JPWO2013118783A1 - 高分子化ニトロキシド化合物と無機粒子の有機−無機ハイブリッド複合体 - Google Patents

Abstract

高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物と無機ナノ粒子の有機−無機ハイブリッド複合体が提供される。かような複合体は、例えば、胃液中で安定なナノ粒子の形態を保持でき、それ自体または他の薬剤を腸にデリバリーする担体として使用できる。

Description

本発明は、高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物とシリカまたは磁性粒子の有機−無機ハイブリッド複合体およびその使用に関する。

近年、不規則な生活習慣・老化・社会的ストレスなどによっても生体内で過剰に活性酸素種（ＲＯＳ）が産生し、さまざまな慢性疾病（動脈硬化症や糖尿病など）や難治性疾患（アルツハイマーやパーキンソン病など）をもたらすことが明らかとなっている。また、ＲＯＳは、通常、生体内では酸化−抗酸化（レドックス）のバランスを厳密に調節しているが、このＲＯＳが過剰に生成されると、酸化−抗酸化因子のバランスが酸化の方向に傾く。これまでに各種抗酸化剤を用いた慢性疾患の予防について検討がなされてきたものの、低分子抗酸化剤の例では、それらの高濃度の投与は、ミトコンドリアの電子伝達系などの生体に必須な反応をも阻害するほか、腎排出や代謝のため有効濃度が低く、また全身へ拡散し、全身副反応を惹起するなど、問題があった。また、低分子抗酸化剤を用いた酸化ストレス疾患治療・予防が行われてきたものの著しい効果が見られなかった。

そこで、本発明者等は触媒的に機能するＲＯＳ消去剤であるニトロキシドラジカルをポリマー鎖で封入した自己組織化ナノ粒子（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ＲＮＰ）を用い、必要なところでＲＯＳを消去する新しいナノ治療法を開発してきた（特許文献１）。その後、本発明者等は、このようなＲＮＰが静脈投与後、ナノ粒子を形成したまま、血管を長期間滞留し、酸化ストレスの生じている組織で崩壊することで、脳梗塞、心筋梗塞・急性腎不全に対して高い治療効果を示すことを確認し、現時点では未公開であるが特許出願明細書に開示している。

このような事情を考慮し、本発明者等は触媒的に機能するＲＯＳ消去剤ニトロキシドラジカルを封入した自己組織化ナノ粒子（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ：ＲＮＰ）を用い、必要なところでＲＯＳを消去する新しいナノ治療法を開発してきた（特許文献１）。また、このようなＲＮＰと低分子抗酸化剤をはじめとする他の薬剤を含む組成物も提供した（特許文献２）。この文献には、当該組成物が経口投与用の医薬製剤として利用できることも記載されているが、実際に経口投与した結果は何ら開示されていない。さらに、カチオン荷電性のＲＮＰそれ自体またはカチオン荷電性を利用してアニオン性の薬剤を当該ＲＮＰに内包させたコンジュゲート（水性媒体中では高分子ミセルを形成している）は、静脈投与後、ナノ粒子を形成したまま、血管内に長期間滞留するが、酸化ストレスの生じている組織でミセルまたは粒子が崩壊することで、脳梗塞、心筋梗塞・急性腎不全、その他の疾患に対して高い治療効果を示すことも本発明者等は確認した（一部については特許文献１参照。また、一部については現時点で未公開状態にある特許出願中である）。

一方で、このようなＲＮＰが酸化ストレスの生じている組織で崩壊するとの性質や、その後判明した胃液のような酸性環境下で速やかに崩壊するとの性質は、当該ＲＮＰの使用様式を限定する場合がある。

ＷＯ２００９／１３３６４７ 特開２０１１−１８４４２９

酸性環境下をはじめ、種々の生理学的条件下で安定に使用でき、可能であるなら、ＲＮＰの特性を維持したままさらなる新たな性質が付与された材料若しくは複合体、またはＲＮＰの薬剤内包コンジュゲートもしくは複合体を提供することが本発明の目的である。

仮に、上記のような材料または複合体が提供できるなら、例えば、酸性環境下にある胃において薬剤がＲＮＰ中で安定に存在し、消化されず、腸に効率よく薬剤を送達できるシステムの構築が可能となるであろう。

また、限定されるものではないが、上記の性質に加え、さらなる新たな性質として体液等に存在する老廃物を除去できる作用等を付与できると、例えば、腹膜透析液の機能を向上できる可能性もある。腹膜透析は、近年、高齢化社会を迎え、様々な疾病の影響を受けて腎臓機能が低下する腎機能不全患者の治療方法の一つである。この方法は、ダイアライザーを利用し、血液の体外循環によって浄化を行う血液透析とともに、利用されている。前者は、社会復帰が容易で、残腎機能の保護にも優れているものの、煩雑な透析液の交換と腹膜硬化症の問題が解決できず、さらには透析患者に高いがんのリスクを伴っている等のため、後者に比べ、未だ、利用率が低い。腹膜硬化症や発がんの原因のひとつに高い糖濃度を中心とした過剰な活性酸素産生による酸化ストレスが寄与していることが指摘されている。そこで、ＲＮＰの優れた抗酸化作用を維持するとともに、腹膜透析中に生じる酸化ストレスを抑制し、さらに腹膜透析効率を向上させるために老廃物を吸着させる機能を持つシステムが提供できれば、上記の長所を有する腹膜透析の利用率を高めることが可能になるであろう。また、磁性ナノ粒子が効果的に内包されたＲＮＰは、ＲＮＰのもう一つの構成要素である高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物の抗酸化作用に悪影響を及ぼすことなく、一方では、磁性ナノ粒子の作用を介して、例えば、磁気ハイパーサーミアでの利用が可能であろうし、また、特定の生体分子の単離（スクリーニング）及び細胞分離の基剤となり得るであろう。

