WO2013165008A1 - Ｔａｃｃ３を標的とする小化合物 - Google Patents

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nme
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良司 八尾
長田　裕之
恭光 近藤
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公益財団法人がん研究会
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Definitions

  • the present invention relates to a small compound targeting TACC3.
  • the present invention also relates to a medicament based on a small compound targeting TACC3, particularly an anticancer agent.
  • microtubule constitutes the spindle formed during cell division. Since tumor cells are actively divided, drugs that inhibit cell division are effective as anticancer agents. Therefore, anticancer agents that target microtubules, which are the main structure of the spindle, and tubulin, which is a constituent protein, have been developed for a long time and are used for treatment regardless of whether they are solid tumors or blood tumors.
  • Non-patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • TACC3 which has been reported to be involved in microtubule polymerization and abnormally expressed in various tumors. Has been analyzed.
  • TACC3 Transforming acid-coiled-coil 3 protein
  • oncogene for example, Non-Patent Documents 3 to 8 and Patent Document 2.
  • TACC3 is known to be involved in spindle formation and control of the division apparatus involved in chromosome distribution and cell division (for example, Non-Patent Document 9).
  • TOGp Tumor over-expressed gene
  • TACC3 expression induces a different phenomenon depending on the cell line used. For example, it has been reported that a decrease in microtubule polymerization (Non-patent Document 10) and apoptosis induced by chromosomal imbalance (Non-patent Document 9) are observed.
  • TACC3 binds to TOGp, stabilizes microtubule polymerization in the centrosome during mitosis, and controls cell division. (Non-Patent Document 11).
  • the present inventors conducted an experiment to suppress TACC3 expression using a TACC3 conditional knockout mouse. As a result, it was found that lymphomas regress due to apoptosis, but normal thymocytes had no obvious effect despite TACC3 expression (Non-patent Document 12). Therefore, the present inventors have considered that a compound targeting TACC3 can be an excellent anticancer agent that selectively acts on tumor cells, and has already disclosed a screening method for an anticancer agent targeting TACC3 (Patent Literature). 3).
  • An object of the present invention is to provide a small compound targeting TACC3. Furthermore, it is providing the pharmaceutical containing the small compound which targets TACC3, especially an anticancer agent, and these manufacturing methods.
  • the anticancer agent of the present invention is characterized by containing a compound represented by the following general formula (I), a pharmaceutically acceptable salt, solvate or ester derivative thereof as an active ingredient.
  • the present inventors have clarified through experiments using mice and cultured cells that the above compound having a dicoumarin structure suppresses cell division via TACC3 and exhibits an antitumor effect. Therefore, an effective anticancer agent can be developed by using these compounds as an active ingredient of an anticancer agent. By using these compounds for the treatment of cancers that express TACC3 to form an anticancer agent composition, an anticancer agent that selectively acts on tumor cells can be produced.
  • the anticancer agent of the present invention has a compound represented by the general formula (I) represented by the following formula: And a pharmaceutically acceptable salt, solvate or ester derivative thereof as an active ingredient.
  • the above compound is a novel compound synthesized by the present inventors. These compounds can be used as anticancer agents because they suppress cell division by experiments using cultured cells.
  • the anticancer agent of the present invention is a cancer in which the target cancer expresses TACC3, and in particular, colorectal cancer, ovarian cancer, uterine cancer, breast cancer, esophageal cancer, lymphoma, glioma, prostate cancer, renal cancer, melanoma It is characterized by being.
  • the compound of the present invention acts via TACC3 and TACC3-TOGp complex, it acts on tumor cells expressing TACC3.
  • TACC3 and TACC3-TOGp complex acts on tumor cells expressing TACC3.
  • colon cancer, ovarian cancer, uterine cancer, breast cancer, esophageal cancer, and lymphoma have many cancers that overexpress TACC3, an anticancer agent containing the compound of the present invention as an active ingredient is effective for these cancer types. It is recognized that it works.
  • anticancer agents containing the compound of the present invention as an active ingredient are included in these cancer types. It is recognized that it works effectively.
  • an anticancer agent containing the compound of the present invention as an active ingredient was confirmed from the fact that the apoptosis-inducing tumor regression effect by TACC3 suppression was confirmed in mouse experiments and the cell death induction effect by the compound of the present invention was confirmed. It is recognized that it effectively acts on these cancer types.
  • the anticancer agent composition of the present invention is a composition for oral administration.
  • Oral administration eliminates the need for a doctor's injection and allows the patient to continue treatment at home without visiting the hospital. In addition, since it is relatively easy to use with other agents, a wide range of applications and effects can be expected.
  • the present invention also relates to a method for producing an anticancer agent composition comprising mixing the compound of the present invention, a pharmaceutically acceptable salt, solvate or ester derivative thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutically acceptable salt, solvate or ester derivative thereof a pharmaceutically acceptable excipient.
  • an anticancer agent composition that selectively acts on tumor cells expressing TACC3.
  • the present invention it is possible to provide a medicine targeting TACC3, particularly an anticancer agent.
  • the compound disclosed in the present invention selectively inhibits the function of the spindle and the division apparatus via the TACC3-TOGp complex, only the tumor expressing TACC3 with high cell division is selectively used. Target to.
  • the compound of the present invention can be administered orally, a wide range of clinical applications can be expected.
  • A Cell growth inhibitory effect of SPL-B and paclitaxel in combination
  • the present invention provides a compound targeting TACC3.
  • a compound targeting TACC3 means a compound that inhibits its action by binding to the TACC3 protein.
  • TACC3 is one type of protein belonging to the TACC family.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene encoding TACC3 are disclosed on databases such as GenBank accession number NM_006342.1, UniProt accession number Q9Y6A5, and the like.
  • the disease that can benefit from inhibiting the action of the TACC3 gene or TACC3 protein is not limited, but is preferably a tumor.
  • cancer and tumor are used interchangeably.
  • TACC3 is highly expressed compared to the corresponding non-tumor cells.
  • Expression means expression of a gene and / or protein unless otherwise specified.
  • Tumors include, but are not limited to, sarcoma, leukemia, biliary tract cancer, breast cancer, uterine cancer, colorectal cancer, laryngeal cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, tonsillar cancer, tongue cancer, neck cancer, lymphoma, lung cancer, thyroid cancer Ovarian cancer, renal cancer, pancreatic cancer, brain tumor, myeloma, glioma, melanoma, liver cancer, prostate cancer and bladder cancer, preferably ovarian cancer, breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, pancreatic cancer , Prostate cancer, lymphoma, myeloma, glioma, renal cancer, melanoma, particularly preferably from colon cancer, ovarian cancer, uterine cancer, breast cancer, esophageal cancer, lymphoma, glioma, prostate cancer, renal cancer, melanoma Selected from the group consisting of
  • the medicament of the present invention is a medicament for treating cells and tumors that express TACC3 and actively perform cell division.
  • Treatment refers to reducing a disease or disorder in a subject, particularly a tumor, by inhibiting abnormal cell growth in TACC3-expressing cells or inducing cell death of TACC3-highly expressing cells, preferably tumor cells, or It means delaying or suppressing tumor growth.
  • the pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention and pharmaceuticals include hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, citric acid, formic acid, maleic acid, acetic acid, succinic acid, tartaric acid, methanesulfonic acid, And salts with inorganic acids and organic acids such as para-toluenesulfonic acid.
  • base salts such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium bicarbonate, ammonia, amine salts, trialkylamine salts and the like are also included.
  • examples of the pharmaceutically acceptable ester derivative include an ester compound with an alcohol or carboxylic acid having 1 to 10 carbon atoms, preferably methyl alcohol, ethyl alcohol, acetic acid, or propionic acid.
  • the pharmaceutically acceptable solvate preferably includes a solvate with water.
  • the medicament of the present invention may be orally administered, for example, in the form of tablets, coated tablets, dragees, hard or soft gelatin capsules, solutions, emulsions or suspensions. It may also be administered rectally, for example using suppositories. Alternatively, it may be administered topically or transdermally using, for example, an ointment, cream, gel or solution. It may also be administered parenterally, for example intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intraspinally or intradermally using injections. Intravenous, intramuscular or oral administration is preferred, and oral administration is most preferred. Without limitation, it can be administered once or several times a day.
  • the medicament of the present invention may be mixed with a pharmaceutically inert inorganic or organic excipient.
  • excipients suitable for tablets, dragees or hard gelatin capsules include lactose, corn starch or derivatives thereof, talc or stearic acid or salts thereof and the like.
  • suitable excipients used in soft gelatin capsules include vegetable oils, waxes, fats, semi-solid or liquid polyols and the like.
  • excipients for the preparation of solutions and syrups include water, polyols, saccharose, invert sugar and glucose.
  • excipients for injection include water, alcohol, polyol, glycerin and vegetable oil.
  • suppositories and excipients for topical or transdermal application include natural or hardened oils, waxes, fats and semi-solid or liquid polyols. Further, it may contain preservatives, solubilizers, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, sweeteners, colorants, flavoring agents, salts that change osmotic pressure, buffers, coating agents or antioxidants. In addition, other therapeutically useful agents may be included.
  • the effective amount or dose of the compound of the present invention is not particularly limited, but may be appropriately selected depending on the administration form, age, weight, and symptoms.
  • the subject to be treated with the medicament of the present invention is a mammal.
  • the mammal can be any mammal such as a mouse, rat, rabbit, guinea pig, dog, cat, cow, horse, goat, sheep, monkey, human.
  • Preferred are pets such as dogs and cats, humans, and more preferred are humans.
  • Non-patent Document 13 a cell lysate containing a TACC3-DsRed fusion protein was brought into contact with a chemical array, and a compound that binds to the TACC3-DsRed fusion protein was screened (FIG. 1, upper figure). .
  • a cell lysate containing the TACC3-DsRed fusion protein is prepared as follows.
  • Human TACC3 cDNA was cloned into pDsRed-Express-N1 (registered trademark, manufactured by Clontech), introduced into HEK293T cells, and cells were collected after 48 hours. The obtained cells were sonicated in PBS, and insoluble substances were removed by centrifugation to obtain a cell lysate. The presence of the TACC3-DsRed fusion protein in the cell lysate was confirmed by anti-TACC3 antibody and anti-DsRed antibody.
