WO2013022238A2

WO2013022238A2 - 트리사이클로 당화 유도체 화합물, 그 제조방법 및 타크롤리무스 당화 유도체를 포함하는 면역억제용 약제학적 조성물

Info

Publication number: WO2013022238A2
Application number: PCT/KR2012/006210
Authority: WO
Inventors: 김재종; 우진석; 임시규; 강선엽; 김대희; 서원민; 양지영; 백승원; 주정훈; 이상미; 유상은; 이미옥; 이기호; 박병철; 이보미; 염태현; 조정원
Original assignee: (주)제노텍
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2013-02-14
Also published as: WO2013022238A3

Abstract

본 발명은 트리사이클로 화합물 구조에 당을 부착하여 신규 구조의 트리사이클로 화합물 유도체들을 만드는 기술 및 그 기술에 의해 합성되는 당화 유도체에 관한 것으로서, 면역억제 기능을 보유하며, 최대 10,000배 이상 수용성이 향상되었다. 또한, 본 발명은 알러지성 결막염, 안구 건조증을 포함하는 면역질환 억제용 약학 조성물에 관한 것으로서, 타크롤리무스 당화 유도체를 유효 성분으로 포함한다.

Description

트리사이클로 당화 유도체 화합물, 그 제조방법 및 타크롤리무스 당화 유도체를 포함하는 면역억제용 약제학적 조성물

본 발명은 타크롤리무스 (본 명세서에서 "FK506"과 혼용함)를 비롯한 트리사이클로 화합물의 구조에 당을 부착하여 신규 구조의 트리사이클로 화합물 유도체들을 만드는 방법 및 그 방법에 의해 합성되는 당화 유도체, 그리고 타크롤리무스 당화 유도체를 포함하는 면역억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

현재 약물로 개발되는 선도물질의 약 70% 정도는 천연 물질에서 유래되는 것으로 추정되며 이들 중 대다수는 당이 수식되어 있는 것으로 나타났다 (Poiter, P. Actual. Chim. 11:9 (1999)). 당류의 부착은 약물의 흡수 (absorption), 분포 (distribution), 대사 (metabolism) 또는 배설 (excretion)의 조절에 매우 큰 영향을 미친다. 당류의 종류와 수에 따라 목표 (target)에 대한 친화도 또한 크게 변화될 수 있다.

트리사이클로 화합물 (Tricyclo compounds)은 주로 미생물, 특히 방선균 속이 생산하는 항진균 활성 및 면역억제 활성을 보이는 미생물 이차 대사산물이다. 이들 물질은 일반적으로 독성이 매우 약하고, 약리활성이 매우 높아, 면역억제제, 항암제 등으로 개발되었으며, 프로그랍(Prograf^TM), 라파뮨(Rapamune^TM) 등으로 고가의 의약품으로 판매되고 있다.

대표적인 트리사이클로 화합물로서 타크롤리무스 (tacrolimus, FK506), 아스코마이신 (ascomycin, FK520), 라파마이신 (rapamycin, sirolimus), 메리다마이신 (meridamycin) 등이 알려져 있다. 타크롤리무스, 아스코마이신, 라파마이신과 그 구조 유사체 들은 유사 구조 부위를 가지고 있어 인비보 (in vivo)와 (in vitro)에서 면역세포인 T 세포의 활성화를 억제하는 활성을 나타낸다. 이들 화합물은 피라노스-피페콜린 부위 (pyranose-pipecolinyl region)를 가지고 있는데, 이는 루이신-프롤린 펩타이드 (leucine-proline peptide)와 유사한 구조로 펩티딜 프로릴 시스/트랜스 이성화 효소 (peptidyl prolyl cis/trans isomerase)의 결합으로 다양한 생리적 활성을 나타낸다고 보고되었다 (Rosen M. K. 등, 1990).

이들 트리사이클로 화합물에는 당이 부착되어 있지 않다. 그러므로 대부분의 트리사이클로 화합물 약물은 매우 비극성으로 수용성 용매에 잘 녹지 않는다. 이는 약물의 제제화에 매우 불리하다. 이들 약물에 당을 부착하는 것은 새로운 신규 활성 물질을 제공할 기회가 될 뿐만 아니라, 수용성의 증가를 통해 좀더 효과적인 신규 의약품 개발이 가능해질 수 있다.

타크롤리무스 (Tacrolimus, FK506)는 1984년 일본의 후지사와사 (Fujisawa Co., Ltd.)가 개발한 면역억제제이다. 이는 그람양성세균인 토양방선균종 스트렙토마이세스 츠쿠바엔시스 (Streptomyces tsukubaensis)에 의해 생산되는 분자량 약 803 m/z의 매크롤라이드 (macrolide) 구조 저분자 이차 대사산물이다. 타크롤리무스는 주로 간, 신장, 심장, 척수, 소장, 췌장, 폐, 기관 (氣管), 피부, 각막 및 팔다리 등 광범위한 이식수술 후 거부반응의 경감 및 해소에 사용하고 있으며, 최근 심각한 아토피 염증 치료에도 사용되고 있다.

타크롤리무스의 상품명은 Prograf^TM로 캡슐과 혈관내 확산을 위한 주사제 및 연고제로 개발되어 있다. 타크롤리무스는 백색 분말상으로 물, 헥산 (hexane), 헵탄 (heptane) 등에 낮은 용해도를 보이며, 알콜성 용매에는 높은 용해도를 보이나, 특히 물의 혼입에 의해 급격한 용해도 감소가 일어난다. 이러한 물성으로 인해 타크롤리무스는 주사제 등의 제형 개발이 용이하지 않고, 특히 약리 동력학적으로 생체이용율이 매우 낮다. 이러한 이유로 타크롤리무스는 불수용성 약제의 특성상 유기용매에 녹인 상태에 급속히 투여될 경우 침전 또는 결정이 형성될 가능성이 높고, 이로 인하여 국소적인 약물의 편재가 일어나기 쉬우며, 또한 다양한 용액제제, 분말제, 현탁제를 조제하여 주사액, 경구 투여액, 국부산포액, 안구용 전하제 등의 제형으로 여러가지 임상용도에 적용하기가 매우 까다롭다.

만약 타크롤리무스의 수용액 상의 용해도를 증가시킬 경우 다양한 제제 및 제형연구가 가능해지며, 약물의 투과성이 크게 개선되어 약물의 흡수력을 증대함으로써 약물의 약리 동력학적인 특성이 크게 개선될 수 있을 것이다.

자가면역질환 (autoimmune disease)은 신체의 방어 기작, 즉 면역시스템이 자신의 신체 조직에 대항하게 되어 손상을 입히기 시작할 때 일어나는 면역과민반응에 의한 질환이며, 환자는 현재도 계속 증가 추세에 있다. 자가면역질환은 바이러스나 세균에 대해 신체의 사이토카인 (신체의 방어 체계를 제어하고 자극하는 신호물질) 환경이 변화되면서 부적절한 면역반응이 유도되어 자가면역반응이 과도하거나 부적절하게 제어되면서 병이 생기는 것이라고 보지만, 정확한 발병원인은 밝혀지지 않았으며 환경적 요인, 유전적 요소, 면역학적 요인에 의해 발병할 수 있는 것으로 보인다. 현재까지 알려진 자가면역질환은 80여종에 이르고, 류마티스 관절염, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선 (psoriasis), 백반증, 쇼그렌 증후군 (Sjogren syndrome) 등이 있다. 또한 이미 알려진 자가면역 안질환으로는 포도막염, 베체트병, 각결막염을 비롯하여, 최근에는 안구건조증이 면역반응 이상으로 인한 염증성 질환으로 여겨지면서 건조증 또한 자가면역 질환으로 여겨지고 있다. 대부분의 자가면역 질환에서는 스테로이드제를 사용하거나 최근에는 면역억제제를 사용하고 있다. 대표적인 자가면역 안질환 중 하나가 포도막염(uveitis)이다. 포도막은 홍체, 섬모체, 맥락막으로 구성되어 있는데, 포도막에는 혈관이 풍부하고 결합조직이 많아서 염증이 생기기 쉽다. 이 포도막에 생긴 염증을 포도막염이라 하는데 현재까지 그 병의 원인이 불분명한 편인데, 그나마 원인으로 여겨지는 경우는 매독과 결핵 정도이다. 현재 포도막염의 원인으로 면역체계의 이상을 보고 있는데, 포도막에서의 염증이 균이나 바이러스에 의해 생기기도 하지만 면역학적 반응의 염증이 많아서 자가 면역질환으로 분류하게 된다. 포도막염의 치료는 국소 또는 전신성 스테로이드를 사용해 치료해 왔다. 그러나 점안제와 같은 국소 치료나 전신성 스테로이드의 치료는 약물이 포도막 조직에 충분히 도달하지 않을 경우, 고용량을 사용할 수밖에 없는데 이럴 경우 심각한 부작용이 나타나는 경우가 많다. 또한 스테로이드 치료에 반응하지 않는 환자 또는 전신 스테로이드의 심각한 부작용을 견디지 못하는 환자들에게는 면역억제제를 사용하는데, 이 역시 골수 억제, 출혈방광염, 신장 손상 등의 부작용으로 결국 치료를 중단하는 사례가 있었다. 이런 환자들은 실명에 이르게 되는 경우가 많다. 따라서 안구 침투가 잘 되고 부작용이 적은 안질환용 점안제 개발이 시급한 실정이다.

알러지성 결막염 (Allergic Conjunctivitis)은 알러젠이 눈 점막을 자극해 일어나는 안질환이며, 다양한 유발원인물질인 꽃가루, 먼지, 진드기, 렌즈의 착용, 대기상의 원인 미상의 물질, 화장품, 비누 등의 여러 가지 원인들에 의해 발생되는 것으로 밝혀지고 있다. 알러지성 결막염은 고초열성 결막염 (Hay fever conjunctivitis), 춘계 각결막염 (Vernal keratoconjunctivitis), 아토피성 각결막염 (Atopic keratoconjunctivitis), 플릭텐성 각결막염 (Phlyctenulosis), 접촉성 안검염에 의한 결막염 (Contact dermatitis induced conjuctivitis) 등의 다양한 병명으로 진단될 수 있으며, 증상으로 안구 건조 (dry eye), 충혈 (red eye), 가려움 등의 증상을 수반한다. 이러한 알러지성 각결막염의 유병율은 도시생활의 증가와 더불어 점점 증가하고 있으며, 전체 인구의 20-25% 정도에서 발생하는 것으로 추정되고 있다. 이들 중의 대부분 (80% 이상)은 계절성 알러지성 각결막염으로 확인되고 있다. 알러지성 결막염의 치료에는 항히스타민제 (Antihistmines), 스테로이드제 (Steroids), 알러지 예방·차단제 (Antiallergics) 등의 처방이 주로 이루어지고 있으며, 이러한 약물 사용으로도 안전하고 완전하게 만족할 만한 치료가 이루어지지 않고 있다. 최근 면역억제제는 스테로이드 제제를 대체하는 안구 건조증 치료제로 개발되고 있다(WO 2004/014373). 사람을 포함하는 포유류의 안구 건조증 (건조각막결막염) 및 알러지성 결막염의 치료제로 사용되고 있는 대표적인 약물은 Allergan사에서 발매한 레스타시스 (RESTASIS)^TM로 0.05%의 사이클로스포린 A 점안액이다. 사이클로스포린 A의 안구건조증 치료 기작은 정확하게는 알려지지는 않았다. 레스타시스^TM는 특히 다양한 원인의 안구건조증 (건성 각막결막염, Keratoconjunctivitis sicca) 치료제로 사용되고 있다. 이와 더불어 후지사와사에서 FK506 (타크롤리무스, tacrolimus)을 유효 활성성분으로 조제한 조성물을 눈 질환의 치료제로 제시하였다 (미국특허 제6,384,073호).

안구건조증 및 건성 각막결막염의 치료제 등으로 개발된 사이클로스포린 A는 물 용해성이 약 20 ug/ml 내지 30 ug/ml으로 낮으며, 또한 FK506 (타크롤리무스와 혼용함)은 약 1 ug/ml 내지 2 ug/ml로 매우 낮은 물 용해성을 나타낸다. 이러한 난용성 약물을 안약제제로 개발하는 것은 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 현재까지 보고된 사이클로스포린 A 성분의 안구 건조증 치료제인 레스타시스^TM는 액-액 분산계로 된 에멀젼 (emulsion) 형태로 조제된다. 일반적으로 마이크로에멀젼은 열역학적으로 매우 불안정하여 응집, 침강, 크림화, 입자성장, 유착 등의 현상이 발생하여 액-액 분산이 파괴된다. 이러한 문제를 해결하고 좀더 안정적인 입자로 만들기 위해 입자를 나노크기로 줄인 나노에멀젼 등을 만들기도 한다 (한국특허등록 제1,008,189호). 이러한 나노 에멀젼화 제조 공정은 고압식 호모게나이저, 마이크로플루다이져와 같은 고가 기계가 필요할 뿐 아니라 공정 중의 열화 등이 발생 할 수 있어 제조 공정에 많은 노력과 비용이 소요된다. 또 다른 방법으로는 FK506과 같이 연고제로 만들기도 하는데 이를 위해 가열 하에 FK506을 프로필렌 카보네이트에 녹여 용해하는 방법 (한국특허등록 제10,019,424호) 혹은 고분자 미셀을 만드는 방법 (한국특허공개 제10-2006-70212)을 사용한다. 이러한 방법은 과다한 에너지의 사용, 특별한 기계 및 공정을 사용하여야 하는 문제로 인하여 비경제적이며 또한 유효 성분 함량의 편재 및 제제의 안정성이 나쁠 수 있는 단점이 있다.

