WO2013051608A1 - 複合型糖鎖加水分解酵素 - Google Patents

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WO2013051608A1
WO2013051608A1 PCT/JP2012/075650 JP2012075650W WO2013051608A1 WO 2013051608 A1 WO2013051608 A1 WO 2013051608A1 JP 2012075650 W JP2012075650 W JP 2012075650W WO 2013051608 A1 WO2013051608 A1 WO 2013051608A1
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endo
activity
seq
amino acid
protein
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PCT/JP2012/075650
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千葉　靖典
村上　智史
成松　久
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独立行政法人産業技術総合研究所
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    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the present invention relates to a complex type sugar chain hydrolase and its gene.
  • glycoproteins In addition to being found in eukaryotes from microorganisms such as yeast to humans, glycoproteins have been reported in several bacteria in recent years.
  • the function of the sugar chain is not only involved in protein stability and protease resistance, but also necessary for folding to form higher-order structures. It is also known to control interactions between proteins and to bind to lectins on the cell surface to cause signal transduction. In order to analyze these glycoproteins, it is necessary to separate the sugar chain and determine the sugar chain structure.
  • Peptides: N-glycanase and endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase are known as enzymes that cleave N-type sugar chains bound to asparagine residues.
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase is an enzyme that cleaves between chitobiose present at the reducing end of an N-type sugar chain.
  • Endo-A derived from Arthrobacter Non-patent Document 1, Patent Document 4
  • Endo-D derived from Streptococcus pneumoniae Non-patent document 2
  • Endo-F derived from Flavobacterium Non-patent document 3
  • Endo-H derived from Streptomyces plicatus Non-patent document 4
  • Endo- ⁇ -derived from Mycosphaerella N-acetylglucosaminidase (patent document 3), Endo-Os derived from rice (non-patent document 5), Endo-M derived from Mucor hiemalis (patent documents 1, 2, 5, non-patent documents 6, 7) and the like are known.
  • Non-patent Document 7 there is a description (Non-patent Document 7) that the N-type sugar chain of 3 branches and 4 parts of asialo can be cleaved.
  • the enzyme activity measurement using PA sugar chain the activity against asialo 3 branches and asialo 4 branches is It has not been detected (Non-Patent Document 6).
  • the 2-branched PA-glycan added with core fucose cannot be cleaved.
  • Endo-F2 is an enzyme derived from Elizabethkingia miricola, which hydrolyzes high mannose type and biantennary complex type sugar chains, but has no hydrolytic activity of hybrid sugar chains (Non-patent Document 8).
  • Endo-F3 is also an enzyme derived from Elizabethkingia miricola, which hydrolyzes a 2-branch or 3-branch complex type sugar chain, but does not have a hydrolytic activity of a high mannose type, mixed sugar chain (Non-patent Document 8).
  • Endo-S is an enzyme derived from Streptococcus pyogenes and hydrolyzes only a biantennary complex type sugar chain, but has no hydrolyzing activity of a high mannose type, mixed sugar chain (Non-patent Document 9).
  • Endo-CE is an enzyme derived from Caenorhabditis elegans, which hydrolyzes high mannose type and biantennary complex type sugar chains, but it is unclear whether or not the mixed type sugar chain is cleaved (Non-patent Document 10).
  • the substrate specificity of the trans-glycosidase activity of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase is the same as the degradation activity. Only these enzymes can do this.
  • endo-M has a different substrate specificity from Endo-M. There has been a strong demand for ⁇ -N-acetylglucosaminidase, and it has also been desired to provide an enzyme with a high specific activity for complex sugar chains.
  • the present invention has been made in order to solve such problems of conventional methods for releasing sugar chains from these asparagine-linked glycoproteins and the transfer of complex sugar chains using transglycosidase activity. .
  • a new enzyme different from the previously reported endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase was obtained and endo- ⁇ -N-acetyl differed from Endo-M in terms of substrate specificity and specific activity.
  • the object is to provide glucosaminidase and a method for producing the same.
  • Endo-Om endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • Endo-Om of the present invention has low homology (identity) with any sequence of conventionally known endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase, 33.9% at the amino acid level with the known Mucor genus Endo-M, Endo-F2 is 8.8%, Endo-F3 is 9.0%, Endo-S is 14.7%, Endo-CE is 18.9%, and the function is derived from the genus Candida with the closest sequence in the database It is a novel enzyme that has only about 53.9% identity at the amino acid level with a hypothetical protein. Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity was increased by transforming an O.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Om) of the present invention has the following enzymological and physicochemical properties; (1) Action; acts on an asparagine-linked glycoprotein in an endo-type to release sugar chains.
  • Oligosaccharides are produced by cleaving between N, N'-diacetylchitobiose present in the core structure of high mannose type, hybrid type, and biantennary complex type sugar chains. 2) When the activity against high mannose type M8A-PA sugar chain is 100%, the activity against high mannose type M6B-PA sugar chain is about 103% and the activity against complex type biantennary PA-sugar About 15%.
  • the Endo-Om of the present invention has an activity against high mannose type M6B-PA sugar chain of about 103% when the activity against high mannose type M8A-PA sugar chain is defined as 100%, and a complex biantennary sugar chain (agalacto biantennary PA).
  • -sugar is about 15%, has a substrate specificity different from that of the known Endo-M, and has a specific activity 13 times higher than that of Endo-M and a high Vmax of 55 times that of Endo-M. ing.
  • mass production is possible by using the overexpression system developed by the present invention, a high-quality enzyme can be produced at low cost.
  • Candida parapolymorpha DL-1 Strain-derived enzymes, Pichia genus Pichia anomala genus enzymes, and Zygosaccharomyces genus Zygosaccharomyces rouxii enzymes are all novel enzymes with high endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (ENGase) activity similar to Endo-Om I found.
  • the respective enzymes were named “Endo-Cp”, “Endo-Pa”, and “Endo-Zr”.
  • a protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5); (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 5, 9 or 13, (2) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 5, 9 or 13; (3) an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 5, 9 or 13; (4) an amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 6, 10 or 14; (5) An amino acid sequence encoded by a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 6, 10 or 14.
  • a polynucleotide encoding a protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity according to [1].
  • nucleotide (3) Amplified with a primer set comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, and encodes a protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity that is 70% or more identical to SEQ ID NO: 2
  • Polynucleotide (4) Amplified with a primer set comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, and encodes a protein having at least 70% identity with SEQ ID NO: 6 and having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity
  • Polynucleotide (5) Amplified with a primer set comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 and 12, and encodes a protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity having 70% or more identity with SEQ ID NO: 10.
  • Polynucleotide (6) Amplified with a primer set comprising the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 15 and 16, and encodes a protein having at least 70% identity with SEQ ID NO: 14 and having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity Polynucleotide.
  • a vector for expressing a protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity comprising the polynucleotide according to [2] or [3].
  • [5] A transformed cell for protein expression having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity, into which the vector according to [4] is introduced.
  • [6] The transformation according to [5], wherein the transformed cell is a transformed cell using a yeast cell selected from any one of Ogataea minuta, Candida parapolymorpha, Pichia anomala, and Zygosaccharomyces rouxii as a host. cell.
  • [7] A method for producing a protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity, comprising using the transformed cell according to [5] or [6].
  • [8] A method for cleaving an asparagine-linked sugar chain from a glycoprotein, comprising using the protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity according to [1].
  • [9] A method for transferring an asparagine-linked sugar chain to an arbitrary acceptor molecule, wherein the protein having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity according to [1] is used.
  • the endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase Endo-Om in the present invention has a low identity with the known Endo-M at the amino acid sequence level of 33.9%, and has 100% activity against the high mannose M8A-PA sugar chain.
  • the substrate specificity is different in that the activity against high mannose type M6B-PA sugar chain is about 103% and the activity against complex type biantennary PA-sugar is about 15%. It is clearly a novel enzyme in that it has a high specific activity of 13 times that of Endo-M and a Vmax that is 55 times that of Endo-M, but it is capable of hydrolyzing complex sugar chains, a characteristic of Endo-M.
  • Endo-Cp, Endo-Pa and Endo-Zr which are other endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases of the present invention, also have the same complex-type glycosylation activity and complex-type glycosyltransferase activity. Applications similar to Om are expected.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Om gene.
  • the underlined sequence is a highly conserved sequence in GH family 85 ENGase.
  • ⁇ is the putative active center amino acid residue.
  • FIG. 2 is a phylogenetic tree of Endo-Om and ENGase derived from a species close to yeast. In the figure, numerical values in parentheses indicate the homology between the length of the amino acid sequence and Endo-Om.
  • FIG. 3 shows the measurement results of protein expression and enzyme activity in Endo-Om overexpressing O. minuta strain. A. Confirmation of overexpression of Endo-Om by Western blotting. Results of enzyme reaction detection by HPLC C.I. Specific activity of Endo-Om overexpressing strain
  • FIG. 4 is an SDS-PAGE result of a purified sample of recombinant Endo-Om.
  • FIG. 5 shows the measurement results of Km and Vma ⁇ of Endo-Om and commercially available Endo-M.
  • FIG. 6 shows the measurement results of the optimal reaction conditions (pH, temperature) of Endo-Om.
  • FIG. 7 shows the results of detection of the presence or absence of Endo-Om transglycosidase activity.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Cp gene.
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE, Western blotting and enzyme activity measurement of the Endo-Cp partially purified enzyme solution.
  • FIG. 10 shows the measurement results of the optimal reaction conditions (pH, temperature) of Endo-Cp.
  • FIG. 11 shows the results of detection of the presence or absence of Endo-Cp transglycosidase activity.
  • FIG. 12 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Pa gene.
  • the underlined sequence is a highly conserved sequence in GH family 85 ENGase.
  • ⁇ is the putative active center amino acid residue.
  • FIG. 13 shows the results of SDS-PAGE, Western blotting, and enzyme activity measurement of the Endo-Pa partially purified enzyme solution.
  • FIG. 14 shows the measurement results of the optimal reaction conditions (pH, temperature) of Endo-Pa.
  • FIG. 15 shows the result of detecting the presence or absence of Endo-Pa transglycosidase activity.
  • FIG. 16 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Zr gene. In the figure, the underlined sequence is a highly conserved sequence in GH family 85 ENGase. ⁇ is the putative active center amino acid residue.
  • FIG. 17 shows the results of SDS-PAGE, Western blotting, and enzyme activity measurement of the Endo-Zr partially purified enzyme solution.
  • FIG. 18 shows the measurement results of the optimal reaction conditions (pH, temperature) of Endo-Zr.
  • Endo-Om (1) Enzymological and physicochemical properties; (1) Action; acts as an endo-type on asparagine-linked glycoprotein and releases sugar chains. (2) substrate specificity; 1) Oligosaccharides are produced by cleaving between N, N'-diacetylchitobiose present in the core structure of high mannose type, hybrid type, and biantennary complex type sugar chains. 2) When the activity against high mannose type M8A-PA sugar chain is 100%, the activity against high mannose type M6B-PA sugar chain is about 103% and the activity against complex type biantennary PA-sugar About 15%.
  • Endo-Om amino acid sequence and base sequence
  • Endo-Om amino acid sequence and base sequence
  • the endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Om) of the present invention includes endo- ⁇ -N-acetyl comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5): It can be expressed as a protein having glucosaminidase activity. Preferably, it is a protein derived from yeast, particularly from Ogataea genus yeast.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (2) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the number is 1 to 20, preferably Represents 1 to 10, more preferably 1 to 5.
  • It is an amino acid sequence having (4) an amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • stringent conditions refer to normal hybridization operations described in T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, etc., and so-called specific hybrids are formed. And non-specific hybrids are not formed.
  • 6 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 ⁇ Denhardt's, 0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1 % Ficoll 400] and 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA, and conditions for incubation at 50 ° C. for 4 hours to overnight.
  • the protein having Endo-Om activity of the present invention is 30% or more, preferably 40% or more, more preferably, by BLAST search against NCBI GenBank amino acid sequence database based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity consisting of an amino acid sequence derived from yeast that is detected with a homology of 50% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more. Particularly preferred is a gene derived from the genus Ogataea.
  • the Endo-Om gene of the present invention can be expressed as a polynucleotide encoding a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity comprising any one of the amino acid sequences (1) to (5) above.
  • polynucleotide is derived from yeast, particularly from Ogataea yeast.
  • a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a polynucleotide that encodes a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity which hybridizes with a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions.
  • polypeptides consisting of amino acid sequences having identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more are highly likely to have Endo-Om activity, and are shown in SEQ ID NO: 2.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more identity with the nucleotide sequence to be detected is also highly likely to be an Endo-Om gene.
  • the homology search for polypeptides and polynucleotides can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo-Om has a high hydrolytic activity for high mannose type sugar chains as in Endo-M, and further hydrolyzes hybrid sugar chains and biantennary complex sugar chains.
  • complex sugar chains having three or more branches and sugar chains having a core fucose structure cannot be decomposed.
  • the reactivity with respect to several sugar chains is different from Endo-M, and especially the sugar chain of agaracto biantennary, M3B, M6B, and M9A structure shows high reactivity compared with Endo-M.
  • Endo-Om has the activity to transfer sugar chains to any acceptor molecule.
  • Typical acceptor molecules are monosaccharides such as glucose or GlcNAc or derivatives thereof, but can also be transferred to glycopeptides and glycoproteins containing them.
  • the sugar chain that can be transferred is an asparagine-linked sugar chain, and may be a chemically synthesized sugar chain or a cleaved sugar chain.
  • Endo-Om transglycosidase activity was incubated for 3 hours at 30 ° C in a reaction solution containing the biantennary complex sugar chain of the substrate, acceptor molecule (p-nitrophenylglucose) and Endo-Om purified enzyme solution.
  • acceptor molecule p-nitrophenylglucose
  • Endo-Om purified enzyme solution As a result of detection, a new peak different from the hydrolyzate was detected, and MS analysis confirmed that this was a glycosyltransferase reaction product in which a biantennary complex sugar chain was added to the acceptor molecule (FIG. 7). ).
  • Enzymological and physicochemical properties (1) Enzymological and physicochemical properties; (1) Action; acts as an endo-type on asparagine-linked glycoprotein and releases sugar chains. (2) substrate specificity; 1) Oligosaccharides are produced by cleaving between N, N'-diacetylchitobiose present in the core structure of high mannose type, hybrid type, and biantennary complex type sugar chains. 2) When the activity against high mannose type M8A-PA sugar chain is 100%, the activity against high mannose type M6B-PA sugar chain is about 172% and the activity against complex type biantennary PA-sugar About 7.0%.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Cp) of the present invention includes endo- ⁇ -N-acetyl comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5): It can be expressed as a protein having glucosaminidase activity.
  • the protein is derived from yeast, more preferably from Candida genus yeast, and most preferably from Candida parapolymorpha.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (2) Amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, (wherein several are preferably 1 to 20, preferably Represents 1 to 10, more preferably 1 to 5.
  • It is an amino acid sequence having (4) an amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, (5) An amino acid sequence encoded by a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the protein having Endo-Cp activity of the present invention is 30% or more, preferably 40% or more, more preferably, by BLAST search against NCBI GenBank amino acid sequence database based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity consisting of an amino acid sequence derived from yeast that is detected with a homology of 50% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • a gene derived from a Candida genus yeast, particularly Candida parapolymorpha is preferable.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 by BLAST search against the NCBI GenBank nucleotide sequence database, 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, more preferably 70% or more, Most preferably, it can be expressed as a protein encoded by a gene comprising a nucleotide sequence derived from yeast detected with a homology of 80% or more and having endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity.
  • Endo-Cp gene of the present invention can be expressed as a polynucleotide encoding a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity comprising any one of the amino acid sequences (1) to (5) above. However, it can also be expressed as any of the following polynucleotides (1) to (3).
  • a polynucleotide derived from yeast, particularly a Candida yeast is preferred.
  • a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 6,
  • the endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Cp) of the present invention is 53.9% of the “Endo-Om” derived from Ogataea minuta of the present invention at the amino acid sequence level.
  • Endo-M has only 38.2% identity at the amino acid sequence level.
  • “Endo-Cp” of the present invention since “Endo-Cp” of the present invention has a specific sequence, it is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • Polypeptides consisting of amino acid sequences having identity are very likely to have Endo-Cp activity, and are 70% or more, preferably 80% or more, more preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. It can be said that a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity is also likely to be an Endo-Cp gene.
  • the homology search for polypeptides and polynucleotides can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo-Cp has a high hydrolytic activity on high mannose type sugar chains as in Endo-M, and further hydrolyzes hybrid sugar chains and biantennary complex sugar chains.
  • complex sugar chains having three or more branches and sugar chains having a core fucose structure cannot be decomposed.
  • the reactivity with respect to some sugar chains is different from Endo-M, and especially the sugar chain of agaracto biantennary, M3B, and M6B structure shows high reactivity compared with Endo-M.
  • Endo-Cp has the activity to transfer sugar chains to any acceptor molecule.
  • Typical acceptor molecules are monosaccharides such as glucose or GlcNAc or derivatives thereof, but can also be transferred to glycopeptides and glycoproteins containing them.
