WO2013147213A1 - ＣＤＲ改変抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体 - Google Patents

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由晴 昼間
貴子 木村
洋成 清水
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Definitions

  • the present invention relates to a substance useful as a therapeutic and / or preventive agent for abnormal bone metabolism and a method for treating and / or preventing abnormal bone metabolism.
  • Bone is known as a dynamic organ that reconstructs by constantly repeating formation and resorption in order to maintain its own morphological changes and blood calcium concentration.
  • bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts are in an equilibrium relationship, and the bone mass is kept constant.
  • bone metabolism abnormalities such as osteoporosis occur (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Document 1 and 3 A number of systemic hormones and local cytokines have been reported as factors that regulate bone metabolism, and the formation and maintenance of bone is carried out by the joint action of these factors (for example, Non-Patent Document 1 and 3).
  • the development of osteoporosis is widely known as a change in bone tissue due to aging, but the mechanism of its onset is decreased secretion of sex hormones and receptor abnormalities, fluctuations in cytokine expression in bone, aging gene expression, osteoclast It is difficult to understand as a simple physiological phenomenon due to aging due to a variety of cells and osteoblast differentiation and dysfunction.
  • Primary osteoporosis is roughly classified into postmenopausal osteoporosis due to decreased estrogen secretion and senile osteoporosis due to aging. In order to elucidate the onset mechanism and develop therapeutic agents, the regulation mechanism of bone resorption and bone formation Progress in basic research is essential.
  • Osteoclasts are multinucleated cells derived from hematopoietic stem cells that release the chloride and hydrogen ions on the bone-adherent surface, thereby acidifying the gap between the cell-bone adhesive surface and being an acidic protease.
  • Cathepsin K etc. are secreted (for example, refer nonpatent literature 4).
  • decomposition of calcium phosphate, activation of acidic protease and decomposition of bone matrix protein are caused, and bone resorption proceeds.
  • osteoclast progenitor cells differentiate into osteoclasts upon stimulation with RANKL (Receptor activator of NF- ⁇ B ligand) expressed on the cell membrane of osteoblasts / stromal cells on the bone surface.
  • RANKL Receptor activator of NF- ⁇ B ligand
  • RANKL is a membrane protein produced by osteoblasts / stromal cells, its expression is regulated by bone resorption factors, and RANKL induces differentiation from osteoclast precursor cells to mature multinucleated osteoclasts, etc.
  • mice knocked out of RANKL develop a pathological condition like marble bone disease, and it was proved that RANKL is a physiological osteoclast differentiation inducing factor (see, for example, Non-Patent Document 8). reference).
  • bisphosphonates As pharmaceuticals for treating bone metabolic diseases and shortening the treatment period, bisphosphonates, active vitamin D 3 , calcitonin and derivatives thereof, hormones such as estradiol, SERMs (Selective estogen receptor modulators), ipriflavone, vitamin K 2 (menatetrenone), PTH and calcium preparations are used.
  • hormones such as estradiol, SERMs (Selective estogen receptor modulators), ipriflavone, vitamin K 2 (menatetrenone), PTH and calcium preparations.
  • Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins, hereinafter referred to as “Siglecs”) are a family of type I membrane proteins that recognize and bind sialic acid-containing sugar chains.
  • Siglecs are abundantly expressed on the cell membrane of immune system cells, and also recognize sialic acid present on the cell membrane of immune system cells and regulate cell-cell interactions and cell functions, and are involved in immune responses There are many Siglecs molecules that have been considered (see, for example, Non-Patent Document 9), but whose physiological functions are not clear.
  • Siglec-15 Sialic-acid binding immunoglobulin-like electin 15
  • CD33L3 CD33 molecule-like 3 Is the same.
  • Patent Document 1 discloses an antibody that suppresses osteoclast differentiation, but the search for an antibody that exhibits a more potent action is continued.
  • An object of the present invention is to provide a gene that is specifically expressed in various bone metabolism abnormalities found in osteoporosis, rheumatoid arthritis, cancer bone metastasis, and the like, a substance that inhibits differentiation and maturation and activity of osteoclasts, and bone metabolism
  • the object is to provide an agent for the treatment and / or prevention of abnormalities.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the heavy chain sequence includes a variable region having CDRH1, CDRH2, and CDRH3, the CDRH1 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the CDRH2 is composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and the CDRH3 Consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11; and the light chain sequence comprises a variable region having CDRL1, CDRL2, CDRL3, said CDRL1 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and said CDRL2 is SEQ ID NO: 13 consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 13, wherein the CDRL3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; Or an antigen-binding fragment of the antibody.
  • a heavy chain variable region sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain variable consisting of amino acid residues 21 to 133 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 The antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to (1), comprising a region sequence.
  • It consists of a heavy chain sequence consisting of amino acid residues 20 to 466 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain sequence consisting of amino acid residues 21 to 238 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to (1) (4) It consists of a heavy chain sequence consisting of amino acid residues 20 to 465 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and a light chain sequence consisting of amino acid residues 21 to 238 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to (1) (5)
  • the antigen-binding fragment of the antibody according to (1) or (2) which is selected from the group consisting of Fab, F (ab ′) 2, Fab ′ and Fv. (6)
  • the antibody according to (1) or (2), which is scFv. (7) A pharmaceutical composition comprising at least one of the antibody or antigen-binding fragment of the antibody according to (1) to (6).
  • the pharmaceutical composition according to (7) which is a therapeutic and / or preventive agent for abnormal bone metabolism.
  • Bone metabolism abnormality is caused by osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, cancerous hypercalcemia, bone destruction associated with multiple myeloma or cancer bone metastasis, giant cell tumor, osteopenia, periodontitis (8) or (9) selected from the group consisting of tooth loss, osteolysis around an artificial joint, bone destruction in chronic osteomyelitis, Paget's disease of bone, renal osteodystrophy, and osteogenesis imperfecta
  • the pharmaceutical composition according to (10), wherein the bone metabolism abnormality is osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, or bone destruction associated with cancer bone metastasis.
  • the osteoporosis is postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, secondary osteoporosis due to the use of therapeutic agents such as steroids and immunosuppressive agents, or osteoporosis associated with rheumatoid arthritis (12) Pharmaceutical composition.
  • At least one of the antibody described in (1) to (6), the antigen-binding fragment of the antibody, or the pharmaceutical composition described in (8) or (9) is administered. A method for treating and / or preventing abnormal bone metabolism.
  • hormones such as
  • a method for treating and / or preventing abnormal bone metabolism (16) The treatment and / or prevention method according to (14) or (15), wherein the bone metabolism abnormality is osteoporosis, bone destruction accompanying rheumatoid arthritis, or bone destruction accompanying bone metastasis of cancer. (17) The treatment and / or prevention method according to (16), wherein the bone metabolism abnormality is osteoporosis. (18) The osteoporosis is postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, secondary osteoporosis due to the use of a therapeutic agent such as a steroid or an immunosuppressant, or osteoporosis associated with rheumatoid arthritis (17) Treatment and / or prevention methods.
  • the polynucleotide according to (19) comprising: (21) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence comprising nucleotides 58 to 1398 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a polynucleotide comprising a nucleotide sequence comprising nucleotides 61 to 714 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a transformed host cell comprising any one of the polynucleotides according to (19) to (21).
  • a transformed host cell comprising the vector according to (22).
  • the method for producing an antibody according to any one of (1) to (6), comprising culturing the host cell according to (23) or (24) and purifying the antibody from the culture product.
  • a therapeutic and / or prophylactic agent for abnormal bone metabolism which has an action mechanism of osteoclast differentiation and maturation and inhibition of bone resorption activity.
  • FIG. 3 shows the amino acid sequences of CDRs of # 32A1 antibody and K3-1115 / T103E antibody.
  • the term “gene” includes not only DNA but also mRNA, cDNA, and cRNA.
  • polynucleotide is used in the same meaning as a nucleic acid, and includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers.
  • polypeptide and “protein” are used without distinction.
  • RNA fraction refers to a fraction containing RNA.
  • cell includes cells in an individual animal and cultured cells.
  • Siglec-15 is used in the same meaning as Siglec-15 protein.
  • osteoclast formation is used in the same meaning as “osteoclast differentiation” or “osteoclast maturation”.
  • antigen-binding fragment of an antibody is also referred to as “functional fragment of an antibody” and means a partial fragment of an antibody having binding activity to an antigen.
  • Fab ' which is a monovalent fragment of the variable region of an antibody obtained by treating F (ab') 2 under reducing conditions, is also included in the antigen-binding fragment of an antibody.
  • the molecule is not limited to these molecules as long as it has the ability to bind to an antigen.
  • These antigen-binding fragments include not only those obtained by treating full-length antibody protein molecules with appropriate enzymes, but also proteins produced in appropriate host cells using genetically engineered antibody genes. It is.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the complementarity-determining region is also called a hypervariable domain, and is located in the variable region of the heavy and light chains of the antibody and has a particularly high primary structure variability.
  • the polypeptide chains are separated at three locations on the primary structure of the polypeptide chain.
  • the complementarity determining region of an antibody is expressed as CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence, and the complementarity determining region of the light chain is lightly expressed.
  • CDRL1, CDRL2, and CDRL3 are represented from the amino terminal side of the chain amino acid sequence. These sites are close to each other on the three-dimensional structure and determine the specificity for the antigen to be bound.
  • hybridize under stringent conditions means to hybridize at 68 ° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech) or use a filter on which DNA is fixed. After hybridization at 68 ° C in the presence of 0.7-1.0 M NaCl, 0.1-2 fold SSC solution (1 fold SSC consists of 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate) ) And hybridization under conditions that can be identified by washing at 68 ° C. or equivalent conditions.
  • Siglec-15 The inventors have found that the Siglec-15 gene is specifically expressed in giant cell tumors. The present inventors have also found that the expression level of the Siglec-15 gene increases when the monocyte-derived cell line differentiates into osteoclasts.
  • Siglec-15 used in the present invention is directly purified from human, non-human mammals (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) or chicken monocyte cells or bone marrow cells. It can be used, or it can be used by preparing a cell membrane fraction of the above-mentioned cells, or by synthesizing Siglec-15 in vitro or producing it in a host cell by genetic manipulation. .
  • Siglec-15 cDNA is incorporated into an expressible vector and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic organisms, or The protein can be obtained by expressing Siglec-15 by transforming a eukaryotic host cell.
  • Siglec-15 The nucleotide sequence of human Siglec-15 cDNA is registered in GenBank with accession number: NM_213602.
  • the nucleotide sequence of mouse Siglec-15 cDNA is registered with GenBank under the accession number: XM — 844636.
  • Siglec-15 is sometimes called CD33 antigen-like 3, CD33 molecular-like 3, CD33-like 3, or CD33L3, and these all indicate the same molecule.
  • the Siglec-15 cDNA is, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using a cDNA library expressing the Siglec-15 cDNA as a template and a primer that specifically amplifies the Siglec-15 cDNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence encoding human or mouse Sigle-15 under stringent conditions and encodes a protein having biological activity equivalent to that of Siglec-15.
  • Polynucleotides are also included in the Siglec-15 cDNA.
  • a splicing variant transcribed from the human or mouse Siglec-15 gene locus or a polynucleotide that hybridizes to this under stringent conditions, and that encodes a protein having a biological activity equivalent to Siglec-15 Nucleotides are also included in the Siglec-15 cDNA.
  • amino acid sequence of human or mouse Siglec-15 or an amino acid sequence obtained by subtracting, deleting, or adding one or several amino acids from the amino acid sequence obtained by removing the signal sequence from these sequences. Proteins having biological activity equivalent to ⁇ 15 are also included in Siglec-15. And an amino acid sequence encoded by a splicing variant transcribed from the human or mouse Siglec-15 gene locus, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added, and A protein having biological activity equivalent to that of Siglec-15 is also included in Siglec-15.
  • the Siglec-15 gene is a bone tumor in which many osteoclast-like multinucleated giant cells appear when the expression level of the gene in various bone tissue specimens is analyzed. Characterized by sexual bone destruction (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, pp 17.6-17.8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (c) 1994) It was found that the expression level increased.
  • Siglec-15 is considered to be involved in human pathological conditions such as GCT where bone resorption is enhanced. That is, by measuring the expression level in each cell and / or each tissue of the Siglec-15 gene and / or Siglec-15, the state of abnormal bone metabolism accompanied by overexpression of Siglec-15 can be determined.
  • abnormal bone metabolism is a disorder characterized by net bone loss.
  • osteoporosis postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, use of therapeutic drugs such as steroids and immunosuppressive agents
  • Secondary osteoporosis osteoporosis associated with rheumatoid arthritis
  • bone destruction associated with rheumatoid arthritis cancerous hypercalcemia
  • bone destruction associated with multiple myeloma and cancer bone metastasis giant cell tumor
  • osteopenia periodontal ligament
  • examples include, but are not limited to, tooth loss due to inflammation, osteolysis around artificial joints, bone destruction in chronic osteomyelitis, Paget's disease of bone, renal osteodystrophy, osteogenesis imperfecta and the like.
