WO2013118783A1 - 高分子化ニトロキシド化合物と無機粒子の有機－無機ハイブリッド複合体 - Google Patents

高分子化ニトロキシド化合物と無機粒子の有機－無機ハイブリッド複合体 Download PDF

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silica
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長崎　幸夫
池田　豊
徹 吉冨
達也 矢口
真代 山下
モハメド アムラン ホサイン
友貴 吉成
敦志 植田
暁 平山
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国立大学法人筑波大学
国立大学法人筑波技術大学
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Definitions

  • the present invention relates to an organic-inorganic hybrid complex of a polymerized cyclic nitroxide radical compound and silica or magnetic particles and use thereof.
  • ROS reactive oxygen species
  • the present inventors use a self-assembled nanoparticle (Nitroxide radical-containing nanoparticulate: RNP) in which a nitroxide radical, which is a catalytically functioning ROS scavenger, is encapsulated with a polymer chain, and eliminates ROS where necessary.
  • RNP Nonide radical-containing nanoparticulate
  • Nanotherapy has been developed (Patent Document 1). After that, the present inventors, after intravenous administration of such RNP, the blood vessel stays for a long time while forming nanoparticles, and collapses in the tissue where oxidative stress occurs, so that cerebral infarction, myocardial infarction, It has been confirmed that it has a high therapeutic effect on acute renal failure, and is disclosed in the patent application specification, although it has not been disclosed yet.
  • the present inventors use a self-organized nanoparticle (RNP) encapsulating a catalytically functioning ROS scavenger nitroxide radical, and erase the ROS where necessary.
  • RNP self-organized nanoparticle
  • a new nanotherapy has been developed (Patent Document 1).
  • medical agents including such RNP and a low molecular antioxidant was also provided (patent document 2). This document also describes that the composition can be used as a pharmaceutical preparation for oral administration, but does not disclose any results of actual oral administration.
  • a cation-charged RNP itself or a conjugate in which an anionic drug is encapsulated in the RNP using cation chargeability forms a polymer micelle in an aqueous medium
  • cation chargeability forms a polymer micelle in an aqueous medium
  • It stays in the blood vessel for a long time with nanoparticles formed, but it is high for cerebral infarction, myocardial infarction / acute renal failure, and other diseases due to the collapse of micelles or particles in tissues where oxidative stress occurs
  • the present inventors have also confirmed that it has a therapeutic effect (see Patent Document 1 for a part, and a patent application that is currently unpublished for a part).
  • a material or complex as described above can be provided, for example, the construction of a system capable of efficiently delivering a drug to the intestine without the drug being stably present in the RNP in the stomach in an acidic environment and not being digested. It will be possible.
  • peritoneal dialysis is one of the methods for treating patients with renal insufficiency, which has been in an aging society and whose renal function is reduced due to various diseases.
  • This method is used together with hemodialysis that uses a dialyzer to purify blood by extracorporeal circulation.
  • the former is easy to return to society and protects the residual kidney function, but it does not solve the problems of complicated dialysate replacement and peritoneal sclerosis.
  • the utilization rate is still lower than the latter.
  • RNP in which magnetic nanoparticles are effectively encapsulated does not adversely affect the antioxidant action of the polymerized cyclic nitroxide radical compound, which is another constituent element of RNP.
  • it may be used in magnetic hyperthermia, and may be a base for isolation (screening) and cell separation of specific biomolecules.
  • silica or magnetic particles can be efficiently encapsulated in RNP or polymer micelles, or silica or magnetic particles can be made of a polymerized cyclic nitroxide radical compound. It has been found that it can be coated. Furthermore, RNP or polymer micelles that contain such inorganic particles are more physiological than those that do not contain inorganic particles, especially in certain RNPs, even in an acidic environment at pH 3, for example. The micelle state or particle state is stably maintained. Moreover, it has also been found that particles in such a state that a drug is further contained in RNP are stable in a physiological environment. In addition, it was also confirmed that RNP encapsulating silica significantly suppressed peritoneal deterioration when administered to the peritoneum of a peritoneal inflammation model rat.
  • organic-inorganic hybrid composite wherein the organic component is a block copolymer represented by the following general formula (I), and the inorganic component is selected from the group consisting of silica and magnetic nanoparticles.
  • a composite is provided that is a particle.
  • PEG-CNR (I) Where PEG is a segment containing poly (ethylene glycol); A CNR is a repeating comprising as part of a pendant group a cyclic nitroxide radical attached to the polymer backbone via a linking group, preferably a linking group having at least one imino (—NH—) or oxy (—O—). A polymer segment containing units.
  • the average particle size is generally 3 nm to Preferred examples include those present as particles of 1 mm, preferably 5 nm to 500 nm, more preferably 5 nm to 100 nm, and even more preferably 10 nm to 50 nm.
  • Such composites are not limited, but are suitable for use in vivo when referred to as so-called nanoparticles with a size in the nm range, while inorganic particles are particularly suitable.
  • the composite of the present invention is not nanoparticles but has an average particle size of 500 nm to 1 mm, preferably 1 ⁇ m to 500 ⁇ m. More preferably, the particles may be 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, and even more preferably 1 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • a peritoneal dialysis solution containing at least the complex and a pharmaceutically acceptable diluent or carrier as an active ingredient is provided.
  • the complex further including an anionic drug is provided.
  • the RNP formed from the organic-inorganic composite can disperse and hold the particles uniformly in the body fluid by encapsulating the inorganic particles in the RNP, and the action of the encapsulated inorganic particles.
  • the block copolymer represented by the above general formula (I) contains at least one imino as a linking group and the inorganic nanoparticles are silica, even in the body fluid exhibiting acidity for a certain period of time.
  • the shape of the RNP particles can be stably maintained, and further, other drugs can be stably encapsulated in the RNP at a high concentration.
  • the size and shape of the inorganic particles may vary depending on the intended use of the organic-inorganic composite to be provided, but the size is intended to be a particle having an average diameter in the range of several nanometers to several millimeters. .
  • silica particles are commercially available as SNOWTEX O or MEK-ST or methanol silica sol from the supplier, Nissan Chemical, and can be used as they are or after purification if necessary. Can be included in the complex.
  • the shape of such inorganic particles is not limited, but may be a sphere, a cube, a rectangular parallelepiped, an 8-16 polyhedron, or the like. The particle size of such particles is displayed as a value when converted to a sphere.
  • the magnetic nanoparticles are not limited, but are preferably used or proposed to be used in the art for bio-medical magnetic nanoparticles or bio-separation, Further, magnetite (Fe 3 O 4 ), magnethemite ( ⁇ -Fe 2 O 3 ), or an intermediate thereof, which is available from the supplier, JSR Life Science Co., Ltd., can be used. Furthermore, the magnetic nanoparticles can be specifically FePt (the average content of Fe is preferably 35 atoms or more) nanoparticles (see, for example, JP 2009-57609 A).
  • the early composite can include one or more magnetic particles selected from the group consisting of Fe 3 O 4 , ⁇ -Fe 2 O 3 , and FePt.
  • the cyclic nitroxide radical is a linking group such as o- or p-phenylene-C 1-6 alkylene-NH— (C 1-6 alkylene) q — or o- or p-phenylene-C 1-6 alkylene-O— (C 1-6 alkylene) q — (where q is an integer 0 or 1, preferably 0) to the polymer backbone.
  • the cyclic nitroxide radical is 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine-1-oxyl-3- Yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4 4-trimethyl-1,3-thiazolidin-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl - selected from the group consisting of imidazoline-3-oxyl-2-yl.
  • the polymer main chain is derived from a polymerizable unsaturated double bond, and the unbonded end of phenylene is bonded to the main chain. With respect to the structure of such a polymer main chain, the description of Patent Document 1 can be referred to (Patent Document 1 is incorporated by reference into the contents of this specification).
  • block copolymer represented by the general formula (I) include those represented by the general formula (II)
  • A represents unsubstituted or substituted C 1 -C 12 alkoxy, and when substituted, the substituent is a formyl group
  • the formula R 1 R 2 CH— (wherein R 1 and R 2 are independently C 1 -C 4 alkoxy or R 1 and R 2 are -OCH 2 CH 2 O together -, - O (CH 2) 3 O- or a group of -O (CH 2) represents a 4 O-).