  • the sugar chain that can be transferred is an asparagine-linked sugar chain, and may be a chemically synthesized sugar chain or a cleaved sugar chain.
  • Endo-Cp transglycosidase activity was measured by incubating the reaction solution containing the biantennary complex sugar chain of the substrate, the acceptor molecule (p-nitrophenylglucose) and the Endo-Cp partially purified enzyme solution at 30 ° C for 3 hours.
  • the acceptor molecule p-nitrophenylglucose
  • the Endo-Cp partially purified enzyme solution As a result of detection by HPLC, a new peak different from the hydrolyzate was detected, and MS analysis confirmed that the product was a glycosyltransferase reaction product in which a biantennary complex sugar chain was added to the acceptor molecule (Fig. 11).
  • Enzymological and physicochemical properties (1) Enzymological and physicochemical properties; (1) Action; acts as an endo-type on asparagine-linked glycoprotein and releases sugar chains. (2) substrate specificity; 1) Oligosaccharides are produced by cleaving between N, N'-diacetylchitobiose present in the core structure of high mannose type, hybrid type, and biantennary complex type sugar chains. 2) When the activity against high mannose type M8A-PA sugar chain is 100%, the activity against high mannose type M6B-PA sugar chain is about 140% and the activity against complex type biantennary PA-sugar About 54.4%.
  • Endo-Pa amino acid sequence and base sequence
  • the endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Pa) of the present invention includes endo- ⁇ -N-acetyl comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5): It can be expressed as a protein having glucosaminidase activity.
  • a protein derived from yeast, particularly Pichia genus yeast, particularly Pichia anomala is preferable.
  • an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, (preferably, 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% identity) (It is an amino acid sequence having (4) an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, (5) An amino acid sequence encoded by a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the protein having Endo-Pa activity of the present invention is 30% or more, preferably 40% or more, more preferably, by BLAST search against NCBI GenBank amino acid sequence database based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity consisting of an amino acid sequence derived from yeast that is detected with a homology of 50% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • a gene derived from a yeast of the genus Pichia particularly a gene derived from Pichia anomala is preferable.
  • the Endo-Pa gene of the present invention can be expressed as a polynucleotide encoding a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity comprising any one of the amino acid sequences (1) to (5) above.
  • polynucleotide derived from yeast particularly Pichia genus yeast, particularly Pichia anomala is preferable.
  • a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 (2) A polynucleotide that encodes a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity by hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • Polypeptides consisting of amino acid sequences having identity have a high probability of having Endo-Pa activity and are 70% or more, preferably 80% or more, more preferably, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity can be said to be highly likely to be an Endo-Pa gene.
  • the homology search for polypeptides and polynucleotides can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo-Pa has a high hydrolytic activity for high mannose type sugar chains as in Endo-M, and further hydrolyzes mixed sugar chains and biantennary complex sugar chains.
  • complex sugar chains having three or more branches and sugar chains having a core fucose structure cannot be decomposed.
  • most sugar chains show higher reactivity than Endo-M.
  • Endo-Pa has an activity of transferring a sugar chain to any acceptor molecule.
  • Typical acceptor molecules are monosaccharides such as glucose or GlcNAc or derivatives thereof, but can also be transferred to glycopeptides and glycoproteins containing them.
  • the sugar chain that can be transferred is an asparagine-linked sugar chain, and may be a chemically synthesized sugar chain or a cleaved sugar chain.
  • Endo-Pa transglycosidase activity was obtained by incubating the reaction solution containing the biantennary complex sugar chain of the substrate, acceptor molecule (p-nitrophenylglucose) and Endo-Pa partially purified enzyme solution at 30 ° C for 16 hours.
  • acceptor molecule p-nitrophenylglucose
  • Endo-Pa partially purified enzyme solution at 30 ° C for 16 hours.
  • MS analysis confirmed that the product was a glycosyltransferase reaction product in which a biantennary complex sugar chain was added to the acceptor molecule (Fig. 15).
  • Enzymological and physicochemical properties (1) Enzymological and physicochemical properties; (1) Action; acts as an endo-type on asparagine-linked glycoprotein and releases sugar chains. (2) substrate specificity; 1) Oligosaccharides are produced by cleaving between N, N'-diacetylchitobiose present in the core structure of high mannose type, hybrid type, and biantennary complex type sugar chains. 2) When the activity against high mannose type M8A-PA sugar chain is 100%, the activity against high mannose type M6B-PA sugar chain is about 127% and the activity against complex type biantennary PA-sugar About 23.6%.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Zr) of the present invention includes endo- ⁇ -N-acetyl comprising any one of the following amino acid sequences (1) to (5): It can be expressed as a protein having glucosaminidase activity.
  • yeast in particular from Zygosaccharomyces yeast, in particular Zygosaccharomyces A protein derived from rouxii is preferred.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 (2) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, wherein several are 1 to 20, preferably Represents 1 to 10, more preferably 1 to 5.) (3) an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, (preferably, 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% identity) (It is an amino acid sequence having (4) an amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 14, (5) An amino acid sequence encoded by a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the protein having Endo-Zr activity of the present invention is 30% or more, preferably 40% or more, more preferably, by BLAST search against the NCBI GenBank amino acid sequence database based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity consisting of an amino acid sequence derived from yeast that is detected with a homology of 50% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • a gene derived from the genus Zygosaccharomyces is preferable.
  • the Endo-Zr gene of the present invention can be expressed as a polynucleotide encoding a protein having an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase activity comprising any one of the amino acid sequences of (1) to (5) above.
  • a polynucleotide derived from yeast, particularly Zygosaccharomyces yeast is preferable.
  • a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 (2)
  • Endo-Cp derived from Candida parapolymorpha DL-1
  • Endo-Pa derived from Pichia anomala
  • the known Mucor genus “Endo-M” has only 29.4% identity at the amino acid sequence level.
  • “Endo-Zr” of the present invention has a specific sequence, it is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • Polypeptides consisting of amino acid sequences having identity are highly likely to have Endo-Zr activity, and are 70% or more, preferably 80% or more, more preferably the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14. It can be said that a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity is also likely to be an Endo-Zr gene.
  • the homology search for polypeptides and polynucleotides can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo-Zr has a high hydrolysis activity for high mannose-type sugar chains as in Endo-M, and further hydrolyzes hybrid sugar chains and biantennary complex sugar chains.
  • a complex sugar chain having 3 or more branches, a sugar chain having a core fucose structure, or a hybrid sugar chain having bisecting GlcNAc cannot be decomposed.
  • the reactivity to some sugar chains is different from Endo-M, especially for biantennary complex-type sugar chains and M3B, M5A, and M6B structured sugar chains compared to Endo-M. Shows reactivity.
  • Endo-Om acquisition method and manufacturing method (1) Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Om) -producing strain of the present invention
  • the Endo-Om-producing microorganism of the present invention is the methanol stock described in our earlier application specification Patent Document 6. Ogataea minuta IFO10746, a yeast that can grow using methanol as the sole carbon source. Details of the culture method and the like are as described in Patent Document 6, and methanol is added to a normal yeast medium, and the culture is performed under normal yeast culture conditions.
  • the cultured cells can be collected and crushed, and the supernatant from which impurities have been removed can be collected as a crude enzyme solution.
  • the Endo-Om gene was cloned and the original yeast strain was isolated. Transformation was performed as a host, and an Endo-Om gene overexpression system was prepared as described in (3) below.
  • Primer 1 5'-CGATGACAAGGGATCATGGCGCAATCTCAGCTACTGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Primer 2 5'-GCACCGTCTCGGATCTCACACCCAAACCTCACTCC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • the obtained PCR fragment was subcloned with TOPO Blunt cloning kit (Invitrogen), and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-O gene obtained as a result of cloning are shown in FIG.
  • the Endo-Om ORF consisted of 2319 bases and encoded a protein of molecular weight 87,398 consisting of 772 amino acids.
  • This method is applied to Ogataea minuta closely related microorganisms from which the Endo-Om gene of the present invention is collected, for example, yeasts such as other methylotrophic yeasts such as Pichia genus yeast, or DNA libraries derived from microorganisms such as bacteria.
  • yeasts such as other methylotrophic yeasts such as Pichia genus yeast
  • DNA libraries derived from microorganisms such as bacteria.
  • an enzyme gene having Endo-Om activity can be collected. That is, the Endo-Om gene thus obtained hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, and has Endo-Om activity.
  • the Endo-Om gene of the present invention can also be collected by searching a known database, and the obtained Endo-Om gene is 70% or more, preferably 85% with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. % Or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the base sequence having homology (identity), and the corresponding protein having Endo-Om activity is the amino acid shown in SEQ ID NO: 1. It can be expressed as consisting of an amino acid sequence having a homology (identity) of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • the homology search for polynucleotides and proteins can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo-Om / TK10- 1-2 shares Endo-Om / TK10-1-2 shares.
  • Endo-Om / TK10-1-2 strain is induced to induce Endo-Om expression.
  • Extraction buffer and glass beads are added to the collected cells, and the cells are disrupted by shaking vigorously and insoluble by centrifugation. The supernatant from which the product has been removed is used as the Endo-Om crude enzyme solution. After denaturing the Endo-Om crude enzyme solution with SDS sample buffer, Western blotting is performed by a conventional method to confirm protein expression.
  • a similar overexpression strain can be constructed by using a vector incorporating a high expression promoter as a vector. Production using transgenic animals and the like is also possible.
  • These transformed Ogataea minuta Endo-Om overexpressing strains can be used for mass production under normal transformed cell culture conditions or by applying a culture method using methanol induction. Become.
  • Endo-Cp acquisition method and manufacturing method (1) Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Cp) producing strain of the present invention
  • the Endo-Cp producing microorganism of the present invention is a methanol-assimilating yeast, Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012 strain, It is a yeast strain that can grow as a carbon source.
  • the culture is carried out under normal yeast culture conditions by adding methanol to a normal yeast medium.
  • the cultured cells can be collected and disrupted, and the supernatant from which impurities have been removed can be collected as a crude enzyme solution.
  • an Endo-Cp gene overexpression system was prepared.
  • Genomic DNA of Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012 strain was extracted by a conventional method, and primer 3 (SEQ ID NO: 7) and primer 4 (SEQ ID NO: 8) were obtained.
  • primer 3 SEQ ID NO: 7
  • primer 4 SEQ ID NO: 8
  • the full length ORF sequence of the Endo-Cp gene was amplified.
  • Primer 3 5'-TCGAAGGTAGGCATATGCCTCGAAACACAGCTAA-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Primer 4 5'-GCTTGAATTCGGATCCTCAAATGTGCATATCGGTACCCT-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • the obtained PCR product was incorporated into E.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Cp gene obtained as a result of cloning.
  • the ORF of Endo-Cp consisted of 2238 bases and encoded a protein of molecular weight 86,500 consisting of 745 amino acids.
  • This method is applied to a Candida parapolymorpha DL-1 related microorganism from which the Endo-Cp gene of the present invention is collected, for example, another methylotrophic yeast such as Pichia genus yeast, or a microorganism-derived DNA library such as bacteria.
  • another methylotrophic yeast such as Pichia genus yeast
  • a microorganism-derived DNA library such as bacteria.
  • the Endo-Cp gene of the present invention can also be collected by searching a known database, and the obtained Endo-Cp gene is 70% or more, preferably 85% with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. % Or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the base sequence having homology (identity), and the corresponding protein having Endo-Cp activity is the amino acid shown in SEQ ID NO: 5. It can be expressed as consisting of an amino acid sequence having a homology (identity) of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • the homology search for polynucleotides and proteins can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo-Pa acquisition method and manufacturing method (1) Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Pa) producing strain of the present invention
  • the Endo-Pa producing microorganism of the present invention is a yeast strain called Pichia anomala ATCC36904 strain.
  • the culture method is performed under normal yeast culture conditions using a normal yeast medium.
  • the cultured cells can be collected and crushed, and the supernatant from which impurities have been removed can be collected as a crude enzyme solution.
  • the Endo-Pa gene is cloned and transformed using E. coli as the host.
  • an Endo-Pa gene overexpression system was prepared.
  • Genomic DNA of Pichia anomala ATCC36904 strain was extracted by a conventional method, and PCR was performed using primer 5 (SEQ ID NO: 11) and primer 6 (SEQ ID NO: 12). The full-length ORF sequence of the Endo-Pa gene was amplified by the method.
  • Primer 5 5'-TCGAAGGTAGGCATATGCAACATGATCATGCTGCCATA-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • Primer 6 5'-GCTTGAATTCGGATCCCTATATAAATATATCCTCGCCTTTG-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • the obtained PCR product was incorporated into Escherichia coli protein expression plasmid pCold I DNA (TaKaRa-Bio) using In-Fusion TM HD Cloning Kit (Clontech) to construct pCold I-Endo-Pa.
  • the DNA sequence of the purified vector was performed, and the full-length base sequence of the Endo-Pa gene was determined.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Pa gene obtained as a result of cloning are shown in FIG.
  • the Endo-Pa ORF consisted of 1971 bases and encoded a protein with a molecular weight of 76,050 consisting of 656 amino acids.
  • yeasts such as Pichia genus yeast that is methyl-assimilating yeast, or DNA libraries derived from microorganisms such as bacteria
  • an enzyme gene having Endo-Pa activity can be collected.
  • the Endo-Pa gene thus obtained hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, and has Endo-Pa activity. It can be expressed as a gene encoding a protein having Further, the Endo-Pa gene of the present invention can also be collected by searching a known database, and the obtained Endo-Pa gene is 70% or more, preferably 85% with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. % Or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the base sequence having homology (identity), and the corresponding protein having Endo-Pa activity is the amino acid shown in SEQ ID NO: 9.
  • the homology search for polynucleotides and proteins can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo-Zr acquisition and manufacturing method (1) Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Zr) producing strain of the present invention
  • the Endo-Zr producing microorganism of the present invention is a yeast strain called Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623 strain.
  • the culture method is performed under normal yeast culture conditions using a normal yeast medium.
  • the cultured cells can be collected and crushed, and the supernatant from which impurities have been removed can be collected as a crude enzyme solution.
  • the Endo-Zr gene is cloned and transformed using E. coli as the host. As described in (3) below, an Endo-Zr gene overexpression system was prepared.
  • Genomic DNA of Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623 strain was extracted by a conventional method, and PCR was performed using primer 7 (SEQ ID NO: 15) and primer 8 (SEQ ID NO: 16).
  • the full-length ORF sequence of the Endo-Zr gene was amplified by the method.
  • Primer 7 5'-TCGAAGGTAGGCATATGAAACGTATTAATCAGGT-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • Primer 8 5'-GCTTGAATTCGGATCCTTACTTCTTGACTACGAATTTCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • the obtained PCR product was incorporated into E.
  • the Endo-Zr ORF consisted of 1920 bases and encoded a protein of molecular weight 73,105 consisting of 639 amino acids.
  • the method is applied to a Zygosaccharomyces rouxii related microorganism from which the Endo-Zr gene of the present invention is collected, for example, a yeast such as a Pichia genus yeast that is a methyl-assimilating yeast, or a DNA library derived from a microorganism such as a bacterium.
  • a yeast such as a Pichia genus yeast that is a methyl-assimilating yeast
  • a DNA library derived from a microorganism such as a bacterium.
  • the Endo-Zr gene of the present invention can also be collected by searching a known database, and the obtained Endo-Zr gene is 70% or more, preferably 85% with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. % Or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more of the base sequence having homology (identity), and the corresponding protein having Endo-Zr activity is the amino acid shown in SEQ ID NO: 13. It can be expressed as consisting of an amino acid sequence having homology (identity) of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • the homology search for polynucleotides and proteins can be performed using programs such as FASTA and BLAST for the DNA Databank of Japan (DDBJ), for example.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase of the present invention has an activity of cleaving complex sugar chains with high specific activity, as well as glucose and N-acetyl. It has an activity to transfer a cleaved sugar chain or a chemically synthesized sugar chain to any acceptor molecule such as a monosaccharide such as glucosamine or a derivative thereof, or a glycopeptide or glycoprotein having them. Therefore, by using the Endo-Om of the present invention, it is possible to analyze a sugar chain structure including a complex type sugar chain in a glycoprotein.
  • neoglycoprotein such as adding a sugar chain to a protein that does not naturally add a sugar chain, or introducing an N-type sugar chain at a position where a conventional sugar chain is not added, or a non-uniform sugar chain once. It can also be used for various sugar chain modifications, such as cleaving and homogenizing the N-type sugar chain portion of the glycoprotein using a transglycosidase reaction, and preparing a standard glycoprotein for a sugar chain analyzer.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases of the present invention Endo-Cp, Endo-Pa, and Endo-Zr, also have similar glycosylation activity and glycosylation activity for any acceptor molecule. Therefore, the same use is expected.
  • Example 1 Discovery of O. minuta-derived ENGase (Endo-Om) As described in our previous application specification (Patent Document 6), secretory production of human glycosyltransferase by O. minuta was performed. It was. The secreted MGAT5 was partially purified, and the reaction was carried out using a complex biantennary sugar chain (NGA2-Asn-Fmoc) as an acceptor substrate and UDP-GlcNAc as a donor substrate. When the product was analyzed, another peak was confirmed as a by-product in addition to the product by the glycosyl transfer reaction.
