WO2013066200A2 - Processo de produção de vinhos sem adição de anidrido sulfuroso por utilização de filmes com base em quitosana - Google Patents

Processo de produção de vinhos sem adição de anidrido sulfuroso por utilização de filmes com base em quitosana Download PDF

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WO2013066200A2
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Manuel António Coimbra Rodrigues da SILVA
Cláudia Sofia Cordeiro NUNES
Élia Sofia Oliveira MARICATO
Ângela Maria Martins Vieira da CUNHA
Sónia Alexandra Leite Velho Mendo BARROSO
José António Lopes da SILVA
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Dão Sul - Sociedade Vitivinícola S.A.
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Definitions

  • the present invention relates to a winemaking process using the traditional vinification process without the addition of sulfur dioxide, with the addition of a chitosan-based film in contact with wine after fermentation.
  • the present invention further relates to a process of preparing the chitosan-based film by modifying chitosan with natural compounds which enable the production of acid-stable chitosan films with high antioxidant activity and maintaining antimicrobial activity.
  • the addition of a chitosan-based film having anti-microbial and anti-oxidant properties, together with low acid solubility in the winemaking process after fermentation, provides good wine preservation while maintaining its good quality, in particular its organoleptic properties and avoiding the addition of sulfur dioxide.
  • the winemaking process involves the preservation of the wine under conditions that allow its storage without favoring the growth of microorganisms that affect the quality of the wine, changing its organoleptic properties.
  • Grapes contain a high amount of phenolic compounds in the film, pulp and pips, and these are partially transferred to the wine during the winemaking process. Thus, grapes, wine and by-products of winemaking are a good source of phenolic compounds.
  • the main phenolic compounds present are flavonoids (anthocyanins, flavan-3-ols and flavonols), stilbenes (resveratrol), phenolic acids (cinnamic and benzoic acid derivatives) and tannins.
  • Vinification by-products have been used as a source of bioactive compounds, mainly due to the presence of phenolic compounds, for incorporation into cosmetic, pharmaceutical and food products (US Patent Application 2006078568 Al; US Patent Application 2003108493 Al;).
  • European patent application EP 0448674 A1 discloses a vinification process without the addition of sulfur dioxide which consists of the addition of by-products of vinification containing these phenolic compounds before, during and after fermentation.
  • Chitosan is a polysaccharide consisting of D-glucosamine and N-acetti-D-glucosamine residues, where D-glucosamine residues are the majority, ie wherein the degree of acetylation is less than 50%.
  • This polysaccharide is, in industrial and commercial environments, called "chitosan".
  • the name chitosan is, however, the one recommended by the Carbohydrate Nomenclature and will therefore be used throughout the text.
  • Solubilization of chitosan in aqueous media is due to the protonation of the C2 -NH2 group from D-glucosamine residues, which occurs in dilute acid solutions (pH below 6.0, when the -NH2 group is mostly protonated and converted to (N + 3 + , since the pKa of the glucosamine amino group is 6.3).
  • this protonation will influence the antimicrobial properties of chitosan which depend essentially on the ratio of the number of -NH3 + groups to the -NH2 groups in the chitosan chains.
  • the size of molecules is also an important factor for their antimicrobial properties.
  • chitosan's antioxidant activity is related to its size and degree of acetylation. Chitosan with a lower degree of acetylation has higher anti-oxidant activity as it allows greater complexation with metal ions such as Fe 2+ or Cu + (participants in the Fenton reaction).
  • chitosan the biological properties already described but also the possibility of various chemical reactions such as acetylation, quaternization, reactions with aldehydes and ketones (which give Schiff bases), alkylation or chelation of metals, allowing obtaining a wide variety of modified chitosans, increasing their application potentials.
  • Chemical bonding (grafting) and crosslinking are the most commonly used methods for chemical modification of chitosan to alter its physical, chemical and mechanical properties. Covalent binding of molecules to the chitosan backbone allows materials with improved properties to be obtained, notably by binding of antioxidants, antifungals, antibacterials and other nutrients with different biological properties.
  • One of the characteristics that has been improved in chitosan-based matrices is their anti-oxidant ability by incorporating natural antioxidants such as phenolic compounds (US Patent Application 2011059162 Al).
  • Covalent binding of molecules to the chitosan chain has already been accomplished using different methods, such as by radical mechanism using an oxidizing agent, use of ⁇ radiation (US Patent Application 2005272876 Al) or use of enzymes.
  • oxidizing agents potassium persulfate (KPS) and ammonium hexanitrocerate (IV). These reagents are mainly used to bind molecules having vinyl bonds.
  • Cross-linking the polymer by a molecule which bridges the bond of two or more chitosan molecules, leads to the formation of a three-dimensional covalent network.
  • cross-linking agent which bridges the bond of two or more chitosan molecules.
  • the formation of strong and permanent intermolecular bonds allows the polymer properties to be improved, namely mechanical strength, chemical stability, water absorption capacity and solubility, while maintaining biological properties.
  • genipine has been used very successfully as a cross-linking agent for chitosan due to its characteristics.
  • This compound is the aglycone of the geniposide present in the fruit of Gardenia (originating in China).
  • Genipine reacts rapidly with amino groups, resulting in blue pigments that are used as a natural food coloring.
  • Many studies have emerged on the use of genipine as a cross-linking agent for chitosan as it is less cytotoxic, for example about 5000 to 10,000 times less than glutaraldehyde.
  • Genipine-added films have better mechanical properties, namely higher tensile strength, are more stable in water and the antimicrobial activity is equal to that of chitosan-only film.
  • US Patent Application US 20070299034 A1 discloses the process of obtaining polymers of chitin, chitosan or chitin-glucan complex from fungal and yeast biomass and further reports possible applications of these polymers in various areas, including fermented beverages. as clarifying.
  • the present invention relates to a winemaking process comprising winemaking by the traditional method without the addition of sulfur dioxide, further comprising: a) preparing a chitosan film by adding a crosslinker to the chitosan; or b) preparing a modified chitosan film comprising:
  • step c) 100 cm 2 of chitosan-based film is contacted with 750 ml of wine.
  • step b) the chitosan modification comprises the steps of:
  • step b) the formation of the modified chitosan film comprises the steps of:
  • step b) neutralization of the chitosan based film comprises the steps of: neutralizing the modified chitosan based film with NaOH solution for 1 hour and washing with water to pH 6; and
  • the antioxidant phenolic compound is selected from the group consisting of caffeic acid and antioxidant phenolic compounds extracted from grapes or wine.
  • caffeic acid is used in a ratio of 3 mg caffeic acid per gram of chitosan solution.
  • the antioxidant phenolic compounds extracted from grape or wine are selected from phenolic acids and anthocyanins.
  • the antioxidant phenolic compounds extracted from grape or wine are used in a ratio of 0.7 mg extract per gram of chitosan solution.
  • the oxidant is selected from potassium persulphate (KPS) and ammonium hexanitrocerate (IV).
  • the oxidant is 60 mM ammonium hexanitrocerate (IV) in a ratio of 1 ml CAN solution per gram chitosan solution.
  • the plasticizer is glycerol in a ratio of 1% w / w per solution mass.
  • the crosslinking agent is genipine in a 0.05% to film ratio.
  • the present invention further relates to the chitosan based film production process for application in the wine making process.
  • Figure 1 graphically represents a sensory analysis of white wines, after 9 months, produced with sulfur dioxide addition, according to traditional vinification (sulfur dioxide - "Sulfuroso”) and wines without sulfur dioxide, subjected to contact with the sulfur dioxide.
