WO2014003307A1 - 히알루론산을 포함하는 인공 타액 조성물 - Google Patents

히알루론산을 포함하는 인공 타액 조성물 Download PDF

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artificial saliva
hyaluronic acid
lysozyme
saliva
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PCT/KR2013/003844
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고홍섭
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서울대학교산학협력단
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    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin

Definitions

  • the present application relates to artificial saliva compositions capable of treating or preventing diseases associated with lowered salivation.
  • the antimicrobial substance contained in the existing artificial saliva is not the antimicrobial effect or level as desired, unlike when the antibacterial substance alone due to the interaction between the main components of the artificial saliva, reduced antibacterial function of the patient It was often not able to supplement.
  • the artificial saliva developed to date is not much less than human saliva in terms of physical properties such as viscosity and lubricity, as well as biological properties such as antibacterial and antifungal activity, so the patient's satisfaction with them is insignificant.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 1994-0011001 discloses an oral mucosal edema inhibitor having an artificial saliva form containing lysozyme
  • Japanese Patent No. 09007116 discloses artificial saliva containing hydroxypropyl cellulose as a thickener, but none of them have hyaluronic acid as a component of artificial saliva.
  • the present application provides hyaluronic acid, lysozyme, lactoperoxidase, glucose oxidase, SCN, having a viscosity of 1.0 to 20.0 cps (centipoise) depending on shear rate. - or I - It provides an artificial saliva composition comprising a sugar alcohol and a buffer.
  • the hyaluronic acid included herein has a viscosity of 1.0 to 20.0 cps (centipoise) at a shear rate of 11.0 to 450.0 sec ⁇ 1 , and in another embodiment, a viscosity of 1.0 to 20.0 at a shear rate of 11.3 to 450.0 sec ⁇ 1 . It represents cps (centipoise).
  • the hyaluronic acid included herein has a viscosity of 1.0 to 4.5 cps at a shear rate of 45.0 to 225.0 sec ⁇ 1 .
  • the present disclosure also provides hyaluronic acid, lysozyme, lactoperoxidase, glucose oxidase, SCN - or I -
  • the artificial saliva composition comprising a sugar alcohol and a buffer
  • the artificial saliva composition provides an artificial saliva composition comprising 0.25 to 0.7 mg / mL hyaluronic acid.
  • the concentration of lysozyme included in the composition of the present application is about 10 to 100 ⁇ g / mL.
  • the concentration of lactoperoxidase included in the composition of the present application is about 10 to 70 ⁇ g / mL.
  • the sugar alcohol included in the composition of the present invention is xylitol, sorbitol or mannitol, or a mixture thereof, and the concentration thereof is about 50 to 300 mM.
  • the concentration of glucose oxidase included in the composition of the present application is about 10 to 200 ⁇ g / mL.
  • the SCN ⁇ included in the present compositions is in the form of KSCN or NaSCN, and its concentration is 0.5 to 3 mM.
  • I ⁇ included in the present compositions is in the form of KI or NaI, and its concentration is about 5 ⁇ M to 0.5 mM.
  • the present application is about 1.0 to 20.0 cps viscosity, in particular a shear rate hyaluronate having from about 45.0 to about 1.0 to 4.5 cps viscosity at 225.0 sec -1 acid, or from about 0.25 to 0.7 mg at a shear rate of about 11.0 to 450.0 sec -1 hyaluronic acid at / mL; Lysozyme of about 10-100 ⁇ g / mL; About 10 to 70 ⁇ g / mL of lactoperoxidase; At least one of about 50-300 mM xylitol, sorbitol or mannitol; About 10-200 ⁇ g / mL glucose oxidase; And from about 0.5 to 3 mM KSCN or NaSCN or from about 5 ⁇ M to 0.5 mM KI or NaI.
  • the artificial saliva composition according to the present invention is a disease associated with lowered salivation, in particular, dry mouth or a disease associated with dry mouth, such as dental caries, periodontitis, oral fungal infection, tongue pain, tongue wrinkles, oral ulcers, oral mucosal pain, taste disorders It is used for the treatment or prophylaxis of abrasion, bristles increase or bad breath.
  • the present application unlike the prior art, by including the hyaluronic acid in the artificial saliva composition can adjust the viscosity of the composition similar to the saliva of the human body, in addition to antimicrobial enzymes such as lysozyme, glucose oxidase-mediated lactoperoxidase system (glucose oxidase-mediated lactoperoxidase Enzyme and substrate constituting the system) or sugar carbohydrates with anti-carious and antibacterial and antifungal action as a component can supplement the antibacterial function of the oral cavity.
  • antimicrobial enzymes such as lysozyme, glucose oxidase-mediated lactoperoxidase system (glucose oxidase-mediated lactoperoxidase Enzyme and substrate constituting the system) or sugar carbohydrates with anti-carious and antibacterial and antifungal action as a component can supplement the antibacterial function of the oral cavity.
  • the composition presented herein can effectively supplement and replace saliva, which can be usefully applied to diseases related to lowered salivation.
  • composition of the present application is hyaluronic acid, lysozyme, galactosidase peroxidase, glucose oxidase having a particular viscoelasticity also, SCN - or I -, each comprising an alcohol and buffering agents, in the final composition state viscoelastic similar to the human saliva, antibacterial activity and fungicidal Because of its activity, it is useful for the prevention or treatment of diseases associated with lowered salivation, such as dry mouth.
  • the disclosure is hyaluronic acid, lysozyme, lactoperoxidase, glucose oxidase, SCN - And / or I - It relates to an artificial saliva composition comprising a sugar alcohol and a buffer.
  • the artificial saliva composition according to the present invention comprises hyaluronic acid as opposed to the artificial saliva developed so far.
  • Hyaluronic acid as used herein is a glycosaminoglycan consisting of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine units. Glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine are connected by ⁇ (1 ⁇ 3), and N-acetyl-D-glucosamine and glucuronic acid are connected by ⁇ (1 ⁇ 4).
  • Hyaluronic acid is abundant in ocular vitreous fluid, joint lubricating fluid and extracellular matrix. Due to its inherent biocompatibility and unique physical properties, hyaluronic acid has been used in the manufacture of substances for drug delivery, relief of symptoms of artificial tears and osteoarthritis for dry eye patients (O'Brien and Collum, 2004, Curr Allergy). Asthma Rep 4: 314-319; Almond, 2007 Cell Mol Life Sci 64: 1591-1596; Fam et al. 2007 Biorheology 44: 59-74).
  • Hyaluronic acid herein is a concept including both hyaluronic acid itself and salts thereof, and the term "hyaluronic acid” means a hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt, or a mixture of hyaluronic acid and hyaluronic acid.
  • the hyaluronic acid salts include inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronic acid, and organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronic acid. In some cases, a combination of two or more thereof may be used.
  • hyaluronic acid has a molecular weight of about 5 kDa to 20,000 kDa, and the molecular weight of hyaluronic acid is not particularly limited herein, and may be about 10 kDa to 10,000 kDa.
  • the artificial saliva composition of the present application has a similar viscoelasticity to the saliva of the actual human body (see Tables 2 to 5).
  • Conventional artificial saliva which contains cellulose as a thickener, has too high a viscoelasticity than human saliva, and as a result, there is a problem that patient satisfaction is low when it is actually applied to the oral cavity.
  • hyaluronic acid is a natural component of the human body is also an advantage that is indispensable.
  • Hyaluronic acid included in the composition of the present invention has a viscoelasticity that the viscosity decreases when the shear rate is increased, but in general, human unstimulated whole saliva secreted when unstimulated at the shear rate at which the oral movement and the human body secreted when stimulated It has a viscosity range of human stimulated whole saliva.
  • the viscosity of hyaluronic acid included in the composition herein varies with shear rate and has a viscosity that varies from about 1.0 to 20.0 cps.
  • the hyaluronic acid herein has a shear rate of about 11.0 to 450.0 sec. -One At a viscosity of about 1.0 to 20.0 cps.
  • the hyaluronic acid included in the composition herein is about 45.0 to 225.0 sec shear rate -One At a viscosity of about 1.0 to 4.5 cps.
  • about 45.0 to 225.0 sec shear rate in which the oral cavity is generally in motion -One For example, about 60 sec after swallowing -One , About 160 sec when talking -One Has a viscosity similar to human saliva.
  • the range is about 45.0 sec shear rate -One Shear ranges from about 1.5 to 4.5 cps and shear rate about 225.0 sec -One In the range from about 1.0 to 2.5 cps.
