CN108753949B - 血清中circ_0082660作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血清中circ_0082660作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用，并以circ_0082660作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断URSA病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高。

Description

血清中circ_0082660作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的 应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及血清中circ_0082660作为原因不明性复发性自然流产(URSA)诊断及妊娠结局评估标志物的应用。

背景技术

自然流产连续发生2次或2次以上称为复发性流产(recurrent spontaneousabortion，RSA)，发病率约为育龄妇女的1％～5％，其病因复杂，除少数染色体、内分泌、解剖、感染等因素外，约80％病因不明，称为不明原因复发性流产(unexplained recurrentspontaneous abortion，URSA)。URSA严重危害育龄妇女生殖健康，但目前尚缺乏特异性强、灵敏度高、稳定性好的生物学指标，临床干预治疗尚无明确统一的标准，无法有效预测妊娠结局。因此，目前有必要探寻新的有效的URSA临床诊断、治疗和预后检测的标记物，为诊断、治疗URSA和相关新药研发提供依据。

环状RNA(Circular RNAs，circRNAs)是一类通过共价键形成的闭合环状非编码RNA，不具备5'→3'极性及3'polyA末端，表现出与线性RNA不同的特征。随着深度测序技术的发展和多个基因组计划的完成，大量非编码RNA被鉴定出来，越来越多的研究发现这些曾经因不能编码蛋白质而被称为基因组中的“暗物质”或“垃圾RNA”在许多生命活动过程中扮演了重要角色。circRNA分子富含miRNA应答元件，能通过这些应答元件吸附特定的微小RNA(microRNA)，充当microRNA的“分子海绵”，竞争性结合并封闭microRNA与靶基因的互补结合位点，进而解除microRNA对其靶基的抑制，调控靶基因表达与功能。与传统的线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNnase R降解，在体液如血浆及唾液中表达较线性RNA更稳定，因此成为研究疾病诊断及预后新标志物的热点，有望成为寻找有效的URSA临床诊断、治疗和预后检测的标记物的突破口。

发明内容

针对以上现有技术，发明人经过大量的技术研究和长期的临床实践，提供了一种诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局的相关产品，以及提供circ_0082660作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用。

在本发明的第一个方面，提供了circ_0082660作为URSA诊断和/或URSA患者妊娠结局评估标志物在制备用于诊断URSA和/或用于评估URSA患者妊娠结局产品中的应用。