このような観点から、ＲＮＰの機能を向上せしめるべく検討してきたところ、ＲＮＰまたは高分子ミセルにシリカまたは磁性粒子を効率よく内包できるか、或はシリカまたは磁性粒子を高分子化環状ニトロキシドラジカル化合物で被覆できることを見出した。さらに、このような無機粒子を内包したＲＮＰまたは高分子ミセルは、無機粒子を含まないものに比べ、生理学的環境下、特に、特定のＲＮＰにあっては、例えば、ｐＨ３の酸性環境下ですら安定にミセル状態または粒子状態を保持する。また、かようなＲＮＰにさらに薬剤を含有した状態の粒子も生理学的環境下で安定であることも見出した。その上、シリカを内包したＲＮＰは腹膜炎症モデルラットの腹膜に投与すると腹膜の劣化を著しく抑制することも確認できた。

したがって、今ここに、有機−無機ハイブリッド複合体であって、有機成分が下記一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーであり、無機成分が、シリカ及び磁性ナノ粒子からなる群より選ばれる無機粒子である、複合体が提供される。

ＰＥＧ−ＣＮＲ （Ｉ）
式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を含むセグメントであり、
ＣＮＲは、連結基、好ましくは、少なくとも１つのイミノ（−ＮＨ−）またはオキシ（−Ｏ−）を有する連結基を介してポリマー主鎖に結合した環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含む反復単位を含むポリマーセグメントである。

また、上記一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーと無機粒子を含む有機−無機複合体の一つの態様として、水に溶解または分散させたとき、一般的には、平均粒径が３ｎｍ〜１ｍｍ、好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ〜１００ｎｍ、さらにより好ましくは１０ｎｍ〜５０ｎｍの粒子として存在するものを好ましいものとして挙げることができる。このような複合体は、限定されるものでないが、サイズがｎｍの範囲内にある、所謂ナノ粒子と称される場合には生体内で使用するのに適しており、一方、特に無機粒子が磁性粒子であり、生体分子や細胞の分離または単離、所謂バイオセパレーションに使用する場合には、本発明の複合体は、ナノ粒子でなく、平均粒径が５００ｎｍ〜１ｍｍ、好ましくは１μｍ〜５００μｍ、より好ましくは１μｍ〜１００μｍ、さらにより好ましくは１μｍ〜５０μｍの粒子であることができる。

また、別の発明の態様のとして、活性成分として、少なくとも前記複合体と製薬学的に許容される希釈剤またはキャリヤーを含む腹膜透析液が提供される。

また、さらに別の発明の態様として、アニオン性の薬物をさらに含む前記複合体が提供される。

前記の有機−無機複合体から形成されるＲＮＰは、無機粒子がＲＮＰに内包されることにより該粒子を体液中で均質に分散し、保持することができ、また、内包された無機粒子の作用により、体液中、特に、上記一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーが連結基として少なくとも１つのイミノを含み、無機ナノ粒子がシリカである場合には、酸性を示す体液中ですら一定時間安定にＲＮＰの粒子の形状を保持でき、さらに他の薬剤を高濃度で安定にＲＮＰに内包することも可能になる。

発明の詳細な記述

無機粒子は、提供しようとする有機−無機複合体の使用目的によりそのサイズ、形状は変動し得るが、サイズについては、平均径が数ｎｍ〜数ｍｍの範囲内にある粒子を意図している。このような粒子のうち、シリカ粒子は、供給元、日産化学からのスノーテックスＯまたはＭＥＫ−ＳＴまたはメタノールシリカゾルとして市販されているものをそのまま、または必要があれば、精製して利用し、それらを前記複合体に含めることができる。このような無機粒子の形状は、限定されるものでないが、球、立方体、直方体、８〜１６多面体等であるかとできる。このような粒子の粒径は、球に換算した場合の値として表示している。

一方、磁性ナノ粒子は、限定されるものでないが、好ましくはバイオ・医療用磁性ナノ粒子またはバイオセパレーション用として当該技術分野で使用されているか、使用することが提案されているもの、また、例えば、供給元、ＪＳＲライフサイエンス（株）から入手できる、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）もしくはマグネへマイト（γ−Ｆｅ_２Ｏ_３）またはこれらの中間体であるものを利用できる。さらに、磁性ナノ粒子は、具体的には、ＦｅＰｔ（Ｆｅの平均含有割合が３５原子以上であることが好ましい。）ナノ粒子（例えば、ＪＰ ２００９−５７６０９ Ａ参照）であることができる。本発明では、磁性ナノ粒子は、例えば、カルボキシル基またはスルホン基で表面が修飾されたものを使用することが当該粒子を複合体中に安定に保持する上で適する場合がある。したがって、前期複合体は、Ｆｅ_３Ｏ_４、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、ＦｅＰｔからなる群より選ばれる１種以上の磁性粒子を含むことができる。