  • L 1 is selected from the group consisting of a single bond, — (CH 2 ) c S—, —CO (CH 2 ) c S—, wherein c is an integer of 1 to 5, L 2 is —C 1-6 alkylene-NH— (C 1-6 alkylene) q — or —C 1-6 alkylene-O— (C 1-6 alkylene) q —, where q is 0 or
  • R is 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-yl, 2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl-3-yl, 2, 2,5,5-tetramethylpyrrolin-1-oxyl-3-yl and 2,4,4-trimethyl-1,3-oxazolidine-3-oxyl-2-yl, 2,4,4-trimethyl-1, Represents a residue of a cyclic nitroxide radical compound selected from the group consisting of 3-thiazolidine-3-oxyl-2-yl and 2,4,4-trimethyl
  • R ′ is a methyl group.
  • the group represented by these can be mentioned.
  • the organic-inorganic hybrid composite may be formed by simply mixing inorganic particles and the above block copolymer in a powdered state at room temperature to 90 ° C.
  • the complex is buffered or unbuffered, and if necessary, a water-soluble organic solvent such as dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylacetamide, methanol, ethanol. It can produce
  • Such composites can also be provided as particles or polymeric micelles formed through self-assembly during their preparation. Also, the particles or polymer micelles thus formed can be provided as a dried product, preferably a lyophilized product.
  • the particle size of the particles depends on the size of the inorganic particles used as the starting material, but in general, the starting inorganic particles can have an average diameter in the range of several nanometers to several millimeters. Is in the range of 3 nm to 1 mm, generally 3 nm to 500 ⁇ m, preferably 5 nm to 100 nm, more preferably 5 nm to 80 nm, particularly preferably 10 nm to 50 nm.
  • the inorganic particles are magnetic particles
  • particles having an average particle diameter of 500 nm to 1 mm, preferably 1 ⁇ m to 500 nm, more preferably 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, and still more preferably 1 ⁇ m to 50 ⁇ m can be used.
  • the particle size means a value that can be confirmed by performing dynamic light scattering (DLS) measurement of composite particles dissolved or dispersed in an aqueous medium.
  • DLS dynamic light scattering
  • the content ratio of the composite inorganic particles and the block copolymer is not limited as long as the composite particles can be observed in the aqueous medium as having the above particle diameter. Therefore, a person skilled in the art will select the above-mentioned content ratio according to the method for producing composite particles described below, try to form composite particles, and measure their dynamic light scattering. A suitable content ratio can be selected.
  • the present invention is not limited thereto, and the poly (ethylene glycol) segment represented by the general formula (II) is 20 to 5,000 and n is 3 to 1,000.
  • the weight ratio (polymer: silica particles) is 100: 5 to 100: 300, preferably 100: 10 to 100: 200, more preferably Can be between 100: 20 and 100: 100.
  • the content ratio of the inorganic nanoparticles to the block copolymer in the composite is: It can be 1: 10000, preferably 1: 1000, more preferably 1; 100.
  • the self-assembly of the block copolymer and the inorganic particles contained in the aqueous medium is conveniently performed by using a block copolymer (PEG-b-PMNT) as necessary, as shown in the conceptual diagram of the method for preparing silica-encapsulated RNP in FIG. After dissolving in an aqueous medium adjusted to acidic (pH 1 to 5), if necessary, it can be deprotonated by adjusting to weakly acidic-alkaline (pH 6 to 10) and stirred, and then allowed to proceed.
  • a block copolymer PEG-b-PMNT
  • the block copolymer is dissolved in a water-soluble organic solvent (for example, DMF), inorganic particles are added, and the mixture thus produced is dialyzed against distilled water through a dialysis membrane. Can be made.
  • a water-soluble organic solvent for example, DMF
  • inorganic particles are added, and the mixture thus produced is dialyzed against distilled water through a dialysis membrane.
  • the composite particles formed in this way are those in which the inorganic particles are encapsulated in RNP or polymer micelles or coated with a block copolymer.
  • DMF water-soluble organic solvent
  • the organic-inorganic hybrid composite (or inorganic particle-encapsulating RNP) provided in this way can be uniformly dispersed in the body fluid and can stably maintain the particle form.
  • the RNP particularly when the inorganic particles are silica and the linking group of the block copolymer contains imino (-NH-), the RNP is at least several tens of minutes even in a low pH acidic environment such as gastric juice. Maintains particle morphology stably.
  • terms such as body fluid, in vivo, physiological, and physiological as used herein are intended for use with mammals such as humans.
  • silica-encapsulated RNP When such a silica-encapsulated RNP is produced by using the latter dialysis method of the above-described method, it is possible to further contain various agents, preferably anionic or hydrophobic agents, in the solution before dialysis.
  • the drug can be contained or encapsulated in the encapsulated RNP.
  • medical agent can be included or included in silica inclusion RNP by adding them to the solution or dispersion liquid in the aqueous medium of silica inclusion RNP prepared beforehand, and stirring and mixing.
  • the silica and drug-encapsulating RNP formed in this way also stably maintain the particle form for at least several tens of minutes in a low pH acidic environment such as gastric juice.
  • RNP when the inorganic nanoparticles are magnetic particles and the linking group of the block copolymer contains imino (-NH-) is stable for a certain period of time even in an in vivo acidic environment, like the silica-encapsulated RNP. Retain form.
  • silica encapsulated RNP contains glucose, sodium, magnesium, calcium, lactic acid, etc., which are commonly used in the art, and stably forms particles even in peritoneal dialysis fluids at low pH (acidic). Hold.
  • the dialysate bag into two chambers and mixing them immediately before use, even in physiologically friendly peritoneal dialysate with a neutral pH (6.3 to 7.3), the silica-encapsulated RNP is stable. It is possible to maintain the form (sometimes referred to as Si-RNP).
  • silica-encapsulated RNPs improve the dialysis efficiency so that it can be understood that the wastes that have exuded outside the body through the peritoneum are adsorbed to the silica. Therefore, degradation of the peritoneum, which has been a problem in the past, can be suppressed by including silica-encapsulated RNP in the conventionally used peritoneal dialysis fluid.
  • the peritoneal dialysis solution has been proposed more recently (for example, an icodextrin-containing peritoneum containing icosadextrin instead of glucose). Dialysate and the like) are also included in the peritoneal dialysate referred to in the present invention.
  • silica and drug-encapsulating RNP also stably maintain the particle form for at least several tens of minutes in a low pH acidic environment such as gastric juice. Therefore, the silica and drug-encapsulating RNP can be conveniently used in order to efficiently deliver the drug to the intestine after passing through the stomach after oral administration.
  • rebamipide which is a gastrointestinal drug
  • the particle form of RNP in the stomach can be maintained stably for a certain time, so that the sustained release of the drug in the gastrointestinal tract is improved. Can be achieved.
  • an RNP which is an anionic drug and is encapsulated with silica for delivery to the intestine by oral administration.
  • drugs include, but are not limited to, degafur uracil, krestin, leucovorin, acetaminophen, cyclophosphamide, melphalan, cytarabine ocphosphat, tegafur uracil, tegafur guineastat and otastat potassium , Doxyfluridine, hydroxycarbamide, methotrexate, mercaptopurine, etoposide, anastrozole, tamoxifen citrate, toremifene citrate, bicalutamide, flutamide, estramustine phosphate, meloxicam, etodolac, piroxicam, ampiroxicam, lornoxicam, mofezosil farnesil , Indomethacin, clinda, fenbufen, di
  • the RNP may exist in the form of self-assembled particles as described above, for example, in an aqueous medium.
  • the solid preparation may contain the RNP in any state, but it is preferable to include a self-assembled particle once formed in an aqueous medium and then dried by lyophilization or the like.
  • Such pharmaceutical preparations may contain diluents, excipients (or carriers) and additives well known in the art as long as the purpose of the present invention is met, but should be the lyophilizate itself. You can also.
  • the pharmaceutical preparation is, for example, a preparation for oral administration and is a solid, the polymer cyclic nitroxide radical compound is converted into sucrose, lactose, mannitol, cellulose, trehalose, maltitol, dextran, starch, agar, gelatin, casein, It can be included in one or more combinations selected from albumin, glycerides and the like.
  • inert diluents such as magnesium stearate, parabens, sorbic acid, preservatives such as ⁇ -tocopherol, antioxidants such as cysteine, disintegrants, binders, buffers, Sweeteners and the like can also be included.
