WO2013018778A1 - ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている改変型核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞、当該細胞の製造方法、および当該核酸構築物 - Google Patents

ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている改変型核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞、当該細胞の製造方法、および当該核酸構築物 Download PDF

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acid construct
cell
seq
present
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眞一郎 藤井
佳奈子 清水
順 信賀
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独立行政法人理化学研究所
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid construct encoding a Wilms tumor gene product or a fragment thereof, and a cell into which the nucleic acid construct has been introduced and the expression level of the product or a fragment thereof is remarkably enhanced.
  • NKT cells The antitumor effects of NKT cells known so far include a direct effect on tumors and an indirect effect (adjuvant effect) through maturation of dendritic cells.
  • an immunotherapy using NKT cells an immunotherapy in which dendritic cells presenting tumor antigens are administered has been known, and studies on clinical application of the immunotherapy have been repeated (Non-patent Document 1). ⁇ 7).
  • antigen-specific immunotherapy using dendritic cells into which mRNA encoding a tumor antigen has been introduced has already been established and clinically applied (Non-Patent Documents 8 to 15).
  • RNA introduction efficiency and low expression level of tumor antigens in dendritic cells are problems, these immunizations can be performed in combination with an adjuvant. Attempts have been made to improve the therapeutic effect of therapy.
  • WT1 Wilms tumor 1
  • Patent Documents 1 and 2 disclose their own immunotherapy.
  • Patent Document 1 discloses abnormal cells isolated from a patient in which CD1d presenting a ligand of NKT cells is present on the cell surface, and a method for producing them (Patent Document 1). ). The cells can induce both NKT cell activation and tumor-specific T cell immune responses.
  • Patent Document 2 discloses an allocell that is not a patient-derived cell, in which CD1d presenting a ligand of an NKT cell is present on the cell surface and expresses a disease-specific antigen, and These manufacturing methods. The cell can exhibit the same kind of immunity induction ability as the cell described in Patent Document 1 without isolation from the patient.
  • These immunotherapy is expected to be applied to various antitumor immunotherapy such as leukemia.
  • the therapeutic effect can be improved by combining with an adjuvant as in the past, but the administered cell itself is the target of attack by the patient's immune system. It has been found that the improvement in the expression level can greatly contribute to the efficiency of immune induction.
  • the expression level of the tumor antigen protein is improved by increasing the amount of RNA to be introduced. In this case, the improvement in the expression level is roughly proportional to the amount of RNA introduced.
  • the total amount of RNA that can be introduced into cells is limited. Therefore, for example, when other RNA (such as RNA encoding CD1d) is further introduced into cells, it is considered that the expression level of tumor antigen protein cannot be improved to a desired level. For this reason, it is desirable to achieve a significantly high expression level while suppressing the amount of RNA to be introduced as much as possible.
  • the object of the present invention depends on an expression regulatory element contained in an expression vector or the like when a WT1 protein is selected as a tumor-specific antigen protein. Without increasing the expression level of the WT1 protein in the cell. That is, an object of the present application is to provide a cell containing a modified WT1 nucleic acid construct in which the expression level of a polypeptide derived from WT1 is improved in a DNA-independent manner, and a modified WT1 to be introduced into the cell. It is to provide a nucleic acid construct.
  • the present inventors have found that the expression level of a polypeptide derived from WT1 is far more than expected by introducing a mutation into the nucleic acid sequence of WT1 having a known sequence. Such a significant increase in the expression level is not known in the modified WT1 so far. As a result of repeated studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention. That is, the present invention includes the following features in order to solve the above problems.
  • An immunotherapeutic cell comprising a nucleic acid construct encoding a Wilms tumor gene product or fragment thereof, wherein the nucleic acid construct has a sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 from position 194 to position 493, or SEQ ID NO: 1.
  • An immunotherapeutic cell containing only AUG as a functional start codon.
  • the present invention relates to an immunotherapeutic cell into which a nucleic acid construct in which the expression level of a WT1 gene product or a fragment thereof is remarkably improved without depending on an expression regulatory element contained in an expression vector or the like, and There is an effect that a nucleic acid construct can be provided. They can be used for effective immunotherapy independent of gene therapy.
  • the present invention provides an immunotherapeutic cell (hereinafter simply referred to as the cell of the present invention) comprising a nucleic acid construct encoding a Wilms tumor gene product or a fragment thereof.
  • the nucleic acid construct comprises a region encoding a fragment of the Wilms tumor gene product indicated by positions 194 to 493 of SEQ ID NO: 1 or by the corresponding position of the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, as well as the region It contains only AUG as a functional start codon, which is present via a base of 3 m (m is 0 or a positive integer) on the 5′-terminal side of.