  • the cell lysate containing the TACC3-DsRed fusion protein was brought into contact with the chemical array, washed, and then the TACC3-DsRed fusion protein bound to the compound immobilized on the chemical array was detected. Detection of the TACC3-DsRed fusion protein and compound was performed by exciting the chemical array slide at a wavelength of 532 nm and detecting fluorescence at 575 nm.
  • 70 compounds were bound to the TACC3-DsRed fusion protein.
  • 70 compounds found to bind to the TACC3-DsRed fusion protein were added to the culture medium of cultured cells, and compounds that induce cell division abnormalities were selected by microscopic observation. As a result, four compounds were screened as compounds that inhibit cell division (FIG. 1, lower panel, visual screening).
  • the four compounds represented by the following formulas (II) to (V) are compounds in which abnormal cell division was observed by binding to the TACC3-DsRed fusion protein.
  • the compounds (II) to (V) fixed to the chemical array are registered as NPD3574, 2568, 4089, and 2448 in the RIKEN natural compound bank “RIKEN NPDepo” (http://npd.riken.jp/npd/). Available from the bank.
  • NPD3574,2568,4089,2448 has a Jikumarin structure having an OH group at C 7 position represented by the following formula (I). Therefore, the structure of formula (I) is important for binding to TACC3.
  • Ovarian cancer cells SKOV-3 were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 5% fetal bovine serum.
  • Stable cells expressing EGFP- ⁇ -tubulin were obtained by lentiviral transduction using the pLenti4 / V5-DEST vector (registered trademark, manufactured by Invitrogen), and the infected cells were transformed into Zeocin (registered trademark) followed by FACSAria ( Selected by FACS sorting using the registered trademark, Becton Dickinson).
  • EGFP- ⁇ tubulin-expressing SKOV-3 cells were synchronized with thymidine block, and the effect of the compound on cell division was analyzed. As shown in the upper part of FIG. 2, each compound was added to the culture solution after the first thymidine block. Synchronized with 2 thymidine blocks and then imaged in RPMI 1640 medium with 5% fetal calf serum without phenol red for 3 days every 2 minutes using Leica AF6000 and x20 / 0.5 PlanFluotar objective And imaged. The time-lapse image was analyzed using ImageJ1.42a software and the fission stop time was determined visually. Mitotic time was determined manually from an image sequence of at least 50 cells.
  • C 7 -O- propylated NPD3574 was propylated the C 7 position, since it has lost the mitotic arrest activity, OH group of C 7 position is important for activity. Further, in view of the structure of the four compounds were screened in the above, C 8 position N, it is N- disubstituted aminomethyl group major determinant is presumed.
  • novel compounds represented by the general formula (I) having a TACC3 binding activity inhibition of cell division to a compound having N, a N- disubstituted aminomethyl group at C 7-position OH group, in C 8 position Activity is observed. Therefore, in order to obtain a novel compound having TACC3 binding activity and cell division inhibitory activity, a compound having the basic structure of formula (I) was synthesized.
  • Table 1 shows the amines used for the synthesis of compounds having cell growth inhibitory activity shown in Table 2 below among the 30 compounds synthesized.
  • Example 2 As in Example 2, EGFP- ⁇ -tubulin-expressing SKOV-3 cells synchronized with two thymidine blocks were treated with the synthesized compound, time-lapse photography was performed for 3 days, and at least 50 cells were observed. Each cell arrest time was calculated, and EC 50 was obtained therefrom.
  • Lymphoma cells are adjusted to a cell number of 1.2 ⁇ 10 5 / ml, seeded in a 96-well culture dish at 50 ⁇ l / well, and further added with 50 ⁇ l of a medium containing an RT compound, which is a novel compound of the present invention at a double concentration. (Final concentration: 0.021 to 13.3 ⁇ g / ml). After culturing for 3 days, the survival rate was obtained using WST-1 reagent (Roche).
  • RT-007 shows an effect at an extremely low concentration of EC 50 of 0.05 ⁇ g / ml in the analysis using SKOV-3 and IC 50 of 0.02 ⁇ g / ml in the analysis using lymphoma.
  • R 1 is, OAc, NEt 2, NMe (CH 2 CH 2 OH), NH (CH 2 CH 2 NMe 2), NEt (CH 2 CH 2 NMe 2), N (CH 2 CH 2 OMe) 2, the N + O - ( CH 2 CH 2 OMe) 2 , NMe (CH 2 ) 3 Me, or N (CH 2 CH 2 Me) 2 , R 2 is Ac or H, and R 3 is H, Cl, F, Br.
  • RT-011 and RT-007 which have action effects at different concentrations, are selected from 18 compounds that have been found to have superior effects on mitotic arrest and cell death. They were selected and named SPL-A and SPL-B, respectively, and analyzed in detail. The results are described below.
  • SKOV-3 cells expressing EGFP- ⁇ -tubulin supplemented with varying concentrations of SPL-A and SPL-B were synchronized by two thymidine blocks and were based on a single cell Analysis was performed by time-lapse photography. Mitotic time was measured from an image sequence of at least 50 cells.
  • the concentration in FIG. 3 indicates the final concentration.
  • SPL-A induced mitotic arrest at 2.667 ⁇ g / ml
  • SPL-B induced mitotic arrest at 0.107 ⁇ g / ml.
  • SPL-B was more active against mitotic arrest than SPL-A. This result is consistent with the results of mitotic arrest and cell death analysis shown in Table 2.
  • the cells used were SKOV-3 cells and OVCAR-3 cells expressing EGFP- ⁇ tubulin.
  • OVCAR-3 cells expressing EGFP- ⁇ tubulin were obtained using the same method as SKOV-3 cells expressing EGFP- ⁇ tubulin.
  • cells to which SPL-A and SPL-B were added were synchronized by two thymidine blocks, and images were acquired by time-lapse photography and analyzed. Each cell is treated with SPL-A at 13.3 ⁇ g / ml and SPL-B at 2.7 ⁇ g / ml.
  • Cell fate was determined manually from an image sequence of at least 50 cells, with a nuclear membrane disruption time of 0.
  • FIG. 4 shows the analysis results. Both SKOV-3 and OVCAR-3 stop mitosis and suppress cell proliferation, but the timing of arrest in the cell cycle is different.
  • SKOV-3 most cells show mitotic delay (mitotic-slippage) by SPL-A treatment. Mitotic delay is caused by sustained cell cycle arrest during cell division. Some cells experienced death in interphase after mitotic delay and mitotic death during mitosis. In addition, by SPL-B treatment, most cells showed mitotic delay, and some cell death during mitosis was observed.
  • Immunostaining was performed by the following method. Cells were fixed in 3.7% PFA, methanol or 10% TCA on chamber slides, permeabilized in 0.2% Triton-X100 in PBS, and incubated with primary antibody. Monoclonal antibodies against ⁇ -tubulin (DM1A) and monoclonal antibodies against ⁇ -tubulin (DQ19 and GTU-88) were obtained from Sigma. Anti-centrin 2 (sc-27793) was purchased from Santa Cruz. Fluorescently labeled conjugated goat anti-mouse IgG (Cappel) and Cy3 conjugated goat anti-rabbit IgG (Millipore) were used as secondary antibodies. DNA was detected using 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Images were acquired using a Leica DM6000B microscope equipped with a x100 / 1.40-0.70 PlanApo objective and Z-projections.
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 5 shows the analysis results of the spindle form.
  • the proportion of spindle morphology is expressed as a percentage (%) of normal, multipolar, disorganized, and monopolar spindles in the number of mitotic cells.
  • the concentration indicates the final concentration.
  • Normal means that the spindle is bipolar and aligned (normal), and disorganized, multipolar or monopolar is an abnormal spindle Point to.
  • SPL-A induced various abnormal spindles at a high concentration.
  • SKOV-3 56.7% produced disordered spindles at 5 ⁇ g / ml, the highest proportion.
  • OVCAR-3 57.3% produced disordered spindles at 2.5 ⁇ g / ml, the highest proportion.
  • the proportion of disordered spindles decreased with increasing SPL-A concentration and increased multipolar spindles.
  • Monopolar spindles increased with higher doses of SPL-A.
  • ⁇ -tubulin was localized at the poles of each spindle, while centrin 2 was detected in only two of them. Furthermore, by time-lapse image analysis, SPL-A selectively inhibits nucleation of centrosome microtubules, but centromeric microtubules nucleate and polymerize, resulting in ectopic spindle poles, multiple It became clear that a polar spindle was formed.
  • SPL treatment reproduces the spindle expression system induced by TACC3 depletion or TOGp depletion. This suggests that SPL-A destabilizes spindle microtubules by inhibiting the TACC3-TOGp pathway.
  • a cell lysate of SKOV-3 was prepared by sonication in a binding buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 1 mM EDTA and protease inhibitor mixture (Roche)). After insoluble material was removed by centrifugation, the supernatant (500 ⁇ g protein) was incubated with 30 ⁇ l of beads for 3 hours at 4 ° C. The beads after the reaction were washed 4 times with a binding buffer containing 0.025% NP40. The protein bound to the beads was eluted with SDS-PAGE sample buffer, separated by SDS-PAGE, and transferred to nitrocellulose. Blots were incubated with primary antibody followed by peroxidase-conjugated secondary antibody and visualized using ECL detection system (GE Healthcare). An antibody against TACC3 or TOGp and an antibody against GADPH were used as controls.
  • a binding buffer 10 mM Tris-HCl pH 7.5
  • An antibody against human TACC3 was generated by immunizing a rabbit with a peptide corresponding to amino acids 213 to 224 of human TACC3.
  • Rabbit anti-TOGp antibodies were raised against the GST protein fused to the C-terminal 111 amino acids of human TOGp. These were purified and used using a peptide binding immunoaffinity column.
  • Anti-GADPH antibody (sc-25778) was purchased from Santa Cruz.
  • SPL-A beads, SPL-B beads and control beads indicate SPL-A-immobilized agarose beads, SPL-B-immobilized agarose beads and non-immobilized agarose beads.
  • TACC3, TOGp and GAPDH indicate anti-TACC3 antibody, anti-TOGp antibody and anti-GAPDH antibody treatment.
  • SPL inhibits microtubule spindle formation through direct binding to the TACC3-TOGp complex, and induces morphological abnormalities of the spindle and suppression of cell division.
  • This result indicates that SPL not only targets TACC3 but also TOGp.