  • Chitosan based film Chitosan film).
  • Figure 2 graphically represents the solubility (mass loss) of the modified chitosan based film by binding to genipine and caffeic acid and the unmodified chitosan film in a pH 3.5 aqueous solution for 7 days at room temperature with stirring. constant (Example 4).
  • Figure 3 graphically represents the antioxidant activity (% inhibition) of the modified chitosan-based film by binding to genipine and caffeic acid and the unmodified chitosan film (Example 4).
  • Figure 4 graphically represents the solubility (% mass loss) and anti-oxidant (inhibitory) activity of the modified chitosan-based film by ligating phenolic compounds extracted from wine and cross-linked with genipine and the unmodified chitosan film (Example 5).
  • the present invention relates to a winemaking process using the traditional vinification method, with the addition of a chitosan-based film in contact with wine after fermentation as an alternative to the addition of sulfur dioxide. common to prior art wine production processes for wine conservation.
  • the present invention further relates to the process of producing a genipine cross-linked, chemically modified chitosan-based film by covalently bonding anti-oxidant phenolic compounds for addition to the winemaking process of the present invention.
  • this film has, in addition to the anti-microbial properties of chitosan, an increase in antioxidant properties compared to chitosan and, at the same time, a low acid solubility resulting in a film which, when in contact with wines, prolongs its shelf life and quality while maintaining its organoleptic properties unchanged.
  • the process of producing chitosan-based film modified by covalently bonding anti-oxidant phenolic compounds with genipine in accordance with the present invention is described below.
  • the process of producing modified chitosan with the binding of natural molecules consists in the addition of an oxidizing reagent to the chitosan solution in an acid medium and at the same time the molecules to be bound.
  • the first step is to dissolve the medium molecular weight chitosan in an acidic aqueous solution with stirring for at least 16 hours, preferably at room temperature, so that the chitosan solution has a concentration of approximately 1.5% ( m / V).
  • an oxidant selected from potassium persulfate (KPS) and ammonium hexanitrocerate (IV), preferably 60 mM ammonium hexanitrocerate (IV), This addition is made in a ratio of 1 ml of oxidant per gram of chitosan solution.
  • a phenolic compound is added.
  • antioxidant selected from the group consisting of caffeic acid and antioxidant phenolic compounds extracted from grapes or wine.
  • the modified chitosan-based film is then prepared by dissolving the chitosan previously obtained in a 5% V / V acetic acid solution and a plasticizer such as glycerol at a concentration of 1% relative to that solution. to the solution mass and the mixture is homogenized at a temperature between 40 and 60 ° C, preferably at 50 ° C, in a water bath for 10 minutes. This mixture is allowed to cool to room temperature while maintaining constant stirring (approximately 30 minutes). To this solution is added a crosslinking agent, genipine, in a ratio of 0.05% relative to the film mass and then filtered and degassed is plated (0.2 g solution per cm 2 ). .
  • a plasticizer such as glycerol
  • Genipine reacts with chitosan for at least 6 hours at room temperature.
  • the plate is then placed in a 35 ° C oven for solvent evaporation (about 16 hours).
  • the obtained film is washed to remove all compounds that are not covalently bound to the chitosan molecules, preferably in a methanol Soxhlet extractor for about 2 hours (12 cycles / hour).
  • ethanol may be used as a solvent for washing the film. After washing, the film is allowed to dry at room temperature.
  • a contact neutralization treatment with a sodium hydroxide solution is required.
  • the film is placed in a 1 M NaOH solution for 1 hour. After this time, wash thoroughly with distilled water to completely remove NaOH and dry at room temperature for at least 18 hours.
  • the final pH of the film should be approximately 6.
  • the use of the film obtained in the winemaking process occurs after fermentation, preferably in the wine bottling step, wherein the chitosan-based film is placed in a bottle for wine stabilization.
  • the area of the film to apply depends on the properties of the film and the type of wine. In a white wine it is sufficient to add a 100 cm 2 genipine cross-linked chitosan film to a bottle. After placement of the film, the wine bottle can be stored and manipulated following the practice of traditional winemaking.
  • the process according to the present invention not only preserves the antimicrobial activity characteristic of chitosan, but also confers a surprisingly increased antioxidant activity over chitosan and also solubility in acid medium. very low, either in relation to chitosan or modified chitosan using only genipine as cross-linking agent (see examples 4 and 5).
  • the solubility of the films is determined by the percentage of mass loss of the films after being immersed 7 days in an aqueous solution at pH 3.5 over a 4 cm 2 area of film in 30 ml of orbital shaking solution at room temperature. room temperature.
  • the antioxidant activity of the films is determined by the acid method.
  • Ab is the absorbance value of ABTS + * without film
  • Aa is the absorbance value of ABTS + * in the presence of the film (both after
  • Antimicrobial activity is determined in a yeast culture (Sacharomyces cerevisae). Yeasts are inoculated in a liquid medium, YEPD (consisting of 0.5% yeast extract, 1% meat bacteropeptone and 1% glucose) so that there are approximately 100 cells per mL. The films are placed in this suspension, at a ratio of 4 cm 2 of film per 10 mL, which is incubated at 25 ° C and with an orbital shaking of 160 rpm. Cell viability is determined after 48 hours by inoculation into plates containing YEPDA. Colony forming units (CFUs) are determined after 36 hours at 25 ° C.
  • Chitosan was dissolved in 5% (V / V) aqueous acetic acid solution for 4 hours with stirring at room temperature. After complete dissolution, 1% w / w glycerol was added and the mixture was homogenized at 50 ° C in a water bath for 10 minutes. The mixture was allowed to cool to room temperature while maintaining constant stirring (approximately 30 minutes). To this mixture was added a 10% (m / V) solution of genipine in ethanol, so that the concentration of genipine in the film was 0.05%. The mixture was homogenized for 30 minutes with constant stirring. The solution was filtered under vacuum with a porous plate funnel (size G2) and degassed under vacuum. The solution was transferred to a plate (0.2 g / cm 2 ) and 6 hours after genipine addition the plate was placed in an oven at 35 ° C for about 16 hours to form the film by solvent evaporation. .
  • Chitosan was dissolved in an aqueous 5% V / V acetic acid solution with stirring for 16 hours at room temperature so that the chitosan solution had a concentration of approximately 1.5% (m / V ). Thereafter, 1 mL of 60 mM ammonium hexanitrocerate (IV) was added to the chitosan solution in a ratio of 1 mL of oxidant per gram of chitosan solution. At the same time, 0.7 mg of wine extracts per gram of chitosan solution was added. After mixing all reagents, N 2 (g) was bubbled through the mixture placed in a dark 40 ° C water bath for 3 hours with constant stirring. After the reaction, acetone was added to precipitate the modified chitosan. The precipitate formed was obtained by centrifugation (15,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C) and washed with methanol for 1 hour.
  • the solution was filtered under vacuum with a porous plate funnel (size G2) and degassed under vacuum.
  • the solution was transferred to a plate (0.2 g / cm 2 ) and 6 hours after genipine addition the plate was placed in an oven at 35 ° C to form the film by solvent evaporation (about 16 hours). .
  • the film obtained was washed on a Soxhlet extractor with methanol for about 2 hours (12 cycles / hour). After washing, the film was allowed to dry at room temperature. 2.5. Modified chitosan-based film neutralization
  • the film was placed in 1 M NaOH solution for 1 hour. After this time, it was washed thoroughly with distilled water to completely remove NaOH and dried at room temperature for 18 hours. The final pH of the obtained film was approximately 6.
  • Example 3 Production of wine in contact with a chitosan based film.