  • lubricants such as magnesium stearate, parabens, sorbic acid, preservatives such as ⁇ -tocopherol, antioxidants such as cysteine, disintegrants, binders, buffers, Sweeteners and the like can also be included.
  • Liquid preparations for oral administration include physiologically acceptable emulsions, syrups, elixirs, suspensions and solution preparations. These formulations may contain a commonly used inert diluent such as water. Such an aqueous solution may contain the above-mentioned sugars and polyethylene glycol having a molecular weight of about 200 to 100,000.
  • the above preparation can be liquid or semi-liquid at the time of use or from the beginning.
  • a physiological saline, buffered physiological saline, sterile water, etc. as a diluent
  • parenterally It can also be a formulation.
  • the conceptual diagram of silica inclusion RNP preparation of this invention The graph showing the DLS measurement result of the nanoparticle obtained in manufacture example 1.
  • FIG. The graph showing the uptake
  • FIG. SiO 2 —RNP1 is the result for particles made using TEOS
  • SiO 2 —RNP 2 is the result for particles made using commercially available silica particles.
  • FIG. The graph showing the result of having analyzed the repamipide content of the repamipide inclusion particle produced in manufacture example 4 by test 1.
  • the black triangle curve is the result of the silica content of 8.5 wt% per polymer weight
  • the black circle curve is the result of the silica content of 0 wt% per polymer weight.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of a blood uptake inhibition test after intraperitoneal administration of Si-RNP according to Test Example 5.
  • the graph which shows the therapeutic effect of RNP using the peritoneal sclerosis model animal by the test example 6.
  • FIG. 6 is a graph showing the amount of PEG-b-PMNT in which the magnetic particles obtained in Production Example 5 are modified.
  • the polymerized nitroxide radical compound was prepared according to Production Examples 2 and 4 of the above-mentioned Patent Document 1 (the contents of which are incorporated herein by reference).
  • An example using nanoparticles from PEG-b-PCMS-N-TEMPO or PEG-b-PMNT (hereinafter also referred to as nRNP) will be described.
  • the values of m and n related to the molecular weight and the values of nm and ⁇ m related to the particle diameter described in the examples are average values.
  • Production Example 1 Method for preparing silica-containing nitroxide radical-containing nanoparticles (Si-nRNP) (Part 1) Amphiphilic block polymer: PEG-b-PMNT (corresponding to m in the formula below being about 100 and n being about 20. M part Mn is 4600, PCMS Mn from 3,300 Silica nanoparticles (10 nm, 0.5 mg) were added to an aqueous solution (converted) (5 mg / mL, 1 mL, pH 3) and stirred at room temperature. Next, silica-encapsulated nitroxide radical-containing nanoparticles (Si-nRNP) were prepared by adding sodium hydroxide to adjust the pH to 9 (see FIG. 1).
  • Amphiphilic block polymer PEG-b-PMNT (corresponding to m in the formula below being about 100 and n being about 20. M part Mn is 4600, PCMS Mn from 3,300 Silica nanoparticles (10 nm, 0.5 mg) were added to an aque
  • Production Example 2 Preparation method of silica-containing nitroxide radical-containing nanoparticles (Si-nRNP) (Part 2) 2 mL of DMF passed through a 0.2 ⁇ m syringe filter and 10 mg of amphiphilic block polymer polymer: PEG-b-PMNT were put into a screw, and heat was applied using a drier to completely dissolve the polymer. Further, a predetermined amount of silica nanoparticles (Nissan Chemical, MEK-ST, 10-15 nm, 2.1-15.5 mg) was added to the screw tube.
  • Si-nRNP silica-containing nitroxide radical-containing nanoparticles
  • the DMF solution of the polymer was transferred with a Pasteur pipette to a dialysis membrane having a molecular weight cut off of 3500, which had been soaked and swollen in advance, and dialyzed against 2 L of distilled water. Distilled water was exchanged every few hours and dialyzed for 24 hours. Distilled water was added to the collected solution to make a total volume of 6.5 mL. Sodium chloride was added to this solution at a concentration of 10 mg / ml, and then passed through a 0.2 ⁇ m syringe filter to remove unencapsulated silica particles. The amount of silica encapsulated was determined by silicon (Si) using a plasma emission spectrometer. The results are shown in Table 1 below.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • nRNP nRNP (20 mg / mL) aqueous solution
  • Production Example 4 Encapsulation of rebamipide, a drug with anti-inflammatory action on silica-encapsulated nanoparticles
  • silica-encapsulated nanoparticles with different silica contents (silica content 0 wt%, 11 wt%, 14 wt%, 36 wt%, 88 wt% / polymer weight) 1 mL of each was transferred to a microtube, 3 mg of rebamipide was added, and the mixture was stirred at room temperature at 500 rpm with a stirrer for 24 hours. After stirring, a 0.2 ⁇ m syringe filter was passed to remove unencapsulated rebamipide.
  • silica content and particle size before and after the rebamipide encapsulation operation are summarized in Table 2 below.
  • PDI represents the particle size polydispersity
  • Test Example 1 Analyzing the rebamipide content of the prepared repamipide-encapsulated particles The remamipide content of the produced repamipide-encapsulated particles was analyzed by measuring an absorption spectrum at 330 nm, which is the absorption maximum wavelength of rebamipide. The result is shown in FIG.
  • FIG. 5 confirms that nanoparticles containing silica can contain more rebamipide than nanoparticles not containing silica.
  • Test Example 2 Stability of Nanoparticles Encapsulating Drug under Acidic Conditions
  • Nanoparticles encapsulating rebamipide of Production Example 4 above (containing 8.5 wt% silica per polymer weight) as a drug under acidic conditions
  • the change in scattering intensity at pH 3 was measured.
  • 350 ⁇ L of deionized water and 40 ⁇ L of buffer solution (pH 3) were added and stirred by pipetting, and then 10 ⁇ L of the sample was added and the scattering intensity was measured.
  • the measurement was set to the conditions of measuring once per minute, the measurement was started 4 minutes after adjusting to pH 3, and the scattering intensity was measured continuously for 15 minutes. The results are shown in FIG.
  • Test example 3 Release behavior of encapsulated drug when the nanoparticles are left under acidic conditions
  • Encapsulation when nanoparticles (same as Test 2 above) are left for 20 minutes under acidic conditions at pH 3
  • the release behavior of the drug rebamipide was evaluated. If the nanoparticles disintegrate under acidic conditions and rebamipide is released, it can be removed by passing through a 0.2 ⁇ m syringe filter.
  • the amount of rebamipide released was measured by measuring the amount of rebamipide contained in the acid particles under the condition of pH 7 and measuring the absorption as the standard of rebamipide inclusion amount (100%). Asked. The result is shown in FIG.
  • nanoparticles containing silica can stably encapsulate drugs under acidic conditions compared to nanoparticles not containing silica.
  • Test Example 4 Testing of urea adsorption ability of silica-encapsulated nanoparticles As a peritoneal dialysis model, commercially available dialysate (Die annealing-NPD4, Baxter, component (w / v%) glucose 1.36 calcium chloride 0.
  • Test Example 5 Blood uptake suppression test after intraperitoneal administration of Si-nRNP Usually, a low molecular weight compound is taken into the blood after being administered intraperitoneally, and there is a concern that it may diffuse throughout the body.
  • FIG. 9 shows the results of measuring the electron spin resonance (ESR) signal in the blood after actually administering the low molecular compound TEMPO intraperitoneally. From FIG. 9, it is clear that the drug is present in the blood for over an hour.
  • Administration of high concentrations of low molecular weight TEMPO compounds causes side effects such as lowering blood pressure and inhibiting the mitochondrial energy transfer system.
  • silica-encapsulated RNP (Si-nRNP) does not permeate from the peritoneum at all, it was confirmed that there was no migration into blood. This is data that is expected to be an extremely safe peritoneal dialysis solution without concern for systemic toxicity.
  • Test Example 6 Therapeutic effect of Si-nRNP using a peritoneal sclerosis model animal
  • Peritoneal sclerosis model rats were treated with 0.1% (v / v) glucone chlorohexidine (Chlorhexidine gluconate) intraperitoneally every day for one week. Prepared by administration.
  • physiological saline (Saline), Si-nRNP, or low-molecular compound TEMPOL was simultaneously administered daily for one week, and its peritoneal deterioration inhibitory effect was examined by quantifying the amount of superoxide produced by peritoneal inflammation. The results are shown in FIG.
