WO2013080366A1 - 殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法 - Google Patents

殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法 Download PDF

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圭祐 中村
紘代 猪飼
河野　雅弘
吉己 庭野
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Definitions

  • the present invention relates to a bactericidal agent, a bactericidal agent for oral cavity, a bactericidal method, a bactericidal apparatus, and a bactericidal agent evaluation method.
  • a conventional sterilization method there is a method in which an oxidant such as hydrogen peroxide is brought into contact with a sterilization target, and light having a wavelength of 400 nm to 1000 nm is irradiated on the sterilization target (see, for example, Patent Document 1).
  • an oxidant such as hydrogen peroxide
  • light having a wavelength of 400 nm to 1000 nm is irradiated on the sterilization target
  • hydrogen radicals are irradiated with light having a wavelength of 400 nm to 1000 nm to generate hydroxy radicals, and sterilization can be performed with the hydroxy radicals.
  • Patent Document 1 there is a problem that the bactericidal effect on the cells and microorganisms is reduced because some of the hydrogen peroxide is decomposed by the catalase of the cells and microorganisms present in the sterilization target. .
  • This invention was made paying attention to such a subject, and aims at providing the bactericidal agent which can improve a bactericidal effect, a bactericidal agent for oral cavity, a bactericidal method, a bactericidal apparatus, and the evaluation method of a bactericidal agent. Yes.
  • catalase possessed by cells and microorganisms present in the sterilization target decomposes hydrogen peroxide, which is a substrate for producing hydroxy radicals having high antibacterial properties.
  • catalase-positive bacteria and fungi Streptcoccus aureus ATCC 12693 and Candida albicans JCM 9061 and analyzed the reaction of these with hydroxy radicals using Lineweaver-Burk Plot ⁇ ⁇ by measuring changes in DMPO-OH. went. The result is shown in FIG.
  • the fungicide according to the present invention is characterized by containing hydrogen peroxide and a catalase activity inhibitor.
  • the bactericidal agent for oral cavity according to the present invention includes hydrogen peroxide and a catalase activity inhibitor.
  • the disinfectant and oral disinfectant according to the present invention are used as follows. First, the bactericidal agent and the bactericidal agent for oral cavity according to the present invention are brought into contact with the sterilization target by applying or spraying the sterilization target. At this time, since it contains a catalase activity inhibitor, even if cells or microorganisms such as catalase-positive bacteria or fungi are present in the sterilization target, their catalase activity can be reduced. The reaction can be prevented.
  • the light to be sterilized is irradiated with light having a predetermined wavelength.
  • the catalase activity inhibitor can reduce the catalase activity of cells and microorganisms present in the sterilization target, thus preventing the reduction of hydroxy radicals caused by the reaction of catalase with hydrogen peroxide. .
  • the hydrogen peroxide that generates hydroxy radicals reacts with the catalase of cells and microorganisms present in the sterilization target and decreases by the catalase activity inhibitor.
  • reduction of hydroxy radicals generated from hydrogen peroxide can be prevented, so that the bactericidal effect by hydroxy radicals can be enhanced.
  • the sterilization method according to the present invention is characterized in that hydrogen peroxide and a catalase activity inhibitor are brought into contact with a sterilization target, and the sterilization target is irradiated with light having a wavelength of 350 nm to 500 nm.
  • the sterilization method according to the present invention is a catalase activity inhibitor when hydrogen peroxide and a catalase activity inhibitor are brought into contact with a sterilization target, even if cells or microorganisms such as catalase-positive bacteria or fungi are present in the sterilization target.
  • their catalase activity can be reduced, and catalase can be prevented from reacting with hydrogen peroxide.
  • the catalase activity inhibitor can reduce the catalase activity of cells and microorganisms present in the sterilization target, thus preventing the reduction of hydroxy radicals caused by the reaction of catalase with hydrogen peroxide.
  • the catalase activity inhibitor prevents hydrogen peroxide that generates hydroxy radicals from reacting with the catalase possessed by cells or microorganisms present in the sterilization target and decreasing.
  • the reduction of hydroxy radicals generated from hydrogen peroxide can be prevented, so that the bactericidal effect of hydroxy radicals can be enhanced.
