WO2013179672A1 - 子宮内膜症の判定方法 - Google Patents
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Definitions
- RNA is extracted from the sample to prepare a template cDNA, and this is used as a template to perform PCR using the amplification primer of the present invention.
- amplification primer of the present invention -amplify one or more miRNAs selected from the group consisting of miR-708, hsa-miR-127-3p and hsa-miR-518d-3p.
- the following values can be used as cutoff values: When three miRNAs of has-miR-708, has-miR-127-3p and has-miR-518d-3p are used as miRNAs in the sample, the cut-off value is 0.1 or more and 0.9 or less, preferably 0.31 or more A value of 0.68 or less, more preferably 0.40 or more and 0.59 or less can be used. When two miRNAs, has-miR-708 and has-miR-518d-3p, are used as miRNAs in the sample, the cut-off value is 0.1 or more and 0.9 or less, preferably 0.34 or more and 0.66 or less, more preferably 0.38 or more. Values below 0.54 can be used.
Abstract
Description
[1] 被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される1つ以上のmiRNAの濃度を測定するための、該miRNAの増幅プライマーを主成分とする子宮内膜症診断薬;
[2] [1]の診断薬を含む子宮内膜症診断キット;
[3] miRNAが、hsa-miR-708である、[1]の子宮内膜症診断薬;
[4] miRNAが、hsa-miR-127-3pである、[1]の子宮内膜症診断薬;
[5] miRNAが、hsa-miR-518d-3pである、[1]の子宮内膜症診断薬;
[6] 血液に由来する試料が、血漿である、[1]および[3]ないし[5]のいずれかに記載の子宮内膜症診断薬;
[7] 被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される1つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む子宮内膜症の検出方法;
[8] 前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、[7]の方法;
[9] 前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、[7]または[8]のいずれかに記載の方法;
[10] miRNAが、hsa-miR-708である[7]ないし[9]のいずれかに記載の方法;
[11] miRNAが、hsa-miR-127-3pである[7]ないし[9]のいずれかに記載の方法;
[12] miRNAが、hsa-miR-518d-3pである[7]ないし[9]のいずれかに記載の方法;
[13] 血液に由来する試料が、血漿である[7]ないし[12]のいずれかに記載の方法;
[14] 被験者の血液に由来する試料におけるhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される1つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む被験者における子宮内膜症を診断する方法;
[15] 前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、[14]の方法;
[16] 前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、[14]または[15]に記載の方法、
を提供する。
hsa-miR-708 (aaggagcuuacaaucuagcuggg) 配列番号1
hsa-miR-127-3p (ucggauccgucugagcuuggcu) 配列番号2
hsa-miR-518d-3p (caaagcgcuucccuuuggagc) 配列番号3
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-708、has-miR-127-3p及びhas-miR-518d-3pの3つのmiRNAを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.31以上0.68以下、より好ましくは0.40以上0.59以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-708及びhas-miR-518d-3pの2つのmiRNAを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.34以上0.66以下、より好ましくは0.38以上0.54以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-708を用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.42以上0.60以下、より好ましくは0.46以上0.58以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-127-3pを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.44以上0.55以下、より好ましくは0.49以上0.55以下の値を使用することができる。
前記試料中のmiRNAとしてhas-miR-518d-3pを用いる場合、そのカットオフ値として、0.1以上0.9以下、好ましくは0.44以上0.56以下、より好ましくは0.47以上0.53以下の値を使用することができる。