  • PEG-b-PMNT was dissolved by adding 10 ⁇ L of 0.1 M HCl to PEG-b-PMNT, and 3 ⁇ L (90 ⁇ g, 22. 5 mol carboxyl group) and pH 7.4 phosphate buffer (240 mL) was added, and the pH was measured. The pH was adjusted to 7.4 using 0.1 M NaOH and 0.1 M HCl and stirred for about 24 hours, after which unadsorbed PEG-b-PMNT not adsorbed on the magnetic particle surface was removed.
  • PEG-b-PMNT-modified magnetic particles Fe-nRNP
  • Fe-nRNP PEG-b-PMNT-modified magnetic particles
  • the organic-inorganic hybrid complex of the present invention can improve the properties of peritoneal dialysis fluid per se, and further contains other drugs and is a carrier for delivering the drug to the intestine by oral administration.

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Abstract

　高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物と無機ナノ粒子の有機－無機ハイブリッド複合体が提供される。かような複合体は、例えば、胃液中で安定なナノ粒子の形態を保持でき、それ自体または他の薬剤を腸にデリバリーする担体として使用できる。

Description

高分子化ニトロキシド化合物と無機粒子の有機－無機ハイブリッド複合体
　本発明は、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物とシリカまたは磁性粒子の有機－無機ハイブリッド複合体およびその使用に関する。
　近年、不規則な生活習慣・老化・社会的ストレスなどによっても生体内で過剰に活性酸素種（ＲＯＳ）が産生し、さまざまな慢性疾病（動脈硬化症や糖尿病など）や難治性疾患（アルツハイマーやパーキンソン病など）をもたらすことが明らかとなっている。また、ＲＯＳは、通常、生体内では酸化－抗酸化（レドックス）のバランスを厳密に調節しているが、このＲＯＳが過剰に生成されると、酸化－抗酸化因子のバランスが酸化の方向に傾く。これまでに各種抗酸化剤を用いた慢性疾患の予防について検討がなされてきたものの、低分子抗酸化剤の例では、それらの高濃度の投与は、ミトコンドリアの電子伝達系などの生体に必須な反応をも阻害するほか、腎排出や代謝のため有効濃度が低く、また全身へ拡散し、全身副反応を惹起するなど、問題があった。また、低分子抗酸化剤を用いた酸化ストレス疾患治療・予防が行われてきたものの著しい効果が見られなかった。
　そこで、本発明者等は触媒的に機能するＲＯＳ消去剤であるニトロキシドラジカルをポリマー鎖で封入した自己組織化ナノ粒子（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ　ｒａｄｉｃａｌ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ＲＮＰ）を用い、必要なところでＲＯＳを消去する新しいナノ治療法を開発してきた（特許文献１）。その後、本発明者等は、このようなＲＮＰが静脈投与後、ナノ粒子を形成したまま、血管を長期間滞留し、酸化ストレスの生じている組織で崩壊することで、脳梗塞、心筋梗塞・急性腎不全に対して高い治療効果を示すことを確認し、現時点では未公開であるが特許出願明細書に開示している。
　このような事情を考慮し、本発明者等は触媒的に機能するＲＯＳ消去剤ニトロキシドラジカルを封入した自己組織化ナノ粒子（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ　ｒａｄｉｃａｌ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ＲＮＰ）を用い、必要なところでＲＯＳを消去する新しいナノ治療法を開発してきた（特許文献１）。また、このようなＲＮＰと低分子抗酸化剤をはじめとする他の薬剤を含む組成物も提供した（特許文献２）。この文献には、当該組成物が経口投与用の医薬製剤として利用できることも記載されているが、実際に経口投与した結果は何ら開示されていない。さらに、カチオン荷電性のＲＮＰそれ自体またはカチオン荷電性を利用してアニオン性の薬剤を当該ＲＮＰに内包させたコンジュゲート（水性媒体中では高分子ミセルを形成している）は、静脈投与後、ナノ粒子を形成したまま、血管内に長期間滞留するが、酸化ストレスの生じている組織でミセルまたは粒子が崩壊することで、脳梗塞、心筋梗塞・急性腎不全、その他の疾患に対して高い治療効果を示すことも本発明者等は確認した（一部については特許文献１参照。また、一部については現時点で未公開状態にある特許出願中である）。
　一方で、このようなＲＮＰが酸化ストレスの生じている組織で崩壊するとの性質や、その後判明した胃液のような酸性環境下で速やかに崩壊するとの性質は、当該ＲＮＰの使用様式を限定する場合がある。
ＷＯ２００９／１３３６４７ 特開２０１１－１８４４２９
　酸性環境下をはじめ、種々の生理学的条件下で安定に使用でき、可能であるなら、ＲＮＰの特性を維持したままさらなる新たな性質が付与された材料若しくは複合体、またはＲＮＰの薬剤内包コンジュゲートもしくは複合体を提供することが本発明の目的である。
　仮に、上記のような材料または複合体が提供できるなら、例えば、酸性環境下にある胃において薬剤がＲＮＰ中で安定に存在し、消化されず、腸に効率よく薬剤を送達できるシステムの構築が可能となるであろう。
　また、限定されるものではないが、上記の性質に加え、さらなる新たな性質として体液等に存在する老廃物を除去できる作用等を付与できると、例えば、腹膜透析液の機能を向上できる可能性もある。腹膜透析は、近年、高齢化社会を迎え、様々な疾病の影響を受けて腎臓機能が低下する腎機能不全患者の治療方法の一つである。この方法は、ダイアライザーを利用し、血液の体外循環によって浄化を行う血液透析とともに、利用されている。前者は、社会復帰が容易で、残腎機能の保護にも優れているものの、煩雑な透析液の交換と腹膜硬化症の問題が解決できず、さらには透析患者に高いがんのリスクを伴っている等のため、後者に比べ、未だ、利用率が低い。腹膜硬化症や発がんの原因のひとつに高い糖濃度を中心とした過剰な活性酸素産生による酸化ストレスが寄与していることが指摘されている。そこで、ＲＮＰの優れた抗酸化作用を維持するとともに、腹膜透析中に生じる酸化ストレスを抑制し、さらに腹膜透析効率を向上させるために老廃物を吸着させる機能を持つシステムが提供できれば、上記の長所を有する腹膜透析の利用率を高めることが可能になるであろう。また、磁性ナノ粒子が効果的に内包されたＲＮＰは、ＲＮＰのもう一つの構成要素である高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物の抗酸化作用に悪影響を及ぼすことなく、一方では、磁性ナノ粒子の作用を介して、例えば、磁気ハイパーサーミアでの利用が可能であろうし、また、特定の生体分子の単離（スクリーニング）及び細胞分離の基剤となり得るであろう。
　このような観点から、ＲＮＰの機能を向上せしめるべく検討してきたところ、ＲＮＰまたは高分子ミセルにシリカまたは磁性粒子を効率よく内包できるか、或はシリカまたは磁性粒子を高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物で被覆できることを見出した。さらに、このような無機粒子を内包したＲＮＰまたは高分子ミセルは、無機粒子を含まないものに比べ、生理学的環境下、特に、特定のＲＮＰにあっては、例えば、ｐＨ３の酸性環境下ですら安定にミセル状態または粒子状態を保持する。また、かようなＲＮＰにさらに薬剤を含有した状態の粒子も生理学的環境下で安定であることも見出した。その上、シリカを内包したＲＮＰは腹膜炎症モデルラットの腹膜に投与すると腹膜の劣化を著しく抑制することも確認できた。
　したがって、今ここに、有機－無機ハイブリッド複合体であって、有機成分が下記一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーであり、無機成分が、シリカ及び磁性ナノ粒子からなる群より選ばれる無機粒子である、複合体が提供される。
　　ＰＥＧ－ＣＮＲ　　　　（Ｉ）
　式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を含むセグメントであり、
　ＣＮＲは、連結基、好ましくは、少なくとも１つのイミノ（－ＮＨ－）またはオキシ（－Ｏ－）を有する連結基を介してポリマー主鎖に結合した環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含む反復単位を含むポリマーセグメントである。