上記の一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーにおいて、環状ニトロキシドラジカルが、連結基、例えば、ｏ−もしくはｐ−フェニレン−Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−またはｏ−もしくはｐ−フェニレン−Ｃ_１−６アルキレン−Ｏ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−（ここで、ｑは整数０または１であり、好ましくは０である）を介してポリマー主鎖に結合しており、かつ、環状ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる。
ここで、ポリマー主鎖は重合性不飽和二重結合に由来し、当該主鎖にフェニレンの未結合末端が結合している。このようなポリマー主鎖の構造について、特許文献１の記載を参照できる（特許文献１は引用することにより本明細書の内容に組み込まれる）。

さらに、一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーのより具体的なものとしては、一般式（ＩＩ）

式中、
Ａは、非置換または置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−（ここで、Ｒ^１及びＲ^２は独立して、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシまたはＲ^１とＲ^２は一緒になって−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ_２）_３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ_２）_４Ｏ−を表す。）の基を表し、
Ｌ_１は、単結合、−（ＣＨ_２）_ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ_２）_ｃＳ−、からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、
Ｌ_２は、−Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−または−Ｃ_１−６アルキレン−Ｏ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−であり、ここでｑは０または１であり、そして
Ｒは、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、
Ｌ_２−Ｒは、ｎの総数の少なくとも、５０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、特により好ましくは９５％が存在することができ、存在しない場合、残りのＬ_２−Ｒ部は、メチル、ハロ（例えば、クロロ、ブロモ、ヨード）メチルまたはヒドロキシメチル基であることができ、
ｍは、２０〜５，０００、好ましくは、２０〜１，０００、より好ましくは２０〜５００の整数であり、そして
ｎは、独立して、３〜１，０００、好ましくは、３〜５００、より好ましくは３〜１００、特に好ましくは５〜５０の整数である。
Ｒとしては、より好ましいものとして、次式

式中、Ｒ’はメチル基である、
で表される基を挙げることができる。

以上のブロックコポリマーは、特許文献１に記載されているか、記載された方法に準じて製造できる。

有機−無機ハイブリッド複合体は、室温〜９０℃において、無機粒子と上記のブロックコポリマーを粉末化状態で単に混合して生成してもよい。一般的には、前記複合体は、両者を緩衝化したもしくは未緩衝化、必要により、水溶性有機溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、メタノール、エタノール等を含有する水性媒体中で溶解もしくは分散混合することにより生成できる。かような複合体は、その調製中に、自己組織化を介して形成される粒子もしくは高分子ミセルとしても提供できる。また、こうして形成された粒子もしくは高分子ミセルの乾燥、好ましくは凍結乾燥物としても提供できる。粒子の粒径は、出発原料として使用する無機粒子のサイズに依存するが、一般に、出発原料の無機粒子は、平均径が数ｎｍ〜数ｍｍの範囲内にあることができるが、具体的には３ｎｍ〜１ｍｍ、一般的には３ｎｍ〜５００μｍ、好ましくは５ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ〜８０ｎｍ、特に好ましくは１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内にある。これらの中、無機粒子が磁性粒子である場合、平均粒径が５００ｎｍ〜１ｍｍ、好ましくは１μｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは１μｍ〜１００μｍ、さらにより好ましくは１μｍ〜５０μｍの粒子を用いることができる。ここにいう、粒径は、水性媒体中に溶解または分散した複合体粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行って確認できる値を意味する。

複合体の無機粒子とブロックコポリマーの含有比率は、複合体粒子が水性媒体中で上記の粒径を有するものとして観察できるものであれば限定されない。したがって、当業者であれば、後述する複合体粒子の製造方法にしたがって、適当な上記含有比を選び複合体粒子を形成してみて、それらの動的光散乱を測定することにより、本発明に適する含有比を選択することができる。しかし、限定されるものではないが、上記一般式（ＩＩ）で示され、ポリ（エチレングリコール）セグメントのｍが２０〜５，０００であり、かつ、ｎが３〜１，０００であるようなブロックコポリマーであり、無機粒子が平均径３０ｎｍ〜５０ｎｍのシリカ粒子である場合は、重量比（ポリマー：シリカ粒子）で１００：５〜１００：３００、好ましくは１００：１０〜１００：２００、さらに好ましくは１００：２０〜１００：１００であることができる。一方、当該ブロックコポリマーであり、無機粒子が平均粒径５ｎｍ〜１ｍｍの磁性ナノ粒子である場合、複合体中の無機ナノ粒子とブロックコポリマーの含有比率（重量基準のポリマー：磁性ナノ粒子）は、１：１００００，好ましくは１：１０００、さらに好ましくは１；１００であることができる。