  • hyaluronic acid may be included in the total composition at a concentration of about 0.25 to 0.7 mg / mL. When included in the concentration range, antimicrobial and fungicidal effects of the whole composition can be expected along with desirable viscoelasticity.
  • Artificial saliva herein also includes components related to antimicrobial enzyme activity.
  • human saliva contains about 10 kinds of digestive enzymes and many components such as vitamins, inorganic elements, hormones, proteins, glucose, urea and mucin. Among them, there is a component that prevents the growth of bacteria in the oral cavity, especially the enzyme peroxidase removes free radicals and increases the disinfecting effect of saliva.
  • the antimicrobial components of sediment include lysozyme, which is a kind of protease, gamma globulin that functions as an antibody, and other sulfur cyanide.
  • Lysozyme is a component of a group of enzymes that can dissolve the cell walls of bacteria and other microorganisms, and has been widely used as food additives and for other purposes.
  • lysozyme refers to a class of enzymes that catalyze the hydrolysis of certain mucopolysaccharides of bacterial cell walls and cause bacterial lysis.
  • the term “lysozyme” refers to natural lysozyme such as egg white lysozyme, synthetic lysozyme and recombinant lysozyme such as human recombinant lysozyme and lysozyme salts such as organic and inorganic acids, in particular physiologically acceptable acids such as chloridic acid And sulfuric acid, phosphoric acid, lactic acid, acetic acid, malic acid, fumaric acid, citric acid and ascorbic acid alone or in combination.
  • the lysozyme is human recombinant lysozyme.
  • the lysozyme is a non-human lysozyme, in particular an egg white lysozyme.
  • the concentration of lysozyme is in the range of about 10-100 ⁇ g / mL, in particular may be included at about 20-50 ⁇ g / mL.
  • the concentration range was chosen in consideration of the desired level of antimicrobial effect as well as the economics of the production cost.
  • lactoperoxidase systems mediated by glucose oxidase are used.
  • Typical Lactobacillus peroxidase system galactosidase peroxidase, thiocyanate hydrogen peroxide (H 2 O 2) carbonate (SCN -) is configured to exert an antimicrobial action.
  • the glucose oxidase mediated lactoperoxidase system according to the present application is completed by supplying hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) using glucose in the oral cavity of the patient.
  • the glucose oxidase mediated lactoperoxidase system works with lactoperoxidase, glucose oxidase, thiocyanate (SCN ⁇ ), and glucose, wherein the composition herein is applied to the saliva of a patient without glucose. The remaining glucose can be used to operate the lactoperoxidase system.
  • the glucose oxidase-mediated lactoperoxidase (GO / LPO) system used herein consumes the physiological glucose present in the oral cavity, and thus, bacteria that cause dental caries may reduce the occurrence of dental caries.
  • bacteria that cause dental caries may reduce the occurrence of dental caries.
  • hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) may be promoted to exert a stronger antibacterial effect. It has a higher antibacterial activity.
  • glucose oxidase is a catalytic enzyme of the reaction that oxidizes glucose ( ⁇ -D-glucose) with oxygen in the air to produce D-gluconic acid (D-gluconolactone). As the glucose is oxidized, hydrogen peroxide is produced to have bactericidal power.
  • Glucose oxidases of various origins can be used, for example penicillium notatum, or those from Aspergillus niger, but are not limited thereto.
  • the "peroxidase” of this application is an enzyme which catalyzes the reaction which dehydrogenates a substrate using hydrogen peroxide as an oxidizing agent (hydrogen receptor), and is also commonly called peroxidase.
  • “Lactopperoxidase” is a member of the heme peroxidase family, secreted by the mammary glands, salivary glands and other mucosal glands. The lactoperoxidase system kills bacteria in milk and mucosal secretion, playing an important role in the innate immune system. Specifically, lactoperoxidase catalyzes a reaction of oxidizing receptor materials such as thiocyanate (SCN ⁇ ) and bromide (Br ⁇ ) using hydrogen peroxide.
  • SCN ⁇ thiocyanate
  • bromide bromide
  • lactoperoxidase forms part of the antimicrobial defense system.
  • the lactoperoxidase system mediated by the glucose oxidase of the present application requires H 2 O 2 in order to exhibit an antibacterial function, which is produced by glucose and glucose oxidase.
  • Glucoseoxidase added as one component of the present application, utilizes the levels of glucose originally present in human saliva to make H 2 O 2 , and then allow lactopperoxidase to produce intermediates associated with antibacterial function.
  • glucose oxidase may be added to a composition herein at a concentration of about 10 to 200 ⁇ g / mL, especially about 20 to 80 ⁇ g / mL, and lactoperoxidase is about 10 to 70 ⁇ g / mL, especially about 12.5 to It can be added at a concentration of 50 ⁇ g / mL.
  • SCN - can be used in the form of is added to the composition of the present application to indicate that the antibacterial function by receiving the oxygen atom of the hydrogen peroxide in the Lactobacillus peroxidase system, KSCN (Potassium thiocyanate) or NaSCN (Sodium thiocyanate),
  • the concentration may be added at a concentration of about 0.5 to 3 mM, in particular about 0.5 to 1.5 mM.
  • iodine ions may be added to or instead of SCN ⁇ in the compositions herein and may be used in the form of potassium iodine (KI) or sodium iodine (NaI).
  • the concentration may be added at a concentration of about 5 ⁇ M to 0.5 mM, in particular about 5 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • the concentration range was chosen in consideration of the desired level of antimicrobial and antifungal effects along with the economics of production costs.
  • the components added to the composition itself exhibit antibacterial enzyme activity as well as antifungal function by utilizing the physiological glucose present in human saliva based on the glucose oxidase mediated lactoperoxidase system. It can effectively compensate for the reduced defense function of dry mouth disease patients.
  • compositions herein also comprise, as one component, a sugar alcohol which can function as an anti-cavity agent.
  • compositions herein may include, but are not limited to, the sugar alcohols, in particular one or more sugar alcohols selected from xylitol, sorbitol, and mannitol.
  • xylitol and / or sorbitol can be used.
  • xylitol or sorbitol can be used individually or in mixture.
  • xylitol: sorbitol can be used in a ratio of about 0: 100, about 25:75, about 50:50, about 75:25, or about 100: 0.
  • the sugar alcohol may be added to the composition herein at a concentration of about 50 to 300 mM, in particular about 100 to 200 mM.
  • concentration range was chosen in consideration of the desired level of antimicrobial effect as well as the economics of the production cost.
  • the composition herein comprises a buffer or buffer.
  • buffer or buffer is a solution that exhibits pH buffering action in the oral cavity and has a similar ionic strength as human saliva, and in particular, allows each component in the composition to maintain or increase its own activity. Make it work.
  • the presence of buffers in the oral cavity can stabilize the pH in the oral cavity. Since the buffer can stabilize phosphate ions and calcium ions in saliva, it is desirable to exhibit excellent pH buffering action in the presence of phosphate ions and calcium ions.
  • PH buffers that may be used herein may be added to neutral aqueous solutions containing phosphate and calcium ions (i.e. aqueous solutions of pH 6-8) by adding well-known buffers to observe the presence of precipitation and choosing not to form precipitates in these experiments. Can be used.
  • the oral cavity is acidified by the effects of organic acids produced by oral bacteria, and when the teeth or plaques are acidified, the calcium and phosphors of the tooth are eluted with Ca and P ions leading to the development of caries. .
  • a buffer stabilizes the pH of the saliva and dental plaques in the oral cavity to a neutral pH, so that the formation of caries does not proceed easily.
  • the pH of saliva is usually neutral.
  • buffers with buffering action at neutral pH are preferred.
  • a buffer solution similar to human saliva for example NaCl and CaCl 2 2H 2 O and a buffer solution comprising Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 or KCl, NaCl, CaCl 2 2H 2 O and Buffers containing K 2 HPO 4 are provided, but are not limited to these.
  • concentration and type of the buffer may be known and used in the art.
  • Artificial saliva composition of the present application may further include preservatives, flavors, flavor enhancers, and the like, which are known in the art, if necessary, in addition to the above-described ingredients, and the type and concentration thereof are based on the common knowledge of those skilled in the art.
