistry of Fmoc for use in point transfer assays and experimental immunizations, in which they proved to be antigenic and immunogenic.
  • Example 3 The SEQ ID NO 1 peptide sequence protects against myiasis infection caused by Dermatobia hominis.
  • a group of six calves was immunized with two injections of 1 mg separated over 20 days with SEQ ID NO 1 peptide in 0.5 ml of Montanide.
  • the peptides were dissolved in a PBS solution and formulated with the water-in-oil emulsion of Montanide ISA 720 vortexing (Miles et al., 2005).
  • Serums were collected weekly and evaluated to determine the subclass titers of IgG and total IgG.
  • the same amount of adjuvant was inoculated in a calf control group. All animals were kept in their natural environment, drawing blood each month to evaluate the inoculated anti-peptide immunoglobulin titer. Protection was evaluated six months after the start of immunization, counting the number of lesions caused by Dermatobia in the skin of animals.
  • Figure 1 shows the reduction in the number of larvae in vaccinated animals compared to the control group.
  • a group of rabbits was immunized in parallel in the same manner (dose, regimen and route of administration) as the calves, the antibody titre being evaluated every fifteen days against a total Dermatobia larval antigen. The results are shown in figure 2.
  • Preparation of the vaccine For immunization the synthetic peptide consisting of SEQ ID NO 1 was used. mg of the synthetic peptide dissolved in 1 mL of PBS was mixed with 1 mL of Montanide ISA 51 adjuvant (1: 1 v / v ratio). The adjuvant control was prepared by mixing 1.0 mL of PBS and 1.0 mL of Montanide and 2 mL of PBS was used for immunization control.
  • Immunization The animals were immunized subcutaneously at the top of the scapula with 2.0 mL of the peptide / adjuvant mixture (containing 1 mg peptide), PBS / adjuvant or PBS only. After a first immunization, you will be they administered two booster doses on days 15 and 30 after said first immunization (day 0).
  • the serum samples were analyzed by ELISA to evaluate the response of specific total IgG antibodies against the synthetic peptide. Each sample was tested in duplicate.
  • Antibodies against the peptide were initially detected 15 days after the first immunization in animals immunized with the peptide and the titer continued to rise until day 60 of the immunization schedule. In the serum of the animals immunized with the adjuvant only and the non-immunized animals no antibodies against the peptide were detected (See Figure 6). 30 days after transfer (60 days after the last immunization) and every 30 days for 5 months, the animals were evaluated for larvae of D. homonis. After 60 days of exposure to D.
  • the adjuvant control group ( ⁇ ) and the infection control group ( ⁇ ) had a larger number of larvae at 60 days (Total of 12 and 14 larvae respectively) compared to the immunized group ( ⁇ ) that only presented 3 larvae in total .
  • the adjuvant control group ( ⁇ ) and the infection control group v showed an increase in the number of larvae as time passed, showing a high infestation after 180 days (1 10 and 54 larvae respectively)
  • the group immunized with the peptide and the adjuvant ( ⁇ ) maintained a minimum number of larvae up to 150 days after the challenge, reaching a maximum of 12 larvae after 180 days.
  • the larvae observed were smaller and with morphological alterations.
  • compositions of the invention can be used to protect mammals against infection of diptera insects that cause myiasis.

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Abstract

La presente invención describe fragmentos de péptidos homólogos a aquellos presentes en la secuencia de la arginina quinasa que pueden conferir inmunidad protectora en mamíferos contra la infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis. La presente invención también describe composiciones basadas en dichos péptidos para su uso como vacuna frente a miasis.

Description

COMPOSICIÓN BASADA EN POLIPÉPTIDOS PARA EL TRATAMIENTO DE
MIASIS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a composiciones para su uso como vacunas que comprenden fragmentos polipeptídicos para el tratamiento de miasis.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los insectos dípteros, y las moscas en particular, transmiten enfermedades que representan un grave peligro para la salud de personas y animales. A una escala global, provocan pérdidas de producción de aves de corral y ganado que se estima que representan miles de millones de dólares. El crecimiento y rendimiento de casi todos los animales de granja se ven adversamente afectados por moscas, especialmente cuando están presentes en números altos. Los animales infectados se vuelven nerviosos y se reduce drásticamente el consumo de alimentos. El resultado: reducciones significativas de producción de carne y leche, calidad de piel deteriorada y graves pérdidas económicas. Las moscas que no pican, a menudo se alimentan de secreciones de los ojos, nariz y cualquier herida pequeña de ganado, esto distrae a los animales del pasto, provocando una reducción en crecimiento y productividad. Las moscas que no pican no son vectores biológicos de ningún organismo patológico específico, pero debido a sus hábitos de alimentación y reproducción y la estructura de sus patas y aparato bucal, pueden actuar como vectores mecánicos para una gran gama de patógenos, desde virus hasta helmintos.
Las moscas que pican pueden provocar irritación a animales domésticos, y también son vectores para la transmisión de enfermedades. Sin embargo, debido a que se alimentan de sangre, también pueden provocar anemia e hipersensibilidad. Por tanto algunos consideran que las moscas que pican son un problema incluso más grave en la producción de ganado que las moscas que no pican.