  • NGA2-Asn-Fmoc complex biantennary sugar chain
  • a standard sample was prepared by sequentially digesting the receptor substrate NGA2-Asn-Fmoc with an exo-type glycosidase and analyzed for this peak. It was suggested that it was cut. Since Endo-M is known to efficiently cleave complex biantennary sugar chains, O. minuta was considered to have the same activity, and thus gene cloning was examined.
  • Primer 1 5'-CGATGACAAGGGATCATGGCGCAATCTCAGCTACTGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Primer 2 5'-GCACCGTCTCGGATCTCACACCCAAACCTCACTCC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • the obtained PCR fragment was subcloned with TOPO Blunt cloning kit (Invitrogen), and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-O gene obtained as a result of cloning are shown in FIG.
  • the Endo-Om ORF consisted of 2319 bases and encoded a protein of molecular weight 87,398 consisting of 772 amino acids.
  • the estimated isoelectric point was 5.59.
  • Endo-Om is located in the GH family 85 ENGase belonging to GH18 Chitinase-like superfamily at the position of about 80-410 amino acids on the N-terminal side. It had a highly conserved sequence.
  • FIG. 2 shows the result of creating a phylogenetic tree for species close to yeast among the upper sequences hit by the BLAST search. For sequences other than Endo-M, the annotation indicating ENGase was not described in the database.
  • Endo-Om had the highest homology with the putative ENGase derived from the methanol-assimilating yeast Candida parapolymorpha DL-1 (Hansenula polymorpha DL-1) (Example 6, Endo-Cp below), which was 53.9%.
  • Mucor The homology with Hiemalis-derived Endo-M was 33.9%, and there was no homology except for the conserved sequence on the N-terminal side.
  • no corresponding gene was detected in Pichia pastoris and Candida boidinii, which are the same methanol-assimilating yeast. Furthermore, no corresponding gene was detected in Saccharomyces cerevisiae.
  • Example 3 Production of Endo-Om overexpression O. minuta strain Endo-Om overexpression strains in methanol-assimilating yeast O. minuta were prepared as follows. First, as in Example 2, the full-length ORF sequence of the Endo-Om gene was amplified by PCR using the primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4). After the amplified 2349 bp PCR product was purified, the PCR product was incorporated into the expression plasmid pOMEA1 cleaved with BamHI using the In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) to construct pOMEA1-Endo-Om.
  • the constructed pOMEA1-Endo-Om was cleaved with NotI and transformed into competent cells of O. minuta TK10-1-2 strain using electroporation.
  • the transformed bacterial solution is transferred to SD-Ade agar medium (2% D-glucose, 0.67% Yeast Nitrogen Base w / o amino acids (Difco), 0.5% Casamino acid, 0.1 mg / ml Uracil, 1.5% Agar) After coating and culturing at 30 ° C. for 2 days, transformant colonies were obtained. The colony is scraped from the plate, confirmed to be integrated on the chromosome by a simple PCR method suspended in the PCR reaction solution, and Endo-Om overexpressed O. minuta strain (Endo-Om / TK10-1-2 strain) did.
  • Example 4 Endo-Om overexpression Endo-Om expression and enzyme activity confirmation in O. minuta strain Endo-Om / TK10-1-2 strain in 3 ml of YPD medium (2% Peptone, 1% Yeast Extract, 2% glucose) and cultured at 30 ° C. for 2 days.
  • YPD medium 2% Peptone, 1% Yeast Extract, 2% glucose
  • BMMY medium 2% Peptone, 1% Yeast Extract, 1.34% Yeast Nitrogen Base w / o amino acids, 2% Casamino acid, 1% MeOH, 0.2 mg / ml Adenine1 / 2 sulfate, 0.1 mg / ml Uracil, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0)) and resuspended, and cultured for additional 2 days at 20 ° C to induce Endo-Om expression It was.
  • reaction solution containing 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.3), 0.5 M NaCl, 10 ⁇ M Fmoc-labeled biantennary complex type sugar chain (NGA2-Asn-Fmoc), and Endo-Om crude enzyme solution (total volume) : 10 ⁇ l) was incubated at 50 ° C. for 1 hour, and the enzyme reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 5 minutes. The reaction solution was subjected to HPLC, and the enzyme activity was calculated from the peak area ratio of the substrate NGA2-Asn-Fmoc and its hydrolyzate.
  • Asahipak NH2P-50 4E (4.6 ⁇ 250 mm, Shodex) was used as the column, and acetonitrile (solvent A) and 200 mM TEAA (pH 7.0, GLEN RESEARCH: solvent B) were used as the solvent. Isocratic elution was performed under conditions of a flow rate of 1.0 ml / min and solvent B: 43%, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 265 nm, fluorescence wavelength: 315 nm). The enzyme activity of Endo-Om was defined as 1 Unit, which hydrolyzes 1 ⁇ mol of NGA2-Asn-Fmoc per minute under the above reaction conditions.
  • the detection result of the enzyme reaction by HPLC is shown in FIG. First, when the biantennary complex sugar chain (NGA2-Asn-Fmoc) of the substrate was subjected to HPLC alone, a peak was detected at a position of 11.7 min. Subsequently, the reaction was performed at a ratio of 50 ⁇ g protein / reaction in the crude enzyme solution of the O. minuta strain and the Endo-Om overexpression strain before transformation, and the activities were compared. In the strain overexpressing Endo-Om, the substrate peak was significantly reduced compared to the strain before transformation, and the peak of the hydrolyzate GlcNAc-Asn-Fmoc (6.8 min) was increased.
  • Endo-Om is the true identity of the enzyme that hydrolyzes the biantennary complex type sugar chain of O. minuta.
  • the result of comparison of specific activities of the Endo-Om overexpression strain is shown in FIG.
  • the specific activity was 15.0 [ ⁇ Unit / mg protein] when 10 ⁇ M NGA2-Asn-Fmoc was used as a substrate, whereas in the Endo-Om overexpression strain, 295 ⁇ It was increased to 339 [ ⁇ Unit / mg protein] (20 to 24 times before transformation).
  • Example 5 Examination of various properties of Endo-Om (5-1) Preparation and Specific Activity of Endo-Om Purified Enzyme Solution and Calculation of Km and Vmax Various properties of Endo-Om were examined using the purified enzyme solution.
  • the Endo-Om crude enzyme solution prepared from 100 ml of the bacterial solution by the method described in Example 4 was dialyzed with an equilibration buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.5 mM PMSF, 50 mM imidazole). ).
  • the dialyzed Endo-Om crude enzyme solution is applied to a HisTrap HP column (GE Healthcare), washed with equilibration buffer, and then eluted stepwise with equilibration buffer containing 50 mM, 100 mM, and 200 mM imidazole. Eluted.
  • the fraction containing Endo-Om eluted from the column was ultrafiltered and concentrated with Amicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore), dialyzed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) and 0.5 M NaCl, and then finished. Glycerol was added to a concentration of 10% to obtain an Endo-Om purified enzyme solution.
  • the activity of the purified Endo-Om enzyme solution when the substrate concentration was 1 mM was measured by the method described in Example 4, and the specific activity was calculated. In addition, activities were measured using various concentrations of NGA2-Asn-Fmoc as substrates, and Km and Vmax were calculated. For comparison, the specific activity, Km, and Vmax of commercially available Endo-M were calculated by the same method. Since the optimum pH of Endo-M is 6.0 (Non-patent Document 6), the pH of the sodium acetate buffer was 6.0 when measuring the activity of Endo-M. The purification results of Endo-Om are shown in FIG. Endo-Om was purified to single on SDS-PAGE.
  • the specific activity of the purified Endo-Om was 0.80 ⁇ mol / min / mg when 1 mM NGA2-Asn-Fmoc was used as a substrate.
  • the specific activity of commercially available Endo-M under the same measurement conditions was 0.06 ⁇ mol / min / mg, and Endo-Om was found to have a specific activity approximately 13 times that of Endo-M.
  • activity was measured using various concentrations of NGA2-Asn-Fmoc as a substrate, and Km and Vmax were calculated.
  • Buffers include sodium citrate buffer (pH 3.5-5.5), sodium acetate buffer (pH 4.5-6.0), sodium phosphate buffer (pH 6.0-7.5), MOPS-NaOH buffer (pH 6.5-8.0), Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.0) was used.
  • the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 4, and the enzyme activity was calculated.
  • the optimum reaction temperature was examined by changing the reaction temperature of the activity measurement method described in Example 4 from 10 ° C to 60 ° C. The measurement results of the optimal reaction conditions for Endo-Om are shown in FIG. The optimum reaction pH of Endo-Om was around 5.5, and the optimum reaction temperature was around 50 ° C.
  • the column is Cosmosil 5C18-ARII (2.0 ⁇ 150mm, Nacalai Tesque), and the solvent is 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0: solvent A) and 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0), 0.5% 1- Butanol (solvent B) was used.
  • Solvent B 5% -50% linear gradient elution was performed over 24 minutes at a flow rate of 0.5 ml / min, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 320 nm, fluorescence wavelength: 400 nm).
  • reaction solution (total volume: 10 ⁇ l) containing a final concentration of 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0), 2 mM NGA2-Asn-Fmoc, 50 mM acceptor molecule (p-nitrophenylglucose) and Endo-Om purified enzyme solution at 30 ° C.
  • the enzyme reaction was stopped by incubating for 3 hours at 95 ° C. for 5 minutes.
  • the total amount of the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 4 and detected with a UV detector (274 nm).
  • FIG. 7 shows the detection result of the glycosyltransferase activity of Endo-Om.
  • Example 6 Cloning of Candida parapolymorphaDL-1-derived ENGase (Endo-Cp) gene
  • a BLAST search was performed on the amino acid sequence database of NCBI based on the amino acid sequence of Endo-Om. A gene with high homology was detected (Fig. 2). Among them, the gene derived from Candida parapolymorpha DL-1 (Hansenula polymorpha DL-1) was 53.9% homologous to Endo-Om in amino acid sequence, but the annotation that it is ENGase is described in the database. There wasn't. Therefore, cloning of Endo-Cp gene and construction of protein expression system were examined.
  • Genomic DNA of Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012 strain was extracted by a conventional method, and the full-length ORF sequence of the Endo-Cp gene was amplified by PCR using primer 3 (SEQ ID NO: 7) and primer 4 (SEQ ID NO: 8).
  • Primer 3 5'-TCGAAGGTAGGCATATGCCTCGAAACACAGCTAA-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Primer 4 5'-GCTTGAATTCGGATCCTCAAATGTGCATATCGGTACCCT-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • the PCR product is incorporated into the Escherichia coli protein expression plasmid pCold I DNA (TaKaRa-Bio) cleaved with Nde I and BamHI using the In-Fusion TM HD Cloning Kit (Clontech). PCold I-Endo-Cp was constructed.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Cp gene obtained as a result of cloning.
  • the ORF of Endo-Cp consisted of 2238 bases and encoded a protein of molecular weight 86,500 consisting of 745 amino acids. The estimated isoelectric point was 5.61.
  • Endo-Cp had a sequence highly conserved in GH family 85 ENGase belonging to GH18 Chitinase-like superfamily at the position of about 75 to 410 amino acids on the N-terminal side.
  • Example 7 Production of E. coli strain expressing Endo-Cp pCold I-Endo-Cp of Example 6 was transferred to an E. coli competent cell for protein expression (NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs). Transformed. The transformed bacterial solution is applied to an LB agar medium (2.5% LB Broth, Miller (Difco), 1.5% Agar) containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight. A colony was obtained. The colony was scraped from the plate, and the amplification of the Endo-Cp gene was confirmed by a simple PCR method suspended in a PCR reaction solution to obtain an Endo-Cp-expressing Escherichia coli strain.
  • Endo-Cp expression induction and preparation of partially purified enzyme solution Endo-Cp-expressing Escherichia coli strain was seeded in 5 ml of LB medium and cultured overnight at 37 ° C. The total amount of the bacterial solution was added to 500 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. for about 3 hours to grow the cells until the OD value reached about 0.5. Thereafter, IPTG was added to a final concentration of 1.0 mM, and the protein expression was induced by quenching to 15 ° C. and applying a cold shock. After culturing at 15 ° C.
  • the cells were collected and extracted buffer (50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 1.25 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 ⁇ Complete (Roche), 5% glycerol. ) And glass beads were added, and the cells were disrupted by shaking vigorously. The supernatant from which insolubles were removed by centrifugation was used as the Endo-Cp crude enzyme solution.
  • the Endo-Cp crude enzyme solution was replaced with an equilibration buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.5 mM PMSF, 50 mM imidazole) by dialysis.
  • the dialyzed Endo-Cp crude enzyme solution is applied to a HisTrap HP column (GE Healthcare), washed with equilibration buffer, and then eluted stepwise with equilibration buffer containing 50 mM, 100 mM, and 200 mM imidazole. Eluted.
  • the fraction containing Endo-Cp eluted from the column was concentrated by ultrafiltration with Amicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore), and further dialyzed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) and 0.5 M NaCl. Glycerol was added to a final concentration of 10% to obtain an Endo-Cp partially purified enzyme solution.
  • Western blotting was performed as follows.
  • Endo-Cp partially purified enzyme solution was denatured with SDS sample buffer, and then Western blotting was performed by a conventional method.
  • the enzyme activity was measured as follows. Final concentration 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.3), 0.5 M NaCl, 10 ⁇ M Fmoc-labeled biantennary complex type sugar chain (NGA2-Asn-Fmoc), and reaction solution containing Endo-Cp (total volume: 10 ⁇ l) was incubated at 30 ° C.
  • Isocratic elution was performed under conditions of a flow rate of 1.0 ml / min and solvent B: 43%, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 265 nm, fluorescence wavelength: 315 nm).
  • the enzyme activity of Endo-Cp was defined as 1 Unit, which hydrolyzes 1 ⁇ mol of NGA2-Asn-Fmoc per minute under the above reaction conditions.
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE, Western blotting and activity measurement of the Endo-Cp partially purified enzyme solution.
  • Example 9 Examination of various properties of Endo-Cp (9-1) Examination of optimum reaction conditions for Endo-Cp The optimum reaction pH for Endo-Cp was examined as follows. Incubate a reaction solution (total volume: 10 ⁇ l) containing various buffers with a final concentration of 100 mM, 0.5 M NaCl, 10 ⁇ M NGA2-Asn-Fmoc, and Endo-Cp partially purified enzyme solution at 30 ° C. for 3 hours, and then at 95 ° C. for 5 minutes. The enzyme reaction was stopped by heating.
  • Buffers include sodium citrate buffer (pH 3.5-5.5), sodium acetate buffer (pH 4.5-6.0), sodium phosphate buffer (pH 6.0-7.5), MOPS-NaOH buffer (pH 6.5-8.0), Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.0) was used.
  • the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 8, and the enzyme activity was calculated.
  • the optimum reaction temperature was examined by changing the reaction temperature of the activity measurement method described in Example 8 from 10 ° C to 70 ° C.
  • the measurement results of the optimal reaction conditions for Endo-Cp are shown in FIG.
  • the optimum reaction pH of Endo-Cp was around 5.5, and the optimum reaction temperature was around 60 ° C.
  • the column is Cosmosil 5C18-ARII (2.0 ⁇ 150mm, Nacalai Tesque), and the solvent is 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0: solvent A) and 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0), 0.5% 1- Butanol (solvent B) was used.
  • Solvent B 5% -50% linear gradient elution was performed over 24 minutes at a flow rate of 0.5 ml / min, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 320 nm, fluorescence wavelength: 400 nm).
  • a final reaction solution (total volume: 10 ⁇ l) containing 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0), 2 mM NGA2-Asn-Fmoc, 50 mM acceptor molecule (p-nitrophenylglucose) and Endo-Cp partially purified enzyme solution
  • the enzyme reaction was stopped by incubating at 0 ° C for 3 hours and heating at 95 ° C for 5 minutes.
  • the total amount of the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 8, and detection was performed with a UV detector (274 nm).
  • Genomic DNA of Pichia anomala ATCC36904 strain was extracted by a conventional method, and the full length ORF sequence of the Endo-Pa gene was amplified by PCR using primer 5 (SEQ ID NO: 11) and primer 6 (SEQ ID NO: 12).
  • Primer 5 5'-TCGAAGGTAGGCATATGCAACATGATCATGCTGCCATA-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • Primer 6 5'-GCTTGAATTCGGATCCCTATATAAATATATCCTCGCCTTTG-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • the PCR product is incorporated into the E.
  • Endo-Pa coli protein expression plasmid pCold I DNA (TaKaRa-Bio) cleaved with Nde I and BamHI using the In-Fusion TM HD Cloning Kit (Clontech). PCold I-Endo-Pa was constructed. The DNA sequence of the purified vector was performed, and the full-length base sequence of the Endo-Pa gene was determined. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Pa gene obtained as a result of cloning are shown in FIG. The Endo-Pa ORF consisted of 1971 bases and encoded a protein with a molecular weight of 76,050 consisting of 656 amino acids. The estimated isoelectric point was 6.06. Endo-Pa had a highly conserved sequence in GH family 85 ENGase belonging to the GH18 Chitinase-like superfamily at a position of about 65 to 400 amino acids on the N-terminal side.