  • the artificial saliva composition of the present application possesses viscoelasticity, antibacterial activity and fungicidal activity similar to human saliva, so that dry mouth and related diseases such as dental caries, periodontitis, oral fungal infections, especially oral candidiasis, tongue pain, tongue wrinkles, It is useful for the prevention or treatment of oral ulcers, oral mucosal pain, taste disorders, abrasion or glia increase or bad breath.
  • it can be applied and developed as a therapeutic agent for various immune and inflammatory diseases in other parts of the oral cavity. Since the composition of the present invention utilizes a biomaterial and a proven material, it is expected to have a rapid industrial effect due to easy market entry, and related industries such as the elderly health care field, dentistry field, intractable disease treatment field, and pharmaceutical industry. It is expected to contribute greatly to the field development.
  • Hyaluronic acid (1,630 kDa, Sigma-Aldrich, USA), hen egg white lysozyme (Sigma-Aldrich, USA), sorbacperoxidase (Sigma-Aldrich, USA), KSCN (Sigma-Aldrich, USA), glucose oxidase (Sigma-Aldrich, USA) , USA) and xylitol (Sigma-Aldrich, USA) were dissolved in a buffer solution containing 36 mM NaCl, 0.96 mM CaCl 2 2H 2 O, and 21 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 (pH 7.0).
  • a saliva composition was prepared. The final concentration in the composition of each component is as follows.
  • Bovine lactoperoxidase-0.32 ⁇ M 25 ⁇ g / mL
  • a human saliva composition was prepared in the same manner except that xylitol was replaced with sorbitol (Sigma-Aldrich, USA) in Example 1-1.
  • concentration of sorbitol was 131 mM (24 mg / mL).
  • Human saliva composition in the same manner as in Example 1-1 except that a buffer solution containing 16 mM KCl, 14.5 mM NaCl, 0.96 mM CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, and 1.95 mM K 2 HPO 4 (pH 7.1) was used.
  • a buffer solution containing 16 mM KCl, 14.5 mM NaCl, 0.96 mM CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, and 1.95 mM K 2 HPO 4 (pH 7.1) was used.
  • a buffer solution containing 16 mM KCl, 14.5 mM NaCl, 0.96 mM CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, and 1.95 mM K 2 HPO 4 (pH 7.1) was used.
  • the human saliva composition was prepared in the same manner as in Example 1-2, except that a buffer solution containing 16 mM KCl, 14.5 mM NaCl, 0.96 mM CaCl 2 2H 2 O, and 1.95 mM K 2 HPO 4 (pH 7.1) was used. Prepared.
  • pH was measured using a pH meter (pH meter 440, Corning Inc., Lowell, MA, USA). Viscosity was measured using an LVT Wells-Brookfield cone-and-plate digital viscometer (Brookfield Engineering Laboratories, USA). Shear rate increased from 11.3 to 450 s ⁇ 1 at six different rates. All measurements were performed at 37 ° C. and 0.5 mL was used for each experiment. The results are shown in Tables 1-5 below.
  • the composition of the present application has a pH similar to human saliva at pH 7, and as shown in Tables 2 to 5, the composition of the present invention has a viscosity and also a physiological range of human saliva at the shear rate at which the oral cavity functions. It maintains a viscoelastic property that decreases in viscosity with increasing shear rate, such as human saliva, and this effect was found to be similar for both buffers and sugar alcohols (xylitol and sorbitol) used.
  • Peroxidase activity SCN by peroxidase-5, 5 'of the 5-thio-2-nitrobenzoic acid (Nbs) by ion--OSCN produced in the oxidation process of dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (Nbs) 2 (Mansson-Rahemtulla B, et al., (1986). Specific assays for peroxidases in human saliva. Arch Oral Biol 31: 661-668). Lysozyme and peroxidase activity are expressed in Unit / mL and mUnit / mL, respectively.
  • the composition according to the present invention had a comparable effect to the control in the case of lysozyme included in the composition, compared to the use of HEWL and GO / bLPO alone as a control, and in the case of peroxidase showed better activity It is to exhibit the excellent effect of the present composition comprising hyaluronic acid.
  • the composition of the present invention has a similar viscosity as human saliva, but still has comparable antimicrobial activity with lysozyme alone and higher antimicrobial activity than with peroxidase alone, resulting in salivary reduction of dry mouth patients. It can be seen that it is effective in replenishing the antibacterial function due to.
  • the percentage increase in peroxidase activity present in the same system in the final composition of the present application is percentage (composition / (GO / bLPO) x100). Represented by. As shown in Tables 10-13, as a result of the component-to-component interactions in the final composition of the present application, the peroxidase activity increased by about 20% or more than when the GO / bLPO system was used alone. To indicate.
  • GO / bLPO glucose oxidase-mediated bovine lactoperoxidase system
  • GO / bLPO glucose oxidase-mediated bovine lactoperoxidase system
  • Candida albicans ATCC (18804, 10231, 11006) was inoculated in 10 mL of Sabouraud dextrose broth (Difco, USA) for antifungal activity and incubated for 24 hours with stirring at 37 ° C.
  • Cells were then harvested and washed with buffer (pH 7.0) used in Example 1 and then resuspended in the buffer (pH 7.0) at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • 40 ⁇ l of Composition 1 or 2 was then added to 20 ⁇ l of the suspension and incubated for 1.5 hours with stirring at 37 ° C.
  • the culture was then diluted 10-fold in human saliva-like buffer (pH 7.0), and then 50 ⁇ l was plated on SDA (Sabouraud Dextrose Agar, Difco) plates (repeat 3 times) and incubated overnight at 37 ° C.
  • Inhibitory activity to Candida bacteria was determined by measuring the number of colony forming units of control plates (samples not treated with the compositions herein) and test plate.
  • compositions of the present application still retain the fungicidal effect against Candida albicans (in all three strains), the main strain of oral fungal infections (10.7%-20.6%) compared to the control group.
  • the phenomenon was similar for both xylitol and sorbitol. It can be seen that the composition of the present invention has a therapeutic effect on oral candidiasis (Oral Candidiasis) that frequently occurs in dry mouth patients.
  • the above results mean that even in the final composition, each active ingredient retains useful properties required for artificial saliva without losing physical properties or activity.
  • the present application exhibits a pH, viscoelasticity, antimicrobial enzymatic activity and candidacidal activity similar to human saliva in the final composition, so that the composition of the present invention is a conventional product when applied to the oral cavity of a patient. It is suggested that it can show effective antibacterial function while eliminating dissatisfaction with

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Abstract

본원은 인체 타액과 유사한 점탄성, 항균 활성 및 살진균 활성을 보유하는 인공 타액 조성물에 관한 것으로 전단속도 약 11.3 내지 450.0 sec-1에서 점도 약 1.0 내지 20 cps 를 나타내는 히알루론산, 리소자임, 락토퍼옥시다아제, 글루코스옥시다아제, SCN- 또는<sup/>I-, 당알코올 및 완충제를 포함한다. 본원의 인공타액 조성물은 타액과 유사한 점탄성도를 나타내면서도 첨가된 성분의 항균, 살진균 활성이 유지되어 타액 분비 저하와 관계된 질환의 예방이나 치료에 유용하다.

Description

히알루론산을 포함하는 인공 타액 조성물
본원은 타액 분비 저하와 관련된 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 인공 타액 조성물에 관한 것이다.
타액의 감소로 구강이 건조해지면, 구강건조감뿐만 아니라 치아우식증 (충치)이 급속하게 일어나고, 구강 캔디다증 (진균 감염)과 구강 궤양이 빈번하게 발생하며, 노인의 경우 폐렴의 위험성도 높아지게 된다. 또한, 구강건조증 환자는 음식물을 씹거나 삼키기 힘들고 자다가 물을 마시기 위해 자주 일어나야 하는 등 삶의 질에 심각한 타격을 받게 되며, 노인 인구의 증가로 인해, 치료가 필요한 환자 수도 급증하는 추세이다.
이를 해결하기 위한 방법으로 인체 타액을 대체할 수 있는 인공타액의 개발 요구가 지속적으로 있어 왔으며 이에 따라 개발되어 시판되고 있는 제품들도 있다.