  • the method of bringing hydrogen peroxide and the catalase activity inhibitor into contact with the sterilization target is a method of applying or spraying the bactericide according to the present invention and the bactericide for oral cavity, or a sterilization target. Any method may be used, such as a method of immersing in a solution of the disinfectant according to the present invention.
  • the sterilization apparatus is provided so that light having a wavelength of 350 nm to 500 nm can be irradiated to a sterilization target in which hydrogen peroxide and a catalase activity inhibitor are contacted with the hydrogen peroxide and the catalase activity inhibitor.
  • the light emitting means is provided.
  • the sterilization apparatus according to the present invention can suitably carry out the sterilization method according to the present invention.
  • the catalase activity inhibitor can prevent hydrogen peroxide that generates hydroxy radicals from reacting with the catalase possessed by cells and microorganisms present in the sterilization target, and being reduced. As a result, reduction of hydroxy radicals generated from hydrogen peroxide can be prevented, so that the bactericidal effect by hydroxy radicals can be enhanced.
  • the hydrogen peroxide and the catalase activity inhibitor may be constituted by the bactericidal agent or oral bactericidal agent according to the present invention.
  • the sterilization target may be teeth in the oral cavity, dentures, and the like
  • the catalase activity inhibitor may be composed of a toothpaste or a mouthwash containing a catalase activity inhibitor. In this case, after brushing teeth with the toothpaste or gargle with a mouthwash, hydrogen peroxide is brought into contact with the sterilization target, and light is emitted by a light emitting means.
  • the light emitting means for irradiating light may be anything as long as it can irradiate light having a wavelength of 350 nm to 500 nm, such as a heat lamp, a fluorescent lamp, Halogen lamps, xenon lamps, LEDs (light emitting diodes), semiconductor lasers, and the like.
  • the light to irradiate has a wavelength of 350 nm to 500 nm, it may be a single wavelength, a plurality of wavelengths, or a wavelength in a predetermined band.
  • the catalase activity inhibitor is, for example, oxon, ryokucha, fennel, loquat, licorice, aloe, salvia, hamamelis, chamomile, rosemary, melissa, Or it is preferable that a peach is included. In particular, it is preferable to include an ogon or a ryokcha that has a high catalase activity inhibitory effect.
  • the method for evaluating a bactericidal agent according to the present invention includes a sample collected from a sterilization target brought into contact with the bactericidal agent according to the present invention, 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxide (TEMPOL). ) And the mixture is mixed with the sample, and based on the line width of the obtained electron spin resonance (ESR) spectrum, the catalase activity of the cells or microorganisms contained in the sample is measured, The sterilizing effect of the sterilizing agent is evaluated.
  • ESR electron spin resonance
  • the evaluation method of the bactericide according to the present invention catalyzes a reaction in which catalase decomposes hydrogen peroxide into water and oxygen, and therefore, by measuring the oxygen generated from this reaction by the ESR oximetry method, Catalase activity is measured.
  • Catalase activity is measured.
  • the catalase activity of the cells or microorganisms contained in the sample is measured based on the line width of the ESR spectrum.
  • the bactericidal effect of the bactericide can be evaluated.
  • the bactericidal agent may be a bactericidal agent for oral cavity according to the present invention.
  • a bactericidal agent an oral bactericidal agent, a bactericidal method, a bactericidal device and a bactericidal evaluation method capable of enhancing the bactericidal effect.
  • concentration of the ogon with respect to (a) Streptcoccusaureus, (b) Candidaalbicans of the catalase activity inhibitor of the fungicide of embodiment of this invention, (c) Streptcoccus ⁇ aureus, (d) The density
  • the sterilizer according to the embodiment of the present invention includes the sterilizer according to the present invention and a light emitting means.
  • the disinfectant contains hydrogen peroxide and a catalase activity inhibitor.
  • the catalase activity inhibitor consists of hornon or ryokcha.
  • the light emitting means is composed of a semiconductor laser capable of irradiating light having a wavelength of 350 nm to 500 nm.