  • a white wine was produced according to the traditional vinification method, except that no sulfur dioxide was added, but brought into contact with a chitosan-based film (genipine cross-linked chitosan). After 9 months of storage the wine was microbiologically stable, as it did not present any yeast and bacterial colony forming unit.
  • Physicochemical analyzes showed that, compared to wine containing SOi, wine in contact with the film had the same antioxidant activity and composition in phenolic compounds. However, the color of the wines was different, with white wine that was in contact with chitosan a less intense color. According to the CIELAB parameters, this wine was also greener and less yellow in color than wine without sulfur dioxide but not in contact with the chitosan-based film.
  • a chitosan-based film was prepared according to example 1 and another of genipine cross-linked chitosan.
  • Figure 2 shows the solubility of these films and, as a comparison, that of an unmodified chitosan-based film prepared by the same procedure.
  • Chitosan-based films produced with caffeic acid and genipine or only with genipine have about 45% lower solubility in acid medium than films produced with chitosan without chemical modification.
  • Film neutralization decreases the solubility of chitosan-based films, with the modified covalent bonded film of caffeic acid and genipine having a solubility of approximately 10% ( Figure 2), which represents a 36% decrease. compared to the untreated film.
  • Figure 3 The antioxidant activity of chitosan based films with caffeic acid and / or genipine as well as unmodified chitosan with and without neutralization with NaOH is shown in Figure 3.
  • Cell suspensions containing the films, caffeic acid and / or genipine modified chitosan prepared film, and unmodified chitosan prepared film showed no CFU after 48 hours of incubation, while the control (cell suspension inoculated on same conditions but without film addition) showed 8x10 7 CFU / mL.
  • the crosslinked film with genipine and chitosan-linked caffeic acid molecules has low acid solubility and high anti-oxidant activity compared to an unmodified chitosan-based film.
  • the modified chitosan film retained antimicrobial activity.
  • the wine extracts were obtained by solid phase extraction (SPE) with a Cie (octadecyl) polymer.
  • SPE solid phase extraction
  • Cie octadecyl
  • the column was activated with methanol and washed with distilled water before use.
  • the red wine was distilled at atmospheric pressure to remove ethanol.
  • the resulting de-alcoholized residue was passed through the Cys column at wine pH (about 3.5).
  • the non-retained fraction was eluted with distilled water and then the phenolic compounds were eluted with methanol containing 0.1% HCl (acidic methanol).
  • the pH of this fraction was raised to 7 by addition of 1 M NaOH and was diluted 2 times with 0.1 M phosphate buffer at pH 7.
  • Column Cia was washed with 0.1 M phosphate buffer solution at pH 7.
  • the fraction eluting with acidic methanol contained in the pH 7 solution was again applied to the C18 column and the non-retained fraction, eluted with the pH 7 buffer, was collected.
  • This fraction rich in phenolic acids at a concentration of 2.4 g / l (in gallic acid equivalents), consisted mainly of caffeic, gallic and coumaric acids, among others.
  • After elution with the pH 7 buffer elution with ethyl acetate and finally with acidic methanol (methanol with 0.1% HCl).
  • the fraction eluting with acidic methanol was mostly anthocyanins, with malvidin-3-glucoside being the most abundant anthocyanin (representing about 60%).
  • This fraction which was used to add to the chitosan-based films contained a concentration of phenolic compounds of 2.2 g / l (in gallic acid equivalents).
  • a genipine cross-linked chitosan based film was prepared and covalently linked with phenolic acids or anthocyanins from a wine extract according to example 2.
  • An unmodified chitosan based film was prepared following the same procedure for be used as a comparison. The films were treated with NaOH.
  • Figure 4 shows the acid solubility after 7 days and the antioxidant activity of the film obtained by cross-linking with genipine and addition of the antioxidant phenolic compounds extracted from wine and the unmodified chitosan based film prepared. using the same procedure.
  • the solubility and anti-oxidant activity of the films were determined as described above, except for the reaction time of the films with ABTS + 'solution, to determine the antioxidant activity, which was only 48 hours.
  • the modified chitosan based film has a solubility of approximately 12%, being 58% lower than the unmodified chitosan based film solubility.
  • the antioxidant activity of the film with genipine cross-linked chitosan and the addition of anti-oxidant phenolic compounds extracted from wine is higher (about 100%) than that of the chitosan-based film.
  • Film produced with genipine cross-linked chitosan and added anthocyanins extracted from wine showed identical antioxidant activity (83% inhibition after 48 hours reaction with ABTS + * solution) to that of chitosan prepared film crosslinked with genipine and with covalent bonding of phenolic acids from the same wine extract.
  • the chitosan prepared film crosslinked with genipine and with the addition of wine extract has a much higher antioxidant activity, since after 48 hours already had a higher inhibition percentage (87%) than the other film had after 72 hours, about 75% (Figure 3).
  • the acid solubility (after 7 days) of the two films was identical, approximately 10% ( Figures 2 and 4).

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  • Anti-Oxidant Or Stabilizer Compositions (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo de produção de vinho utilizando o processo de vinificação tradicional com a excepção de, após a fermentação, o vinho ser colocado em contacto com um filme à base de quitosana e sem adição de anidrido sulfuroso ao vinho. A presente invenção refere-se ainda a um processo de preparação do filme à base de quitosana por modificação da quitosana com compostos naturais que permitem produzir filmes de quitosana estáveis em meio ácido, com elevada actividade antioxidante e mantendo a actividade antimicrobiana. Numa forma de realização, os filmes são preparados por ligação covalente à quitosana de moléculas que permitem aumentar a sua insolubilidade em meio ácido, como por exemplo a genipina, e de moléculas com elevada actividade antioxidante, como por exemplo o ácido cafeico ou extractos de uva ou vinho ricos em compostos com actividade antioxidante.

Description

"PROCESSO DE PRODUÇÃO DE VINHOS SEM ADIÇÃO DE ANIDRIDO SULFUROSO POR UTILIZAÇÃO DE FILMES COM BASE EM QUITOSANA"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um processo de produção de vinho utilizando o processo de vinificação tradicional sem adição de anidrido sulfuroso, com a adição de um filme à base de quitosana em contacto com o vinho após a fermentação. A presente invenção refere-se ainda a um processo de preparação do filme à base de quitosana por modificação da quitosana com compostos naturais que permitem produzir filmes de quitosana estáveis em meio ácido, com elevada actividade antioxidante e mantendo a actividade antimicrobiana. A adição de um filme à base de quitosana, possuindo propriedades anti- microbianas e anti-oxidantes, em simultâneo com uma baixa solubilidade em meio ácido, no processo de produção de vinho após a sua fermentação, proporciona uma boa conservação do vinho mantendo a sua qualidade, nomeadamente as suas propriedades organolépticas e evitando a adição de anidrido sulfuroso.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O processo de produção vinícola envolve o passo de conservação do vinho em condições que permitam o seu armazenamento sem favorecer o crescimento de microrganismos que afectem a qualidade do vinho, alterando as suas propriedades organolépticas.
Um dos processos mais utilizados para a conservação do vinho é a adição de anidrido sulfuroso, uma vez que este composto inibe o crescimento de microrganismos e actua como anti-oxidante, impedindo o escurecimento do vinho. No entanto, embora o anidrido sulfuroso seja um dos conservantes mais completos e eficientes, a sua utilização está associada ao desencadeamento de reacções alérgicas, originando sintomas como dores de cabeça, náuseas, irritações gástricas e dificuldades respiratórias, sobretudo em doentes asmáticos. Como consequência, a concentração máxima de anidrido sulfuroso nos vinhos tem vindo a ser progressivamente reduzida.