Sin embargo, algunas moscas que no pican provocan daño significativo por sí mismas en virtud de su propensión para provocar "miasis" en animales propensos. La miasis es una enfermedad que afecta animales y seres humanos, provocada por larvas de insectos del orden Díptera, en particular moscas y entre ellas Dermatobia hominis, comúnmente conocida como tórsalo. Las condiciones climáticas, tales como temperatura y humedad a niveles encontrados en regiones tropicales y ecuatoriales, particularmente en determinadas estaciones del año, favorecen la proliferación de insectos, en particular insectos dípteros o moscas, en grandes cantidades y por lo tanto de los casos de miasis. Existe, por tanto, la necesidad de producir nuevas formulaciones mejoradas útiles en el tratamiento y la prevención de miasis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención proporciona un péptido que puede generar una respuesta inmunitaria protectora frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis que comprende:
a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ,
b) una variante de (a) que es homologa en al menos el 70% a la SEQ ID NO 1 , más preferiblemente homologa en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% a la SEQ ID NO 1 y que puede generar una respuesta inmunitaria protectora frente a una infección por larvas de insectos dípteros que provocan miasis, o
c) un fragmento de (a) o (b) o una mezcla el mismo, de al menos 6 aminoácidos de longitud que puede generar una respuesta inmunitaria protectora frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
Un segundo aspecto se refiere a polinucleótidos (de aquí en adelante polinucleótido de la invención) que tienen una secuencia seleccionada de:
a) la secuencia de ADN de SEQ ID NO 1 1 o la secuencia complementaria a la misma;
b) una secuencia que se híbrida selectivamente con dicha secuencia (a) o un fragmento de la misma; o
c) una secuencia que codifica para un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la codificada por dicha secuencia (a) o (b). Un tercer aspecto de la invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos que pueden unirse a una cualquiera de las secuencias peptídicas mencionadas anteriormente. Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición veterinaria o farmacéutica (de aquí en adelante "composición farmacéutica") que comprende cualquiera de los péptidos y/o anticuerpos o fragmentos de los mismos mencionados anteriormente. Otra realización se refiere a la composición farmacéutica para su uso en terapia. Otra realización más se refiere a la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad miasis provocada por larvas de insectos dípteros capaces de provocar dicha enfermedad.
En una realización preferida de la invención, la composición farmacéutica es una composición útil como vacuna, en la que esta composición de vacuna puede usarse para proteger mamíferos, preferiblemente un ser humano, más preferiblemente un mamífero que pertenece a la subfamilia biológica bovina, caprina, ovina o equina, contra la infección producida por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis. En un aspecto preferido, la invención proporciona una composición de vacuna que comprende cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto preferido, la invención proporciona la composición de vacuna que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de unirse a una cualquiera de las secuencias peptídicas mencionadas anteriormente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización más preferida de la invención, la enfermedad miasis se provoca por larvas de insectos dípteros que pertenecen a una cualquiera de las siguientes familias: Calliphorídae (moscas azules), Oestridae (moscardón), Sarcophagidae (moscas de la carne) o Gasterophilidae.
En una realización preferida adicional de la invención, la miasis se provoca por insectos dípteros que pertenecen a la familia Oestridae, preferiblemente al género Oestrus, Dermatobia o Hypoderma; más preferiblemente a las especies Oestrus ovis Linnaeus, Dermatobia hominis, Hypoderma spp (rezno) o Gasterophilus spp.
En una realización más preferida de la invención, la miasis se provoca por insectos dípteros que pertenecen a la familia Calliphoridae, preferiblemente al género Cochliomyia, Lucilla o Chrysomya.
En otra realización de la invención, la miasis se provoca por insectos dípteros que pertenecen a la familia Calliphoridae, preferiblemente al género Cordylobia o Chrysomya; más preferiblemente, a las especies Cordylobia anthropophaga o Chrysomya bezziana.
La invención también se refiere a un vector recombinante, tal como un vector de expresión, que comprende un polinucleotido de la invención operativamente unido a una secuencia reguladora, por ejemplo un promotor; una célula huésped que se transforma con un polinucleotido de la invención; y un procedimiento de producción de un polipéptido adecuado para su uso como composición farmacéutica, preferiblemente como vacuna, que comprende mantener una célula huésped transformada con un polinucleotido de la invención en condiciones para proporcionar la expresión del péptido.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de vacunación de un sujeto humano o un animal contra una infección producida por una larva de insecto díptero capaz de provocar miasis, en el que el animal es preferiblemente un mamífero que pertenece a la subfamilia biológica bovina, caprina, ovina o equina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Esta figura muestra el número de larvas encontradas en 6 terneros sometidos a prueba, 3 de los cuales se vacunaron con dos dosis intradérmicas de 1 mg/kg de peso de la SEQ ID NO 1 usando Montanide ISA 51 como adyuvante. A los 3 animales no vacunados control sólo se les inoculó adyuvante (Montanide).
Figura 2: Esta figura muestra el título de anticuerpo frente un antígeno total de larvas de Dermatobia medido en un grupo de conejos inmunizados por vía intradérmica con la secuencia antigénica SEQ ID NO 1 usando Montanide como adyuvante. Los triángulos representan animales inmunizados y los rombos animales control. El eje de abscisas representa los días transcurridos desde la inmunización y el de ordenadas el logaritmo del título de anticuerpo.