其中，所述circ_0082660的核酸序列如下：

GTTCAATGTATCTATGCCTGCCTACCTCAATCTGCAAGGGAGTGTCAGAAAGGCCCCGCATTCGCCAAGCCGTGAGTTATCGCTAACTTTTCAGATGTGTTAATGAATGTGGAACAAAAGCAGTTGTGTTTAAAAGGAAAAAGGACCATCAAAATAACTTTTATTATAGTAGCAGGCGTAAACACTAAACTGAATATTCCAAATTGTGTCAAAAATAACCTACTAGAGACGAGCTTCTAGAAAACCTATTGTTGAACTGCTCTGAAGCTATCATTTTAACTATAAATTACTGTTGTTAAAATTTTATATACCCTGGTTGCAAATTAGAATGTTTTAAAAATATCTTTAACCACGTTAAAACAATTTGAACAAAATCTTACCCCATCTAAAAATGATAGTGTTTAGTTGAATTTAAGTTAAGCTCTTTAGTATATGACCATATGAAGGGGTAAAGTTTTAATCTTTTTTGTTATTTACATGTGAAAATACAGAAACTAAGTGATTGAATCACATCCTACACGAAAGTTTTTGGAGTGCTCCAGGCATATCATGTGAAATACAGAGGTATTTATATCTCTTTTGGCACCAATAGTTCTTGCTTCAGTAATTCACCAGTAGGTTTTCATTCATCGATAATATATCAGTTTAAGGCTAAAATAAAACACCTACATTTCTTAGGGCTTATCATTCTATATAGAAAGAGGAAACATCCTAATGAGTTTTTTCTTTTGTTTTTCCAAAGAGATTCTAAGCAAAAAAATTTTAACTAACATCTATATTTTGTTATTGGAGCTAGTTACCTTTCTTTTTCTTAGATTCTTTAACGTTTTGAGTAGATAGCCATATTTGATAAGCAGGTTGGATGCTTCTGTTGCTTAGGAGGTAGGTGTATTGTGTTATATGAAGACAGAATGAATTTAAATATACCCAGTTTGGCAGTATGAAAAAGCTCAGACTACATAAAACTTGGAGGTATGGAACCTTTGGACGCATTAAAGTTAACGTTTCATTAGGCAATGTGCCTTTGTTTGACTGGTGTGTAAGTCCTTCTTCCAGGTTTGTACGCTCTTAAACGCGTTATTCTACCCTCTCTAACTCCTCCCAGCAGCAAAAGGGAGACACTTCAGCTGGAACAAAATAGTGGAAGAAATGGCGTCTGGGGTTCAGTGGGGATTCGCAGTGTGTATGCAATGTTTGCAAGATTATTTTTTATGTTTTTCAATTACTGTAAATAAAAATATATCAATGCTTAGTGTCAAGAAGGGAACATTGTATACCAGTATAAACTCTCTTAGTGGGTCTGCAAGTTGCTTAACCTCTCGGGGCCTCAGTTTTCTCATCTGCAATATGAAGGAGTTGGACTCGATAATCTTTAAAGTCCATTCCTGCTCTAAAATCCTATGCTTTTCTGAAGTACTCTATTTAACAGAATGCATTGCTTTCTCACTTTGACTATTTGAATTATGTATGCAGTACACTTACTGCAACTGCATGTTGTCTAAAATAGTTTTTCTATAGGATGTATATAAAAACTAATCCCTCTTGAGCTGATTTATAATGTGTGTATATAGCCACACATAAAAAGCTAGTAATAGTAGGGCTCTCAGAAAATACTTTCCAGTTGTCTAACCTTGAATGTTATTAACTCTTCTATATTACAGGAGATACAACTCGTCAACGAATCAAATTCAGTGATGACAGAGTATGCAAGAGTCACCTTCTCAACTGTTGTCCTCATGATGTCCTTTCTGGAACTAGAATGGATCTTGGAGAATGTCTGAAAGTCCATGACCTGGCTTTAAGAGCGGATTATGAAATTGCATCCAAAGAACAAGATTTTTTCTTTGAACTTGATGCCATGGATCATCTGCAGTCATTCATTGCAGATTGTGATCGTAGAACAGAAGTGGCCAAGAAAAGATTAGCAGAAACTCAAGAAGAGATTAGTGCTGAAGTAGCAGCAAAGGCAGAACGTGTTCATGAGTTAAATGAAGAAATTGGTAAATTGTTAGCCAAGGTGGAACAACTAGGAGCTGAAGGGAATGTGGAGGAATCCCAGAAAGTAATGGATGAAGTAGAGAAAGCACGGGCAAAGAAAAGAGAAGCAGAGGAAGTTTATCGGAATTCTATGCCAGCTTCCAGTTTTCAGCAGCAGAAACTTCGAGTCTGTGAAGTCTGCTCTGCCTATTTAGGACTTCATGATAATGACAGACGACTGGCTGATCATTTTGGGGGTAAACTGCACCTGGGATTTATTGAAATAAGAGAGAAGCTTGAAGAATTAAAGAGAGTCGTAGCTGAGAAGCAGGAGAAAAGAAACCAGGAACGGCTGAAACGAAGAGAAGAGAGAGAGAGAGAAGAAAGGGAGAAGCTGAGGAGGTCCCGATCACACAGCAAGAATCCAAAAAGATCCAGGTCCAGAGAGCATCGCAGACATCGATCTCGCTCCATGTCACGTGAACGCAAGAGGAGAACTCGATCCAAATCTCGGGAGAAACGCCATCGCCACAGGTCCCGCTCCAGCAGCCGTAGCCGCAGCCGTAGCCACCAGAGAAGTCGGCACAGTTCTAGAGATAGGAGCAGAGAACGATCCAAGAGGAG