  • the “specimen” to be examined for the expression level of the Siglec-15 gene and / or Siglec-15 refers to bone marrow, bone, prostate, testis, penis, bladder, kidney obtained from a subject or clinical specimen.
  • a tissue such as a node, muscle, adipose tissue, blood, body fluid or excrement, but in the present invention, blood or bone marrow is more preferable.
  • RANKL which is known to be related to osteoclast differentiation
  • knockout mice have been prepared, and the phenotype when RANKL function is lost has been analyzed (Young-Yung Kong, et. Al., Nature (1999) 397, p. 315-323).
  • Siglec-15 By producing a knockout mouse for Siglec-15, it is possible to analyze the phenotype when the function of Siglec-15 is lost.
  • the antibody against Siglec-15 of the present invention is immunized in vivo using a conventional method to immunize animals with any polypeptide selected from the amino acid sequence of Siglec-15 or Siglec-15. It can be obtained by collecting and purifying the produced antibody.
  • the species of Sigle-15 used as an antigen is not limited to humans, and Siglec-15 derived from animals other than humans such as mice and rats can also be used to immunize animals.
  • an antibody applicable to a human disease can be selected by examining the cross-reactivity between the obtained antibody that binds to different types of Siglec-15 and human Siglec-15.
  • a hybridoma can be established by fusing an antibody-producing cell producing an antibody against Siglec-15 with a myeloma cell to obtain a monoclonal antibody.
  • Specific examples of such a method are described in International Publication No. WO 09/48072 pamphlet (published on April 16, 2009) and WO 10/117011 pamphlet (published on October 14, 2010).
  • Sigle-15 as an antigen can be obtained by producing a Siglec-15 gene in a host cell by genetic manipulation. Specifically, a vector capable of expressing the Siglec-15 gene is prepared, introduced into a host cell, the gene is expressed, and the expressed Siglec-15 is purified.
  • hybridoma strains established in this way include the hybridoma # 32A1 described in International Publication WO09 / 48072.
  • Hybridoma # 32A1 is dated August 28, 2008 at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (location: postal code 305-8565, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) The deposit number is FERM BP-10999 under the name of anti-Siglec-15 Hybridoma # 32A1.
  • an antibody produced by hybridoma # 32A1 is referred to as “# 32A1 antibody” or simply “# 32A1”.
  • a partial fragment containing the heavy chain variable region or the light chain variable region of the # 32A1 antibody is described in International Publication No. WO2010 / 11701.
  • a humanized antibody which is a recombinant antibody, can be prepared by artificially modifying the sequence of the monoclonal antibody against Siglec-15 for the purpose of reducing the heterologous antigenicity with respect to humans.
  • the antibody of the present invention includes an antibody obtained by modifying the CDR of the humanized antibody. These antibodies can be produced using known methods.
  • a humanized antibody an antibody in which only a complementarity determining region (CDR; complementarity determining region) is incorporated into a human-derived antibody (see Nature (1986) 321, p.522-525), a CDR sequence is obtained by CDR grafting.
  • CDR complementarity determining region
  • an antibody International Publication No. WO90 / 07861 in which amino acid residues of some frameworks are grafted to a human antibody can be mentioned.
  • Examples of a humanized antibody of rat antibody # 32A1 include a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO: 2, and 21st to 133rd of SEQ ID NO: 4. The combination of the light chain containing the light chain variable region which consists of an amino acid sequence which consists of an amino acid residue can be mentioned.
  • antibodies include a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 466 of SEQ ID NO: 2 and a light chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 238 of SEQ ID NO: 4. Mention may be made of antibodies. In the present specification, the antibody is referred to as “K3-1115” or “K3-1115 antibody”.
  • the heavy chain variable region of antibody # 32A1 consists of CDRH1 (DYFMN) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, CDRH2 (QIRNKIYTYATYAYASLEG) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or CDRH2 shown in SEQ ID NO: 9 ( One of QIRNKYYTYTFYA) and CDRH3 (SLTGGGDYFDY) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • CDRH2 shown in SEQ ID NO: 8 is based on the definition of Kabat (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL.I, FIFTH EDION (1991)).
  • CDRH2 shown in SEQ ID NO: 9 the C-terminus is shortened by 5 residues from the Kabat definition.
  • this heavy chain sequence containing CDRH2 since the CDR sequence derived from rat is reduced and more human framework sequences are incorporated, it is more difficult to be recognized as a heterologous antigen when administered to humans.
  • the light chain variable region of the # 32A1 antibody consists of CDRL1 (RASQSVTGISGFIH) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, CDRL2 (RASNLAS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and amino acids shown in SEQ ID NO: 14. It has CDRL3 (QQSRKSPWT) consisting of the sequence.
  • CDRL1 RASQSVTGISGFIH
  • RASNLAS RASNLAS
  • QQSRKSPWT amino acid sequences of the CDRs of SEQ ID NOs: 7 to 10 and 12 to 14 are also shown in FIG.
  • CDR variant of a humanized antibody derived from antibody # 32A1 is an antibody in which the third threonine residue of CDRH3 of SEQ ID NO: 10 is substituted with a glutamic acid residue.
  • Siglec-15 is a basic protein, and it is expected that by introducing acidic amino acid residues such as aspartic acid and glutamic acid into the antibody sequence, an ionic bond between the antigen and the antibody is formed and the binding ability is expected to be improved. .
  • CDRH3 (SLEGGGDYFDY) having the above-described substitution corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in the Sequence Listing.
  • the amino acid sequence of CDRH3 of SEQ ID NO: 11 is also shown in FIG.
  • a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 140 of SEQ ID NO: 6, and amino acids 21 to 133 of SEQ ID NO: 4
  • the combination of the light chain containing the light chain variable region which consists of an amino acid sequence which consists of a residue can be mentioned.
  • Further preferred antibodies include a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 466 of SEQ ID NO: 6 and a light chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 238 of SEQ ID NO: 4. Mention may be made of antibodies.
  • the antibody is referred to as “K3-1115 / T103E” or “K3-1115 / T103E antibody”.
  • the K3-1115 / T103E antibody heavy chain is a sequence obtained by substituting the glutamic acid residue for the 103rd threonine residue in the amino acid sequence obtained by removing the signal sequence from the K3-1115 heavy chain sequence shown in SEQ ID NO: 2. .
  • the CDR variant of humanized # 32A1 of the present invention is not limited to the above CDR variant as long as it retains the CDRH3 sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the CDRH2 sequence of the CDR variant of humanized # 32A1 of the present invention may be either CDRH2 shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the present invention includes antibodies having such modifications, including deletions in which one or two amino acids have been deleted at the heavy chain carboxyl terminus, and the amidated deletions (for example, at the carboxyl terminal site).
  • Heavy chain in which a proline residue is amidated is not limited to the above type.
  • the two heavy chains constituting the antibody according to the present invention may be either one of the full length and the heavy chain selected from the group consisting of the above-mentioned deletion forms, or a combination of any two of them. It may be a thing.
  • the amount ratio of each deletion can be influenced by the type and culture conditions of cultured mammalian cells producing the antibody according to the present invention, but the main component of the antibody according to the present invention is the carboxyl in both of the two heavy chains. A case where one terminal amino acid residue is deleted can be mentioned.
  • the antibody obtained by the above method can be evaluated for binding to the antigen by the method shown in Example 3 or the like, and a suitable antibody can be selected.
  • An example of another index for comparing antibody properties is antibody stability.
  • Differential scanning calorimetry (DSC) is a method that can quickly and accurately measure the thermal denaturation midpoint (Tm), which is an indicator of good relative structural stability of proteins.
  • Tm thermal denaturation midpoint
  • the difference in thermal stability can be compared by measuring the Tm value using DSC and comparing the values. It is known that the storage stability of an antibody shows a certain degree of correlation with the thermal stability of the antibody (Lori Burton, et. Al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), and heat.
  • a suitable antibody can be selected using stability as an index.
  • Other indicators for selecting antibodies include high yields in suitable host cells and low aggregation in aqueous solutions. For example, since the antibody with the highest yield does not necessarily exhibit the highest thermal stability, it is necessary to select the most suitable antibody for human administration based on a comprehensive judgment based on the above-mentioned indicators. .
  • the antibody of the present invention may be an antibody having a single heavy chain variable region and no light chain sequence.
  • Such an antibody is called a single domain antibody (sdAb) or nanobody, and is actually observed in a camel or llama and reported to retain antigen-binding ability.
  • sdAb single domain antibody
  • nanobody single domain antibody
  • the above antibody can also be interpreted as a kind of antigen-binding fragment of the antibody in the present invention.
  • WO99 / 54342, WO00 / 61739, WO02 / 31140, and the like are known as regulation techniques for antibody sugar chain modification, but are not limited thereto.
  • an antibody gene When an antibody gene is once isolated and then introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • Specific examples of the antibody gene include a combination of a gene encoding the heavy chain sequence of the antibody described in the present specification and a gene encoding the light chain sequence.
  • the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene When transforming a host cell, the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene can be inserted into the same expression vector, or can be inserted into separate expression vectors. is there.
  • eukaryotic cells When eukaryotic cells are used as hosts, animal cells, plant cells, and eukaryotic microorganisms can be used. Examples of animal cells include (1) mammalian cells such as COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.
  • ATCC CRL-1650 which are monkey cells, mouse fibroblasts NIH3T3 (ATCC). No. CRL-1658) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase-deficient strains (Urlauub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. U.). S. A. (1980) 77, p. 4126-4220).
  • Escherichia coli and Bacillus subtilis can be mentioned, for example.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. In the above culture method, the yield may vary depending on the sequence of the antibody. From the antibodies having equivalent binding activity, those that can be easily produced as pharmaceuticals can be selected using the yield as an index.
  • IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4
  • IgM IgA (IgA1, IgA2)
  • IgD or IgE preferably IgG or IgM
  • IgG1 or IgG2 More preferably, IgG1 or IgG2 can be mentioned.
  • the antibody of the present invention may be an antigen-binding fragment of an antibody having an antigen-binding portion of the antibody or a modified product thereof.
  • a fragment of the antibody can be obtained by treating the antibody with a proteolytic enzyme such as papain or pepsin, or modifying the antibody gene by a genetic engineering technique and expressing it in an appropriate cultured cell.
  • a fragment that retains all or part of the functions of the full-length antibody molecule can be referred to as an antigen-binding fragment of an antibody.
  • Antibody functions generally include antigen-binding activity, activity that neutralizes antigen activity, activity that enhances antigen activity, antibody-dependent cytotoxic activity, complement-dependent cytotoxic activity, and complement-dependence Mention may be made of cellular cytotoxic activity.
  • the function of the antigen-binding fragment of the antibody in the present invention is the binding activity to Siglec-15, preferably the activity of suppressing the formation of osteoclasts, more preferably the process of cell fusion of osteoclasts. Activity.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2, Fv, or single chain Fv (scFv), diabodies (diabodies), linear antibody in which Fvs of heavy and light chains are linked by an appropriate linker.
  • Fab ' which is a monovalent fragment of the variable region of an antibody obtained by treating F (ab') 2 under reducing conditions, is also included in the antibody fragment.
  • the antibody of the present invention may be a multispecific antibody having specificity for at least two different antigens.
  • a molecule binds to two types of antigens (ie, bispecific antibodies), but the “multispecific antibody” in the present invention is more than that (for example, three types). It includes an antibody having specificity for the antigens.
  • the multispecific antibody of the present invention may be a full-length antibody or a fragment of such an antibody (for example, F (ab ') 2 bispecific antibody).
  • Bispecific antibodies can be prepared by combining the heavy and light chains (HL pairs) of two types of antibodies, or by hybridizing hybridomas that produce different monoclonal antibodies to produce a bispecific antibody. It can also be produced by producing cells (Millstein et al., Nature (1983) 305, p. 537-539).
  • the antibody of the present invention may be a single chain antibody (also referred to as scFv).
  • a single-chain antibody is obtained by linking an antibody heavy chain variable region and light chain variable region with a polypeptide linker (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg and Moore, edited by Springer Verlag, New). York, p. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p. 1126-1136)
  • a BiscFv fragment produced by linking two scFvs with a polypeptide linker is used as a bispecific antibody. It can also be used.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked via a linker that does not form a conjugate, preferably a polypeptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883).
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region in scFv may be derived from the same antibody or different antibodies.
  • the polypeptide linker that links the variable regions for example, any single chain peptide consisting of 12 to 19 residues is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA encoding the heavy chain or heavy chain variable region of the antibody, and a DNA encoding the light chain or light chain variable region.
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained in accordance with a conventional method.
  • ScFv can be obtained according to the method.
  • These antibody fragments can be produced by a host after obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • the antibody of the present invention may be one that has been increased in quantity and has increased affinity for the antigen.