Na tentativa de minimizar o impacto do anidrido sulfuroso nos consumidores, têm sido testados diferentes métodos para substituir a sua adição no processo de produção de vinhos: adição de ácido ascórbico, dimetildicarbonato (DMDC), resveratol e/ou estilbenos (Pedido de Patente US 2009175984 Al), lisozima (Pedido de Patente US 2008026100 Al; Pedido de Patente US 2010034923 Al) e nisina, assim como a utilização de novas tecnologias como os campos eléctricos pulsados e alta pressão hidrostática.
A uva contém uma elevada quantidade de compostos fenólicos na película, na polpa e nas grainhas, e estes são parcialmente transferidos para o vinho durante o processo de vinificação. Assim, as uvas, o vinho e os subprodutos da vinificação são uma boa fonte de compostos fenólicos. Os principais compostos fenólicos presentes são os flavonóides (antocianinas, flavan-3-óis e flavonóis), os estilbenos (resveratrol), os ácidos fenólicos (derivados dos ácidos cinâmicos e benzóicos) e os taninos.
Os subprodutos da vinificação têm vindo a ser utilizados como fonte de compostos bioactivos, principalmente devido à presença de compostos fenólicos, para incorporação em produtos cosméticos, farmacêuticos e alimentares (Pedido de Patente US 2006078568 Al; Pedido de Patente US 2003108493 Al;). O pedido de patente Europeia EP 0448674 Al divulga um processo de vinificação sem adição do anidrido sulfuroso que consiste na adição dos subprodutos da vinificação, que contêm estes compostos fenólicos, antes, durante e após a fermentação.
A quitosana é um polissacárido constituído por resíduos de D-glucosamina e N-acetti-D-glucosamina, em que os resíduos de D-glucosamina são maioritários, ou seja, em que o grau de acetilação é inferior a 50% . Este polissacárido é, em ambientes industriais e comerciais, designado por "quitosano" . A designação quitosana é, no entanto, a recomendada pela Nomenclatura de Hidratos de Carbono e, por esse motivo, será utilizada ao longo do texto.
A solubilização da quitosana em meios aquosos deve-se à protonação do grupo -NH2 do C2 dos resíduos de D-glucosamina, que ocorre em soluções ácidas diluídas (pH abaixo de 6,0, quando o grupo -NH2 é maioritariamente protonado e convertido a -NfÍ3+, dado que o pKa do grupo amina da glucosamina é de 6,3).
Como consequência, esta protonação irá influenciar as propriedades anti-microbianas da quitosana que dependem essencialmente da razão do número de grupos -NH3+ em relação aos grupos -NH2 existentes nas cadeias de quitosana. O tamanho das moléculas é também um factor importante para as suas propriedades anti-microbianas.
Tal como para a actividade anti-microbiana, a actividade anti-oxidante da quitosana está relacionada com o seu tamanho e grau de acetilação. Uma quitosana com um grau de acetilação inferior tem maior actividade anti-oxidante pois permite uma maior complexação com os iões metálicos como o Fe2+ ou o Cu+ (participantes na reacção de Fenton).
A presença do grupo amina confere à quitosana as propriedades biológicas já descritas mas também a possibilidade de ocorrência de diversas reacções químicas, tais como acetilação, quaternização, reacções com aldeídos e cetonas (que originam bases de Schiff), alquilação ou quelação de metais, permitindo a obtenção de uma grande variedade de quitosanas modificadas, aumentando as suas potencialidades de aplicação.
A ligação química de moléculas (grafting) e a reticulação polimérica (crosslinking) são os métodos mais utilizados para a modificação química da quitosana com o intuito de alterar as suas propriedades físicas, químicas e mecânicas. A ligação covalente de moléculas à cadeia principal de quitosana permite obter materiais com propriedades melhoradas, nomeadamente por ligação de anti-oxidantes, antifúngicos, anti-bacterianos e outros nutrientes com diferentes propriedades biológicas. Uma das características que tem sido melhorada nas matrizes com base de quitosana é a sua capacidade anti-oxidante por incorporação de anti-oxidantes naturais, tais como os compostos fenólicos (Pedido de Patente US 2011059162 Al).
A ligação covalente de moléculas à cadeia da quitosana já foi realizada com recurso a diferentes métodos, tais como, por mecanismo radicalar recorrendo a um agente oxidante, uso de radiação γ (Pedido de Patente US 2005272876 Al) ou uso de enzimas. De entre os agentes oxidantes mais usados, encontram-se o perssulfato de potássio (KPS) e o hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN). Estes reagentes utilizam-se principalmente para ligar moléculas que possuam ligações vinílicas.
A reticulação do polímero por uma molécula (agente de reticulação), em que esta serve de ponte na ligação de duas ou mais moléculas de quitosana, leva à formação de uma rede covalente tridimensional. A formação de ligações intermoleculares fortes e permanentes permite melhorar as propriedades do polímero, nomeadamente a resistência mecânica, a estabilidade química, a capacidade de absorção de água e a solubilidade, mas mantendo as propriedades biológicas.
Recentemente, a genipina tem vindo a ser utilizada com muito sucesso como agente de reticulação para a quitosana devido às suas características. Este composto é a aglicona do genipósido presente no fruto de Gardênia (originária da China). A genipina reage rapidamente com os grupos amina, originando pigmentos azuis que são utilizados como corante natural alimentar. Muitos estudos têm surgido sobre a utilização da genipina como agente de reticulação para a quitosana, por esta ser menos citotóxica, por exemplo, cerca de 5000 a 10000 vezes menos do que o glutaraldeído. Os filmes preparados com adição de genipina possuem melhores propriedades mecânicas, nomeadamente, maior resistência às tensões, são mais estáveis em água e a actividade anti-microbiana é igual à do filme apenas com quitosana. O pedido de patente Norte-americano US 20070299034 Al divulga o processo de obtenção de polímeros de quitina, quitosana ou do complexo quitina-glucana a partir da biomassa de fungos e leveduras e refere ainda possíveis aplicações destes polímeros em várias áreas, incluindo em bebidas fermentadas como clarificantes.
Embora este pedido demonstre que a quitosana e os complexos quitina-glucana podem ser utilizados para o tratamento de mostos e vinhos como clarificantes em substituição de outros adjuvantes enológicos, não é referido que estes compostos possam substituir a adição de anidrido sulfuroso ao vinho, actuando somente como substitutos de agentes clarificantes e estabilizantes da cor por co-precipitação de compostos. Em enologia, o anidrido sulfuroso nunca é utilizado como agente clarificante nem estabiliza a cor dos vinhos por remoção de compostos que são importantes para a manutenção das características organolépticas dos vinhos.
O documento Spagna et ai , Fining treatments of white wines by means of polymeric adjuvants for their stabilization against browning, J. Agric. Food Chem., Vol. 48, pp. 4619-4627, divulga tratamentos de vinhos brancos por meio de adjuvantes poliméricos, como a quitosana, referindo a capacidade deste polímero na remoção de polifenóis, estabilizando os vinhos contra o escurecimento. No entanto não é referida nem sugerida a utilização na substituição do anidrido sulfuroso na conservação dos vinhos.
De acordo com o exposto existe a necessidade de um processo de produção de vinho que permita a conservação das propriedades organolépticas eliminando a adição de anidrido sulfuroso.