그러므로, 수용성이 높은 면역억제제를 이용하여 좀더 쉽고 편리한 안질환용 약학 조성물과 조제 방법의 개발이 요구된다.

본 발명은 용해도가 높은 트리사이클로 화합물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 용해도가 높은 트리사이클로 화합물 유도체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 수용성이 높은 면역억제제를 제공하여 인간을 포함하는 포유류의 안구건조증 및 알러지성 결막염을 포함하는 안질환에 효과적인 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 트리사이클로 화합물의 용해도를 높이는 방법을 연구하던 중 당을 수식하여 신규 구조의 물질을 합성함으로써 용해도를 높인 트리사이클로 화합물 당화 유도체를 제조하였다.

본 발명은 용해도가 높고 다양한 생리활성을 갖고 있는 트리사이클로 화합물의 당화 유도체들, 좀더 자세히는 수용성이 크게 개선되어, 체내동태, 안전면에서 우수한 트리사이클로 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 당을 트리사이클로 화합물에 부착시키는데 있어서 입체적 장해 (steric hindrance)를 극복하기 위해 링커 (linker)를 트리사이클로 화합물과 당 사이에 개입시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명자들은 수용해성이 높은 새로운 타크롤리무스 당화 유도체에 대하여 면역억제활성, 독성 및 수용해성을 시험하였다. 그 결과, 새로운 타크롤리무스 당화 유도체가 사이클로스포린 A보다 면역억제활성이 4~5배 강함을 확인하였고, 안과용 약물로 사용되는 기존의 면역억제제에 비해 현저히 낮은 독성을 나타냄을 확인하였으며, 수용해성은 FK506과 비교하여 최소 수백 배 이상 높은 값을 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 상기 신규 타크롤리무스 당화 유도체를 유효성분으로 포함하는 점안제 조성물을 제조한 후 pH 값, 안정성, 안질환에 대한 치료 효능을 시험하였다. 그 결과, 점안제 조성물들은 pH가 허용치 내에 포함되었으며, 12주 이상 보관하여도 안정적임을 확인하였다. 안질환 치료효능은 레스타시스와 비교하였는데, 이와 유사하거나 우수한 효능을 나타내었다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 새로운 트리사이클로 당화 유도체 화합물은 FK506과 비교하여 수용성이 최대 10,000배 증대되었으며, 우수한 면역억제활성을 나타내었다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 타크롤리무스 당화 유도체는 사이클로스포린 A보다 면역억제활성이 4~5배 강함을 확인하였고, 안과용 약물로 사용되는 기존의 면역억제제에 비해 현저히 낮은 독성을 나타냄을 확인하였으며, 수용해성은 FK506과 비교하여 최소 수백배 이상 높은 값을 나타내었다.

또한, 상기 신규 타크롤리무스 당화 유도체를 유효성분으로 포함하는 점안제 조성물은 pH가 허용치 내에 포함되었으며, 12주 이상 보관하여도 안정적임을 확인하였다. 안질환 치료효능은 레스타시스™와 비교하였는데, 이와 유사하거나 우수한 효능을 나타내었다.

도 1은 FK506과 FK506 당화 유도체 화합물들의 수용성 시험 결과이다.

도 2a는 FK506과 FK506 당화 유도체 FK506-M32-LS, FK506-D-LS, FK506-M32-LS-Glc 화합물들의 면역억제활성 시험 결과이다.

도 2b는 FK506 당화 유도체 FK506-M32-LS-Lac, FK506-M32-LS-SL, FK506-M32-LA-Glc, FK506-M24-LA-Glc 화합물들의 면역억제활성 시험 결과이다.

도 2c는 FK506 당화 유도체 FK506-M32-LA-Lac, FK506-M24-LA-Lac, FK506-M32-LA-SL, FK506-M24-LA-SL 화합물들의 면역억제활성 시험 결과이다.

도 2d는 본 발명의 타크롤리무스 당화 유도체인 FK506-M32-LA-Glc (화합물 16), FK506-M32-LA-Lac (화합물 19), FK506-M32-LA-SL (화합물 22)와 레스타시스^TM의 약효 성분인 사이클로스포린 A의 면역억제 활성을 인비트로 세포 기반 측정법 (in-vitro cell based assay)을 실시하여 비교한 그래프이다.

도 3은 본 발명에 의한 점안제 조성물의 pH 값을 측정한 결과이다.

도 4는 타크롤리무스를 함유한 점안제의 안정성을 1~12주에 걸쳐 시험한 결과이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 타크롤리무스 당화 유도체를 함유한 점안제의 안정성을 시험한 결과이다.

도 6은 본 발명의 다른 실시예에 의한 타크롤리무스 당화 유도체를 함유한 점안제의 안정성을 시험한 결과이다.

도 7은 마우스에 능동 감작된 알러지성 결막염에 시험물질 점안제를 가하여 치료 효능을 측정하여 얻어진 총 증상 점수 (total clinical score)이다.

도 8은 마우스에 능동 감작된 알러지성 결막염에 시험물질 점안제를 가하여 얻어진 결막수종 (Chemosis), Tearing and discharge, 결막 충혈 및 연조직 침범 (Lid edema) 치료 결과를 나타내는 그래프들이다.

도 9는 마우스에 능동 감작된 알러지성 결막염에 시험물질 점안제를 가하여 비만세포 (Mast-Cell) 탈과립 (Degranulation) 정도를 측정한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "안질환"은 스티븐슨-존슨 증후군, 쇼그렌 증후군, 안구건조 증후군, 외상, 안구 수술에 의한 안구 외상(안구 수술은 안구를 절개하는 모든 수술을 의미하며, 대표적으로 백내장 수술, 녹내장 수술, 망막 수술, 라식 수술, 라섹 수술 등을 말한다), 감염성/비감염성 포도막염, 각막 이식수술 후 면역거부반응 또는 하드 콘택즈 렌즈 착용에 의한 외인성 질환에 의한 각결막 상피 장해를 말한다. 상기 안질환은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 안구건조증을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “안구건조증”은 눈물 생성이 부족하거나 눈물막의 눈물이 과도하게 증발하여 눈물막이 불안정하게 되고 이에 따라 이물감이나 따가움 등 여러 가지 증상이 발생하는 증후군을 의미한다. 좀더 구체적으로는 "안구건조증"이란 눈물 분비가 저하되거나 눈알과 눈 부속기관의 질환, 즉 눈꺼풀의 이상이나 염증, 피부질환과 동반된 경우로서 스티븐슨-존슨 증후군 혹은 유사물집증 (pemphigoid), 또한 전신 질환과 동반된 경우인 비타민 A 결핍증 및 쇼그렌증후군을 의미하며, 노출된 눈꺼풀 틈새 내의 눈알 표면이 손상되고 눈에 불쾌감, 이물감, 건조감 같은 자극증상을 일으키며, 각막손상이 심해질 경우 안구표면에 염증이 발생하는 질환을 말한다. 병변이 진행되면 충혈이 보일 수 있으며, 합병증으로 처음에는 약한 시력장애가 있을 수 있고, 그 후에 각막궤양, 각막천공, 이차적인 세균감염도 올 수 있으며, 각막흉터와 혈관신생 등이 생기면 시력장애가 심해진다.

본 발명에서 사용된 시료는 트리사이클로 화합물로서, 구체적으로는 타크롤리무스, 아스코마이신, 라파마이신, 메리다마이신 등이며, 좀더 바람직하게는 타크롤리무스이다. 트리사이클로 화합물에서 당이 수식될 관능기로는 수산화기, 메틸기, 메톡실기 (methoxyl group)가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 수산화기이다. 당의 수식 부위로는 타크롤리무스를 예로 들면 32 위치, 또는 24 위치의 수산화기가 될 수 있으며, 두 곳에 모두 수식될 수도 있으며, 두 부위 중 한 부위가 수식될 수도 있다. 본 발명에서는 당을 화합물과 연결하기 위해 링커를 사용할 수 있으며, 링커는 에스테르 (ester) 또는 아마이드 (amide) 결합을 활용하여 연결할 수 있으며 관능기로 포밀 (formyl)기, 아세틸 (acetyl)기, 프로피오닐 (propionyl)기, 부틸 (butyl)기, 아크릴 (acryl)기, 에틸석시닐 (ethylsuccinyl)기, 석시닐 (succinyl)기, 아미노헥실 (aminohexyl)기 등이 부착될 수 있으며 바람직하게는 석시닐기, 아미노헥실기가 단독으로 또는 모두 사용될 수 있다. 부착되는 당은 단당류, 이당류, 삼당류 및 다당류가 가능하며, 부착되는 당의 수는 1~5개가 바람직하며, 각 당은 C3~C7으로 구성되는 알도즈 (aldose) 또는 케토즈 (ketose)로 통상의 당이 포함될 수 있다. 당의 종류에 특별한 제한은 없으며, 바람직하게는 단당이 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 푸코오스, 만노오스, 람노오스, 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 반코사민, 에피-반코사민, 글루쿠론산, 시알산, 데옥시글루코오스, 데옥시갈락토오스로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 더욱 바람직하게는 단당으로는 글루코오스, 이당으로는 락토오스, 삼당으로는 시알릴락토오스를 선택할 수 있다.

당의 부착 방법으로는 링커에 당을 부착하고 그 이후 트리사이클로 화합물을 부착하거나, 트리사이클로 화합물에 링커를 부착하고 여기에 당을 부착할 수 있다.

링커-당 복합체는 링커에 단당을 붙인 후에 이당, 삼당으로 확장할 수도 있으며, 링커에 이당을 부착 후에 삼당으로 확장할 수도 있다. 이때 이당, 삼당으로의 확장은 화학반응을 통해 합성하거나, 효소 반응으로 확장할 수 있다. 효소 반응은 글루코오스에서 락토오스로 변형에는 갈락토실트랜스퍼레이즈 (galactosyltransferase)를 사용할 수 있으며, 락토오스에서 시알릴락토오스 (sialyllactose)로의 전환에는 시알릴트랜스퍼레이즈 (sialyltransferase)가 적절하다.

이하 본 발명의 트리사이클로 화합물 당화 유도체의 구체적인 예 몇 가지를 설명한다.

본 발명은 트리사이클로 화합물을 원료로 하여 만들어지는 화학식 1로 표시되는 트리사이클로 당화 유도체 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 타크롤리무스 당화 유도체 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물을 포함하는 안질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며, R₁, R₂의 적어도 하나에는 에스테르 결합 또는 아마이드 결합으로 C1~C12의 링커에 연결된 C3~C7으로 구성되는 알도즈 (aldose) 또는 케토즈 (ketose) 당쇄가 1~5개 결합되어 있고, 당쇄가 결합되지 않은 R₁ 또는 R₂는 H임)

또한, 본 발명은 상기 링커가 포밀 (formyl)기, 아세틸 (acetyl)기, 프로피오닐 (propionyl)기, 부틸 (butyl)기, 아크릴 (acryl)기, 에틸석시닐 (ethylsuccinyl)기, 석시닐 (succinyl)기 또는 아미노헥실 (aminohexyl)기인 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 알도즈 또는 케토즈가 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 푸코오스, 만노오스, 람노오스, 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 반코사민, 에피-반코사민, 글루쿠론산, 시알산, 데옥시글루코오스, 데옥시갈락토오스로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상인 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 하기 화학식 I의 구조를 가지는 타크롤리무스를 비롯한 트리사이클로 화합물 골격의 R₁, R₂에 링커를 부착시켰다. 구체적인 몇 가지 예를 들면, 아래 화합물 (1) 내지 화합물 (6)과 같다. 이와 같이 링커가 붙은 화합물에 당을 연결하여 본 발명의 화합물의 구체적인 예인 (7) 내지 (24) 등의 화합물을 제조하였다.

화학식 1

(Rx는 OH 또는 methoxy 임)

(화합물 1); R₁=

, R₂=H

(화합물 2); R₁=H, R₂=

(화합물 3); R₁, R₂=

(화합물 4); R₁=

, R₂=H

(화합물 5); R₁=H, R₂=

(화합물 6); R_1, R₂=

(화합물 7); R₁=

, R₂=H

(화합물 8); R₁=H, R₂=

(화합물 9); R₁, R₂=

(화합물 10); R₁=

, R₂=H

(화합물 11); R₁=H, R₂=

(화합물 12); R₁, R₂=

(화합물 13); R₁=

, R₂=H

(화합물 14); R₁=H, R₂=

(화합물 15); R₁, R₂=

(화합물 16); R₁=

, R₂=H

(화합물 17); R₁=H, R₂=

(화합물 18); R₁, R₂=

(화합물 19); R₁=

, R₂=H

(화합물 20); R₁=H, R₂=

(화합물 21); R₁, R₂=

(화합물 22); R₁=

,R₂=H

(화합물 23); R₁=H, R₂=

(화합물 24); R₁, R₂=

상기 (1) 내지 (24)에 기재된 화합물의 제조 방법은 이하(25) 내지 (35)에 나타내는 공정과 같다.