  • the compound having the common structure of the formula (I) induces cell growth suppression by the same mechanism of action.
  • mice 13 days after the treatment, the mice were dissected and the tissues were collected and fixed overnight in 10% buffered formalin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), embedded in paraffin, and 1, 4 or 6 ⁇ m sections were prepared.
  • the sections were immunostained with anti-p53 antibody, anti-p21 antibody, anti-H3K9me3 antibody, and anti-PCNA antibody.
  • the percentage of positive cells in at least 10 arbitrarily selected regions in the two sections was counted. Data are shown as mean and SD.
  • SPL-B inhibited tumor growth in a dose-dependent manner in vivo.
  • SPL-B was orally or intraperitoneally administered at 20 mg / kg, and the serum concentration after 6 hours was measured.
  • the SPL-B concentration in the serum was 270 ng / ml, whereas in the case of intraperitoneal administration, it was 90 ng / ml.
  • SPL-B has a higher blood SPL-B concentration in the oral administration, and thus has various clinical applications in the treatment.
  • SPL-B treatment enhances the expression of p53, p21 and K9 trimethylhistone H3 (HSK9me3) that induce cell death and suppresses PCNA expression that induces cell proliferation. This result indicates that the anticancer effect of SPL-B is caused by activating the p53-p21 pathway.
  • SPL-B Effect of SPL-B on various cell lines If SPL acts on spindle formation and mitotic apparatus control via the TACC3-TOGp complex, it is considered to have a cell growth inhibitory effect on a wide range of cancer types. . Therefore, the effect of SPL was measured using various cancer cell lines.
  • FIG. 9 shows the rate of change in G2 / M phase cells by SPL-B treatment.
  • SPL has a selective growth inhibitory effect on cancer cells
  • SPL is effective in suppressing the growth of cancer cells, but it does not cause growth inhibition in normal cells. .
  • Method (A) Two cell lines, SKOV-3 and OVCAR-3, which are cancer cell lines, and three cell lines, hTERT-RPE, MCF10A, and 184B5, which are normal cell lines, are shown in FIG. ) SPL-A treatment for 24 hours at the concentration indicated on the horizontal axis, followed by prodium iodide (PI) staining and analysis by flow cytometry.
  • FIG. 10 (A) shows the rate of change in G2 / M phase cells by SPL-B treatment.
  • FIG. 10B shows the rate of change in G2 / M phase cells due to each drug treatment.
  • SPL-A has an effect of stopping cell division because the ratio of G2 / M phase cells increases in two types of cancer cell lines in a concentration-dependent manner. However, in all normal cell lines, even when SPL is acted at a high concentration, no inhibition of division occurs. Therefore, SPL-A was shown to act selectively on cancer cells.
  • the human colon cancer cell HCT-116 p53 knockout cells were cultured with paclitaxel and SPL-B administered in combination, and the cell viability was measured by WST assay after 3 days. The results are shown in FIG.
  • FIG. 11 (A) SPL-B at concentrations of 0, 150 and 300 ⁇ M and paclitaxel were added in combination at a concentration range of 0 to 32 nM, HCT-116p53 knockout cells were cultured, and cell proliferation was measured by WST assay. The measurement results are shown.
  • the IC 50 of paclitaxel was 8.339 nM when SPL-B was not added, 7.697 nM when 150 ⁇ M was added, and 7.537 nM when 300 ⁇ M was added.
  • Paclitaxel is a microtubule depolymerization inhibitor and, like SPL-B, inhibits cell division but is thought to have a potentiating effect due to the different mechanism of action.
  • the compound of the present invention can be administered orally, and acts on the spindle via the TACC3, TACC3-TOGp complex, not the microtubule itself.
  • the compound of the present invention does not inhibit the microtubule function even in non-dividing cells like the vinca alkaloid, which is an anticancer agent targeting the microtubules currently used. Therefore, there is no worry of causing serious side effects such as peripheral neuropathy.
  • a new anticancer agent targeting TACC3 protein is provided.
  • the compound of the present invention acts on an individual by oral administration, and inhibits the function of the spindle at a low concentration, so that it can be used as an anticancer agent with few side effects.

Abstract

　本発明は、ＴＡＣＣ３を標的にする小化合物を提供する。さらに、ＴＡＣＣ３を標的にする小化合物を含む医薬、特に抗癌剤を提供する。　一般式（Ｉ）で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体はＴＡＣＣ３と結合し、細胞増殖を抑制する。したがって、これら化合物を、医薬、特に抗癌剤として利用することができる。

Description

ＴＡＣＣ３を標的とする小化合物
　本発明は、ＴＡＣＣ３を標的とする小化合物に関する。また、本発明は、ＴＡＣＣ３を標的とした小化合物に基づく医薬、特に抗癌剤に関する。
　微小管は、細胞分裂の際に形成される紡錘体を構成する。腫瘍細胞は細胞分裂が盛んであることから、細胞分裂を阻害する薬剤は抗癌剤として有効である。そのため紡錘体の主要構造である微小管やその構成タンパク質であるチューブリンを標的とする抗癌剤は古くから開発され、固形腫瘍、血液系腫瘍を問わず治療に用いられている。
　実際にビンクリスチンやパクリタキセル等、微小管を標的とする多くの化合物が抗癌剤として広く用いられている。これら薬剤は、腫瘍細胞において、紡錘体形成を阻害することにより、細胞分裂を抑制する結果、抗癌作用があるものと考えられている。
　しかしながら、これらの化合物は、紡錘体の微小管だけではなく、正常細胞の微小管を同時に標的とすることから、末梢性ニューロパシーのような重篤な副作用が生じることが知られている（例えば、特許文献１、非特許文献１）。また、チューブリンの特定のアイソフォームが抗癌剤に対して抵抗性を備えることも報告されてきている。そのため、腫瘍細胞の微小管を選択的に標的とする新しい医薬の開発が必要とされている（非特許文献２）。
　本発明者らは、腫瘍細胞の微小管を選択的に標的とする化合物を探索するにあたり、微小管重合に関与し、種々の腫瘍で異常発現していることが報告されているＴＡＣＣ３に着目して解析を行ってきた。
　ＴＡＣＣ３（Transforming acidic coiled-coil 3）タンパク質をコードしている遺伝子は、いわゆる癌遺伝子であると考えられている（例えば、非特許文献３～８、特許文献２）。また、ＴＡＣＣ３は紡錘体形成や、染色体分配と細胞分裂に関与する分裂装置の制御に関与することが知られている（例えば、非特許文献９）。さらに、ＴＡＣＣ３やＴＡＣＣ３と相互作用することが知られているＴＯＧｐ（Tumor over-expressed gene）は、種々の癌で過剰発現している。
　ＴＡＣＣ３の発現抑制は、用いる細胞株等により異なる現象が誘導される。例えば、微小管重合の減少（非特許文献１０）、染色体不均衡により誘導されるアポトーシス（非特許文献９）が観察されることが報告されている。
　これらの現象は、XenopusやDrosophilaで得られた知見をもとに、ＴＡＣＣ３がＴＯＧｐと結合し、有糸分裂の際に中心体での微小管の重合を安定化し、細胞分裂を制御するというモデルによって説明されている（非特許文献１１)。
　本発明者らは、ＴＡＣＣ３のコンディショナルノックアウトマウスを用い、ＴＡＣＣ３発現を抑制する実験を行った。その結果、リンパ腫はアポトーシスにより退縮するが、正常胸腺細胞はＴＡＣＣ３発現が見られるにも関わらず、明らかな影響はないことを見出した（非特許文献１２）。そこで、本発明者らは、ＴＡＣＣ３を標的とする化合物は、腫瘍細胞に選択的に作用する優れた抗癌剤となり得ると考え、ＴＡＣＣ３を標的とする抗癌剤のスクリーニング方法をすでに開示している（特許文献３）。
特開２００９－１６７１６３号公報 国際公開２００５／０７１４１９号 特開２０１２－５４７９号公報