Figura 3: Esta figura muestra una alineación de los péptidos identificados como SEQ ID NO 1 y 2 con la isoforma de arginina cinasa de Dermatobia hominis (gi|23093854| gb|AAN1 1983.11)
Figura 4: Esta figura muestra un análisis de inmunotransferencia usando los sueros de animales infectados de manera natural a diferentes diluciones como anticuerpos primarios.
Figura 5: Esta figura muestra una alineación de múltiples secuencias entre secuencias peptídicas de SEQ ID NO 3 a SEQ ID NO 10 con isoforma de arginina cinasa de Dermatobia hominis (gi|23093854| gb|AAN1 1983.11)
Figura 6: Titulo de anticuerpos frente al péptido sintético tras tras el reto con Dermatobia hominis. El eje de ordenadas representa la Densidad Óptiva a 490 nm. . Los símbolos representan:■ Grupo inoculado con el adyuvante; ♦ Grupo inoculado con PBS; · Grupo vacunado
Figura 7: Número de larvas recuperadas en los terneros evaluados tras el reto con Dermatobia hominis. Los símbolos representan:■ Grupo inoculado con el adyuvante; ♦ Grupo inoculado con PBS; · Grupo vacunado
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La arginina quinasa es una enzima crucial para el metabolismo de los insectos y otros invertebrados que se ha propuesto como una diana farmacológica pesticida. En este documento, se presentan fragmentos de péptidos novedosos homólogos a aquellos presentes en la secuencia de la arginina quinasa que pueden conferir inmunidad protectora en mamíferos contra la infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a péptidos adecuados para conferir inmunidad protectora en mamíferos frente a una infección provocada por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis (a continuación "péptidos de la invención"), en los que dichos péptidos comprenden una secuencia seleccionada del siguiente grupo:
a) la secuencia de cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO
10, b) una variante de (a) que es homologa en al menos el 70% a una cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10, más preferiblemente homologa en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% a una cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10 y que pueda generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis, o c) un fragmento de (a) o (b) o una mezcla de los mismos, de al menos 6 aminoácidos de longitud que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
En un aspecto preferido de la presente invención el péptido se selecciona de una cualquiera de las siguientes secuencias:
a) la secuencia de SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2,
b) una variante de (a) que es homologa en al menos el 70% a una cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2, más preferiblemente homologa en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99 % a una cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 2 y, que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis, o c) un fragmento de (a) o (b) o una mezcla de los mismos, de al menos 6 aminoácidos de longitud que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
En un aspecto más preferido de la presente invención el péptido de la invención se selecciona de una cualquiera de las siguientes secuencias:
a) una secuencia que comprende SEQ ID NO 1 o una secuencia que consiste esencialmente en SEQ ID NO 1 o una secuencia que consiste en SEQ ID NO 1 ;
b) una variante de (a) que es homologa en al menos el 70% a SEQ ID NO 1 , más preferiblemente homologa en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% a SEQ ID NO 1 y que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis, o c) un fragmento de (a) o (b) o una mezcla de los mismos, de al menos 6 aminoácidos de longitud que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
Los péptidos de la invención se identificaron tal y como se indica en el ejemplo 1 , sometiendo un homogenizado de larvas L2 y L3 de Dermatobia hominis a SDS-PAGE al 12% (por duplicado) e inmunotransferencia de tipo Western según la metodología convencional (Towbin et al., 1979) usando los sueros de animales infectados de manera natural a diferentes diluciones como anticuerpos primarios. Se digirieron las bandas con el potencial inmunogénico más alto, en comparación con los sueros positivos, con tripsina y entonces se analizaron con MALDI TOF EM/EM.
Los péptidos de la invención fueron finalmente identificados alineando las masas experimentales obtenidas por MALDI TOF EM/EM (huella peptídica) contra la digestión teórica de la base de datos completa usando el motor de búsqueda Mascot (www.matrixscience.com; Matrix Science Ltd., Londres, R.U.). Adicionalmente, los autores de la presente invención confirmaron, tal como se ilustra en el ejemplo 3, que estos péptidos, concretamente la SEQ ID NO 1 , podían reducir significativamente las lesiones provocadas por Dermatobia hominis en animales infectados y por tanto, que estos péptidos pueden conferir inmunidad en mamíferos contra la enfermedad miasis provocada por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis, particularmente la enfermedad provocada por larvas de insectos dípteros que pertenecen a la especie Dermatobia hominis. En este sentido, se hace referencia a la figura 1 en la que el número de larvas de insectos dípteros en los animales vacunados en comparación con el grupo control (animales infectados sin vacunar) se ha reducido significativamente.
En el contexto de la presente invención, se define enfermedad miasis como una enfermedad animal o humana provocada por larvas de insectos dípteros parásitos que se alimentan del tejido vivo o necrótico del huésped.
Los insectos dípteros (larvas de insectos dípteros) que pueden provocar miasis pertenecen a cualquiera de las siguientes familias: Calliphoridae (moscas azules), Oestridae (moscardón), Sarcophagidae (moscas de la carne) o Gasterophilidae. Se consideran que éstas son las cuatro familias principales capaces de provocar miasis en ganado y además, ocasionalmente, en seres humanos.