进一步的，所述circ_0082660为血清样本中的circ_0082660。

本发明的第二个方面，提供了检测circ_0082660的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断URSA和/或用于评估URSA患者妊娠结局产品中的应用。

进一步的，所述试剂盒至少包括针对circ_0082660的正向引物5'-CCAGAGAAGTCGGCACAGTT-3'和反向引物5'-AGCGATAACTCACGGCTTGG-3'。

进一步的，所述基因芯片至少包括与circ_0082660的核酸序列杂交的探针。

进一步的，所述产品能够通过检测血清中circ_0082660表达水平来诊断患者是否患有URSA，circ_0082660的高表达与URSA的发生发展及妊娠结局相关。

更进一步的，所述检测circ_0082660的表达水平的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测circ_0082660的表达水平以诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局的产品。

本发明的第三个方面，提供了一种用于诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局的产品，该产品的特点是：所述产品能够通过检测血清中的circ_0082660表达水平来诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局，高通量检测结果显示circ_0082660在URSA组表达较正常妊娠妇女显著升高。

进一步的，所述产品为芯片或检测试剂盒；其中芯片至少包括与circ_0082660的核酸序列杂交的探针。

进一步的，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

本发明的第四个方面，提供circ_0082660在制备治疗URSA的药物中的应用。

进一步的，所述药物为circ_0082660的抑制剂。

与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果是：

(1)本发明经过高通量芯片及临床大样本表达验证，筛选得到circ_0082660能够作为诊断URSA的标志物，其诊断效率高达97.30％。

(2)本发明经过高通量芯片，筛选得到circ_0082660能够作为URSA患者妊娠结局评估的标志物，其诊断效率高达94.30％。

(3)本发明为将来研制抑制circ_0082660靶点的药物提供了依据。

(4)本发明以circ_0082660作为诊断URSA及妊娠结局评估的标志物，开发了相应的检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高、特异性高、检测方便，满足诊断URSA病人的检测需求，经临床验证诊断准确率高。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：URSA患者与正常妊娠妇女外周血差异circRNA筛选。

图2：URSA患者与正常妊娠妇女外周血circ_0082660表达验证。

图3：URSA患者中妊娠失败组与妊娠成功组外周血circ_0082660表达验证。

图4：URSA患者与正常妊娠妇女ROC Curve图，A为circ_0082660ROC曲线图，B为孕激素ROC曲线图。

图5：URSA患者中妊娠失败组与妊娠成功组ROC Curve图，A为circ_0082660ROC曲线图，B为孕激素ROC曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

术语解释：

circ_0082660：环状RNA0082660，核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

正如背景技术所介绍的，现有技术中采用孕激素等作为诊断URSA及妊娠结局评估存在一定不足，为了解决如上的技术问题，本发明通过高通量芯片，筛选得到circ_0082660能够作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述circ_0082660为血清样本中的circ_0082660。

在本发明的一个具体实施例中，涉及的具体技术方案包括：

(1)收集URSA患者及正常妊娠妇女静脉血(每组各6例)，分离单个核细胞，采用高通量芯片筛选差异环状RNA。

(2)扩大样本量(每组各60例)，荧光实时定量PCR(qPCR)验证筛选差异环状RNA表达。

(3)临床资料(年龄、性别)分析。

(4)Logistic回归模型分析。

(5)ROC曲线分析检验效能及最佳cutoff值。

在本发明的一个典型实施方式中，提供了检测circ_0082660的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局产品中的应用。

在本发明的一个具体实施方式中，所述试剂盒至少包括针对circ_0082660的正向引物5'-CCAGAGAAGTCGGCACAGTT-3'和反向引物5'-AGCGATAACTCACGGCTTGG-3'。

在本发明的一个具体实施方式中，所述基因芯片至少包括与circ_0082660的核酸序列杂交的探针。

在本发明的一个具体实施方式中，所述产品能够通过检测血清中circ_0082660表达水平来诊断患者是否患有URSA，circ_0082660高表达与URSA的发生发展及妊娠结局相关。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述检测血清中circ_0082660的表达水平的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测circ_0082660的表达水平以诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局的产品。