Kavallaris, M., Nat.Rev.Cancer(2010), 10, 194-204 Sudakin, V. and Yen, T.J., BioDrugs (2007), 21, 225-33 Charrasse, S.et al., Eur.J.Biochem. (1995), 234(2), 406-413 Kiemeney, L.A. et al., Nat.Genet. (2010), 42(5), 415-419 Peters, D.G. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. (2005), 14(7), 1717-1723 Ma, X.J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2003), 100(10), 5974-5979 Ulisse, S. et al., Endocr.Relat.Cancer (2007), 14(3), 827-837 Still, I.H. et al., Genomics (1999), 58(2), 165-170 Schneider, L. et al. Oncogene (2008), 27(1), 116-125 Gergely, F. et al. Genes Dev. (2003),17, 336-341 Peset, I., and Vernons, I. Trends Cell Biol. (2008), 18(8), 379-388 Yao, R. et al., Oncogene (2012), 31, 135-148 Miyazaki, I. et al., Methods Mol.Biol. (2010) 669,95-107 Dubovic I. P. et al., Chemist. Natural Compounds, (2004) 40, 434-443 Yamori, T., Cancer Chemother.Pharmacol., (2007), 52 Suppl. 1, S74-79
　本発明の課題は、ＴＡＣＣ３を標的とする小化合物を提供することである。さらに、ＴＡＣＣ３を標的とする小化合物を含む医薬、特に抗癌剤及びこれらの製造方法を提供することである。
　本発明の抗癌剤は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体を有効成分として含有することを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 OAc、NEt2、NMe(CH2CH2OH)、NH(CH2CH2NMe2)、NEt(CH2CH2NMe2)、N(CH2CH2OMe)2、N+O-(CH2CH2OMe)2、NMe(CH2)3Me、又はN(CH2CH2Me)2、Ｒ２は、Ac又はＨ、Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、又はＢｒを表す。）
　本発明者らは、マウスや培養細胞を用いた実験により、ジクマリン構造を有する上記化合物がＴＡＣＣ３を介して細胞分裂を抑制し、抗腫瘍効果を示すことを明らかにした。したがって、これら化合物を抗癌剤の有効成分として用いることにより、有効な抗癌剤を開発することができる。これら化合物をＴＡＣＣ３を発現する癌の治療に用い、抗癌剤組成物とすることにより、腫瘍細胞に選択的に作用する抗癌剤を製造することが可能となる。
　また、本発明の抗癌剤は、一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の式、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体を有効成分として含有することを特徴とする。
　上記化合物は、本発明者らが合成した新規化合物である。これら化合物は、培養細胞を用いた実験により細胞分裂を抑制することから、抗癌剤として用い得るものである。
　さらに、本発明の抗癌剤は、対象となる癌がＴＡＣＣ３を発現する癌であり、特に、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、食道癌、リンパ腫、神経膠腫、前立腺癌、腎癌、メラノーマであることを特徴とする。
　本願発明の化合物はＴＡＣＣ３、ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を介して作用することから、ＴＡＣＣ３を発現している腫瘍細胞に作用する。また、特に、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、食道癌、リンパ腫ではＴＡＣＣ３を過剰発現している癌が多いことから、本発明の化合物を有効成分として含む抗癌剤がこれら癌種に有効に作用するものと認められる。
　また、卵巣癌、大腸癌、神経膠腫、前立腺癌、腎癌、メラノーマでは、本発明化合物による細胞分裂阻害停止効果が高いことから、本発明の化合物を有効成分として含む抗癌剤がこれら癌種に有効に作用するものと認められる。
　加えて、リンパ腫では、マウス実験において、ＴＡＣＣ３抑制によるアポトーシス誘導腫瘍退縮効果が確認されたこと、本発明化合物による細胞死誘導効果が確認されたことより、本発明の化合物を有効成分として含む抗癌剤がこれら癌種に有効に作用するものと認められる。
　さらに、本発明の抗癌剤組成物は、経口投与のための組成物であることを特徴とする。
　マウスを用いた実験によって、経口投与で効果があったことから、経口投与剤として与えることが可能である。経口投与であれば、医師による注射は不要となり、患者が病院に来院することなく、在宅でも治療を継続することができる。また、他剤との併用も比較的容易であるため、幅広い応用と効果が期待できる。
　また、本発明は、本発明の化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体と、薬学的に許容されうる賦形剤を混合することを含む抗癌剤組成物の製造方法を提供する。
　本発明で開示される化合物を有効成分とし、賦形剤を混合することにより、ＴＡＣＣ３を発現する腫瘍細胞に選択的に作用する抗癌剤組成物を製造することが可能となる。
　本発明により、ＴＡＣＣ３を標的とする医薬、特に抗癌剤の提供が可能となる。また、本発明で開示される化合物は、ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を介して、紡錘体、及び分裂装置の機能を選択的に阻害するため、細胞分裂の盛んなＴＡＣＣ３を発現する腫瘍のみを選択的に標的とする。さらに、本発明の化合物は経口投与が可能であることから、臨床での幅広い応用が期待できる。
ケミカルアレイを用いてＴＡＣＣ３と結合する化合物をスクリーニングする方法の概略図。 ＮＰＤ化合物による用量依存性有糸分裂停止を示す図。 ＳＰＬ（Spindlactone）による用量依存性有糸分裂停止を示す図。 ＳＰＬ処理によるＳＫＯＶ－３細胞とＯＶＣＡＲ-３細胞を用いた細胞運命分析の結果を示す図。 ＳＰＬ処理により誘導される異常な紡錘体を含む細胞の紡錘体形態の割合を示す図。（Ａ）ＳＫＯＶ-３細胞、（Ｂ）ＯＶＣＡＲ-３細胞を用いて解析した図。 ＴＡＣＣ３－ＴＯＧｐ複合体とＳＰＬの相互作用を示す図。 インビボにおけるＳＰＬ－Ｂの抗腫瘍効果を示す図。 ＳＰＬ－Ｂ投与の腫瘍に対する効果を免疫組織化学分析により示す図。腫瘍切片を抗ｐ５３、抗ｐ２１、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、抗ＰＣＮＡ抗体を用いて免疫組織染色を行い、陽性細胞の割合を示す。 種々の癌細胞株におけるＳＰＬ-Ｂの細胞周期解析を示す図。 ＳＰＬ－Ａ及び他の抗癌剤の正常細胞、癌細胞に対する増殖抑制効果の解析を示す図。 癌細胞増殖に対するＳＰＬ-Ｂとパクリタキセル併用効果を示す図。（Ａ）ＳＰＬ－Ｂとパクリタキセルの併用、（Ｂ）ＳＰＬ-Ｂ単独添加による細胞増殖抑制効果を示す。
　本発明は、ＴＡＣＣ３を標的とした化合物を提供する。ＴＡＣＣ３を標的とした化合物とは、化合物がＴＡＣＣ３タンパク質と結合することによって、その作用を阻害する化合物を意味する。
　ＴＡＣＣ３は、ＴＡＣＣファミリーに属するタンパク質の１種である。ＴＡＣＣ３をコードする遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えば、GenBankアクセッション番号NM_006342.1、UniProtアクセッション番号Q9Y6A5等、データベース上に開示されている。
　ＴＡＣＣ３遺伝子またはＴＡＣＣ３タンパク質の働きを阻害することによって利益が得られる疾患は、限定されないが、好ましくは腫瘍である。本発明において、癌と腫瘍は交換可能に用いられる。
　腫瘍細胞においては、対応する腫瘍化していない細胞と比較してＴＡＣＣ３が高発現している。発現とは、特に記載しない限り、遺伝子及び／またはタンパク質の発現を意味する。
　腫瘍は、限定されないが、肉腫、白血病、胆道癌、乳癌、子宮癌、結腸直腸癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌、扁桃癌、舌癌、首の癌、リンパ腫、肺癌、甲状腺癌、卵巣癌、腎癌、すい臓癌、脳腫瘍、骨髄腫、神経膠腫、メラノーマ、肝癌、前立腺癌及び膀胱癌、好ましくは、卵巣癌、乳癌、子宮癌、食道癌、胃癌、大腸癌、すい臓癌、前立腺癌、リンパ腫、骨髄腫、神経膠腫、腎癌、メラノーマ、特に好ましくは、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、食道癌、リンパ腫、神経膠腫、前立腺癌、腎癌、メラノーマからなる群から選択される。
　本発明の医薬は、ＴＡＣＣ３を発現し、細胞分裂を盛んに行っている細胞、腫瘍を処置するための医薬である。処置とは、ＴＡＣＣ３発現細胞において異常な細胞増殖を抑制する、または、ＴＡＣＣ３高発現細胞、好ましくは腫瘍細胞の細胞死を誘導することにより、対象における疾患もしくは障害、特に腫瘍を退縮させる、または、腫瘍の増殖を遅延もしくは抑制することを意味する。
　本発明の化合物、医薬の薬学的に許容されうる塩には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、クエン酸、ギ酸、マレイン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸等の無機酸及び有機酸との塩が挙げられる。また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、アンモニア、アミン塩、トリアルキルアミン塩等の塩基塩も挙げられる。
　また、薬学的に許容されうるエステル誘導体には、炭素数１～１０個のアルコールまたはカルボン酸など、好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、酢酸、又はプロピオン酸などとのエステル化合物が挙げられる。
　薬学的に許容されうる溶媒和物には、好ましくは、水との溶媒和物が挙げられる。
　このような塩、エステル誘導体、溶媒和物は、標準的な技術を使用して当業者により形成することができる。
　本発明の医薬は、例えば錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬若しくは軟ゼラチンカプセル剤、液剤、乳剤又は懸濁剤の剤形で経口投与してよい。また、例えば坐剤を使用して直腸内に投与してよい。また、例えば軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤又は液剤を使用して局所的又は経皮的に投与してよい。また、例えば、注射剤を使用して非経口的、例えば静脈内、筋肉内、皮下、脊髄内又は皮内的に投与してよい。好ましくは、静脈内、筋肉内又は経口投与であり、最も好ましくは経口投与である。限定されないが、１日に１回または数回投与できる。
　本発明の医薬は、薬学的に不活性な無機又は有機の賦形剤と混合してもよい。錠剤、糖衣錠又は硬ゼラチンカプセル剤に適切な賦形剤の例には、乳糖、トウモロコシデンプン若しくはその誘導体、タルク又はステアリン酸若しくはその塩などが挙げられる。軟ゼラチンカプセル剤に使用される適切な賦形剤の例には、植物油、ロウ、脂肪、半固体又は液体ポリオール等が挙げられる。液剤及びシロップ剤の調製のための賦形剤の例には、水、ポリオール、サッカロース、転化糖及びグルコースなどが挙げられる。注射剤のための賦形剤の例には、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油などが挙げられる。坐剤及び局所又は経皮適用のための賦形剤の例には、天然又は硬化油、ロウ、脂肪及び半固体又は液体ポリオールなどが挙げられる。また、防腐剤、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着香剤、浸透圧を変える塩、緩衝剤、被膜剤又は酸化防止剤などを含んでよい。さらに、他の治療上有用な薬剤を含んでよい。
　本発明の化合物の有効量または投与量は、特に制限されないが、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。
　本発明の医薬を用いて治療を行う対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ヒトなど任意の哺乳動物であり得る。好ましくは、イヌ、ネコ等の愛玩動物、ヒト、より好ましくは、ヒトである。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質と結合する化合物のスクリーニング
　本発明者らは、ＴＡＣＣ３を標的とする化合物をケミカルアレイによってスクリーニングした（図１）。
　　Miyazakiらの方法（非特許文献１３）により、ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質が含まれる細胞溶解液を、ケミカルアレイに接触させ、ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質と結合する化合物をスクリーニングした（図１、上図）。
　ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合たんぱく質が含まれる細胞溶解液は以下のように調製する。
　ヒトＴＡＣＣ３　ｃＤＮＡをｐＤｓＲｅｄ-Ｅｘｐｒｅｓｓ-Ｎ１（登録商標、クロンテック社製）にクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、４８時間後に細胞を収集した。得られた細胞はＰＢＳ中で超音波処理を行い、不溶性の物質を遠心によって除去することにより細胞溶解液を得た。細胞溶解液中にＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質が含まれることは、抗ＴＡＣＣ３抗体及び抗ＤｓＲｅｄ抗体により確認した。
　ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質が含まれる細胞溶解液をケミカルアレイに接触させ、洗浄後、ケミカルアレイに固定されている化合物と結合しているＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質の検出を行った。ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質と化合物の検出は、ケミカルアレイスライドを５３２ｎｍの波長で励起し、５７５ｎｍの蛍光を検出することによって行った。
　６８００の化合物をスクリーニングしたところ、７０の化合物がＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質と結合していた。ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質と結合することが認められた７０の化合物を、培養細胞の培養液中に添加し、顕微鏡観察によって、細胞分裂異常を誘導する化合物を選択した。その結果、４つの化合物が細胞分裂を阻害する化合物としてスクリーニングされた（図１、下図、visual screening）。
　下記式（II)～（V)で表される４つの化合物は、ＴＡＣＣ３-ＤｓＲｅｄ融合タンパク質と結合し、細胞分裂異常が観察された化合物である。ケミカルアレイに固定された上記(II)～（V)の化合物は理研天然化合物バンク「ＲＩＫＥＮ　ＮＰＤｅｐｏ」（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｄ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｎｐｄ／）に、ＮＰＤ３５７４、２５６８、４０８９、２４４８として登録されており、当該バンクより入手することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ケミカルアレイを用いたスクリーニングによって得られた４つの化合物、ＮＰＤ３５７４、２５６８、４０８９、２４４８は、下記式（Ｉ）で表されるＣ７位にＯＨ基を有するジクマリン構造を有する。したがって、式（Ｉ）の構造がＴＡＣＣ３との結合に重要である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　ＮＰＤ化合物により誘導される核分裂停止（mitotic arrest）
　ケミカルアレイを用いたスクリーニングによって選択された４つのＮＰＤ化合物に関し、同調培養系でＮＰＤ化合物の細胞分裂に対する活性を解析した。
　また、４つの化合物がＣ７位にＯＨ基を有するジクマリン構造を有することから、Ｃ７位のＯＨ基が重要であることが示唆される。そこで、Ｃ７位をプロピル化したＣ７－Ｏ－プロピル化ＮＰＤ３５７４を合成し、上記４つのＮＰＤ化合物とともに培養細胞での細胞分裂に対する影響を解析した。
　以下に解析方法を詳述する。
　（１）ＥＧＦＰ－α－チューブリン発現細胞の作成
アッセイ系に用いたＥＧＦＰ－α－チューブリン発現細胞について説明する。有糸分裂を蛍光顕微鏡下で観察するために、蛍光タンパク質ＥＧＦＰとα－チューブリンの融合タンパク質、ＥＧＦＰ－α-チューブリンを発現する細胞を作成し、蛍光顕微鏡下で細胞を固定することなく観察可能な系を作成した。
　卵巣癌細胞ＳＫＯＶ-３は、５％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地で培養された。ＥＧＦＰ－α－チューブリンを発現する安定な細胞は、ｐＬｅｎｔｉ４/Ｖ５-ＤＥＳＴベクター（登録商標、インビトロジェン社製）を使用したレンチウイルス形質導入と、感染細胞をゼオシン（登録商標）及びそれに続くＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標、ベクトンディッキンソン）を使用するＦＡＣＳソーティングにより選択された。
　（２）ＮＰＤ化合物による核分裂停止解析
化合物ＮＰＤ２４４８、２５６８、３５７４、４０８９及びＣ７－Ｏ－プロピル化ＮＰＤ３５７４を濃度を変えてＥＧＦＰ－αチューブリンを発現するＳＫＯＶ-３細胞の培養液に添加し、細胞分裂に対する影響を解析した。
　ＥＧＦＰ－αチューブリン発現ＳＫＯＶ-３細胞を、チミジンブロックにより同調し、化合物の細胞分裂に対する影響を解析した。図２上部に示すように、各化合物は１回目のチミジンブロック後に培養液に添加した。２回のチミジンブロックにより同調させた後、フェノールレッド無添加の５％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、画像を２分毎に３日間、Ｌｅｉｃａ　ＡＦ６０００及び×２０／０．５　ＰｌａｎＦｌｕｏｔａｒ対物レンズを使用して撮像した。この微速度撮影（time-lapse）画像をＩｍａｇｅＪ１．４２ａソフトウェアを使用して解析し、核分裂の停止時期は目視で決定した。有糸分裂時間は、少なくとも５０細胞の画像シークエンスから手動で決定した。
　（３）結果
　図２に示すように、スクリーニングによって得られた４つの化合物は濃度依存的に核分裂停止を引き起こした。なお、濃度は終濃度を示しており、４つの化合物すべてで、用量依存的（ＥＣ５０＝０．３～８．０μｇ／ｍｌ）な有糸分裂停止が観察された。一方、Ｃ７位をプロピル化したＣ７－Ｏ－プロピル化ＮＰＤ３５７４は、有糸分裂を停止しなかった。
　式（Ｉ）の構造を有し、Ｃ７位をプロピル化したＣ７－Ｏ－プロピル化ＮＰＤ３５７４は、核分裂停止活性を失っていることから、Ｃ７位のＯＨ基は活性に重要である。また、上記でスクリーニングされた４つの化合物の構造に鑑みて、Ｃ８位のＮ，Ｎ－ジ置換アミノメチル基も主要な決定基であることが推認される。
　新規化合物の合成
　上述したように、ＴＡＣＣ３結合活性を有する一般式（Ｉ）で表され、Ｃ７位にＯＨ基、Ｃ８位にＮ，Ｎ－ジ置換アミノメチル基を有する化合物に細胞分裂阻害活性が認められる。そこで、ＴＡＣＣ３結合活性及び細胞分裂阻害活性を有する新規の化合物を得るために、式（Ｉ）の基本構造を有する化合物を合成した。
　以下の２９の化合物について合成を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　以下、合成方法について説明する。ジクマリンを出発物質として合成される代表的な２つの化合物、ＲＴ－００７、ＲＴ－０１１及び、式（ＩＩ）の化合物（ＮＰＤ３５７４）を出発物質とする２つの化合物、ＲＴ－００２及びＲＴ－０２７に関して、詳細に合成方法を説明する。他の化合物に関しても、前記化合物等を出発物質とし合成することができる。
　（１）実施例３－１
　ＲＴ－００７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　出発物質であるジクマリンの合成方法は、Dubovicらの方法による（非特許文献１４）。
　アセトニトリル（１５ｍｌ）中のジクマリン（１００ｍｇ、０．３２７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、３７％ホルムアルデヒド水溶液（４５８μｌ、６．２１ｍｍｏｌ）及び４－（エチルアミノメチル）ピリジン（２６７ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を加えて加熱還流下で２４時間加熱した。反応溶液を室温まで冷却し、ＣＨＣｌ３で希釈した。有機層を水及び飽和食塩水で順次洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４下で乾燥し溶媒を留去した。残渣を調製用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）で粗分した後、さらに調製用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５０：１）で精製し、ＲＴ－００７（黄色固体、７３．７ｍｇ、４９％収率）を得た。
　合成によって得られた化合物ＲＴ－００７のＮＭＲのデータは下記のとおりである。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ= 1.21 (t, J= 6.9 Hz, 3H), 2.69 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 3.73 (brs, 2H), 4.16 (s, 2H), 6.28 (s, 1H), 6.74 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.20 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 4.6, 1.7 Hz, 2H), 7.38 (ddd, J = 7.4, 7.4, 1.1 Hz, 1H), 7.43 (brd, J = 8.6 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.66 (ddd, J = 8.6, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 8.60 (dd, J = 4.6, 1.7 Hz, 2H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ= 11.0, 47.6, 49.9, 57.0, 108.4, 110.5, 112.3, 113.8, 116.9, 118.3, 124.0, 124.1, 125.1, 126.5, 128.5, 133.1, 143.3, 145.6, 150.1, 150.2, 152.9, 154.2, 159.0, 160.6, 162.8.
HRMS-FAB: m/z [M + H]+ calcd for C27H23N2O5: 455.1607; found: 455.1589. [M + Na]+ calcd for C27H22N2NaO5: 477.1426; found: 477.1423.
（２）実施例３－２
　ＲＴ－０１１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　アセトニトリル（３．５ｍｌ）中のジクマリン（９．２ｍｇ、３０．０μｍｏｌ）の溶液に、３７％ホルムアルデヒド水溶液（１７．７μｌ、２４０μｍｏｌ）及び４－ピペリジンエタノール（９．７ｍｇ、７５．０μｍｏｌ）を室温（約２３℃）で加えた。この攪拌反応混合液を加熱還流下で２４時間加熱した。混合液を室温まで冷却し、ＣＨＣｌ３で希釈した。有機層を水及び飽和食塩水で順次洗浄後、Ｎａ２ＳＯ４下で乾燥し溶媒を留去した。得られた残渣を調製用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）で粗分した後、さらに調製用ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１０：１）で精製し、ＲＴ－０１１（黄色油状物、１０．２ｍｇ、７６％収率）を黄色オイルとして得た。
　合成によって得られた化合物ＲＴ－０１１のＮＭＲのデータは下記のとおりである。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ= 1.32 (m, 2H), 1.53 (m, 3H), 1.79 (brd, J = 12.6 Hz, 2H), 2.24 (brs, 2H), 3.03 (brs, 2H), 3.70 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 4.04 (s, 2H), 6.22 (s, 1H), 6.67 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.36 (brdd, J = 7.4, 7.4 Hz, 1H), 7.42 (brd, J = 8.6 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.63 (ddd, J = 8.6, 7.4, 1.7 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H). 
13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ= 32.0, 39.0, 53.3, 54.3, 60.3, 108.1, 110.2, 114.0, 117.0, 118.4, 124.3, 125.0, 126.2, 128.5, 133.0, 143.1, 150.1, 152.9, 154.3, 159.0, 160.7, 168.8.
HRMS-FAB: m/z [M + H]+ calcd for C26H26NO6: 448.1760; found: 448.1764.