(25) 글루코오스를 원료로 하여 1 -OH 위치에 석시닐기를 도입하고 기타 -OH기에 보호기를 도입하는 공정

(이때 R₃와 R₄는 동일할 수도 있고 다를 수도 있으며, 쉽게 산 또는 염기의 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 통상의 화학합성의 OH기의 보호기이며, 바람직하게는 MMTr (Monomethoxytrityl)기 또는 TMS (Tetramethylsilane)기이며, 더욱 바람직하게는 R₃가 MMTr기, R₄가 TMS기임).

(26) 아미노헥실기를 글루코오스, 락토오스에 도입하여 1-O-아미노헥실 글루코오스를 만드는 공정 (하기 공정 1, 2를 순차적으로 수행하는 공정) 또는 1-O-아미노헥실 락토오스를 만드는 공정 (하기공정 1, 3 또는 1, 2, 4를 순차적으로 수행하는 공정), 또는 1-O-아미노헥실 시알릴락토오스를 만드는 공정 (하기 공정 1, 3, 5 또는 1, 2, 4, 5를 순차적으로 수행하는 공정, 또는 1, 2 공정을 순차적으로 수행하고 4, 5를 동시에 수행하는 공정)으로 각 단계를 1~4회 반복할 수 있다.

공정 26-1

R은 아미노기 보호기로서, 바람직하게는 MMTr기이다.

공정 26-2

상기 공정 1에서 생성된

에 초산 브롬 글루코오스 (acetyl bromo glucose)를 부착한 후 당에 부착된 아세틸기 및 R기를 제거하여 1-O-아미노헥실 글루코오스를 만드는 공정이다.

공정 26-3

상기 공정 1에서 생성된

에 초산 브롬 락토오스 (acetyl bromo lactose)를 부착한 후 당에 부착된 초산기 및 R기를 제거하여 1-O-아미노헥실 락토오스를 만드는 공정이다.

공정 26-4

1-O-아미노헥실 글루코오스에 효소를 이용한 당화반응을 행하여 락토오스를 도입하여 1-O-아미노헥실 락토오스를 만드는 공정이다.

공정 26-5

1-O-아미노헥실 락토오스에 효소를 이용한 당화반응을 행하여 시알산을 도입하여 1-O-아미노헥실 3′-시알릴락토오스를 만드는 공정이다.

(27) 도 1의 타크롤리무스에 상기 공정 (25)에 의해 제조된 화합물 (25)를 부가한 후 OH 보호기인 R1, R2를 제거하여 화합물 7, 8 또는 9를 만드는 공정이다.

(R₃와 R₄는 동일할 수도 있고, 다를 수도 있으며, 쉽게 산 또는 염기의 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 통상의 화학합성의 OH기의 보호기이며, 바람직하게는 MMTr기, TMS기이며, 더욱 바람직하게는 R₃가 MMTr기, R₄가 TMS기임)

(이때 R₁, R₂는

R₁=

, R₂=H; (화합물 7),

R₁=H, R₂=

; (화합물 8) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 9)이며,

Rx는 수산화기 또는 메톡시기 또는 H임)

(28) 상기 (27)의 공정에서 확보된 화합물 7, 8 또는 9에 갈락토실트랜스퍼레이즈 (galactosyltransferase)를 이용하여 화합물 10, 11 또는 12를 합성하는 공정.

(이때 R1, R2는 각각

R₁=

, R₂=H ; (화합물 10),

R₁=H, R₂=

; (화합물 11) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 12)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(29) 이하의 공정

상기 (28)의 공정으로 제조되는 화합물 10, 11 또는 12에 시알릴트랜스퍼레이즈 (sialyltransferase)를 사용하는 효소학적 방법으로 시알산을 전이시켜 화합물 13, 14 또는 15를 합성하는 공정.

(이때 R₁, R₂는

R₁=

, R₂=H ; (화합물 13),

R₁=H, R₂=

; (화합물 14) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 15)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(30) 이하의 공정

도 1의 타크롤리무스의 OH기에 다이카복실레이트 (dicarboxylate)를 에스테르 결합시키고 여기에 알킬 클로로카보네이트 (alkyl chlorocarbonates) 또는 아랄킬 클로로카보네이트 (aralkyl chlorocarbonates)를 부가하여 활성 에스테르를 만드는 공정.

이하 공정을 나누어 설명하면

공정 30-1

도 1의 타크롤리무스의 수산화기에 에스테르 결합을 할 수 있는 링커로서 X를 부가할 수 있다. 이때 X는 이초산 (dicarboxylic acid) 또는 그의 무수물이며, 이의 염 또는 용매화물이며 바람직하게는 옥살산 (oxalic acid), 말론산 (malonic acid), 숙신산 (succinic acid), 글루타르산 (glutaric acid), 애디프산 (adipic acid), 피멜릭산 (pimelic acid), 수베르산 (suberic acid), 아젤라익산 (azelaic acid), 세바스산 (sebacic acid), 운데칸다이오익산 (undecanedioic acid), 도데칸다이오익산 (dodecanedioic acid), 프탈산 (phthalic acid), 이소프탈산 (isophthalic acid), 테레프탈산 (terephthalic acid), 말레인산 (maleic acid), 퓨마르산 (fumaric acid), 글루타콘산 (glutaconic acid), 트로마틱산 (traumatic acid), 뮤코익산 (muconic acid) 중에서 선택되는 일종이며, 더욱 바람직하게는 말론산 (malonic acid), 숙신산 (succinic acid), 말레인산 (maleic acid), 프탈산 (phthalic acid), 글루타르산 (glutaric acid), 애디프산 (adipic acid), 피멜릭산 (pimelic acid), 퓨마르산 (fumaric acid) 또는 그의 무수화물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 일종이다.

(Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임) (X는 C2 ~ C12의 이초산기이며 바람직하게는 숙신산 무수화물임)

R₁=

, R₂=H ; (화합물 1),

R₁=H, R₂=

; (화합물 2) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 3)임,

Rx는 수산화기 메톡시기 또는 H임)

공정 30-2

화합물 1, 2 또는 3에 Y(알킬 클로로카보네이트, 아랄킬 클로로카보네이트, 이들의 염 또는 용매화물 중에서 선택되며, 클로로카보네이트는 메틸 클로로포메이트, 바람직하게는 알킬 클로로포메이트 (methyl chloroformate), 에틸 클로로카보네이트 (ethyl chlorocarbonate), 아이소부틸 클로로포메이트 (isobutyl chloroformate), 아이소프로필 클로로포메이트 (isopropyl chloroformate), 벤질 클로로포메이트 (beznyl chloroformate), 나이트로페닐 클로로포메이트 (nitrophenyl chloroformate)가 될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 나이트로페닐 클로로포메이트가 선택될 수 있음)를 부가하여 각각 화합물 4, 5 또는 6을 만드는 공정.

(Y는 알킬 클로로카보네이트 또는 아랄킬 클로로카보네이트, 바람직하게는 p-나이트로페닐 클로로포메이트임)

(이때 R₁, R₂는

R₁=

, R₂=H ; (화합물 4),

R₁=H, R₂=

; (화합물 5) 또는

R_1, R₂=

; (화합물 6)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(31) 이하의 공정

공정 (30)에 의해 제조된 화합물 4, 5 또는 6에 공정 (26)에서 제조되는 화합물 1-O-아미노헥실 글루코오스를 부가하여 각각 화합물 16, 17 또는 18을 제조하는 공정.

(이때 R₁, R₂는

R₁=

, R₂=H ; (화합물 16),

R₁=H, R₂=

; (화합물 17) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 18)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(32) 이하의 공정

상기 공정 (31)에서 만들어지는 화합물 16, 17 또는 18에 효소 갈락토실트랜스퍼레이즈를 사용하여 갈락토오스를 부가하여 화합물 19, 20 또는 21을 만드는 공정.

(이때 R₁, R₂는

R₁=

, R₂=H ; (화합물 19),

R₁=H, R₂=

; (화합물 20) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 21)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(33) 이하의 공정

공정 (30)에 의한 만들어진 화합물 4, 5 또는 6에 공정 (26)에서 만들어지는 1-O-아미노헥실 락토오스를 부가하여 각각 화합물 19, 20 또는 21을 만드는 공정.

(이때 R₁, R₂는

R₁=

, R₂=H ; (화합물 19),

R₁=H, R₂=

; (화합물 20) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 21)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(34) 이하의 공정

공정 (32) 또는 공정 (33)에 의해 만들어지는 화합물 19, 20 또는 21에 시알릴트랜스퍼레이즈를 사용하는 효소학적 방법으로 시알산을 전이시켜 화합물 22, 23 또는 24를 합성하는 공정

(이때 R₁, R₂는

R₁=

,R₂=H; (화합물 22),

R₁=H, R₂=

;(화합물 23) 또는

R₁, R₂=

;(화합물 24)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(35) 이하의 공정

공정 (30)에 의해 만들어진 화합물 4, 5 또는 6에 공정 (28)에서 만들어지는 1-O-아미노헥실 시알릴락토오스 (1-O-aminohexyl sialyllactose)를 부가하여 각각 화합물 22, 23 또는 24를 만드는 공정

(이때 R₁, R₂는

R₁=

,R₂=H; (화합물 22),

R₁=H, R₂=

;(화합물 23) 또는

R₁, R₂=

; (화합물 24)임,

Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

또한, 본 발명은 상기 면역억제용 조성물이 안질환 치료용으로 이용됨을 특징으로 한다. 또한, 상기 안질환은 스티븐슨-존슨 증후군, 쇼그렌 증후군, 안구건조 증후군, 외상, 안구 수술에 의한 안구 외상, 포도막염(감염성 또는 비감염성), 각막 이식수술 후 면역거부반응 또는 하드 콘택즈 렌즈 착용에 의한 외인성 질환에 의한 각결막 상피 장해임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 타크롤리무스 당화 유도체 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물이 전체 조성물 중 0.001% (w/v) 내지 0.1% (w/v) 함유됨을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜, 미글리올, 피마자유, 카보머, 폴리소르베이트, 카르복시메틸셀룰로오스, D-만니톨, 사이트레이트 다이하이트레이트 및 보레이트 데카라이드레이트를 더 포함함을 특징으로 한다

또한, 본 발명은 상기 조성물에 다른 면역억제제가 더 포함됨을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 조성물은 면역과민반응으로 인해 야기되는 질환의 예방 또는 치료에 사용됨을 특징으로 한다. "면역과민반응으로 야기되는 질환"이란 면역기능이 비정상적으로 활성화되어 병적인 상태에 이른 것을 말하며, 예컨대 장기이식시의 거부반응, 루푸스, 류마티스 관절염과 같은 자가면역질환, 비염, 천식, 아토피와 같은 알러지성 질환 등의 피부 과민반응을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 외에도, 본 발명에 따른 조성물은 개별적으로 또는 다른 종류의 면역억제제와 혼합하여 투여할 수 있다.

통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기한 기능을 갖는 약학 조성물을 제조할 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새셰이 (sachet), 엘릭서 (elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥, 안구 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 유효성분을 기준으로 할 때 타크롤리무스 당화 유도체는 0.1 내지 500 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 효과를 상승시키거나 보완하기 위해 약학적으로 허용되는 다른 첨가물, 면역억제제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 타크롤리무스 당화 유도체를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 점안제로 제형화할 수 있다. 점안제 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 삼투압 조절을 위한 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

통상 점안제 조성물에는 히알루론산 및 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 음이온성 중합체나 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염이 점안액에서 보습작용과 윤활작용을 하는 것으로 알려져 왔으며, 이들 성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체로는 등장화제, 완충제, 안정제, pH 조절제 및 용제 등을 들 수 있다. 등장화제는 점안제의 등장성을 조절하는 역할을 하며, 대표적으로 염화나트륨 또는 염화칼륨 등을 선택할 수 있다. 완충제는 점안제의 산도 또는 알칼리도를 조정하는 기능을 수행한다. 통상 점안제 제조에 사용되는 완충제는 아미노카프론산, 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨 등을 들 수 있다. 안정제는 점안제를 안정화시키는 역할을 수행하며, 통상 안정제로서 에데트산 나트륨 및/또는 과붕산나트륨을 이용할 수 있다. pH 조절제는 점안제 조성물의 pH를 조절하며, 예컨대 염산 및/또는 수산화나트륨을 들 수 있다. 용제로는 멸균 정제수 또는 주사용 증류수를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 점안제는 액제 제형인 것이 바람직하다. 상기 점안제 조성물에는 필요에 따라 보존제, 방부제 등을 부가할 수 있다.