  • the sterilization method according to the embodiment of the present invention is preferably performed by the sterilization apparatus according to the embodiment of the present invention.
  • a disinfectant containing hydrogen peroxide and a catalase activity inhibitor is brought into contact with the object to be disinfected.
  • the catalase activity inhibitor can reduce the catalase activity, and catalase reacts with hydrogen peroxide. Can be prevented.
  • the light to be sterilized is irradiated with light having a wavelength of 350 nm to 500 nm by the light emitting means.
  • the catalase activity inhibitor can reduce the catalase activity of cells and microorganisms present in the sterilization target, thus preventing the reduction of hydroxy radicals caused by the reaction of catalase with hydrogen peroxide. .
  • the catalase included in the cells or microorganisms present in the sterilized target is hydrogen peroxide that generates hydroxy radicals by the catalase activity inhibitor. It is possible to prevent the reaction from decreasing and to reduce the hydroxy radicals generated from hydrogen peroxide. As a result, the bactericidal effect of the hydroxy radicals can be enhanced.
  • the final concentrations shown in 1 were mixed to prepare five types of mixed solutions having final catalase concentrations of 0, 0.25, 0.5, 1.0, and 2.0 U / mL. ESR measurement is performed on the prepared mixed solution, and the measurement result is shown in FIG.
  • the catalase activity inhibitory action of the catalase activity inhibitor was measured.
  • a mixed solution was prepared by mixing to a concentration. Ogon, Ryokucha, and lemon balm were used as herbal medicines.
  • the crude drug used was filtered through a 0.22 ⁇ m filter in order to remove water-insoluble substances.
  • a mixed liquid sample (Milli Q water: MQ) to which no herbal medicine was added was also prepared.
  • the ESR measurement was performed on the obtained mixed liquid sample, the catalase activity was measured from FIG. 2 based on the line width of the ESR spectrum, and the measurement result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, a significantly higher catalase inhibitory effect was confirmed at 5% of the level of Ogon and Ryukaku compared to MQ (control) having no inhibitory effect on catalase activity (marked with * in FIG. 3). From this, it can be said that as a catalase activity inhibitor, ogon and ryokcha are preferable.
  • Streptcoccus aureus a catalase-positive bacterium
  • a sterilization target a bacterial suspension having a concentration of 10 7 cells / mL was prepared with physiological saline and used for the test.
  • a light emitting means a semiconductor laser (trade name “RV-1000”; manufactured by Ricoh Optical Co., Ltd.) was used.
  • the wavelength of irradiation light was 400 ⁇ 20 nm, the irradiation output was 300 mW, and the irradiation time was 2 minutes.
  • FIG. 6 (a) and (b) it was confirmed not only with Streptcoccus ⁇ ⁇ ⁇ aureus but with respect to Candida albicans that the bactericidal effect becomes large as the concentration of urgon increases. .
  • FIGS. 6 (c) and 6 (d) when ryokucha is used as a catalase activity inhibitor, the bactericidal effect generally increases as the concentration of ryokcha increases against Streptcoccus aureus and Candida albicans. Was confirmed.
  • or (d) it was also confirmed that a bactericidal effect increases dramatically by using a catalase activity inhibitor together with hydrogen peroxide and laser irradiation.
  • the catalase activity inhibitor can be sterilized more efficiently by combining with the hydroxyl radical sterilization by photolysis of hydrogen peroxide.
  • the present invention can be said to be effective for sterilization of highly pathogenic bacteria.