水性媒体に含められるブロックコポリマーと無機粒子の自己組織化は、都合よくは、図１のシリカ内包ＲＮＰの調製方法の概念図にみられるようにブロックコポリマー（ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ）を、必要により酸性（ｐＨ１〜５）に調整した、水性媒体中で溶解した後、必要により弱酸性―アルカリ性（ｐＨ６〜１０）に調整して脱プロトン化し、撹拌することにより進行させることができる。別法としては、水溶性有機溶媒（例えば、ＤＭＦ）にブロックコポリマーを溶解させた後、無機粒子を加え、こうして生成した混合液を、透析膜を通して蒸留水に対して透析することにより上記自己組織化を行うことができる。こうして形成される複合体粒子は、動的光散乱測定の結果等を考慮すると、無機粒子がＲＮＰまたは高分子ミセルに内包されてか、或はブロックコポリマーにより被覆されているものと推測できる。また、より具体的な方法については、後述する実施例を参照されたい。

こうして提供される有機−無機ハイブリッド複合体（または無機粒子内包ＲＮＰ）は、体液中で均一に分散でき、安定に粒子の形態を保持できる。このＲＮＰにおいて、特に、無機粒子がシリカであり、ブロックコポリマーの連結基にイミノ（−ＮＨ−）が含まれる場合のＲＮＰは、胃液のような低いｐＨの酸性環境下でも、少なくとも数十分にわたり安定に粒子の形態を保持する。なお、本明細書にいう体液、生体内、生理的、生理学的等の用語は、哺乳動物、例えばヒトについて使用することを意図している。このようなシリカ内包ＲＮＰは、上記方法の後者の透析方法を用いて製造する場合には、透析前の溶液中にさらに種々の薬剤、好ましくはアニオン性または疎水性の薬剤を含めることにより、シリカ内包ＲＮＰに当該薬剤を含有または内包させることができる。また、このような薬剤は、予め、調製したシリカ内包ＲＮＰの水性媒体中での溶解または分散液にそれらを添加し、撹拌混合することにより、シリカ内包ＲＮＰに内包または含有せしめることできる。こうして形成した、シリカおよび薬剤内包ＲＮＰも、胃液のような低いｐＨの酸性環境下で、少なくとも数十分にわたり安定に粒子の形態を保持する。無機ナノ粒子が磁性粒子であり、ブロックコポリマーの連結基にイミノ（−ＮＨ−）が含まれる場合のＲＮＰは、前記シリカ内包ＲＮＰと同様に生体内の酸性環境下ですら一定時間安定に粒子の形態を保持する。

本発明の複合体の特定の使用に関してシリカ内包ＲＮＰを例にとり説明するが、これらが本発明の複合体の用途を限定するものでない。シリカ内包ＲＮＰ（薬剤不含）は、当該技術分野で常用されている、ブドウ糖、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、乳酸等を含み、低ｐＨ（酸性）にある腹膜透析液においても安定に粒子の形態を保持する。勿論、透析液バックを２室に分けて、使用直前に混ぜ合わせることで、ｐＨを中性（６．３〜７．３）とした生理的にやさしい腹膜透析液においても、安定にシリカ内包ＲＮＰ（Ｓｉ−ＲＮＰということもある）の形態を保持できる。さらに、これらのシリカ内包ＲＮＰは、腹膜を通して体外に滲みだした老廃物をシリカに吸着するものと理解できるように透析効率を向上させる。したがって、従来使用されている腹膜透析液に、シリカ内包ＲＮＰを含めることにより、従来問題となっていた腹膜の劣化を抑制できる。上記のように想定されるシリカ内包ＲＮＰの作用機序を考慮すれば、腹膜透析液には、より最近提案されたもの（例えば、グルコースに代え、イコサデキストリンを含有するようなイコデキストリン含有腹膜透析液等）も本発明にいう腹膜透析液に包含される。

また、上述したとおり、シリカおよび薬剤内包ＲＮＰも、胃液のような低いｐＨの酸性環境下で、少なくとも数十分にわたり安定に粒子の形態を保持する。したがって、経口投与した後、胃を通過し、腸に薬剤を効率よくデリバリーするために、当該シリカおよび薬剤内包ＲＮＰは都合よく利用することができる。例えば、限定されるものではないが、薬剤として消化器管用薬であるレバミピドを選択すると、胃内でのＲＮＰの粒子形態を一定安定に時間安定に保持できるので、薬剤の胃腸内徐放性が達成できる。したがって、アニオン性の薬物であって、経口投与により腸にデリバリーするための薬物をシリカとともに内包したＲＮＰが提供される。このような薬物としては、限定されるものではないが、デガフールウラシル、クレスチン、ロイコボリン、アセトアミノフェン、シクロホスファミド、メルファラン、シタラビン オクホスファート、テガフール・ウラシル、テガフール・ギネスタット・オタスタットカリウム配合、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メトトレキサート、メルカプトプリン、エトポシド、アナストロゾール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、リン酸エストラムスチン、メロキシカム、エトドラク、ピロキシカム、アンピロキシカム、ロルノキシカム、モフェゾラク、インドメタシンファルネシル、インドメタシン、スクリンダ、フェンブフェン、ジクロフェナクナトリウム、ナブメトン、ロキソプロフェンナトリウム、イブプロフェン、ザルトプロフェン、プラノプルフェン、アルミノプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、メフェナム酸、塩酸チアラミド、アザチオプリン、タクロリムス、メサラジン、エカベトナトリウム、レバミピド、アスピリン等を挙げることができる。