본 발명에 따른 점안제 조성물의 권장량 및 사용 횟수는 1회 1~3적, 1일 5~6회 점안하되 증상에 따라 적절히 증감할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여횟수, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기의 발명을 분석예, 혹은 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 자세히 설명하고 본 발명의 내용을 이해하기 용이하게 설명하는 것이며, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것은 아니다. 또한, 아래 실시예에서는 본 발명의 트리사이클로 당화 유도체 중 일부 특히, 타크롤리무스 당화 유도체에 대하여 제조 및 시험하였으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것이 아니며, 여타 트리사이클로 화합물도 동일한 방법으로 당화 유도체 제조가 가능함은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 중 사용된 약어는 아래와 같다.

MMTr-Cl; Monomethoxytrityl chloride

MC; Methylene Chloride

TEA; Triethylamine

DMAP; 4-Dimethylaminopyridine

TMS; Tetramethylsilane

CMP; Cytidine 5' monophosphate

DCC; N,N-dicyclohexylcarbodiimide

Et3N; Triethylamine

Hex; Hexane

EA; Ethylacetate

본 발명의 화합물 1 내지 화합물 24의 구조, 명칭, 분자량은 표 1 내지 표 6과 같다.

[규칙 제91조에 의한 정정 05.10.2012]　
표 1

[규칙 제91조에 의한 정정 05.10.2012]　
표 2

[규칙 제91조에 의한 정정 05.10.2012]　
표 3

[규칙 제91조에 의한 정정 05.10.2012]　
표 4

[규칙 제91조에 의한 정정 05.10.2012]　
표 5

[규칙 제91조에 의한 정정 05.10.2012]　
표 6

이들 화합물의 제조 방법의 전형의 예로 실시예 1, 실시예 4, 실시예 7, 실시예 10, 실시예 13, 실시예 16, 실시예 19, 실시예 22, 실시예 25, 실시예 28의 화합물 제조 방법을 예시한다.

<실시예 1, 2, 3>

실시예 1은 화합물 1의 제조에 관한 것이며, 실시예 2와 3은 각각 화합물 2와 화합물 3의 제조방법에 관한 것으로서, 실시예 1과 동일한 방법이다.

FK506 (10 g)과 DMAP (4-Dimethylaminopyridine, 0.3 g)을 무수 MC (Methylene Chloride anhydride, 100 ml)에 녹인 후 Et3N (Triethylamine, 3.5 ml)를 넣고 교반하였다. 숙신산 무수물 (1.5 g)을 넣고 하룻밤 교반하였다. MC:MeOH(9:1)로 박막크로마토그래피 확인 후 반응이 끝나면 0.5 M 시트르산 수용액으로 반응액을 세척하였다. 이러한 반응액에 각각 화합물 1, 2, 3이 혼합되어 있으며, 실리카 컬럼 (Silica column)에 노말 헥산으로 충진한 후 노말 헥산:에틸아세테이트(1:1 → 0:1) 혼합용액과 MC:MeOH(9:1) 혼합용액을 차례로 전개하여 화합물 1, 화합물 2, 화합물 1과 화합물 2의 혼합물 또는 화합물 3을 얻었다.

<실시예 4, 5, 6>

실시예 4로 화합물 4를 만드는 방법을 설명하며, 실시예 5와 실시예 6의 화합물 5와 화합물 6은 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이때 화합물 5는 화합물 2가 포함된 화합물, 화합물 6은 화합물 3이 포함된 화합물로부터 제조할 수 있다.

실시예 1에서 제조되는 화합물 1이 포함된 혼합물을 무수 피리딘 (22 ml)에 녹인 후 DMAP (0.1 당량, 0.016 g)을 넣고 교반하였다. p-나이트로페닐 클로로포메이트 (p-nitrophenyl chloroformate, 1.5 당량, 0.398 g)을 넣고 1시간 교반하였다. 박막 크로마토그래피 (메틸렌 클로라이드:MeOH, 95:5)로 반응 확인 후 농축하였다. 메틸렌 클로라이드와 5% 시트르산 수용액으로 분획 후 유기층을 농축하였다. 밝은 노란색의 화합물 4를 얻었다.

<실시예 7, 8, 9>

실시예 7로 화합물 7을 만드는 방법을 설명하며, 실시예 8과 실시예 9의 화합물 8과 화합물 9는 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이하 공정을 나누어 설명한다.

제 1 공정: 중간체 화합물 6-MMTr 글루코오스 합성

35 ℃ 진공 오븐에서 3시간 건조한 글루코오스 (60 g)을 무수 피리딘 600 ml에 녹인 후 교반하였다. 약 10분간 교반 후 0 ℃에서 30분 정도 교반하였다. MMTr-Cl (1.1당량, 113.3 g)을 무수 메틸렌 클로라이드 150 ml에 녹여 반응액에 천천히 넣어주었다 (0 ℃). 상온에서 1시간 교반하였다. 박막 크로마토그래피 (MC : MeOH 9:1)로 전개하여 반응 종결을 확인하였다. 반응이 끝나면 반응액을 농축하였다. 메틸렌 클로라이드 800 ml와 증류수 800 ml로 분획 후 유기층을 농축하였다. 실리카 컬럼 (12 x 31 cm)를 메틸렌 클로라이드로 충진 후 MC : MeOH (98:2), MC : MeOH (95:5), MC : MeOH (9:1) 순으로 전개하여 연한 황토색의 화합물 6-MMTr 글루코오스 (74.5 g, 49.3%)를 얻었다.

제 2 공정: 중간체 화합물 6-MMTr 1-O-석시닐 글루코오스 합성

6-MMTr 글루코오스 (74.5 g)을 무수 메틸렌 클로라이드 740 ml에 녹인 후 교반하였다. 약 10분간 교반 후 무수 트리에틸렌아민 (2 당량, 46 ml)와 DMAP (0.2 당량, 4 g), 숙신산 무수물 (1.2 당량, 19.8 g)을 넣어주었다. 상온에서 2시간 교반하였다. 박막크로마토그래피 (MC : MeOH 5:1)로 전개하여 반응 종결을 확인하였다. 반응이 끝나면 반응액에 메틸렌 클로라이드 60 ml를 넣어준 후 10% 시트르산 수용액 800 ml로 분획하였다. 유기층 (MC)을 받아 Na₂SO₄ 처리 후 글라스 필터로 여과하였다. 여액을 농축한 후 고진공에서 밤새 건조하였다. 연한 황토색의 6-MMTr 1-O-석시닐 글루코오스가 얻어졌다 (95.9 g, 105.5%).

제 3 공정: 중간체 화합물 6-MMTr 2,3,4-트리테트라메틸실란 1-O-석시닐 글루코오스 합성

6-MMTr 1-O-석시닐 글루코오스 (46.78 g) 을 무수 메틸렌 클로라이드 230 ml에 녹였다. 무수 피리딘 230 ml를 넣은 후 교반하였다. 0 ℃에서 약 15~20분간 교반하였다. TMS-Cl (6 당량, 64.2 ml)를 천천히 넣어주었다(0 ℃). 0 ℃에서 약 20~30분 교반 후 상온에서 1~2시간 교반하였다. TLC (MC : MeOH 9:1)로 전개하여 반응 종결을 확인하였다. 반응액에 메틸렌 클로라이드 570 ml를 넣어준 후 5% NaHCO₃ 수용액 800 ml로 분획하였다. 이때 유기층 (MC)의 pH가 6~7이 되었는지 확인하였다. pH 확인 후 유기층을 받아 Na₂SO₄ 처리하였다. 글라스 필터로 여과한 후 여액을 농축하였다. 실리카 컬럼 (8 x 36 cm)을 헥산으로 충진한 후 헥산:에틸아세테이트 (5 : 1 ~ 2 : 1)의 순으로 전개하여 연노란색의 6-MMTr 2,3,4-트리테트라메틸실란 1-O-석시닐 글루코오스를 얻었다 (23.34g, 35.8%).

제 4 공정: 중간체 화합물 FK506-LS-글루코오스 (6-MMTr, 2,3,4-tri TMS)의 합성

이때

인 경우 FK506-M32-LS-glc(6-MMTr, 2,3,4-tri TMS)이며,

인 경우 FK506-M24-LS-glc(6-MMTr, 2,3,4-tri TMS)이고,

인 경우 FK506-D-LS-glc(6-MMTr, 2,3,4-tri TMS)이다.

충분히 건조된 FK506 (12 g)을 무수 메틸렌 클로라이드 120 ml에 녹인 후 교반하였다. 약 10분간 교반 후 DMAP (1.5 당량, 4.6 g), DCC (1.5 당량, 2.7 g)을 넣고 0 ℃에서 15~20분간 교반 하였다. 공정 3에서 만든 6-MMTr 2,3,4-tri TMS 1-O-석시닐 글루코오스 (2 당량, 23g)을 무수 메틸렌 클로라이드 120 ml에 녹여 0 ℃에서 천천히 넣어주었다. 상온에서 3~4시간 교반 반응하면서, TLC (MC : MeOH 95 : 5)로 전개하여 반응을 확인하였다. 반응액에 메틸렌 클로라이드 260 ml를 넣어준 후 10% 시트르산 수용액 500 ml로 분획하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 처리 후 글라스 필터로 여과한 후 여액을 농축하였다. 농축액을 메틸렌 클로라이드 용매 하에 충진한 실리카 컬럼 (8 x 36 cm)에 로딩한 후 MC : MeOH (99 : 1), MC : MeOH (99 :1) + (98 : 2)로 차례로 전개하여 연노란색의 혼합물 FK506-LS-glc (6-MMTr, 2,3,4-tri TMS)을 얻었다 (18.52g, 79.9%).

제 5 공정: FK506-M32-LS-glc의 합성

제 4 공정에서 만든 화합물을 (18.52g)을 MeOH 120 ml에 녹인 후 교반하였다. 초산 420 ml를 넣고 밤새 상온에서 교반하였다. TLC (MC : MeOH 9 : 1)로 전개하여 반응 종결을 확인한 후 농축하였다. 에탄올을 넣고 진공 농축을 2~3번 반복하였다. 농축액을 메틸렌 클로라이드 용매 하에 충진한 실리카 컬럼 (8 x 27 cm)에 로딩하여 MC : MeOH (99 : 1), (98 : 2), (95 : 5), (92 : 8)의 순으로 순차적으로 전개하여 연한 노란색의 FK506-M32-LS-glc를 얻었다 (5.14g, 40.4%).

<실시예 10, 11, 12>

실시예 10을 들어 화합물 10을 만드는 방법을 설명하며, 실시예 11과 실시예 12의 화합물 11과 화합물 12는 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이때 실시예 11에서는 화합물 8을, 실시예 12에서는 화합물 9를 반응 시료로 사용하였다.

화합물(7), FK506-M32-LS-glc의 글루코오스의 4번 위치에 갈락토오스를 전이시켜 주는 1,4 갈락토실트랜스퍼레이즈 (galactosyltransferase; LgtB)를 사용하여 FK506-M32-LS-Lac을 합성하였다.

반응기에 MgCl₂6H₂O 4.06 g, UDP-D-갈락토오스 12 g 그리고 Tris HCl 완충액 (pH 7.5)을 25~50 mM이 되도록 넣고, 부피가 2.4 ℓ가 되도록 증류수로 조절하였다. 1,4 갈락토실트랜스퍼레이즈를 넣어 반응을 준비하였다. 반응 출발물질인 FK506-M32-LS-Glc 4.3 g을 DMSO 1.2 ℓ로 잘 녹인 후 반응기에 천천히 주입하여 반응을 개시하였다. 반응 조건인 pH 7.5와 37 ℃를 유지시켜주며, 전환되는 정도를 HPLC 분석으로 확인하여 90% 정도의 전환률에서 반응을 종료하였다. 반응액 (4.3 g, 약 4 ℓ)를 에틸아세테이트 4 ℓ로 2회 추출하여FK506-M32-LS-Lac을 회수하였다. 에틸아세테이트 층을 농축하였으며 농축액에는 DMSO가 포함되어 있었으며, 이를 메틸렌 클로라이드 용매 조건으로 충진된 실리카 컬럼 (4 x 26 cm)에 로딩하여 DMSO를 제거하였고, MC:MeOH (10 : 1), (8 : 1), (6 : 1), (5 : 1)로 전개하여 연한 노란색의 FK506-M32-LS-Lac, 화합물 10을 얻었다 (1.49 g, 30%).

<실시예 13, 14, 15>

실시예 13을 들어 화합물 13의 제조방법을 설명하며, 실시예 14와 실시예 15의 화합물 14와 화합물 15는 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이때 실시예 13의 화합물 10 대신 실시예 14에서는 화합물 11을, 실시예 15에서는 화합물 12를 반응 시료로 사용하였다.

실시예 10에서 만들어진 화합물 10 FK506-M32-LS-Lac의 갈락토오스에 시알산을 전이시켜 주는 시알릴트랜스퍼레이즈 (sialyltransferase, SialT)를 이용하여 FK506-M32-LS-Lac와 CMP-시알산 전구체로부터 시알산이 부가된 화합물 13인 FK506-M32-LS-SL를 합성하였다.