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Abstract

【課題】殺菌効果を高めることができる殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法を提供する。 【解決手段】過酸化水素と、オウゴンまたはリョクチャから成るカタラーゼ活性阻害剤とを含む殺菌剤を、口腔内の歯や義歯等の殺菌対象に接触させる。次に、半導体レーザーから成る発光手段により、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を殺菌対象に照射する。これにより、過酸化水素が光分解してヒドロキシラジカルを発生させ、発生したヒドロキシラジカルにより殺菌を行うことができる。

Description

殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法
　本発明は、殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法に関する。
　従来の殺菌方法として、過酸化水素などの酸化剤を殺菌対象に接触させ、４００ｎｍ～１０００ｎｍの波長の光を殺菌対象に照射する方法がある（例えば、特許文献１参照）。この方法によれば、過酸化水素に４００ｎｍ～１０００ｎｍの波長の光を照射してヒドロキシラジカルを発生させ、そのヒドロキシラジカルにより殺菌を行うことができる。
特開２００８－２８４３１２号公報
　特許文献１に記載の方法では、殺菌対象に存在する細胞や微生物が有するカタラーゼにより、一部の過酸化水素が分解されるため、それらの細胞や微生物に対する殺菌効果が低下するという課題があった。
　本発明は、このような課題に着目してなされたもので、殺菌効果を高めることができる殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法を提供することを目的としている。
　本発明者等は、殺菌対象に存在する細胞や微生物が有するカタラーゼが、高い抗菌性を有するヒドロキシラジカル生成の基質である過酸化水素を分解することを見出した。本発明者等は、カタラーゼ陽性細菌および真菌のStreptcoccus aureus ATCC 12693およびCandida albicans JCM 9061を使用し、これらとヒドロキシラジカルとの反応を、ＤＭＰＯ－ＯＨの変化を測定してLineweaver-Burk Plot で解析を行った。その結果を、図１に示す。
　図１に示すように、菌の細胞数が異なる全ての直線が、１／ＤＭＰＯ濃度のマイナス側で交わっており、S.aureus およびC.albicans がヒドロキシラジカルと反応するだけでなく、これら微生物が有するカタラーゼが過酸化水素と反応することが見出された。なお、S.aureus およびC.albicans がヒドロキシラジカルのみと反応するならば、１／ＤＭＰＯ－ＯＨ濃度軸上で、菌の細胞数が異なる全ての直線が交わり、カタラーゼが過酸化水素のみと反応するならば、菌の細胞数が異なる全ての直線が平行になるはずである。
　なお、図１に示す実験は、S.aureus およびC.albicans の細胞数を様々に変えた菌液２００μＬ（マイクロリットル）の各試料に、２５～３００ｍＭのラジカル捕捉材：ＤＭＰＯ（5,5-Dimethyl-pyrrolin-N-oxide）５０μＬを加え、さらに０．５Ｍの過酸化水素４５０μＬを加えてから、波長４００±２０ｎｍのＬＥＤ光を１分間照射し、１分後にＥＳＲ（電子スピン共鳴）測定を行うことにより、実施した。
　本発明者等は、図１に示す結果から、カタラーゼ活性阻害剤を加えて細胞や微生物のカタラーゼ活性を低下させることにより、効率的なヒドロキシラジカル殺菌を行えるとの知見を得て、本発明に至った。
　すなわち、本発明に係る殺菌剤は、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを含むことを、特徴とする。
　本発明に係る口腔用殺菌剤は、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを含むことを、特徴とする。
　本発明に係る殺菌剤および口腔用殺菌剤は、以下のようにして使用される。まず、本発明に係る殺菌剤および口腔用殺菌剤を、殺菌対象に塗布したりスプレーしたりすることにより、殺菌対象に接触させる。このとき、カタラーゼ活性阻害剤を含んでいるため、殺菌対象にカタラーゼ陽性細菌・真菌等の細胞や微生物が存在していても、それらのカタラーゼ活性を低下させることができ、カタラーゼが過酸化水素と反応するのを防ぐことができる。