無機粒子および、任意に薬剤、を内包するＲＮＰを経口製剤とする場合、剤形により、当該ＲＮＰは、例えば、水性媒体中では、上記のような自己組織化した粒子の形態で存在することができ、また、固体製剤では、如何なる状態の当該ＲＮＰを含むこともできるが、水性媒体中で一旦、自己組織化した粒子を形成した後、凍結乾燥等により乾燥したものを含めるのが好ましい。

かような医薬製剤は、本発明の目的に沿う限り、当該技術分野で周知の希釈剤、賦形剤（またはキャリヤー）、添加剤を含めることができるが、上記凍結乾燥物それ自体であることもできる。医薬製剤が、例えば、経口投与用製剤であり、固形である場合、高分子環状ニトロキシドラジカル化合物を、ショ糖、乳糖、マンニトール、セルロール、トレハロース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、ゼラチン、カゼイン、アルブミン、グリセリド等から選ばれる１種以上の組み合わせで含むことができる。さらに、他の不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、パラベン、ソルビン酸、α−トコフェロールのような保存剤、システインのような抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、甘味料、なども含めることができる。

経口投与用液体製剤は、生理学的に許容される、乳剤、シロップ、エリキシル剤、懸濁剤および溶液製剤を包含する。これらの製剤は、一般に使用されている、不活性希釈剤、例えば、水を含むことができる。このような水溶液には、上述した、糖類や分子量２００〜１００，０００程度のポリエチレングリコールを含めることもできる。

上記製剤は、使用時または当初から、液状、半液状であることができ、ここでは、希釈剤として、例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、滅菌水、等を使用して、非経口製剤とすることもできる。

本発明のシリカ内包ＲＮＰ調製の概念図。 製造実施例１で得られたナノ粒子のＤＬＳ測定結果を表すグラフ。 製造実施例３で得られたナノ粒子のポリマー重量に対するシリカの取り込み比率を表すグラフ。ＳｉＯ_２−ＲＮＰ１はＴＥＯＳを用いて作成した粒子について、ＳｉＯ_２−ＲＮＰ^２は市販シリカ粒子を用いて作成した粒子に対いての結果である。 製造実施例３で得られたナノ粒子の各種ｐＨの水溶液中の安定性を表すグラフ。 試験１による、製造実施例４で作製したレパミピド内包粒子のレパミピド含有量を解析した結果を表すグラフ。 試験例２で薬剤を内包したナノ粒子の酸性条件下での安定性を動的光散乱法（ＤＬＳ）よって評価した結果を表すグラフ。クロ塗り三角の曲線は、ポリマー重量当りシリカ含有率８．５ｗｔ％を、黒塗り丸の曲線は、ポリマー重量当りシリカ含有率０ｗｔ％の結果である。 試験例３にしたがい、酸性条件下にナノ粒子を放置した際の内包されている薬剤の放出挙動を示すグラフ。 試験例４による、シリカ内包ナノ粒子の尿素吸着能の効率を示すグラフ。 試験例５による、Ｓｉ−ＲＮＰ腹腔内投与後の血中取り込み抑制試験の結果を示すグラフ。 試験例６による、腹膜硬化症モデル動物を用いたＲＮＰの治療効果を示すグラフ。 製造実施例５で得られた磁性粒子が修飾されたＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの量を表すグラフ。

発明を実施するための具体例

以下、本発明を具体的に説明するが、本発明をこれらの具体的な態様に限定することを意図するものではない。なお、説明を簡潔にするため、高分子化ニトロキシドラジカル化合物としては、上記特許文献１（引用することにより、開示事項は、本明細書の内容となる）の製造例２および４にしたがって調製されたＰＥＧ−ｂ−ＰＣＭＳ−Ｎ−ＴＥＭＰＯまたはＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴからのナノ粒子（以下、ｎＲＮＰともいう）を用いた例をベースに説明する。また、実施例に記載の分子量に関連するｍ、ｎの値、粒径に関連する、ｎｍ及びμｍの値は、それぞれ平均値である。

製造実施例１：
シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ−ｎＲＮＰ）の調製方法（その１）
両親媒性ブロックポリマー：ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ（下記式におけるｍが約１００であり、ｎが約２０のものに相当する。それぞれ、ｍ部のＭｎが４６００で、ＰＣＭＳのＭｎが３，３００から換算した）の水溶液（５ｍｇ／ｍＬ，１ｍＬ，ｐＨ３）に、シリカナノ粒子（１０ｎｍ，０．５ｍｇ）を加え、室温で撹拌した。次に、水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨ９に調整することによってシリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ−ｎＲＮＰ）を作製した（図１参照）。

得られたナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行ったところ、３７ｎｍの粒子径を有することが明らかとなった。またシリカナノ粒子を含有させていない場合（ＲＮＰと記載する）、粒子径が２２ｎｍであったことから、シリカナノ粒子がＳｉ−ＲＮＰに内包されたことが示唆される（図２参照）。