其中，所述基因测序能够检测基因表达水平的相对变化，例如Illumina测序。Illumina平台是一种基于边合成边测序技术(Sequencing-By-Synthesis，SBS)的测序方法。由于可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储。利用hisat2将Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。一个基因表达水平的直接体现就是其转录本的丰度情况，转录本丰度程度越高，则基因表达水平越高。在转录组测序分析中，可以通过定位到转录本外显子区的测序序列(reads)的计数来估计基因的表达水平。转录本表达量的计算使用FPKM法(Fragments Per kb Per MillionReads)，是每百万fragments中来自某一转录本每千碱基长度的fragments数目。FPKM同时考虑了测序深度和转录本长度对fragments计数的影响，是目前最为常用的转录本表达水平估算方法。FPKM计算公式如下：

在本发明的一个典型实施方式中，提供了一种用于诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局的产品，该产品的特点是：所述产品能够通过检测血清中的circ_0082660表达水平来诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局，高通量检测结果显示circ_0082660在URSA组表达较正常妊娠妇女显著升高。

在本发明的一个具体实施方式中，所述产品为芯片或检测试剂盒；其中芯片至少包括与circ_0082660的核酸序列杂交的探针。

在本发明的一个具体实施方式中，对于检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

在本发明的一个具体实施例中，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液(MLV-5×buffer)、dNTP混合液、RNA酶蛋白质抑制剂(RNAsin)、反转录酶液(M-MLV)和多聚胸腺嘧啶(OligodT)。

在本发明的一个具体实施例中，用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对circ_0082660的正向引物液和反向引物液，还包括SYBR Green混合液、无核酸酶纯水。

在本发明的一个典型的实施方式中，提供circ_0082660在制备治疗URSA的药物中的应用。

在本发明的一个具体实施方式中，所述药物为circ_0082660的抑制剂，所述circ_0082660的抑制剂是指能够降低circ_0082660表达水平的产品，该产品包括：通过siRNA以及CRISPR介导的基因敲低策略获得的抑制circ_0021132表达水平的siRNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体，以及降低circ_0082660表达水平的化合物、组合物或试剂等。其中，通过敲低方法抑制环状RNA表达水平的siRNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体已经商业化，也可通过常规的技术手段制备得到。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

1.实验对象纳入与排除标准：

(一)病例来源

全部病例均来源于2016年01月至2017年06月山东中医药大学附属医院妇科住院与门诊病人，共60例。正常对照组血样均来自于山东中医药大学附属医院正常妊娠查体者，为无心、脑、肺、肝、肾疾病和血栓性疾病，无已知影响研究指标疾病，共60例。

(二)入选标准：

(1)RSA患者入选标准：

①患者有2次或2次以上自然流产史，无活产史；

②夫妇双方和(或)胚胎染色体正常，无家族遗传病及近亲结婚史；

③妇检白带检查、超声检查和(或)子宫输卵管造影等检查排除患者器质性病变、生殖器官解剖畸形及感染性因素；

④月经周期正常，基础体温双相，超声监测排卵正常；

⑤男方精液分析正常；

⑥性激素、甲状腺功能、血糖、胰岛素等内分泌检查均正常；

⑦自身抗体如抗核抗体、抗心磷脂抗体、抗甲状腺抗体、抗2-糖蛋白Ⅰ抗体检查均呈阴性；

⑧血栓前状态有关的检查，包括D-二聚体、纤维蛋白(原)降解产物、血凝系列、全血分析均正常；

⑨Torch系列IgM均阴性；

⑩以往未进行过主动免疫治疗。

(2)正常对照纳入标准：

妊娠12周以内正常妊娠查体妇女，既往无自然流产、死胎、死产史，无遗传、解剖、内分泌方面异常，无感染、自身免疫性疾病史；本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状和体征；超声证实胚胎发育正常，有心管搏动。

2.高通量芯片检测：

收集URSA及正常妊娠妇女外周血，总RNA利用NanoDrop ND-2000(ThermoScientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA完整性。RNA质检合格后，总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。标记好的cRNA和Agilent Human lncRNA Microrray V6(4*180K,Design ID:084410)芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。