  • Example 11 Production of E. coli strain expressing Endo-Pa pCold I-Endo-Pa of Example 10 was transferred to an E. coli competent cell for protein expression (NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs). Transformed. The transformed bacterial solution is applied to an LB agar medium (2.5% LB Broth, Miller (Difco), 1.5% Agar) containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight. A colony was obtained. The colony was scraped from the plate, and the amplification of the Endo-Pa gene was confirmed by a simple PCR method suspended in a PCR reaction solution to obtain an Endo-Pa-expressing Escherichia coli strain.
  • Example 12 Endo-Pa Expression Induction and Partially Purified Enzyme Solution Preparation Endo-Pa-expressing E. coli strains were seeded in 5 ml of LB medium and cultured overnight at 37 ° C. The total amount of the bacterial solution was added to 500 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. for about 3 hours to grow the cells until the OD value reached about 0.5. Thereafter, IPTG was added to a final concentration of 1.0 mM, and the protein expression was induced by quenching to 15 ° C. and applying a cold shock. After culturing at 15 ° C.
  • the cells were collected and extracted buffer (50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 1.25 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 ⁇ Complete (Roche), 5% glycerol. ) And glass beads were added, and the cells were disrupted by shaking vigorously. The supernatant from which insoluble matter was removed by centrifugation was used as the Endo-Pa crude enzyme solution. The crude Endo-Pa enzyme solution was replaced with an equilibration buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.5 mM PMSF, 50 mM imidazole) by dialysis.
  • an equilibration buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.5 mM PMSF, 50 mM imidazole
  • the dialyzed Endo-Pa crude enzyme solution is applied to a HisTrap HP column (GE Healthcare), washed with the equilibration buffer, and then the protein is eluted stepwise with the equilibration buffer containing 50 mM, 100 mM, and 200 mM imidazole. Eluted.
  • the fraction containing Endo-Pa eluted from the column was ultrafiltered and concentrated with Amicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore), dialyzed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) and 0.5 M NaCl, and the final reaction was completed. Glycerol was added to a concentration of 10% to obtain an Endo-Pa partially purified enzyme solution.
  • Western blotting was performed as follows.
  • Endo-Pa partially purified enzyme solution was denatured with SDS sample buffer, and then Western blotting was performed by a conventional method.
  • the enzyme activity was measured as follows. Final concentration of 100 mM sodium acetate buffer (pH 5.3), 0.5 M NaCl, 10 ⁇ M Fmoc-labeled biantennary complex sugar chain (NGA2-Asn-Fmoc), and reaction solution containing Endo-Pa (total volume: 10 ⁇ l) was incubated at 30 ° C.
  • Isocratic elution was performed under conditions of a flow rate of 1.0 ml / min and solvent B: 43%, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 265 nm, fluorescence wavelength: 315 nm).
  • the enzyme activity of Endo-Pa was defined as 1 Unit for the activity of hydrolyzing 1 ⁇ mol of NGA2-Asn-Fmoc per minute under the above reaction conditions.
  • the results of SDS-PAGE, Western blotting and activity measurement of the Endo-Pa partially purified enzyme solution are shown in FIG.
  • Endo-Pa is an ENGase that hydrolyzes a biantennary complex type sugar chain in the same manner as known Endo-M.
  • the specific activity of the Endo-Pa partially purified enzyme solution was 353 ⁇ Unit / mg.
  • Example 13 Examination of various properties of Endo-Pa (13-1) Examination of optimal reaction conditions for Endo-Pa The optimum reaction pH for Endo-Pa was examined as follows. Reaction solutions (total volume: 10 ⁇ l) containing various buffers with a final concentration of 100 mM, 0.5 M NaCl, 10 ⁇ M NGA2-Asn-Fmoc, and Endo-Pa partially purified enzyme solution are incubated at 30 ° C. for 3 hours, and then at 95 ° C. for 5 minutes. The enzyme reaction was stopped by heating.
  • Buffers include sodium citrate buffer (pH 3.5-5.5), sodium acetate buffer (pH 4.5-6.0), sodium phosphate buffer (pH 6.0-7.5), MOPS-NaOH buffer (pH 6.5-8.0), Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.0) was used.
  • the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 12, and the enzyme activity was calculated.
  • the optimum reaction temperature was examined by changing the reaction temperature of the activity measurement method described in Example 12 from 10 ° C to 60 ° C.
  • the measurement results of the optimal reaction conditions for Endo-Pa are shown in FIG.
  • the optimum reaction pH of Endo-Pa was around 5.0-5.5, and the optimum reaction temperature was around 40 ° C.
  • the column is Cosmosil 5C18-ARII (2.0 ⁇ 150mm, Nacalai Tesque), and the solvent is 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0: solvent A) and 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0), 0.5% 1- Butanol (solvent B) was used.
  • Solvent B 5% -50% linear gradient elution was performed over 24 minutes at a flow rate of 0.5 ml / min, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 320 nm, fluorescence wavelength: 400 nm).
  • a final reaction solution (total volume: 10 ⁇ l) containing 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0), 2 mM NGA2-Asn-Fmoc, 50 mM acceptor molecule (p-nitrophenylglucose) and Endo-Pa partially purified enzyme solution
  • the enzyme reaction was stopped by incubating at 0 ° C for 16 hours and heating at 95 ° C for 5 minutes.
  • the total amount of the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 12, and detection was performed with a UV detector (274 nm).
  • Genomic DNA of Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623 strain was extracted by a conventional method, and the ORF full-length sequence of Endo-Zr gene was amplified by PCR using primer 7 (SEQ ID NO: 15) and primer 8 (SEQ ID NO: 16).
  • Primer 7 5'-TCGAAGGTAGGCATATGAAACGTATTAATCAGGT-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • Primer 8 5'-GCTTGAATTCGGATCCTTACTTCTTGACTACGAATTTCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • the PCR product is incorporated into the E.
  • Endo-Zr coli protein expression plasmid pCold I DNA (TaKaRa-Bio) cleaved with Nde I and BamHI using the In-Fusion TM HD Cloning Kit (Clontech). PCold I-Endo-Zr was constructed. The DNA sequence of the purified vector was performed, and the full-length base sequence of the Endo-Zr gene was determined. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the Endo-Zr gene obtained as a result of cloning are shown in FIG.
  • the Endo-Zr ORF consisted of 1920 bases and encoded a protein of molecular weight 73,105 consisting of 639 amino acids. The estimated isoelectric point was 6.69. Endo-Zr had a highly conserved sequence in GH family 85 ENGase belonging to the GH18 Chitinase-like superfamily at a position of about 70 to 400 amino acids on the N-terminal side.
  • Example 15 Production of Endo-Zr-expressing Escherichia coli strain pCold I-Endo-Zr of Example 14 was transferred to an E. coli competent cell for protein expression (NEB Express Competent E. coli (High Efficiency), NEW ENGRAND BioLabs). Transformed. The transformed bacterial solution is applied to an LB agar medium (2.5% LB Broth, Miller (Difco), 1.5% Agar) containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight. A colony was obtained. The colony was scraped from the plate, and the amplification of the Endo-Zr gene was confirmed by a simple PCR method suspended in a PCR reaction solution to obtain an Endo-Zr-expressing Escherichia coli strain.
  • Example 16 Endo-Zr Expression Induction and Preparation of Partially Purified Enzyme Solution An Endo-Zr-expressing E. coli strain was seeded in 5 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. overnight. The total amount of the bacterial solution was added to 500 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. for about 3 hours to grow the cells until the OD value reached about 0.5. Thereafter, IPTG was added to a final concentration of 1.0 mM, and the protein expression was induced by quenching to 15 ° C. and applying a cold shock. After culturing at 15 ° C.
  • the cells were collected and extracted buffer (50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 1.25 M NaCl, 1 mM PMSF, 1 ⁇ Complete (Roche), 5% glycerol. ) And glass beads were added, and the cells were disrupted by shaking vigorously. The supernatant from which insolubles were removed by centrifugation was used as the Endo-Zr crude enzyme solution. The crude Endo-Zr enzyme solution was replaced with an equilibration buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.5 mM PMSF, 50 mM imidazole) by dialysis.
  • an equilibration buffer (20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.5 mM PMSF, 50 mM imidazole
  • the dialyzed Endo-Zr crude enzyme solution is applied to a HisTrap HP column (GE Healthcare), washed with equilibration buffer, and then eluted stepwise with equilibration buffer containing 50 mM, 100 mM, and 200 mM imidazole. Eluted.
  • the fraction containing Endo-Zr eluted from the column was ultrafiltered and concentrated with Amicon Ultra (50,000 NMWL, Millipore), dialyzed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl, and the final reaction was completed. Glycerol was added to a concentration of 10% to obtain an Endo-Zr partially purified enzyme solution.
  • Western blotting was performed as follows.
  • Endo-Zr partially purified enzyme solution was denatured with SDS sample buffer, and then Western blotting was performed by a conventional method.
  • the enzyme activity was measured as follows.
  • Asahipak NH2P-50 4E (4.6 ⁇ 250 mm, Shodex) was used as the column, and acetonitrile (solvent A) and 200 mM TEAA (pH 7.0, GLEN RESEARCH: solvent B) were used as the solvent. Isocratic elution was performed under conditions of a flow rate of 1.0 ml / min and solvent B: 43%, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 265 nm, fluorescence wavelength: 315 nm). The enzyme activity of Endo-Zr was defined as 1 Unit for the activity of hydrolyzing 1 ⁇ mol of NGA2-Asn-Fmoc per minute under the above reaction conditions.
  • FIG. 17 shows the results of SDS-PAGE, Western blotting and activity measurement of the Endo-Zr partially purified enzyme solution.
  • SDS-PAGE detected multiple bands, but Western blotting detected a His-tag signal at a position corresponding to 73 kDa, the molecular weight of Endo-Zr, confirming protein expression (FIGS. 17A and B).
  • NZA2-Asn-Fmoc biantennary complex type sugar chain
  • Endo-Zr is an ENGase that hydrolyzes a biantennary complex type sugar chain in the same manner as the known Endo-M.
  • the specific activity of the Endo-Zr partially purified enzyme solution was 3.3 ⁇ Unit / mg.
  • Example 17 Examination of various properties of Endo-Zr (17-1) Examination of optimum reaction conditions for Endo-Zr The optimum reaction pH for Endo-Zr was examined as follows. Incubate a reaction solution (total volume: 10 ⁇ l) containing various buffers with a final concentration of 100 mM, 0.5 M NaCl, 10 ⁇ M NGA2-Asn-Fmoc, and Endo-Zr partially purified enzyme solution at 30 ° C. for 3 hours, and then at 95 ° C. for 5 minutes. The enzyme reaction was stopped by heating.
  • Buffers include sodium citrate buffer (pH 3.5-5.5), sodium acetate buffer (pH 4.5-6.0), sodium phosphate buffer (pH 6.0-7.5), MOPS-NaOH buffer (pH 6.5-8.0), Tris-HCl buffer (pH 8.0-9.0) was used.
  • the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 16, and the enzyme activity was calculated.
  • the optimum reaction temperature was examined by changing the reaction temperature of the activity measurement method described in Example 16 from 10 ° C to 60 ° C.
  • the measurement results of the optimal reaction conditions for Endo-Zr are shown in FIG.
  • the optimum reaction pH of Endo-Zr was around 4.5-5.0, and the optimum reaction temperature was around 40 ° C.
  • the column is Cosmosil 5C18-ARII (2.0 ⁇ 150mm, Nacalai Tesque), and the solvent is 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0: solvent A) and 0.1M ammonium acetate buffer (pH4.0), 0.5% 1- Butanol (solvent B) was used.
  • Solvent B 5% -50% linear gradient elution was performed over 24 minutes at a flow rate of 0.5 ml / min, and detection was performed with a fluorescence detector (excitation wavelength: 320 nm, fluorescence wavelength: 400 nm).
  • a final reaction solution (total volume: 10 ⁇ l) containing 100 mM sodium acetate buffer (pH 6.0), 2 mM NGA2-Asn-Fmoc, 50 mM acceptor molecule (p-nitrophenylglucose) and Endo-Zr partially purified enzyme solution
  • the enzyme reaction was stopped by incubating at 0 ° C for 16 hours and heating at 95 ° C for 5 minutes.
  • the total amount of the reaction solution was subjected to HPLC by the method described in Example 16, and detection was performed with a UV detector (274 nm).