　また、上記一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーと無機粒子を含む有機－無機複合体の一つの態様として、水に溶解または分散させたとき、一般的には、平均粒径が３ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは５ｎｍ～５００ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ～１００ｎｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ～５０ｎｍの粒子として存在するものを好ましいものとして挙げることができる。このような複合体は、限定されるものでないが、サイズがｎｍの範囲内にある、所謂ナノ粒子と称される場合には生体内で使用するのに適しており、一方、特に無機粒子が磁性粒子であり、生体分子や細胞の分離または単離、所謂バイオセパレーションに使用する場合には、本発明の複合体は、ナノ粒子でなく、平均粒径が５００ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは１μｍ～５００μｍ、より好ましくは１μｍ～１００μｍ、さらにより好ましくは１μｍ～５０μｍの粒子であることができる。
　また、別の発明の態様のとして、活性成分として、少なくとも前記複合体と製薬学的に許容される希釈剤またはキャリヤーを含む腹膜透析液が提供される。
　また、さらに別の発明の態様として、アニオン性の薬物をさらに含む前記複合体が提供される。
　前記の有機－無機複合体から形成されるＲＮＰは、無機粒子がＲＮＰに内包されることにより該粒子を体液中で均質に分散し、保持することができ、また、内包された無機粒子の作用により、体液中、特に、上記一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーが連結基として少なくとも１つのイミノを含み、無機ナノ粒子がシリカである場合には、酸性を示す体液中ですら一定時間安定にＲＮＰの粒子の形状を保持でき、さらに他の薬剤を高濃度で安定にＲＮＰに内包することも可能になる。
発明の詳細な記述
　無機粒子は、提供しようとする有機－無機複合体の使用目的によりそのサイズ、形状は変動し得るが、サイズについては、平均径が数ｎｍ～数ｍｍの範囲内にある粒子を意図している。このような粒子のうち、シリカ粒子は、供給元、日産化学からのスノーテックスＯまたはＭＥＫ－ＳＴまたはメタノールシリカゾルとして市販されているものをそのまま、または必要があれば、精製して利用し、それらを前記複合体に含めることができる。このような無機粒子の形状は、限定されるものでないが、球、立方体、直方体、８～１６多面体等であるかとできる。このような粒子の粒径は、球に換算した場合の値として表示している。
　一方、磁性ナノ粒子は、限定されるものでないが、好ましくはバイオ・医療用磁性ナノ粒子またはバイオセパレーション用として当該技術分野で使用されているか、使用することが提案されているもの、また、例えば、供給元、ＪＳＲライフサイエンス（株）から入手できる、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）もしくはマグネへマイト（γ－Ｆｅ２Ｏ３）またはこれらの中間体であるものを利用できる。さらに、磁性ナノ粒子は、具体的には、ＦｅＰｔ（Ｆｅの平均含有割合が３５原子以上であることが好ましい。）ナノ粒子（例えば、ＪＰ　２００９－５７６０９　Ａ参照）であることができる。本発明では、磁性ナノ粒子は、例えば、カルボキシル基またはスルホン基で表面が修飾されたものを使用することが当該粒子を複合体中に安定に保持する上で適する場合がある。したがって、前期複合体は、Ｆｅ３Ｏ４、γ－Ｆｅ２Ｏ３、ＦｅＰｔからなる群より選ばれる１種以上の磁性粒子を含むことができる。
　上記の一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーにおいて、環状ニトロキシドラジカルが、連結基、例えば、ｏ－もしくはｐ－フェニレン－Ｃ１－６アルキレン－ＮＨ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－またはｏ－もしくはｐ－フェニレン－Ｃ１－６アルキレン－Ｏ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－（ここで、ｑは整数０または１であり、好ましくは０である）を介してポリマー主鎖に結合しており、かつ、環状ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる。
　ここで、ポリマー主鎖は重合性不飽和二重結合に由来し、当該主鎖にフェニレンの未結合末端が結合している。このようなポリマー主鎖の構造について、特許文献１の記載を参照できる（特許文献１は引用することにより本明細書の内容に組み込まれる）。
　さらに、一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーのより具体的なものとしては、一般式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式中、
　Ａは、非置換または置換Ｃ１－Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－（ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１－Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ－もしくは－Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ－を表す。）の基を表し、
　Ｌ１は、単結合、－（ＣＨ２）ｃＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ－、からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、
　Ｌ２は、－Ｃ１－６アルキレン－ＮＨ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－または－Ｃ１－６アルキレン－Ｏ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－であり、ここでｑは０または１であり、そして
　Ｒは、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、
　Ｌ２－Ｒは、ｎの総数の少なくとも、５０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特により好ましくは９５％が存在することができ、存在しない場合、残りのＬ２－Ｒ部は、メチル、ハロ（例えば、クロロ、ブロモ、ヨード）メチルまたはヒドロキシメチル基であることができ、
　ｍは、２０～５，０００、好ましくは、２０～１，０００、より好ましくは２０～５００の整数であり、そして
　ｎは、独立して、３～１，０００、好ましくは、３～５００、より好ましくは３～１００、特に好ましくは５～５０の整数である。
　Ｒとしては、より好ましいものとして、次式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基を挙げることができる。
　以上のブロックコポリマーは、特許文献１に記載されているか、記載された方法に準じて製造できる。
　有機－無機ハイブリッド複合体は、室温～９０℃において、無機粒子と上記のブロックコポリマーを粉末化状態で単に混合して生成してもよい。一般的には、前記複合体は、両者を緩衝化したもしくは未緩衝化、必要により、水溶性有機溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール等を含有する水性媒体中で溶解もしくは分散混合することにより生成できる。かような複合体は、その調製中に、自己組織化を介して形成される粒子もしくは高分子ミセルとしても提供できる。また、こうして形成された粒子もしくは高分子ミセルの乾燥、好ましくは凍結乾燥物としても提供できる。粒子の粒径は、出発原料として使用する無機粒子のサイズに依存するが、一般に、出発原料の無機粒子は、平均径が数ｎｍ～数ｍｍの範囲内にあることができるが、具体的には３ｎｍ～１ｍｍ、一般的には３ｎｍ～５００μｍ、好ましくは５ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ～８０ｎｍ、特に好ましくは１０ｎｍ～５０ｎｍの範囲内にある。これらの中、無機粒子が磁性粒子である場合、平均粒径が５００ｎｍ～１ｍｍ、好ましくは１μｍ～５００ｎｍ、より好ましくは１μｍ～１００μｍ、さらにより好ましくは１μｍ～５０μｍの粒子を用いることができる。ここにいう、粒径は、水性媒体中に溶解または分散した複合体粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行って確認できる値を意味する。
　複合体の無機粒子とブロックコポリマーの含有比率は、複合体粒子が水性媒体中で上記の粒径を有するものとして観察できるものであれば限定されない。したがって、当業者であれば、後述する複合体粒子の製造方法にしたがって、適当な上記含有比を選び複合体粒子を形成してみて、それらの動的光散乱を測定することにより、本発明に適する含有比を選択することができる。しかし、限定されるものではないが、上記一般式（ＩＩ）で示され、ポリ（エチレングリコール）セグメントのｍが２０～５，０００であり、かつ、ｎが３～１，０００であるようなブロックコポリマーであり、無機粒子が平均径３０ｎｍ～５０ｎｍのシリカ粒子である場合は、重量比（ポリマー：シリカ粒子）で１００：５～１００：３００、好ましくは１００：１０～１００：２００、さらに好ましくは１００：２０～１００：１００であることができる。一方、当該ブロックコポリマーであり、無機粒子が平均粒径５ｎｍ～１ｍｍの磁性ナノ粒子である場合、複合体中の無機ナノ粒子とブロックコポリマーの含有比率（重量基準のポリマー：磁性ナノ粒子）は、１：１００００，好ましくは１：１０００、さらに好ましくは１；１００であることができる。