반응기의 CMP-시알산 (purity approx. 60%) 4.2 g 그리고 Tris HCl 완충액 (pH 7.5)를 25~50 mM이 되도록 넣고 증류수로 1.4 ℓ가 되도록 부피를 조절하였다. 반응 출발물질인 FK506-M32-LS-Lac 대략 3 g을 DMSO 0.4 ℓ로 잘 녹인 후 반응기에 천천히 첨가하였다. 불투명한 반응액에 α2,3 시알릴트랜스퍼레이즈를 넣어 반응을 시작하고 반응은 상온에서 진행하였다. 반응 조건인 pH 7.5를 유지시켜주며, HPLC 분석을 통하여 전환되는 정도를 확인하였다. 90% 정도의 전환률을 보일 때 MeOH 동량 (2 ℓ)를 넣어 반응을 종료하였다. 반응 종료 후 반응액을 농축하였다. 반응액 (약 1.2 ℓ)를 에틸아세테이트 1.2 ℓ로 추출하여 반응 중 남아 있는 FK506-M32-LS-Lac를 제거하였다. 추출은 같은 방법으로 2번 반복한다. 화합물 13, 즉 FK506-M32-LS-SL이 반응액 층에서 확인되었다. 반응액 층은 EtOH를 넣어 감압건조하여 농축하였다. 농축에는 잔류 DMSO가 있었으며, MC로 충진한 실리카 컬럼 (8 x 33 cm)에서 전개하였다. DMSO가 어느 정도 제거 되면 MC : MeOH (2 : 1)로 전개하여 노란색 오일 형태의 화합물 13, FK506-M32-LS-SL를 얻었다. 순도를 높이기 위하여 Prep-HPLC을 이용하여 추가적으로 정제를 진행하였다. 추가로 고순도 정제를 위해 역상 컬럼 (Reverse phase column, 50 x 500 mm)에 완충액 (A), 정제수; (B), 아세토나이트릴로 시간별 변화를 주면서 정제를 수행하였다. 감압건조 및 동결건조기로 건조하여 최종 회수하였다 (1.1 g, 29.5%).

<실시예 16, 17, 18>

실시예 16에서 화합물 16의 제조방법을 설명하며, 실시예 17과 실시예 18은 각각 화합물 17과 화합물 18의 제조방법으로서, 실시예 16과 방법은 동일하며, 각기 반응 시료가 다르다. 즉, 화합물 4를 대신하여 실시예 17에서는 화합물 5를, 실시예 18에서는 화합물 6을 반응 시료로 사용하였다.

이하 공정을 나누어 설명한다.

공정 1: 중간체 화합물 MMTr-아미노-헥사놀 합성

진공건조기에서 40 ℃로 2시간 동안 건조시킨 6-아미노-1-헥사놀 3 g에 메틸렌 클로라이드 무수물 50 ml를 넣고 마개로 입구를 막고 아르곤 풍선을 꽂은 뒤 녹여주었다. 건조된 트리에틸렌아민 (2 당량 7.14 ml)와 MMTr-Cl (1.1 당량 8.7 g)을 넣고 3시간 정도 교반하였다. TLC 조건(n-Hex:EA=1:1)에서 닌히드린 발색시약으로 반응을 확인하였다. 반응이 끝나면 메틸렌 클로라이드와 5% NaHCO₃를 넣고 층 분리시키고 TLC 확인 후 메틸렌 클로라이드층을 Na₂SO₄로 처리하고 글라스 필터로 여과하였다. 유기용매층을 농축한 후 실리카 컬럼 (5.5 × 25 cm)으로 정제하였다. 정제 조건은 n-Hex:에틸렌아민 (5:1)로 충진 후 2.4 ℓ 전개, n-Hex:EA (3:1) 1.6 ℓ, 그리고n-Hex:EA (2:1) 1.8 ℓ로 순차적으로 전개하였다. 얻어진 분획을 농축한 후 진공건조기에서 하룻밤 건조시켜 MMTr-아미노-헥사놀을 얻었다 (9.29 g, 93%).

공정 2: 중간체 MMTr 1-O-아미노헥실 l 2,3,4,6-테트라 아세틸 글루코오스 합성

아세틸 브로모 글루코오스 3.1 g에 자석막대와 분자체 (molecular sieve), Ag₂CO₃6.2 g를 넣고 진공 오븐에서 40 ℃로 2시간 동안 건조시켰다. 메틸렌 클로라이드 무수물 31 ml를 넣은 후 마개로 입구를 막고 아르곤 풍선을 꽂은 후 교반하였다. MMTr-아미노-헥사놀 8.81 g 을 넣고 하룻밤 교반하였다. 반응물을 소량 가수분해해서 TLC 조건 (n-Hex:EA=1:2)에서 반응을 확인하였다. 반응이 끝나면 글라스 필터로 여과하였다. 메틸렌 클로라이드와 5% NaHCO₃를 넣고 층 분리시키고 TLC 확인 후 메틸렌 클로라이드 층을 Na₂SO₄로 처리하고 글라스 필터로 여과후 농축하여, MMTr 1-O-아미노헥실 2,3,4,6-테트라 아세틸 글루코오스를 만들었다 (10.14g).

공정 3: 중간체 MMTr 1-O-아미노헥실 글루코오스의 합성

MMTr 1-O-아미노헥실 2,3,4,6-테트라 아세틸 글루코오스 (10.14 g)에 메탄올 89.5 ml와 1 M NaOH 89.5 ml를 넣고 1시간 정도 교반하였다. TLC 조건 (n-Hex:EA=1:2)와 (MC: MeOH=9:1)으로 반응을 확인하고 반응이 끝나면 농축하였다. 에틸렌아민과 증류수를 넣고 층 분리시키고 TLC 확인 후 에틸렌아민 층을 Na₂SO₄처리 후 글라스 필터로 여과하였다. 여액을 농축한 후 실리카 컬럼으로 정제하였다. 정제 조건은 MC:MeOH (95:5) 충진 후 전개한 다음 MC:MeOH (9:1)로 전개하였다. 얻어진 분획을 농축한 후 진공 오븐에서 밤새 건조시켜 MMTr 1-O-아미노헥실 글루코오스를 얻었다 (1.57 g, 39.5%).

공정 4: 중간체 1-O-아미노헥실 글루코오스의 합성

공정 3에서 제조한 MMTr 1-O-아미노헥실 글루코오스 (1.55g)에 MeOH 64.65 ml와 초산 432.36 ml를 넣고 8시간 정도 교반하였다. TLC 조건 (n-pro:NH₄OH=6:10)에서 반응을 확인하였다. 농축 후 메틸렌 클로라이드와 물로 층 분리시키고 TLC 확인 후 물층을 농축하여 1-O-아미노헥실 글루코오스를 얻었다 (1.04 g, 100%).

공정 5: FK506-M-LA-Glc 합성

실시예 4에서 제조된 화합물 4, FK506-M32-LA (1.406 g)를 무수 피리딘 (10 ml)과 트리에탄올아민 (10 당량, 1.833 ml)에 녹인 후 1-O-아미노헥실 글루코오스 (1.5 당량, 0.551 g)을 넣고 교반하였다. 밤샘 반응 후 TLC (메틸렌 클로라이드:MeOH 5:1)로 반응을 확인한 후 실리카 컬럼 (4.5x24 cm) MC:MeOH (9:1, 8:1, 6:1)으로 전개하여 혼합 상태의 산물을 얻었다. 이후 Prep HPLC 정제를 통하여 혼합물을 분리하여 화합물 16, FK506-M32-LA-Glc를 얻었다 (1.113 g).

<실시예 19, 20, 21>

실시예 19에서 화합물 19 제조 방법을 설명하며, 실시예 20과 실시예 21의 화합물 20과 화합물 21은 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이때 화합물 16 대신 실시예 20에서는 화합물 17을, 실시예 21에서는 화합물 18을 반응 시료로 사용하였다.

실시예 16에 의해 합성된 화합물 16, FK506-M-LA-glc에 글라이코실트랜스퍼레이즈 중 UDP-갈락토오스 전구체로부터 글루코오스의 4번 위치에 갈락토오스를 전이시켜 주는 1,4 갈락토실트랜스퍼레이즈 (LgtB)를 사용하여 화합물 19 FK506-M-LA-Lac를 합성하였다.

반응기의 증류수 20 ml에 UDP-D-갈락토오스 0.15 g, MgCl₂6H₂O 그리고 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5)을 25~50 mM이 되도록 넣고 기질들을 잘 녹인 후 pH 7.5가 되도록 보정하였다. 이 액에 1,4 갈락토실트랜스퍼레이즈를 넣고, FK506-M-LA-Lac 0.13 g을 DMSO 13 ml로 잘 녹인 후 반응기에 천천히 투입한다. 반응 조건인 pH 7.5를 유지시켜 주며 37 ℃에서 반응하면서, 전환되는 정도를 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 90% 이상의 전환률을 보일때 반응을 종료하고 Prep-HPLC를 이용하여 반응산물인 화합물 19, FK506-M32-LA-Lac를 정제하였다. 정제 조건은 역상 컬럼 (50 x 500 mm)에 완충액 (A), 증류수; (B), 아세토나이트릴로 시간별 변화를 주면서 정제하였으며, 활성분획을 진공감압건조기 및 동결건조기를 이용하여 건조하여 화합물 19, FK506-M32-LA-Lac를 얻었다 (0.016g).

<실시예 22, 23, 24>

실시예 22에서 화합물 19를 만드는 방법을 설명하며, 실시예 23과 실시예 24의 화합물 20과 화합물 21은 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이때 화합물 4 대신 실시예 23에서는 화합물 5를, 실시예 24에서는 화합물 6을 반응 시료로 사용하였다.

이하 공정을 나누어 설명한다.

공정 1: MMTr-1-O-아미노헥실 2,3,6,2'3'4'6'-헵타 아세틸 락토오스 합성

아세틸 브로모 락토오스 45 g에 자석 막대와 분자체, Ag₂CO₃35.5 g를 넣고 진공건조기에서 40 ℃로 2시간동안 건조시켰다. 무수 메틸렌 클로라이드 450 ml를 넣은 후 마개로 입구를 막고 아르곤 풍선을 꽂은 후 교반하였다. MMTr-아미노-헥사놀 30 g을 넣고 하룻밤 교반하였다. TLC 조건 (n-Hex:EA=1:2)에서 출발물질과 반응물의 위치가 같으므로 소량 가수분해해서 반응을 확인하였다. 반응이 끝나면 글라스 필터로 여과하였다. 메틸렌 클로라이드와 5% NaHCO₃를 넣고 층 분리시키고 TLC 확인 후 메틸렌 클로라이드 층을 Na₂SO₄로 처리한 다음 글라스 필터로 여과하여 농축하였다. 이를 통해 MMTr-1-O-아미노헥실 2,3,6,2'3'4'6'-헵타 아세틸 락토오스를 얻었다 (60g).

공정 2: MMTr-1-O-아미노헥실 락토오스 합성

MMTr-1-O-아미노헥실 2,3,6,2'3'4'6'-헵타 아세틸 락토오스 (60g)에 MeOH 최소량과 1M NaOH 457.5 ml를 넣고 1시간 정도 교반하면서 반응하였으며, TLC 조건 (n-Hex:EA=1:2)와 (MC:MeOH=9:1)으로 반응을 확인하고, 반응이 끝나면 농축하였다. 에틸렌아민과 증류수를 넣고 층 분리시키고 TLC로 확인한 다음 에틸렌아민 층을 Na₂SO₄처리하고 글라스 필터로 여과하였다. 여액을 농축한 후 실리카 컬럼에 로딩, 정제하였다. 정제 조건은 MC:MeOH (95:5) 충진 후 MC:MeOH (9:1)로 전개하였다. 얻어진 유효성분을 농축한 후 진공건조기에서 하룻밤 건조시켜 MMTr-1-O-아미노헥실 락토오스를 얻었다 (32g).

공정 3: 1-O-아미노헥실 락토오스 합성

MMTr-1-O-아미노헥실 락토오스 (32 g)에 MeOH 최소량과 초산 1.1 ℓ를 넣고 8시간 정도 교반하면서 반응하였다. TLC 조건 (메틸렌 클로라이드:MeOH=2:1)으로 반응을 확인하고 반응물을 농축한 후 메틸렌 클로라이드와 물로 층 분리시켜 물층을 회수, 농축하였다. 이를 건조하여 1-O-아미노헥실 락토오스를 얻었다 (5.3 g).

공정 4: FK506-LA-Lac의 합성

실시예 4로 확보한 화합물 4, FK506-M32-LA (1.8 g)를 무수 피리딘 (70 ml)과 트리에탄올아민 (10 당량, 2.3 ml)에 녹인 후 1-O-아미노헥실 락토오스 (1.2 당량, 0.89 g)을 넣고 교반하였다. 하룻밤 반응 후 TLC (M.C.:MeOH 5:1)로 반응을 확인하고 실리카 컬럼에서 메틸렌 클로라이드:MeOH (9:1, 8:1, 5:1)로 전개하여 화합물 16, FK506-M32-LA-Lac을 얻었다 (1.5 g).