Tal como ya se mencionó anteriormente, la arginina cinasa es una enzima crucial para el metabolismo de los insectos y otros invertebrados y ciertamente compartida por todas las especies de las familias mencionadas anteriormente de insectos dípteros. Tal como se ilustra en las figuras 3 y 5, todos los péptidos de la invención, preferiblemente las secuencias SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10, más preferiblemente la SEQ ID NO 1 ó 2, comparten un porcentaje de identidad significativo con determinados fragmentos de la secuencia de aminoácidos de arginina cinasa de D. melanogaster con número de registro de Genebank AAN1983.1 ; obsérvese que esta secuencia (AAN1983.1 ) tiene un grado significativo de homología con cualquier otra secuencia de arginina cinasa relacionada. Este resultado establece claramente la utilidad de los péptidos de la invención para conferir inmunidad protectora en mamíferos frente a la infección producida por cualquier larva de insecto díptero que puede provocar miasis, particularmente la miasis provocada por cualquier larva de insecto díptero que pertenece a una cualquiera de las familias mencionadas anteriormente. En una realización particular de la invención, las larvas que pueden producir miasis pertenecen a la familia Oestridae y pertenecen a uno cualquiera del siguiente grupo de géneros: Oestrus, Dermatobia, Hypoderma o Gasterophilus; más preferiblemente a las especies Oestrus ovis Linnaeus, Dermatobia hominis, Hypoderma spp (rezno) o Gasterophilus spp. En una realización más preferida la presente invención se refiere a larvas de la especie Dermatobia hominis.
En otra realización particular de la presente invención, las larvas que pueden producir miasis pertenecen a la familia Calliphoridae, preferiblemente al género Cordylobia o Chrysomya; más preferiblemente a las especies Cordylobia anthropophaga o Chrysomya bezziana.
Un péptido para su uso en la presente invención consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10 o una variante de la misma, o en un fragmento de cualquiera de estas secuencias. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos expuesta es la SEQ ID NO 1 o una variante o fragmento de la misma. En el contexto de la presente invención, se entiende como variante aquella secuencia aminoacidica con un grado de homología de al menos el 70% de una cualquiera de las SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10 capaz de producir inmunidad protectora frente a miasis, particularmente frente a miasis provocada por cualquiera de las larvas mencionadas anteriormente.
A lo largo de toda la longitud de una cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10, una variante será preferiblemente homologa en al menos el 70% a esa secuencia basándose en la identidad de aminoácidos. Más preferiblemente homologa en al menos el 85 o el 90% y más preferiblemente al menos el 95, el 97, el 98 o el 99% a una cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10 con respecto a la región entera, basándose en la identidad de aminoácidos. Los fragmentos de los péptidos de la invención incluyen preferiblemente cualquier región de 6 aminoácidos de longitud de una cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10. Las variantes de estas regiones serán preferiblemente homologas en al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80% o el 90% y más preferiblemente el 95% a estas regiones, basándose en la identidad de aminoácidos.
Los péptidos de la invención pueden modificarse por ejemplo mediante la adición de residuos de histidina para ayudar a su identificación o purificación o mediante la adición de una secuencia señal para promover su secreción a partir de una célula. Un péptido de la invención puede marcarse con un marcador de revelado.
El marcador de revelado puede ser cualquier marcador adecuado que permite detectar el péptido. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y ligadores tales como biotina.
Los péptidos marcados de la invención pueden usarse en ensayos inmunitarios mediados por células o serológicos para la detección de reactividad inmunitaria frente a dichos polipéptidos en animales y seres humanos usando protocolos convencionales. El péptido marcado puede usarse para identificar y/o aislar proteínas "auxiliares" que están implicadas en la unión de los péptidos de la invención. Un péptido o péptido marcado de la invención o fragmento del mismo también puede fijarse a una fase sólida, por ejemplo la superficie de un tira reactiva o pocilio de inmunoensayo. Tales péptidos inmovilizados y/o marcados pueden envasarse en kits en un recipiente adecuado incluyendo opcionalmente reactivos adecuados adicionales, controles o instrucciones y similares. Los kits pueden usarse para identificar componentes que interaccionan con los péptidos. Los péptidos de la invención pueden prepararse por medios sintéticos o de manera recombinante tal como se describe a continuación.
Los péptidos de la invención pueden introducirse en una célula mediante expresión in situ del péptido a partir de un vector de expresión recombinante. El vector de expresión lleva opcionalmente un promotor inducible para controlar la expresión del péptido.
Tales sistemas de cultivo celular en los que se expresan los péptidos de la invención pueden usarse en sistemas de ensayo.
En un segundo aspecto de la presente invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos que pueden unirse a cualquiera de los péptidos de la invención también pueden usarse para conferir inmunidad protectora en un mamífero frente a la miasis provocada por un insecto díptero. Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden obtenerse fácilmente a partir de antisueros.
Los antisueros frente a los péptidos de la invención pueden generarse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante inyección de cualquiera de los péptidos de la invención en un animal apropiado y recogida y purificación de antisueros de animales. Los anticuerpos que se unen a una cualquiera de las secuencias SEQ ID NO 1 a SEQ ID NO 10 o una variante o fragmento de las mismas según la invención pueden identificarse mediante inmunoensayos convencionales. Los anticuerpos así obtenidos pueden usarse para aislar o purificar péptidos para la incorporación en las composición farmacéuticas de la invención. A continuación, estos anticuerpos o fragmentos de los mismos se denominarán anticuerpos de la invención.