　次に、殺菌対象に所定の波長の光を照射する。これにより、過酸化水素が光分解してヒドロキシラジカルを発生させるため、発生したヒドロキシラジカルにより殺菌を行うことができる。このときにも、カタラーゼ活性阻害剤により、殺菌対象に存在する細胞や微生物のカタラーゼ活性を低下させることができるため、カタラーゼが過酸化水素と反応することにより生ずるヒドロキシラジカルの減少を防ぐことができる。
　このように、本発明に係る殺菌剤および口腔用殺菌剤は、カタラーゼ活性阻害剤により、ヒドロキシラジカルを発生させる過酸化水素が、殺菌対象に存在する細胞や微生物が有するカタラーゼと反応して減少するのを防ぐことができ、結果として過酸化水素から発生するヒドロキシラジカルの減少が防げるので、ヒドロキシラジカルによる殺菌効果を高めることができる。
　本発明に係る殺菌方法は、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを殺菌対象に接触させ、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を前記殺菌対象に照射することを、特徴とする。
　本発明に係る殺菌方法は、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを殺菌対象に接触させたとき、殺菌対象にカタラーゼ陽性細菌・真菌等の細胞や微生物が存在していても、カタラーゼ活性阻害剤により、それらのカタラーゼ活性を低下させることができ、カタラーゼが過酸化水素と反応するのを防ぐことができる。
　また、殺菌対象に３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を照射することにより、過酸化水素が光分解してヒドロキシラジカルを発生させるため、発生したヒドロキシラジカルにより殺菌を行うことができる。このときにも、カタラーゼ活性阻害剤により、殺菌対象に存在する細胞や微生物のカタラーゼ活性を低下させることができるため、カタラーゼが過酸化水素と反応することにより生ずるヒドロキシラジカルの減少を防ぐことができる。
　このように、本発明に係る殺菌方法によれば、カタラーゼ活性阻害剤により、ヒドロキシラジカルを発生させる過酸化水素が、殺菌対象に存在する細胞や微生物が有するカタラーゼと反応して減少するのを防ぐことができ、結果として過酸化水素から発生するヒドロキシラジカルの減少が防げるので、ヒドロキシラジカルによる殺菌効果を高めることができる。
　本発明に係る殺菌方法で、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを殺菌対象に接触させる方法は、本発明に係る殺菌剤および口腔用殺菌剤を塗布したりスプレーしたりする方法や、殺菌対象を本発明に係る殺菌剤の溶液に浸漬する方法など、いかなる方法であってもよい。
　本発明に係る殺菌装置は、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤と、前記過酸化水素と前記カタラーゼ活性阻害剤とを接触させた殺菌対象に、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を照射可能に設けられた発光手段とを、有することを特徴とする。
　本発明に係る殺菌装置は、本発明に係る殺菌方法を好適に実施することができる。本発明に係る殺菌装置によれば、カタラーゼ活性阻害剤により、ヒドロキシラジカルを発生させる過酸化水素が、殺菌対象に存在する細胞や微生物が有するカタラーゼと反応して減少するのを防ぐことができ、結果として過酸化水素から発生するヒドロキシラジカルの減少が防げるので、ヒドロキシラジカルによる殺菌効果を高めることができる。
　本発明に係る殺菌装置で、過酸化水素およびカタラーゼ活性阻害剤は、本発明に係る殺菌剤または口腔用殺菌剤により構成されていてもよい。また、本発明に係る殺菌装置で、殺菌対象は口腔内の歯や義歯等から成り、カタラーゼ活性阻害剤は、カタラーゼ活性阻害剤を含む歯磨き粉やうがい薬等で構成されていてもよい。この場合、その歯磨き粉で歯等を磨いたり、うがい薬でうがいしたりした後、殺菌対象に過酸化水素を接触させて、発光手段により光を照射して、使用される。
　本発明に係る殺菌方法および殺菌装置で、光を照射する発光手段は、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を照射可能であれば、いかなるものであってもよく、例えば、発熱灯、蛍光灯、ハロゲンランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ（発光ダイオード）、半導体レーザー等である。照射する光は、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有していれば、単一の波長であっても、複数の波長を含んでいても、所定の帯域の波長から成っていてもよい。