인체 타액은 힘을 받지 않고 있을 때(구강이 움직이지 않을 때)는 높은 점도를 발휘하여 치아와 구강점막을 보호하고, 구강이 움직여서 힘을 받으면 점도가 떨어져서 음식물과 섞이고, 윤활을 가능하게 하는 비뉴톤 유체 (non-Newtonian fluid)의 특성을 가지고 있다. 기존의 인공 타액은 이러한 특성을 가지고 있지 못할 뿐만 아니라, 셀룰로오스를 주성분으로 하여 인체 타액보다 너무 높은 점탄성이 얻어져 실제 구강에 적용하였을 때 환자의 만족도가 낮다는 문제가 있었다. 이를 극복하기 위하여 동물의 뮤신을 주성분으로 하는 인공타액이 유럽에서 개발되었지만 이것도 기대하는 바의 점탄성에 이르지 못하였을 뿐만 아니라 FDA 허가 역시 얻지 못하였다.
또한, 기존 인공타액에 포함되는 항균 물질은 인공타액의 주요 성분들 사이의 상호 작용으로 항균 물질 단독으로 있을 때와 달리 원하는 바의 항균 효과나 수준이 발현되지 않는 경우가 많아 환자의 감소된 항균 기능을 보충해 주지 못하는 경우가 빈번하였다.
즉, 현재까지 개발된 인공타액은 점도와 윤활력 등의 물리적 특성뿐만 아니라 항균, 항진균 활성과 같은 생물학적 특성의 측면에서도 인체 타액에 크게 미치지 못하여 이들에 대한 환자의 만족도는 미미한 실정이다.
이와 관련하여, 한국공개특허 제1994-0011001호는 리소자임을 함유하는 인공 타액 형태를 가진 구강 점막 부종 억제제를 개시하고 있고,
일본 등록특허 제09007116호는 증점제로서 하이드록시프로필 셀룰로오스를 함유하는 인공 타액을 개시하고 있으나, 어느 것도 히알루론산을 인공 타액의 구성성분으로 하고 있지 않다.
또한, 선행 논문 (Kang et al., Influences of hyaluronic acid on the anticandidal activities of lysozyme and the peroxidase system. Oral Diseases 2011;17(6, Sep):577-583)은 히알루론산과 항균 물질의 상호작용 결과, 항균물질의 살진균 활성이 감소함을 개시하고 있는데, 이것은 첨가물질의 단독 작용보다는 상호작용의 결과가 효과적인 인공타액 개발에 중요함을 제시한다.
하지만, 인공 타액에 관한 선행 기술은 최종 조성에서 기대되는 유효 효과를 가지는 인공 타액을 제시하고 있지 않다.
본원의 목적은 인체 타액과 유사한 점탄성을 가지는 인공 타액 조성물을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 구강에 적용하기 위한 최종 조성에서 항균 효소 활성 및 살진균 효과를 보유하는 인공 타액 조성물을 제공하는 것이다.
한 양태에서 본원은 전단속도에 따라 점도 1.0 내지 20.0 cps(centipoise)를 나타내는 히알루론산, 리소자임, 락토퍼옥시다아제, 글루코스 옥시다아제, SCN- 또는 I-, 당알코올 및 완충제를 포함하는 인공 타액 조성물을 제공한다.
본원 한 구현예에 따르면 본원에 포함되는 히알루론산은 전단속도 11.0 내지 450.0 sec-1에서 점도 1.0 내지 20.0 cps(centipoise)를 나타내며, 다른 구현예에서 전단속도 11.3 내지 450.0 sec-1에서 점도 1.0 내지 20.0 cps(centipoise)를 나타낸다.
본원의 다른 구현예에 따르면 본원에 포함되는 히알루론산은 전단속도 45.0 내지 225.0 sec-1에서 점도 1.0 내지 4.5 cps를 가진다.
다른 양태에서 본원은 또한 히알루론산, 리소자임, 락토퍼옥시다아제, 글루코스 옥시다아제, SCN- 또는 I-, 당알코올 및 완충제를 포함하는 인공 타액 조성물에 있어서, 상기 인공 타액 조성물은 0.25 내지 0.7 mg/mL의 히알루론산을 포함하는 인공 타액 조성물을 제공한다.
본원의 한 구현예에 따르면 본원 조성물에 포함되는 리소자임의 농도는 약 10 내지 100μg/mL이다.
본원의 다른 구현예에 따르면 본원 조성물에 포함되는 락토퍼옥시다아제의 농도는 약 10 내지 70μg/mL이다.
본원의 또다른 구현예에 따르면 본원 조성물에 포함되는 당알코올은 자일리톨, 솔비톨 또는 만니톨 또는 이의 혼합물이며, 그 농도는 약 50 내지 300 mM이다.
본원의 또다른 구현예에 따르면 본원 조성물에 포함되는 글루코스 옥시다아제의 농도는 약 10 내지 200μg/mL이다.
본원의 또다른 구현예에 따르면 본원 조성물에 포함되는 SCN-은 KSCN 또는 NaSCN 형태이며, 그 농도는 0.5 내지 3mM이다.
본원의 또다른 구현예에 따르면 본원 조성물에 포함되는 I-은 KI 또는 NaI 형태이며, 그 농도는 약 5 μM 내지 0.5 mM이다.
다른 양태에서 본원은 전단속도 약 11.0 내지 450.0 sec-1에서 점도 약 1.0 내지 20.0 cps, 특히 전단속도 약 45.0 내지 225.0 sec-1에서 점도 약 1.0 내지 4.5 cps를 갖는 히알루론산, 또는 약 0.25 내지 0.7 mg/mL의 히알루론산; 약 10 내지 100μg/mL의 리소자임; 약 10 내지 70μg/mL의 락토퍼옥시다아제; 약 50 내지 300 mM의 자일리톨, 솔비톨 또는 만니톨 중 하나 이상; 약 10 내지 200μg/mL의 글루코스 옥시다아제; 및 약 0.5 내지 3mM의 KSCN 또는 NaSCN 또는 약 5 μM 내지 0.5 mM의 KI 또는 NaI를 포함한다.
본원에 따른 인공타액 조성물은 타액 분비 저하와 관계된 질환, 특히 구강 건조증 또는 구강 건조과 관련된 질환, 예를 들면 치아우식증, 치주염, 구강 진균감염, 혀통증, 혀주름, 구강 궤양, 구강점막 통증, 미각 장애, 치아마모 및 교모 증가 또는 구취의 치료 또는 예방용으로 사용된다.
본원은 종래 기술과 달리 인공 타액 조성물에 히알루론산을 포함함으로써 조성물의 점도를 인체의 타액과 유사하게 조절할 수 있고, 그 외에도 리소자임과 같은 항균 효소, 글루코스옥시다아제 매개 락토퍼옥시다아제 시스템(glucose oxidase-mediated lactoperoxidase system)을 구성하는 효소 및 기질이나 항우식 작용 및 항균, 항진균 작용이 있는 당알코올을 구성성분으로 포함하여 구강의 항균 기능을 보충할 수 있다.
즉, 구강에 적용할 수 있는 인공 타액의 최종 조성에서 자연적인 인체 타액과 유사한 점탄성을 보유하고, 항균 효소 활성 및 살진균 효과를 갖고 있음이 본원에 의해 확인되었으므로, 본원에서 제시하는 조성물은 인체의 타액을 효과적으로 보충, 대체하여 타액 분비 저하와 관계된 질환에 유용하게 적용할 수 있다.
본원의 조성물은 특정 점탄성도를 갖는 히알루론산, 리소자임, 락토퍼옥시다아제, 글루코스 옥시다아제, SCN- 또는 I-, 당알코올 및 완충제를 포함하며, 최종 조성 상태에서 인체 타액과 유사한 점탄성, 항균 활성 및 살진균 활성을 보유하므로, 구강건조증과 같은 타액 분비 저하와 관계된 질환의 예방이나 치료에 유용하다.
이하, 본 명세서에 사용된 용어의 정의를 포함하여 본원을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명한다.
한 양태에서 본원은 히알루론산, 리소자임, 락토퍼옥시다아제, 글루코스 옥시다아제, SCN- 및/또는 I-, 당알코올 및 완충제를 포함하는 인공 타액 조성물에 관한 것이다.
본원에 따른 인공 타액 조성물은 지금까지 개발된 인공 타액에서와 달리 히알루론산을 포함한다.
본원에서 사용되는 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민 단위로 이루어진 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이다. 글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민은 β(1→3) 연결되어 있으며, N-아세틸-D-글루코사민 및 글루쿠론산은 β(1→4)로 연결되어 있다.