Polinucleótidos
Un polinucleótido de la invención puede hibridarse selectivamente con la secuencia codificante (a continuación "secuencia codificante de la invención") de una cualquiera de las secuencias peptídicas de la invención o con la secuencia complementaria a la secuencia codificante. Polinucleótidos de la invención incluyen variantes de la secuencia codificante de la invención que codifican para los péptidos de la invención debido a la degeneración del código genético y variantes que son la secuencia codificante de la invención o su complemento a lo largo de una región de al menos 20 o más nucleótidos contiguos tal como a lo largo de toda la longitud de la secuencia codificante o su complemento. También pueden ser polinucleótidos de la invención aquellos que incluyen dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos diferentes de modificaciones (de polinucleótidos). Estos incluyen estructuras principales de fosforotioato y fosfato de metilo, adición de cadenas de acridina o polilisina a los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines de la presente invención, ha de entenderse que los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la técnica.
Los polinucleótidos de la invención pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda por ejemplo marcada con un marcador de revelado por medios convencionales usando marcadores radioactivos o no radioactivos, o pueden clonarse los polinucleótidos en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo al menos 25 ó 30 nucleótidos de longitud y también se abarcan por el término polinucleótidos de la invención tal como se usa en el presente documento.
Los polinucleótidos tales como un polinucleótido de ADN y cebadores según la invención pueden producirse de manera recombinante, sintética o por cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También pueden clonarse mediante técnicas convencionales. Normalmente se proporcionan los polinucleótidos en forma aislada y/o purificada. En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos que implican una fabricación por etapas de la secuencia de ácido nucleico deseada de un nucleótido en un nucleótido. Las técnicas para lograr esto, usando técnicas automáticas están fácilmente disponibles en la técnica.
Los polinucleótidos o cebadores de la invención pueden portar un marcador de revelado.
Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos, marcadores enzimáticos u otros marcadores proteicos tales como biotina. Tales marcadores pueden añadirse a polinucleótidos o cebadores de la invención y pueden detectarse usando técnicas conocidas en sí mismas.
Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector. Puede usarse el vector para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto, en una realización adicional de la invención se proporciona un método de preparación de polinucleótidos introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector que puede replicarse, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y haciendo crecer la célula huésped en condiciones en las que provocan replicación del vector. El vector puede recuperarse a partir de la célula huésped.
Preferiblemente, un polinucleótido de la invención en un vector está operativamente unido a una secuencia control que puede proporcionar la expresión de la secuencia codificante mediante la célula huésped.
El término "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que permite que funcionen de su manera pretendida.
Una secuencia control "operativamente unida" a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias control. Tales vectores pueden transformarse en una célula huésped adecuada para proporcionar la expresión de un polipéptido o fragmento de polipéptido de la invención.
Por tanto, un aspecto adicional de la invención proporciona un procedimiento para preparar un péptido o fragmento de péptido según la invención, procedimiento que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión tal como se describió anteriormente en condiciones para proporcionar la expresión del polipéptido o fragmento y recuperar el péptido o fragmento expresado. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmido, virus o fago dotados de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleotido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionares, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina en el caso de un plásmido bacteriano.
Una realización adicional de la invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con los polinucleótidos o vectores para la replicación y expresión de polinucleótidos de la invención. Las células se elegirán para ser compatibles con dicho vector y serán preferiblemente bacterianas. Las células huésped también pueden ser células de un animal no humano o una planta transformada con un polinucleotido de la invención.
Los promotores y otras señales de regulación de expresión pueden seleccionarse para ser compatibles con la célula huésped para la cual se diseña el vector de expresión.
Formulación de vacuna y otras formulaciones médicas
La presente invención también se refiere a una composición veterinaria o farmacéutica (composición farmacéutica de la invención) que comprende cualquiera de los péptidos, polinucleótidos o anticuerpos de la invención. En particular, la presente invención se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en terapia. Más particularmente, se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad miasis provocada por larvas de insectos dípteros en mamíferos, preferentemente por moscas, preferiblemente en un ser humano, más preferiblemente en un mamífero que pertenece a la subfamilia biológica bovina, caprina, ovina o equina. Más particularmente, contra la miasis provocada por larvas de insectos dípteros que pertenecen a la especie Dermatobia hominis. En una realización particular de la presente invención, la composición farmacéutica de la invención comprende un péptido, un anticuerpo o fragmento del mismo que puede unirse a dicho péptido o una secuencia que codifica para dicho péptido, en el que la secuencia peptídica se selecciona de uno cualquiera del siguiente grupo:
a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ,
b) una variante de (a) que es homologa en al menos el 70% a SEQ ID NO 1 , más preferiblemente homologa en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% a SEQ ID NO 1 y que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis, o
c) un fragmento de (a) o (b) o una mezcla de los mismos, de al menos 6 aminoácidos de longitud que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
En un aspecto aún más particular de la invención, la composición farmacéutica de la invención comprende un péptido, un anticuerpo o fragmento del mismo que puede unirse a dicho péptido o una secuencia que codifica para dicho péptido, en la que la secuencia peptídica comprende la SEQ ID NO 1 o una secuencia que consiste esencialmente en SEQ ID NO 1 o una secuencia que consiste en SEQ ID NO 1 . Obsérvese que SEQ ID NO 1 pudo reducir significativamente el número de larvas dípteras en los animales vacunados en comparación con el grupo control tal como se muestra en la figura 1 . Por tanto, este péptido es un excelente candidato para una composición veterinaria o farmacéutica, concretamente para una composición de vacuna.