　本発明に係る殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法および殺菌装置で、カタラーゼ活性阻害剤は、例えば、オウゴン、リョクチャ、ウイキョウ、ビワ、カンゾウ、アロエ、サルビア、ハマメリス、カミツレ、ローズマリー、メリッサ、またはモモを含むことが好ましい。特に、カタラーゼ活性阻害効果が高い、オウゴンまたはリョクチャを含むことが好ましい。
　本発明に係る殺菌剤の評価方法は、本発明に係る殺菌剤を接触させた殺菌対象から採取した試料と、４－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－Ｎ－オキサイド（ＴＥＭＰＯＬ）との混合液に対して電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定を行い、得られた電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトルの線幅に基づいて、前記試料に含まれる細胞または微生物のカタラーゼ活性を測定し、前記殺菌剤の殺菌効果の評価を行うことを、特徴とする。
　本発明に係る殺菌剤の評価方法は、カタラーゼが過酸化水素を水と酸素とに分解する反応を触媒していることから、この反応から発生する酸素をＥＳＲオキシメトリー法により測定することで、カタラーゼ活性を測定するものである。また、ＴＥＭＰＯＬのＥＳＲスペクトルの線幅とカタラーゼ濃度との間には、正の相関関係が認められることから、ＥＳＲスペクトルの線幅に基づいて、試料に含まれる細胞または微生物のカタラーゼ活性を測定し、殺菌剤の殺菌効果の評価を行うことができる。なお、殺菌剤は、本発明に係る口腔用殺菌剤であってもよい。
　本発明によれば、殺菌効果を高めることができる殺菌剤、口腔用殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法を提供することができる。
過酸化水素の光分解により生成されたヒドロキシルラジカルと（ａ）S.aureusとの反応動態解析、（ｂ）C.albicansとの反応動態解析を示すグラフである。 本発明の実施の形態の殺菌剤の評価方法に基づいた、カタラーゼ濃度とＴＥＭＰＯＬのＥＳＲスペクトルの線幅との関係を示すグラフである。 本発明の実施の形態の殺菌剤のカタラーゼ活性阻害剤としての使用が検討される各種の生薬の、カタラーゼ活性の阻害作用を示すグラフである。 本発明の実施の形態の殺菌剤のカタラーゼ活性阻害剤の、Streptcoccus aureusに対するオウゴンによる殺菌効果の増強効果を示すグラフである（図中のＨは過酸化水素、Ｌはレーザー照射、Ｏはオウゴン（１ｍｇ／ｍＬ）、＋は有り、－は無し、を表わす）。 本発明の実施の形態の殺菌剤のカタラーゼ活性阻害剤の、Streptcoccusaureusに対するオウゴンの濃度による殺菌効果を示すグラフである。 本発明の実施の形態の殺菌剤のカタラーゼ活性阻害剤の、（ａ）Streptcoccusaureus、（ｂ）Candidaalbicansに対するオウゴンの濃度による殺菌効果を示すグラフ、（ｃ）Streptcoccus aureus、（ｄ）Candidaalbicansに対するリョクチャの濃度による殺菌効果を示すグラフである（図中のＨは過酸化水素、Ｌはレーザー照射、＋は有り、－は無し、を表わす）。
　以下、本発明の実施の形態の殺菌剤、殺菌方法、殺菌装置および殺菌剤の評価方法について説明する。
　本発明の実施の形態の殺菌装置は、本発明に係る殺菌剤と発光手段とを有している。
　殺菌剤は、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを含んでいる。カタラーゼ活性阻害剤は、オウゴンまたはリョクチャから成っている。
　発光手段は、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を照射可能な半導体レーザーから成っている。
　本発明の実施の形態の殺菌方法は、本発明の実施の形態の殺菌装置により好適に実施される。まず、過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを含む殺菌剤を、殺菌対象に接触させる。このとき、殺菌対象にカタラーゼ陽性細菌・真菌等の細胞や微生物が存在していても、カタラーゼ活性阻害剤により、それらのカタラーゼ活性を低下させることができ、カタラーゼが過酸化水素と反応するのを防ぐことができる。