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Abstract

【課題】　本発明は、新規エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)及びその遺伝子を提供する。 【解決手段】　本発明は、メタノール資化性酵母Ogataea minuta IFO10746株由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)遺伝子をクローニングし、形質転換株を用いて新規なエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)を提供した。本発明のEndo-Omは、公知のEndo-Mと比較して13倍もの高い比活性および55倍もの高いVmaxを有し、糖タンパク質における複合型糖鎖も含めた糖鎖構造の解析及び糖鎖修飾にとって有用である。さらに、Endo-Om遺伝子配列をもとにCandida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株、Pichia anomala ATCC36904株、及びZygosaccharomyces rouxii ATCC2623株から、Endo-Omと同様の複合型糖鎖切断活性及び複合型糖鎖転移活性を有するエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Cp)、(Endo-Pa)、及び(Endo-Zr)を提供した。

Description

複合型糖鎖加水分解酵素
　本発明は、複合型糖鎖の加水分解酵素及びその遺伝子に関する。
　糖タンパク質は酵母などの微生物からヒトまで真核生物に見られるほか、近年ではいくつかの細菌でも報告されている。その糖鎖の機能はタンパク質の安定性やプロテアーゼ耐性などに関わるだけでなく、高次構造形成のための折りたたみにも必要である。またタンパク質間の相互作用を制御したり、細胞表面のレクチンと結合しシグナル伝達などを起こすことも知られている。これらの糖タンパク質の解析のために、糖鎖を切り離して糖鎖構造を決定することが必要である。アスパラギン残基に結合したN-型糖鎖を切り離す酵素としてはペプチド：N-グリカナーゼやエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼが知られている。後者のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼはN-型糖鎖の還元末端に存在するキトビオースの間を切断する酵素であり、これまでにArthrobacter由来のEndo-A(非特許文献１、特許文献４)、Streptococcus pneumoniae由来のEndo-D(非特許文献２)、Flavobacterium由来のEndo-F(非特許文献３)、Streptomyces plicatus由来のEndo-H(非特許文献４)、Mycosphaerella由来のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(特許文献３)、イネ由来のEndo-Os(非特許文献５)、Mucor hiemalis由来のEndo-M(特許文献１，２，５，非特許文献６，７)などが知られている。これらの多くはキトビオースの間を切断する分解活性のほか、糖鎖を転移するトランスグリコシダーゼ活性が存在する。すなわち、これらは糖タンパク質のN-結合型糖鎖に作用して糖鎖を切り出し、 該糖鎖をアクセプターである糖質や複合糖質に転移する反応を効率よく触媒する。したがって、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、糖タンパク質の糖鎖構造の解析のみならず、複合糖質糖鎖の修飾、ネオグライコプロテイン(Neoglycoprotein)の調製、糖タンパク質の糖鎖部分の均一化等に有用な酵素群である。
　しかしながら、主要な生理活性を示す糖タンパク質が有するアスパラギン結合型糖鎖は、その構造から高マンノース型(マンナン型糖鎖)、混成型及び複合型に分類されるが、複合型糖鎖を切断する活性を有すると報告されているのは、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのうちで、Endo-M、Endo-F2、Endo-F3、Endo-S、Endo-CEである。
　Endo-Mはその諸性質が詳しく調べられており、その基質特異性は高マンノース型のMan8GlcNAc2に対する活性を100％とした際に、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対して4.4％である(非特許文献６)。また３分岐、アシアロ４分岐のN-型糖鎖を切断できるという記載(非特許文献７)がある一方、PA糖鎖を利用した酵素活性測定においては、アシアロ３分岐、アシアロ４分岐に対する活性は検出されていない(非特許文献６)。またコアフコースが付加した２分岐PA化糖鎖も切断できない。
　Endo-F2はElizabethkingia miricola由来の酵素であり、高マンノース型および２分岐複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖の加水分解活性はない(非特許文献８)。Endo-F3もElizabethkingia miricola由来の酵素であり、２分岐または３分岐複合型糖鎖を加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない(非特許文献８)。Endo-SはStreptococcus pyogenes由来の酵素であり、２分岐複合型糖鎖のみを加水分解するが、高マンノース型、混成型糖鎖の加水分解活性はない(非特許文献９)。Endo-CE はCaenorhabditis elegans由来の酵素であり、高マンノース型および２分岐の複合型糖鎖を加水分解するが、混成型糖鎖を切断するかどうかは不明である(非特許文献１０)。
　複合型糖鎖の修飾に関しても、従来の知見からみて、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのトランスグリコシダーゼ活性の基質特異性は分解活性と同一であるから、複合型糖鎖をアクセプターに転移することができるのもこれらの酵素のみしかない。
　糖タンパク質の糖鎖構造の解析の際にはもちろんのこと、複合糖質糖鎖を含む様々な糖鎖を有する糖タンパク質を合成するためには、Endo-Mとは基質特異性が異なるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの提供が切望されており、またさらに複合型糖鎖に対する比活性が高い酵素の提供も望まれていた。
特許公開平１１－３３２５６８号公報 特許公開平７－５９５８７号公報 特許公開平９－１９１８７５号公報 特許公開平９－１７３０８３号公報 ＷＯ２００８／１１１５２６号パンフレット ＷＯ２００９／０５７８１３号パンフレット 特許第４４６４２６９号公報
Takegawa K et al.,(1989)Appl Environ Microbiol.55：p3107-3112 Koide N and Muramatsu T,(1974) J Biol Chem.249：p4897-4904 Elder JH and Alexander S,(1982) PNAS U S A.79：4540-4544 Robbins PW et al.,(1984) J Biol Chem.259：p7577-7583 Kimura Y,(2007)In Comprehensive Glycoscience 3：p61-78 Fujita et al.,(2004)Arch Biochem Biophy.432：p41-49 Kadowaki S et al.,(1990)Agric Biol Chem.54：p97-106 Tarentino AL et al.,(1993)J Biol Chem.268：p9702-9708 Goodfellow JJ et al.,(2012)J Am Chem Sci.134：p8030-8033 Kato T et al.,(2002)Glycobiology 12：p581-587
　本発明は、このような従来におけるこれらのアスパラギン結合型糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法、またトランスグリコシダーゼ活性を用いた複合型糖鎖の転移の問題点を解決するためになされたものである。すなわち、これまでに報告されているエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼとは異なる新規の酵素を取得し、基質特異性や比活性などの点でEndo-Mとは異なるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼおよびその製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、メタノール資化性酵母Ogataea minuta IFO10746株の特性を研究する中で、その培養上清中に高いエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)活性が存在することを見いだした。そこで、当該酵母からEndo-Om遺伝子を単離し、塩基配列及び対応するアミノ酸配列を決定した(配列番号１、２)。本発明のEndo-Omは、従来知られているエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼのどの配列とも相同性(同一性)は低く、公知のMucor属由来Endo-Mとはアミノ酸レベルで33.9％、Endo-F2とは8.8％、Endo-F3とは9.0％、Endo-Sとは14.7％、Endo-CEとは18.9％の同一性であり、データベース上で最も近い配列を有するCandida属由来の機能不明タンパク質(hypothetical protein)ともアミノ酸レベルで53.9％程度の同一性しかない新規酵素である。Endo-Om遺伝子を用いて当該遺伝子を単離したO.minuta株を形質転換し、Endo-Om遺伝子の過剰発現株を作製することによってエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性が増加した。この過剰発現株からエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを単離し、諸性質を決定することに成功し、本発明を完成させた。
　本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)は、次の酵素学的及び理化学的性質を有する；
(1)作用；アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。 
(2)基質特異性； 
　1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
　2)高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対する活性が約15％。
(3)至適pH；約5.5
(4)至適温度；45～50℃
(5)遺伝子；2,319bp(Endo-Mとアミノ酸配列で33.9％の相同性)
(6)分子量；87,398Da(アミノ酸配列より)
(7)1mM 複合型２分岐糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)を基質とした際の比活性；0.80μmol/min/mg
(Endo-Mの比活性(0.06μmol/min/mg)の約13倍)
(8)複合型２分岐糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)に対するKm; 5539μM,Vmax;3.88μmol/min/mg
(Endo-MのKm(176μM)の31倍、Endo-MのVmax(0.070μmol/min/mg)の55倍)
(9)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型(NGA2-Asn-Fmoc)を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
　本発明のEndo-Omは、高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対する活性が約15％で、公知のEndo-Mとは基質特異性が異なっており、またEndo-Mの13倍という高い比活性およびEndo-Mの55倍という高いVmaxを有している。また、本発明により開発された過剰発現系を用いることで大量生産が可能であるから、高品質の酵素を安価に生産できる。
　さらに、本発明のEndo-Omのアミノ酸配列をもとに近縁の酵母類のNCBIアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、部分的に相同性の高い遺伝子が数種類検出された。これら酵母類由来遺伝子をクローニングして配列決定し、その発現産物を精製して得た酵素液の酵素活性を詳細に検討した結果、これら遺伝子発現酵素液のうち、Candida属の Candida parapolymorpha DL-1株由来酵素、Pichia属のPichia anomala由来酵素、及びZygosaccharomyces属のZygosaccharomyces rouxii由来酵素が、いずれもEndo-Om と同様の高いエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(ENGase)活性を有する新規酵素であることを見出した。それぞれの酵素を「Endo-Cp」、「Endo-Pa」、及び「Endo-Zr」と命名した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕　下記の(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質；
(1)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、
(3)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(4)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕　前記〔１〕に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕　下記の(1)～(6)のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド；
(1)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(3)配列番号３及び４に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号２と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(4)配列番号７及び８に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号６と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(5)配列番号１１及び１２に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１０と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(6)配列番号１５及び１６に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１４と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔４〕　前記〔２〕又は〔３〕に記載のポリヌクレオチドを含有する、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を発現するためのベクター。
〔５〕　前記〔４〕に記載のベクターが導入されている、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質発現用形質転換細胞。
〔６〕　前記形質転換細胞がOgataea minuta、Candida parapolymorpha、Pichia anomala、及びZygosaccharomyces rouxiiのいずれかの酵母から選択された酵母細胞を宿主とする形質転換細胞である、前記〔５〕に記載の形質転換細胞。
〔７〕　前記〔５〕又は〔６〕に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
〔８〕　前記〔１〕に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴とする、糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を切断する方法。
〔９〕　前記〔１〕に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴とする、アスパラギン結合型糖鎖を任意のアクセプター分子に対して転移する方法。
　本発明におけるエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼEndo-Omは、公知のEndo-Mとは、アミノ酸配列レベルでの同一性は33.9％と低く、高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対する活性が約15％である点で基質特異性も異なる上に、Endo-Mの13倍という高い比活性およびEndo-Mの55倍という高いVmaxを有している点で、明らかに新規酵素であるが、Endo-Mの特性である、複合型糖鎖を加水分解でき、かつ複合型糖鎖に対するトランスグリコシダーゼ活性も有する、という優れた機能はそのまま保持し、その非活性および最大反応速度が顕著に高いという特性も兼ね備えていることから、特に、糖タンパク質における複合型糖鎖も含めた糖鎖構造の解析及び糖鎖修飾などの有用性に大きな期待が持てる。さらに、本発明により開発された過剰発現系を用いることで、この高品質のEndo-Om酵素を大量生産により安価に供給できる。
　本発明の他のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼであるEndo-Cp、Endo-Pa及びEndo-Zrも同様の複合型糖鎖切断活性及び複合型糖鎖転移活性を有しており、Endo-Omと同様の用途が期待される。
図１はEndo-Om遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。 図２はEndo-Omと酵母に近い生物種由来のENGaseとの系統樹である。図中、括弧内の数値はアミノ酸配列の長さとEndo-Omとの相同性を示す。Accession No.，Ashbya gossypii，NP_986144; Mucor hiemalis (Endo-M)，BAB43869；Candidaparapolymorpha DL-1 (Hansenula polymorpha DL-1)，EFW94296；Pichia anomala，CAC69142；Zygosaccharomycesrouxii，×P_002495262. 図３はEndo-Om過剰発現O.minuta株におけるタンパク質の発現と酵素活性の測定結果を示す。　Ａ．ウェスタンブロッティングによるEndo-Om過剰発現の確認　Ｂ．HPLCによる酵素反応検出結果　Ｃ．Endo-Om過剰発現株の比活性 図４は組換え型Endo-Omの精製サンプルのSDS-PAGE結果である。 図５はEndo-Omと市販のEndo-MのKmとVma×の測定結果を示す。 図６はEndo-Omの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。　Ａ．至適pH　Ｂ．至適温度 図７はEndo-Omのトランスグリコシダーゼ活性の有無の検出結果を示す。　Ａ．Endo-Omの糖転移反応図　Ｂ．HPLCによる糖転移活性の検出　Ｃ．糖転移反応物のＭＳパターン 図８はEndo-Cp遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。 図９はEndo-Cp部分精製酵素液のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング、酵素活性測定の結果を示す。　Ａ．SDS-PAGE　Ｂ．ウェスタンブロッティング　Ｃ．HPLCによる酵素活性の検出 図１０はEndo-Cpの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。　Ａ．至適pH　Ｂ．至適温度 図１１はEndo-Cpのトランスグリコシダーゼ活性の有無の検出結果を示す。　Ａ．Endo-Omの糖転移反応図　Ｂ．HPLCによる糖転移活性の検出　Ｃ．糖転移反応物のＭＳパターン 図１２はEndo-Pa遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。 図１３はEndo-Pa部分精製酵素液のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング、酵素活性測定の結果を示す。　Ａ．SDS-PAGE　Ｂ．ウェスタンブロッティング　Ｃ．HPLCによる酵素活性の検出 図１４はEndo-Paの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。　Ａ．至適pH　Ｂ．至適温度 図１５はEndo-Paのトランスグリコシダーゼ活性の有無の検出結果を示す。　Ａ．Endo-Paの糖転移反応図　Ｂ．HPLCによる糖転移活性の検出　Ｃ．糖転移反応物のＭＳパターン 図１６はEndo-Zr遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示す。図中、下線部はGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列。■は推定の活性中心アミノ酸残基。 図１７はEndo-Zr部分精製酵素液のSDS-PAGEとウェスタンブロッティング、酵素活性測定の結果を示す。　Ａ．SDS-PAGE　Ｂ．ウェスタンブロッティング　Ｃ．HPLCによる酵素活性の検出 図１８はEndo-Zrの至適反応条件(pH、温度)の測定結果を示す。　Ａ．至適pH　Ｂ．至適温度
１．本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼについて
１－１．「Endo-Om」について
(１)酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；　アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
　1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
　2)高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約103％、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対する活性が約15％。
(3)至適pH；　約5.5
(4)至適温度；　45～50℃
(5)遺伝子；　2,319bp(Endo-Mとアミノ酸配列で33.9％の相同性)
(6)分子量；　87,398 Da(アミノ酸配列より)
(7)1mM 複合型２分岐糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)を基質とした際の比活性；0.80μmol/min/mg
(Endo-Mの比活性(0.06μmol/min/mg)の約13倍)
(8) 複合型２分岐糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)に対するKm；5539μM，Vmax3.88μmol/min/mg
(Endo-MのKm(176μM)の31倍、Endo-MのVmax(0.070μmol/min/mg)の55倍)
(9)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型(NGA2-Asn-Fmoc)を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
(２)アミノ酸配列及び塩基配列
　本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)は、以下の(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、特に、Ogataea属酵母由来のタンパク質であることが好ましい。
(1)配列番号１に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、(なお、数個とは１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個を表す。)
(3)配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。)
(4)配列番号２に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号２に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
　ここで、ストリンジェントな条件とは、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作で、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件である。例えば、6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s,0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNA中で、50℃で4時間～一晩保温を行う条件が挙げられる。よりストリンジェンシーを高めたい場合は、さらに2×SSC、0.5％SDS、25％ホルムアミド、5×デンハルツ及び100μg/mlサケ精子DNA中で、55℃で4時間～一晩保温を行う条件を適用することができる。一般には、全塩基配列中の15％未満、好ましくは10％未満のミスマッチを許容する条件であるということができる。
　さらに、本発明のEndo-Om活性を有するタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Ogataea属酵母由来遺伝子であることが好ましい。
　または、配列番号２に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
　また、本発明のEndo-Om遺伝子は、上記(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)～(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Ogataea属酵母由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号２に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号２に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号３及び４に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号２と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。)
　ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)は、公知のMucor属由来Endo-Mとは、アミノ酸配列レベルで33.9％の同一性しかなく、データベース内での最も近い位置のCandida属由来の機能不明タンパク質ともアミノ酸レベルで53.9％程度の同一性しかない、特異的な配列を有しているから、配列番号１に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Om活性を有している蓋然性が高く、配列番号２に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Om遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)各種糖鎖に対する加水分解活性
　本発明のEndo-Om精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖(TaKaRa-Bio社)に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文(非特許文献６)の測定値と共に下記(表１)に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　上記(表１)の結果から見て、Endo-OmはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できない。また、いくつかの糖鎖に対する反応性がEndo-Mとは異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B、M9A構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
(４)トランスグリコシダーゼ活性
　Endo-OmはEndo-Mと同様に、任意のアクセプター分子に対して糖鎖を転移する活性を有している。典型的なアクセプター分子は、グルコースまたはGlcNAcなどの単糖又はその誘導体であるが、それらを有する糖ペプチドや糖タンパク質に対しても転移させることができる。転移させることができる糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖であり、化学合成された糖鎖でも切断された糖鎖でもよい。
　Endo-Omのトランスグリコシダーゼ活性を、基質の２分岐複合糖鎖、アクセプター分子(p-ニトロフェニルグルコース)およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液を30℃で3時間インキュベートし、反応終了後にHPLCに供することにより検出したところ、加水分解物とは異なる新たなピークが検出され、MS解析によりアクセプター分子に２分岐複合糖鎖が付加された糖転移反応物であることが確認された(図７)。
１－２．「Endo-Cp」について
(１)酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；　アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
　1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
　2)高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約172％、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対する活性が約7.0％。
(3)至適pH；　約5.5
(4)至適温度；　60℃
(5)遺伝子；　2,238bp(Endo-Mとアミノ酸配列で38.2％の相同性)
(6)分子量；　86,500Da(アミノ酸配列より)
(7)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型(NGA2-Asn-Fmoc)を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
(２)アミノ酸配列及び塩基配列
　本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Cp)は、以下の(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、より好ましくはCandida属酵母由来、最も好ましくはCandida parapolymorpha由来のタンパク質である。
(1)配列番号５に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号５に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、(なお、数個とは１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個を表す。)