経膣子宮鏡により診断された子宮内膜症患者(20例)および患者群に年齢をマッチさせた対照被験者(20例(うち9例は子宮内膜症以外の良性婦人科疾患患者、11例は健常人))の血清試料をCureline Inc. (South San Francisco, 米国カリフォルニア州)より購入した。血清試料は使用時まで-80℃にて保管した。各被験者の臨床情報を表1に記す。
Trizol LS reagentとmirVana miRNA isolation kit (ともにLife Technologies Inc.)を用いて血清試料からRNAを抽出した。具体的な手順は以下に記す。血清1mLに1mL滅菌水を添加した後、さらに6mLのTrizol LS reagentを添加して、混合した。混合した溶液を室温にて5分間静置した後、1.6mLのクロロホルムを添加して、手で激しく攪拌した。攪拌後の溶液を室温にて10分間静置したのち、遠心操作(4℃、12,000 x g、10分間)により有機溶媒層と水層を分離した。得られた水層から4mLを分取し、分取した水層に5mLの99.5%エタノールを添加して均一に攪拌した。攪拌後の溶液をmirVana miRNA isolation kitのフィルターカートリッジに添加して、該kitに添付されたプロトコールに従ってRNA画分を分取した。分取したRNA画分を凍結乾燥した後、10μLの滅菌水で再懸濁してRNA濃縮溶液を得た。得られたRNA濃縮溶液に含まれるmiRNA濃度は、該RNA濃縮溶液に含まれる10~40塩基長相当のRNA濃度として、Agilent 2100 bioanalyzerとSmall RNA kit(Agilent Technologies)を用いて測定した。
上記RNA濃縮溶液からMegaplex RT primers (pool A or B v.2.0)ならびにTaqManTM MicroRNA Reverse Transcription Kitを用いてcDNAを含む溶液を得た後、得られた溶液に含まれるcDNAをMegaplex PreAmp primers (pool A or B v.2.0)ならびにTaqManTM PreAmp Master Mixを用いて増幅した。増幅されたcDNAとTaqMan Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG)を混合して得られた試料をTaqManTM Human MicroRNA Array v2.0に装填し、7900HT Fast Real-Time PCRシステムを用いて定量的PCR解析を行った。なお、本項における各操作は、製品に添付されたプロトコールに従って行った。
データ解析にはRQ Manager 1.2 software (Life Technologies)を用いた。増幅曲線からのCT (Threshold cycle)値算出は、Liangらにより報告された手法に従い (Liang, Y. et al., BMC Genomics, 8, 166-, 2007)、閾値を0.2に設定した。全40検体のうち80%以上で増幅が見られなかったmiRNAについては以降の解析から除外した。残った全miRNAのCT 値の中央値を各検体毎に算出し、それぞれのCT 値から該中央値を差し引いた値(ΔCT 値)を算出して検体間の発現差を標準化した。患者群と対照群の間で有意に発現量の異なるmiRNAを同定するためにWelch’s t-testを実施した。ロジスティック回帰解析を用いて同定された複数のmiRNAの組み合わせによる診断モデルの構築と評価を行った。またROC(Receiver operating characteristic)解析を用いてmiRNA個々のあるいは組み合わせによる診断力を評価した。これら解析にはMATLAB software (The Mathworks Inc.)を用いた。
図1に、患者および対照の2群間における3種のmiRNAの発現分布を示す。縦軸は各miRNAの相対的発現量を、底を2とする対数として表している。各被験者の発現量を青点で、各群の発現量の中央値を赤線で表示した。箱の上限と下限はそれぞれ25および75パーセンタイルを、ヒゲの両端は外れ値を除いた上限値と下限値を、赤十字は外れ値を表す。Welch’s t-testの結果得られたP値と両群の発現量(底を2とする対数)の平均値の差を各図のmiRNA名の下に表示した。
Claims (16)
- 被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される1つ以上のmiRNAの濃度を測定するための、前記miRNAの増幅プライマーを主成分とする子宮内膜症診断薬。
- 請求項1記載の診断薬を含む子宮内膜症診断キット。
- miRNAが、hsa-miR-708である請求項1記載の子宮内膜症診断薬。
- miRNAが、hsa-miR-127-3pである請求項1記載の子宮内膜症診断薬。
- miRNAが、hsa-miR-518d-3pである請求項1記載の子宮内膜症診断薬。
- 血液に由来する試料が、血漿である請求項1記載の子宮内膜症診断薬。
- 被験者の血液に由来する試料中のhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される1つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む子宮内膜症の検出方法。
- 前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、請求項7記載の方法。
- 前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、請求項7記載の方法。
- miRNAが、hsa-miR-708である請求項7記載の方法。
- miRNAが、hsa-miR-127-3pである請求項7記載の方法。
- miRNAが、hsa-miR-518d-3pである請求項7記載の方法。
- 血液に由来する試料が、血漿である請求項7記載の方法。
- 被験者の血液に由来する試料におけるhsa-miR-708、hsa-miR-127-3pおよびhsa-miR-518d-3pからなる群より選択される1つ以上のmiRNAの濃度を測定する工程を含む被験者における子宮内膜症を診断する方法。
- 前記miRNAの濃度が正常対照における前記miRNAの濃度と比較して高値か否かを決定する工程を含む、請求項14記載の方法。
- 前記miRNAの濃度がカットオフ値以上か否かを決定する工程を含む、請求項14記載の方法。
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