采用Feature Extraction软件(version10.7.1.1,Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件(version 13.1,AgilentTechnologies)进行quantile标准化和后续处理。标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少有一组100％标记为“P”的探针留下进行后续分析。利用T检验的p值和倍数变化值进行差异circRNA和LncRNA，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0且P值≤0.05。

3.qPCR验证差异circRNA表达：

(1)细胞提取RNA：

取5×10⁶～1×10⁷个细胞，加入1ml Trizon，充分混匀，室温静置5～10min；加入200μl/1mlTrizon氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15s；4℃离心：12000rpm×10min，取上层水相于一新的EP管中；加入等体积异丙醇，温和颠倒混匀，室温放置10min；4℃离心：12000rpm×10min；弃上清，加入1ml 75(v/v)％乙醇(无水乙醇：DNase/RDase-free water＝3:1)，轻轻混匀；4℃离心：12000rpm×5min；弃上清，加入1ml无水乙醇；4℃离心，12000rpm×5min；弃上清(尽量将残余液体除去)，室温或真空干燥10～20min；根据RNA沉淀量加入适量DNase/RDase-free water(通常为30-50μl)溶解RNA；混匀后测浓度并记录，进行逆转录。

(2)RT实验

取0.2mlEP管标记样本名称和日期，将RNA、DNase/RDase-free water、OligodT按要求加入到标记好的EP管中；运行RT-1程序，70℃，5min(表1)；按体系配制好的MLV-5×buffer、dNTP、RNAsin、M-MLV的MIX加入到上述EP管中，运行RT-2程序，42℃，1h，得到cDNA，进行PCR实验(表2)。

表1.RNA与OligodT

体系体积	20μl
		RNA	11μl
DNase/RDase-free water	11-V1
		OligodT	1μl
RNA使用体积V1	2000ng/C1

表2.逆转录反应体系

体系体积	20μl
		MLV-5×buffer	4μl
dNTP	2μl
		RNAsin	1μl
M-MLV	1μl
		RNA+OligodT	11μl

(3)qPCR实验：SYBR、引物及cDNA溶解后，瞬时离心，混匀，置于冰上；DNase/RDase-free water。

表3.PCR反应体系(20μl)

反应体系	20μl
		引物F(10μm)	1.2μl
引物R(10μm)	1.2μl
		SYBR	10μl
cDNA	2μl
		DNase/RDase-free water	5.6μl

瞬时离心；运行7500程序，条件按下表设置。

表4.PCR程序

表5.circ_0082660引物序列

circ_0082660	Sequence(5'->3')
		Forward primer	CCAGAGAAGTCGGCACAGTT(SEQ ID NO:2)
Reverse primer	AGCGATAACTCACGGCTTGG(SEQ ID NO:3)
		Product length	138bp

4.统计学分析：

采用SPSS22.0软件(SPSS Inc.,USA)。连续变量采用中位数(Median)和平均值±标准差

表示；计量资料采用t检验，计数资料采用χ²检验。通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线和计算相应的曲线下面积(AUC)来判断诊断能力。最佳cutoff值选取为灵敏度和特异性之和最大所对应的值。采用medcale10.4.7.0软件比较曲线下面积AUC差异性。P<0.05(双侧)为有统计学差异。采用R软件分析检验效能及样本大小，R≥0.8为具有检验效能。

结果

1.高通量检测结果

高通量结果显示，circ_0082660、circ_0079591、LncRNA NONHSAT167899.1、LncRNA ENST00000514235在URSA组表达较正常妊娠对照组显著不同，其中，如图1所示，circ_0082660在URSA组表达较正常妊娠对照组显著升高，P<0.05。而关于circ_0079591、LncRNA NONHSAT167899.1和LncRNA ENST00000514235的具体技术方案，本专利申请人已经作为其他专利申请进行保护。

2.qPCR验证circ_0082660表达

如图2所示，与正常对照组比较，URSA组circ_0082660表达显著升高(P<0.05)；如图3所示，URSA患者中，circ_0082660在妊娠失败组较妊娠成功组表达显著升高，P<0.05。