히알루론산은 안구 유리액, 관절의 윤활액 및 세포외 기질(extracellular matrix)에 풍부하다. 이것의 고유의 생체적합성 및 독특한 물리적 특성에 의하여 히알루론산은 약물 전달, 안구 건조 환자를 위한 인공 눈물 및 골관절염의 증상 완화를 위한 물질의 제조에 사용돼왔다(O'Brien and Collum, 2004, Curr Allergy Asthma Rep 4:314-319; Almond, 2007 Cell Mol Life Sci 64:1591-1596; Fam et al. 2007 Biorheology 44: 59-74).
본원에서의 히알루론산은 히알루론산 자체와 그것의 염을 모두 포함하는 개념으로, 용어 "히알루론산" 은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산과 히알루론산의 혼합물을 의미한다. 상기 히알루론산 염에는, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염이 포함된다. 경우에 따라서는, 이들의 둘 또는 그 이상의 조합이 사용될 수도 있다.
또한, 히알루론산은 분자량이 약 5 kDa 내지 20,000 kDa으로, 본원에서 히알루론산의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니며, 약 10 kDa 내지 10,000 kDa 일 수 있다.
상기 히알루론산을 포함함으로써 본원의 인공 타액 조성물은 실제 인체의 타액과 유사한 점탄성을 갖게 된다 (표 2 내지 표 5 참조). 셀룰로오스를 증점제 등으로 포함하였던 종래의 인공 타액이 인체 타액보다 너무 높은 점탄성을 갖게 되고 그 결과 실제 구강에 적용하였을 때 환자의 만족도가 낮다는 문제가 있었던 바, 본원은 이러한 문제를 해결하였다. 또한 히알루론산은 자연적인 인체 내 성분이므로 안전하다는 점도 빼놓을 수 없는 장점이다.
본원의 조성물에 포함되는 히알루론산은 전단속도 증가시 점도가 감소하는 점탄성을 보유하면서도, 일반적으로 구강이 운동하는 전단속도에서 비자극시 분비되는 인체 전타액 (human unstimulated whole saliva)과 자극시 분비되는 인체 전타액 (human stimulated whole saliva)의 점도범위를 가진다. 한 구현예에서 본원의 조성물에 포함되는 히알루론산의 점도는 전단속도에 따라 변화하며, 점도 약 1.0 내지 20.0 cps에서 변화하는 점도를 가진다. 다른 구현예에서 본원의 히알루론산은 전단속도 약 11.0 내지 450.0 sec-1에서 점도 약 1.0 내지 20.0 cps를 가진다. 또다른 구현예에서 본원 조성물에 포함되는 히알루론산은 전단속도 약 45.0 내지 225.0 sec-1에서 점도 약 1.0 내지 4.5 cps를 가진다. 구체적으로 구강이 일반적으로 운동하는 상태인 전단속도 약 45.0 내지 225.0 sec-1, 예를 들면 연하시 약 60 sec-1, 말을 할 때 약 160 sec-1에서 인체 타액과 유사한 점도를 가진다. 그 범위는 전단속도 약 45.0 sec-1에서 약 1.5 내지 4.5 cps 범위이고 전단속도 약 225.0 sec-1에서 약 1.0 내지 2.5 cps 범위이다.
히알루론산의 점도 및 점탄성도는 분자량에 영향을 받기 때문에, 상기 특징을 고려하여 적절한 농도 및 분자량을 선택할 수 있을 것이다. 구체적으로, 히알루론산은 전체 조성물에 약 0.25 내지 0.7 mg/mL 의 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위로 포함되는 경우, 바람직한 점탄성과 함께 전체 조성물의 항균 및 살진균 효과도 기대할 수 있다.
본원의 인공타액은 또한 항균 효소 활성과 관계된 성분을 포함한다.
통상 인간의 타액에는 10 여종의 소화효소를 비롯하여 비타민, 무기원소, 호르몬, 단백질, 포도당, 요소 및 뮤신 등 많은 성분들이 함유되어 있다. 이 중에는 구강 내 세균의 번식을 막아주는 성분도 있으며, 특히 효소인 퍼옥시다아제는 활성산소를 제거하며, 침의 소독효과를 크게 해준다. 또한, 침속의 항균성분에는 단백질 분해효소의 일종인 리소자임, 항체기능을 하는 감마 글로불린, 기타 시안화황 등이 포함되어 우리 몸을 방어한다.
리소자임은 세균 및 기타 미생물의 세포벽을 용해할 수 있는 효소 그룹의 구성요소로, 식품 첨가제로 그리고 기타 목적으로 널리 사용되어 왔다.
본원에 사용된 용어 "리소자임"은 세균 세포벽의 특정 뮤코다당류의 가수분해를 촉매화하고 세균 융해를 일으키는 효소의 부류를 의미한다. 용어 "리소자임"은 천연 리소자임, 예컨대 계란 흰자 리소자임, 합성 리소자임 및 재조합 리소자임, 예컨대 인간 재조합 리소자임 및 리소자임 염, 예컨대 유기 및 무기산, 특히 생리학적으로 허용되는 산, 예를 들어 클로리드 산(chloridic acid), 황산, 인산, 락트산, 아세트산, 말산, 푸마르산, 시트르산, 아스코르빈산을 단독으로 또는 조합하여 얻은 것을 포함한다.
원칙상 모든 리소자임이 본원의 조성물에 유용하다. 한 구현예에서, 리소자임은 인간 재조합 리소자임이다. 다른 바람직한 구현예에서 리소자임은 비-인간 리소자임, 특히 계란 흰자 리소자임이다.
본원의 조성물에서, 리소자임의 농도는 약 10~100μg/mL의 범위 내이며, 특히 약 20~50μg/mL로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위는 생산 단가의 경제적인 면과 함께 원하는 수준의 항균 효과를 고려하여 선택되었다.
본원의 조성물에는 글루코스 옥시다아제에 의해서 매개되는 락토퍼옥시다아제 시스템이 사용된다. 일반적인 락토퍼옥시다아제 시스템은 락토퍼옥시다아제, 과산화수소 (H2O2), 티오시아네이트 (SCN-)로 구성되어 항균 작용을 발휘한다. 반면 본원에 따른 글루코스 옥시다아제 매개 락토퍼옥시다아제 시스템은 글루코스 옥시다아제가 환자의 구강에 있는 글루코스를 활용하여 과산화수소 (H2O2)를 공급함으로써 완성되는 것이다. 따라서 본원에 사용되는 글루코스 옥시다아제 매개 락토퍼옥시다아제 시스템은 락토퍼옥시다아제, 글루코스 옥시다아제, 티오시아네이트 (SCN-), 및 글루코스를 이용하여 작용하는 것으로, 본원의 조성물은 글루코스를 포함하지 않고도 환자의 타액에 남아 있는 글루코스를 활용하여 락토퍼옥시다아제 시스템을 작동할 수 있는 것이다.
글루코스를 포함하는 경우 충치(치아우식증) 유발 가능성을 증가시킨다. 따라서 본원에서 이용하는 글루코스 옥시다아제 매개 락토퍼옥시다아제(GO/LPO) 시스템은 구강에 존재하는 생리적인 글루코스를 소모하므로 치아우식증을 유발시키는 세균이 글루코스를 활용하여 충치를 유발하는 것을 줄일 수 있다. 또한 환자가 당분을 섭취하여 입안의 글루코스 농도가 높아진 경우에는 이를 더 많이 활용, 과산화수소 (H2O2) 생성을 촉진하여 더 강한 항균 효과를 발휘할 수 있으며, 특히 당뇨 환자의 경우 타액내 글루코스 농도가 높아져 있으므로 더 높은 항균 활성을 가진다. 당뇨 환자에서 구강건조증의 유병율이 높고 구강 궤양이 많이 생기며 구강 진균 감염이 높다는 것을 고려하면, 본원의 조성물은 큰 장점을 가진다.
본원에 사용되는“글루코스 옥시다아제”는 포도당(β-D-글루코스)을 공기 중 산소로 산화시켜 D-글루콘산(D-글루코노락톤)을 생성하는 반응의 촉매효소이다. 포도당의 산화에 따라 과산화수소가 생성되어 살균력을 가진다. 다양한 유래의 글루코스 옥시다아제가 사용될 수 있으며, 예를 들면 페니실리움 노테이텀(Penicillium notatum), 또는 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger) 유래의 것이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의“퍼옥시다아제”는 산화제(수소 수용체)로서 과산화수소를 이용해 기질을 탈수소화시키는 반응을 촉매하는 효소로 보통 과산화효소라고도 한다. “락토퍼옥시다아제”는 유선, 침샘 및 다른 점막샘 등에서 분비되는, 헴(heme) 퍼옥시다아제 패밀리를 구성하는 일원이다. 락토퍼옥시다아제 시스템은 우유 및 점막 분비(mucosal secretion)에서 박테리아를 사멸시켜, 선천적면역계(innate immune system)에서 중요한 역할을 한다. 구체적으로 락토퍼옥시다아제는 아래와 같이 티오시아네이트(SCN-), 브로마이드(Br-)와 같은 수용체 물질을 과산화수소를 이용하여 산화시키는 반응을 촉매한다.