  • the antibody that multiplies may be one type of antibody or a plurality of antibodies that recognize multiple epitopes of the same antigen. Examples of the method for increasing the number of antibodies include binding of IgG CH3 domain and two scFvs, binding to streptavidin, introduction of helix-turn-helix motif, and the like.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody that is a mixture of a plurality of types of anti-Siglec-15 antibodies having different amino acid sequences.
  • a polyclonal antibody a mixture of plural kinds of antibodies having different CDRs can be mentioned.
  • a polyclonal antibody a mixture of cells producing different antibodies can be cultured, and an antibody purified from the culture can be used (see WO 2004/061104).
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the antibody of the present invention may be one in which these antibody and another drug form a conjugate (Immunoconjugate).
  • conjugate examples include those in which the antibody is bound to a radioactive substance or a compound having a pharmacological action (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. (Stratesies) for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al.eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies:. A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory ( 988)) it is not intended to be limited thereto.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography. These chromatography can be performed using liquid chromatography, such as HPLC and FPLC.
  • column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • a column using a protein A column Hyper D, POROS, Sepharose F.R. F. (Pharmacia) and the like. It is also possible to purify an antibody using a carrier on which an antigen is immobilized, utilizing the binding property to the antigen.
  • Medicament containing anti-Siglec-15 antibody Among the anti-Siglec-15 antibodies obtained by the method described in the above section "3. Production of anti-Siglec-15 antibody", the biological activity of Siglec-15 is neutralized. Antibody can be obtained. These antibodies that neutralize the biological activity of Siglec-15 inhibit the biological activity of Siglec-15 in vivo, that is, the differentiation and / or maturation of osteoclasts. And / or can be used as a therapeutic and / or prophylactic agent for abnormal bone metabolism caused by abnormal maturation. An abnormal bone metabolism may be any disorder characterized by net bone loss (osteopenia or osteolysis). In general, treatment and / or prevention with anti-Siglec-15 antibody is applied when bone resorption needs to be suppressed.
  • Bone metabolism disorders that can be treated and / or prevented with anti-Siglec-15 antibodies include osteoporosis (postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, secondary osteoporosis due to the use of therapeutic agents such as steroids and immunosuppressants, and rheumatoid arthritis Osteoporosis), bone destruction associated with rheumatoid arthritis, cancerous hypercalcemia, bone destruction associated with multiple myeloma and cancer bone metastasis, giant cell tumor, osteopenia, periodontitis, tooth loss, periarticular joint Bone osteolysis, bone destruction in chronic osteomyelitis, Paget's disease of bone, renal osteodystrophy, osteogenesis imperfecta, etc., but if the disease involves net bone loss due to osteoclasts, It is not limited to these.
  • Examples of the above-mentioned anti-Siglec-15 antibody as a medicament include a humanized antibody prepared from # 32A1 antibody and CDR variants thereof.
  • the in vitro neutralizing activity of Siglec-15 biological activity by anti-Siglec-15 antibody can be measured, for example, by the activity of inhibiting differentiation of cells overexpressing Siglec-15 into osteoclasts. For example, adding anti-Siglec-15 antibody at various concentrations to mouse monocyte-derived cell line RAW264.7 cell or RAW264 cell, and measuring the inhibitory activity on differentiation to osteoclast by RANKL or TNF- ⁇ stimulation Can do.
  • anti-Siglec-15 antibody can be added to bone marrow-derived primary cultured cells at various concentrations, and the inhibition activity of osteoclast differentiation by RANKL, TNF- ⁇ or activated vitamin D 3 stimulation can be measured. it can.
  • anti-Siglec-15 antibody was added to normal human osteoclast precursor cells (Normal Human Natural Osteoblast Precursor Cells, available from Sanko Junyaku, catalog number 2T-110) at various concentrations, and stimulated with RANKL and M-CSF.
  • the activity of inhibiting the differentiation into osteoclasts can be measured.
  • Such an osteoclast differentiation inhibitory effect can be measured using as an index the inhibition of the tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity of osteoclasts.
  • the osteoclast differentiation inhibitory effect can be measured using as an index the inhibition of formation of TRAP-positive multinucleated osteoclasts, that is, inhibition of cell fusion of osteoclasts.
  • the therapeutic or preventive effect on bone metabolism abnormalities of anti-Siglec-15 antibody using an in vivo experimental animal is, for example, anti-Siglec-15 antibody in osteoporosis model animals or transgenic animals overexpressing Siglec-15 Can be confirmed by measuring the change of osteoclasts.
  • the osteoporosis model animal include an ovariectomized rat or an ovariectomized monkey.
  • bone resorption markers such as urinary deoxypyridinoline, urinary N-telopeptide of type I collagen (NTX), urinary C-telepeptide of type I collagen (CTX), blood NTX, blood CTX, blood target-resistant acid phosphatase (TRAP5b), blood bone type alkaline phosphatase (BAP), blood osteocalcin (BGP), Procollagen type I C-peptide (P1NP), etc.
  • NTX urinary N-telopeptide of type I collagen
  • CCTX urinary C-telepeptide of type I collagen
  • CTX blood NTX
  • CTX blood target-resistant acid phosphatase
  • BAP blood bone type alkaline phosphatase
  • BGP blood osteocalcin
  • P1NP Procollagen type I C-peptide
  • the antibody that neutralizes the biological activity of Siglec-15 thus obtained is used as a medicine, particularly for the treatment or prevention of abnormal bone metabolism such as osteoporosis, bone destruction associated with rheumatoid arthritis, bone destruction associated with bone metastasis of cancer, etc. It is useful as a pharmaceutical composition for the purpose of, or as an antibody for immunological diagnosis of such diseases.
  • RA rheumatoid arthritis
  • RANKL and TNF- ⁇ are considered to be the most important causes of osteoclast induction (differentiation and maturation), activation, and bone destruction in RA (Romas E et al., Bone 30, p340-). 346, 2002).
  • the RANKL decoy receptor OCIF / OPG can suppress RANKL-induced osteoclast formation, but not TNF- ⁇ -induced osteoclast formation.
  • the anti-Siglec-15 antibody of the present invention effectively suppressed both RANKL-induced osteoclast formation and TNF- ⁇ -induced osteoclast formation. Therefore, the anti-Siglec-15 antibody of the present invention is expected to suppress TNF- ⁇ -induced bone loss and bone destruction in RA and the like more strongly than RANKL blockers (OCIF / OPG, anti-RANKL antibody, etc.).
  • RANKL blockers OCIF / OPG, anti-RANKL antibody, etc.
  • the anti-Siglec-15 antibody can be administered alone or in combination with at least one other bone disease therapeutic agent for the treatment or prevention of abnormal bone metabolism.
  • the anti-Siglec-15 antibody can be administered in combination with a therapeutically effective amount of an anti-bone metabolic disorder therapeutic agent.
  • Other therapeutic agents that can be administered in combination with the anti-Siglec-15 antibody include bisphosphonates (eg, alendronate, etidonate, ibandronate, incadronate, pambronate, risedronate, or zoledronate), active vitamin D 3 , calcitonin and its derivatives, estradiol Hormones such as SERMs (Selective estrogen receptor modulators), ipriflavone, vitamin K 2 (menatetrenone), calcium preparations, PTH (parathyroid hormone), non-steroidal anti-inflammatory agents (eg, celecoxib or rofecoNb, rofecoNb receptors, etanerc pt), an anti-TNF ⁇ antibody or an antigen-binding fragment of the antibody (eg, infliximab), an anti-PTHrP (parathyrido hormone-related protein) antibody, or an antigen-binding fragment of the antibody, an IL-1 receptor antagonist (eg, anakinr
  • two, three or more types of other therapeutic agents may be administered, and these other therapeutic agents may be of the same formulation. It can be administered simultaneously by encapsulating in.
  • Other therapeutic agents and anti-Siglec-15 antibody can also be administered simultaneously by encapsulating them in the same formulation.
  • the anti-Siglec-15 antibody and other therapeutic agent can be encapsulated in separate formulations and administered simultaneously.
  • the other therapeutic agent and the anti-Siglec-15 antibody can be administered separately one after the other.
  • a therapeutic agent containing an anti-Siglec-15 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody as an active ingredient is administered, or an anti-Siglec-15 antibody or an antigen-binding fragment of the antibody is effective.
  • the protein bone disease therapeutic agent gene and the anti-Siglec-15 antibody gene can be inserted separately or downstream of the same promoter region, and can be inserted into separate or the same vector. Can be introduced.
  • any antibody fragment can be applied as long as the recognition of osteoclasts is not completely lost.
  • fragments such as Fab, F (ab ′) 2, Fv, etc.
  • antibodies and fragments thereof can also be used in the present invention.
  • the binding mode of the anti-Siglec-15 antibody or a fragment of the antibody and the bone disease therapeutic agent is described in M.M. C.
  • Examples of drug carriers include liposomes and water-soluble polymers. More specifically, these drug carriers are intervened in such a manner that an antibody and a bone disease therapeutic agent are included in a liposome, the mode in which the liposome and the antibody are bound, and the bone disease therapeutic agent is highly water-soluble.
  • a mode in which an antibody is bound to a molecule a compound having a molecular weight of about 1000 to 100,000
  • a spacer such as an oligopeptide and bound to the water-soluble polymer
  • the binding of the antibody (or the fragment) to a drug carrier such as a bone disease therapeutic agent, a liposome and a water-soluble polymer is described in G. T.A.
  • the complex of the antibody (or the fragment) and the proteinaceous bone disease therapeutic agent (or the fragment) can be prepared by a method well known to those skilled in the art, in addition to the above method, by genetic engineering.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically and / or prophylactically effective amount of an anti-Siglec-15 antibody and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, solubilizer, emulsifier, preservative and / or adjuvant. To do.
  • the present invention comprises a therapeutically and / or prophylactically effective amount of an anti-Siglec-15 antibody, a therapeutically and / or prophylactically effective amount of at least one bone disease therapeutic agent, and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, solubilization
  • pharmaceutical compositions comprising agents, emulsifiers, preservatives and / or adjuvants.
  • bone disease therapeutic agents include bisphosphonates (for example, alendronate, etidronate, ibandronate, incadronate, pamidronate, risedronate, or zoledronate), active vitamin D 3 , calcitonin and derivatives thereof, hormones such as estradiol, SERMs (selectort) , Ipriflavone, vitamin K 2 (menatetrenone), calcium preparations, PTH (parathyroid hormone), non-steroidal anti-inflammatory agents (eg celecoxib or rofecoxib), soluble TNF receptor (eg ethanercept), anti-TNF ⁇ antibody or antigen of said antibody Join A fragment (eg, infliximab), an anti-PTHrP (parathyrido hormone-related protein) antibody or an antigen-binding fragment thereof, an IL-1 receptor antagonist (eg, anakinra), an anti-IL-6 receptor antibody, or an antigen-binding fragment of the antibody (eg, , Tocili
  • the substance used in the preparation acceptable in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably a substance that is non-toxic to a person who is administered the pharmaceutical composition at a dosage or concentration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention changes or maintains pH, osmotic pressure, viscosity, transparency, color, isotonicity, sterility, stability, dissolution rate, sustained release rate, absorption rate, and penetration rate. Can be included for the formulation.
  • Substances for formulation may include, but are not limited to: amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, antibacterial agents, ascorbic acid, sodium sulfate or sodium bisulfite Antioxidants, phosphoric acid, citric acid, boric acid buffer, sodium bicarbonate, buffer such as tris-hydrochloric acid (Tris-Hcl) solution, filler such as mannitol and glycine, chelate such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Agents, caffeine, polyvinylpyrrolidine, complexing agents such as ⁇ -cyclodextrin and hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, bulking agents such as glucose, mannose or dextrin, other carbohydrates such as monosaccharides and disaccharides, coloring agents, Flavoring agent, diluent, emulsifier and polyvinylpyrrolidine Hydrophilic polymers such as low
  • the amount of these substances for preparation is preferably 0.01 to 100 times, more preferably 0.1 to 10 times the weight of the anti-Siglec-15 antibody.
  • the composition of a suitable pharmaceutical composition in the preparation can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the disease to be applied, the route of administration and the like.
  • the excipient or carrier in the pharmaceutical composition may be liquid or solid.
  • Appropriate excipients and carriers may be water for injection, physiological saline, artificial cerebrospinal fluid and other substances commonly used for parenteral administration.
  • Neutral physiological saline or physiological saline containing serum albumin can also be used as a carrier.
  • the pharmaceutical composition may include Tris buffer at pH 7.0-8.5, acetate buffer at pH 4.0-5.5, citrate buffer at pH 3.0-6.2. These buffers may also contain sorbitol and other compounds.
  • Examples of the pharmaceutical composition of the present invention include a pharmaceutical composition containing an anti-Siglec-15 antibody and a pharmaceutical composition containing an anti-Siglec-15 antibody and at least one therapeutic agent for bone disease.
  • a pharmaceutical composition comprising an anti-Siglec-15 antibody and a pharmaceutical composition comprising an anti-Siglec-15 antibody and at least one agent for treating bone metabolism disorders are molded as lyophilized products using an appropriate excipient such as sucrose. You can also.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared for parenteral administration or for oral digestive tract absorption.
  • the composition and concentration of the preparation can be determined by the administration method, and the affinity of the anti-Siglec-15 antibody for Siglec-15, that is, the dissociation constant (Kd value) for Siglec-15 contained in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Kd value the dissociation constant
  • the higher the affinity (the lower the Kd value) the more effective the drug can be exerted even if the dose to humans is reduced. Based on this result, the pharmaceutical composition of the present invention is administered to humans.
  • the amount can also be determined.
  • about 0.1 to 100 mg / kg may be administered once every 1 to 180 days.
  • Examples of the form of the pharmaceutical composition of the present invention include injections containing infusions, suppositories, nasal agents, sublingual agents, and transdermal absorption agents.
  • h # 32A1-H1-1 / L2-15 described in International Publication No. WO2010 / 117011 was used as an antibody to be used as a control for comparison test.
  • the antibody gene can be prepared according to International Publication No. WO2010 / 117011 pamphlet.
  • the h # 32A1-H1-1 / L2-15 antibody is referred to as “K3-1115” or “K3-1115 antibody”.