3.组间临床资料分析

(1)年龄：组间年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性(见表6、表7)。

表6.正常组与URSA组组间年龄比较

注：两组间年龄进行t检验，P>0.05。

表7.URSA中妊娠成功与失败组组间年龄比较

注：两组间年龄进行t检验，P>0.05。

4.Logistic回归分析：正常妊娠组与URSA组Logistic回归分析见表8，URSA中妊娠成功组与妊娠失败组Logistic回归分析见表9。

表8.正常妊娠组与URSA组Logistic回归分析

Model 1:以circ_0082660为自变量构建单因素Logistic回归模型；

Model 2:以年龄、circ_0082660为自变量构建多因素Logistic回归模型；

以circ_0082660为自变量构建单因素Logistic回归模型和同时校正年龄后所构建的多因素Logistic回归模型结果显示，校正和不校正所得到的统计学结果是一致的，因此确定circ_0082660具有诊断URSA的潜力。

表9.URSA中妊娠成功组与妊娠失败组Logistic回归分析

Model 1:以circ_0082660为自变量构建单因素Logistic回归模型；

Model 2:以年龄、circ_0082660为自变量构建多因素Logistic回归模型；

以circ_0082660为自变量构建单因素Logistic回归模型和同时校正年龄后所构建的多因素Logistic回归模型结果显示，校正和不校正所得到的统计学结果是一致的，因此确定circ_0082660具有预测URSA妊娠结局的潜力。

5.ROC曲线分析检验效能及最佳cutoff值：

结果如图4所示，circ_0082660ROC曲线下面积为0.973，高于孕激素(0.703)，p<0.05。circ_0082660相对表达量高于1.884，诊断为URSA；相对表达量低于1.884，不诊断为URSA；诊断效率为97.30％。

结果如图5所示，circ_0082660ROC曲线下面积为0.943，高于孕激素(0.838)，p<0.05。circ_0082660相对表达量高于1.863，URSA患者预后评估为妊娠失败；相对表达量低于1.863，URSA患者预后评估为妊娠成功；预后评估效率为94.30％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省医学科学院基础医学研究所