Estas composiciones farmacéuticas de la invención adoptan la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen del 10% al 95% de principio activo, preferiblemente del 25% al 70%.
Adicionalmente, los péptidos, anticuerpos o polinucleótidos de la invención pueden formularse como vacunas (a continuación composición de vacuna de la invención). La composición de vacuna de la invención puede usarse en terapia, particularmente para el tratamiento o la prevención de la enfermedad miasis producida por larvas de insectos dípteros. Por tanto, un aspecto particular de la presente invención se refiere a una composición de vacuna que comprende cualquiera de los péptidos, anticuerpos o polinucleótidos de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención en un mamífero, preferiblemente un ser humano, más preferiblemente un mamífero que pertenece a la subfamilia biológica bovina, caprina, ovina o equina, contra la infección de larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis; más particularmente, contra la enfermedad miasis provocada por larvas que pertenecen a la especie Dermatobia hominis.
En otro aspecto particular de la invención, la composición de vacuna de la invención comprende un péptido, un anticuerpo o fragmento del mismo que puede unirse a dicho péptido o una secuencia que codifica para dicho péptido, en la que la secuencia peptídica se selecciona de uno cualquiera del siguiente grupo:
a) la secuencia de SEQ ID NO 1 ,
b) una variante de (a) que es homologa en al menos el 70% a SEQ ID NO 1 , más preferiblemente homologa en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% a SEQ ID NO 1 y que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis, o
c) un fragmento de (a) o (b) o una mezcla de los mismos, de al menos 6 aminoácidos de longitud que puede generar una respuesta inmunitaria protectora en un mamífero frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
En un aspecto aún más particular de la invención, la composición de vacuna comprende un péptido, un anticuerpo o fragmento del mismo que puede unirse a dicho péptido o una secuencia que codifica para dicho péptido, en la que la secuencia peptídica es SEQ ID NO 1 .
Normalmente, se preparan las vacunas como producto inyectable, o bien como disoluciones líquidas o bien suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o la proteína encapsularse en liposomas o en otros vehículos tales como ISCOM adecuados para la inmunización. El principio inmunogénico activo puede mezclarse con un excipiente que es farmacéuticamente aceptable y compatible con el principio activo. Los excipientes adecuados son por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento de pH y/o adyuvantes que potencian la eficacia de la vacuna. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser eficaces son Montanide, adyuvante de Freund de alúmina, quitoseno, quitina, LPS, muramil dipéptido, liposomas o ISCOM. Otros adyuvantes alternativos a los mencionados anteriormente resultarán evidentes para el experto en la técnica. Las vacunas se administran de manera convencional por vía parental mediante inyección, por ejemplo, por vía o bien subcutánea o bien intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y en algunos casos formulaciones orales. Cuando se liofiliza la composición de vacuna de la invención o la composición farmacéutica de la invención, puede reconstituirse el material liofilizado antes de la administración, por ejemplo como una suspensión. La reconstitución se realiza preferiblemente en tampón. Los péptidos de la invención pueden formularse en la vacuna o composición de la invención como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico y maleico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2- etilaminoetanol, histidina y procaína.
Administración de vacuna y otras composiciones farmacéuticas
Las vacunas y las composiciones farmacéuticas de la invención se administran de manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad que será profilácticamente eficaz. La cantidad de antígeno por dosis que va a administrarse que está generalmente en el intervalo de 10 ug a 1 mg por kg de peso, particularmente para la composición de vacuna de la invención, depende del sujeto que va a tratarse, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado. Las cantidades precisas de principio activo que se requiere administrar pueden depender del criterio del médico y pueden ser diferentes para cada sujeto.
Las vacunas y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en un programa de dosis única, o preferiblemente en un programa de múltiples dosis. Un programa de múltiples dosis es uno en el que un ciclo principal de vacunación puede ser con 1 -10 dosis separadas, seguido por otras dosis administradas a intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y/o reforzar la respuesta inmunitaria, por ejemplo a de 1 a 4 meses para una segunda dosis y si es necesario una(s) dosis posterior(es) tras varios meses. El régimen de dosificación también se determinará, al menos, en parte mediante la necesidad del individuo y dependerá del criterio del médico.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 : Reconocimiento serolóqico de antíqenos de Dermatobia hominis usando inmunotransferencia.
Se sometió un homogenizado de larvas L2 y L3 de Dermatobia hominis a SDS-PAGE al 12% (por duplicado) e inmunotransferencia de tipo Western según metodología convencional (Towbin et al., 1979) usando los sueros de animales infectados de manera natural a diferentes diluciones como anticuerpos primarios. Se usaron sueros de animales no infectados como control negativo. Se usó el anticuerpo anti-vaca secundario marcado con peroxidasa a una dilución indicada por la empresa; se llevó a cabo el revelado con tetraclorhidrato de 3'3'-diaminobencidina y H202. Se tiñó el segundo gel con azul de Coomassie y se seleccionaron las bandas con el potencial inmunogénico más alto en comparación con los sueros positivos para identificar las proteínas de interés. Se sometieron las rodajas de gel que contenían las proteínas de interés a digestión con tripsina y entonces se analizaron mediante EM/EM. Se identificaron las proteínas alineando las masas experimentales obtenidas mediante MALDI (huella de péptido) contra la digestión teórica de la base de datos entera usando el motor de búsqueda Mascot (www.matrixscience.com; Matrix Science Ltd., Londres, R.U.).