  • the amino acid sequence of the K3-1115 heavy chain is set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a signal sequence and a heavy chain, respectively. It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1398th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 are respectively a signal sequence, a heavy chain variable region sequence and a heavy chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are also shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the K3-1115 light chain is set forth in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is respectively a signal sequence and a light chain It corresponds to the variable region and the light chain constant region.
  • sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, the sequence consisting of the 61st to 399th nucleotides, and the sequence consisting of the 400th to 714th nucleotides are respectively a signal sequence, a light chain variable region sequence and a light chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 are also shown in FIG.
  • Siglec-15 is a basic protein, and by introducing acidic amino acid residues such as aspartic acid and glutamic acid into the antibody sequence, it is expected that an ionic bond is formed between the antigen and the antibody and the binding ability is improved.
  • a glutamic acid residue with a long side chain of acidic amino acid is introduced into the threonine residue which is located in the center of CDRH3 loop considered to be the most important in the recognition site of the antibody and is expected to face the antigen side by X-ray crystal structure analysis A replacement was designed.
  • the position of amino acid residue substitution corresponds to position 103 of the K3-1115 heavy chain sequence excluding the signal sequence.
  • “K3-1115 / T103E heavy chain” may also be referred to as “K3-1115 / T103E antibody heavy chain”.
  • WO2010 / 117011 pamphlet as a template, for example, using QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies) and the following primer set:
  • a K3-1115 / T103E heavy chain expression vector can be constructed by performing base substitution according to the manual of the kit.
  • the obtained expression vector was designated as “pEG2 / K3-1115 / T103E”.
  • sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues, the sequence consisting of the 20th to 140th amino acid residues, and the sequence consisting of the 141st to 466th amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 are respectively a signal sequence and a heavy chain It corresponds to the variable region and heavy chain constant region.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • the sequence consisting of the 1st to 57th nucleotides, the sequence consisting of the 58th to 420th nucleotides, and the sequence consisting of the 421th to 1398th nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 are respectively a signal sequence, a heavy chain variable region sequence and a heavy chain constant.
  • the normal region sequence is encoded.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 are also shown in FIG.
  • K3-1115 antibody and K3-1115 / T103E antibody 2-1 Production of K3-1115 antibody and K3-1115 / T103E antibody Antibody was produced by the following method or a method analogous thereto.
  • FreeStyle 293F cells (Invitrogen) were subcultured and cultured according to the manual. 1.2 ⁇ 10 9 cells of FreeStyle 293F cells in the logarithmic growth phase (Invitrogen) were seeded in 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING Inc.), FreeStyle293 expression medium was diluted with (Invitrogen, Inc.) 1.0 ⁇ 10 6 cells / Ml, and cultured with shaking at 90 rpm in an 8% CO 2 incubator at 37 ° C. for 1 hour.
  • Polyethyleneimine (Polyscience # 24765) 3.6 mg was dissolved in Opti-Pro SFM medium (Invitrogen) 20 ml, and then heavy chain expression vector (0.4 mg) and light chain expression prepared using NucleoBond Xtra (TaKaRa) The vector (0.8 mg) was suspended in 20 ml of Opti-Pro SFM medium (Invitrogen). 20 ml of an expression vector / Opti-Pro SFM mixture was added to 20 ml of a polyethyleneimine / Opti-Pro SFM mixture, gently stirred, allowed to stand for another 5 minutes, and then added to FreeStyle 293F cells. The culture supernatant obtained by shaking culture at 90 rpm in a 37 ° C., 8% CO 2 incubator for 7 days was filtered with a Disposable Capsule Filter (Advantec # CCS-045-E1H).
  • K3- 1115 antibodies can be made. Further, by combining the heavy chain expression vector pEG2 / K3-1115 / T103E prepared in Example 1 and the light chain expression vector pEF6KCL / h # 32A1-L2-15 described in International Publication No. WO2010 / 117001 pamphlet, One amino acid residue substitution product of the humanized antibody of rat anti-human Siglec-15 monoclonal antibody # 32A1 can be prepared.
  • the one amino acid residue-substituted product was named “K3-1115 / T103E”.
  • “K3-1115 / T103E” is sometimes referred to as “K3-1115 / T103E antibody”.
  • the light chain sequences of the K3-1115 antibody and the K3-1115 / T103E antibody are identical. That is, only one amino acid residue in CDRH3 of the heavy chain differs between the K3-1115 antibody and the K3-1115 / T103E antibody.
  • K3-1115 and K3-1115 / T103E antibodies were purified by the following method or a method analogous thereto.
  • the culture supernatant obtained in 2-1) above was purified in two steps, rProtein A affinity chromatography (4-6 ° C.) and ceramic hydroxyapatite (room temperature).
  • the buffer replacement step after purification of rProtein A affinity chromatography and after purification of ceramic hydroxylapatite was carried out at room temperature.
  • 1100-1200 ml of the culture supernatant was applied to MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience, HiTrap column: volume 1 ml ⁇ 2 connections) equilibrated with PBS. After all of the culture solution entered the column, the column was washed with 15-30 ml of PBS.
  • the substituted antibody solution was applied to a ceramic hydroxyapatite column (Nippon Bio-Rad, Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column: volume 2 ml) equilibrated with 5 mM NaPi / 50 mM MES / 20 mM NaCl / pH 6.5 buffer. Applied. Linear gradient elution with sodium chloride was performed and the fractions containing antibody were collected. The fraction was subjected to liquid replacement with CBS (10 mM citrate buffer / 140 mM sodium chloride, pH 6.0) with a desalting column (GE Healthcare Bioscience, HiTrap Desalting column: volume 5 ml ⁇ 2 linked).
  • CBS 10 mM citrate buffer / 140 mM sodium chloride, pH 6.0
  • desalting column GE Healthcare Bioscience, HiTrap Desalting column: volume 5 ml ⁇ 2 linked.
  • Escherichia coli Rosetta-gamiB (DE3) (Novagen, catalog number: 71136-4) was transformed and cultured in TB medium (Invitrogen, catalog number: 22711-022). After culturing, the sonicated cells were centrifuged, and the supernatant was purified with a HisTrap HP column (GE Healthcare, catalog number: 17-5247-01). Thereafter, the His tag was cut with FactorXa (NEW ENGLAND BioLabs, catalog number P8010L), Mono S5 / 50 GL column (GE Healthcare, catalog number: 17-5168-01), and Superdex 75 10/300 column. (GE Healthcare, catalog number: 17-5174-01) was used to purify the human Siglec-15 V-set domain by electrophoresis to a single band with a molecular weight of 14 kDa.
  • K3-1115 or K3-1115 / T103E Measurement of dissociation constant of K3-1115 or K3-1115 / T103E with human Siglec-15 V-set domain K3-1115 or K3-1115 / T103E antibody and hSiglec-15 (39-165) V-set
  • the dissociation constant of the domain was measured using Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.) with the antibody immobilized as a ligand and the antigen as an analyte.
  • K3-1115 or K3-1115 / T103E antibody is an anti-human IgG antibody (GE Healthcare Biosciences) immobilized on sensor chip CM5 (GE Healthcare Biosciences) by the amine coupling method. Through which about 50 RU were bound.
  • HBS-EP + (10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% Surfactant P20) was used as a running buffer.
  • a dilution series solution of the antigen (0.003-7 nM) was added onto the antibody-bound chip for 233 seconds at a flow rate of 90 ⁇ l / min, and the dissociation phase was subsequently monitored for 2000-3600 seconds.
  • 3M MgCl 2 was added at a flow rate of 10 ⁇ l / min for 30 seconds.
  • KD KD
  • the KD value of K3-1115 was 2.6E-10 [M]
  • the KD value of K3-1115 / T103E was 4.1E-12 [M]
  • one amino acid residue in K3-1115 / T103E It was revealed that the substitution enhanced the affinity about 60-fold compared to K3-1115.
  • 121 kinds of antibodies as one amino acid substitution of K3-1115 were prepared by the method of Example 2 or a method analogous thereto, and bound to human Siglec-15 protein according to the method of Example 3 or a method analogous thereto. Sex assessment was performed. Of these 121 substitutions, there were 6 types of antibodies showing stronger affinity for human Siglec-15 protein than K3-1115, and K3-1115 / T103E showed the highest affinity.
  • the femur and tibia are removed from 5- to 8-week-old male ddY mice, and soft tissues are removed. Both ends of the femur or tibia are cut off, D-PBS is injected with a syringe with a 25 gauge needle, the bone marrow cells are pushed out, and collected in a centrifuge tube. After centrifuging at 100 g for 5 minutes at room temperature and discarding the supernatant, 1 ml of Hemolytic Buffer (RED BLOOD CELL LYSING BUFFER, manufactured by Sigma) is added to the cell pellet and suspended, and left at room temperature for 5 minutes.
  • Hemolytic Buffer RED BLOOD CELL LYSING BUFFER
  • a mouse bone marrow non-adherent cell prepared by the above method was prepared in an ⁇ -MEM medium containing 10% FBS and 10 ng / ml M-CSF (R & D Systems) to 1.5 ⁇ 10 5 cells / ml. 200 ⁇ l is seeded in each well of a 96-well plate and cultured in a CO 2 incubator for 2 days. The old culture medium in the 96-well plate was removed, and human RANKL (RANKL, manufactured by Peprotech) was added to a final concentration of 20 ng / ml and M-CSF containing 10 ng / ml. Add 100 ⁇ l of ⁇ medium.
  • RANKL human RANKL
  • the K3-1115 / T103E antibody prepared in Example 2 is added to a concentration of 3 to 100 ng / ml, and further cultured in a CO 2 incubator for 3 days.
  • the tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity of the formed osteoclast is measured by the following operation.
  • the culture solution in each well of the 96-well plate was removed by aspiration, 50 ⁇ l of 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.1) containing 1% Triton X-100 was added to each well, and the plate was shaken for 5 minutes. Solubilize the cells.
  • a substrate solution 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.1) containing 5 mg / ml p-nitrophenyl phosphate and 0.46% sodium tartrate
  • 50 ⁇ l of a substrate solution 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.1) containing 5 mg / ml p-nitrophenyl phosphate and 0.46% sodium tartrate
  • the enzyme reaction is stopped by adding 50 ⁇ l of 1N sodium hydroxide solution to each well of the 96-well plate.
  • the absorbance at 405 nm of each well is measured and used as an index of TRAP activity.
  • the inhibitory effect of K3-1115 / T103E antibody on mouse osteoclast formation can be evaluated.
  • Osteoclasts are known to degrade type I collagen, a component of bone tissue, by releasing proteases such as cathepsin K.
  • OsteoLyce Assay Kit (manufactured by Lonza, catalog number PA-1500) provides a 96-well plate (96-well OsteoLyse cell culture plate) coated with human collagen to which europium is bound, and osteoclasts on the plate. By measuring the amount of fluorescent collagen fragments released into the supernatant when cultivating, the bone resorption activity of osteoclasts can be evaluated in vitro.
  • Normal human osteoclast progenitor cells Normal Human Natural Osteoblast Precursor Cells, purchased from Sanko Junyaku, Catalog No. 2T-110, according to the protocol attached to the cells, 96-well OsteoLyce cell culture plate with 1 ⁇ 10 4 cells / well Sowing.
  • the medium is an OPGM additive factor set (purchased from Sanko Junyaku) containing fetal bovine serum (final concentration 10%), human RANKL (final concentration 63.8 ng / ml), human M-CSF (final concentration 33 ng / ml), etc.
  • the basic medium for osteoclast precursor cells (OPBM, purchased from Sanko Junyaku, catalog number PT-8201) supplemented with catalog number PT-9501) was used.
  • the K3-1115 antibody and K3-1115 / T103E antibody prepared in Example 2 were added to final concentrations of 0.8, 4, 20, and 100 ng / ml, and the mixture was added to a CO 2 incubator. For 5 days. 10 ⁇ l of the culture supernatant was collected, 200 ⁇ l of Fluorophore Release Reagent supplied with OsteoLyase Assay Kit was added, and fluorescence intensity was measured using a fluorescence plate reader (ARVO MX, manufactured by PerkinElmer) (Excitation: 340 nm, Emission: 615 nm). The amount of free fluorescent collagen fragments released into the culture supernatant was quantified (FIG. 5).
  • the amount of free collagen fragments was suppressed in a concentration-dependent manner by the K3-1115 antibody in the range of 20 ng / ml to 100 ng / ml.
  • the K3-1115 / T103E antibody when the K3-1115 / T103E antibody was added, the concentration was suppressed in a concentration range from 4 ng / ml to 100 ng / ml. This revealed that the K3-1115 / T103E antibody strongly suppressed the bone resorption activity of human osteoclasts from a lower concentration than the K3-1115 antibody.
  • the amount of deoxypyridinoline excreted in the urine was significantly increased in the ovariectomized group, suggesting that bone resorption by osteoclasts is enhanced in the ovariectomized rat.
  • the increase in deoxypyridinoline excretion by ovariectomy is suppressed to the same extent as in the sham operation group. From this, it was confirmed in animal models that a monoclonal antibody that specifically binds to Siglec-15 inhibits bone resorption of osteoclasts, and this bone resorption inhibition action suppressed the decrease in lumbar bone density in ovariectomized rats. It is strongly suggested. If one group to which K3-1115 is administered is added to the protocol described in a), the inhibitory effect on the bone density phenomenon by K3-1115 and K3-1115 / T103E can be compared.
  • K3-1115 / T103E antibody Biological evaluation of K3-1115 / T103E antibody using ovariectomized monkeys
  • the inhibitory effect of K3-1115 / T103E antibody on bone resorption activity in ovariectomized monkeys can be evaluated by the following method.
  • the K3-1115 / T103E antibody prepared in Example 2 is administered once subcutaneously at a dose of 0.1 to 30 mg / kg.
  • Urine is collected and collected over time until about 2 months after administration, and the bone resorption inhibitory activity of the antibody is evaluated by measuring bone metabolism markers in urine and blood.
  • Bone resorption markers such as urinary N-telopeptide of type I collagen (NTX), urinary C-telopeptide of type I collagen (CTX), blood NTX, blood CTX, blood Tartrate-resistive
  • NTX urinary N-telopeptide of type I collagen
  • CX urinary C-telopeptide of type I collagen
  • CTX urinary C-telopeptide of type I collagen
  • BAP bone bone type alkaline phosphatase
  • BGP blood osteocalcin
  • P1NP Procollagen type I C-peptide
  • the CDR variants of the humanized anti-Siglec-15 antibody of the present invention have a stronger ability to suppress osteoclast differentiation or bone resorption activity than known antibodies, and a pharmaceutical composition comprising the anti-Siglec-15 antibody is It can be a therapeutic or preventive agent for diseases of abnormal bone metabolism.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of K3-1115 antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of K3-1115 antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of K3-1115 antibody light chain
  • SEQ ID NO: 4 of K3-1115 antibody light chain
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence of K3-1115 / T103E antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 6 Amino acid sequence of K3-1115 / T103E antibody heavy chain
  • SEQ ID NO: 8 # 32A1
  • SEQ ID NO: 9 amino acid sequence of CDRH2 of antibody # 32A1 (consisting of 14 amino acid residues)
  • SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of CDRH3 of antibody # 32A1