<120> 血清中circ_0082660作为URSA诊断及妊娠结局评估标志物的应用

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2601

<212> DNA

<213> circ_0082660序列

<400> 1

gttcaatgta tctatgcctg cctacctcaa tctgcaaggg agtgtcagaa aggccccgca 60

ttcgccaagc cgtgagttat cgctaacttt tcagatgtgt taatgaatgt ggaacaaaag 120

cagttgtgtt taaaaggaaa aaggaccatc aaaataactt ttattatagt agcaggcgta 180

aacactaaac tgaatattcc aaattgtgtc aaaaataacc tactagagac gagcttctag 240

aaaacctatt gttgaactgc tctgaagcta tcattttaac tataaattac tgttgttaaa 300

attttatata ccctggttgc aaattagaat gttttaaaaa tatctttaac cacgttaaaa 360

caatttgaac aaaatcttac cccatctaaa aatgatagtg tttagttgaa tttaagttaa 420

gctctttagt atatgaccat atgaaggggt aaagttttaa tcttttttgt tatttacatg 480

tgaaaataca gaaactaagt gattgaatca catcctacac gaaagttttt ggagtgctcc 540

aggcatatca tgtgaaatac agaggtattt atatctcttt tggcaccaat agttcttgct 600

tcagtaattc accagtaggt tttcattcat cgataatata tcagtttaag gctaaaataa 660

aacacctaca tttcttaggg cttatcattc tatatagaaa gaggaaacat cctaatgagt 720

tttttctttt gtttttccaa agagattcta agcaaaaaaa ttttaactaa catctatatt 780

ttgttattgg agctagttac ctttcttttt cttagattct ttaacgtttt gagtagatag 840

ccatatttga taagcaggtt ggatgcttct gttgcttagg aggtaggtgt attgtgttat 900

atgaagacag aatgaattta aatataccca gtttggcagt atgaaaaagc tcagactaca 960

taaaacttgg aggtatggaa cctttggacg cattaaagtt aacgtttcat taggcaatgt 1020

gcctttgttt gactggtgtg taagtccttc ttccaggttt gtacgctctt aaacgcgtta 1080

ttctaccctc tctaactcct cccagcagca aaagggagac acttcagctg gaacaaaata 1140

gtggaagaaa tggcgtctgg ggttcagtgg ggattcgcag tgtgtatgca atgtttgcaa 1200

gattattttt tatgtttttc aattactgta aataaaaata tatcaatgct tagtgtcaag 1260

aagggaacat tgtataccag tataaactct cttagtgggt ctgcaagttg cttaacctct 1320

cggggcctca gttttctcat ctgcaatatg aaggagttgg actcgataat ctttaaagtc 1380

cattcctgct ctaaaatcct atgcttttct gaagtactct atttaacaga atgcattgct 1440

ttctcacttt gactatttga attatgtatg cagtacactt actgcaactg catgttgtct 1500

aaaatagttt ttctatagga tgtatataaa aactaatccc tcttgagctg atttataatg 1560

tgtgtatata gccacacata aaaagctagt aatagtaggg ctctcagaaa atactttcca 1620

gttgtctaac cttgaatgtt attaactctt ctatattaca ggagatacaa ctcgtcaacg 1680

aatcaaattc agtgatgaca gagtatgcaa gagtcacctt ctcaactgtt gtcctcatga 1740

tgtcctttct ggaactagaa tggatcttgg agaatgtctg aaagtccatg acctggcttt 1800

aagagcggat tatgaaattg catccaaaga acaagatttt ttctttgaac ttgatgccat 1860

ggatcatctg cagtcattca ttgcagattg tgatcgtaga acagaagtgg ccaagaaaag 1920

attagcagaa actcaagaag agattagtgc tgaagtagca gcaaaggcag aacgtgttca 1980

tgagttaaat gaagaaattg gtaaattgtt agccaaggtg gaacaactag gagctgaagg 2040

gaatgtggag gaatcccaga aagtaatgga tgaagtagag aaagcacggg caaagaaaag 2100

agaagcagag gaagtttatc ggaattctat gccagcttcc agttttcagc agcagaaact 2160

tcgagtctgt gaagtctgct ctgcctattt aggacttcat gataatgaca gacgactggc 2220

tgatcatttt gggggtaaac tgcacctggg atttattgaa ataagagaga agcttgaaga 2280

attaaagaga gtcgtagctg agaagcagga gaaaagaaac caggaacggc tgaaacgaag 2340

agaagagaga gagagagaag aaagggagaa gctgaggagg tcccgatcac acagcaagaa 2400

tccaaaaaga tccaggtcca gagagcatcg cagacatcga tctcgctcca tgtcacgtga 2460

acgcaagagg agaactcgat ccaaatctcg ggagaaacgc catcgccaca ggtcccgctc 2520

cagcagccgt agccgcagcc gtagccacca gagaagtcgg cacagttcta gagataggag 2580

cagagaacga tccaagagga g 2601

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccagagaagt cggcacagtt 20

<210> 3

<211> 0

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

000

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcgataact cacggcttgg 20

Claims (4)

1.检测circ_0082660的试剂在制备用于诊断URSA和/或用于评估URSA患者妊娠结局产品中的应用；

所述试剂为定量检测试剂；

所述circ_0082660的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述circ_0082660为血清样本中的circ_0082660；

所述试剂包括针对circ_0082660的正向引物5'-CCAGAGAAGTCGGCACAGTT-3'和反向引物5'-AGCGATAACTCACGGCTTGG-3'。

2.检测circ_0082660的基因芯片在制备用于诊断URSA和/或评估URSA患者妊娠结局产品中的应用；

所述circ_0082660的核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述circ_0082660为血清样本中的circ_0082660；

所述基因芯片包括针对circ_0082660的正向引物5'-CCAGAGAAGTCGGCACAGTT-3'和反向引物5'-AGCGATAACTCACGGCTTGG-3'以及与circ_0082660的核酸序列杂交的探针。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是：所述产品能够通过检测血清中circ_0082660表达水平来诊断患者是否患有URSA和/或评估URSA患者妊娠结局。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是：所述检测血清中circ_0082660的表达水平的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、基因芯片或基因测序检测circ_0082660的表达水平以诊断URSA及评估URSA患者妊娠结局的产品。

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