  • the nucleic acid construct exhibits markedly enhanced expression of a Wilms tumor gene product or a fragment thereof when introduced into an arbitrary cell, as will be described later in [Nucleic acid construct of the present invention]. Therefore, if the cell for immunotherapy of the present invention is used, a large amount or a necessary amount of protein can be administered to a desired living body by a small number of administrations.
  • the cell of the present invention may be a dendritic cell derived from a living body to be administered for the purpose of immunotherapy including administration of a dendritic cell presenting a tumor antigen. Since various known literatures may be referred to for immunotherapy using dendritic cells, detailed description thereof is omitted herein.
  • the cells further contain mRNA encoding CD1d for the purpose of immunotherapy developed by the present inventors (see WO 2007/097370 and WO 2010/061930).
  • the glycolipid recognized by the antigen receptor of an NKT cell is couple
  • This injury processes the WT1 gene product expressed from the nucleic acid construct of the present invention or a fragment thereof into a peptide fragment.
  • the peptide fragment is presented to T cells together with major histocompatibility antigen (MHC) class II molecules, and the T cells are activated.
  • MHC major histocompatibility antigen
  • NKT cells injured with the cells of the present invention are activated by dendritic cells that have incorporated the peptide fragment. That is, administration of the cells of the present invention results in innate immunity and acquired immunity that depends on tumor-specific antigenic peptides.
  • the cells of the present invention express a large amount of the WT1 gene product or a fragment thereof, the immunity of the living body against the tumor can be improved efficiently.
  • CD1d is an MHC-like molecule that presents a glycolipid as described above.
  • CD1d is expressed in antigen presenting cells (eg dendritic cells) and epithelial cells in certain tissues (eg intestinal tract, liver), as well as in some tumor cells (eg solid tumor cells, leukemia cells) and virus infected cells. .
  • antigen presenting cells eg dendritic cells
  • epithelial cells in certain tissues (eg intestinal tract, liver), as well as in some tumor cells (eg solid tumor cells, leukemia cells) and virus infected cells.
  • glycolipids recognized by the antigen receptors of NKT cells include ⁇ -GalCer ( ⁇ -galactylceramide), ⁇ -C-GalCer ( ⁇ -C-galactylceramide), iGB3 (isoglobintrisosylceramide, G3, G3, G3 Examples include GSL-1 ( ⁇ -linked gluconic acid) and GSL-1′SA (galacturonic acid). Of these, ⁇ -GalCer or ⁇ -C-GalCer is preferred.
  • the cell of the present invention is preferably an established cell line.
  • the established cell line has higher proliferation efficiency and gene introduction efficiency than cells obtained from living bodies, and can stably prepare a large number of cells.
  • the established cell line can be a cell derived from a mammal. From the viewpoint of clinical application to humans, cells derived from humans, particularly normal cells, are preferred.
  • cells derived from animal species to be administered can be used for uses for pet animals (for example, dogs and cats), and human-derived cells can be used in the same manner as for humans.
  • the present invention also provides a nucleic acid construct with an improved expression level that encodes a Wilms tumor gene product or a fragment thereof.
  • the nucleic acid construct encodes a fragment of the Wilms tumor gene product as indicated above by positions 194 to 493 of SEQ ID NO: 1 or by the corresponding position of the sequence corresponding to SEQ ID NO: 1
  • This region contains only AUG as a functional start codon, which is present via a 3 m (m is 0 or positive integer) base on the 5 ′ end side of the region as well as the region.
  • the term “Wilms tumor gene product” or “fragment thereof” is indicated by the same amino acid sequence as the wild-type protein encoded by the Wilms tumor gene (Wilms tum 1: WT1).
  • a polypeptide hereinafter referred to as the same polypeptide as the wild body
  • a polypeptide represented by substantially the same amino acid sequence as the wild body protein hereinafter referred to as a polypeptide similar to the wild body
  • a tumor-specific It means a polypeptide containing a WT1-derived peptide known as an antigen peptide (hereinafter referred to as tumor-specific polypeptide).
  • the same polypeptide as the wild body is a polypeptide encoded by the cDNA of a known WT1 gene.
  • the cDNA encoding the longest polypeptide among the variants is represented by the sequence of SEQ ID NO: 3 (GenBnak # NM_024426).
  • the one represented by this sequence is known as variant D of WT1.