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Abstract

　破骨細胞で強く発現する遺伝子にコードされる蛋白質を標的とした骨代謝異常治療及び／又は予防用医薬組成物を提供すること。　ヒトＳｉｇｌｅｃ－１５を特異的に認識し、破骨細胞の形成を抑制する活性を有する抗体を含む医薬組成物の提供等。

Description

ＣＤＲ改変抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体
　本発明は、骨代謝異常の治療及び／又は予防薬として有用な物質、並びに骨代謝異常の治療及び／又は予防方法に関する。
　骨は、自らの形態変化や血中カルシウム濃度の維持のために、常に形成と吸収を繰り返して再構築を行う動的な器官として知られている。正常な骨では骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とは平衡関係にあり、骨量は一定に保たれている。一方、骨形成と骨吸収との平衡関係が崩れると、骨粗鬆症などの骨代謝異常になる（例えば、非特許文献１及び２を参照）。
　骨代謝を調節する因子としては、全身性のホルモンや局所性のサイトカインが数多く報告されており、それらの因子の共同作用により骨の形成と維持が営まれている（例えば、非特許文献１及び３を参照）。加齢による骨組織の変化としては、骨粗鬆症の発症が広く知られているが、その発症機構は性ホルモンの分泌低下やそのレセプター異常、骨局所におけるサイトカイン発現の変動、老化遺伝子の発現、破骨細胞や骨芽細胞の分化あるいは機能不全など多岐にわたっており、加齢による単純な生理現象として理解するのは困難である。原発性骨粗鬆症はエストロゲンの分泌低下による閉経後骨粗鬆症と加齢による老人性骨粗鬆症に大別されているが、その発症機構の解明と治療薬開発の為には、骨吸収と骨形成の調節機構についての基礎的研究の進展が必須である。
　破骨細胞は、造血幹細胞に由来する多核の細胞であり、骨との接着面に塩素イオンと水素イオンを放出することによって、細胞と骨の接着面の間隙を酸性化すると共に酸性プロテアーゼであるカテプシンＫなどを分泌する（例えば、非特許文献４を参照）。この結果、リン酸カルシウムの分解、酸性プロテアーゼの活性化と骨基質蛋白質の分解が引き起こされ、骨吸収が進行する。
　破骨細胞の前駆細胞は骨表面の骨芽細胞／ストローマ細胞の細胞膜上に発現するＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－κＢ　ｌｉｇａｎｄ）の刺激を受けて、破骨細胞へ分化することが明らかにされた（例えば、非特許文献５及び６を参照）。ＲＡＮＫＬは骨芽細胞／ストローマ細胞が産生する膜蛋白質であり、その発現は骨吸収因子により調節されること、及びＲＡＮＫＬは破骨細胞前駆細胞から成熟多核破骨細胞への分化を誘導することなどが明らかにされた（例えば、非特許文献５及び７を参照）。さらに、ＲＡＮＫＬをノックアウトしたマウスが、大理石骨病様の病態を発症することが見出され、ＲＡＮＫＬが生理的な破骨細胞分化誘導因子であることが証明された（例えば、非特許文献８を参照）。
　骨代謝疾患の治療や治療期間の短縮を図る医薬品として、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、ＰＴＨ及びカルシウム製剤等が使用されている。しかし、これらの薬剤は、治療結果において必ずしも満足できるものではなく、より治療効果の高い薬剤の開発が望まれていた。
　免疫系細胞の細胞膜上はシアル酸含有糖鎖などの多様な糖鎖によって高度に覆われており、様々な糖鎖結合蛋白質によって認識されている。シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉａｌｉｃ－ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｌｅｃｔｉｎｓ、以下、「Ｓｉｇｌｅｃｓ」という。）は、シアル酸含有糖鎖を認識して結合するＩ型膜蛋白質ファミリーである。Ｓｉｇｌｅｃｓは免疫系細胞の細胞膜上で多く発現しており、同じく免疫系細胞の細胞膜上に存在するシアル酸を認識して細胞間相互作用や細胞機能を調節し、免疫応答に関与していると考えられている（例えば、非特許文献９を参照）が、生理的機能が明らかとなっていないＳｉｇｌｅｃｓ分子も多い。Ｓｉｇｌｅｃ－１５（Ｓｉａｌｉｃ－ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｌｅｃｔｉｎ　１５）は、Ｓｉｇｌｅｃｓに属することが新たに報告された分子で（例えば、非特許文献１０を参照）、ＣＤ３３Ｌ３（ＣＤ３３　ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｌｉｋｅ　３）と呼ばれる分子と同一である。この分子は魚類からヒトまで進化的な保存度が高く、ヒト脾臓及びリンパ節において、樹状細胞／マクロファージ系の細胞に強く発現することが明らかにされた。またシアル酸プローブを用いた結合試験の結果、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１５はＮｅｕ５Ａｃα２－６ＧａｌＮＡｃと、マウスＳｉｇｌｅｃ－１５はさらにＮｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃと結合することなども明らかにされた（例えば、非特許文献１０を参照）。最近まで、Ｓｉｇｌｅｃ－１５の生理的役割は明らかではなかったが、破骨細胞の分化、成熟に伴ってＳｉｇｌｅｃ－１５の発現が亢進し、ＲＮＡ干渉によってＳｉｇｌｅｃ－１５の発現を低下させると破骨細胞の分化が抑制されることが報告された（例えば、特許文献１を参照）。さらに、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体が破骨細胞分化におよぼす作用について、特許文献２（２００９年４月１６日公開）及び特許文献３（２０１０年１０月１４日公開）において初めて明らかにされた。さらに特許文献４においても破骨細胞の分化を抑制する抗体が開示されたが、より強力な作用を示す抗体の探索が続けられている。
国際公開第ＷＯ０７／０９３０４２号パンフレット 国際公開第ＷＯ０９／０４８０７２号パンフレット 国際公開第ＷＯ１０／１１７０１１号パンフレット 国際公開第ＷＯ１１／０４１８９４号パンフレット
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ，（１９９２）１３，ｐ６６－８０ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９９６）ｐ８７－１０２ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ，（１９９６）１７，ｐ３０８－３３２ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，（１９９１）２６０，Ｃ１３１５－Ｃ１３２４ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，（１９９８）９５，ｐ３５９７－３６０２、 Ｃｅｌｌ，（１９９８）９３，ｐ１６５－１７６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９８）２３，Ｓ２２２ Ｎａｔｕｒｅ，（１９９９）３９７，ｐ３１５－３２３ Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２００７）７，ｐ２５５－２６６ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００７）１７，ｐ８３８－８４６
　本発明の目的は、骨粗鬆症、関節リウマチ、癌の骨転移等に見られる種々の骨代謝異常の際に特異的に発現する遺伝子、破骨細胞の分化成熟と活性を阻害する物質、及び骨代謝異常の治療及び／又は予防剤を提供することにある。
　本発明者らは、骨代謝異常の治療及び／又は予防効果を有する物質を探索する目的で、破骨細胞の分化、成熟及び活性化の機構（メカニズム）の解明を目指した研究を行った結果、破骨細胞の分化、成熟に伴いＳｉｇｌｅｃ－１５遺伝子の発現が上昇することを見出した。また、本発明者らは、Ｓｉｇｌｅｃ－１５と特異的に結合する抗体により、破骨細胞の分化が抑制されることを見出した。さらに発明者らは、得られたラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ－１５抗体をヒト化し、さらに当該ヒト化抗体のＣＤＲを改変して本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
 