(3)配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。)
(4)配列番号６に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号６に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。(なお、ストリンジェントな条件については、上述の通り。)
　さらに、本発明のEndo-Cp活性を有するタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Candida属酵母由来遺伝子、とりわけCandida parapolymorpha由来であることが好ましい。
　または、配列番号６に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
　また、本発明のEndo-Cp遺伝子は、上記(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)～(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Candida属酵母由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号６に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号７及び８に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号６と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。)
　ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Cp)は、本発明のOgataea minuta由来「Endo-Om」とは、アミノ酸配列レベルで53.9％の同一性があり、同時に見出されたPichia anomala由来の「Endo-Pa」酵素、及びZygosaccharomyces rouxii由来「Endo-Zr」酵素とは、それぞれ42.8％及び31.9％の同一性を有している。また、公知のMucor属由来「Endo-M」とは、アミノ酸配列レベルで38.2％の同一性しかない。このように、本発明の「Endo-Cp」は特異的な配列を有しているから、配列番号５に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Cp活性を有している蓋然性が高く、配列番号６に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Cp遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)各種糖鎖に対する加水分解活性
　本発明のEndo-Cp部分精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖(TaKaRa-Bio社)に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文(非特許文献６)の測定値と共に下記(表２)に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　上記(表２)の結果から見て、Endo-CpはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できない。また、いくつかの糖鎖に対する反応性がEndo-Mとは異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
(４)トランスグリコシダーゼ活性
　Endo-CpはEndo-Mと同様に、任意のアクセプター分子に対して糖鎖を転移する活性を有している。典型的なアクセプター分子は、グルコースまたはGlcNAcなどの単糖又はその誘導体であるが、それらを有する糖ペプチドや糖タンパク質に対しても転移させることができる。転移させることができる糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖であり、化学合成された糖鎖でも切断された糖鎖でもよい。
　Endo-Cpのトランスグリコシダーゼ活性を、基質の２分岐複合糖鎖、アクセプター分子(p-ニトロフェニルグルコース)およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液を30℃で3時間インキュベートし、反応終了後にHPLCに供することにより検出したところ、加水分解物とは異なる新たなピークが検出され、MS解析によりアクセプター分子に２分岐複合糖鎖が付加された糖転移反応物であることが確認された(図１１)。
１－３．「Endo-Pa」について
(１)酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；　アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
　1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
　2)高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約140％、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対する活性が約54.4％。
(3)至適pH；　約5.0～5.5
(4)至適温度；　40℃
(5)遺伝子；　1,971bp(Endo-Mとアミノ酸配列で33.0％の相同性)
(6)分子量；　76,050Da(アミノ酸配列より)
(7)トランスグリコシダーゼ活性；二分岐複合型(NGA2-Asn-Fmoc)を糖供与体、アクセプターをp-ニトロフェニルグルコースとした際に、有意なトランスグリコシダーゼ活性が確認された。
(２)アミノ酸配列及び塩基配列
　本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Pa)は、以下の(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、特にPichia属酵母由来、とりわけPichia anomala由来のタンパク質であることが好ましい。
(1)配列番号９に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号９に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、(なお、数個とは１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個を表す。)
(3)配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。)
(4)配列番号１０に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号１０に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。(なお、ストリンジェントな条件については、上述の通り。)
　さらに、本発明のEndo-Pa活性を有するタンパク質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Pichia属酵母由来遺伝子、とりわけPichia anomala由来遺伝子であることが好ましい。
　または、配列番号１０に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
　また、本発明のEndo-Pa遺伝子は、上記(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)～(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Pichia属酵母由来、とりわけPichia anomala由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号１０に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号１０に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号１１及び１２に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１０と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。)
　ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Pa)は、本発明のOgataea minuta由来「Endo-Om」とは、アミノ酸配列レベルで42.5％の同一性があり、同時に見出されたCandida parapolymorpha DL-1由来の「Endo-Cp」酵素、及びZygosaccharomyces rouxii由来「Endo-Zr」酵素とは、それぞれ42.8％及び30.2％の同一性を有している。また、公知のMucor属由来「Endo-M」とは、アミノ酸配列レベルで33.0％の同一性しかない。このように、本発明の「Endo-Pa」は特異的な配列を有しているから、配列番号９に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Pa活性を有している蓋然性が高く、配列番号１０に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Pa遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)各種糖鎖に対する加水分解活性
　本発明のEndo-Pa部分精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖(TaKaRa-Bio社)に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文(非特許文献６)の測定値と共に下記(表３)に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　上記(表３)の結果から見て、Endo-PaはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できない。また、ほとんどの糖鎖でEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
(４)トランスグリコシダーゼ活性
　Endo-PaはEndo-Mと同様に、任意のアクセプター分子に対して糖鎖を転移する活性を有している。典型的なアクセプター分子は、グルコースまたはGlcNAcなどの単糖又はその誘導体であるが、それらを有する糖ペプチドや糖タンパク質に対しても転移させることができる。転移させることができる糖鎖は、アスパラギン結合型糖鎖であり、化学合成された糖鎖でも切断された糖鎖でもよい。
　Endo-Paのトランスグリコシダーゼ活性を、基質の２分岐複合糖鎖、アクセプター分子(p-ニトロフェニルグルコース)およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液を30℃で16時間インキュベートし、反応終了後にHPLCに供することにより検出したところ、加水分解物とは異なる新たなピークが検出され、MS解析によりアクセプター分子に２分岐複合糖鎖が付加された糖転移反応物であることが確認された(図１５)。
１－４．「Endo-Zr」について
(１)酵素学的及び理化学的性質；
(1)作用；　アスパラギン結合型糖タンパク質にエンド型に作用し、糖鎖を遊離する。
(2)基質特異性； 
　1)高マンノース型、混成型、２分岐複合型糖鎖のコア構造に存在するN,N'-ジアセチルキトビオース間を切断してオリゴ糖を生成する。
　2)高マンノース型M8A-PA糖鎖に対する活性を100％としたとき、高マンノース型M6B-PA糖鎖に対する活性が約127％、複合型２分岐糖鎖(agalacto biantennary PA-sugar)に対する活性が約23.6％。
(3)至適pH；　約4.5～5.0
(4)至適温度；　40℃
(5)遺伝子；　1920bp(Endo-Mとアミノ酸配列で29.4％の相同性)
(6)分子量；　73,105Da(アミノ酸配列より)
(7)トランスグリコシダーゼ活性；検出されなかった。 
(２)アミノ酸配列及び塩基配列
　本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Zr)は、以下の(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質、として表すことができる。好ましくは、酵母由来、特に、Zygosaccharomyces属酵母由来、とりわけZygosaccharomyces
rouxii由来のタンパク質であることが好ましい。
(1)配列番号１３に示されるアミノ酸配列、
(2)配列番号１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、(なお、数個とは１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個を表す。)
(3)配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有するアミノ酸配列である。)
(4)配列番号１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
(5)配列番号１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。(なお、ストリンジェントな条件については、上述の通り。)
　さらに、本発明のEndo-Zr活性を有するタンパク質は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列をもとに、NCBIのGenBankアミノ酸配列データベースに対するBLAST検索により30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来のアミノ酸配列からなり、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質である。特に、Zygosaccharomyces属酵母由来遺伝子であることが好ましい。
　または、配列番号１４に示される塩基配列をもとに、NCBIのGenBank塩基配列データベースに対するBLAST検索により、30％以上、好ましくは40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上のホモロジーで検出される酵母由来の塩基配列からなる遺伝子によりコードされ、かつエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質であると表現することができる。
　また、本発明のEndo-Zr遺伝子は、上記(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、と表現することができるが、以下の(1)～(3)のいずれかのポリヌクレオチドとしても、表すことができる。なお、好ましくは、酵母由来、特に、Zygosaccharomyces属酵母由来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
(1)配列番号１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(2)配列番号１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号１５及び１６に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１４と７0％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。(なお、好ましくは、80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％上の同一性を有する塩基配列である。)
　ここで、図２に示されるように、本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Zr)は、本発明のOgataea minuta由来「Endo-Om」とは、アミノ酸配列レベルで30.6％の同一性があり、同時に見出されたCandida parapolymorpha DL-1由来の「Endo-Cp」酵素、及びPichia anomala由来の「Endo-Pa」酵素とは、それぞれ31.9％及び30.2％の同一性を有している。また、公知のMucor属由来「Endo-M」とは、アミノ酸配列レベルで29.4％の同一性しかない。このように、本発明の「Endo-Zr」は特異的な配列を有しているから、配列番号１３に示されるアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであれば、きわめてEndo-Zr活性を有している蓋然性が高く、配列番号１４に示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドもまたEndo-Zr遺伝子である蓋然性が高いといえる。ポリペプチドやポリヌクレオチドのホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)各種糖鎖に対する加水分解活性
　本発明のEndo-Zr部分精製酵素液を用いて、各種のPAラベル化された市販の複合糖鎖(TaKaRa-Bio社)に対する加水分解活性を測定した測定結果を、Endo-Mに関する論文(非特許文献６)の測定値と共に下記(表４)に示した。その際の加水分解活性は、HPLCにおける基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　上記(表４)の結果から見て、Endo-ZrはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解する。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖、bisecting GlcNAcを有する混成型糖鎖は分解できない。また、いくつかの糖鎖に対する反応性がEndo-Mとは異なっており、特に２分岐の複合型糖鎖やM3B、M5A、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示す。
２．本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの取得方法及び製造方法
２－１．Endo-Omの取得方法及び製造方法
(１)本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)産生菌株
　本発明のEndo-Om産生微生物は、本発明者らの先の出願明細書特許文献６に記載されたメタノール資化性酵母Ogataea minuta IFO10746株であり、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母株である。培養方法などの詳細は、特許文献６に記載されるとおりであり、通常の酵母用の培地にメタノールを加えて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Om遺伝子をクローニングし、もとの酵母株を宿主として形質転換を行い、下記(３)に述べるように、Endo-Om遺伝子過剰発現系を作製した。
(２)他の微生物からのEndo-Om及びその遺伝子の採取方法
　Ogataea minuta IFO10746株を用いた宿主・ベクター系については、特許4464269号(特許文献７)に記載されている。このゲノム配列情報に対し、Endo-Mと相同性の高い遺伝子を検索したところ、部分的に相同性の高い遺伝子を見いだした。そこでO.minutaのゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー１(配列番号３)とプライマー２(配列番号４)を用いてPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー１：
5’-CGATGACAAGGGATCATGGCGCAATCTCAGCTACTGG-3’　(配列番号３)
プライマー２：
5’-GCACCGTCTCGGATCTCACACCCAAACCTCACTCC-3‘　　(配列番号４)
得られたPCR断片をTOPO Blunt cloning kit(Invitrogen社)によりサブクローニングし、塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-O遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１に示した。Endo-OmのORFは2319塩基からなり、772アミノ酸からなる分子量87,398のタンパク質をコードしていた。
　当該方法を本発明のEndo-Om 遺伝子を採取したOgataea minutaの近縁微生物、例えば他のメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Om活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
　すなわち、このようにして得られたEndo-Om遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Om活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
　また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Om遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Om遺伝子は、配列番号２に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Om活性を有するタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)過剰発現系の構築とEndo-Omの大量生産方法
　メタノール資化性酵母O.minutaでのEndo-Om過剰発現株の作製は以下のように行った。
まずPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列(2349 bp)を増幅し、精製後、発現用プラスミド pOMEA1にIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pOMEA1-Endo-Omを構築する。
　構築したpOMEA1-Endo-Omを、O.minuta TK10-1-2株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法を用いて形質転換し、Endo-Om過剰発現O.minuta株(Endo-Om/TK10-1-2株)を得る。
　Endo-Om/TK10-1-2株に対してEndo-Omの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Om粗酵素液とする。
　Endo-Om粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
　上記のようなEndo-Om過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Om遺伝子を採取したと同じメチル資化性酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
　これら形質転換Ogataea minuta Endo-Om過剰発現株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で、又はメタノール誘導を用いた培養法などを適用することにより、大量生産が可能となる。
２－２．Endo-Cpの取得方法及び製造方法
(１)本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Cp)産生菌株
　本発明のEndo-Cp産生微生物は、メタノール資化性酵母Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株であり、メタノールを唯一の炭素源として生育できる酵母株である。培養方法は通常の酵母用の培地にメタノールを加えて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Cp遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主として形質転換を行い、下記(３)に述べるように、Endo-Cp遺伝子過剰発現系を作製した。
(２)他の微生物からのEndo-Cp及びその遺伝子の採取方法
　Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー３(配列番号７)とプライマー４(配列番号８)を用いてPCR法によりEndo-Cp遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー３：
5’-TCGAAGGTAGGCATATGCCTCGAAACACAGCTAA-3’ 　　　(配列番号７)
プライマー４：
5’-GCTTGAATTCGGATCCTCAAATGTGCATATCGGTACCCT-3’　(配列番号８)
得られたPCR産物を、大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pCold I-Endo-Cpを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Cp遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-Cp遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図８に示した。Endo-CpのORFは2238塩基からなり、745アミノ酸からなる分子量86,500のタンパク質をコードしていた。
　当該方法を本発明のEndo-Cp遺伝子を採取したCandida parapolymorpha DL-1の近縁微生物、例えば他のメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Cp活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
　すなわち、このようにして得られたEndo-Cp遺伝子は、配列番号６に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Cp活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
　また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Cp遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Cp遺伝子は、配列番号６に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Cp活性を有するタンパク質は、配列番号５に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)過剰発現系の構築とEndo-Cpの大量生産方法
　大腸菌でのEndo-Cp過剰発現株の作製は以下のように行った。
上記(２)で述べたpCold I-Endo-Cpをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル(NEB Express Competent E. coli (High Efficiency)，NEW ENGRAND BioLabs社)に形質転換し、Endo-Cp発現大腸菌株を得る。
　Endo-Cp発現大腸菌株に対してEndo-Cpの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Cp粗酵素液とする。
　Endo-Cp粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
　上記のようなEndo-Cp過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Cp遺伝子を採取したと同じCandida属酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
　これらEndo-Cp過剰発現大腸菌株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で大量生産が可能となる。
２－３．Endo-Paの取得方法及び製造方法
(１)本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Pa)産生菌株
　本発明のEndo-Pa産生微生物は、Pichia anomala ATCC36904株という酵母株である。培養方法は通常の酵母用の培地を用いて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Pa遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主として形質転換を行い、下記(３)に述べるように、Endo-Pa遺伝子過剰発現系を作製した。
(２)他の微生物からのEndo-Pa及びその遺伝子の採取方法
　Pichia anomala ATCC36904株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー５(配列番号１１)とプライマー６(配列番号１２)を用いてPCR法によりEndo-Pa遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー５：
5’-TCGAAGGTAGGCATATGCAACATGATCATGCTGCCATA-3’　(配列番号１１)
プライマー６：
5’-GCTTGAATTCGGATCCCTATATAAATATATCCTCGCCTTTG-3’(配列番号１２)
得られたPCR産物を、大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pCold I-Endo-Paを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Pa遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-Pa遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１２に示した。Endo-PaのORFは1971塩基からなり、656アミノ酸からなる分子量76,050のタンパク質をコードしていた。
　当該方法を本発明のEndo-Pa遺伝子を採取したPichia anomalaの近縁微生物、例えばメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Pa活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
　すなわち、このようにして得られたEndo-Pa遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Pa活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
　また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Pa遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Pa遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Pa活性を有するタンパク質は、配列番号９に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)過剰発現系の構築とEndo-Paの大量生産方法
　大腸菌でのEndo-Pa過剰発現株の作製は以下のように行った。
上記(２)で述べたpCold I-Endo-Paをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル(NEB Express Competent E. coli(High Efficiency)，NEW ENGRAND BioLabs社)に形質転換し、Endo-Pa発現大腸菌株を得る。