수용체 + H2O2 → 산화된 수용체 + H2O
티오시아네이트 (SCN-) → 히포티오시아니트 (OSCN-)
브로마이드 (Br-) → 히포브로미트 (BrO-)
상대적으로 짧게 존재하는 이들 산화된 중간체들은 강력한 항균 작용을 하므로, 락토퍼옥시다아제는 항균 방어 시스템의 일부를 구성한다. 본원에는 다양한 유래, 특히 포유류, 특히 인간 또는 소(bovine)유래의 천연 또는 재조합 락토퍼옥시다아제가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
상술한 바와 같이 본원의 글루코스옥시다아제에 의해서 매개되는 락토퍼옥시다아제 시스템은 항균 기능을 나타내기 위해서 아래 반응식과 같이 H2O2가 필요하며, 이는 글루코스와 글루코스옥시다아제에 의해 생성된다. 본원의 일 구성성분으로 첨가되는 글루코스옥시다아제는 인체 타액에 원래 존재하는 수준의 글루코스를 활용하여 H2O2를 만들고, 이어 락토퍼옥시다아제가 항균 기능과 관련된 중간체를 제조할 수 있게 한다.
glucose oxidase
β-D-Glucose+O2 ---------------------> β-D-Glucono-δ-lactone+H2O2
lactoperoxidase
H2O2 +SCN- ---------------------> OSCN- + H2O
본원의 구체적인 구현예에서 글루코스옥시다아제는 본원의 조성물에 약 10 내지 200μg/mL, 특히 약 20 내지 80μg/mL의 농도로 첨가될 수 있으며, 락토퍼옥시다아제는 약 10 내지 70μg/mL, 특히 약 12.5 내지 50μg/mL의 농도로 첨가될 수 있다.
SCN- (thiocyanate)은 상기 락토퍼옥시다아제 시스템에서 과산화수소의 산소 원자를 수용함으로써 항균 기능을 나타내기 위해 본원의 조성물에 첨가되며, KSCN (Potassium thiocyanate) 또는 NaSCN (Sodium thiocyanate)의 형태로 사용될 수 있으며, 농도는 약 0.5 내지 3mM, 특히 약 0.5 내지 1.5mM의 농도로 첨가될 수 있다.
또한 SCN- 대신에 또는 이와 함께 요오드이온 (I-)이 본원의 조성물에 첨가될 수 있으며, 포타슘요오드 (KI) 또는 나트륨요오드 (NaI)의 형태로 사용될 수 있다. 농도는 약 5 μM 내지 0.5 mM, 특히 약 5 μM 내지 50 μM의 농도로 첨가될 수 있다.
상기 농도 범위는 생산 단가의 경제적인 면과 함께 원하는 수준의 항균 및 항진균 효과를 고려하여 선택되었다.
본원에서는 실시예에 제시된 바와 같이, 글루코스옥시다아제 매개 락토퍼옥시다아제 시스템 (glucose oxidase-mediated lactoperoxidase system)이 구강의 생리적 글루코스 농도에서 작용함을 확인하였다 (표 10 내지 표 15 참조). 이는 타액에 존재하는 글루코스 농도에서 본원의 인체 타액 조성물이 실제로 항균 효소 활성과 항진균 활성을 나타내는 것을 의미한다.
본원의 조성물의 경우, 상기 조성물에 첨가되는 성분들이 자체로 항균 효소 활성을 나타낼 뿐만 아니라 글루코스옥시다아제 매개 락토퍼옥시다아제 시스템을 기반으로 인체 타액에 존재하는 생리적인 글루코스를 활용하여 항진균 기능을 나타내므로, 감염성 질환에 대한 구강건조증 환자의 감소된 방어기능을 효과적으로 보충해 줄 수 있다.
본원의 조성물은 또한 항-충치제로 기능할 수 있는 당알코올을 일 구성성분으로 포함한다.
"당알코올"은 단당류의 카보닐기를 환원하여 만들어지는 히드록시기가 두 개 이상인 알코올이나, 그와 같은 계열에 속하는 화합물을 통틀어 일컫는 것이다. 일반적으로 HOCH2(CHOH)nCH2OH (n=2~5)의 화학식을 가지며, 히드록시기의 수에 따라 4가 당알코올(tetritol), 5가 당알코올(pentitol), 6가 당알코올(hexitol) 및 7가 당알코올(heptitol)로 분류된다. 이들은 모두 자연계에 천연적으로 존재하나 시판되는 것은 대부분 합성에 의해 얻어진다. 일반적으로 당알코올은 우수한 보습성, 용해열의 특성에 힘입어 주로 식품첨가물로 사용되어온 소재로 식품의 이용범위가 제한되어 왔으나, 최근에 당알코올이 비만, 당뇨 등의 원인이 되지 않는 생리적 기능이 밝혀지면서 새로운 감미료 및 증점제로 각종 식품의 주원료로 광범위하게 사용되고 있으며 또한 껌이나 치약, 의약품 등에도 다량 사용되고 있다.
본원의 조성물은 상기 당알코올로서, 특히 자일리톨, 솔비톨, 및 만니톨로부터 선택된 하나 이상의 당알코올을 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 특히 자일리톨 및/또는 솔비톨이 사용될 수 있다.
특히 이들 중 자일리톨 혹은 솔비톨을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들면 자일리톨 : 솔비톨은 약 0:100,약 25:75, 약 50:50, 약 75:25, 또는 약 100:0의 비율로 사용될 수 있다.
본원의 구현예에서 상기 당알코올은 본원의 조성물에 약 50 내지 300 mM, 특히 약 100 내지 200 mM의 농도로 첨가될 수 있다. 상기 농도 범위는 생산 단가의 경제적인 면과 함께 원하는 수준의 항균 효과를 고려하여 선택되었다.
본원의 다른 구현예에 따르면, 본원의 조성물은 완충제 또는 완충용액을 포함한다. 본원에 사용되는 "완충제" 또는 "완충용액"이라는 용어는 구강 내 pH 완충 작용을 나타내는 용액으로 인체 타액과 유사한 이온강도를 가지며, 특히 본원 조성물에 포함된 각 성분들이 고유의 활성을 유지하도록 하거나 상승 작용을 갖도록 한다. 구강 내 완충제의 존재는 구강 내 pH를 안정화시킬 수 있다. 완충제는 타액내의 인산 이온 및 칼슘 이온을 안정화시킬 수 있기 때문에 인산 이온 및 칼슘 이온의 존재 시 우수한 pH 완충 작용을 나타내는 것이 바람직하다.
본원에 사용될 수 있는 pH 완충제는 널리 알려진 완충제들을 인산 이온 및 칼슘 이온 함유 중성 수용액(즉, pH 6~8의 수용액)에 첨가하여 침전의 유무를 관찰하고 이러한 실험에서 침전물을 형성하지 않는 것을 선택하여 사용할 수 있다.
완충제가 존재하지 않는다면 구강은 구강 박테리아에 의해 생성된 유기산의 효과에 의해 산성화되고, 치아나 플라크가 산성화되면 치아의 칼슘 및 인광체(phosphor)는 Ca 및 P 이온으로 용출되어 충치의 발달을 초래하게 된다. 그러나, 완충제가 존재하게 되면 구강 내 타액 및 치아 플라크의 pH가 중성 pH 상태로 안정하게 되어 충치 형성이 쉽게 진행되지 않는다. 타액의 pH는 일반적으로 중성 상태이다. 따라서 중성 pH에서 완충 작용을 지닌 완충제가 바람직하다.
한 구현예에서 사람 타액과 유사한 완충 용액이 사용되며, 예를 들면 NaCl 및 CaCl22H2O 및 Na2HPO4/NaH2PO4를 포함하는 완충용액 또는 KCl, NaCl, CaCl22H2O 및 K2HPO4을 포함하는 완충용액을 제시하나, 이들로 제한되는 것이 아니다. 상기 완충제의 농도 및 종류는 당업계에 공지된 것 및 이를 변형하여 사용할 수 있다.