  • variants A to D A: GenBank # NM 024424, C: GenBank # NM 024425, D: GanBank # NM 024426
  • the same polypeptide as that of the wild body for example, substitutions, deletions or additions found when compared with various variants are arbitrarily introduced into the corresponding position of the sequence of SEQ ID NO: 3. It means the polypeptide encoded by the polynucleotide shown in the sequence.
  • the WT1 gene is known to express two proteins having different lengths.
  • the same polypeptide as the wild body encompasses those represented by the same amino acid sequence as two proteins of different length, with or without the mutations found in variants as described above.
  • amino acid sequence of the same polypeptide as that of the wild body is compared with that of the wild body, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more of the amino acids are identical. It is a polypeptide.
  • wild-type polypeptides are known to have tumor-specific mutations that are known not to impair, enhance, or alter the type of human leukocyte antigen that can be applied. It is a polypeptide that has been introduced into a region of an antigenic peptide.
  • the mutation examples include those described in International Publication No. 05/045027.
  • the mutation is a substitution of the first, fourth, sixth or ninth amino acid from the C-terminal side to another amino acid in a peptide portion consisting of nine amino acid residues.
  • the corresponding amino acid residues can be substituted as follows:
  • the first amino acid can be substituted with either phenylalanine, tyrosine, tryptophan, valine, isoleucine, leucine or methionine.
  • the fourth amino acid can be substituted with either valine, isoleucine, leucine, methionine, aspartic acid or glutamic acid.
  • the sixth amino acid can be substituted with either asparagine, serine, threonine, glutamine, lysine or aspartic acid.
  • the ninth amino acid can be substituted with either aspartic acid, glutamic acid or glutamine.
  • Examples of the mutation further include the mutation described in International Publication No. 05/053618.
  • the 9th of 9 amino acid residues encoded by the base corresponding to the 770th to the 796th base in SEQ ID NO: 3 of the present application is substituted with leucine.
  • Examples of the mutation further include the mutation described in International Publication No. 07/016466.
  • the 9th of 9 amino acid residues encoded by the base corresponding to the 770th to the 796th base in SEQ ID NO: 3 of the present application is substituted with methionine.
  • Examples of the mutations further include two mutations described in the opinion document of European Patent No. 1127068.
  • the first mutation the second of nine amino acid residues encoded by the bases corresponding to the 770th to 796th bases in SEQ ID NO: 3 of the present application is substituted with leucine.
  • the second mutation of the 9 amino acid residues encoded by the bases corresponding to the 770th to 796th bases in SEQ ID NO: 3 of the present application, the second is substituted with leucine and the ninth is substituted with valine. .
  • the tumor-specific polypeptide is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more when compared with the amino acid sequence of the region containing the antigen peptide in the same polypeptide as the wild body.
  • the wild-type polypeptide is introduced with a mutation that is known not to impair or enhance immunity induction ability, or to change the type of applicable human leukocyte antigen. Polypeptide. The mutation is as described above.
  • the nucleic acid construct of the present invention contains the same polypeptide as the wild body, a polypeptide similar to the wild body, or a polynucleotide encoding a tumor-specific peptide. Therefore, the nucleic acid construct of the present invention optionally has a conservative mutation in which the encoded amino acid does not change in addition to the mutation in the WT1 gene as described above.
  • the nucleic acid construct of the present invention is further introduced with a mutation that inserts 1 or 2 bases at the 5 ′ end of the first A: the region from position 192 to position 769 of SEQ ID NO: 2.
  • a base represented by AUG at any position in the region corresponding to the region in the sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 is generated by one of the mutations described above, and the leading A is in positions 191 + 3n (n is Except for the integers 1 to 192).
  • corresponding sequence in the description referring to SEQ ID NO: 2 means the sequence of RNA corresponding to a known cDNA representing various variants of the WT1 gene as described above. These variants can be introduced with various mutations as described above.
  • the “corresponding base” means a base specified in the “corresponding sequence” as compared with the base at the X position of SEQ ID NO: 2 (X is an arbitrary integer) and the surrounding base. .
  • nucleic acid construct of the present invention will be described in this specification using SEQ ID NO: 2 as a reference sequence. However, all descriptions may refer to the position or region of the base in the sequence corresponding to SEQ ID NO: 2. Is intended.
  • the base corresponding to position 191 of SEQ ID NO: 2 can be substituted with a base represented by, for example, A, U or G. Substitution with any base can generate a codon that has been reported to function as an initiation codon in eukaryotes.
  • any base up to the base at position 769 in SEQ ID NO: 2 can be deleted, which is a continuous base starting from the base corresponding to position 191 in SEQ ID NO: 2. This can provide a nucleic acid construct that encodes a polypeptide containing a previously known tumor-specific antigenic peptide as described above.