（３）実施例３－３
　ＲＴ－００２及びＲＴ－０２７に関しては、ＮＰＤ３５７４を出発物質として下記のようにして合成を行った。
　ＲＴ－００２の合成　　　　　　　　　　　　　　　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　ＮＰＤ３５７４ (6.6 mg, 15 μmol) の無水酢酸 (4 mL) 溶液を加熱還流下10時間撹拌した。反応溶液を室温に戻した後、無水酢酸を減圧下留去した。残渣にCHCl3を加え、有機層をH2O及び飽和食塩水で順次洗浄後、Na2SO4で乾燥し溶媒を留去した。残渣を調整用 TLC (CHCl3 : MeOH = 20 : 1) にて、精製し、ＲＴ－００２(無色結晶: 5.3 mg, 84%) を得た。
（４）実施例３－４
　ＲＴ－０２７の合成　　　　　　　　　　　　　　　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　ＮＰＤ３５７４(5.0 mg, 11.1 μmol) のCH2Cl2 (5 mL) 溶液にm-chloroperbenzoic acid (77% purity, 3.0 mg, 13.3 μmol) を加えて室温で4時間撹拌後、反応溶液をCHCl3で希釈した。有機層を飽和Na2CO3水溶液及び飽和食塩水で順次洗浄後Na2SO4で乾燥し溶媒を留去した。残渣を調整用 TLC (CHCl3 : MeOH = 10 : 1) にて精製し、RT-027 (黄色油状物: 3.9 mg, 75%) を得た。
　他の化合物に関しても、以下の表１に記載されているアミンを用いることによって、同様に合成することができる。なお、表１には合成した３０の化合物のうち、下記表２で示される細胞増殖阻害活性のある化合物の合成に用いたアミンを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　ＳＫＯＶ-３の有糸分裂停止（ＥＣ５０＝５０％停止率）及びリンパ腫の細胞死（ＩＣ５０＝５０％生存率）試験
　実施例３で、合成した２９の化合物、及びＲＴ－００２、ＲＴ－０２７合成の出発物質として用いたＮＰＤ３５７４に関して、細胞増殖阻害活性を有するか解析した。
　（１）有糸分裂停止（ＥＣ５０＝５０％停止率）に対する効果
　有糸分裂停止（ＥＣ５０＝５０％停止率）は個々の単細胞を顕微鏡解析することによって行った。
　実施例２と同様に、２回のチミジンブロックにより同調させたＥＧＦＰ－α－チューブリン発現ＳＫＯＶ－３細胞を合成した化合物により処理し、３日間微速度撮影を行い、少なくとも５０個の細胞を観察し、それぞれの細胞停止時間を算出し、そこからＥＣ５０を求めた。
　（２）細胞死（ＩＣ５０＝５０％生存率）の算出
　ｐ５３ＫＯに生じた胸腺リンパ腫由来の細胞株であるマウスｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株（非特許文献１２参照）を用いて、合成した化合物の細胞死誘導に対する活性を解析した。
　ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞を１．２　ｘ１０５／ｍｌの細胞数に調整し、５０μｌ/ｗｅｌｌで９６穴培養皿に播種し、さらに５０μｌの２倍濃度の本発明の新規化合物であるＲＴ化合物を含む培地を添加した（終濃度：０．０２１～１３．３μｇ/ｍｌ）。３日間培養後、ＷＳＴ－１試薬（ロッシュ社製）を用いて生存率を出した。
　（３）結果
　下記表２は、細胞増殖阻害効果の強い化合物から順に記載している。化合物ＲＴ－００７、０１６、０１９、０２９、０１１、００３、０１０、００６、０１２、００９、００８、０２７、０２８、０１４、００４、００２、００５、ＮＰＤ３５７４において顕著な細胞増殖抑制効果が認められた。
　特に、ＲＴ－００７は、ＳＫＯＶ－３を用いた解析で、ＥＣ５０が０．０５μｇ/ｍｌ、ｌｙｍｐｈｏｍａを用いた解析でＩＣ５０が０．０２μｇ/ｍｌと非常に低濃度で効果が見られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
 　上記結果から、一般式（Ｉ）の構造を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３として以下の特定の基を有する化合物に、細胞増殖を抑制する効果があるものと認められる。
　Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
OAc、NEt2、NMe(CH2CH2OH)、NH(CH2CH2NMe2)、NEt(CH2CH2NMe2)、N(CH2CH2OMe)2、はN+O-(CH2CH2OMe)2、NMe(CH2)3Me、又はN(CH2CH2Me)2、Ｒ２は、Ac又はＨ、Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒである。
　これら化合物は細胞増殖を抑制する効果が見られることから、抗癌剤等に用いれば、腫瘍細胞の増殖抑制が期待できる。そこで、これらの化合物に関し、細胞増殖抑制作用、特に細胞分裂に対する効果に関し、詳細な解析を行うこととした。
　上記、試験を行った３０の新規化合物のうち、有糸分裂停止及び細胞死に関し、優位な効果を認めた１８の化合物の中から、異なる濃度で作用効果を有するＲＴ－０１１及びＲＴ-００７を選択し、それぞれＳＰＬ-Ａ，ＳＰＬ－Ｂと命名し詳細に解析した。以下に結果を述べる。
　ＳＰＬ-Ａ及びＳＰＬ-Ｂの細胞分裂に対する効果
　ＳＫＯＶ-３及びマウスｌｙｍｐｈｏｍａで細胞増殖抑制効果が観察された１８の化合物のうち、ＳＰＬ-Ａ及びＳＰＬ－Ｂについて、細胞分裂に対する作用を検討するために、ＳＰＬの用量依存性有糸分裂停止を解析した。
　実施例２と同様に、ＳＰＬ-Ａ及びＳＰＬ-Ｂを濃度を変えて添加したＥＧＦＰ－α－チューブリンを発現するＳＫＯＶ-３細胞を、２回のチミジンブロックによって同調し、単一細胞に基づく分析を微速度撮影によって行った。有糸分裂時間は少なくとも５０細胞の画像シークエンスから測定された。
　図３の濃度は終濃度を示している。ＳＰＬ－Ａは２．６６７μｇ／ｍｌで有糸分裂停止が誘導されたのに対し、ＳＰＬ－Ｂは０．１０７μｇ／ｍｌで有糸分裂停止が誘導された。ＳＰＬ－ＡよりＳＰＬ－Ｂが有糸分裂停止に対して高活性であった。この結果は、表２で示した有糸分裂停止、細胞死解析の結果とも一致している。
　ＳＰＬ-Ａ及びＳＰＬ-Ｂ処理による細胞運命分析
　図３で示すように、ＳＰＬ－Ａ及びＳＰＬ－Ｂによって、濃度依存的に有糸分裂停止が誘導される。そこで、有糸分裂停止が細胞周期のどの時点で誘導されているかを解析した。
　（１）微速度撮影による細胞運命決定
　用いた細胞は、ＥＧＦＰ－αチューブリンを発現するＳＫＯＶ－３細胞と、ＯＶＣＡＲ-３細胞である。
　ＥＧＦＰ－αチューブリンを発現するＯＶＣＡＲ-３細胞は、ＥＧＦＰ－αチューブリンを発現するＳＫＯＶ-３細胞と同様の方法を用いて得られた。実施例２と同様に、ＳＰＬ-Ａ及びＳＰＬ-Ｂを添加した細胞を、２回のチミジンブロックによって同調し、微速度撮影により画像を取得し、解析を行った。各細胞ともＳＰＬ－Ａは１３．３μｇ/ｍｌ、ＳＰＬ－Ｂは２．７μｇ/ｍｌで処理している。細胞運命は、核膜崩壊時点を０とし、少なくとも５０細胞の画像シークエンスから手動で決定した。
　（２）結果
　図４に解析結果を示す。ＳＫＯＶ－３とＯＶＣＡＲ－３はどちらも有糸分裂を停止し、細胞増殖が抑制されるが、細胞周期における停止時期は異なる。
　ＳＫＯＶ－３では、ＳＰＬ－Ａ処理により、ほとんどの細胞が有糸分裂遅延（mitotic slippage）を示す。有糸分裂遅延は、細胞分裂期での細胞周期の停止が持続したことにより起こる。一部の細胞は有糸分裂遅延後の中間期の細胞死（death in interphase）及び有糸分裂中の細胞死（mitotic death）を起こしていた。また、ＳＰＬ－Ｂ処理によっては、ほとんどの細胞が有糸分裂遅延を示し、一部で有糸分裂中の細胞死が認められた。
　一方、ＯＶＣＡＲ-３は、ＳＰＬ－Ａ処理により、ほとんどの細胞が有糸分裂中の細胞死を示し、一部で有糸分裂遅延後の中間期の細胞死、及び有糸分裂遅延が認められた。また、ＳＰＬ－Ｂ処理により、ほとんどが有糸分裂中の細胞死を示し、一部細胞で有糸分裂遅延が認められた。延長した有糸分裂停止後に、両化合物はＳＫＯＶ－３において有糸分裂停止を誘導またはＯＶＣＡＲ－３は有糸分裂中の細胞死を誘導した。
　この結果は、ＳＫＯＶ－３及びＯＶＣＡＲ－３に、ｓｈＲＮＡを用いて、ＴＡＣＣ３の発現を抑制し、細胞運命を決定した実験結果と一致している。すなわち、ｓｈＲＮＡを用いてＴＡＣＣ３発現を抑制すると、ＳＫＯＶ－３では、細胞分裂期での細胞周期の停止が持続したことにより起こる有糸分裂遅延が、ＯＶＣＡＲ－３では有糸分裂中の細胞死が誘導される。
　ｓｈＲＮＡを用いた、ＴＡＣＣ３の発現抑制の実験結果とＳＰＬ-Ａ、ＳＰＬ－Ｂを用いた解析結果とが非常に良く一致していることから、ＳＰＬはＴＡＣＣ３を標的としていることが示唆される。
　ＳＰＬ化合物の濃度による細胞分裂異常の変化
　上記結果から、ＳＰＬ－Ａ、ＳＰＬ－Ｂは、同一の細胞であれば、細胞周期に対して、同様の効果を示すものと認められる。そこで、ＳＰＬ－Ａを濃度依存的に添加し、異常な形態の紡錘体を含む細胞の解析をＳＫＯＶ－３細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞を用いて行った。
（１）ＳＰＬ-Ａで処理した細胞の紡錘体の異常形態の解析
　ＳＫＯＶ－３またはＯＶＣＡＲ－３細胞は、各濃度でＳＰＬ－Ａを加え、２４時間後に固定し、以下に記載するα－チューブリン等、細胞分裂に関連する抗体を使用して免疫染色した。紡錘体形態の割合は、少なくとも５０個の細胞から決定した。データは３回の独立実験の平均とＳＤで示した。
　免疫染色は、以下の方法で行った。チャンバースライド上で細胞を３．７％ＰＦＡ、メタノールまたは１０％ＴＣＡ中で固定し、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００中で透過処理し、一次抗体とともにインキュベートした。α－チューブリンに対するモノクロナール抗体（ＤＭ１Ａ）及びγ－チューブリンに対するモノクロナール抗体（ＤＱ１９及びＧＴＵ－８８）をＳｉｇｍａから入手した。抗セントリン２（ｓｃ－２７７９３）はＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚから購入した。蛍光標識結合山羊抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ）及びＣｙ３結合山羊抗ウサギＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を二次抗体として使用した。ＤＮＡを４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して検出した。画像は×１００／１．４０－０．７０　ＰｌａｎＡｐｏ対物レンズ及びＺ－ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓを装備したＬｅｉｃａ　ＤＭ６０００Ｂ顕微鏡を使用して取得した。