（１）重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号７に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（２）配列番号６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（３）配列番号６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（４）配列番号６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６５番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（１）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
（５）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、（１）又は（２）に記載の抗体の抗原結合断片。
（６）ｓｃＦｖであることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の抗体。
（７）（１）乃至（６）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
（８）骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、（７）に記載の医薬組成物。
（９）（１）乃至（６）に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ－６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
（１０）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、（８）又は（９）に記載の医薬組成物。
（１１）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）（１）乃至（６）に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（８）若しくは（９）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（１５）（１）乃至（６）に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は（８）に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ－６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は連続して投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（１６）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする（１４）又は（１５）に記載の治療及び／又は予防方法。
（１７）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（１６）に記載の治療及び／又は予防方法。
（１８）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（１７）に記載の治療及び／又は予防方法。
（１９）（１）乃至（６）のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
（２０）配列番号５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（１９）に記載のポリヌクレオチド。
（２１）配列番号５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（１９）に記載のポリヌクレオチド。
（２２）（１９）乃至（２１）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
（２３）（１９）乃至（２１）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
（２４）（２２）に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
（２５）（２３）又は（２４）に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む（１）乃至（６）のいずれか一つに記載の抗体の生産方法。
　本発明によれば、破骨細胞の分化成熟、及び骨吸収活性の阻害を作用機序とする、骨代謝異常の治療剤及び／又は予防剤を得ることができる。 
　 
Ｋ３－１１１５抗体重鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 Ｋ３－１１１５抗体軽鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体重鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。なお、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３抗体の軽鎖は、Ｋ３－１１１５抗体の軽鎖と共通である。 ＃３２Ａ１抗体及びＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の各ＣＤＲのアミノ酸配列を示した図である。 Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の添加による、正常ヒト破骨細胞の骨吸収活性の抑制を示したグラフである（Ｎ＝６）。
　本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
　本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
　本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
　本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。
　本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
　本明細書中において、「Ｓｉｇｌｅｃ－１５」は、Ｓｉｇｌｅｃ－１５蛋白質と同じ意味で用いている。
　本明細書中において、「破骨細胞の形成」は、「破骨細胞の分化」又は「破骨細胞の成熟」と同じ意味で用いている。
　本明細書中における「抗体の抗原結合断片」とは、「抗体の機能性断片」とも呼ばれ、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の抗原結合断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの抗原結合断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
　抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
　本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７－１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１－２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１５　ｍＭ　クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
 
１．Ｓｉｇｌｅｃ－１５
　本発明者らによって、Ｓｉｇｌｅｃ－１５遺伝子は巨細胞腫において特異的に発現していることが見出された。また、本発明者らによってＳｉｇｌｅｃ－１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された。
　本発明で用いるＳｉｇｌｅｃ－１５は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）あるいはニワトリの単球細胞あるいは骨髄細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、Ｓｉｇｌｅｃ－１５をｉｎ　ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ－１５　ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＳｉｇｌｅｃ－１５を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
　ヒトＳｉｇｌｅｃ－１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿２１３６０２で登録されている。マウスＳｉｇｌｅｃ－１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＸＭ＿８８４６３６で登録されている。なお、Ｓｉｇｌｅｃ－１５は、ＣＤ３３　ａｎｔｉｇｅｎ－ｌｉｋｅ　３、ＣＤ３３　ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｌｉｋｅ　３、ＣＤ３３－ｌｉｋｅ　３又はＣＤ３３Ｌ３と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。
　Ｓｉｇｌｅｃ－１５のｃＤＮＡは例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－１５のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｓｉｇｌｅｃ－１５のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７－４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
　なお、ヒト又はマウスのＳｉｇｌｅｃ－１５をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ－１５と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ－１５のｃＤＮＡに含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＳｉｇｌｅｃ－１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ－１５と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ－１５のｃＤＮＡに含まれる。
　また、ヒト又はマウスのＳｉｇｌｅｃ－１５のアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｓｉｇｌｅｃ－１５と同等の生物活性を有する蛋白質もＳｉｇｌｅｃ－１５に含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＳｉｇｌｅｃ－１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ－１５と同等の生物活性を有する蛋白質もＳｉｇｌｅｃ－１５に含まれる。
 
２．骨代謝異常の検出
　Ｓｉｇｌｅｃ－１５遺伝子は、ヒト各種骨組織検体群における遺伝子の発現量の解析をすると、破骨細胞様の多核巨細胞が多数出現する骨腫瘍であり、臨床的所見として骨溶解性の骨破壊を特徴とする（Ｂｕｌｌｏｕｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　ｐｐ１７．６－１７．８，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９２））巨細胞腫（Ｇｉａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｔｕｍｏｒ；　ＧＣＴ）において有意に発現量が増加していることが見出された。
　また、Ｓｉｇｌｅｃ－１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された。
　したがって、Ｓｉｇｌｅｃ－１５はＧＣＴのような骨吸収が亢進するヒトの病態に関与していると考えられる。すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ－１５遺伝子及び／又はＳｉｇｌｅｃ－１５の各細胞、及び／又は各組織における発現量を測定することでＳｉｇｌｅｃ－１５の過剰発現を伴う骨代謝異常の状態を判定することができる。なお、本明細書における骨代謝異常とは、正味の骨喪失によって特徴付けられる障害であり、具体的には骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症等を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本発明においてＳｉｇｌｅｃ－１５遺伝子及び／又はＳｉｇｌｅｃ－１５の発現量を調べる対象となる「検体」とは、被験者や臨床検体等から得られた、骨髄、骨、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織、血液、体液又は排泄物等の試料を意味するが、本発明においては血液又は骨髄がより好ましい。
　破骨細胞の分化に関連することが知られているＲＡＮＫＬについては、ノックアウトマウスが作製されており、ＲＡＮＫＬの機能が失われた場合の表現型について解析がなされている（Ｙｏｕｎｇ－Ｙｕｎ　Ｋｏｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９７，ｐ．３１５－３２３）。Ｓｉｇｌｅｃ－１５についても同様にノックアウトマウスを作製することによって，Ｓｉｇｌｅｃ－１５の機能が失われた場合の表現型の解析を行うことができる。
　
３．抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の製造
　本発明のＳｉｇｌｅｃ－１５に対する抗体は、常法を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ－１５又はＳｉｇｌｅｃ－１５のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＳｉｇｌｅｃ－１５の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＳｉｇｌｅｃ－１５を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種Ｓｉｇｌｅｃ－１５に結合する抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ－１５との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
　また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、Ｓｉｇｌｅｃ－１５に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。このような方法の具体的な例は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット（２００９年４月１６日公開）及び第ＷＯ１０／１１７０１１号（２０１０年１０月１４日公開）パンフレットに記載されている。
　なお、抗原となるＳｉｇｌｅｃ－１５はＳｉｇｌｅｃ－１５遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ－１５遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＳｉｇｌｅｃ－１５を精製すればよい。
　このようにして樹立されたされたハイブリドーマ株の例としては、国際公開ＷＯ０９／４８０７２号パンフレットに記載のハイブリドーマ＃３２Ａ１を挙げることができる。ハイブリドーマ＃３２Ａ１は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（所在地：郵便番号３０５－８５６６　日本国　茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に２００８年８月２８日付けで寄託され、ａｎｔｉ－Ｓｉｇｌｅｃ－１５　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　＃３２Ａ１の名称で受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０９９９が付与されている。なお、本明細書中においては、ハイブリドーマ＃３２Ａ１が産生する抗体を、「＃３２Ａ１抗体」又は単に「＃３２Ａ１」と記載する。＃３２Ａ１抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む部分断片は、国際公開第ＷＯ２０１０／１１７０１１号パンフレットに記載されている。
　上記Ｓｉｇｌｅｃ－１５に対するモノクローナル抗体の配列を、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変して、遺伝子組換え型抗体であるヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を作製することができる。本発明の抗体には、前記ヒト化抗体のＣＤＲを改変した抗体が含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット）を挙げることができる。ラット抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の実例としては、配列番号２の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号４の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せを挙げることができる。　
　さらに好適な抗体としては、配列番号２の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書においては、前記の抗体を「Ｋ３－１１１５」あるいは「Ｋ３－１１１５抗体」と呼称する。
　但し、＃３２Ａ１抗体由来のヒト化抗体としては、＃３２Ａ１の６種全てのＣＤＲ配列を保持し、破骨細胞の形成を抑制する活性を持つ限り、上記のヒト化抗体に限定されない。なお、＃３２Ａ１抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＦＭＮ）、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＱＩＲＮＫＩＹＴＹＡＴＦＹＡＥＳＬＥＧ）又は配列番号９に示されるＣＤＲＨ２（ＱＩＲＮＫＩＹＴＹＡＴＦＹＡ）のいずれか一つ、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＳＬＴＧＧＤＹＦＤＹ）を保有している。配列番号８に示されるＣＤＲＨ２は、Ｋａｂａｔの定義（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ　ＯＦ　ＰＲＯＴＥＩＮＳ　ＯＦ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＩＮＴＥＲＥＳＴ　ＶＯＬ．Ｉ，ＦＩＦＴＨ　ＥＤＴＩＯＮ（１９９１））によるものである。配列番号９に示されるＣＤＲＨ２では、Ｃ末端がＫａｂａｔの定義より５残基短縮されている。このＣＤＲＨ２を含む重鎖配列においては、ラット由来のＣＤＲ配列を減らしてヒトフレームワーク配列をより多く取り入れているために、ヒトに投与した際に異種抗原としてより一層認識されにくい。また、＃３２Ａ１抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＲＡＳＱＳＶＴＩＳＧＹＳＦＩＨ）、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＡＳＮＬＡＳ）、及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＳＲＫＳＰＷＴ）を保有している。なお、上記の配列番号７乃至１０、及び１２乃至１４のＣＤＲのアミノ酸配列は、図４にも記載されている。
　＃３２Ａ１抗体由来のヒト化抗体のＣＤＲ改変体の一例としては、配列番号１０のＣＤＲＨ３の３番目のスレオニン残基をグルタミン酸残基に置換した抗体を挙げることができる。Ｓｉｇｌｅｃ－１５は塩基性の蛋白質であり、アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸残基の抗体配列への導入により、抗原－抗体間のイオン結合が形成されて結合能が向上することが期待される。抗体の認識部位で最も重要と考えられるＣＤＲＨ３ループの中央に位置し、Ｘ線結晶構造解析により抗原側に向いていると予想されるスレオニン残基に酸性アミノ酸で側鎖の長いグルタミン酸残基を導入する置換体を設計した。前記の置換を有するＣＤＲＨ３（ＳＬＥＧＧＤＹＦＤＹ）は、配列表の配列番号１１のアミノ酸配列に相当する。なお、配列番号１１のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は、図４にも記載されている。
　上記のＣＤＲ改変体として好適な抗体としては、配列番号６の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号４の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の組合せを挙げることができる。
　さらに好適な抗体としては、配列番号６の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。本明細書においては、前記の抗体を「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ」あるいは「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体」と呼称する。なお、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体重鎖は、配列番号２に記載のＫ３－１１１５重鎖配列からシグナル配列を除いたアミノ酸配列の１０３番目のスレオニン残基がグルタミン酸残基に置換された配列である。
　但し、本発明のヒト化＃３２Ａ１のＣＤＲ改変体は、配列番号１１のＣＤＲＨ３配列を保有する限り、上記のＣＤＲ改変体に限定されない。また、本発明のヒト化＃３２Ａ１のＣＤＲ改変体のＣＤＲＨ２配列は、配列番号８又は配列番号９に示されるＣＤＲＨ２のいずれであっても良い。
　なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
　以上の方法によって得られた抗体は、実施例３に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ　Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５－２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
　また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ　Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ　Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合断片の一種と解釈することも可能である。
　また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞障害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０等が知られているが、これらに限定されるものではない。
　抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。　抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
　本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げることができる。
　また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合断片が保持する機能は、Ｓｉｇｌｅｃ－１５に対する結合活性であり、好ましくは破骨細胞の形成を抑制する活性であり、より好ましくは破骨細胞の細胞融合の過程を抑制する活性である。
　例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
　さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
　本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７－５３９）。
　本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
　一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２～１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
　また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
　本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ　ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
　本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
　本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
　クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ　Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。また、抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
 