　次に、発光手段により、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を殺菌対象に照射する。これにより、過酸化水素が光分解してヒドロキシラジカルを発生させるため、発生したヒドロキシラジカルにより殺菌を行うことができる。このときにも、カタラーゼ活性阻害剤により、殺菌対象に存在する細胞や微生物のカタラーゼ活性を低下させることができるため、カタラーゼが過酸化水素と反応することにより生ずるヒドロキシラジカルの減少を防ぐことができる。
　このように、本発明の実施の形態の殺菌剤、殺菌方法および殺菌装置によれば、カタラーゼ活性阻害剤により、ヒドロキシラジカルを発生させる過酸化水素が、殺菌対象に存在する細胞や微生物が有するカタラーゼと反応して減少するのを防ぐことができ、結果として過酸化水素から発生するヒドロキシラジカルの減少が防げるので、ヒドロキシラジカルによる殺菌効果を高めることができる。
　カタラーゼ活性とＴＥＭＰＯＬのＥＳＲスペクトルの線幅との関係を求める試験を行った。１００μＬのカタラーゼ（和光純薬工業株式会社製）と、２５μＬのＴＥＭＰＯＬ（Sigma-Aldrich Corporation 製）と、１２５μＬの過酸化水素（三徳化学工業株式会社製）とをそれぞれ超純水で稀釈し、表１に示す最終濃度になるよう混合して、カタラーゼの最終濃度が０、０．２５、０．５、１．０、２．０Ｕ／ｍＬの５種類の混合液を作成した。作成した混合液に対してＥＳＲ測定を行い、その測定結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図２に示すように、ＴＥＭＰＯＬのＥＳＲスペクトルの線幅とカタラーゼ濃度との間には、高い正の相関関係が認められることが確認された。この結果から、ＥＳＲスペクトルの線幅に基づいて、検査試料のカタラーゼ活性を測定することができる。
　図２の結果を用いて、カタラーゼ活性阻害剤によるカタラーゼ活性の阻害作用の測定を行った。５０μＬのカタラーゼと、２５μＬのＴＥＭＰＯＬと、カタラーゼ活性の阻害作用を有すると考えられる５０μＬの生薬と、１２５μＬの過酸化水素とをそれぞれ超純水（ミリＱ水）で稀釈し、表２に示す最終濃度になるよう混合して混合液を作成した。生薬として、オウゴン、リョクチャ、レモンバームを使用した。また、生薬は、水に不溶な物質を除去するために、０．２２μｍのフィルターでろ過したものを使用した。また、比較のため、生薬を加えない混合液試料（ミリＱ水：ＭＱ）も作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　得られた混合液試料に対してＥＳＲ測定を行い、そのＥＳＲスペクトルの線幅に基づいて、図２からカタラーゼ活性を測定し、その測定結果を図３に示す。図３に示すように、カタラーゼ活性阻害作用のないＭＱ（コントロール）に比べて、オウゴンとリョクチャで、有意水準５％で有意に高いカタラーゼ阻害作用が確認された（図３中の＊印）。このことから、カタラーゼ活性阻害剤として、オウゴンおよびリョクチャが好ましいといえる。
　カタラーゼ活性阻害剤による殺菌効果の増強効果を調べる試験を行った。試験には、殺菌の対象として、カタラーゼ陽性の細菌であるStreptcoccus aureusを用いた。この細菌を使用して、生理食塩水で１０７cells／ｍＬの濃度の細菌懸濁液を作成し、試験に用いた。発光手段として、半導体レーザー（商品名「ＲＶ－１０００」；リコー光学株式会社製）を用い、照射光の波長４００±２０ｎｍ、照射出力を３００ｍＷ、照射時間を２分間とした。１００μＬの細菌懸濁液と、１５０μＬの過酸化水素とを、それぞれ表３に示す最終濃度になるように、９６ウェル・マイクロプレート中で混合した。カタラーゼ活性阻害剤としてオウゴンを用い、超純水に希釈後、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌を行い、最終濃度がそれぞれ０、１、３ｍｇ／ｍＬとなるように、細菌懸濁液と過酸化水素との混合液に添加して試験試料を作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　試験試料の作成後、直ちにレーザー照射を行い、照射後の試料５０μＬと、５０００Ｕ／ｍＬのカタラーゼ５０μＬとを混合して、過酸化水素の反応を停止させた。その後、１０倍希釈系列を作成し、ＢＨＩ寒天培地に播種して、３７℃の好気的条件下で２４時間培養した後、殺菌効果の評価を行った。また、殺菌の対象として、カタラーゼ陽性真菌であるCandida albicansを用いた場合、および、カタラーゼ活性阻害剤としてリョクチャを用いた場合についても、同様の試験を行った。また、比較試験として、過酸化水素、カタラーゼ活性阻害剤、およびレーザー照射の有無による殺菌効果の評価も行った。これらの試験結果を、図４乃至図６に示す。