製造実施例２：
シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ−ｎＲＮＰ）の調製方法（その２）
スクリューに０．２μｍのシリンジフィルターを通したＤＭＦ ２ｍＬと両親媒性ブロックポリマーポリマー：ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ １０ｍｇを入れ、ドライヤーを用いて熱を与え、ポリマーを完全に溶解した。このスクリュー管にさらに、シリカナノ粒子（日産化学、ＭＥＫ−ＳＴ、１０−１５ｎｍ、２．１−１５．５ｍｇ）を所定量加えた。あらかじめ水に浸し膨潤させておいた分画分子量３５００の透析膜にポリマーのＤＭＦ溶液をパスツールピペットで移し、２Ｌの蒸留水に対して透析を行った。数時間おきに外液の蒸留水を交換し、２４時間透析を行った。回収した溶液に蒸留水を加え全量を６．５ｍＬとした。この溶液に塩化ナトリウムを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、０．２μｍのシリンジフィルターを通し、内包されていないシリカ粒子を除去した。シリカの内包量はプラズマ発光分光分析装置によりケイ素（Ｓｉ）の定量を行った。結果を下記表１に示す。

製造実施例３：
シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ−ｎＲＮＰ）の調製方法（その３）
（１）調製方法：
ｎＲＮＰ（２０ｍｇ／ｍＬ）水溶液１ｍＬにテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）または市販のシリカ粒子（日産化学、スノーテックス）を所定量加え８０℃で２４時間撹拌した。撹拌後水を用いて透析（ＭＷＣＯ＝１，０００，０００）を行い精製し、シリカ内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｓｉ−ｎＲＮＰ）を得た。内包されたシリカの量はプラズマ発光分光分析装置により定量した。結果を図３に示す。
（２）上記で得られたＳｉ−ｎＲＮＰの水溶液中での安定性
上記の方法で作成したＳｉ−ｎＲＮＰまたはＳｉ不含ｎＲＮＰを、それぞれ指定するｐＨ水溶液で室温下、１５分間インキュベートした際の粒子の安定性を光散乱強度で評価した。結果を図４に示す。

製造実施例４：
シリカ内包ナノ粒子に抗炎症作用を有する薬剤であるレパミピドの内包
シリカ含有量が異なるシリカ内包ナノ粒子４種類（シリカ含有量０ｗｔ％，１１ｗｔ％，１４ｗｔ％，３６ｗｔ％，８８ｗｔ％／ポリマー重量）を、各１ｍＬをマイクロチューブに移し、レバミピド３ｍｇを加え、室温下、撹拌機により２４時間ｒｐｍ５００で撹拌を行った。撹拌後、内包されていないレバミピドを除去するために０．２μｍのシリンジフィルターを通した。

レバミピド内包操作前後のシリカ含有量と粒径を下記表２にまとめて示す。

表中、ＰＤＩは粒子径多分散度を表す。

試験例１：作製したレパミピド内包粒子のレパミピド含有量を解析
作製したレパミピド内包粒子のレパミピド含有量は、レバミピドの吸収極大波長である３３０ｎｍの吸収スペクトルを測定することで解析した。その結果を図５に示す。

図５から、シリカを含有してないナノ粒子に比べシリカを含有しているナノ粒子の方が多くのレバミピドを内包できることが確認できる。

試験例２：薬剤を内包したナノ粒子の酸性条件下での安定性
薬剤として、上記の製造実施例４のレバミピドを内包したナノ粒子（ポリマー重量当りシリカ８．５ｗｔ含有）の酸性条件下での安定性を評価する為にｐＨ３での散乱強度変化を測定した。ディスポーザブル・ロウ・サイズ・キュベット（Ｄｉｓｐｏｒｓａｂｌｅ ｌｏｗ ｓｉｚｅ ｃｕｖｅｔｔｅ）に、脱イオン水３５０μＬ、緩衝液（ｐＨ３）４０μＬを入れ、ピペッティングにより撹拌した後、サンプルを１０μＬ入れ、散乱強度を測定した。なお、測定は１分間に１回測定する条件に設定し、ｐＨ３に調節してから４分後に測定を開始し、連続で１５分間散乱強度を測定した。結果を図６に示す。

図６から、シリカ含有なしのナノ粒子は２０分後には、もとの約４０％の散乱強度へ低下するのに比べ、シリカを内包したナノ粒子では散乱強度の変化はほとんど見られなかった。したがって、酸性環境下においてもナノ粒子が安定に存在していることが確認された。

試験例３：酸性条件下にナノ粒子を放置した際の内包されている薬剤の放出挙動
ｐＨ３の酸性条件下にナノ粒子（上記の試験２と同じ）を２０分間放置した際の内包されている薬剤レバミピドの放出挙動の評価を行った。酸性条件下でナノ粒子が崩壊し、レバミピドが放出されていれば、０．２μｍのシリンジフィルターを通すことで除去することが可能である。

そこで、ｐＨ７の条件に調製し吸収を測定したものを、レバミピド内包量の基準（１００％）として、酸性条件下に置かれたナノ粒子のレバミピド内包量を測定し、放出されたレバミピドの割合を求めた。その結果を図７に示す。