Surpreendentemente, verificou-se que o processo da presente invenção com um filme à base de quitosana que combina as propriedades anti-microbianas e anti-oxidantes em simultâneo com uma baixa solubilidade em meio ácido, permite uma conservação estável do vinho, a longo prazo, mantendo inalteradas as suas propriedades organolépticas e eliminando a adição de anidrido sulfuroso. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um processo de produção de vinhos compreendendo a produção de vinho pelo método tradicional sem adição de anidrido sulfuroso, caracterizado por compreender ainda: a) preparar um filme de quitosana adicionando um agente de reticulação à quitosana; ou b) preparar um filme de quitosana modificada compreendendo:
• modificar a quitosana por ligação covalente a compostos fenólicos antioxidantes,
• formar um filme por reacção da quitosana modificada com um plastificante e um agente de reticulação e,
• neutralizar o filme anterior; c) fazer contactar o filme de quitosana obtido em qualquer um dos passos anteriores com vinho após a fermentação.
Numa forma de realização da invenção, no passo c) faz-se contactar 100 cm2 de filme à base de quitosana com 750 mL de vinho.
Numa outra forma de realização da invenção, no passo b) a modificação da quitosana compreende as etapas de:
- dissolver a quitosana em meio ácido até uma concentração final de 1,5% (m/V);
- adicionar, em simultâneo, à solução obtida na etapa anterior um oxidante e um composto fenólico anti-oxidante; e - manter a mistura obtida acima sob atmosfera inerte, no escuro durante, pelo menos, 3 horas a uma temperatura de 40 °C.
Ainda numa outra forma de realização da invenção, no passo b) a formação do filme de quitosana modificada compreende as etapas de:
- dissolver a quitosana modificada em meio ácido;
- adicionar um plastificante à solução anterior e deixar reagir a uma temperatura de 50 °C durante 10 minutos;
- após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar um agente de reticulação e agitar durante 30 minutos;
- filtrar e secar a solução anterior para obter um filme à base de quitosana modificada; e
- lavar o referido filme à base de quitosana modificada com metanol e secar à temperatura ambiente. Numa outra forma de realização da invenção, no passo b) a neutralização do filme à base de quitosana compreende as etapas de: - neutralizar o filme à base de quitosana modificada com uma solução de NaOH durante 1 hora e lavar com água até obter pH 6; e
- secar à temperatura ambiente durante, pelo menos 18 horas.
Numa forma de realização da invenção, o composto fenólico anti-oxidante é seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho.
Numa forma preferida de realização da invenção, o ácido cafeico é utilizado numa razão de 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana.
Numa outra forma de realização preferida, os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho são seleccionados de entre ácidos fenólicos e antocianinas.
Ainda noutra forma de realização preferida da invenção, os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho são utilizados numa razão de 0,7 mg de extracto por grama de solução de quitosana.
Numa outra forma de realização da invenção, o oxidante é seleccionado de entre persulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN).
Numa forma de realização preferida da invenção, o oxidante é hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM numa razão de 1 mL de solução de CAN por grama de solução de quitosana.
Ainda numa outra forma de realização preferida, o plastificante é glicerol numa razão de 1 % m/m por massa de solução.
Numa outra forma de realização preferida, o agente de reticulação é a genipina numa razão de 0,05% em relação ao filme. A presente invenção refere-se ainda ao processo de produção de filme à base de quitosana para aplicação no processo de produção de vinhos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
De seguida procede-se à descrição detalhada da invenção fazendo referência aos desenhos anexos, nos quais:
A Figura 1 representa graficamente uma análise sensorial dos vinhos brancos, ao fim de 9 meses, produzidos com adição de anidrido sulfuroso, segundo a vinificação tradicional (anidrido sulfuroso - "Sulfuroso") e vinhos sem adição de anidrido sulfuroso, submetidos ao contacto com o filme à base de quitosana (Filme de quitosana).
A Figura 2 representa graficamente a solubilidade ( perda de massa) do filme à base de quitosana modificada por ligação com genipina e ácido cafeico e do filme de quitosana não modificada numa solução aquosa com pH 3,5 durante 7 dias à temperatura ambiente, com agitação constante (Exemplo 4).
A Figura 3 representa graficamente a actividade anti-oxidante (% de inibição) do filme à base de quitosana modificada por ligação com genipina e ácido cafeico e do filme de quitosana não modificada (Exemplo 4).
A Figura 4 representa graficamente a solubilidade (% perda de massa) e actividade anti-oxidante ( de inibição) do filme à base de quitosana modificada por ligação de compostos fenólicos extraídos do vinho e reticulada com genipina e do filme de quitosana não modificada (Exemplo 5).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo de produção de vinho utilizando o método de vinificação tradicional, com a adição de um filme à base de quitosana em contacto com o vinho após a fermentação, em alternativa à adição de anidrido sulfuroso comum aos processos de produção de vinho de técnica anterior para conservação de vinhos.
A presente invenção refere-se ainda ao processo de produção de um filme à base de quitosana, reticulado com genipina e quimicamente modificado por meio de ligação covalente de compostos fenólicos anti-oxidantes, para adição ao processo de produção de vinho da presente invenção.
Verificou-se que este filme apresenta, para além das propriedades anti- microbianas da quitosana, um aumento das propriedades anti-oxidantes comparativamente à quitosana e, simultaneamente, uma baixa solubilidade em meio ácido resultando num filme que, quando em contacto com os vinhos, prolonga o seu tempo e qualidade de conservação, mantendo inalteradas as suas propriedades organolépticas. Descreve-se de seguida o processo de produção do filme à base de quitosana modificada por ligação covalente de compostos fenólicos anti-oxidantes e reticulada com genipina, de acordo com a presente invenção.
Produção de quitosana modificada
O processo de produção de quitosana modificada com ligação de moléculas naturais consiste na adição à solução de quitosana, em meio ácido, de um reagente oxidante e, simultaneamente, das moléculas que se pretendem ligar. O primeiro passo consiste em dissolver a quitosana de massa molecular média numa solução aquosa ácida com agitação, durante pelo menos 16 horas, de um modo preferido à temperatura ambiente, de modo que a solução de quitosana apresente concentração de, aproximadamente 1 ,5% (m/V). Em seguida, adiciona-se à solução de quitosana um oxidante seleccionado de entre perssulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN), de um modo preferido, hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) a 60 mM, Esta adição faz-se numa razão de 1 mL de oxidante por grama de solução de quitosana. Em simultâneo, adiciona-se um composto fenólico anti-oxidante, seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho. No caso do ácido cafeico são adicionados 3 mg (a solução é preparada em etanol) por grama de solução de quitosana, enquanto para os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho é adicionado um volume que corresponde a 0,7 mg de compostos fenólicos por grama de solução de quitosana. Após mistura de todos os reagentes, manteve-se a mistura em atmosfera inerte, fazendo borbulhar N2 (g) através da mistura colocada num banho de água a 40 °C, no escuro, durante pelo menos 3 horas, com agitação constante. Após a reacção, adiciona-se acetona para precipitar a quitosana modificada. O precipitado formado é obtido por centrifugação (por exemplo, 15000 rpm durante 20 min a 4 °C) e é lavado com metanol durante, pelo menos, 1 hora para retirar o excesso de compostos iniciais que não reagiram.