<실시예 25, 26, 27>

실시예 25에서 화합물 22 제조 방법을 설명하며, 실시예 26과 실시예 27의 화합물 23과 화합물 24는 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이때 화합물 19 대신 실시예 26에서는 화합물 20을, 실시예 27에서는 화합물 21을 반응 시료로 사용하였다.

실시예 19 또는 실시예 22에 의하여 제조된 화합물 19, FK506-M32-LA-Lac의 갈락토오스에 시알산을 전이시켜 주는 시알릴트랜스퍼레이즈 (SialT)를 이용하여 FK506-M-LA-Lac와 CMP-시알산 전구체로부터 시알산이 부가된 화합물 22, FK506-M32-LA-SL를 합성하였다.

반응기에 CMP-시알산 1.52 g 그리고 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5)을 25~50 mM이 되도록 증류수 0.47 ℓ에 잘 녹인 후 pH 7.5가 되도록 보정하였다. 반응액에 a2,3 시알릴트랜스퍼레이즈를 넣고 반응 출발물질인 FK506-M32-LA-Lac 1.35 g을 DMSO 25 ml로 잘 녹인 후 반응기에 천천히 한 방울씩 투입하면서 반응시켰다. 반응은 실온에서 pH 7.5를 유지시켜주면서 실시하였고, HPLC 분석으로 전환되는 정도를 확인하였다. 90% 이상의 전환률을 보일 때 MeOH 동량 (0.5 ℓ)을 넣어 반응을 종료시킨 후 감압건조기를 이용하여 반응액을 농축하였다. 농축액을 메틸렌 클로라이드로 충진된 실리카 컬럼 (8 x 33cm)에 로딩하여 100% MC로 충분히 전개하여 DMSO를 제거하였다. DMSO가 어느 정도 제거되면 MC:MeOH (2:1)로 전개하여 노란색 오일 형태의 FK506-M32-LA-SL를 얻었다. 순도를 높이기 위하여 Prep-HPLC를 이용하여 추가적으로 정제시켰다. 정제 조건은 역상 컬럼 (50 x 500 mm)에 완충액 (A), 0.01% TFA; (B), 아세토나이트릴의 용매로 시간별 변화를 주면서 정제를 수행하였다. 최종 반응 산물인 화합물 22, FK506-M32-LA-SL 분획을 진공건조기와 감압동결건조기를 이용하여 건조하였다 (0.5 g).

<실시예 28, 29, 30>

실시예 28에 화합물 22 제조 방법을 설명하며, 실시예 29와 실시예 30의 화합물 23과 화합물 24는 이와 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 이때 화합물 4 대신 실시예 29에서는 화합물 5를, 실시예 30에서는 화합물 6을 반응 시료로 이용하였다.

이하 공정을 나누어 설명한다.

공정 1:1-O-아미노헥실 3'-시알릴 락토오스의 합성

반응기에 실시예 22의 공정 3 단계에서 만들어진 1-O-아미노헥실 락토오스 2.6 g과 CMP-시알산 5.76 g 그리고 트리스 HCl 완충액 (pH 7.5)을 25~50mM이 되도록 넣고 증류수 0.11 ℓ에 잘 녹인 후 pH 7.5가 되도록 보정하였다. 여기에 a2,3 시알릴트랜스퍼레이즈를 넣어 반응을 시작하였다. 반응은 상온에서 pH 7.5를 유지시켜주면서 진행하고, TLC 분석을 통하여 90% 이상의 전환률을 보일 때 반응을 종료하였다. 메탄올 동량 (0.12 ℓ)을 넣어 반응을 종료한 후 원심분리하여 고형분을 제거하고 진공 농축방법으로 메탄올을 제거하여 농축하였다. 농축된 반응액을 이온교환수지가 충진된 컬럼 (Acros, DoweX 1x2, 50~100mesh, 5 x 45 cm)에 로딩하여 용출용액의 NaCl 농도를 순차적으로 변화시켜 반응산물을 분리하였다. 그후 크기 배제 수지 (exclusion resin)가 충진된 컬럼 (Bio-RAD, Bio-Gel P2 gel, 5 x 100 cm)을 이용하여 순도가 높은 1-O-아미노헥실 3'-시알릴락토오스를 정제하였다 (2 g).

공정 2: FK506-M32-LA-SL의 합성

실시예 4와 같이 제조한 화합물 4, FK506-M32-LA (0.94 g)를 무수 피리딘 (70 ml)과 트리에탄올아민 (10 당량, 1.2 ml)에 녹인 후 공정 1에서 확보한 1-O-아미노헥실 3'-시알릴락토오스 (1.2 당량, 0.776g)을 넣고 교반하였다. 하룻밤 반응 후 TLC (MC:MeOH 3:1)로 반응을 확인한 다음 실리카 컬럼에 로딩하였다. MC:MeOH (5:1, 2:1)로 전개하여 화합물 22, FK506-M32-LA-SL를 얻었다 (1.24g).

<분석예 1: 타크롤리무스 당화 유도체의 용해도 분석>

상기 실시예에 의하여 제조된 타크롤리무스 당화 유도체들의 수용액상에서 용해도를 측정하고 비교하기 위하여 FK506 (타크롤리무스) 표준품의 무게 대비 HPLC (UV)의 영역 (A)에 대한 보정곡선 (Calibration curve)을 작성하고 상대적인 수용성을 확인하였다. 일정량의 증류수에 각각의 시료를 과포화 상태로 녹인 후 37 ℃ 항온수조에서 30분간 방치하고 상등액을 HPLC 분석법으로 분석하여 UV 파장 260 nM에서 나타나는 피크의 면적 (A)을 구하고, 수용액상에 녹아 있는 화합물의 양을 구하였다. 그 결과, FK506의 용해도를 1이라고 할 때 FK506-M32-LA-glc의 용해도는 11, FK506-M32-LA-Lac은 160, FK506-M32-LA-SL은 >5000, FK506-D-LA-SL은 >5000, FK506-D-LA-glc는 >5000, FK506-D-LA-Lac은 >5000, 그리고 FK506-M32-LS-glc는 2.5, FK506-M32-LS-Lac은 76.3, FK506-M32-LS-SL은 >10000과 같은 높은 용해도를 보였다.

<분석예 2-1: 타크롤리무스 당화 유도체의 약효 검증>

실시예에서 합성한 12 개의 타크롤리무스 당화 유도체 화합물의 유용성을 파악하기 위하여 인비트로 세포 기반 분석 (in-vitro cell based assay)을 실시하였다.

C57BL/6 마우스 (자성, 6주령)로부터 비장을 적출한 후 페트리디쉬에 놓고 시린지 플러그를 이용하여 비장 세포를 유리하였다. 세포를 포함한 현탁액을 15 ml 튜브에 옮겨 5분간 방치한 후 상층액을 취하여 원심분리하여 세포 침전물을 10% FBS (Hyclone, Logan, UT, USA)가 첨가된 RPMI 완전 배지 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 재현탁하여 비장림프구 (splenocyte)를 준비하였다. 비장림프구를 1 X 10⁶ cells/ml의 농도로 조절한 후 96-웰 플레이트에 각 웰당 200 ㎕씩 분주하였다. 평가하고자 하는 시료를 처리한 후 1시간 후에 콘카나발린 A (1 ㎍/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 처리하고 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 3일간 배양하였다. 마지막 18시간 동안은 각 웰당 1 μCi의 [3H] 티미딘을 첨가하였으며, 자동 세포 수집장치 (Inotech, Dottikon, Switzerland)를 이용하여 세포를 수거한 후 Wallac Microbeta 신틸레이션 계수기 (Wallac, Turku, Finland)를 이용하여 DNA에 삽입된 [3H] 티미딘의 양을 측정하였다.

이 실험에 사용된 시료는 FK506, FK506-M32-LS (화합물 1), FK506-D-LS (화합물 3), FK506-M32-LS-Glc (화합물 7), FK506-M32-LS-Lac (화합물 10), FK506-M32-LS-SL (화합물 13), FK506-M32-LA-Glc (화합물 16), FK506-M24-LA-Glc (화합물 17), FK506-M32-LA-Lac (화합물 19), FK506-M24-LA-Lac (화합물 20), FK506-M32-LA-SL (화합물 22), FK506-M24-LA-SL (화합물 23)이다. 실험은 다양한 농도 조건(pM ~ nM 수준)에서 수행하였으며 그 결과는 도 2a, b, c에 나타내었다.

활성 측정 결과 FK506의 면역억제 활성은 IC₅₀값이 1-10 pM 영역으로 매우 강력함을 확인할 수 있었다. 이러한 강력한 활성에 비해 본 발명의 FK506 당화 유도체들은 1-100 nM 수준의 활성을 보여 FK506보다는 낮지만 면역 억제활성이 상당 정도 유지됨을 확인할 수 있었다. 이는 FK506과 같은 기작으로 활성을 나타내는 것으로 보고된 사이클로스포린 A (CsA)의 활성에 비견할 만한 높은 면역억제활성이다. 아미노헥실 링커 (Aminohexyl linker)가 붙은 것이 석시닐 링커 (succinyl linker)를 사용한 것보다 좀더 활성이 크고, 24-OH 위치에 당이 수식된 것보다 32-OH 위치에 당이 부착된 것이 조금 더 큰 활성을 보이고 있으나, 그 차이가 크지는 않았다. 특히, 당의 첨가 정도에 따라 활성의 감소에 있어서 큰 차이를 나타내지 않았다. 시알릴락토오스 (siallylactose)가 부착된 경우 당쇄의 증가에 의해 수용성이 10,000배 이상 향상되었으며, 면역 억제활성 또한 상당히 유지됨을 확인할 수 있었다 (도 2a, 2b, 2c).

<분석예 2-2: 면역억제 활성 확인>

본 발명의 타크롤리무스 당화 유도체인 FK506-M32-LA-Glc (화합물 16), FK506-M32-LA-Lac (화합물 19), FK506-M32-LA-SL (화합물 22)와 레스타시스^TM의 약효 성분인 사이클로스포린 A의 면역억제 활성을 인비트로 세포 기반 측정법 (in-vitro cell based assay)을 실시하여 비교하였다. 타크롤리무스 당화 유도체인 FK506-M32-LA-Glc (화합물 16), FK506-M32-LA-Lac (화합물 19), FK506-M32-LA-SL (화합물 22)을 합성하였고, 순도는 약 95% 수준이었다. 사이클로스포린 A는 98% 이상의 순도로 구매하여 사용하였다.

C57BL/6 마우스(암컷, 6주령)로부터 비장을 적출한 후 페트리 디쉬에 놓고 시린지 플러그 (syringe plug)를 이용하여 비장 세포를 유리하였다. 세포를 포함한 현탁액을 15 ㎖ 코니칼 튜브에 옮겨 5분간 방치한 후 상층액을 취하여 원심분리한 다음 세포 펠렛을 10% FBS (Hyclone, Logan, UT, USA)가 첨가된 RPMI 완전배지 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 재현탁하여 비장림프구 세포 (splenocyte)를 준비하였다. 비장림프구 세포를 1 X 10⁶ cells/ml의 농도로 조절한 후 96-웰 플레이트에 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하였다. 평가하고자 하는 시료를 처리하고 1시간 후에 콘카나발린 A (1 ㎍/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 처리하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양하였다. 마지막 18시간 동안은 각 웰 당 1 μCi의 [³H] 티미딘 (thymidine)을 첨가하였으며, 자동 세포 수거기 (automated cell harvester, Inotech, Dottikon, Switzerland)를 이용하여 세포를 수거한 후 Wallac Microbeta scintillation counter (Wallac, Turku, Finland)를 이용하여 DNA에 삽입된 [³H] 티미딘의 양을 측정하였다.

실험은 다양한 농도 조건(pM ~ nM 수준)에서 수행하였으며 면역활성을 나타내는 범위를 측정하였다. 결과는 도 2d에 나타내었다.

면역억제 활성의 측정 결과 FK506-M32-LA-Glc (화합물 16)은 EC₅₀ (median effective concentration, 반수유효농도) 37.31 nM, FK506-M32-LA-Lac (화합물 19)의 EC₅₀ 53.17 nM, FK506-M32-LA-SL (화합물 22) EC₅₀ 36.46 nM 로 측정되었다. 이는 사이클로스포린 A EC₅₀ 211.6 nM에 비해 약 4 내지 5배 면역억제 활성이 강함을 보여주는 것이다.

<분석예 4: 독성 시험>

본 발명의 타크롤리무스 당화 유도체 화합물 16과 화합물 22는 상기 실시예에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 제조한 화합물의 순도는 약 95%였다.