　水性媒体に含められるブロックコポリマーと無機粒子の自己組織化は、都合よくは、図１のシリカ内包ＲＮＰの調製方法の概念図にみられるようにブロックコポリマー（ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ）を、必要により酸性（ｐＨ１～５）に調整した、水性媒体中で溶解した後、必要により弱酸性―アルカリ性（ｐＨ６～１０）に調整して脱プロトン化し、撹拌することにより進行させることができる。別法としては、水溶性有機溶媒（例えば、ＤＭＦ）にブロックコポリマーを溶解させた後、無機粒子を加え、こうして生成した混合液を、透析膜を通して蒸留水に対して透析することにより上記自己組織化を行うことができる。こうして形成される複合体粒子は、動的光散乱測定の結果等を考慮すると、無機粒子がＲＮＰまたは高分子ミセルに内包されてか、或はブロックコポリマーにより被覆されているものと推測できる。また、より具体的な方法については、後述する実施例を参照されたい。
　こうして提供される有機－無機ハイブリッド複合体（または無機粒子内包ＲＮＰ）は、体液中で均一に分散でき、安定に粒子の形態を保持できる。このＲＮＰにおいて、特に、無機粒子がシリカであり、ブロックコポリマーの連結基にイミノ（－ＮＨ－）が含まれる場合のＲＮＰは、胃液のような低いｐＨの酸性環境下でも、少なくとも数十分にわたり安定に粒子の形態を保持する。なお、本明細書にいう体液、生体内、生理的、生理学的等の用語は、哺乳動物、例えばヒトについて使用することを意図している。このようなシリカ内包ＲＮＰは、上記方法の後者の透析方法を用いて製造する場合には、透析前の溶液中にさらに種々の薬剤、好ましくはアニオン性または疎水性の薬剤を含めることにより、シリカ内包ＲＮＰに当該薬剤を含有または内包させることができる。また、このような薬剤は、予め、調製したシリカ内包ＲＮＰの水性媒体中での溶解または分散液にそれらを添加し、撹拌混合することにより、シリカ内包ＲＮＰに内包または含有せしめることできる。こうして形成した、シリカおよび薬剤内包ＲＮＰも、胃液のような低いｐＨの酸性環境下で、少なくとも数十分にわたり安定に粒子の形態を保持する。無機ナノ粒子が磁性粒子であり、ブロックコポリマーの連結基にイミノ（－ＮＨ－）が含まれる場合のＲＮＰは、前記シリカ内包ＲＮＰと同様に生体内の酸性環境下ですら一定時間安定に粒子の形態を保持する。
　本発明の複合体の特定の使用に関してシリカ内包ＲＮＰを例にとり説明するが、これらが本発明の複合体の用途を限定するものでない。シリカ内包ＲＮＰ（薬剤不含）は、当該技術分野で常用されている、ブドウ糖、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、乳酸等を含み、低ｐＨ（酸性）にある腹膜透析液においても安定に粒子の形態を保持する。勿論、透析液バックを２室に分けて、使用直前に混ぜ合わせることで、ｐＨを中性（６．３～７．３）とした生理的にやさしい腹膜透析液においても、安定にシリカ内包ＲＮＰ（Ｓｉ－ＲＮＰということもある）の形態を保持できる。さらに、これらのシリカ内包ＲＮＰは、腹膜を通して体外に滲みだした老廃物をシリカに吸着するものと理解できるように透析効率を向上させる。したがって、従来使用されている腹膜透析液に、シリカ内包ＲＮＰを含めることにより、従来問題となっていた腹膜の劣化を抑制できる。上記のように想定されるシリカ内包ＲＮＰの作用機序を考慮すれば、腹膜透析液には、より最近提案されたもの（例えば、グルコースに代え、イコサデキストリンを含有するようなイコデキストリン含有腹膜透析液等）も本発明にいう腹膜透析液に包含される。
　また、上述したとおり、シリカおよび薬剤内包ＲＮＰも、胃液のような低いｐＨの酸性環境下で、少なくとも数十分にわたり安定に粒子の形態を保持する。したがって、経口投与した後、胃を通過し、腸に薬剤を効率よくデリバリーするために、当該シリカおよび薬剤内包ＲＮＰは都合よく利用することができる。例えば、限定されるものではないが、薬剤として消化器管用薬であるレバミピドを選択すると、胃内でのＲＮＰの粒子形態を一定安定に時間安定に保持できるので、薬剤の胃腸内徐放性が達成できる。したがって、アニオン性の薬物であって、経口投与により腸にデリバリーするための薬物をシリカとともに内包したＲＮＰが提供される。このような薬物としては、限定されるものではないが、デガフールウラシル、クレスチン、ロイコボリン、アセトアミノフェン、シクロホスファミド、メルファラン、シタラビン　オクホスファート、テガフール・ウラシル、テガフール・ギネスタット・オタスタットカリウム配合、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メトトレキサート、メルカプトプリン、エトポシド、アナストロゾール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、リン酸エストラムスチン、メロキシカム、エトドラク、ピロキシカム、アンピロキシカム、ロルノキシカム、モフェゾラク、インドメタシンファルネシル、インドメタシン、スクリンダ、フェンブフェン、ジクロフェナクナトリウム、ナブメトン、ロキソプロフェンナトリウム、イブプロフェン、ザルトプロフェン、プラノプルフェン、アルミノプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、メフェナム酸、塩酸チアラミド、アザチオプリン、タクロリムス、メサラジン、エカベトナトリウム、レバミピド、アスピリン等を挙げることができる。
　無機粒子および、任意に薬剤、を内包するＲＮＰを経口製剤とする場合、剤形により、当該ＲＮＰは、例えば、水性媒体中では、上記のような自己組織化した粒子の形態で存在することができ、また、固体製剤では、如何なる状態の当該ＲＮＰを含むこともできるが、水性媒体中で一旦、自己組織化した粒子を形成した後、凍結乾燥等により乾燥したものを含めるのが好ましい。
　かような医薬製剤は、本発明の目的に沿う限り、当該技術分野で周知の希釈剤、賦形剤（またはキャリヤー）、添加剤を含めることができるが、上記凍結乾燥物それ自体であることもできる。医薬製剤が、例えば、経口投与用製剤であり、固形である場合、高分子環状ニトロキシドラジカル化合物を、ショ糖、乳糖、マンニトール、セルロール、トレハロース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、ゼラチン、カゼイン、アルブミン、グリセリド等から選ばれる１種以上の組み合わせで含むことができる。さらに、他の不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、パラベン、ソルビン酸、α－トコフェロールのような保存剤、システインのような抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、甘味料、なども含めることができる。
　経口投与用液体製剤は、生理学的に許容される、乳剤、シロップ、エリキシル剤、懸濁剤および溶液製剤を包含する。これらの製剤は、一般に使用されている、不活性希釈剤、例えば、水を含むことができる。このような水溶液には、上述した、糖類や分子量２００～１００，０００程度のポリエチレングリコールを含めることもできる。
　上記製剤は、使用時または当初から、液状、半液状であることができ、ここでは、希釈剤として、例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、滅菌水、等を使用して、非経口製剤とすることもできる。
本発明のシリカ内包ＲＮＰ調製の概念図。 製造実施例１で得られたナノ粒子のＤＬＳ測定結果を表すグラフ。 製造実施例３で得られたナノ粒子のポリマー重量に対するシリカの取り込み比率を表すグラフ。ＳｉＯ２－ＲＮＰ１はＴＥＯＳを用いて作成した粒子について、ＳｉＯ２－ＲＮＰ２は市販シリカ粒子を用いて作成した粒子に対いての結果である。 製造実施例３で得られたナノ粒子の各種ｐＨの水溶液中の安定性を表すグラフ。 試験１による、製造実施例４で作製したレパミピド内包粒子のレパミピド含有量を解析した結果を表すグラフ。 試験例２で薬剤を内包したナノ粒子の酸性条件下での安定性を動的光散乱法（ＤＬＳ）よって評価した結果を表すグラフ。クロ塗り三角の曲線は、ポリマー重量当りシリカ含有率８．５ｗｔ％を、黒塗り丸の曲線は、ポリマー重量当りシリカ含有率０ｗｔ％の結果である。 試験例３にしたがい、酸性条件下にナノ粒子を放置した際の内包されている薬剤の放出挙動を示すグラフ。 試験例４による、シリカ内包ナノ粒子の尿素吸着能の効率を示すグラフ。 試験例５による、Ｓｉ－ＲＮＰ腹腔内投与後の血中取り込み抑制試験の結果を示すグラフ。 試験例６による、腹膜硬化症モデル動物を用いたＲＮＰの治療効果を示すグラフ。 製造実施例５で得られた磁性粒子が修飾されたＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴの量を表すグラフ。
発明を実施するための具体例
　以下、本発明を具体的に説明するが、本発明をこれらの具体的な態様に限定することを意図するものではない。なお、説明を簡潔にするため、高分子化ニトロキシドラジカル化合物としては、上記特許文献１（引用することにより、開示事項は、本明細書の内容となる）の製造例２および４にしたがって調製されたＰＥＧ－ｂ－ＰＣＭＳ－Ｎ－ＴＥＭＰＯまたはＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴからのナノ粒子（以下、ｎＲＮＰともいう）を用いた例をベースに説明する。また、実施例に記載の分子量に関連するｍ、ｎの値、粒径に関連する、ｎｍ及びμｍの値は、それぞれ平均値である。
製造実施例１：
シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ－ｎＲＮＰ）の調製方法（その１）