４．抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を含有する医薬
　上述の「３．抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の中から、Ｓｉｇｌｅｃ－１５の生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＳｉｇｌｅｃ－１５の生物活性を中和する抗体は、生体内でのＳｉｇｌｅｃ－１５の生物活性、即ち、破骨細胞の分化及び／又は成熟を阻害することから、医薬として、破骨細胞の分化及び／又は成熟異常に起因する骨代謝異常に対する治療及び／又は予防剤として用いることができる。骨代謝異常は正味の骨喪失（骨減少症又は骨溶解症）によって特徴付けられるいずれの障害であってもよい。一般に、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体による治療及び／又は予防は、骨吸収を抑制する必要がある場合に適用される。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体で治療及び／又は予防可能な骨代謝異常としては、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症などを挙げることができるが、破骨細胞による正味の骨喪失を伴う疾患であれば、これらに限定されない。上記の医薬としての抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の例として、＃３２Ａ１抗体から作製されたヒト化抗体およびこれのＣＤＲ改変体を挙げることができる。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体によるＳｉｇｌｅｃ－１５の生物活性の中和活性は例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－１５を過剰発現している細胞の破骨細胞への分化の抑制活性で測定することができる。例えば、マウス単球由来細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞又はＲＡＷ２６４細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬあるいはＴＮＦ－α刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。また、骨髄由来の初代培養細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ－αあるいは活性型ビタミンＤ３刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。さらに、正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入可能、カタログ番号２Ｔ－１１０）に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ及びＭ－ＣＳＦ刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。このような破骨細胞の分化抑制効果は、破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性の抑制を指標として測定できる。また、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞の形成の抑制、すなわち破骨細胞の細胞融合の抑制を指標としても、破骨細胞の分化抑制効果を測定することができる。さらに、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞を用いたピットアッセイ（Ｔａｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ，（１９９２）１７，３４７－３５９）実験において、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を添加して象牙切片上のピットの形成を観察することによって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性を測定することができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性の測定系としては、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングしたプレートを使用することも可能である。ｉｎ　ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の骨代謝異常に対する治療又は予防効果は、例えば、骨粗鬆症モデル動物又はＳｉｇｌｅｃ－１５を過剰に発現しているトランスジェニック動物に抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を投与し、破骨細胞の変化を測定することで確認することができる。前記の骨粗鬆症モデル動物として、卵巣摘出ラット又は卵巣摘出サルを挙げることができる。これらの実験動物に抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を投与した後に骨密度又は骨代謝マーカーを測定することによって、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体による骨吸収活性の抑制効果を測定することができる。骨代謝マーカーとしては、骨吸収マーカーである尿中デオキシピリジノリン、尿中Ｎ－ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＮＴＸ）、尿中Ｃ－ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＣＴＸ）、血中ＮＴＸ、血中ＣＴＸ、血中Ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ５ｂ）等や、骨形成マーカーである血中骨型アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）、血中オステオカルシン（ＢＧＰ）、Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｃ-ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｐ１ＮＰ）等を挙げることができるが、これらの骨代謝マーカーに限定されるものではない。
　このようにして得られたＳｉｇｌｅｃ－１５の生物活性を中和する抗体は、医薬として、特に骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の骨転移に伴う骨破壊等の骨代謝異常の治療又は予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
　関節リウマチ（ＲＡ）の治療において、疾患の発症に伴って発生する骨喪失が大きな課題になっている。ＲＡに伴うこの骨喪失においては、破骨細胞が中心的な役割を果たしていることが報告されている。ＲＡにおける破骨細胞の誘導（分化、成熟）、活性化、及び骨破壊の原因として最も重要と考えられているサイトカインはＲＡＮＫＬとＴＮＦ－αである（Ｒｏｍａｓ　Ｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｏｎｅ　３０，　ｐ３４０－３４６，　２００２）。ＲＡＮＫＬのデコイレセプターであるＯＣＩＦ／ＯＰＧではＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成は抑制できるが、ＴＮＦ－αで誘導される破骨細胞形成は抑制されない。その一方で、本発明における抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体によって、ＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成とＴＮＦ－αで誘導される破骨細胞形成の両方が効果的に抑制された。したがって、本発明の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体によって、ＲＡなどにおけるＴＮＦ－αで誘導される骨喪失と骨破壊が、ＲＡＮＫＬブロッカー（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、抗ＲＡＮＫＬ抗体など）以上に強力に抑制できることが期待される。
　抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体は、一つの例としては、骨代謝異常の治療又は予防に対しては該抗体単独で、あるいは少なくとも一つの他の骨疾患治療剤と併用して投与することができる。また一つの例として、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体は治療上有効な量の抗骨代謝異常治療薬剤と併用して投与することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体と併用して投与できる他の治療剤としては、ビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ、ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ、ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ、ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ、ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、又はｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ又はｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト（例えばａｎａｋｉｎｒａ）、抗ＩＬ－６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。骨代謝異常の状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３あるいはそれ以上の種類の他の治療剤を投与することもできるし、それらの他の治療剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することができる。他の治療剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に投与することもできる。また、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体と他の治療剤を別々の製剤に封入して同時に投与することもできる。さらに、他の治療剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を相前後して別々に投与することもできる。すなわち、他の治療剤を投与した後に抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与するか、あるいは抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体又は該抗体の抗原結合断片を有効成分として含有する治療剤を投与した後に他の治療剤を投与しても良い。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の骨疾患治療剤の遺伝子と抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の遺伝子は、別々のあるいは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々のあるいは、同じベクターに導入することができる。
　抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体、あるいはそのフラグメントに対し骨疾患治療剤を結合させることにより、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１－２１６記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、破骨細胞の認識性を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等のフラグメントを例として挙げることができ、本発明においても同様に、抗体及び該フラグメントを使用することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体又は該抗体のフラグメントと骨疾患治療剤との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｒｕｇ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　（２００１）５３，１７１－２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体と骨疾患治療剤が化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソームや水溶性高分子を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、抗体と骨疾患治療剤とがリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、及び、骨疾患治療剤が水溶性高分子（分子量１０００乃至１０万程度の化合物）に化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又は該フラグメント）と骨疾患治療剤、リポソーム及び水溶性高分子等の薬物担体との結合は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ．　Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９５）１２２，　５５－１２３に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤のリポソームへの包含は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ｔｏ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｂ．Ｖ．，　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤の水溶性高分子への結合は、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｄ　Ｊ　Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５－１２３記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又は該フラグメント）と蛋白質性の骨疾患治療剤（又は該フラグメント）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
　本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
　本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体と治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも一つの骨疾患治療剤と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。骨疾患治療剤としては、ビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ、ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ、ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ、ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ、ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、又はｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ又はｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト（例えばａｎａｋｉｎｒａ）、抗ＩＬ－６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片（例えば、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。
　本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体の重量に対して０．０１～１００倍、特に０．１～１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
　医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐＨ７．０－８．５のＴｒｉｓバッファー、ｐＨ４．０－５．５の酢酸バッファー、ｐＨ３．０－６．２のクエン酸バッファーを含むことができる。また、これらのバッファーにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体及び少なくとも一つの骨疾患治療剤を含む医薬組成物を挙げることができ、本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体及び少なくとも一つの骨代謝異常治療薬剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
　本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体のＳｉｇｌｅｃ－１５に対する親和性、即ち、Ｓｉｇｌｅｃ－１５に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１～１００ｍｇ／ｋｇを１～１８０日間に１回投与すればよい。
　本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
 
実施例
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
参考例１
　ヒト化＃３２Ａ１抗体Ｋ３－１１１５の遺伝子の作製
本明細書では、比較試験の対照となる抗体として国際公開第ＷＯ２０１０／１１７０１１号パンフレットに記載のｈ＃３２Ａ１－Ｈ１－１／Ｌ２－１５を使用した。抗体遺伝子は、国際公開第ＷＯ２０１０／１１７０１１号パンフレットに従って作製することが可能である。なお、本明細書においては前記のｈ＃３２Ａ１－Ｈ１－１／Ｌ２－１５抗体を「Ｋ３－１１１５」あるいは「Ｋ３－１１１５抗体」と呼称している。
Ｋ３－１１１５重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に記載されている。配列番号２のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に記載されている。配列番号１のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１のヌクレオチド配列及び配列番号２のアミノ酸配列は、図１にも記載されている。
Ｋ３－１１１５軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４に記載されている。配列番号４のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３に記載されている。配列番号３のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３のヌクレオチド配列及び配列番号４のアミノ酸配列は、図２にも記載されている。
　Ｋ３－１１１５の遺伝子へのＴ１０３Ｅ変異の導入（発現コンストラクトの作製）
Ｓｉｇｌｅｃ－１５は塩基性の蛋白質であり、アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸残基の抗体配列への導入により、抗原－抗体間でイオン結合が形成されて結合能が向上することが期待される。抗体の認識部位で最も重要と考えられるＣＤＲＨ３ループの中央に位置し、Ｘ線結晶構造解析により抗原側に向いていると予想されるスレオニン残基に酸性アミノ酸で側鎖の長いグルタミン酸残基を導入する置換体を設計した。置換を導入する重鎖配列としてＫ３－１１１５重鎖を選択し、Ｋ３－１１１５重鎖配列のＣＤＲＨ３配列の３番目のアミノ酸残基であるスレオニン残基をグルタミン酸残基に置換した重鎖配列を「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ重鎖」と命名した。アミノ酸残基の置換の位置は、シグナル配列を除いたＫ３－１１１５重鎖配列の１０３番目に相当する。なお、「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ重鎖」は「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体重鎖」と呼称されることもある。
国際公開第ＷＯ２０１０／１１７０１１号パンフレットの実施例２８に記載のｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１－Ｈ１－１をテンプレートとして、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と下記のプライマーセットを用いて、キットのマニュアルにしたがって塩基置換を行うことにより、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ重鎖発現ベクターを構築することができる。得られた発現ベクターを「ｐＥＧ２／Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ」と命名した。
塩基置換導入用プライマーセット
５’－ＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣ－３’（３２Ａ１＿ＨＴ１０３ＥＦｗ：配列表の配列番号１５）
５’－ＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧ－３’（３２Ａ１＿ＨＴ１０３ＥＲｖ：配列表の配列番号１６）
 
Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６に記載されている。配列番号６のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５に記載されている。配列番号５のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５のヌクレオチド配列及び配列番号６のアミノ酸配列は、図３にも記載されている。
　Ｋ３－１１１５抗体及びＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の調製
２－１) Ｋ３－１１１５抗体及びＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の生産
以下の方法あるいはこれに準じた方法によって、抗体の生産を行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ　Ｆｅｒｎｂａｃｈ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して１．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで一時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　＃２４７６５）３．６ｍｇをＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ　Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製した重鎖発現ベクター（０．４ｍｇ）及び軽鎖発現ベクター（０．８ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　（Ａｄｖａｎｔｅｃ　＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過した。
　上記の培養において、国際公開第ＷＯ２０１０／１１７０１１号パンフレットに記載の重鎖発現ベクターｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１－Ｈ１－１及び軽鎖発現ベクターｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１－Ｌ２－１５を組み合わせることによって、Ｋ３－１１１５抗体を作製することが可能である。
また、実施例１で作製された重鎖発現ベクターｐＥＧ２／Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ及び国際公開第ＷＯ２０１０／１１７０１１号パンフレットに記載の軽鎖発現ベクターｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１－Ｌ２－１５を組み合わせることによって、ラット抗ヒトＳｉｇｌｅｃ－１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の１アミノ酸残基置換体を作製することが可能である。前記の１アミノ酸残基置換体を「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ」と命名した。本明細書では「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ」は、「Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体」と呼称されることもある。上記の抗体の調製法で述べたように、Ｋ３－１１１５抗体及びＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の軽鎖配列は同一である。すなわち、Ｋ３－１１１５抗体及びＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の間では、重鎖のＣＤＲＨ３中の１アミノ酸残基のみ異なっている。
 
２－２）Ｋ３－１１１５及びＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の精製
　Ｋ３－１１１５及びＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体は、以下の方法あるいはこれに準じた方法によって精製された。
　上記２－１）で得られた培養上清を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（４－６℃下）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温下）の２段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清１１００－１２００ｍｌを、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム：容積１ｍｌ×２連結）にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ１５－３０ｍｌでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム：容積５ｍｌ×２連結）で５ｍＭ　リン酸ナトリウム／５０ｍＭ　ＭＥＳ／２０ｍＭ　ＮａＣｌ／ｐＨ６．５のバッファーへ置換を行った。さらにその置換した抗体溶液を、５ｍＭ　ＮａＰｉ／５０ｍＭ　ＭＥＳ／２０ｍＭ　ＮａＣｌ／ｐＨ６．５のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシルアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　ＣＨＴ２－１　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｃｏｌｕｍｎ：容積２ｍｌ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム：容積５ｍｌｘ２連結）でＣＢＳ（１０ｍＭクエン酸緩衝液／１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）への液置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量３０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を１．０ｍｇ／ｍｌ以上に調製し精製サンプルとした。
　Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体のヒトＳｉｇｌｅｃ－１５蛋白質に対する結合性評価
３－１）ヒトＳｉｇｌｅｃ－１５ Ｖ－ｓｅｔドメインの発現精製
　ヒトＳｉｇｌｅｃ－１５　Ｖ－ｓｅｔドメイン（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿９９８７６７のアミノ酸配列の３９乃至１６５番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド）のＮ末端側にＨｉｓタグ、および、ＦａｃｔｏｒＸａ認識配列を連結させた蛋白をコードするＤＮＡをベクターｐＤＥＳＴ１４（インビトロジェン社、カタログ番号：１１８０１－０１６）に組み込んだ。このプラスミドを用いて、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（ノバジェン社、カタログ番号：７１１３６－４）を形質転換し、ＴＢ培地（インビトロジェン社、カタログ番号：２２７１１－０２２）で培養した。培養後、超音波破砕した菌体を遠心分離し、上清をＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７－５２４７－０１）で精製した。その後、ＦａｃｔｏｒＸａ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ社、カタログ番号Ｐ８０１０Ｌ）でＨｉｓタグを切断後、Ｍｏｎｏ　Ｓ５／５０　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７－５１６８－０１）、さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０/３００カラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７－５１７４－０１）を用いて、電気泳動で分子量１４ｋＤａの単一バンドになるまでヒトＳｉｇｌｅｃ－１５　Ｖ－ｓｅｔドメインを精製した。
 