（２）結果
　図５は紡錘体形態の解析結果を示す。紡錘体形態の割合は、有糸分裂細胞数中の正常（normal）、多極(multipolar)、無秩序(disorganized)、単極(monopolar)紡錘体の百分率（％）で示す。濃度は終濃度を示す。各濃度において、左から、正常（normal）、多極(multipolar)、無秩序(disorganized)、単極(monopolar)を示す。正常（normal）は、紡錘体が双極を有し整列している状態（normal）を意味し、無秩序（disorganized）、多極（multipolar）または単極（monopolar）は、異常な紡錘体であることを指す。
　ＳＰＬ－Ａは両細胞で多極紡錘体を誘導した。１．２５μｇ/ｍｌで、ＳＫＯＶ－３の５３．３％、ＯＶＣＡＲ－３の４４．０％が多極紡錘体を有し正常紡錘体の割合は激減する。
　また、ＳＰＬ－Ａは高濃度で様々な異常紡錘体を誘導した。ＳＫＯＶ－３では、５μｇ/ｍｌで５６．７％が無秩序紡錘体を生じ、最も割合が高かった。ＯＶＣＡＲ－３では、２．５μｇ/ｍｌで５７．３％が無秩序紡錘体を生じ、最も割合が高かった。無秩序紡錘体の割合はＳＰＬ－Ａ濃度が高くなると減少し、多極紡錘体が増加した。単極紡錘体はＳＰＬ－Ａの高用量により増加した。
　ここでは示さないが、γ－チューブリンは各紡錘体の極に局在し、一方、セントリン２はそれらの２つだけで検出された。さらに微速度撮影画像分析によって、ＳＰＬ－Ａが中心体微小管の核生成を選択的に阻害するが、動原体微小管は核生成し重合するため、結果として異所性紡錘体極、多極紡錘体を形成することが明らかとなった。
　ＳＰＬ－Ａが中心体微小管の核生成を選択的に混乱させて多極紡錘体を誘導するという結果は、ｓｈＲＮＡを用いてＴＡＣＣ３発現を抑制したＴＡＣＣ３枯渇の表現系を再現するものである。また、ＯＶＣＡＲ－３は、ＳＰＬ－Ａ処理にＳＫＯＶ－３より高感受性であった。これは、ＴＯＧｐ枯渇がＳＫＯＶ－３よりＯＶＣＡＲ－３により深刻な紡錘体不具合を誘導するというこれまでの観察と一致する。
　ＳＰＬ処理は、ＴＡＣＣ３枯渇またはＴＯＧｐ枯渇により誘導される紡錘体の表現系を再現している。これは、ＳＰＬ－ＡがＴＡＣＣ３－ＴＯＧｐ経路を阻害して紡錘体微小管を不安定化することを示唆する。
　ＴＡＣＣ３－ＴＯＧｐ複合体とＳＰＬの相互作用
　上述のように、ＳＰＬ処理によって、ｓｈＲＮＡを用いてＴＡＣＣ３発現を抑制、あるいはＴＯＧｐ発現を抑制した場合に類似した結果が得られていることは、ＳＰＬがＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を介して、紡錘体微小管に作用することを示唆している。そこで、ＳＰＬが直接ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体と相互作用する可能性が推測される。そこで、当該複合体が直接ＳＰＬに結合するか解析を行った。
（１）ＳＰＬのＴＡＣＣ３及びＴＯＧｐへの結合
　アガロースビーズに固定したＳＰＬを調製した。ＳＫＯＶ-３の細胞溶解物を結合バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、５０ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ及びプロテアーゼインヒビター混合物（ロッシュ社製））中でソニケーションにより調製した。不溶物を遠心により除去後、上清（５００μｇタンパク質）を３０μｌのビーズと３時間、４℃でインキュベーションした。反応後のビーズを０．０２５％ＮＰ４０含有結合バッファーで４回洗浄した。ビーズに結合したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーで溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離後、ニトロセルロースに転写した。ブロットを一次抗体とともにインキュベートし、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体とともにインキュベートし、そしてＥＣＬ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して可視化した。ＴＡＣＣ３またはＴＯＧｐに対する抗体、及びコントロールとしてＧＡＤＰＨに対する抗体を用いた。
　ヒトＴＡＣＣ３に対する抗体は、ヒトＴＡＣＣ３のアミノ酸２１３～２２４に対応するペプチドでウサギを免疫することによって生成した。ウサギ抗ＴＯＧｐ抗体は、ヒトＴＯＧｐのＣ末端１１１アミノ酸と融合したＧＳＴタンパク質に対して生成した。そして、これらをペプチド結合免疫親和性カラムを使用して精製し用いた。抗ＧＡＤＰＨ抗体（ｓｃ－２５７７８）はＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚから購入した。 
（２）結果
　図６中、ＳＰＬ－Ａビーズ、ＳＰＬ－Ｂビーズ及びコントロールビーズは、ＳＰＬ－Ａ固定化アガロースビーズ、ＳＰＬ－Ｂ固定化アガロースビーズ及び固定化していないアガロースビーズを指す。
　ＴＡＣＣ３、ＴＯＧｐ及びＧＡＰＤＨは、抗ＴＡＣＣ３抗体、抗ＴＯＧｐ抗体及び抗ＧＡＰＤＨ抗体処理を示す。
　図６に示すとおり、ＳＰＬとＴＡＣＣ３との特異的結合が認められた。ＴＡＣＣ３のシグナル強度はＳＰＬ－ＡよりＳＰＬ－Ｂにおいて強かった。これは、ＳＰＬ－Ｂが細胞増殖抑制試験等において高活性であることと一致する。また、共沈殿物を、抗ＴＯＧｐタンパク質抗体によるイムノブロットで検出した。ＳＰＬビーズではＴＯＧｐが検出され、ＴＡＣＣ３－ＴＯＧｐ複合体とＳＰＬの相互作用が示された。
　したがって、ＳＰＬはＴＡＣＣ３－ＴＯＧｐ複合体との直接的な結合を介して、微小管の紡錘体形成を阻害し、紡錘体の形態異常、細胞分裂の抑制を誘導していることが示された。この結果は、ＳＰＬがＴＡＣＣ３を標的とするだけではなく、ＴＯＧｐも標的とすることを示している。ここでは、ＳＰＬのみの結果を示しているが、式（Ｉ）の共通構造を有する化合物は同様の作用機序で細胞増殖抑制を誘導しているものと推認される。
　インビボにおけるＳＰＬ－Ｂの抗腫瘍効果
　次に、ＳＰＬが抗癌剤として、作用することをインビボの実験系を用いて示す。
　（１）方法
　すべての動物と方法は、癌研究会動物委員会（ＪＦＣＲ、日本）によって承諾された。ゼノグラフト腫瘍モデルのために、１×１０７細胞の卵巣癌細胞ＳＫＯＶ－３細胞を９匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本チャールズリバー）の両脇腹に皮下注射した。腫瘍容積が約２００ｍｍ３に到達したとき、ＤＭＳＯに溶解したＳＰＬ－Ｂ、５０μｌをマウスに２日おきに経口投与し、腫瘍容積を２日ごとに測定した。コントロールとして、ＤＭＳＯを同じ方法で投与した。各群２～３匹のマウスを用いて解析を行った。なお、腫瘍容積は、腫瘍の長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）をノギスで測定し、腫瘍量（ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅ＝Ｌ×Ｗ×Ｗ／２）を算出した。
　処理の１３日後、マウスを解剖し組織を集め、１０％緩衝ホルマリン（和光純薬株式会社）中で終夜固定し、パラフィン包埋し、１、４または６μｍ切片を作製した。切片を、抗ｐ５３抗体、抗ｐ２１抗体、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体、抗ＰＣＮＡ抗体で免疫染色した。２つの切片中の任意に選択した少なくとも１０領域中の陽性細胞の割合を計測した。データは平均及びＳＤで示した。
　（２）結果
　ＳＰＬ－Ｂ投与開始日を１日目とする。ＳＰＬ－Ｂ投与開始日における腫瘍容積を１とする。
　図７に示すとおり、ＳＰＬ－Ｂは、インビボで用量依存的に腫瘍増殖を抑制した。
　また、ＳＰＬ－Ｂを２０ｍｇ／ｋｇで経口投与、あるいは腹腔内投与を行い、６時間後の血清中の濃度を測定した。その結果、経口投与の場合は、血清中のＳＰＬ-Ｂ濃度は、２７０ｎｇ／ｍｌであるのに対し、腹腔内投与の場合は９０ｎｇ／ｍｌであった。このようにＳＰＬ－Ｂは、経口投与の方が、血中のＳＰＬ-Ｂ濃度が高く、治療を行う上で様々な臨床応用の可能性を有する。
　図８に示すとおり、ＳＰＬ－Ｂ処理は、細胞死を誘導するｐ５３、ｐ２１及びＫ９トリメチルヒストンＨ３（ＨＳＫ９ｍｅ３）の発現を増強し、細胞増殖を誘導するＰＣＮＡ発現を抑制している。この結果は、ＳＰＬ－Ｂの抗癌作用はｐ５３-ｐ２１経路を活性化することに起因していることを示している。
　種々の細胞株に対するＳＰＬ－Ｂの効果
　ＳＰＬがＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を介して紡錘体形成、及び分裂装置制御に作用するのであれば、広範な癌種において細胞増殖抑制効果を有するものと考えられる。そこで、種々の癌細胞株を用いてＳＰＬの効果を測定した。
（１）方法
　ＳＰＬ－Ｂをヒト癌細胞株パネル（非特許文献１４）の細胞株に作用させ、ＳＰＬの細胞分裂に対する効果について解析を行った。
　細胞を０．５μｇ/ｍｌ濃度のＳＰＬ－Ｂで２４時間処理し、ヨウ化プロジウム（ＰＩ）染色を行い、フローサイトメトリーによって解析した。図９はＳＰＬ－Ｂ処理によるＧ２／Ｍ期の細胞の変化の割合を示している。
（２）結果
　解析に用いた３９種の細胞株中、半数以上である２１細胞株でＧ２/Ｍ期の細胞の割合が増加しており、ＳＰＬが細胞分裂を停止させる効果を有することが認められた。特に卵巣癌由来の細胞株ＳＫＯＶ－３、ＯＶＣＡＲ－３、大腸癌由来の細胞株ＨＣＴ１５、ＫＭ１２、神経膠腫由来の細胞株ＳＮＢ－７５、ＳＮＢ－７８、前立腺癌由来の細胞株ＰＣ-３、ＤＵ１４５、腎癌由来の細胞株ＡＣＨＮ、メラノーマ由来の細胞株ＬＯＸ-ＩＭＶＩでは、Ｇ２/Ｍ期の細胞が顕著に増加しており、ＳＰＬによる細胞分裂停止効果が高いことを示している。
　ＳＰＬの癌細胞に対する選択的増殖抑制効果
　次に、ＳＰＬが他の分裂毒やキナーゼ阻害剤とは異なり、癌細胞の増殖抑制には効果を有するが、正常細胞では増殖抑制を起こさないことを示す。
（１）方法
　（Ａ）癌細胞株であるＳＫＯＶ－３、ＯＶＣＡＲ-３の２種の細胞株と、正常細胞株であるｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ、ＭＣＦ１０Ａ、１８４Ｂ５の３種の細胞株に図１０（Ａ）横軸に示した濃度で２４時間ＳＰＬ－Ａ処理し、ヨウ化プロジウム（ＰＩ）染色を行い、フローサイトメトリーによって解析した。図１０（Ａ）はＳＰＬ－Ｂ処理によるＧ２／Ｍ期の細胞の変化の割合を示している。