　Endo-Pa発現大腸菌株に対してEndo-Paの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Pa粗酵素液とする。
　Endo-Pa粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
　上記のようなEndo-Pa過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Pa遺伝子を採取したと同じPichia属酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
　これらEndo-Pa過剰発現大腸菌株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で大量生産が可能となる。
２－４．Endo-Zrの取得方法及び製造方法
(１)本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Zr)産生菌株
　本発明のEndo-Zr産生微生物は、Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623株という酵母株である。培養方法は通常の酵母用の培地を用いて、通常の酵母の培養条件下で行う。培養後の菌体を回収して破砕し、不純物を除いた上清を粗酵素液として採取することもできるが、産生量が少ないため、Endo-Zr遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主として形質転換を行い、下記(３)に述べるように、Endo-Zr遺伝子過剰発現系を作製した。
(２)他の微生物からのEndo-Zr及びその遺伝子の採取方法
　Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー７(配列番号１５)とプライマー８(配列番号１６)を用いてPCR法によりEndo-Zr遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー７：
5’-TCGAAGGTAGGCATATGAAACGTATTAATCAGGT-3’(配列番号１５)
プライマー８：
5’-GCTTGAATTCGGATCCTTACTTCTTGACTACGAATTTCAAAG-3’(配列番号１６)
得られたPCR産物を、大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA (TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて組み込み、pCold I-Endo-Zrを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Zr遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-Zr遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１６に示した。Endo-ZrのORFは1920塩基からなり、639アミノ酸からなる分子量73,105のタンパク質をコードしていた。
　当該方法を本発明のEndo-Zr遺伝子を採取したZygosaccharomyces rouxiiの近縁微生物、例えばメチル資化性酵母であるPichia属酵母などの酵母、又は細菌など微生物由来のDNAライブラリーに対して適用することで、Endo-Zr活性を有する酵素遺伝子を採取することができる。
　すなわち、このようにして得られたEndo-Zr遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつEndo-Zr活性を有するタンパク質をコードする遺伝子として表現できる。
　また、公知のデータベースを検索することでも本発明のEndo-Zr遺伝子を採取することができ、得られたEndo-Zr遺伝子は、配列番号１４に示す塩基配列に対して70％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有する塩基配列を有しており、対応するEndo-Zr活性を有するタンパク質は、配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相同性(同一性)を有するアミノ酸配列からなると表現できる。ポリヌクレオチド及びタンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク(DNA Databank of JAPAN(DDBJ))等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
(３)過剰発現系の構築とEndo-Zrの大量生産方法
　大腸菌でのEndo-Zr過剰発現株の作製は以下のように行った。
上記(２)で述べたpCold I-Endo-Zrをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル(NEB Express Competent E. coli (High Efficiency)，NEW ENGRAND BioLabs社)に形質転換し、Endo-Zr発現大腸菌株を得る。
　Endo-Zr発現大腸菌株に対してEndo-Zrの発現誘導を行い、回収した菌体に抽出バッファーとガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕し、遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Zr粗酵素液とする。
　Endo-Zr粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行い、タンパク質の発現を確認する。
　上記のようなEndo-Zr過剰発現株を得るために、宿主としては本発明のEndo-Zr遺伝子を採取したと同じZygosaccharomyces属酵母又は類似の酵母を用いることが好ましいが、大腸菌などの細菌類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞を用いた場合でもベクターとして高発現プロモーターを組み込んだベクターを用いれば同様の過剰発現株が構築できる。またトランスジェニック動物などを用いての生産も可能である。
　これらEndo-Zr過剰発現大腸菌株などの形質転換細胞株を用いて、通常の形質転換細胞培養条件で大量生産が可能となる。
３．本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼの用途
　本発明のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-Om)は、高い比活性で複合型糖鎖を切断する活性と共に、グルコースやN-アセチルグルコサミンなどの単糖又はその誘導体、あるいはそれらを有する糖ペプチドや糖タンパク質などの任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖や化学合成した糖鎖を転移する活性を有している。
　したがって、本発明のEndo-Omを用いることで、糖タンパク質における複合型糖鎖も含めた糖鎖構造の解析が行える。また、天然には糖鎖が付加しないタンパク質に糖鎖を付加する、あるいは従来付加しない位置にN-型糖鎖を導入するといったネオグライコプロテイン(Neoglycoprotein)の調製や、不均一な糖鎖を一旦切断し、トランスグリコシダーゼ反応を用いて糖タンパク質のN-型糖鎖部分を均一化する、また糖鎖分析装置に対する標準糖タンパク質の作製等、様々な糖鎖修飾に用いることもできる。
　本発明の他のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼであるEndo-Cp、Endo-Pa及びEndo-Zrも同様の複合型糖鎖切断活性及び任意のアクセプター分子に対する複合型糖鎖転移活性を有することから、同様の用途が期待される。
　以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。また、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
(実施例１)O.minuta由来ENGase(Endo-Om)の発見
　本発明者らの先の出願明細書(特許文献６)に記載の通り、O.minutaによるヒト糖転移酵素の分泌生産を行なった。分泌されたMGAT5を部分精製し、複合型２分岐糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)を受容体基質、UDP-GlcNAcを供与体基質として反応を行なった。生成産物の解析を行なったところ、糖転移反応による産物以外に、副産物として別のピークが確認された。受容体基質のNGA2-Asn-Fmocをエキソ型のグリコシダーゼで順次消化して標準サンプルを作製し、このピークについて解析を行なったところ、受容体基質の還元末端側に存在するGlcNAcβ1-4GlcNAcの間が切断されていることが示唆された。複合型２分岐糖鎖を効率よく切断する活性はEndo-Mが知られていることから、O.minutaにも同様の活性があると考えられたため、遺伝子のクローニングを検討した。
(実施例２)O.minuta由来ENGase (Endo-Om)遺伝子のクローニング
　Ogataea minuta IFO10746株を用いた宿主・ベクター系については、特許4464269号(特許文献７)に記載されている。このゲノム配列情報に対し、Endo-Mと相同性の高い遺伝子を検索したところ、部分的に相同性の高い遺伝子を見いだした。そこでO.minutaのゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー１(配列番号３)とプライマー２(配列番号４)を用いてPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー１：
5’-CGATGACAAGGGATCATGGCGCAATCTCAGCTACTGG-3’　　(配列番号３)
プライマー２：
5’-GCACCGTCTCGGATCTCACACCCAAACCTCACTCC-3’　　　(配列番号４)
得られたPCR断片をTOPO Blunt cloning kit(Invitrogen社)によりサブクローニングし、塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-O遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１に示した。Endo-OmのORFは2319塩基からなり、772アミノ酸からなる分子量87,398のタンパク質をコードしていた。推定等電点は5.59であった。得られたアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、Endo-OmはN末端側約80～410アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。BLAST検索によりヒットした上位の配列のうち、酵母に近い種について系統樹を作製した結果を図２に示した。Endo-M以外の配列については、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。Endo-Omはメタノール資化性酵母Candida parapolymorpha DL-1(Hansenula polymorpha DL-1)由来の推定のENGase(下記実施例６、Endo-Cp)との相同性が最も高く、53.9％であった。Mucor
hiemalis由来のEndo-Mとの相同性は33.9％であり、N末端側の保存配列以外には全く相同性がなかった。一方、同じメタノール資化性酵母であるPichia pastorisやCandida boidiniiでは該当する遺伝子は検出されなかった。さらにSaccharomyces cerevisiaeでも該当する遺伝子は検出されなかった。
(実施例３)Endo-Om過剰発現O.minuta株の作製
　メタノール資化性酵母O.minutaでのEndo-Om過剰発現株の作製は以下のように行った。
　まず実施例２の通り、上記プライマー１(配列番号３)とプライマー２(配列番号４)を用いてPCR法によりEndo-Om遺伝子のORF全長配列を増幅した。
　増幅した2349 bpのPCR産物を精製した後、BamHIで切断した発現用プラスミド pOMEA1にIn-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pOMEA1-Endo-Omを構築した。
　構築したpOMEA1-Endo-OmをNotIで切断後、O.minuta TK10-1-2株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法を用いて形質転換した。形質転換後の菌液をSD-Ade寒天培地(2％ D-グルコース、0.67％ Yeast Nitrogen Base w/o amino acids(Difco社)、0.5％ Casamino acid、0.1mg/ml Uracil、1.5％ Agar)に塗布し、30℃で2日間培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にて染色体上への組み込みを確認し、Endo-Om過剰発現O.minuta株(Endo-Om/TK10-1-2株)とした。
(実施例４)Endo-Om過剰発現O.minuta株におけるEndo-Omの発現と酵素活性の確認
　Endo-Om/TK10-1-2株を3mlのYPD培地(2％ Peptone、1％ Yeast Extract、2％ グルコース)にまき、30℃で2日間培養を行った。遠心分離により培地上清を除いた後、菌体に3mlのBMMY培地(2％ Peptone、1％ Yeast Extract、1.34％ Yeast Nitrogen Base w/o amino acids、2％ Casamino acid、1％ MeOH、0.2mg/ml Adenine1/2硫酸塩、0.1mg/ml Uracil、100mM リン酸カリウムバッファー(pH6.0))を加えて再懸濁し、20℃でさらに2日間培養することでEndo-Omの発現誘導を行った。回収した菌体に抽出バッファー(50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール)とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより細胞を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Om粗酵素液とした。
　ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Om粗酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗FLAG抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム(GE Healthcare社)および化学発光検出器(GE Healthcare社)を用いて行った。
　ウェスタンブロッティングの結果を図３のＡに示した。Endo-Om過剰発現株ではEndo-Omの分子量である87kDaに相当する位置にFLAG-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された。
　酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した２分岐複合型糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)、およびEndo-Om粗酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を50℃で１時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E(4.6×250 mm、Shodex社)を使用し、溶媒はアセトニトリル(溶媒A)と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器(励起波長265nm、蛍光波長315nm)にて検出を行った。Endo-Omの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
　HPLCによる酵素反応の検出結果を図３のＢに示した。まず基質の２分岐複合糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)を単独でHPLCに供したところ、11.7minの位置にピークが検出された。続いて形質転換前のO.minuta株とEndo-Om過剰発現株の粗酵素液でそれぞれ50μg protein/reactionの割合で反応を行い、活性を比較した。Endo-Om過剰発現株では形質転換前の株に比べて基質のピークが大幅に減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク(6.8min)が増大していた。この結果からEndo-OmがO.minutaの持つ２分岐複合型糖鎖を加水分解する酵素の正体であることが確認された。
　続いてEndo-Om過剰発現株の比活性を比較した結果を図３のＣに示した。形質転換前のTK10-1-2株では、10μM NGA2-Asn-Fmocを基質とした際に比活性が15.0[μUnit/mg protein]であったのに対し、Endo-Om過剰発現株では295～339[μUnit/mg protein](形質転換前の20～24倍)に増大していた。
(実施例５)Endo-Omの諸性質の検討
(５－１)Endo-Om精製酵素液の調製と比活性およびKm、Vmaxの算出
　Endo-Omの諸性質の検討は精製酵素液を用いて行った。実施例４に記載した方法により100ml分の菌液から調製したEndo-Om粗酵素液を透析により平衡化バッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール)に置換した。透析後のEndo-Om粗酵素液をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Omを含む画分をAmicon Ultra(50,000 NMWL，Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Om精製酵素液とした。実施例４に記した方法により基質濃度を1mMとしたときのEndo-Om精製酵素液の活性を測定し、比活性を算出した。また、種々の濃度のNGA2-Asn-Fmocを基質として活性測定を行い、KmとVmaxを算出した。比較のために同様の方法により市販のEndo-Mの比活性およびKm、Vmaxを算出した。なおEndo-Mの至適pHは6.0(非特許文献６)であるため、Endo-Mの活性測定の際は酢酸ナトリウムバッファーのpHを6.0とした。
　Endo-Omの精製結果を図４に示した。Endo-OmはSDS-PAGE上で単一にまで精製された。精製したEndo-Omの比活性は1mMのNGA2-Asn-Fmocを基質としたときに0.80μmol/min/mgであった。同測定条件における市販のEndo-Mの比活性は0.06μmol/min/mgであり、Endo-Mに比べてEndo-Omは約13倍の比活性を有していることが明らかとなった。また、種々の濃度のNGA2-Asn-Fmocを基質として活性測定を行い、KmとVmaxを算出した結果、Endo-OmのKmは5539μM、Vmaxは3.88μmol/min/mgであり、市販のEndo-MのKm(176μM)の31倍、市販のEndo-MのVmax(0.070μmol/min/mg)の55倍であることが明らかとなった(図５)。
(５－２)Endo-Omの至適反応条件の検討
　Endo-Omの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を50℃で１時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.5-5.5)、酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5-6.0)、リン酸ナトリウムバッファー(pH6.0-7.5)、MOPS-NaOHバッファー(pH6.5-8.0)、Tris-HClバッファー(pH8.0-9.0)を使用した。実施例４に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例４に記載した活性測定法の反応温度を10℃から60℃まで変えることにより行った。
　Endo-Omの至適反応条件の測定結果を図６に示した。Endo-Omの至適反応pHは5.5付近、至適反応温度は50℃付近であった。
(５－３)各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖(TaKaRa-Bio社)、およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3～12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII(2.0×150mm、ナカライテスク社)を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0：溶媒A)および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール(溶媒B)を用いた。流速0.5 ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器(励起波長 320nm、蛍光波長400nm)にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Omの加水分解活性の測定結果を表１に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ(非特許文献６)を引用した。Endo-OmはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、いくつかの糖鎖ではEndo-Mとは反応性が異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B、M9A構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
(５－４)トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
　ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Omにも同様の糖転移活性(トランスグリコシダーゼ活性)があるか否かを調べた。
　Endo-Omのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子(p-ニトロフェニルグルコース)およびEndo-Om精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例４に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。さらに、糖転移反応物と思われるピークを分取し、凍結乾燥後にMilli-Q水に再溶解してMALDI-QIT-TOFMS (A×IMA-QIT、島津製作所)で質量分析を行うことにより、糖転移反応物の同定を行った。
　Endo-Omの糖転移活性の検出結果を図７に示した。まず、反応系にアクセプターを加えていない条件では糖転移反応が起こらないため、ドナーのNGA2-Asn-Fmoc(10.8min)と加水分解物であるGlcNAc-Asn-Fmoc(6.6min)のピークのみが検出された。続いてアクセプターを加えた条件では、加水分解物のピークの他に糖転移反応物と思われる新たなピーク(4.15min)が検出された。このピークを分取してMS解析を行った結果、予測された糖転移反応物の分子量と一致する分子イオンピークが検出された(m/z=1389[M+Na-O2]+，m/z=1405[M+Na-O]+，m/z=1421[M+Na]+，m/z=1437[M+K]+)。以上の結果から、Endo-Omは任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を有していることが示された。
(実施例６)Candida parapolymorphaDL-1由来ENGase (Endo-Cp)遺伝子のクローニング
　Endo-Omのアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、いくつかの酵母において部分的に相同性の高い遺伝子が検出された(図２)。この中でCandida parapolymorpha DL-1(Hansenula polymorpha DL-1)由来の遺伝子は、アミノ酸配列でEndo-Omと53.9％の相同性であったが、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。そこでEndo-Cp遺伝子のクローニングとタンパク質発現系の構築を検討した。
　Candida parapolymorpha DL-1 ATCC26012株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー３(配列番号７)とプライマー４(配列番号８)を用いてPCR法によりEndo-Cp遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー３：
5’-TCGAAGGTAGGCATATGCCTCGAAACACAGCTAA-3’(配列番号７)
プライマー４：
5’-GCTTGAATTCGGATCCTCAAATGTGCATATCGGTACCCT-3’(配列番号８)
得られたPCR産物を精製した後、Nde IとBamHIで切断した大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA(TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pCold I-Endo-Cpを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Cp遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-Cp遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図８に示した。Endo-CpのORFは2238塩基からなり、745アミノ酸からなる分子量86,500のタンパク質をコードしていた。推定等電点は5.61であった。Endo-CpはN末端側約75～410アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。
(実施例７)Endo-Cp発現大腸菌株の作製
　実施例６のpCold I-Endo-Cpをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル(NEB Express Competent E. coli(High Efficiency)，NEW ENGRAND BioLabs社)に形質転換した。形質転換後の菌液を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(2.5％ LB Broth,Miller(Difco社)、1.5％ Agar)に塗布し、37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にてEndo-Cp遺伝子の増幅を確認し、Endo-Cp発現大腸菌株とした。
(実施例８)Endo-Cpの発現誘導と部分精製酵素液の調製
　Endo-Cp発現大腸菌株を5mlのLB培地にまき、37℃で一晩培養を行った。菌液全量を500mlのLB培地に加え、37℃で約3時間培養することでOD値が0.5程度になるまで菌体を増殖させた。その後、終濃度1.0mMとなるようにIPTGを添加し、15℃に急冷してコールドショックを与えることによりタンパク質の発現誘導を行った。15℃で48時間の培養を行った後、菌体を回収し、抽出バッファー(50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール)とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより菌体を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Cp粗酵素液とした。Endo-Cp粗酵素液は透析により平衡化バッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール)に置換した。透析後のEndo-Cp粗酵素液をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Cpを含む画分をAmicon Ultra(50,000 NMWL，Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20 mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Cp部分精製酵素液とした。
　ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Cp部分精製酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗Tetra-His抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム(GE Healthcare社)および化学発光検出器(GE Healthcare社)を用いて行った。
　酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した2分岐複合型糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)、およびEndo-Cpを含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E(4.6×250mm、Shodex社)を使用し、溶媒はアセトニトリル(溶媒A)と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器(励起波長265nm、蛍光波長315nm)にて検出を行った。Endo-Cpの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
　Endo-Cp部分精製酵素液のSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングおよび活性測定の結果を図９に示した。SDS-PAGEでは複数のバンドが検出されたが、ウェスタンブロッティングではEndo-Cpの分子量である86.5kDaに相当する位置にHis-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された(図９Ａ,Ｂ)。2分岐複合型糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)を基質として活性測定を行ったところ、Endo-Cp部分精製酵素液を加えた反応液では基質のピーク(10.8min)が減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク(6.8min)が出現した(図９C)。この結果からEndo-Cpが既知のEndo-Mと同様に2分岐複合型糖鎖を加水分解するENGaseであることが明らかとなった。また、Endo-Cp部分精製酵素液の比活性は120μUnit/mgであった。
(実施例９)Endo-Cpの諸性質の検討
(９－１)Endo-Cpの至適反応条件の検討
　Endo-Cpの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.5-5.5)、酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5-6.0)、リン酸ナトリウムバッファー(pH6.0-7.5)、MOPS-NaOHバッファー(pH6.5-8.0)、Tris-HClバッファー(pH8.0-9.0)を使用した。実施例８に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例８に記載した活性測定法の反応温度を10℃から70℃まで変えることにより行った。
　Endo-Cpの至適反応条件の測定結果を図１０に示した。Endo-Cpの至適反応pHは5.5付近、至適反応温度は60℃付近であった。