シリカなしのナノ粒子では内包した薬物の４３％が放出されるのに対し、シリカを８．５ｗｔ％（／ポリマー重量）含有させることで１７％の放出に抑制することができた。

以上の結果より、シリカを含有したナノ粒子ではシリカを含まないナノ粒子に比べ、酸性条件下で薬物を安定に内包できることが確認された。

試験例４：シリカ内包ナノ粒子の尿素吸着能の試験
腹膜透析モデルとして、市販で用いられている透析液（ダイアニール−Ｎ ＰＤ４、Ｂａｘｔｅｒ、成分（ｗ／ｖ％）ブドウ糖１．３６ 塩化カルシウム０．０１８３ 塩化マグネシウム０．００５０８ 乳酸ナトリウム０．４４８ 塩化ナトリウム０．５３８、体積１０ｍＬ）とＳｉ−ｎＲＮＰ（ポリマー濃度５ｍｇ／ｍＬ、シリカゲル濃度０．２５ｍｇ／ｍＬ）が入った透析膜（分画分子量１２，０００〜１４，０００）を尿素溶液（１９０ｍｇ／ｄＬ、２０ｍＬ）の中に浸し、外液にある尿素量を比色分析法により定量した。外液の尿素量を示す結果を図８に示す。市販に用いられている透析液やＲＮＰ含有透析液では、透析速度が同程度であったが、Ｓｉ−ｎＲＮＰを用いると透析効率が向上することが明らかとなった。この結果は、Ｓｉ−ｎＲＮＰを透析液として用いた場合に、透析時間や効率を向上させることを示す。

試験例５：Ｓｉ−ｎＲＮＰ腹腔内投与後の血中取り込み抑制試験
通常、低分子量の化合物は、腹腔内に投与した後、血中に取り込まれ、全身に拡散することが懸念される。実際に低分子化合物ＴＥＭＰＯを腹腔内に投与した後、血中内の電子スピン共鳴（ＥＳＲ）シグナルを測定した結果を図９に示す。図９から、一時間以上にわたって、血中に薬物が存在することが明らかである。高濃度の低分子ＴＥＭＰＯ化合物の投与は、血圧低下やミトコンドリアのエネルギー伝達系の阻害などの副作用を生じる。一方、シリカ内包ＲＮＰ（Ｓｉ−ｎＲＮＰ）は腹膜から全く透過しないため、血中移行性がないことを確認できた。これは、全身への毒性を懸念する必要がなく、極めて安全な腹膜透析液として期待されるデータである。

試験例６：腹膜硬化症モデル動物を用いたＳｉ−ｎＲＮＰの治療効果
腹膜硬化モデルラットは、０．１％（ｖ／ｖ）のグルコンサンクロロへキシジン（Ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）を腹腔内に一週間毎日投与することにより作成した。また生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）、Ｓｉ−ｎＲＮＰ、もしくは低分子化合物ＴＥＭＰＯＬを同時に一週間毎日投与することによって、その腹膜劣化抑制効果を腹膜炎症により産生されるスーパーオキシド量を定量することにより調べた。結果を図１０に示す。

一週間後、ラットを解剖し、腹膜をホモジネートした後、スーパーオキシド反応性化学発光試薬（ＭＰＥＣ：２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｐｙｒａｚｉｎｏｎｅ）を用いて評価したところ、Ｓｉ−ＲＮＰはＣｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｇｌｕｃｏｎａｔｅによって引き起こされるスーパーオキシドの産生を抑制していることが明らかとなり、低分子化合物のＴＥＭＰＯＬに比べても非常に効果が高いことが示された。

製造実施例５：
磁性粒子内包ニトロキシドラジカル含有ナノ粒子（Ｆｅ−ｎＲＮＰ）の調製方法−ｐＨ７．４(生体条件下)における表面修飾−
１．５ｍＬマイクロチューブに、各カチオン性セグメントＰＭＮＴの重合度（ｕｎｉｔ：製造実施例１の式中のｎの値に相当する。）がそれぞれ、５， １０， ２０， ３０ｕｎｉｔのＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴを、磁性粒子（９０μｇ（カルボキシ基２２．５ｎｍｏｌ、ライフテクノロジーズから入手、製品名：Ｄｙｎａｂｅａｄｓ （ｒ）Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ、粒径：２．８μｍ)のカルボキシ基に対して、５０、１００、２００アミノｍｏｌ等量をそれぞれ秤量した。表３に仕込み量をまとめる。０．１Ｍ ＨＣｌの１０μＬをＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴに加えることによりＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴを溶かし、磁性粒子を３μＬ（９０μｇ、２２．５カルボキシ基ｍｏｌ)とｐＨ７．４のリン酸バッファーを２４０ｍＬ加え、ｐＨを測定した。０．１Ｍ ＮａＯＨと０．１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調整し、約２４時間攪拌した。攪拌後、磁性粒子表面に吸着していない未吸着ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴを除去するため、磁石を用いてＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ修飾磁性粒子（Ｆｅ−ｎＲＮＰ）を壁面に集め、溶液を洗浄した。その後ｐＨ７．４のリン酸バッファーを２５０μＬ加え、撹拌後、同様に溶液を取り除くことにより未吸着のＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴを取り除いた。この動作を４回繰り返すことで未吸着のＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴを完全に取り除いた。取り除いたことを確認するために、４回目の洗浄液を回収しておき、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定をすることでシグナルが消失していることを確認した。ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの修飾量は、ＥＳＲ測定を用い、電子スピンスペクトルの積分値により行った。

ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの表面修飾量をまとめた結果を図１１に示す。図１１のグラフより、上記の結果同様、短い鎖長の方が長い鎖長よりも修飾量が多いことが分かる。また、ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴの添加量依存的に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴが磁性粒子に修飾される量が上昇していることが示された。

本発明の有機−無機ハイブリッド複合体は、例えば、それ自体、腹膜透析液の性質を向上でき、また、他の薬剤をさらに含めるたうえで、経口投与により当該薬剤を腸にデリバリーするための担体として使用できる。したがって、例えば、製薬業界で利用できる。

Claims (15)

1. 無機粒子とポリマーを含む有機−無機ハイブリッド複合体であって、
   無機粒子がシリカ粒子及び磁性粒子からなる群より選ばれ、
   ポリマーが一般式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーである、複合体。
   ＰＥＧ−ＣＮＲ （Ｉ）
   式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を含むセグメントであり、
   ＣＮＲは、連結基を介してポリマー主鎖に結合した環状ニトロキシドラジカルをペンダント基の一部として含む反復単位を含むポリマーセグメントである。
2. 無機粒子が、平均粒径３ｎｍ〜１０００ｎｍのシリカ粒子を含む、請求項１に記載の複合体。
3. 無機粒子が、平均粒径３ｎｍ〜１ｍｍのＦｅ_３Ｏ_４、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、ＦｅＰｔからなる群より選ばれる１種以上の磁性粒子を含む請求項１に記載の複合体。
4. ブロックコポリマーの連結基が、少なくとも１つのイミノ（−ＮＨ−）またはオキシ（−Ｏ−）を含む、請求項２または３に記載の複合体。
5. ブロックポリマーの連結基がｏ−もしくはｐ−フェニレン−Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−またはｏ−もしくはｐ−フェニレン−Ｃ_１−６アルキレン−Ｏ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−（ここで、ｑは０または１である）であり、当該連結基を介してポリマー主鎖に結合した環状ニトロキシドラジカルが、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれ、
   ここで、ポリマー主鎖が重合性不飽和二重結合に由来し、当該主鎖に前記フェニレンの未結合末端が結合しており、かつ、
   シリカ粒子が平均粒径３ｎｍ〜５００ｎｍであり、磁性粒子の平均粒径が３ｎｍ〜１０００ｎｍである、請求項１に記載の複合体。
6. 無機粒子とポリマーを含む有機−無機ハイブリッド複合体であって、
   無機粒子が、平均粒径３ｎｍ〜１０００ｎｍのシリカ粒子、または平均粒径３ｎｍ〜１ｍｍのＦｅ_３Ｏ_４、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３及びＦｅＰｔからなる群より選ばれる１種以上を含む磁性粒子であり、
   ポリマーが、一般式（ＩＩ）で表される、複合体。
   

   

   式中、
   Ａは、非置換または置換Ｃ_１−Ｃ_１２アルコキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ^１Ｒ^２ＣＨ−（ここで、Ｒ^１及びＲ^２は独立して、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシまたはＲ^１とＲ^２は一緒になって−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ_２）_３Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ_２）_４Ｏ−を表す。）の基を表し、
   Ｌ_１は、単結合、−（ＣＨ_２）_ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ_２）_ｃＳ−、からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、
   Ｌ_２は、−Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−または−Ｃ_１−６アルキレン−Ｏ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−であり、ここでｑは０または１であり、そして
   Ｒは、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれ、
   Ｌ_２−Ｒは、ｎの総数の少なくとも５０％が存在し、存在しない場合、残りのＬ_２−Ｒ部は、メチル、ハロメチルまたはヒドロキシメチル基であることができ、
   ｍは、２０〜５，０００の整数であり、そして
   ｎは、独立して、３〜１，０００の整数である。
7. Ｒが、次式
   

   

   式中、Ｒ’はメチル基である、
   で表される基から選ばれ、Ｌ_２−Ｒが、ｎの総数の少なくとも８０％存在する、請求項６記載の複合体。
8. Ｌ_２が、−Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−である、請求項６または７に記載の複合体。
9. Ｌ_２が、−Ｃ_１−６アルキレン−Ｏ−（Ｃ_１−６アルキレン）_ｑ−である、請求項６または７に記載の複合体。
10. 無機粒子が、シリカ粒子である、請求項６または７に記載の複合体。
11. 無機粒子が、磁性粒子である、請求項６または７に記載の複合体。
12. 請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体と製薬学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
13. 請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体と製薬学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物であって、腹膜透析液の形態にある、組成物。
14. 請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体と経口投与により腸にデリバリーされる薬物を含む医薬組成物。
15. 請求項６または７のいずれかに記載の複合体であって、無機粒子がシリカ粒子である複合体の腹膜透析液を調製するための、使用。
    

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