　両親媒性ブロックポリマー：ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ（下記式におけるｍが約１００であり、ｎが約２０のものに相当する。それぞれ、ｍ部のＭｎが４６００で、ＰＣＭＳのＭｎが３，３００から換算した）の水溶液（５ｍｇ／ｍＬ，１ｍＬ，ｐＨ３）に、シリカナノ粒子（１０ｎｍ，０．５ｍｇ）を加え、室温で撹拌した。次に、水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨ９に調整することによってシリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ－ｎＲＮＰ）を作製した（図１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　得られたナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行ったところ、３７ｎｍの粒子径を有することが明らかとなった。またシリカナノ粒子を含有させていない場合（ＲＮＰと記載する）、粒子径が２２ｎｍであったことから、シリカナノ粒子がＳｉ－ＲＮＰに内包されたことが示唆される（図２参照）。
製造実施例２：
シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ－ｎＲＮＰ）の調製方法（その２）
　スクリューに０．２μｍのシリンジフィルターを通したＤＭＦ　２ｍＬと両親媒性ブロックポリマーポリマー：ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ　１０ｍｇを入れ、ドライヤーを用いて熱を与え、ポリマーを完全に溶解した。このスクリュー管にさらに、シリカナノ粒子（日産化学、ＭＥＫ－ＳＴ、１０－１５ｎｍ、２．１－１５．５ｍｇ）を所定量加えた。あらかじめ水に浸し膨潤させておいた分画分子量３５００の透析膜にポリマーのＤＭＦ溶液をパスツールピペットで移し、２Ｌの蒸留水に対して透析を行った。数時間おきに外液の蒸留水を交換し、２４時間透析を行った。回収した溶液に蒸留水を加え全量を６．５ｍＬとした。この溶液に塩化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、０．２μｍのシリンジフィルターを通し、内包されていないシリカ粒子を除去した。シリカの内包量はプラズマ発光分光分析装置によりケイ素（Ｓｉ）の定量を行った。結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
製造実施例３：
シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ－ｎＲＮＰ）の調製方法（その３）
（１）調製方法：
ｎＲＮＰ（２０ｍｇ／ｍＬ）水溶液１ｍＬにテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）または市販のシリカ粒子（日産化学、スノーテックス）を所定量加え８０℃で２４時間撹拌した。撹拌後水を用いて透析（ＭＷＣＯ＝１，０００，０００）を行い精製し、シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ－ｎＲＮＰ）を得た。内包されたシリカの量はプラズマ発光分光分析装置により定量した。結果を図３に示す。
（２）上記で得られたＳｉ－ｎＲＮＰの水溶液中での安定性
　上記の方法で作成したＳｉ－ｎＲＮＰまたはＳｉ不含ｎＲＮＰを、それぞれ指定するｐＨ水溶液で室温下、１５分間インキュベートした際の粒子の安定性を光散乱強度で評価した。結果を図４に示す。
製造実施例４：
シリカ内包ナノ粒子に抗炎症作用を有する薬剤であるレパミピドの内包
　シリカ含有量が異なるシリカ内包ナノ粒子４種類（シリカ含有量０ｗｔ％，１１ｗｔ％，１４ｗｔ％，３６ｗｔ％，８８ｗｔ％／ポリマー重量）を、各１ｍＬをマイクロチューブに移し、レバミピド３ｍｇを加え、室温下、撹拌機により２４時間ｒｐｍ５００で撹拌を行った。撹拌後、内包されていないレバミピドを除去するために０．２μｍのシリンジフィルターを通した。
　レバミピド内包操作前後のシリカ含有量と粒径を下記表２にまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　表中、ＰＤＩは粒子径多分散度を表す。
試験例１：作製したレパミピド内包粒子のレパミピド含有量を解析
　作製したレパミピド内包粒子のレパミピド含有量は、レバミピドの吸収極大波長である３３０ｎｍの吸収スペクトルを測定することで解析した。その結果を図５に示す。
　図５から、シリカを含有してないナノ粒子に比べシリカを含有しているナノ粒子の方が多くのレバミピドを内包できることが確認できる。
試験例２：薬剤を内包したナノ粒子の酸性条件下での安定性
　薬剤として、上記の製造実施例４のレバミピドを内包したナノ粒子（ポリマー重量当りシリカ８．５ｗｔ含有）の酸性条件下での安定性を評価する為にｐＨ３での散乱強度変化を測定した。ディスポーザブル・ロウ・サイズ・キュベット（Ｄｉｓｐｏｒｓａｂｌｅ　ｌｏｗ　ｓｉｚｅ　ｃｕｖｅｔｔｅ）に、脱イオン水３５０μＬ、緩衝液（ｐＨ３）４０μＬを入れ、ピペッティングにより撹拌した後、サンプルを１０μＬ入れ、散乱強度を測定した。なお、測定は１分間に１回測定する条件に設定し、ｐＨ３に調節してから４分後に測定を開始し、連続で１５分間散乱強度を測定した。結果を図６に示す。
　図６から、シリカ含有なしのナノ粒子は２０分後には、もとの約４０％の散乱強度へ低下するのに比べ、シリカを内包したナノ粒子では散乱強度の変化はほとんど見られなかった。したがって、酸性環境下においてもナノ粒子が安定に存在していることが確認された。
試験例３：酸性条件下にナノ粒子を放置した際の内包されている薬剤の放出挙動
　ｐＨ３の酸性条件下にナノ粒子（上記の試験２と同じ）を２０分間放置した際の内包されている薬剤レバミピドの放出挙動の評価を行った。酸性条件下でナノ粒子が崩壊し、レバミピドが放出されていれば、０．２μｍのシリンジフィルターを通すことで除去することが可能である。
　そこで、ｐＨ７の条件に調製し吸収を測定したものを、レバミピド内包量の基準（１００％）として、酸性条件下に置かれたナノ粒子のレバミピド内包量を測定し、放出されたレバミピドの割合を求めた。その結果を図７に示す。
　シリカなしのナノ粒子では内包した薬物の４３％が放出されるのに対し、シリカを８．５ｗｔ％（／ポリマー重量）含有させることで１７％の放出に抑制することができた。
　以上の結果より、シリカを含有したナノ粒子ではシリカを含まないナノ粒子に比べ、酸性条件下で薬物を安定に内包できることが確認された。
試験例４：シリカ内包ナノ粒子の尿素吸着能の試験
　腹膜透析モデルとして、市販で用いられている透析液（ダイアニール－Ｎ　ＰＤ４、Ｂａｘｔｅｒ、成分（ｗ／ｖ％）ブドウ糖１．３６　塩化カルシウム０．０１８３　塩化マグネシウム０．００５０８　乳酸ナトリウム０．４４８　塩化ナトリウム０．５３８、体積１０ｍＬ）とＳｉ－ｎＲＮＰ（ポリマー濃度５ｍｇ／ｍＬ、シリカゲル濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）が入った透析膜（分画分子量１２，０００～１４，０００）を尿素溶液（１９０ｍｇ／ｄＬ、２０ｍＬ）の中に浸し、外液にある尿素量を比色分析法により定量した。外液の尿素量を示す結果を図８に示す。市販に用いられている透析液やＲＮＰ含有透析液では、透析速度が同程度であったが、Ｓｉ－ｎＲＮＰを用いると透析効率が向上することが明らかとなった。この結果は、Ｓｉ－ｎＲＮＰを透析液として用いた場合に、透析時間や効率を向上させることを示す。
試験例５：Ｓｉ－ｎＲＮＰ腹腔内投与後の血中取り込み抑制試験
　通常、低分子量の化合物は、腹腔内に投与した後、血中に取り込まれ、全身に拡散することが懸念される。実際に低分子化合物ＴＥＭＰＯを腹腔内に投与した後、血中内の電子スピン共鳴（ＥＳＲ）シグナルを測定した結果を図９に示す。図９から、一時間以上にわたって、血中に薬物が存在することが明らかである。高濃度の低分子ＴＥＭＰＯ化合物の投与は、血圧低下やミトコンドリアのエネルギー伝達系の阻害などの副作用を生じる。一方、シリカ内包ＲＮＰ（Ｓｉ－ｎＲＮＰ）は腹膜から全く透過しないため、血中移行性がないことを確認できた。これは、全身への毒性を懸念する必要がなく、極めて安全な腹膜透析液として期待されるデータである。
試験例６：腹膜硬化症モデル動物を用いたＳｉ－ｎＲＮＰの治療効果
　腹膜硬化モデルラットは、０．１％（ｖ／ｖ）のグルコンサンクロロへキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ　ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）を腹腔内に一週間毎日投与することにより作成した。また生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）、Ｓｉ－ｎＲＮＰ、もしくは低分子化合物ＴＥＭＰＯＬを同時に一週間毎日投与することによって、その腹膜劣化抑制効果を腹膜炎症により産生されるスーパーオキシド量を定量することにより調べた。結果を図１０に示す。
　一週間後、ラットを解剖し、腹膜をホモジネートした後、スーパーオキシド反応性化学発光試薬（ＭＰＥＣ：２－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｐ－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｐｙｒａｚｉｎｏｎｅ）を用いて評価したところ、Ｓｉ－ＲＮＰはＣｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ　ｇｌｕｃｏｎａｔｅによって引き起こされるスーパーオキシドの産生を抑制していることが明らかとなり、低分子化合物のＴＥＭＰＯＬに比べても非常に効果が高いことが示された。
製造実施例５：
磁性粒子内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｆｅ－ｎＲＮＰ）の調製方法－ｐＨ７．４(生体条件下)における表面修飾－