본원의 인공 타액 조성물은 상술한 성분 이외에도 필요한 경우 당업계에 공지된, 방부제, 향, 향미 증진제 등을 더 포함할 수 있으며, 그 종류와 농도는 당업자의 통상의 지식에 의한다.
본원의 인공 타액 조성물은 인체 타액과 유사한 점탄성, 항균 활성, 살진균 활성을 보유하므로, 구강건조증 및 그 관련 질환 예를 들면 치아우식증, 치주염, 구강 진균감염, 특히 구강 캔디다증, 혀통증, 혀주름, 구강 궤양, 구강점막 통증, 미각 장애, 치아마모 또는 교모 증가 또는 구취의 예방이나 치료에 유용하다. 뿐만 아니라, 구강 이외의 다른 부위의 다양한 면역성, 염증성 질환 치료제로서도 응용, 개발 가능하다. 본원의 조성물은 생체 물질 및 안정성이 입증된 물질을 활용하므로, 시장 진입이 용이하여 산업적 효과가 신속하게 나타날 것으로 기대되어 관련 산업 예를 들면 노인 보건의료 분야, 치의학 분야, 난치성 질환 치료 분야, 제약 산업 분야 발전에 크게 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통하여 본원을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본원의 요지에 따라 본원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 인공타액 조성물의 제조
완충액 및 당알코올의 종류를 달리하여 하기와 같이 상이한 4 종류의 인공타액 조성물을 제조하였다.
실시예 1-1 인공타액 조성물 1의 제조
히알루론산 (1,630 kDa, Sigma-Aldrich, USA), 암탉 난백 리소자임(Sigma-Aldrich, USA), 소락토퍼옥시다아제(Sigma-Aldrich, USA), KSCN(Sigma-Aldrich, USA), 글루코스옥시다아제(Sigma-Aldrich, USA) 및 자일리톨(Sigma-Aldrich, USA)을 36 mM NaCl, 0.96 mM CaCl22H2O, 및 21 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.0)를 포함하는 완충용액에 용해하여 인체 타액 조성물을 제조하였다. 각 성분들의 조성물에서의 최종 농도는 다음과 같다.
히알루론산 - 0.3 μM (0.05%),
암탉 난백 리소자임 - 2.0 μM (30 μg/mL),
소 락토퍼옥시다아제 - 0.32 μM (25 μg/mL),
KSCN - 1.0 mM (97.2 μg/mL),
글루코스 옥시다제 - 0.313 μM (50 μg/mL),
자일리톨 - 131 mM (20 mg/mL)
실시예 1-2 인공타액 조성물 2의 제조
실시예 1-1에서 자일리톨을 솔비톨(Sigma-Aldrich, USA)로 대체한 것을 제외하고 동일한 방법으로 인체 타액 조성물을 제조하였다. 이 경우 솔비톨의 농도는 131 mM (24 mg/mL)이었다.
실시예 1-3 인공타액 조성물 3의 제조
실시예 1-1에서 16 mM KCl, 14.5 mM NaCl, 0.96 mM CaCl2·2H2O, 및 1.95 mM K2HPO4(pH 7.1)를 포함하는 완충용액을 사용한 것을 제외하고 동일한 방법으로 인체 타액 조성물을 제조하였다.
실시예 1-4 인공타액 조성물 4의 제조
실시예 1-2에서 16 mM KCl, 14.5 mM NaCl, 0.96 mM CaCl22H2O, 및 1.95 mM K2HPO4(pH 7.1)를 포함하는 완충용액을 사용한 것을 제외하고 동일한 방법으로 인체 타액 조성물을 제조하였다.
실험예 1: 인공 타액 조성물의 물성 및 활성 평가
실시예 1에서 제조된 각 조성물들에 대하여 각각 pH, 점도, 리소자임 활성, 락토퍼옥시다아제 활성 및 살진균 활성을 측정하였다. 각 실험 당 6회 측정한 평균값을 사용하였으며 Wilcoxon signed ranks 테스트를 이용하여 분석하였고, P값 (유의성)이 0.05 미만인 것을 통계적으로 유의한 것으로 하였다.
실험예 1-1 점도 및 pH 측정
pH는 pH 미터(pH meter 440, Corning Inc., Lowell, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 점도는 LVT Wells-Brookfield cone-and-plate digital viscometer (Brookfield Engineering Laboratories, USA)를 이용하여 측정하였다. 전단 속도는 6개의 상이한 속도로 11.3부터 450 s-1까지 증가시켰다. 모든 측정은 37℃에서 수행하였으며, 각 실험별로 0.5mL을 사용하였다. 결과는 하기 표 1 내지 5에 기재되어 있다.
표 1 인공타액 조성물의 pH
조성물 조성물 1 조성물 2 조성물 3 조성물 4
pH 7.00 ± 0.01 7.00 ± 0.01 7.19 ± 0.03 7.12 ± 0.06
표 2 조성물 1의 전단 속도에 따른 점도
전단속도(sec-1) 11.3 22.5 45.0 90.0 225.0 450.0
조성물 1점도(cps) 2.85±0.26 2.67±0.23 2.70±0.21 2.61±0.20 2.45±0.16 2.31±0.15
표 3 조성물 2의 전단 속도에 따른 점도
전단속도(sec-1) 11.3 22.5 45.0 90.0 225.0 450.0
조성물 2점도(cps) 2.75±0.18 2.54±0.12 2.59±0.11 2.54±0.11 2.40±0.09 2.27±0.07
표 4 조성물 3의 전단 속도에 따른 점도
전단속도(sec-1) 11.3 22.5 45.0 90.0 225.0 450.0
조성물 3점도(cps) 2.81±0.21 2.99±0.09 2.99±0.13 2.86±0.10 2.64±0.08 2.46±0.08
표 5 조성물 4의 전단 속도에 따른 점도
전단속도(sec-1) 11.3 22.5 45.0 90.0 225.0 450.0
조성물 4점도(cps) 2.73±0.16 2.73±0.16 2.77±0.12 2.68±0.11 2.50±0.10 2.35±0.08
표 1에 기재된 바와 같이 본원의 조성물은 pH 7로 인체 타액과 유사한 pH 를 가지고 있으며, 표 2 내지 표 5에 나타난 바와 같이 본원 조성물은 점도 또한 구강이 기능시 나타나는 전단속도에서 인체 타액의 생리적인 범위에 있고, 인체 타액과 같이 전단속도가 증가함에 따라 점도가 감소하는 점탄성(viscoelastic property)을 유지하고 있으며, 이러한 효과는 사용된 두 가지 완충액 및 당알코올 (자일리톨과 솔비톨)의 경우 모두 유사한 것으로 나타났다.
실험예 1-2 리소자임 활성 및 락토퍼옥시다아제 활성 측정
리소자임 활성은 탁도측정법 (turbidimetric method)(Grossowicz and Ariel, (1983). Methods for determination of lysozyme activity. Methods Biochem Anal 29: 435-446)을 이용하였으며, 시료를 동결건조된 Micrococcus lysodeikticus ATCC 4698 (시작시 OD450 = 0.65-0.70)에 처리하였다.
퍼옥시다아제 활성은 퍼옥시다아제에 의한 SCN-의 산화과정에서 생성되는 OSCN- 이온에 의해 5-티오-2-니트로벤조산(Nbs)의 5,5 '-디티오비스(2-니트로벤조산)(Nbs)2로의 산화율로 측정하였다 (Mansson-Rahemtulla B, et al., (1986). Specific assays for peroxidases in human saliva. Arch Oral Biol 31: 661-668). 리소자임 및 퍼옥시다아제 활성은 각각 Unit/mL과 mUnit/mL로 나타내었다.
결과는 표 6 내지 13에 기재하였다.