Ejemplo 2: Selección de las secuencias peptídicas SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 Se identificaron los epítopos de antígeno con la herramienta EMBOSS ANTIGENIC (http://liv.bmc.uu.se/cgi-bin/emboss/antigenic). Una vez que se identificaron las secuencias peptídicas (de seq 1 a seq 10), se alinearon con creatinina cinasa AAD30974.1 de Bos taurus para descartar posibles homologías.
Alineación de Seq. 1
Puntuación = 26,5 bits (55), Esperado = 7e-06
Identidades = 10/14 (71 %), Positivos = 1 1 /14 (79%), Huecos = 2/14 (14%)
Consulta 1 LGF-LTFCPTNLGT 13
LG+ LT CP NLGT
Objeto 277 LGYVLT-CPSNLGT 289
Alineación de Seq.2
Puntuación = 16,8 bits (32), Esperado = 0,025
Identidades = 5/7 (71 %), Positivos = 5/7 (71 %), Huecos = 0/7 (0%)
Consulta 10 SHDDRLG 16
S DRLG
Objeto 337 SNADRLG 343
Puntuación = 1 1 ,7 bits (20), Esperado = 1 ,4
Identidades = 4/9 (44%), Positivos = 6/9 (67%), Huecos = 0/9 (0%)
Consulta 8 PFSHDDRLG 16
PF ++ LG
Objeto 270 PFMWNEHLG 278
Se sintetizaron péptidos sintéticos usando química en fase sólida de Fmoc para usarlos en ensayos de transferencia puntual e inmunizaciones experimentales, en los que demostraron ser antigénicos e inmunogénicos. Ejemplo 3: La secuencia peptídica SEQ ID NO 1 protege contra infección por miasis provocada por Dermatobia hominis.
Se inmunizó un grupo de seis terneros con dos inyecciones de 1 mg separadas a lo largo de 20 días con la SEQ ID NO 1 peptídica en 0,5 mi de Montanide. Se disolvieron los péptidos en una disolución de PBS y se formularon con la emulsión agua en aceite de Montanide ISA 720 agitando con vórtex (Miles et al., 2005). Se recogieron sueros semanalmente y se evaluaron para determinar los títulos de subclases de IgG y de IgG total. Se inoculó la misma cantidad de adyuvante en un grupo control de ternero. Se mantuvieron todos los animales en su entorno natural, extrayendo sangre cada mes para evaluar el título de inmunoglobulina anti-péptido inoculado. Se evaluó la protección seis meses tras el inicio de la inmunización, contándose el número de lesiones provocadas por Dermatobia en la piel de los animales. En la figura 1 se muestra la reducción en el número de larvas en los animales vacunados en comparación con el grupo control.
Se inmunizó un grupo de conejos en paralelo de la misma manera (dosis, régimen y vía de administración) que los terneros, evaluándose el título de anticuerpo cada quince días frente un antígeno total de larvas de Dermatobia. Los resultados se muestran en la figura 2.
Ejemplo 4.- Ensayo realizado en terneros
Para realizar el ensayo se seleccionaron un total de 7 terneros de 6 meses de edad y sin previa exposición a infestación por Dermatobia hominis. Los animales se dividieron en tres grupos: el grupo A o grupo vacunado con tres animales, grupo B o grupo control de adyuvante con dos animales y grupo C o grupo control de inmunización con PBS con dos animales. Durante el periodo de inmunización los animales fueron mantenidos en las instalaciones de la Facultad de agronomía de la Universidad de Panamá en el distrito de David. Esta finca y sus alrededores son declaradas libres de D. Hominis. Los animales fueron mantenidos bajo estricta vigilancia y evaluados periódicamente por el veterinario del centro.
Preparación de la vacuna: Para la inmunización se utilizó el péptido sintético consistente en la SEQ ID NO 1 . mg del péptido sintético disuelto en 1 mL de PBS fue mezclado con 1 mL de adyuvante Montanide ISA 51 (relación1 :1 v/v). El control de adyuvante se preparó mezclando 1 .0 mL de PBS y 1 .0 mL de Montanide y para el control de inmunización se empleó 2 mL de PBS.
Inmunización: Los animales fueron inmunizados subcutáneamente en la parte superior de la escápula con 2.0 mL de la mezcla péptido/adyuvante (conteniendo 1 mg de péptido), PBS/adyuvante o PBS solamente. Tras una primera inmunización, se le administraron dos dosis de refuerzo los días 15 y 30 tras dicha primera inmunización (día 0).
Toma de muestras: Se tomaron muestras de sangre de los animales los días 0, 15 y 30, antes de cada inmunización, y una vez cada 30 días durante los 6 meses posteriores al reto.