　１．５ｍＬマイクロチューブに、各カチオン性セグメントＰＭＮＴの重合度（ｕｎｉｔ：製造実施例１の式中のｎの値に相当する。）がそれぞれ、５，　１０，　２０，　３０ｕｎｉｔのＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴを、磁性粒子（９０μｇ（カルボキシ基２２．５ｎｍｏｌ、ライフテクノロジーズから入手、製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　（ｒ）Ｍ－２７０　Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ、粒径：２．８μｍ)のカルボキシ基に対して、５０、１００、２００アミノｍｏｌ等量をそれぞれ秤量した。表３に仕込み量をまとめる。０．１Ｍ　ＨＣｌの１０μＬをＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴに加えることによりＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴを溶かし、磁性粒子を３μＬ（９０μｇ、２２．５カルボキシ基ｍｏｌ)とｐＨ７．４のリン酸バッファーを２４０ｍＬ加え、ｐＨを測定した。０．１Ｍ　ＮａＯＨと０．１Ｍ　ＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調整し、約２４時間攪拌した。攪拌後、磁性粒子表面に吸着していない未吸着ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴを除去するため、磁石を用いてＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴ修飾磁性粒子（Ｆｅ－ｎＲＮＰ）を壁面に集め、溶液を洗浄した。その後ｐＨ７．４のリン酸バッファーを２５０μＬ加え、撹拌後、同様に溶液を取り除くことにより未吸着のＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴを取り除いた。この動作を４回繰り返すことで未吸着のＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴを完全に取り除いた。取り除いたことを確認するために、４回目の洗浄液を回収しておき、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定をすることでシグナルが消失していることを確認した。ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴの修飾量は、ＥＳＲ測定を用い、電子スピンスペクトルの積分値により行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴの表面修飾量をまとめた結果を図１１に示す。図１１のグラフより、上記の結果同様、短い鎖長の方が長い鎖長よりも修飾量が多いことが分かる。また、ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴの添加量依存的に、ＰＥＧ－ｂ－ＰＭＮＴが磁性粒子に修飾される量が上昇していることが示された。
　本発明の有機－無機ハイブリッド複合体は、例えば、それ自体、腹膜透析液の性質を向上でき、また、他の薬剤をさらに含めるたうえで、経口投与により当該薬剤を腸にデリバリーするための担体として使用できる。したがって、例えば、製薬業界で利用できる。
 

Claims (15)

  1. 　無機粒子とポリマーを含む有機－無機ハイブリッド複合体であって、
    　無機粒子がシリカ粒子及び磁性粒子からなる群より選ばれ、
    　ポリマーが一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーである、複合体。
    　　ＰＥＧ－ＣＮＲ　　　　（Ｉ）
    　式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を含むセグメントであり、
    　ＣＮＲは、連結基を介してポリマー主鎖に結合した環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含む反復単位を含むポリマーセグメントである。
  2. 　無機粒子が、平均粒径３ｎｍ～１０００ｎｍのシリカ粒子を含む、請求項１に記載の複合体。
  3. 　無機粒子が、平均粒径３ｎｍ～１ｍｍのＦｅ３Ｏ４、γ－Ｆｅ２Ｏ３、ＦｅＰｔからなる群より選ばれる１種以上の磁性粒子を含む請求項１に記載の複合体。
  4. 　ブロックコポリマーの連結基が、少なくとも１つのイミノ（－ＮＨ－）またはオキシ（－Ｏ－）を含む、請求項２または３に記載の複合体。
  5. 　ブロックポリマーの連結基がｏ－もしくはｐ－フェニレン－Ｃ１－６アルキレン－ＮＨ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－またはｏ－もしくはｐ－フェニレン－Ｃ１－６アルキレン－Ｏ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－（ここで、ｑは０または１である）であり、当該連結基を介してポリマー主鎖に結合した環状ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれ、
    　ここで、ポリマー主鎖が重合性不飽和二重結合に由来し、当該主鎖に前記フェニレンの未結合末端が結合しており、かつ、
    シリカ粒子が平均粒径３ｎｍ～５００ｎｍであり、磁性粒子の平均粒径が３ｎｍ～１０００ｎｍである、請求項１に記載の複合体。
  6. 　無機粒子とポリマーを含む有機－無機ハイブリッド複合体であって、
    　無機粒子が、平均粒径３ｎｍ～１０００ｎｍのシリカ粒子、または平均粒径３ｎｍ～１ｍｍのＦｅ３Ｏ４、γ－Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅＰｔからなる群より選ばれる１種以上を含む磁性粒子であり、
    　ポリマーが、一般式（ＩＩ）で表される、複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式中、
    　Ａは、非置換または置換Ｃ１－Ｃ１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ１Ｒ２ＣＨ－（ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｃ１－Ｃ４アルコキシまたはＲ１とＲ２は一緒になって－ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ－もしくは－Ｏ（ＣＨ２）４Ｏ－を表す。）の基を表し、
    　Ｌ１は、単結合、－（ＣＨ２）ｃＳ－、－ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ－、からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、
    　Ｌ２は、－Ｃ１－６アルキレン－ＮＨ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－または－Ｃ１－６アルキレン－Ｏ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－であり、ここでｑは０または１であり、そして
    　Ｒは、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル－４－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリジン－１－オキシル－３－イル、２，２，５，５－テトラメチルピロリン－１－オキシル－３－イル及び２，４，４－トリメチル－１，３－オキサゾリジン－３－オキシル－２－イル、２，４，４－トリメチル－１，３－チアゾリジン－３－オキシル－２－イル及び２，４，４－トリメチル－イミダゾリンジン－３－オキシル－２－イルからなる群より選ばれ、
    　Ｌ２－Ｒは、ｎの総数の少なくとも５０％が存在し、存在しない場合、残りのＬ２－Ｒ部は、メチル、ハロメチルまたはヒドロキシメチル基であることができ、
    　ｍは、２０～５，０００の整数であり、そして
    　ｎは、独立して、３～１，０００の整数である。
  7. 　Ｒが、次式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　式中、Ｒ’はメチル基である、
    で表される基から選ばれ、Ｌ２－Ｒが、ｎの総数の少なくとも８０％存在する、請求項６記載の複合体。
  8. 　Ｌ２が、－Ｃ１－６アルキレン－ＮＨ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－である、請求項６または７に記載の複合体。
  9. 　Ｌ２が、－Ｃ１－６アルキレン－Ｏ－（Ｃ１－６アルキレン）ｑ－である、請求項６または７に記載の複合体。
  10. 　無機粒子が、シリカ粒子である、請求項６または７に記載の複合体。
  11. 　無機粒子が、磁性粒子である、請求項６または７に記載の複合体。
  12. 　請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体と製薬学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
  13. 　請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体と製薬学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物であって、腹膜透析液の形態にある、組成物。
  14. 　請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体と経口投与により腸にデリバリーされる薬物を含む医薬組成物。
  15. 　請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体の腹膜透析液を調製するための、使用。
     
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