　図４に示すように、濃度１ｍｇ／ｍＬでオウゴンを加えた場合〔図４中のＨ（＋）Ｌ（＋）Ｏ（＋）〕、オウゴンを添加していない場合〔図４中のＨ（＋）Ｌ（＋）Ｏ（－）〕に比べて、Streptcoccus aureusに対して約１０倍の殺菌効果が得られることが確認された。また、過酸化水素なしでオウゴンのみの場合〔図４中のＨ（－）Ｌ（－）Ｏ（＋）〕や、オウゴンのみに光照射を行った場合〔図４中のＨ（－）Ｌ（＋）Ｏ（＋）〕、過酸化水素のみの場合〔図４中のＨ（＋）Ｌ（－）Ｏ（－）〕、光照射がない場合〔図４中のＨ（＋）Ｌ（－）Ｏ（＋）〕では、Streptcoccus aureusに対する殺菌効果は得られないことが確認された。
　次に、図５に示すように、カタラーゼ活性阻害剤のオウゴンの濃度を変えた場合、オウゴンの濃度が高くなるに従って、Streptcoccus aureusに対する殺菌効果も大きくなることが確認された。例えば、オウゴンの濃度が３ｍｇ／ｍＬの場合、カタラーゼ活性阻害剤を使用しない過酸化水素のみのヒドロキシルラジカル殺菌（オウゴンの濃度０ｍｇ／ｍＬ）に比べて、Streptcoccus aureusに対して約１０００倍の殺菌作用が得られた。
　また、図６（ａ）および（ｂ）に示すように、Streptcoccus aureusに対してだけでなく、Candida albicansに対しても、オウゴンの濃度が高くなるに従って、殺菌効果が大きくなることが確認された。図６（ｃ）および（ｄ）に示すように、カタラーゼ活性阻害剤としてリョクチャを用いた場合も、Streptcoccus aureusおよびCandida albicansに対して、リョクチャの濃度が高くなるに従って、概ね殺菌効果が大きくなることが確認された。また、図６（ａ）乃至（ｄ）に示すように、カタラーゼ活性阻害剤を、過酸化水素およびレーザー照射と併用することにより、殺菌効果が飛躍的に高まることも確認された。
　図４乃至図６の結果から、カタラーゼ活性阻害剤を、過酸化水素の光分解によるヒドロキシルラジカル殺菌と組み合わせることにより、より効率的に殺菌を行うことができるといえる。また、細菌の有するカタラーゼ活性と病原性との間には相関があり、酸化ストレスに対する防御機構が高い細菌ほど感染症を引き起こす可能性が高いといわれていることから、カタラーゼ活性阻害剤を併用した本発明は、病原性の高い細菌の殺菌にも有効であるといえる。
 

Claims (6)

  1. 　過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを含むことを、特徴とする殺菌剤。
  2. 　前記カタラーゼ活性阻害剤はオウゴンまたはリョクチャを含むことを、特徴とする請求項１記載の殺菌剤。
  3. 　過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを含むことを、特徴とする口腔用殺菌剤。
  4. 　過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤とを殺菌対象に接触させ、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を前記殺菌対象に照射することを、特徴とする殺菌方法。
  5. 　過酸化水素とカタラーゼ活性阻害剤と、
    　前記過酸化水素と前記カタラーゼ活性阻害剤とを接触させた殺菌対象に、３５０ｎｍ乃至５００ｎｍの波長を有する光を照射可能に設けられた発光手段とを、
    　有することを特徴とする殺菌装置。
  6. 　請求項１または２記載の殺菌剤を接触させた殺菌対象から採取した試料と、４－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－Ｎ－オキサイド（ＴＥＭＰＯＬ）との混合液に対して電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定を行い、得られた電子スピン共鳴（ＥＳＲ）スペクトルの線幅に基づいて、前記試料に含まれる細胞または微生物のカタラーゼ活性を測定し、前記殺菌剤の殺菌効果の評価を行うことを、特徴とする殺菌剤の評価方法。
     
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