Processo de produção do filme à base de quitosana modificada
Em seguida, prepara-se o filme à base de quitosana modificada dissolvendo a quitosana anteriormente obtida numa solução de ácido acético a 5% V/V e a essa solução é adicionado um plastificante, como por exemplo o glicerol numa concentração de 1 % em relação à massa de solução e a mistura é homogeneizada a uma temperatura entre 40 e 60 °C, de um modo preferido a 50 °C, num banho de água, durante 10 minutos. Esta mistura é deixada arrefecer até à temperatura ambiente, mantendo uma agitação constante (aproximadamente 30 minutos). A esta solução adiciona-se um agente de reticulação, a genipina, numa razão de 0,05%, em relação à massa de filme e depois de filtrada e desgaseif içada é colocada em placas (0,2 g de solução por cm2). A genipina reage com a quitosana durante, pelo menos, 6 horas à temperatura ambiente. Em seguida, a placa é colocada numa estufa a 35 °C para formação do filme por evaporação do solvente (cerca de 16 horas). O filme obtido é lavado para remover todos os compostos que não estão covalentemente ligados às moléculas de quitosana, de um modo preferido num extractor de Soxhlet com metanol durante cerca de 2 horas (12 ciclos/hora). Em alternativa pode ser utilizado etanol como solvente para a lavagem do filme. Após a lavagem, o filme é deixado a secar à temperatura ambiente.
Neutralização do filme à base de quitosana modificada
Por último, de modo a promover a actividade anti-oxidante do filme, é necessário um tratamento de neutralização por contacto com uma solução de hidróxido de sódio. De um modo preferido, o filme é colocado numa solução de NaOH 1 M durante 1 hora. Decorrido esse tempo, lava-se, abundantemente, com água destilada para remoção completa do NaOH e seca-se à temperatura ambiente durante, pelo menos, 18 horas. O pH final do filme deve ser, aproximadamente, 6.
A utilização do filme obtido no processo de produção de vinho decorre após a fermentação, de um modo preferido no passo do engarrafamento do vinho, em que se coloca o filme à base de quitosana numa garrafa para estabilização do vinho. A área do filme a aplicar depende das propriedades do filme e do tipo de vinho. Num vinho branco é suficiente adicionar numa garrafa um filme à base de quitosana reticulada com genipina de 100 cm2. Após a colocação do filme, a garrafa de vinho pode ser armazenada e manipulada seguindo a prática da vinificação tradicional.
Deste modo, é possível obter um vinho seguro do ponto de vista da sua utilização alimentar, possuindo propriedades organolépticas e um tempo de conservação igual ou superior aos verificados com a adição de anidrido sulfuroso do método de vinificação tradicional (ver exemplo 3).
De um modo inesperado, o processo de acordo com a presente invenção permite não só preservar a actividade anti-microbiana característica da quitosana, mas também conferir uma actividade anti-oxidante surpreendentemente aumentada em relação à da quitosana e, também, uma solubilidade em meio ácido muito reduzida, quer em relação à quitosana, quer em relação à quitosana modificada utilizando apenas a genipina como agente de reticulação (ver exemplos 4 e 5).
Exemplos:
Para uma melhor compreensão da presente invenção descrevem-se, em seguida, alguns exemplos de formas de realização preferidas da invenção, as quais não pretendem limitar o objecto da presente invenção. A solubilidade dos filmes é determinada por percentagem de perda de massa dos filmes após estarem mergulhados 7 dias numa solução aquosa a pH 3,5, numa proporção de uma área de 4 cm2 de filme em 30 mL de solução, com agitação orbital, à temperatura ambiente. A actividade anti-oxidante dos filmes é determinada pelo método do ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), ABTS. A solução de ABTS+* é preparada por dissolução do ABTS, numa concentração de 7 mM, em perssulfato de potássio 2,45 mM, sendo a solução deixada a reagir no escuro durante 12-16 horas. Adicionam-se a 1 mL desta solução 80 mL de etanol. Os filmes são mergulhados na solução de ABTS+", numa proporção de 1 cm2 de filme para 1,5 mL de solução. Ao fim de 72 horas de reacção no escuro, mede-se a absorvância a 734 nm da solução de ABTS+*. A actividade anti-oxidante dos filmes corresponde à percentagem de inibição do ABTS+*, calculada da seguinte forma: % Inibição =100 x (Ab-Aa)/Ab, em que:
Ab é o valor da absorvância do ABTS+* sem filme, e
Aa é o valor da absorvância do ABTS+* na presença do filme (ambos ao fim de
72 horas de reacção). A actividade anti-microbiana é determinada numa cultura de leveduras (Sacharomyces cerevisae). As leveduras são inoculadas num meio líquido, YEPD (constituído por 0,5% de extracto de levedura, 1 % de bactopeptona de carne e 1 % de glucose) de modo a existirem aproximadamente 100 células por mL. Os filmes são colocados nesta suspensão, numa proporção de 4 cm2 de filme por 10 mL, que é incubada a 25 °C e com uma agitação orbital de 160 rpm. A viabilidade celular é determinada ao fim de 48 horas por inoculação em placas contendo YEPDA. As unidades formadoras de colónias (UFC) são determinadas após 36 horas a 25 °C. Exemplo 1 - Preparação do filme à base de quitosana modificada com ácido cafeico
1.1. Produção de quitosana modificada Dissolveu-se quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5 % V/V, com agitação, durante 16 horas, à temperatura ambiente, de modo que a solução de quitosana apresentasse uma concentração de, aproximadamente, 1 ,5% (m/V). Em seguida, adicionou-se à solução de quitosana hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM, numa razão de 1 mL por grama de solução de quitosana. Em simultâneo, adicionaram- se 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana. Após mistura de todos os reagentes, fez-se borbulhar N2 (g) através da mistura colocada num banho de água a 40 °C, no escuro, durante 3 horas com agitação constante. Após a reacção, adicionou-se acetona para precipitar a quitosana modificada. O precipitado formado foi obtido por centrifugação (15000 rpm durante 20 minutos a 4 °C) e lavou-se com metanol durante 1 hora. 1.2. Processo de produção do filme à base de quito sana modificada
Dissolveu-se a quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5% (V/V) durante 4 horas, com agitação, e à temperatura ambiente. Após a completa dissolução, adicionou-se glicerol 1 % m/m e homogeneizou-se a mistura a 50 °C, num banho de água, durante 10 minutos. Deixou-se arrefecer a mistura até à temperatura ambiente, mantendo uma agitação constante (aproximadamente 30 minutos). A esta mistura adicionou-se uma solução de genipina 10% (m/V) em etanol, de modo que a concentração de genipina no filme fosse 0,05% . A mistura foi homogeneizada, durante 30 minutos com agitação constante. Filtrou-se a solução sob vácuo com um funil de placa porosa (tamanho G2) e desgaseificou-se com vácuo. Transferiu-se a solução para uma placa (0,2 g/cm2) e 6 horas após a adição da genipina colocou-se a placa numa estufa a 35 °C, durante cerca de 16 horas para formar o filme por evaporação do solvente.
Lavou-se o filme obtido num extractor de Soxhlet com metanol durante cerca de 2 horas (12 ciclos/hora). Após a lavagem, deixou-se o filme secar à temperatura ambiente. 1.3. Neutralização do filme à base de quitosana modificada
O filme foi colocado numa solução de NaOH 1 M durante 1 hora. Decorrido esse tempo, lavou-se, abundantemente, com água destilada para remoção completa do NaOH e secou-se à temperatura ambiente durante 18 horas. O pH final do filme obtido foi, aproximadamente, 6. Exemplo 2 - Preparação do filme à base de quitosana modificada com compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho
2.1. Produção de quitosana modificada
Dissolveu-se quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5% V/V, com agitação, durante 16 horas, à temperatura ambiente, de modo que a solução de quitosana apresentasse uma concentração de, aproximadamente, 1,5 % (m/V). Em seguida, adicionou-se à solução de quitosana 1 mL de hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM, numa razão de 1 mL de oxidante por grama de solução de quitosana. Em simultâneo, adicionaram-se 0,7 mg de extractos de vinho por grama de solução de quitosana. Após mistura de todos os reagentes, fez-se borbulhar N2 (g) através da mistura colocada num banho de água a 40 °C, no escuro, durante 3 horas com agitação constante. Após a reacção, adicionou-se acetona para precipitar a quitosana modificada. O precipitado formado foi obtido por centrifugação (15000 rpm durante 20 minutos a 4 °C) e lavou-se com metanol durante 1 hora.