이들 화합물을 특정 병원체 부재(SPF) 마우스, Hsd:ICR(CD-1®)을 사용하였다. 화합물 22는 각각 0 mg/kg (부형제 대조군), 100 mg/kg, 200 mg/kg, 400 mg/kg을 사용하고, 화합물 16은 37.5 mg/kg, 75 mg/kg, 150 mg/kg을 사용하여 독성을 관찰하였다. 각 화합물의 투여 농도 군당 10 마리 (암수 각 5 마리)에 단회 정맥투여한 후 2 주간 사망률, 일반증상, 체중 및 부검소견을 관찰하였다. 그 결과, 화합물 22의 반수 치사량 (median lethal dose, LD₅₀)은 수컷 365.19 mg/kg, 암컷 297.39 mg/kg으로 산출되었다. 화합물 16의 LD₅₀은 수컷 110.5 mg/kg, 암컷 88.0 mg/kg으로 산출되었다. 이는 안과용 약물로 개발된 기존의 면역억제제의 독성(타크롤리무스의 LD₅₀는 수컷 57.0 mg/kg 암컷 23.6 mg/kg; rat 정맥투여)에 비해 현저히 낮은 독성이었다.

<실시예 31: 타크롤리무스 당화 유도체 화합물을 포함하는 조성물 및 이의 조제>

표 7

성분 조성물	P	A	B	C	D	E	F
FK506, FK506-M32-LA-GLC(6),FK506-M32-LA-SL(22) 중 하나를 선택 (mg)	0	5	5	5	5	5	5
글리세린(mg)	100	100	100	100	-	220	220
폴리에틸렌 글리콜 400 (mg)	-	-	-	-	100	-	-
미글리올 812N (mg)	-	-	-	-	-	62.5	-
피마자유 (mg)	-	-	-	-	-		62.5
카보머 1342 (mg)	-	-	-	-	-	5	5
폴리소르베이트 80 (mg)	100	100	200	100	100	100	100
카르복시메틸셀룰로오스 소듐 (mg)	50	50	50	50	50	-	-
D-만니돌 (mg)	50	50	50	50	50	-	-
소듐 시트레이트 다이하이드레이트 (mg)	40	40	40	40	40	-	-
소듐 보레이트 데카하이드레이트 (mg)	41	41	41	41	41	-	-
붕산 (mg)	25	25	25	25	25	-	-
포타슘 클로라이드 (mg)	14	14	14	14	14	-	-
키토산 (mg)	-	-	-	100	-	-	-
수산화나트륨(0.1N) 수용액	-	-	-	-	-	적량	적량
정제수(ml)	10	10	10	10	10	10	10

조성물 A, B, C, D, E, F 는 하기의 방법과 순서에 따라 조제하였다.

조성물 A, B, C, D 제조 방법

1. 용기 크기의 약 50 내지 90%의 정제수를 적당한 비커 또는 용기에 담았다.

2. 교반기를 이용하여 물을 교반하기 시작하여 강력한 와류를 얻었다.

3. 칭량한 카르복시메틸셀룰로오스 소듐을 강력한 와류에 소량씩 첨가한다. 적어도 3시간 동안 계속해서 강하게 교반하였다.

4. 교반기 속력을 늦추었다.

5. 칭량한 폴리소르베이트 80을 첨가하고 용해했다.

6. 칭량한 글리세린을 첨가하고 용해했다.

7. 칭량한 만니톨을 첨가하고 용해했다.

8. 칭량한 소듐 시트레이트 다이하이드레이트를 첨가하고 용해했다.

9. 칭량한 붕산을 첨가하고 용해했다.

10. 칭량한 소듐 보레이트 데카하이드레이트를 첨가하고 용해했다.

11. 칭량한 포타슘 클로라이드를 첨가하고 용해했다.

12. 칭량한 벤잘코늄 염화물을 첨가하고 용해했다.

14. 최중 부피를 얻기에 충분한 양의 정제수를 가했다.

15. 칭량한 FK506, FK506-M32-LA-GLC 또는 FK506-M32-LA-SL-2을 첨가하고 용해시켰다. 거품이 나지 않도록 느린속도로 교반하며 완전히 용해되도록 혼합하는 데는 24시간이 걸린다.

16. 혼합을 완료한 후, 타크롤리무스 용액을 13 mm 시린지 필터(13mm syringe filter)를 통해 필터하고 여과액을 무균적으로 수집하였다.

조성물 E, F 제조 방법

1. 칭량된 카보머 1342와 글리세린을 60 ℃로 가열된 정제수에 넣고 혼합했다.

2. 칭량된 약물과 폴리소르베이트 80을 60로 가열된 미글리올 812N 또는 피마자유에 넣고 교반했다.

3. 1의 용액에 거품이 생기지 않도록 교반하면서 2의 용액을 소량씩 넣으면서 정제수에 분산시켰다.

4. 혼합을 완료한 후 0.1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH와 점도를 조정하였다.

5. 타크롤리무스 용액을 제균 필터로 여과하여 여과액을 무균적으로 수집하였다.

<시험예 1: 점안제의 pH 값>

점안제의 pH는 안구에 대한 적합성을 나타내므로 pH 허용범위에 포함되어야 하며, 시간이 지남에 따라 pH의 변화가 적어 환자가 투약했을 때 생활에 불편함이 없어야 한다. 조제된 조성물 A 내지 F를 조제 직후 pH 측정기 (Mettler-Toledo AG, CH-8603, schwerzanbach, switzerland)로 pH를 측정하고 점안제의 허용 pH 6.5~7.6에 포함되는 것을 확인하였다 (도 3).

<시험예 2: 점안제의 안정성>

실시예 1의 시험예 A 내지 D에 따른 제제의 약물 함량을 측정, 비교하였다. 처방된 제제의 각 약물 함량을 정제수에 희석하여 0.45 um 시린지 필터 후 액체크로마토그래피 측정법으로 각 유효성분의 함량을 측정하였다. 안구점안제의 안정성은 약효 성분이 제형에 오래 남아있고 변화가 없도록 유지하여 환자가 투약할 때까지 약효가 유지되어야 한다. 각 제조된 점안제를 10 ㎖씩 튜브에 담아 5±3 ℃에서 보관하였다. 각 제제를 제조 직후, 1주, 2주, 3주, 8주, 12주 후 1 ㎖씩을 취하여 분석하였다. 그 결과, 조성물 A 및 B의 제제가 공통적으로 안정성을 유지하고 있는 것을 관찰하였다 (도 4).

<시험예 3: 안질환 치료 효능>

안질환 모델은 알러지성 각결막염 마우스 모델을 이용하여 본 발명 조성물의 치료 효능을 평가하였다. 이때 대조구로 레스타시스^TM(0.05% 사이클로스포린 A)를 사용하여 효능을 평가하고 증상 정도를 관찰하였다. 라그위드 꽃가루 (Ragweed pollen, RW)로 유도한 알러지성 각결막염 모델에서 TA-G {실시예 1의 조성물 A, 유효성분 0.05% FK506-M32-LA-Glc (화합물 16)} 및 TA-S {실시예 1의 조성물 A, 유효성분 0.05% FK506-M32-LA-SL (화합물 22)} 투여 후 증상 정도 및 알러지 완화 효과를 대조약인 레스타시스^TM와 비교 평가하였다.

3-1. 시험군의 구성

시험군은 하기 표와 같다.

표 8

시험군	동물	treatment
시험군	동물	안구	투여물질	투여방법
PBS	Balb/c 마우스8 마리	좌안(대조군)	PBS	10일째부터 5일 동안 PBS를 매일 1회씩 안구에 점적 10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 PBS 2 ul 점안함
PBS	Balb/c 마우스8 마리	우안 (시험군)	PBS	10일째부터 5일 동안 20% RW를 매일 1회씩 안구에 점적함10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 PBS 2 ul 점안
레스타시스^TM(0.05% 사이클로스포린 A)	Balb/c 마우스8 마리	좌안(대조군)	레스타시스	10일째부터 5일 동안 PBS를 매일 1회씩 안구에 점적함 10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 원액 레스타시스 2 ul 점안
레스타시스^TM(0.05% 사이클로스포린 A)	Balb/c 마우스8 마리	우안 (시험군)	레스타시스	10일째부터 5일 동안 20% RW를 매일 1회 씩 안구에 점적함10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 원액 레스타시스 2 ul 점안
TA-G(0.05% FK506-M32-LA-glc)	Balb/c 마우스8 마리	좌안(대조군)	TA-G	10일째부터 5일 동안 PBS를 매일 1회씩 안구에 점적함10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 원액 TA-G 2 ul 점안
TA-G(0.05% FK506-M32-LA-glc)	Balb/c 마우스8 마리	우안 (시험군)	TA-G	10일째부터 5일 동안 20% RW를 매일 1회 씩 안구에 점적함10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 원액 TA-G 2 ul 점안
TA-S(0.05% FK506-M32-LA-SL)	Balb/c 마우스8 마리	좌안(대조군)	TA-S	10일째부터 5일 동안 PBS를 매일 1회씩 안구에 점적함10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 원액 TA-S 2 ul 점안
TA-S(0.05% FK506-M32-LA-SL)	Balb/c 마우스8 마리	우안 (시험군)	TA-S	10일째부터 5일 동안 20% RW를 매일 1회 씩 안구에 점적함10일째부터 5일 동안 PBS 점적 3시간 전에 원액 TA-S 2 ul 점안

PBS: phosphate buffered saline

RW: 알럼에 흡착된 라그위드 꽃가루 (Ragweed pollen absorbed in Alum)

TA-G: 0.05% FK506-M32-LA-glc 조성물 A

TA-S: 0.05% FK506-M32-LA-SL 조성물 A

2. 시험방법

Balb/c 마우스를 대상으로 시험 시작일과 5일째에 알럼에 흡착된 라그위드 꽃가루 (Ragweed pollen absorbed in Alum)를 마우스에 복강 주사하는 방법으로 감작 (sensitization)시키고, 10일째부터 14일째까지 5일 동안 PBS에 용해시킨 라그위드 꽃가루 20%를 매일 1회씩 마우스 안구에 국소 점적하였다. 시험물질 및 대조약물은 10일째부터 14일째까지 5일 동안 매 시도 3시간 전에 각 1회씩 총 5회 투여하였으며, 마지막 시도 30분 후에 임상 신호에 대한 평가를 실시하였다. 또한, 해당 안구를 분리하여 파라핀 슬라이드로 제작하고 톨루이딘 블루 염색을 통하여 결막 및 내안각에서 정상 및 탈과립된 비만세포 (degranulated mast cell)를 계수하고, 이를 바탕으로 탈과립된 비만세포 비율을 산출하였다.

상세한 순서는 아래와 같다.

1. Balb/c 마우스 35마리 입식(수컷, 6주령) 후, 1주일 동안 환경 적응시켰다.

2. 시작일과 5일째에 알럼에 흡착된 라그위드 꽃가루 (0.2 mg RW in 2.5 mg Alum) 0.5 ml을 마우스에 복강 주사하는 방법으로 감작시켰다.

3. 10일째부터 14일째까지 5일 동안 PBS에 용해시킨 라그위드 꽃가루 20%를 매일 1회씩 오른쪽 안구에 국소 점적하였다 (왼쪽 안구는 대조군으로서 동일한 방법으로 동량의 PBS 투여함).

4. 시험물질 및 대조약물은 10일째부터 14일째까지 5일 동안 매 시도 3시간 전에 각 1회씩 총 5회 투여하였다.

5. 마지막 시도 30분 후에 Magone M.T. 등의 방법에 따라 임상 신호에 대한 평가를 실시하였다.

6. 증상 정도에 대한 평가가 완료되면 양쪽 안구를 각각 분리하고 데이비슨 용액 (Davidson's solution) 및 중성 포르말린으로 안구를 고정시켰다.

7. 고정된 안구는 파라핀 슬라이드로 제작하고 톨루이딘 블루 (pH 4.1) 염색을 실시하였다.

8. 톨루이딘 블루 염색 슬라이드를 대상으로 결막 및 내안각에서 정상 세포 및 탈과립된 비만세포를 계수하여 Yamashita H. 등의 방법에 따라 탈과립된 비만세포율 (ratio of degranulated mast cell)을 산출하였다.

9. 각각의 측정결과를 바탕으로 통계 분석하였다.

알러지성 각막염의 증상 정도는 하기의 평가 지표에 따랐다.

표 9

	None 0	Mild 1+	Moderate 2+	Severe 3+
1 Chemosis	Absent 0	Mild chemosis 1	Obvious chemosis 2	Severe chemosis (lid margin 3-4 x thicker than baseline) 3
2 Conjuntive redness	Absent 0	Minimal redness 2	Moderate redness 2	Severe redness 3
3 Lid edema	Absent 0	Mild edema 1	Moderate edema 2	Severe edema (unable to open the eye) 3
4 Tearing and Discharge	Absent 0	Mild 1	Moderate 2	Severe 3
Total score	0	4	8	12

3. 시험결과

대조약으로 투여된 레스타시스^TM (0.05% 사이클로스포린 A)는 물론, 시험 물질인 TA-G 및 TA-S를 투여한 실험군 모두 PBS를 투여한 대조군보다 각결막염에 대한 우수한 치료효능을 보였다.