３－２）Ｋ３－１１１５又はＫ３－１１１５／Ｔ１０３ＥのヒトＳｉｇｌｅｃ－１５ Ｖ－ｓｅｔドメインとの解離定数の測定
Ｋ３－１１１５又はＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体とｈＳｉｇｌｅｃ－１５（３９ー１６５）Ｖ－ｓｅｔドメインの解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を使用し、抗体をリガンドとして固定化し、抗原をアナライトとして測定した。Ｋ３－１１１５又はＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体は、アミンカップリング法にてセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））へ固定化した抗ヒトＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株））を介し、約５０ＲＵを結合させた。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０）を用いた。抗体を結合したチップ上に、抗原の希釈系列溶液（０．００３-７ｎＭ）を流速９０μｌ／分で２３３秒間添加し、引き続き２０００～３６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ　ＭｇＣｌ２を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋｏｎ、解離速度定数ｋｏｆｆ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を算出した。その結果、Ｋ３－１１１５のＫＤ値は２．６Ｅ－１０［Ｍ］、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３ＥのＫＤ値は４．１Ｅ－１２［Ｍ］であり、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅにおける１アミノ酸残基の置換によって、Ｋ３－１１１５と比較して親和性が約６０倍増強されることが明らかとなった。なお、Ｋ３－１１１５の１アミノ酸置換体として１２１種の抗体が実施例２の方法又はこれに準じた方法によって作製され、実施例３の方法又はこれに準じた方法に従ってヒトＳｉｇｌｅｃ－１５蛋白質に対する結合性評価が行われた。これらの１２１種の置換体において、ヒトＳｉｇｌｅｃ－１５蛋白質に対してＫ３－１１１５より強い親和性を示す抗体は６種類存在し、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅは最も高い親和性を示した。
　Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体によるマウス破骨細胞形成に対する影響
５～８週齢の雄ｄｄＹマウスより大腿骨と脛骨を摘出し、軟組織を除去する。この大腿骨あるいは脛骨の両端を切り落とし、２５ゲージの注射針付きシリンジによりＤ－ＰＢＳを注入して骨髄細胞を押し出して、遠心チューブに回収する。室温で１００ｇ、５分間遠心して上清を捨てた後に、細胞のペレットにＨｅｍｏｌｙｔｉｃ　Ｂｕｆｆｅｒ　１ｍｌ（ＲＥＤ　ＢＬＯＯＤ　ＣＥＬＬ　ＬＹＳＩＮＧ　ＢＵＦＦＥＲ、シグマ社製）を加えて懸濁し、室温で５分間放置する。２０ｍｌのＤ－ＰＢＳを加えて室温で１００ｇ，５分間遠心し、上清を捨てた後に細胞のペレットに５ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭＥＭ－α培地（インビトロジェン社製）１０ｍｌを加えて懸濁し、セルストレイナー（４０μｍ　Ｎｙｌｏｎ、ＢＤファルコン社製）を通して凝集物を除く。この細胞を７５ｃｍ２－Ｔ　フラスコ（付着細胞用）に移して、ＣＯ２インキュベーター中で１晩培養する。１晩培養後、Ｔ－フラスコに付着していない細胞を回収して、マウス骨髄非付着細胞として使用する。上記の方法で調製されるマウス骨髄非付着細胞を１０％　ＦＢＳと１０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むα－ＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに調製したものを９６穴プレートの各ウェルに２００μｌ播種して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養する。９６穴プレート中の古い培養液を除去して、ヒトＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫＬ、ぺプロテック社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ－ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した１０％　ＦＢＳ含有ＭＥＭ－α培地１００μｌを添加する。この細胞培養液に、実施例２で調製したＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体を３～１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、更に３日間ＣＯ２インキュベーター中で培養する。培養終了後に、形成された破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を以下の操作で測定する。９６穴プレートの各ウェルの培養液を吸引除去して、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）５０μｌを各ウェルに加え、プレート振とう機で５分間振とうして細胞を可溶化する。これらの各ウェルに基質溶液（５ｍｇ／ｍｌ　ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び０．４６％　酒石酸ナトリウムを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１））５０μｌを加えて室温で１０分間インキュベートする。インキュベート後に９６穴プレートの各ウェルに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μｌを加えて酵素反応を停止させる。酵素反応停止後に各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標とする。抗体非添加時とのＴＲＡＰ活性の比較により、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体のマウス破骨細胞形成抑制効果を評価することができる。
　Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体によるヒト正常破骨細胞の骨吸収活性に対する影響（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ生物活性評価）
　破骨細胞はカテプシンＫなどのプロテアーゼを放出することにより、骨組織の構成成分であるＩ型コラーゲンを分解することが知られている。ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製、カタログ番号　ＰＡ－１５００）は、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングした９６穴プレート（９６－ｗｅｌｌ　ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ）を提供しており、同プレート上で破骨細胞を培養した際に上清に遊離される蛍光コラーゲン断片量を測定することにより、破骨細胞の骨吸収活性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価することが可能である。
　正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ－１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６－ｗｅｌｌ　ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅに１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６３．８ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ－ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ－９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ－８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例２で調製したＫ３－１１１５抗体およびＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体を終濃度０．８、４、２０、１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で５日間培養した。培養上清１０μｌを採取し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔを２００μｌ添加して、蛍光プレートリーダー（ＡＲＶＯ　ＭＸ、パーキンエルマー社製）を用いて蛍光強度を測定（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３４０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１５ｎｍ）することにより、培養上清中に放出された遊離蛍光コラーゲン断片量を定量した（図５）。その結果、遊離コラーゲン断片量が、Ｋ３－１１１５抗体によって、２０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に抑制された。一方、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体添加では、４ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に抑制された。このことから、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体はＫ３－１１１５抗体よりもより低濃度からヒト破骨細胞の骨吸収活性を強く抑制することが明らかとなった。 
　Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の卵巣摘出ラットを用いた生物学的評価
ａ）動物実験のプロトコール
　１２週齢雌性Ｆ３４４ラット（日本チャールス・リバー社より入手）に両側卵巣摘除を施術し、溶媒投与群、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体投与群の２群に分ける。また偽手術群についても１群設定する。抗体を投与する群については、実施例２で調製したＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体を、各１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に週３回、手術翌日から４週間反復投与する。溶媒投与群及び偽手術群には、溶媒として０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを腹腔内に投与する。投与開始４週後に絶食下で２４時間採尿を行い、尿検体は測定まで－８０℃で保存する。採尿終了後にラットを安楽死させ、腰椎を摘出する。
 
ｂ）腰椎骨密度の測定
　摘出した腰椎に付着している軟組織を除去し、第４～６腰椎を切り出す。エタノール中で振とう後に風乾することにより脱脂及び脱水し、骨密度測定装置（ＤＣＳ－６００ＥＸ、アロカ社製）を用いて骨密度を測定する。偽手術群に対し、卵巣摘除群では有意な腰椎骨密度の減少が認められるが、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体投与群では卵巣摘除による骨密度の減少が有意に抑制される。ａ）に記載のプロトコールにＫ３－１１１５を投与する１群を追加すれば、Ｋ３－１１１５とＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅによる骨密度現象に対する抑制効果を比較することができる。
 
ｃ）尿中デオキシピリジノリン排泄量の測定
　Ｉ型コラーゲン架橋の各種代謝産物は骨の代謝回転、特に骨吸収を鋭敏に反映し、なかでもデオキシピリジノリンは主として骨のコラーゲンに局在することから骨吸収の指標として信頼性が高いとされている。
　凍結保存していた尿検体を融解し、遠心操作により不溶物質を沈殿させて上清を得る。この上清中に含まれるデオキシピリジノリン量を、オステオリンクス「ＤＰＤ」（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて測定する。また、クレアチニン－テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて上清中のクレアチニン含量も測定し、クレアチニン補正を行ったデオキシピリジノリン量を算出する。偽手術群に対し、卵巣摘除群では尿中デオキシピリジノリン排泄量が有意に増加することから、卵巣摘除ラットでは破骨細胞による骨吸収が亢進していることが示唆される。一方Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体投与群では、卵巣摘除によるデオキシピリジノリン排泄量の増加が偽手術群と同程度まで抑制される。このことから、Ｓｉｇｌｅｃ－１５に特異的に結合するモノクローナル抗体が破骨細胞の骨吸収を抑制することが動物モデルでも確認され、この骨吸収抑制作用により卵巣摘除ラットの腰椎骨密度減少を抑制したことが強く示唆される。ａ）に記載のプロトコールにＫ３－１１１５を投与する１群を追加すれば、Ｋ３－１１１５とＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅによる骨密度現象に対する抑制効果を比較することができる。
　Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の卵巣摘出サル用いた生物学的評価
Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体の卵巣摘出サルにおける骨吸収活性の抑制効果は、以下に示す方法により評価が可能である。
　７～１５才雌性カニクイザルに両側卵巣摘除を施術し、１ヵ月後に溶媒投与群、Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体投与群に分ける。抗体を投与する群については、実施例２で調製したＫ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体を、０．１～３０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に単回投与する。投与後２ヶ月程度まで経時的に採尿、採血し、尿中および血中における骨代謝マーカーを測定することにより抗体の骨吸収抑制活性を評価する。骨吸収マーカーである尿中Ｎ－ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＮＴＸ）、尿中Ｃ－ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＣＴＸ）、血中ＮＴＸ、血中ＣＴＸ、血中Ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ５ｂ）等や、骨形成マーカーである血中骨型アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）、血中オステオカルシン（ＢＧＰ）、Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｃ-ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｐ１ＮＰ）等を骨代謝マーカーとして挙げることができる。
　本発明のヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体のＣＤＲ改変体は、公知の抗体より強力な破骨細胞の分化又は骨吸収活性の抑制能を有し、該抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体を含む医薬組成物は骨代謝異常疾患の治療又は予防剤となり得る。 
配列番号１：Ｋ３－１１１５抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号２：Ｋ３－１１１５抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号３：Ｋ３－１１１５抗体軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号４：Ｋ３－１１１５抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号５：Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号６：Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号７：＃３２Ａ１抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列
配列番号８：＃３２Ａ１抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（１９アミノ酸残基からなる）
配列番号９：＃３２Ａ１抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（１４アミノ酸残基からなる）
配列番号１０：＃３２Ａ１抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｋ３－１１１５／Ｔ１０３Ｅ抗体のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列
配列番号１２：＃３２Ａ１抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列
配列番号１３：＃３２Ａ１抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列
配列番号１４：＃３２Ａ１抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列
配列番号１５：ＰＣＲプライマー３２Ａ１＿ＨＴ１０３ＥＦｗ
配列番号１６：ＰＣＲプライマー３２Ａ１＿ＨＴ１０３ＥＲｖ

Claims (25)

  1. 重鎖配列が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＨ１は配列番号７に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ２は配列番号９に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＨ３は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなること；及び
    軽鎖配列がＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３を有する可変領域を含み、前記ＣＤＲＬ１は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ２は配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなり、前記ＣＤＲＬ３は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなること；
    を特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  2. 配列番号６に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  3. 配列番号６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  4. 配列番号６に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６５番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項１に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片。
  5. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗体の抗原結合断片。
  6. ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体。
  7. 請求項１乃至６に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
  8. 骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 請求項１乃至６に記載の抗体又は該抗体の抗原結合断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ－６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
  10. 骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
  11. 骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 請求項１乃至６に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は請求項８若しくは９に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
  15. 請求項１乃至６に記載の抗体、該抗体の抗原結合断片、又は請求項８に記載の医薬組成物の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の抗原結合断片、ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ－６レセプター抗体又は該抗体の抗原結合断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の抗原結合断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は相前後してして投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
  16. 骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の治療及び／又は予防方法。
  17. 骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、請求項１６に記載の治療及び／又は予防方法。
  18. 骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする請求項１７に記載の治療及び／又は予防方法。
  19. 請求項１乃至６のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  20. 配列番号５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 配列番号５に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  22. 請求項１９乃至２１に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
  23. 請求項１９乃至２１に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
  24. 請求項２２に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
  25. 請求項２３又は２４に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む請求項１乃至６のいずれか一つに記載の抗体の生産方法。
     
PCT/JP2013/059654 2012-03-30 2013-03-29 ＣＤＲ改変抗Ｓｉｇｌｅｃ－１５抗体 WO2013147213A1 (ja)

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