2.2. Processo de produção do filme à base de quitosana modificada Dissolveu-se a quitosana numa solução aquosa de ácido acético a 5% (V/V) durante 4 horas, com agitação, e à temperatura ambiente. Após a completa dissolução, adicionou-se glicerol 1 % m/m e homogeneizou-se a mistura a 50 °C, num banho de água, durante 10 minutos. Deixou-se arrefecer a mistura até à temperatura ambiente, mantendo uma agitação constante (aproximadamente 30 minutos). A esta mistura adicionou-se uma solução de genipina 10% (m/V) em etanol, de modo que a concentração de genipina no filme fosse 0,05% . A mistura foi homogeneizada, durante 30 minutos com agitação constante. Filtrou-se a solução sob vácuo com um funil de placa porosa (tamanho G2) e desgaseificou-se com vácuo. Transferiu-se a solução para uma placa (0,2 g/cm2) e 6 horas após a adição da genipina colocou-se a placa numa estufa a 35 °C para formar o filme por evaporação do solvente (cerca de 16 horas). Lavou-se o filme obtido num extractor de Soxhlet com metanol durante cerca de 2 horas (12 ciclos/hora). Após a lavagem, deixou-se o filme secar à temperatura ambiente. 2.5. Neutralização do filme à base de quitosana modificada
O filme foi colocado numa solução de NaOH 1 M durante 1 hora. Decorrido esse tempo, lavou-se, abundantemente, com água destilada para remoção completa do NaOH e secou-se à temperatura ambiente durante 18 horas. O pH final do filme obtido foi, aproximadamente, 6.
Exemplo 3 - Produção de vinho em contacto com um filme à base de quitosana.
Um vinho branco foi produzido segundo o método de vinificação tradicional, com a excepção de não ter sido adicionado anidrido sulfuroso, mas tendo sido colocado em contacto com um filme à base de quitosana (quitosana reticulada com genipina). Ao fim de 9 meses de armazenamento o vinho estava estável a nível microbiológico, pois não apresentou nenhuma unidade formadora de colónias de leveduras e bactérias. As análises físico-químicas demonstraram que, em comparação com o vinho contendo SOi, o vinho em contacto com o filme tinha a mesma actividade anti-oxidante e composição em compostos fenólicos. No entanto, a cor dos vinhos era diferente, apresentando o vinho branco que estava em contacto com a quitosana uma menor intensidade da cor. Segundo os parâmetros CIELAB, este vinho apresentava também uma tonalidade de cor mais verde e menos amarela do que o vinho sem anidrido sulfuroso mas que não estava em contacto com o filme à base de quitosana.
A análise sensorial dos vinhos realizada por um painel de provadores treinado revelou que o vinho branco em contacto com o filme à base de quitosana possuía a nível global uma melhor cor, sabor e aroma em relação ao vinho produzido sem adição de SC e de filme à base de quitosana. A comparação com o vinho produzido pela vinificação normal, com adição de SO2, mostrou que o vinho branco produzido segundo o processo descrito nesta invenção foi considerado pelo painel como o melhor vinho das provas (Figura 1).
Exemplo 4 - Solubilidade e actividade anti-oxidante de filmes de quitosana sem modificação química, quitosana reticulada com genipina e quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de ácido cafeico
Seguindo os procedimentos incluídos na descrição detalhada, preparou-se um filme à base de quitosana de acordo com o exemplo 1 e um outro de quitosana reticulada com genipina. Na figura 2 é apresentada a solubilidade destes filmes e, como comparação, a de um filme à base de quitosana não modificada, preparado segundo o mesmo procedimento. Os filmes à base de quitosana produzidos com ácido cafeico e genipina ou apenas com genipina apresentam uma solubilidade, em meio ácido, cerca de 45% inferior em relação aos filmes produzidos com quitosana sem modificação química. A neutralização dos filmes (tratamento com NaOH) diminui a solubilidade dos filmes à base de quitosana, tendo o filme modificado com ligação covalente de ácido cafeico e genipina uma solubilidade de aproximadamente 10% (Figura 2), o que representa uma diminuição de 36% em relação ao filme sem tratamento. A actividade anti-oxidante dos filmes à base de quitosana com ácido cafeico e/ou genipina, assim como o de quitosana não modificada, com e sem neutralização com NaOH, é apresentada na Figura 3.
Os resultados para a actividade anti-oxidante dos filmes demonstram que a neutralização (tratamento com NaOH) aumenta a actividade anti-oxidante dos filmes de quitosana, principalmente dos da quitosana modificada com ácido cafeico e genipina. Este filme obtido após a neutralização apresenta uma capacidade anti-oxidante cerca de 45% superior à dos filmes neutralizados de quitosana com genipina e quitosana não modificada (Figura 3). A actividade anti-microbiana foi determinada para os três filmes numa cultura de leveduras (Sacha vmyces cerevisae). As suspensões de células contendo os filmes, filme preparado com quitosana modificada com ácido cafeico e/ou genipina e filme preparado com quitosana, não modificada, não apresentaram nenhuma UFC ao fim de 48 horas de incubação, enquanto o controlo (suspensão de células inoculadas nas mesmas condições mas sem adição de filme) apresentou 8xl07 UFC/mL.
O filme reticulado com genipina e com moléculas de ácido cafeico ligadas à quitosana apresenta baixa solubilidade em meio ácido e elevada actividade anti-oxidante em comparação com um filme à base de quitosana não modificada. O filme com a quitosana modificada manteve a actividade anti-microbiana.
Exemplo 5 - Solubilidade e actividade anti-oxidante de filmes à base de quitosana reticulada com genipina e quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho
Os extractos de vinho foram obtidos por extracção em fase sólida (SPE) com um polímero Cie (octadecilo). A coluna foi activada com metanol e lavada com água destilada antes da sua utilização. O vinho tinto foi destilado à pressão atmosférica para retirar o etanol. O resíduo desalcoolizado resultante foi passado pela coluna de Cis ao pH do vinho (cerca de 3,5). A fracção não retida foi eluída com água destilada e, em seguida, foram eluídos os compostos fenólicos com metanol contendo 0,1 % de HC1 (metanol acídico). O pH desta fracção foi elevado a 7 por adição de NaOH 1 M e foi diluída 2 vezes com tampão fosfato 0, 1 M a pH 7. A coluna Cia foi lavada com uma solução tampão fosfato 0, 1 M a pH 7. A fracção eluída com metanol acídico contida na solução a pH 7 foi novamente aplicada na coluna Cie e a fracção não retida, eluída com o tampão a pH 7, foi recolhida. Esta fracção, rica em ácidos fenólicos numa concentração de 2,4 g/L (em equivalentes de ácido gálico), era constituída principalmente pelos ácidos caftárico, gálico e cumárico, entre outros. Após a eluição com o tampão a pH 7, foi efectuada uma eluição com acetato de etilo e, por fim, com metanol acídico (metanol com HC1 0,1 %). A fracção eluída com metanol acídico era maioritariamente constituída por antocianinas, sendo a malvidina-3- glucósido a antocianina mais abundante (representando cerca de 60%). Esta fracção que foi utilizada para adicionar aos filmes à base de quitosana continha uma concentração de compostos fenólicos de 2,2 g/L (em equivalentes de ácido gálico).