　（Ｂ）紡錘体の微小管に作用して、腫瘍の増殖阻害を引き起こすことが知られている薬剤の効果を解析した。
　（Ａ）と同様に２種の癌細胞株と３種の正常細胞株を、微小管形成に作用を有する、パクリタキセル（paclitaxel）、ビンクリスチン（vincristine）、ビンブラスチン（vinvlastine）、有糸分裂に関与するタンパク質に作用するＳ－トリチル－Ｌ－システイン（ＳＴＬＣ）、ＳＢ７４３９２１、オーロラキナーゼ阻害剤であるＶＸ６８０、ポロ様キナーゼ（ＰＬＫ）阻害剤であるＢＩ２５３６で、図１０（Ｂ）の横軸に示した濃度で２４時間処理し、ヨウ化プロジウム（ＰＩ）染色を行い、フローサイトメトリーによって解析した。図１０（Ｂ）は各薬剤処理によるＧ２／Ｍ期の細胞の変化の割合を示している。
（２）結果
　図１０（Ａ）に示すように、ＳＰＬ-Ａは２種の癌細胞株では濃度依存的にＧ２／Ｍ期の細胞の割合が増加しており、細胞分裂を停止させる効果を有するが、正常細胞株では３種とも高濃度でＳＰＬを作用させても、分裂阻害を生じない。したがって、ＳＰＬ-Ａは、癌細胞に選択的に作用することが示された。
　これに対し、微小管の重合／脱重合や、それに伴う紡錘体形成に作用することが知られている他の化合物は、いずれの薬剤も濃度依存的にすべての細胞株に対して、分裂阻害を引き起こしており、ＳＰＬのように腫瘍細胞に対する選択的な効果はない（図１０（Ｂ）)。
　したがって、癌細胞に対しては分裂阻害を起こすが、正常細胞には作用しないという効果はＳＰＬ特有のものであり、他の分裂毒やキナーゼ阻害剤等はこのような性質を持たないことが示された。すなわち、本願発明の化合物は、癌細胞に特異的に作用し、正常細胞には作用しないことから、抗癌剤として用いた場合にも重篤な副作用を起こさない可能性が高い。
　ＳＰＬと他の抗癌剤との併用による効果
　次に公知の抗癌剤と併用したときの効果について検討を行った。本発明の化合物を他の薬剤と併用したときに増強効果があれば、各薬剤の用量を減らすことができ、副作用を減じることが可能となる。
　ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ－１１６のｐ５３ノックアウト細胞に、パクリタキセルとＳＰＬ－Ｂとを併用投与して培養し、３日後に細胞の生存率をＷＳＴアッセイにより測定した。結果を図１１に示す。
　図１１（Ａ）に、０、１５０、３００μＭの濃度のＳＰＬ-Ｂと、パクリタキセルを０～３２ｎＭの濃度範囲で併用して添加し、ＨＣＴ－１１６ｐ５３ノックアウト細胞を培養し、細胞増殖をＷＳＴアッセイにより測定した結果を示す。パクリタキセルのＩＣ50は、ＳＰＬ-Ｂを添加しない場合には、８．３３９ｎＭ、１５０μＭ添加した場合には７．６９７ｎＭ、３００μＭ添加した場合には７．５３７ｎＭであった。
　図１１（Ｂ）に示すように、ＳＰＬ-Ｂを３００μＭ培地に添加しても、単独では細胞増殖に対してほとんど効果がないが、パクリタキセルと併用することにより、細胞増殖抑制効果を増強することができる。パクリタキセルは微小管の脱重合阻害剤であり、ＳＰＬ-Ｂ同様、細胞分裂を阻害するものではあるが、作用機作が異なることから増強効果があるものと考えられる。　以上示してきたように、本発明の化合物は経口投与可能であり、また、微小管自体ではなく、ＴＡＣＣ３、ＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を介して、紡錘体に作用する。したがって、本発明の化合物は、現在用いられている微小管を標的とする抗癌剤であるビンカアルカロイドのように、非分裂細胞においても微小管機能を阻害することがない。したがって、末梢神経障害のような重篤な副作用を生じる心配がない。　
　本発明により、ＴＡＣＣ３タンパク質を標的とした、新たな抗癌剤が提供される。本発明の化合物は、経口投与で個体に作用し、また、低濃度で紡錘体の機能を阻害することから、副作用の少ない抗癌剤として用い得る。

Claims (15)

  1. 　一般式（Ｉ）で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体を有効成分として含有することを特徴とする抗癌剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     OAc、NEt2、NMe(CH2CH2OH)、NH(CH2CH2NMe2)、NEt(CH2CH2NMe2)、N(CH2CH2OMe)2、N+O-(CH2CH2OMe)2、NMe(CH2)3Me、又はN(CH2CH2Me)2、Ｒ２は、Ac又はＨ、Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、又はＢｒを表す。）
  2. 　請求項１記載の抗癌剤であって、
    　一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の式、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体を有効成分として含有することを特徴とする抗癌剤。
  3. 　請求項１又は２記載の抗癌剤であって、
    　対象となる癌がＴＡＣＣ３を発現する癌であることを特徴とする抗癌剤。
  4. 　請求項３記載の抗癌剤であって、
    　対象となる前記ＴＡＣＣ３を発現する癌が大腸癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、食道癌、リンパ腫、神経膠腫、前立腺癌、腎癌、メラノーマであることを特徴とする抗癌剤。
  5. 　ＴＡＣＣ３及び／又はＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を標的とする癌の治療に用いるための一般式（Ｉ）で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     OAc、NEt2、NMe(CH2CH2OH)、NH(CH2CH2NMe2)、NEt(CH2CH2NMe2)、N(CH2CH2OMe)2、N+O-(CH2CH2OMe)2、NMe(CH2)3Me、又はN(CH2CH2Me)2、Ｒ２は、Ac又はＨ、Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、又はＢｒを表す。）
  6. 　請求項５記載のＴＡＣＣ３及び／又はＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を標的とする癌の治療に用いるための化合物が、
    　以下の式、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    で表されることを特徴とする化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体。
  7. 　請求項５又は６記載のＴＡＣＣ３及び／又はＴＡＣＣ３-ＴＯＧｐ複合体を標的とする癌の治療に用いるための化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体であって、
    　前記ＴＡＣＣ３を標的とする癌が、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、食道癌、リンパ腫、神経膠腫、前立腺癌、腎癌、メラノーマであることを特徴とする化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体。
  8. 　一般式（Ｉ）で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体を有効成分とし、
    　薬学的に許容し得る賦形剤を含有することを特徴とする抗癌剤組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     OAc、NEt2、NMe(CH2CH2OH)、NH(CH2CH2NMe2)、NEt(CH2CH2NMe2)、N(CH2CH2OMe)2、はN+O-(CH2CH2OMe)2、NMe(CH2)3Me、又はN(CH2CH2Me)2、Ｒ２は、Ac又はＨ、Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、又はＢｒを表す。）
  9. 　請求項８記載の抗癌剤組成物であって、
    　前記一般式（Ｉ）で表される化合物が、以下の式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    で表される化合物であって、
    　該化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体化合物を有効成分とし、
    　薬学的に許容し得る賦形剤を含有することを特徴とする抗癌剤組成物。
  10. 　請求項８又は９に記載の抗癌剤組成物が、
    　ＴＡＣＣ３を発現する癌を対象とすることを特徴とする抗癌剤組成物。
  11. 　請求項１０に記載の抗癌剤組成物において、
    　対象となる前記ＴＡＣＣ３を発現する癌が大腸癌、卵巣癌、子宮癌、乳癌、食道癌、リンパ腫、神経膠腫、前立腺癌、腎癌、メラノーマであることを特徴とする抗癌剤組成物。
  12. 　請求項８記載の抗癌剤組成物が、
    　経口投与のための組成物であることを特徴とする抗癌剤組成物。
  13. 　請求項５又は６記載の化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体と、
    　薬学的に許容されうる賦形剤を混合することを含む抗癌剤組成物の製造方法。
  14. 　一般式（Ｉ）で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     OAc、NEt2、NMe(CH2CH2OH)、NH(CH2CH2NMe2)、NEt(CH2CH2NMe2)、N(CH2CH2OMe)2、又はN+O-(CH2CH2OMe)2
    Ｒ２は、Ac又はＨ、Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、又はＢｒを表し、次式（II）～（Ｖ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
      （II）　　
    で表される化合物を除く。）
  15. 　請求項１４記載の化合物であって、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    で表される化合物、薬学的に許容されうるその塩、溶媒和物またはそのエステル誘導体。
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