(９－２)各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖(TaKaRa-Bio社)、およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3～12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII(2.0×150mm、ナカライテスク社)を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0：溶媒A)および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール(溶媒B)を用いた。流速0.5 ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器(励起波長 320nm、蛍光波長400nm)にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Cpの加水分解活性の測定結果を表2に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ(非特許文献６)を引用した。Endo-CpはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、いくつかの糖鎖ではEndo-Mとは反応性が異なっており、特にagalacto biantennary、M3B、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
(９－３)トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
　ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Cpにも同様の糖転移活性(トランスグリコシダーゼ活性)があるか否かを調べた。
　Endo-Cpのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子(p-ニトロフェニルグルコース)およびEndo-Cp部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例８に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。また、糖転移反応物と思われるピークを分取し、凍結乾燥後にMilli-Q水に再溶解してMALDI-QIT-TOFMS (A×IMA-QIT、島津製作所)で質量分析を行うことにより、糖転移反応物の同定を行った。
　Endo-Cpの糖転移活性の検出結果を図１１に示した。比較のためにEndo-Omの結果を合わせて表示した。反応系にアクセプターを加えた条件でEndo-Cpを反応させたところ、Endo-Omと同様に加水分解物のピークの他に糖転移反応物のピーク(4.15min)が検出された。このピークを分取し、MS解析を行った結果、予測された糖転移反応物の分子量と一致する分子イオンピークが検出された(m/z=1389[M+Na-O2]+，m/z=1405[M+Na-O]+，m/z=1421[M+Na]+，m/z=1437[M+K]+)。以上の結果から、Endo-Cpは任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を有していることが示唆された。
(実施例１０)Pichia anomala由来ENGase (Endo-Pa)遺伝子のクローニング
　Endo-Omのアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、いくつかの酵母において部分的に相同性の高い遺伝子が検出された(図２)。この中でPichia anomala由来の遺伝子は、アミノ酸配列でEndo-Omと42.5％の相同性であったが、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。そこでEndo-Pa遺伝子のクローニングとタンパク質発現系の構築を検討した。
　Pichia anomala ATCC36904株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー５(配列番号１１)とプライマー６(配列番号１２)を用いてPCR法によりEndo-Pa遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー５：
5’-TCGAAGGTAGGCATATGCAACATGATCATGCTGCCATA-3’(配列番号１１)
プライマー６：
5’-GCTTGAATTCGGATCCCTATATAAATATATCCTCGCCTTTG-3’(配列番号１２)
得られたPCR産物を精製した後、Nde IとBamHIで切断した大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA(TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pCold I-Endo-Paを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Pa遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-Pa遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１２に示した。Endo-PaのORFは1971塩基からなり、656アミノ酸からなる分子量76,050のタンパク質をコードしていた。推定等電点は6.06であった。Endo-PaはN末端側約65～400アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。
(実施例１１)Endo-Pa発現大腸菌株の作製
　実施例１０のpCold I-Endo-Paをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル(NEB Express Competent E. coli(High Efficiency)，NEW ENGRAND BioLabs社)に形質転換した。形質転換後の菌液を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(2.5％ LB Broth，Miller (Difco社)、1.5％ Agar)に塗布し、37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にてEndo-Pa遺伝子の増幅を確認し、Endo-Pa発現大腸菌株とした。
(実施例１２)Endo-Paの発現誘導と部分精製酵素液の調製
　Endo-Pa発現大腸菌株を5mlのLB培地にまき、37℃で一晩培養を行った。菌液全量を500mlのLB培地に加え、37℃で約3時間培養することでOD値が0.5程度になるまで菌体を増殖させた。その後、終濃度1.0mMとなるようにIPTGを添加し、15℃に急冷してコールドショックを与えることによりタンパク質の発現誘導を行った。15℃で48時間の培養を行った後、菌体を回収し、抽出バッファー(50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール)とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより菌体を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Pa粗酵素液とした。Endo-Pa粗酵素液は透析により平衡化バッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール)に置換した。透析後のEndo-Pa粗酵素液をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Paを含む画分をAmicon Ultra(50,000 NMWL，Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Pa部分精製酵素液とした。
　ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Pa部分精製酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗Tetra-His抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム(GE Healthcare社)および化学発光検出器(GE Healthcare社)を用いて行った。
　酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した２分岐複合型糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)、およびEndo-Paを含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E(4.6×250 mm、Shodex社)を使用し、溶媒はアセトニトリル(溶媒A)と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器(励起波長265nm、蛍光波長315nm)にて検出を行った。Endo-Paの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
　Endo-Pa部分精製酵素液のSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングおよび活性測定の結果を図１３に示した。SDS-PAGEでは複数のバンドが検出されたが、ウェスタンブロッティングでは配列から予測される分子量である76kDaよりもやや下の位置にHis-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された(図１３Ａ，Ｂ)。２分岐複合型糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)を基質として活性測定を行ったところ、Endo-Pa部分精製酵素液を加えた反応液では基質のピーク(10.8min)が減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク(6.8min)が出現した(図１３Ｃ)。この結果からEndo-Paが既知のEndo-Mと同様に２分岐複合型糖鎖を加水分解するENGaseであることが明らかとなった。また、Endo-Pa部分精製酵素液の比活性は353μUnit/mgであった。
(実施例１３)Endo-Paの諸性質の検討
(１３－１)Endo-Paの至適反応条件の検討
　Endo-Paの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.5-5.5)、酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5-6.0)、リン酸ナトリウムバッファー(pH6.0-7.5)、MOPS-NaOHバッファー(pH6.5-8.0)、Tris-HClバッファー(pH8.0-9.0)を使用した。実施例12に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例１２に記載した活性測定法の反応温度を10℃から60℃まで変えることにより行った。
　Endo-Paの至適反応条件の測定結果を図１４に示した。Endo-Paの至適反応pHは5.0-5.5付近、至適反応温度は40℃付近であった。
(１３－２)各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖(TaKaRa-Bio社)、およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3～12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII(2.0×150mm、ナカライテスク社)を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0：溶媒A)および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール(溶媒B)を用いた。流速0.5 ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器(励起波長 320nm、蛍光波長400nm)にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Paの加水分解活性の測定結果を表3に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ(非特許文献６)を引用した。Endo-PaはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、ほとんどの糖鎖でEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
(１３－３)トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
　ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Paにも同様の糖転移活性(トランスグリコシダーゼ活性)があるか否かを調べた。
　Endo-Paのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子(p-ニトロフェニルグルコース)およびEndo-Pa部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で16時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例１２に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。また、糖転移反応物と思われるピークを分取し、凍結乾燥後にMilli-Q水に再溶解してMALDI-QIT-TOFMS(A×IMA-QIT、島津製作所)で質量分析を行うことにより、糖転移反応物の同定を行った。
　Endo-Cpの糖転移活性の検出結果を図１５に示した。比較のためにEndo-Omの結果を合わせて表示した。反応系にアクセプターを加えた条件でEndo-Paを反応させたところ、Endo-Omと同様に加水分解物のピークの他に糖転移反応物のピーク(4.15min)が新たに検出された。このピークを分取し、MS解析を行った結果、予測された糖転移反応物の分子量と一致する分子イオンピークが検出された(m/z=1389[M+Na-O2]+，m/z=1405[M+Na-O]+，m/z=1421[M+Na]+，m/z=1437[M+K]+)。以上の結果から、Endo-Paは任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を有していることが示唆された。
(実施例１４)Zygosaccharomyces rouxii由来ENGase (Endo-Zr)遺伝子のクローニング
　Endo-Omのアミノ酸配列を元にNCBIのアミノ酸配列データベースに対してBLAST検索を行った結果、いくつかの酵母において部分的に相同性の高い遺伝子が検出された(図２)。この中でZygosaccharomyces rouxii由来の遺伝子は、アミノ酸配列でEndo-Omと30.6％の相同性であったが、データベース上、ENGaseである旨のアノテーションは記載されていなかった。そこでEndo-Zr遺伝子のクローニングとタンパク質発現系の構築を検討した。
　Zygosaccharomyces rouxii ATCC2623株のゲノムDNAを常法により抽出し、プライマー７(配列番号１５)とプライマー８(配列番号１６)を用いてPCR法によりEndo-Zr遺伝子のORF全長配列を増幅した。
プライマー７：
5’-TCGAAGGTAGGCATATGAAACGTATTAATCAGGT-3’(配列番号１５)
プライマー８：
5’-GCTTGAATTCGGATCCTTACTTCTTGACTACGAATTTCAAAG-3’(配列番号１６)
得られたPCR産物を精製した後、Nde IとBamHIで切断した大腸菌用タンパク質発現プラスミド pCold I DNA(TaKaRa-Bio社)にIn-FusionTM HD Cloning Kit(Clontech社)を用いてPCR産物を組み込み、pCold I-Endo-Zrを構築した。精製したベクターのDNAシーケンスを行い、Endo-Zr遺伝子の全長塩基配列の決定を行なった。
　クローニングの結果得られたEndo-Zr遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を図１６に示した。Endo-ZrのORFは1920塩基からなり、639アミノ酸からなる分子量73,105のタンパク質をコードしていた。推定等電点は6.69であった。Endo-ZrはN末端側約70～400アミノ酸の位置にGH18 Chitinase-like superfamilyに属するGH family 85 ENGaseに高度に保存されている配列を有していた。
(実施例１５)Endo-Zr発現大腸菌株の作製
　実施例１４のpCold I-Endo-Zrをタンパク質発現用の大腸菌コンピテントセル(NEB Express Competent E. coli(High Efficiency)，NEW ENGRAND BioLabs社)に形質転換した。形質転換後の菌液を100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地(2.5％ LB Broth,Miller (Difco社)、1.5％ Agar)に塗布し、37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た。コロニーをプレートから掻きとり、PCR反応液に懸濁する簡易PCR法にてEndo-Zr遺伝子の増幅を確認し、Endo-Zr発現大腸菌株とした。
(実施例１６)Endo-Zrの発現誘導と部分精製酵素液の調製
　Endo-Zr発現大腸菌株を5mlのLB培地にまき、37℃で一晩培養を行った。菌液全量を500mlのLB培地に加え、37℃で約3時間培養することでOD値が0.5程度になるまで菌体を増殖させた。その後、終濃度1.0mMとなるようにIPTGを添加し、15℃に急冷してコールドショックを与えることによりタンパク質の発現誘導を行った。15℃で48時間の培養を行った後、菌体を回収し、抽出バッファー(50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、1.25M NaCl、1mM PMSF、1×Complete(Roche社)、5％ グリセロール)とガラスビーズを加え、激しく振とうすることにより菌体を破砕した。遠心分離によって不溶物を除いた上清をEndo-Zr粗酵素液とした。Endo-Zr粗酵素液は透析により平衡化バッファー(20mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaCl、0.5mM PMSF、50mM イミダゾール)に置換した。透析後のEndo-Zr粗酵素液をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)に供し、平衡化バッファーで洗浄した後、50mM、100mM、200mMイミダゾールを含む平衡化バッファーで段階的に溶出することによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Zrを含む画分をAmicon Ultra(50,000 NMWL，Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらに20mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)、0.5M NaClで透析した後、終濃度10％となるようにグリセロールを加えてEndo-Zr部分精製酵素液とした。
　ウェスタンブロッティングは以下のように行った。Endo-Zr部分精製酵素液をSDSサンプルバッファーにて変性後、常法によりウェスタンブロッティングを行った。１次抗体としてマウス抗Tetra-His抗体、２次抗体として抗マウスIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を用い、検出はECL plusシステム(GE Healthcare社)および化学発光検出器(GE Healthcare社)を用いて行った。
　酵素活性測定は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、10μMのFmocラベル化した２分岐複合型糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)、およびEndo-Zrを含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3～12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のNGA2-Asn-Fmocおよびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはAsahipak NH2P-50 4E(4.6×250 mm、Shodex社)を使用し、溶媒はアセトニトリル(溶媒A)と200mM TEAA(pH7.0、GLEN RESEARCH社：溶媒B)を用いた。流速1.0ml/min、溶媒B：43％の条件でアイソクラティック溶出を行い、蛍光検出器(励起波長265nm、蛍光波長315nm)にて検出を行った。Endo-Zrの酵素活性は上記の反応条件で１分間に1μmolのNGA2-Asn-Fmocを加水分解する活性を1Unitとして定義した。
　Endo-Zr部分精製酵素液のSDS-PAGE、ウェスタンブロッティングおよび活性測定の結果を図１７に示した。SDS-PAGEでは複数のバンドが検出されたが、ウェスタンブロッティングではEndo-Zrの分子量である73kDaに相当する位置にHis-tagのシグナルが検出され、タンパク質の発現が確認された(図１７Ａ，Ｂ)。2分岐複合型糖鎖(NGA2-Asn-Fmoc)を基質として活性測定を行ったところ、Endo-Zr部分精製酵素液を加えた反応液では基質のピーク(10.8min)が減少し、加水分解物のGlcNAc-Asn-Fmocのピーク(6.8min)が出現した(図１７Ｃ)。この結果からEndo-Zrが既知のEndo-Mと同様に２分岐複合型糖鎖を加水分解するENGaseであることが明らかとなった。また、Endo-Zr部分精製酵素液の比活性は3.3μUnit/mgであった。
(実施例１７)Endo-Zrの諸性質の検討
(１７－１)Endo-Zrの至適反応条件の検討
　Endo-Zrの至適反応pHの検討は以下のように行った。終濃度100mMの各種バッファー、0.5M NaCl、10μM NGA2-Asn-Fmoc、およびEndo-Zr部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。バッファーにはクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.5-5.5)、酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5-6.0)、リン酸ナトリウムバッファー(pH6.0-7.5)、MOPS-NaOHバッファー(pH6.5-8.0)、Tris-HClバッファー(pH8.0-9.0)を使用した。実施例１６に記載した方法により反応液をHPLCに供し、酵素活性を算出した。至適反応温度の検討は実施例１６に記載した活性測定法の反応温度を10℃から60℃まで変えることにより行った。
　Endo-Zrの至適反応条件の測定結果を図１８に示した。Endo-Zrの至適反応pHは4.5-5.0付近、至適反応温度は40℃付近であった。
(１７－２)各種糖鎖に対する加水分解活性の検討
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対する加水分解活性の比較は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.3)、0.5M NaCl、1μMの各種PAラベル化糖鎖(TaKaRa-Bio社)、およびEndo-Zr部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で3～12時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液をHPLCに供し、基質のPAラベル化糖鎖およびその加水分解物のピーク面積比から酵素活性を算出した。カラムはCosmosil 5C18-ARII(2.0×150mm、ナカライテスク社)を使用し、溶媒は0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0：溶媒A)および0.1M 酢酸アンモニウムバッファー(pH4.0)、0.5％ 1-ブタノール(溶媒B)を用いた。流速0.5ml/minで24分間かけて溶媒B：5％-50％のリニアグラジエント溶出を行い、蛍光検出器(励起波長 320nm、蛍光波長400nm)にて検出を行った。上記の反応条件で１分間に1μmolのPAラベル化糖鎖を加水分解する活性を1Unitとして酵素活性を算出し、M8A構造の糖鎖に対する加水分解活性を100％として各種糖鎖に対する相対活性を算出した。
　各種構造のPAラベル化糖鎖に対するEndo-Zrの加水分解活性の測定結果を表４に示した。比較のためにEndo-Mの過去の論文のデータ(非特許文献６)を引用した。Endo-ZrはEndo-Mと同様に高マンノース型糖鎖に対する加水分解活性が高く、さらに混成型糖鎖や２分岐の複合糖鎖を加水分解することができた。一方で、分岐が３つ以上の複合糖鎖やコアフコース構造を持つ糖鎖、bisecting GlcNAcを有する混成型糖鎖は分解できないことが明らかとなった。また、いくつかの糖鎖ではEndo-Mとは反応性が異なっており、特に２分岐の複合型糖鎖やM3B、M5A、M6B構造の糖鎖に対してはEndo-Mと比較して高い反応性を示した。
(１７－３)トランスグリコシダーゼ活性の有無の検討
　ENGaseの中には糖鎖を加水分解するのと同時に任意のアクセプター分子に対して切断した糖鎖を転移する活性を持つものが知られており、その代表例としてEndo-Mが挙げられる。そこでEndo-Zrにも同様の糖転移活性(トランスグリコシダーゼ活性)があるか否かを調べた。
　Endo-Zrのトランスグリコシダーゼ活性の検出は以下のように行った。終濃度100mM 酢酸ナトリウムバッファー(pH6.0)、2mM NGA2-Asn-Fmoc、50mMのアクセプター分子(p-ニトロフェニルグルコース)およびEndo-Zr部分精製酵素液を含む反応液(total volume：10μl)を30℃で16時間インキュベートし、95℃で5分間加熱することにより酵素反応を停止した。反応液全量を実施例１６に記載した方法でHPLCに供し、UV検出器(274nm)で検出を行った。
　HPLCによる解析の結果、Endo-Zrのサンプルでは糖転移反応物のピークは検出されず、トランスグリコシダーゼ活性は確認できなかった(Data not shown)。
 
[配列フリーテキスト]
配列番号１：Endo-Om AA
配列番号２：Endo-Om (2319 bp)
配列番号３：プライマー１(Endo-Om primer　F)
配列番号４：プライマー２(Endo-Om primer　R)
配列番号５：Endo-Cp AA(Candida parapolymorpha)
配列番号６：Endo-Cp(Candida parapolymorpha)(2238 bp)
配列番号７：プライマー３(Endo-Cp primer　F)
配列番号８：プライマー４(Endo-Cp primer　R)
配列番号９：Endo-Pa AA(Pichia anomala)
配列番号１０：Endo-Pa(Pichia anomala)(1971 bp)
配列番号１１：プライマー５(Endo-Pa primer　F)
配列番号１２：プライマー６(Endo-Om primer　R)
配列番号１３：Endo-Zr AA(Zygosaccharomyces rouxii)
配列番号１４：Endo-Zr(Zygosaccharomyces rouxii)(1920 bp)
配列番号１５：プライマー７(Endo-Zr primer　F)
配列番号１６：プライマー８(Endo-Zr primer　R)

Claims (9)

  1. 　下記の(1)～(5)のいずれかのアミノ酸配列を含むエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質；
    (1)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列、
    (2)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列、
    (3)配列番号１，５，９又は１３に示されるアミノ酸配列と70％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
    (4)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列にコードされたアミノ酸配列、
    (5)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
  2. 　請求項１に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  3. 　下記の(1)～(6)のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチド；
    (1)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    (2)配列番号２，６，１０又は１４に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    (3)配列番号３及び４に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号２と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    (4)配列番号７及び８に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号６と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    (5)配列番号１１及び１２に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１０と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    (6)配列番号１５及び１６に示される塩基配列を含むプライマーセットにより増幅され、配列番号１４と70％以上の同一性を有し、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  4. 　請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを含有する、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を発現するためのベクター。
  5. 　請求項４に記載のベクターが導入されている、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質発現用形質転換細胞。
  6. 　前記形質転換細胞がOgataea minuta、Candida parapolymorpha、Pichia anomala、及びZygosaccharomyces rouxiiのいずれかの酵母から選択された酵母細胞を宿主とする形質転換細胞である、請求項５に記載の形質転換細胞。
  7. 　請求項５又は６に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
  8. 　請求項１に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴とする、糖タンパク質からアスパラギン結合型糖鎖を切断する方法。
  9. 　請求項１に記載のエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることを特徴とする、アスパラギン結合型糖鎖を任意のアクセプター分子に対して転移する方法。
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