Foi preparado um filme à base de quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de ácidos fenólicos ou de antocianinas provenientes de um extracto de vinho, de acordo com o exemplo 2. Um filme à base de quitosana não modificada foi preparado seguindo o mesmo procedimento para ser usado como comparação. Os filmes foram tratados com NaOH.
Na figura 4 é apresentada a solubilidade em meio ácido ao fim de 7 dias e a actividade anti-oxidante do filme obtido por reticulação com genipina e adição dos compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos do vinho e a do filme à base de quitosana não modificada preparado usando o mesmo procedimento. A solubilidade e a actividade anti-oxidante dos filmes foram determinadas tal como anteriormente descrito, com excepção do tempo de reacção dos filmes com a solução de ABTS+', para a determinação da actividade anti-oxidante, que foi apenas de 48 horas. O filme à base de quitosana modificada apresenta uma solubilidade de aproximadamente 12% , sendo 58% inferior em relação à solubilidade do filme à base de quitosana não modificada. A actividade antioxidante do filme com a quitosana reticulada com genipina e com adição de compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos do vinho é superior (cerca de 100%) à do filme à base de quitosana. O filme produzido com quitosana reticulada com genipina e com adição de antocianinas extraídas do vinho apresentou actividade anti-oxidante idêntica (percentagem de inibição de 83% ao fim de 48 horas de reacção com a solução de ABTS+*) à do filme preparado com quitosana reticulada com genipina e com ligação covalente de ácidos fenólicos provenientes do mesmo extracto de vinho.
Em comparação com a actividade anti-oxidante do filme à base de quitosana com ácido cafeico e genipina, descrito no exemplo 4, o filme preparado com a quitosana reticulada com genipina e com adição do extracto de vinho tem uma actividade antioxidante bastante superior, uma vez que ao fim de 48 horas já apresentava uma percentagem de inibição superior (87%) à que o outro filme possuía após 72 horas, cerca de 75% (Figura 3). A solubilidade em meio ácido (após 7 dias) dos dois filmes foi idêntica, aproximadamente 10% (Figuras 2 e 4).

Claims

REIVINDICAÇÕES
Processo de produção de vinhos, compreendendo a produção de vinho pelo método tradicional sem adição de anidrido sulfuroso caracterizado por compreender ainda: a) preparar um filme de quitosana adicionando um agente de reticulação à quitosana; ou b) preparar um filme de quitosana modificada compreendendo:
• modificar a quitosana por ligação covalente a compostos fenólicos antioxidantes,
• formar um filme por reacção da quitosana modificada com um plastificante e um agente de reticulação e,
• neutralizar o filme anterior; c) fazer contactar o filme de quitosana obtido em qualquer um dos passos anteriores com vinho após a fermentação.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por no passo c) se fazer contactar 100 cm2 de filme à base de quitosana com 750 mL de vinho.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por no passo b) a modificação da quitosana compreender as etapas de:
- dissolver a quitosana em meio ácido até uma concentração final de 1,5% (m/V);
- adicionar, em simultâneo, à solução obtida na etapa anterior um oxidante e um composto fenólico anti-oxidante; e - manter a mistura obtida acima sob atmosfera inerte, no escuro durante, pelo menos, 3 horas a uma temperatura de 40 °C.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por no passo b) a formação do filme de quitosana modificada compreender as etapas de:
- dissolver a quitosana modificada em meio ácido;
- adicionar um plastificante à solução anterior e deixar reagir a uma temperatura de 50 °C durante 10 minutos;
- após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar um agente de reticulação e agitar durante 30 minutos;
- filtrar e secar a solução anterior para obter um filme à base de quitosana modificada; e
- lavar o referido filme à base de quitosana modificada com metanol e secar à temperatura ambiente.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por no passo b) a neutralização do filme à base de quitosana compreender as etapas de:
- neutralizar o filme à base de quitosana modificada com uma solução de NaOH durante 1 hora e lavar com água até obter pH 6; e
- secar à temperatura ambiente durante, pelo menos 18 horas.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o meio ácido ser uma solução de ácido acético.
7. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o composto fenólico anti-oxidante ser seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho.
8. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o ácido cafeico ser utilizado numa razão de 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana.
9. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho serem seleccionados de entre ácidos fenólicos e antocianinas.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por os compostos fenólicos anti-oxidantes serem utilizados numa razão de 0,7 mg de extracto por grama de solução de quitosana.
11. Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o oxidante ser seleccionado de entre persulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN).
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o oxidante ser hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM numa razão de 1 mL de solução de CAN por grama de solução de quitosana.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o plastificante ser glicerol numa razão de 1 % m/m por massa de solução.
Processo de produção de vinhos de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por agente de reticulação ser genipina numa razão de 0,05% em relação ao filme.
15. Processo de produção de filme à base de quitosana para aplicação no processo de produção de vinhos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, compreendendo modificar a quitosana por ligação covalente a compostos fenólicos antioxidantes, caracterizado por compreender ainda: i) formar um filme por reacção da quitosana modificada com um plastificante e um agente de reticulação; e ii) neutralizar o filme obtido no passo i).
L6. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a modificação de quitosana compreender as etapas de:
- dissolver a quitosana em meio ácido até uma concentração final de 1,5% (m/V);
- adicionar, em simultâneo, à solução obtida na etapa anterior um oxidante e um composto fenólico anti-oxidante; e
- manter a mistura obtida acima sob atmosfera inerte, no escuro durante, pelo menos, 3 horas a uma temperatura de 40 °C.
7. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o passo i) compreender as etapas de:
- dissolver a quitosana modificada em meio ácido; - adicionar um plastificante e deixar reagir a uma temperatura de 50 °C durante 10 minutos;
- após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionar um agente de reticulação e agitar durante 30 minutos;
- filtrar e secar a solução obtida para obter um filme à base de quitosana modificada; e
- lavar o referido filme à base de quitosana modificada com metanol e secar à temperatura ambiente.
18. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o passo ii) compreender as etapas de:
- neutralizar o filme à base de quitosana modificada com uma solução de NaOH durante 1 hora e lavar com água até obter pH 6; e
- secar à temperatura ambiente durante, pelo menos 18 horas.
19. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o meio ácido ser uma solução de ácido acético.
20. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o composto fenólico anti-oxidante ser seleccionado do grupo consistindo de ácido cafeico e compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho.
21. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o ácido cafeico ser utilizado numa razão de 3 mg de ácido cafeico por grama de solução de quitosana.
Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com ã reivindicação 20, caracterizado por os compostos fenólicos anti-oxidantes extraídos da uva ou do vinho serem seleccionados de entre ácidos fenólicos e antocianinas.
23. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por os compostos fenólicos anti-oxidantes serem utilizados numa razão de 0,7 mg de extracto por grama de solução de quitosana.
24. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o oxidante ser seleccionado de entre persulfato de potássio (KPS) e hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN).
25. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o oxidante ser hexanitrocerato (IV) de amónio (CAN) 60 mM numa razão de 1 mL de solução de CAN por grama de solução de quitosana.
26. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o plastificante ser glicerol numa razão de 1% m/m por massa de solução.
27. Processo de produção de filme à base de quitosana de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o agente de reticulação ser genipina numa razão de 0,05% em relação ao filme.
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