본원에 따른 조성물은 대조군으로 HEWL 및 GO/bLPO를 단독으로 사용한 것과 비교하여, 본원 조성물에 포함된 리소자임의 경우, 대조군과 필적하는 효과를 가지며, 퍼옥시다아제의 경우는 이보다 우수한 활성을 나타내었으며, 이는 히알루론산을 포함하는 본원 조성물의 우수한 효과를 나타내는 것이다. 즉, 본원 조성물은 인체 타액과 유사한 점도를 보이면서도 리소자임 단독으로 있을 때와 필적한 항균 활성을 여전히 가지고 있고, 퍼옥시다아제 단독으로 있을 때보다 더 높은 항균 활성을 가지고 있어, 구강건조증 환자의 타액감소로 인한 항균 기능 저하의 보충에 효과적임을 알 수 있다. 또한 글루코스옥시다아제 매개 락토퍼옥시다아제 시스템이 단독으로 사용될 때의 퍼옥시다아제의 활성과 비교하여, 본원의 최종 조성 상태에서 동일한 시스템에 존재하는 퍼옥시다아제 활성의 증가율을 백분율 (조성물/(GO/bLPO)x100)로 나타내었다. 표 10 내지 표 13에 기재된 바와 같이 본원 최종 조성 상태에서 성분 간 상호작용의 결과로서 퍼옥시다아제 활성이 GO/bLPO 시스템이 단독으로 사용되는 경우보다 약 20% 이상 증가하였으며, 이는 본원 조성물의 우수한 효과를 나타내는 것이다.
표 6 조성물 1의 리소자임 활성
시료 HEWL 조성물 1 유의성
리소자임 활성Units/mL 1188.8 ± 82.3 1152.5 ± 91.4 0.106
HEWL : Hen egg white lysozyme
표 7 조성물 2의 리소자임 활성
시료 HEWL 조성물 2 유의성
리소자임 활성Units/mL 1205.0 ± 57.8 1139.3 ± 89.3 0.249
표 8 조성물 3의 리소자임 활성
시료 HEWL 조성물 3 유의성
리소자임 활성Units/mL 1084.5 ± 130.8 1077.8 ± 106.1 0.674
표 9 조성물 4의 리소자임 활성
시료 HEWL 조성물 4 유의성
리소자임 활성Units/mL 1225.7 ± 76.6 1228.7 ± 57.9 0.917
표 10 조성물 1의 퍼옥시다아제의 활성
시료 GO/bLPO 조성물 1 유의성 %
퍼옥시다제mUnits/mL 0.178 ± 0.016 0.238 ± 0.029 0.027 35.9 ± 26.2
GO/bLPO : glucose oxidase-mediated bovine lactoperoxidase system
표 11 조성물 2의 퍼옥시다아제의 활성
시료 GO/bLPO 조성물 2 유의성 %
퍼옥시다제mUnits/mL 0.176 ± 0.021 0.212 ± 0.029 0.027 20.9 ± 8.1
GO/bLPO : glucose oxidase-mediated bovine lactoperoxidase system
표 12 조성물 3의 퍼옥시다아제의 활성
시료 GO/bLPO 조성물 3 유의성 %
퍼옥시다제mUnits/mL 0.157 ± 0.019 0.199 ± 0.015 0.028 27.3 ± 11.1
표 13 조성물 4의 퍼옥시다아제의 활성
시료 GO/bLPO 조성물 4 유의성 %
퍼옥시다제mUnits/mL 0.163 ± 0.028 0.193 ± 0.040 0.028 17.8 ± 9.6
실험예 1-3 항진균 활성 측정
항진균 활성 측정을 위해 Candida albicans ATCC (18804, 10231, 11006)를 10mL의 Sabouraud dextrose broth (Difco, USA) 에 접종하고 37℃에서 교반하면서 24시간 배양하였다. 이어 세포를 수확한 후 실시예 1에서 사용한 완충용액(pH 7.0)으로 세척한 후, 1x105 세포/mL의 농도로 상기 완충용액(pH 7.0)에 재현탁하였다. 이어 40μl의 조성물 1 또는 2를 20μl의 상기 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 교반하며 1.5시간 동안 배양하였다. 이어 배양물을 인체타액 유사완충용액(pH 7.0)에 10배 희석한 후, 50μl를 SDA (Sabouraud Dextrose Agar, Difco) 플레이트에 도말하고 (3회 반복) 37℃ 에서 하룻밤동안 배양하였다. 캔디다 균에 억제 활성은 대조군 플레이트 (본원의 조성물로 처리되지 않은 시료)와 시험군 플레이트의 형성된 콜로니 수 (Colony Forming Unit)를 측정하여 결정하였다.
결과는 표 14 및 15에 기재되어 있다. 하기 표에 나타난 바와 같이 본원의 조성물은 대조군과 비교하여 구강 진균 감염의 주 균주인 Candida albicans (3가지 strain에 모두에서)에 대해 살진균 효과를 여전히 보유하고 있으며 (10.7% - 20.6%), 이러한 현상이 자일리톨과 솔비톨의 경우에 모두 유사하였다. 이는 본원 조성물이 구강건조증 환자에서 빈번하게 발생하는 구강 캔디다 증(Oral Candidiasis)에 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
표 14 조성물 1의 항진균 활성
Candida albicans N=6 대조군 실시예 1 유의성
ATCC 18804 CFU 157.6 ± 13.2 139.6 ± 19.5 0.144
% Killing - 10.7 ± 15.3 -
ATCC 10231 CFU 140.5 ± 4.9 116.8 ± 26.8 0.046
% Killing - 17.1 ± 17.2 -
ATCC 11006 CFU 149.2 ± 17.2 129.2 ± 15.7 0.027
% Killing - 13.3 ± 7.1 -
표 15 조성물 2의 항진균 활성
Candida albicans N=6 대조군 실시예 2 유의성
ATCC 18804 CFU 152.8 ± 17.7 135.4 ± 22.3 0.028
% Killing - 11.7 ± 6.5 -
ATCC 10231 CFU 158.6 ± 36.0 130.3 ± 31.4 0.028
% Killing - 17.5 ± 11.2 -
ATCC 11006 CFU 129.4 ± 18.3 103.5 ± 24.8 0.027
% Killing - 20.6 ± 12.4 -
종합하면 위와 같은 결과는 최종 조성물 상태에서도 각 유효성분이 물성이나 활성을 잃지 않고, 인공 타액에 요구되는 유용한 특성을 그대로 보유함을 의미한다. 즉, 본원은 최종 조성 상태에서 인체 타액과 유사한 pH, 점탄성(viscoelasticity), 항균 효소 활성(antimicrobial enzymatic activity) 및 살진균 작용(candidacidal activity)을 나타내므로, 본원의 조성물은 환자 구강에 적용시 종래 제품의 불만족도를 해소하면서도 효과적인 항균 기능을 나타낼 수 있음을 제시하는 것이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본원에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본원의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본원에 도입된다.

Claims (13)

  1. 전단속도에 따라 점도 약 1.0 내지 20.0cps 를 나타내는 히알루론산, 리소자임, 락토퍼옥시다아제, 글루코스옥시다아제, SCN- 또는 I-, 당알코올 및 완충제를 포함하는 인공 타액 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 전단속도는 약 11.0 내지 450.0 sec-1인 인공 타액 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 히알루론산은 전단속도 약 45.0 내지 225.0 sec-1에서 점도 약 1.0 내지 4.5 cps 를 나타내는 것인 인공 타액 조성물.
  4. 히알루론산, 리소자임, 락토퍼옥시다아제, 글루코스옥시다아제, SCN- 또는 I-, 당알코올 및 완충제를 포함하는 인공 타액 조성물에 있어서, 상기 인공 타액 조성물은 약 0.25 내지 0.7 mg/mL의 히알루론산을 포함하는 것인, 인공 타액 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 10 내지 100μg/mL의 리소자임을 포함하는 것인 인공 타액 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 10 내지 70μg/mL의 락토퍼옥시다아제를 포함하는 것인, 인공 타액 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 당알코올은 자일리톨, 솔비톨 또는 만니톨 또는 이의 혼합물이며, 50 내지 300 mM의 농도로 포함되는 것인, 인공 타액 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 10 내지 200μg/mL의 글루코스 옥시다아제를 포함하는 것인, 인공 타액 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SCN-은 KSCN 또는 NaSCN 형태로 포함되며, 약 0.5 내지 3mM의 농도로 포함되는 것인 인공 타액 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 I- 는 KI 또는 NaI의 형태로 포함되며, 5 μM 내지 0.5 mM의 농도로 포함되는 것인 인공 타액 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    타액 분비 저하와 관계된 질환을 치료 또는 예방용인 인공 타액 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타액 분비 저하와 관계된 질환은 구강건조증 또는 구강 건조과 관련된 질환인, 인공타액 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 구강 건조와 관련된 질환은 치아우식증, 치주염, 구강 진균감염, 혀통증, 혀주름, 구강 궤양, 구강점막 통증, 미각 장애, 치아마모 및 교모 증가 또는 구취인, 인공 타액 조성물.
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