임상 스코어 및 비만세포 탈과립 정도를 평가한 결과, TA-G를 투여한 실험군은 대체적으로 레스타시스^TM 투여군보다 우수한 각결막염 치료효능을 나타내었고, TA-S를 투여한 실험군은 레스타시스^TM 투여군과 유사한 정도의 치료 효능을 보였다.

결막을 포함한 안구조직을 톨루이딘 블루로 염색한 후 조직 내 총 비만세포 (mast cell)에 대한 탈과립된 비만세포 (degranulated mast cell)의 비율을 측정한 결과, 시험물질을 투여한 2개의 시험군(TA-G, TA-S) 및 대조약 레스타시스^TM를 투여한 실험군 모두에서 비만세포(mast cell) 탈과립(degranulation)이 PBS를투여한 대조군보다 유의적으로 감소하는 것으로 확인되었다. 대조약인 레스타시스^TM 투여군의 경우 비만세포 탈과립율 (mast-cell degranulation rate)이 28.1±11.28%로 PBS를 투여한 대조군의 43.1±8.50%보다 유의적으로 감소한 결과를 보였으며 (p<0.01), TA-G 및 TA-S를 투여한 실험군의 경우에도 각각 23.2±3.16% 및 29.7±8.51%로 PBS 대조군보다 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다 (각각 p<0.01, p<0.05). 한편, TA-G 및 TA-S 투여군 간의 유의적 차이는 관찰되지 않았다.

상기 실험결과를 바탕으로 판단할 때, 각결막염에 대한 치료효능은 유의적 차이는 관찰되지 않았으나, TA-S, TA-G의 치료효능은 기 시판 중인 레스타시스^TM 원액 (0.05% 사이클로스포린 A)보다 뛰어나거나 유사한 것으로 확인되었다.

쥐 안구 결막에 라그위드 꽃가루 (RW)를 사용하여 인위적으로 감작시켜 알러지성 결막염 (allergic conjunctivitis)을 일으켰다. 무감작 대조구로는 PBS (phosphate buffered saline)를 사용하였다. 각 약물 (무처리구는 PBS)을 2 ul/eye로 눈에 국소적으로 점적하였다. 점적은 RW 혹은 PBS 처리 3시간 전에 실시하였다. 알러지성 결막염의 정도를 RW 혹은 PBS를 투여하여 감작한 후 30분에 측정하였다. 증상의 정도 (Clinical scores)는 결막수종 (Chemosis), 눈물과 눈꼽 (Tearing and discharge), 결막 충혈 및 연조직 침범 (Lid edema)으로 나누어 평가하였다. 전체 증상의 정도 (Total clinical scores)는 약물 무처리구 (PBS 처리구)보다 레스타시스^TM(0.05% 사이클로스포린 A), TA-G (0.05% FK506-M32-LA-glc) 또는 TA-S (0.05% FK506-M32-LA-SL) 처리구에서 현저하게 증상의 완화가 관찰되었다.

쥐 안구 결막에 라그위드 꽃가루를 사용하여 인위적으로 감작시켜 알러지성 결막염 (allergic conjunctivitis)을 일으켰다. 무감작 대조구로는 PBS (phosphate buffered saline)를 사용하였다. 각 약물은 2 ㎕/eye로 라그위드 꽃가루로 감작시키기 전에 점적하였으며, 검결막과 구결막 (tarsal and bulbar conjunctiva)에 존재하는 비만세포 (mast cells) 수를 측정하였다. 탈과립 (degranulation)은 비만세포에서 사이토플랜 입자 (cytoplanic granules)의 20% 이상이 융합 혹은 이탈, 염색이상, 유출될 때로 정의하였다. 모든 약물의 처리구에서 결막에 존재하는 전체 비만세포 중 탈과립된 비만세포의 수가 유의적으로 억제되었다. 특히, TA-G 처리군에서 그 억제비가 컸다.

본 발명의 트리사이클로 당화 유도체 화합물은 트리사이클로 화합물의 수용해성을 높인 것으로서, 항진균 활성 및 면역억제 활성을 보유하면서, 생체에 약학 조성물로 투여될 때 활성이 더욱 현저해질 것으로 기대된다.

또한, 본 발명의 타크롤리무스 당화 유도체는 안질환을 비롯한 면역억제용 약학 조성물로서 의약 분야에 유용할 것으로 기대된다.

Claims

트리사이클로 화합물을 원료로 하여 만들어지는 화학식 1로 표시되는 트리사이클로 당화 유도체 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며, R₁, R₂의 적어도 하나에는 에스테르 결합 또는 아마이드 결합으로 C1~C12의 링커에 연결된 C3~C7으로 구성되는 알도즈 (aldose) 또는 케토즈 (ketose) 당쇄가 1~5개 결합되어 있고, 당쇄가 결합되지 않은 R₁ 또는 R₂는 H임)
제1항에 있어서,

상기 트리사이클로 화합물은 타크롤리무스, 아스코마이신, 라파마이신 및 메리다마이신 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
제1항에 있어서,

상기 링커는 포밀 (formyl)기, 아세틸 (acetyl)기, 프로피오닐 (propionyl)기, 부틸 (butyl)기, 아크릴 (acryl)기, 에틸석시닐 (ethylsuccinyl)기, 석시닐 (succinyl)기 또는 아미노헥실 (aminohexyl)기를 포함하는 것임을 특징으로 하는 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
제1항에 있어서,

당쇄를 이루는 단당이 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 푸코오스, 만노오스, 람노오스, 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 반코사민, 에피-반코사민, 글루쿠론산, 시알산, 데옥시글루코오스, 데옥시갈락토오스로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
제1항에 있어서,

상기 화합물은

(화합물 7); R₁=
, R₂=H

(화합물 8); R₁=H, R₂=

(화합물 9); R₁, R₂=

(화합물 10); R₁=
, R₂=H

(화합물 11); R₁=H, R₂=

(화합물 12); R₁, R₂=

(화합물 13); R₁=
, R₂=H

(화합물 14); R₁=H, R₂=

(화합물 15); R₁, R₂=

(화합물 16); R₁=
, R₂=H

(화합물 17); R₁=H, R₂=

(화합물 18); R₁, R₂=

(화합물 19); R₁=
, R₂=H

(화합물 20); R₁=H, R₂=

(화합물 21); R₁, R₂=

(화합물 22); R₁=
,R₂=H

(화합물 23); R₁=H, R₂=
및

(화합물 24); R₁, R₂=

중 선택되는 1종임을 특징으로 하는 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물.
(a) 글루코오스를 원료로 하여 1 -OH 위치에 석시닐기를 도입하고 다른 -OH기에 보호기를 도입하는 공정; 및

(이때 보호기 R₃와 R₄는 동일하거나 다르며, 산 또는 염기 처리로 해리되어 H로 변형될 수 있는 OH기의 보호기임)

(b) 상기 화합물 25에 마크롤라이드 화합물을 부가한 후 상기 화합물 25의 보호기 R₃및 R₄를 제거하는 공정;

을 포함하며,

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(화합물 7); R₁=
, R₂=H

(화합물 8); R₁=H, R₂=
또는

(화합물 9); R₁, R₂=
,

그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물 제조 방법.
화합물 7, 8 또는 9에 갈락토실트랜스퍼레이즈와 UDP-D-갈락토오스를 가하는 공정을 포함하여 각각 화합물 10, 11 또는 12, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(화합물 7); R₁=
, R₂=H

(화합물 8); R₁=H, R₂=
또는

(화합물 9); R₁, R₂=

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(화합물 10); R₁=
, R₂=H

(화합물 11); R₁=H, R₂=

(화합물 12); R₁, R₂=
제7항의 화합물 10, 11 또는 12에 CMP-시알산 및 시알릴트랜스퍼레이즈를 가하는 공정을 포함하여 각각 화합물 13, 14 또는 15, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H임)

(화합물 13); R₁=
, R₂=H

(화합물 14); R₁=H, R₂=

(화합물 15); R₁, R₂=
임)
화합물 4, 5 또는 6에 1-o-아미노헥실 글루코오스를 부가하여 각각 화합물 16, 17 또는 18, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며,

(화합물 4); R₁=
, R₂=H

(화합물 5); R₁=H, R₂=

(화합물 6); R_1, R₂=

(화합물 16); R₁=
, R₂=H

(화합물 17); R₁=H, R₂=

(화합물 18); R₁, R₂=
임.)
제9항의 화합물 16, 17 또는 18에 UDP-D-갈락토오스 및 갈락토실트랜스퍼레이즈를 가하여 각각 화합물 19, 20 또는 21, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며,

(화합물 19); R₁=
, R₂=H

(화합물 20); R₁=H, R₂=

(화합물 21); R₁, R₂=
임)
화합물 4, 5 또는 6에 1-o-아미노헥실 락토오스를 부가하여 화합물 19, 20 또는 21, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며,

(화합물 4); R₁=
, R₂=H ,

(화합물 5); R₁=H, R₂=
,

(화합물 6); R_1, R₂=
,

(화합물 19); R₁=
, R₂=H ,

(화합물 20); R₁=H, R₂=
,

(화합물 21); R₁, R₂=
임)
화합물 19, 20 또는 21에 시알릴트랜스퍼레이즈 및 CMP-시알산을 가하여 각각 화합물 22, 23 또는24, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며,

(화합물 19); R₁=
, R₂=H ,

(화합물 20); R₁=H, R₂=
,

(화합물 21); R₁, R₂=
,

(화합물 22); R₁=
,R₂=H,

(화합물 23);R₁=H,R₂=
및

(화합물 24);R₁,R₂=
임)
화합물 4, 5 또는 6에 1-O-아미노헥실 시알릴락토오스를 가하여 각각 화합물 22, 23 또는 24, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물을 제조하는 방법.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며,

(화합물 4); R₁=
, R₂=H ,

(화합물 5); R₁=H, R₂=
,

(화합물 6); R_1, R₂=
,

(화합물 22); R₁=
,R₂=H ,

(화합물 23);R₁=H,R₂=
및

(화합물 24); R₁, R₂=
임)
화학식 1로 표시되는 타크롤리무스 당화 유도체 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물을 포함하는 면역억제용 약학 조성물.

<화학식 1>

(식중 Rx는 수산화기, 메톡시기 또는 H이며, R₁, R₂의 적어도 하나에는 에스테르 결합 또는 아마이드 결합으로 C1~C12의 링커에 연결된 C3~C7으로 구성되는 알도즈 (aldose) 또는 케토즈 (ketose) 당쇄가 1~5개 결합되어 있고, 당쇄가 결합되지 않은 R₁ 또는 R₂는 H임)
제14항에 있어서,

상기 링커는 포밀 (formyl)기, 아세틸 (acetyl)기, 프로피오닐 (propionyl)기, 부틸 (butyl)기, 아크릴 (acryl)기, 에틸석시닐 (ethylsuccinyl)기, 석시닐 (succinyl)기 또는 아미노헥실 (aminohexyl)기를 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제14항에 있어서,

당쇄를 이루는 단당이 글루코오스, 갈락토오스, 프럭토오스, 푸코오스, 만노오스, 람노오스, 갈락토사민, 글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, 반코사민, 에피-반코사민, 글루쿠론산, 시알산, 데옥시글루코오스, 데옥시갈락토오스로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 조성물.
제14에 있어서,

상기 화합물은

(화합물 7); R₁=
, R₂=H

(화합물 8); R₁=H, R₂=

(화합물 9); R₁, R₂=

(화합물 10); R₁=
, R₂=H

(화합물 11); R₁=H, R₂=

(화합물 12); R₁, R₂=

(화합물 13); R₁=
, R₂=H

(화합물 14); R₁=H, R₂=

(화합물 15); R₁, R₂=

(화합물 16); R₁=
, R₂=H

(화합물 17); R₁=H, R₂=

(화합물 18); R₁, R₂=

(화합물 19); R₁=
, R₂=H

(화합물 20); R₁=H, R₂=

(화합물 21); R₁, R₂=

(화합물 22); R₁=
,R₂=H

(화합물 23); R₁=H, R₂=
및

(화합물 24); R₁, R₂=

중 선택되는 1종임을 특징으로 하는 조성물.
제14항에 있어서,

상기 면역억제용 조성물은 안질환 치료용으로 이용됨을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서,

상기 안질환은 스티븐슨-존슨 증후군, 쇼그렌 증후군, 안구건조 증후군, 외상, 안구 수술에 의한 안구 외상, 감염성 포도막염, 비감염성 포도막염, 각막 이식수술 후 면역거부반응 또는 하드 콘택즈 렌즈 착용에 의한 외인성 질환에 의한 각결막 상피 장해임을 특징으로 하는 조성물.
제18항에 있어서,

상기 조성물은 수용성 점안제 제형임을 특징으로 하는 조성물.
제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 타크롤리무스 당화 유도체 화합물, 그의 제약상 허용되는 염 또는 그들의 용매화물은 전체 조성물 중 0.001% (w/v) 내지 0.1% (w/v)임을 특징으로 하는 조성물.
제14항에 있어서,

상기 조성물은 다른 면역억제제가 더 포함됨을 특징으로 하는 조성물.