Seguimiento: 30 días después del último refuerzo, los animales fueron trasladados a un área de comprobada actividad de infestación de ganado con Dermatobia hominis. Los terneros fueron alimentados y manipulados de manera similar al ganado común. Se evitó el uso de garrapaticidas u otros productos químicos que pudiesen interferir en la evaluación de la respuesta de la vacuna.
Cada 30 días, durante los siguientes 6 meses, se realizó una evaluación exhaustiva de cada animal en busca de lesiones dérmicas causadas por larvas de Dermatobia hominis, se contó el número de larvas y se anotaron datos de tamaño y morfología y mapeó su localización en esquemas preparados para tal efecto.
Determinación del título de anticuerpos frente al péptido sintético: Las muestras de suero fueron analizadas mediante ELISA para evaluar la respuesta de anticuerpos IgG totales específica frente al péptido sintético. Cada muestra fue ensayada por duplicado.
Resultados: Los anticuerpos frente al péptido se detectaron inicialmente 15 días después de la primera inmunización en los animales inmunizados con el péptido y el título continuó subiendo hasta el días 60 del esquema de inmunización. En el suero de los animales inmunizados con el adyuvante solamente y los animales no inmunizados no se detectó anticuerpos frente al péptido (Ver Figura 6). 30 días después del traslado (60 días después de la última inmunización) y cada 30 días durante 5 meses, los animales fueron evaluados en busca de larvas de D. homonis. Tras 60 días de la exposición a D. hominis se observaron los primeros animales infestados (Ver Figura 7) El grupo control de adyuvante (■) y el grupo control de infección (♦) presentaron un número mayor de larvas a los 60 días (Total de 12 y 14 larvas respectivamente) comparados al grupo inmunizado (·) que sólo presentó 3 larvas en total. El grupo control de adyuvante (■) y el grupo control de infección v presentaron un incremento en el número de larvas a medida que transcurrió el tiempo, mostrando una alta infestación tras 180 días (1 10 y 54 larvas respectivamente)
Por su parte, el grupo inmunizado con el péptido y el adyuvante (·) mantuvo un número mínimo de larvas hasta 150 días tras el reto, llegando a un máximo de 12 larvas al cabo de 180 días. Además, las larvas observadas fueron de menor tamaño y con alteraciones morfológicas.
Los resultados indicados anteriormente demuestran que las composiciones farmacéuticas de la invención, particularmente las vacunas, pueden usarse para proteger mamíferos contra infección de insectos dípteros que provocan miasis.
Un experto en la técnica aprecia fácilmente que la presente invención se adapta bien para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos inherentes al mismo. Los ejemplos proporcionados en el presente documento son representativos de realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo, y no pretenden ser limitativos del alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Péptido que comprende:
a) la secuencia SEQ ID NO 1 ; o
b) una variante de la secuencia de a) que sea homologa en al menos el 70% a la SEQ ID NO 1 , basándose en la identidad de la totalidad de los aminoácidos de dicha secuencia, y que puede generar una respuesta inmunitaria protectora frente a una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
2. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el péptido comprende la SEQ ID NO 1 .
3. Péptido de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el péptido consiste esencialmente en la SEQ ID NO 1 .
4. Polinucleotido que comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las siguientes:
a) la secuencia SEQ ID NO 1 1 o su secuencia complementaria; o
b) una secuencia que híbrida selectivamente con la secuencia codificante de una cualquiera de las secuencias peptídicas de la reivindicación 1 apartado b).
5. Vector de expresión que comprende un polinucleotido según la reivindicación 4, operativamente unido a una secuencia reguladora.
6. Célula huésped transformada con un polinucleotido de la reivindicación 4.
7. Procedimiento de producción del péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende mantener una célula huésped transformada con un polinucleotido que codifique para un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones para proporcionar la expresión del péptido.
8. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se una específicamente al péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. Composición veterinaria o farmacéutica que comprende el péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o un anticuerpo o un fragmento del mismo tal y como se define en la reivindicación 8.
10. Composición veterinaria o farmacéutica según la reivindicación 9, para su uso en terapia.
1 1 . Uso de la composición veterinaria o farmacéutica de la reivindicación 9, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención en un mamífero de una infección por larvas de insectos dípteros capaces de provocar miasis.
12. Uso de la composición veterinaria o farmacéutica según la reivindicación 1 1 , donde las larvas de insectos dípteros pertenecen a una cualquiera de las siguientes familias: Calliphorídae (moscas azules), Oestridae (tábanos) o Sarcophagidae (moscas de la carne).
13. Uso de la composición veterinaria o farmacéutica según la reivindicación 12, donde las larvas de insectos dípteros pertenecen a la familia Oestridae.
14. Uso de la composición veterinaria o farmacéutica según la reivindicación 13, donde las larvas de insectos dípteros pertenecen a uno cualquiera de los siguientes géneros: Oestrus, Dermatobia, Hypoderma o Gasterophilinae.
15. Uso de la composición veterinaria o farmacéutica según la reivindicación 14, donde las larvas de insectos dípteros pertenecen a la especie Dermatobia hominis.
16. Composición veterinaria o farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. Composición veterinaria o farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en la que dicha composición veterinaria o farmacéutica es una vacuna.
18. Composición veterinaria o farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 15, en la que el mamífero es un ser humano.
19. Composición veterinaria o farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 15, en la que el mamífero pertenece a la subfamilia biológica bovina.
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