  • RNA contained in the nucleic acid construct in which such a mutation is generated include the following three.
  • RNA in which the base at position 191 in SEQ ID NO: 2 is substituted with A (2) RNA in which 204 consecutive bases starting from the base at position 191 in SEQ ID NO: 2 are deleted. (3) 3 bases represented by AUG, and 3m (m is an integer of 0 or 1 to 250, more preferably an integer of 1 to 200) and a continuous region from the 5 ′ end side in the order of any base, and RNA containing the region from position 770 to position 1663 in SEQ ID NO: 2 following this region.
  • RNA in which the first base of the region encoding the WT1 polypeptide in the nucleic acid construct of the present invention is replaced with the base represented by A.
  • the above (2) is RNA starting from 3 bases represented by AUG that first appears in the region encoding WT1 polypeptide in the nucleic acid construct of the present invention.
  • the above (3) is a C-terminal of a polypeptide chain containing a region (region from 770 to 1663 in SEQ ID NO: 2) that has been identified so far to encode a tumor-specific antigen peptide.
  • RNA with multiple bases of 0 or 3 added after AUG can be used to obtain RNA with a much improved expression level compared to the wild type.
  • nucleic acid construct of the present invention can be used for the bases in SEQ ID NO: 2 from position 1 to position 100, more preferably position 150, even more preferably position 120, most preferably position 190, or the corresponding sequence. It is preferred that the corresponding base is deleted.
  • the nucleic acid construct of the present invention having such a deletion is inserted into a transcription construct described later, the distance from the promoter to the start codon is appropriately adjusted, so that the protein is more appropriately To express.
  • the expression level of the protein from the nucleic acid construct of the present invention is at least 5 times or more, preferably 25 times or more, compared to the wild type.
  • a necessary amount of protein can be prepared using a small number of cells.
  • the nucleic acid construct of the present invention greatly reduces the complexity that arises when preparing such cells in a homogeneous and large amount, and facilitates administration of the cells to the living body.
  • the present invention can provide a nucleic acid construct having an improved protein expression level up to about 50 times or more as compared to the wild type. Therefore, the nucleic acid construct of the present invention is much easier to handle than the wild type and is very useful.
  • the nucleic acid construct of the present invention preferably contains a region represented by SEQ ID NO: 4 or 5 as shown in the Examples. If the nucleic acid construct of the present invention has the region, the protein expression level can be enhanced 25 times or more compared to the wild type.
  • the nucleic acid construct of the present invention preferably further has a 5 'cap structure.
  • the 5 'cap structure in the nucleic acid construct of the present invention can be imparted in vitro or in vivo. In view of ease of purification and isolation, it is preferable to perform transcription in vitro using RNA containing a region encoding a WT1 polypeptide, and to give a 5 'cap structure in vitro. In vitro transcription and 5 'cap application can be easily performed using methods known to those skilled in the art, commercially available reagents, or commercially available kits.
  • the nucleic acid construct of the present invention preferably further has a polyadenylation (polyA) chain at the 3 'end.
  • the poly A chain can be added to the nucleic acid construct of the present invention in vitro and in vivo as well as the 5 'cap structure, but for the same reason, it is preferably applied in vitro.
  • the addition of the poly A chain can be easily performed using methods known to those skilled in the art, commercially available reagents, or commercially available kits.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the nucleic acid construct of the present invention as described above.
  • the polynucleotide of the present invention comprises a region of the WT1 gene that encodes a WT1 gene product or fragment thereof.
  • the polynucleotide is introduced with a mutation corresponding to the mutation introduced into the nucleic acid construct of the present invention as described above.
  • the polynucleotide of the present invention is particularly suitable for the production of the nucleic acid construct of the present invention. When used for the production of the nucleic acid construct of the present invention, the polynucleotide of the present invention is incorporated into a construct for transcription of the nucleic acid construct of the present invention.
  • the present invention also provides a transcription construct comprising the polynucleotide of the present invention.
  • the transcription construct further includes various elements that can achieve efficient transcription of RNA from the polynucleotide.
  • the above-mentioned elements contained in the transcription construct can be selected according to the in vitro transcription method or kit. Details of a construct adapted to a commercially available kit for in vitro transcription are described below as an example of the transcription construct of the present invention.
  • the transcription construct includes a promoter operably linked to the polynucleotide.
  • the promoter may be any promoter that can promote transcription of RNA from the polynucleotide in vitro, and examples thereof include T7 promoter, SP6 promoter, and T3 promoter.
  • the transcription construct may further include a transcription termination signal (that is, a terminator sequence) downstream of the polynucleotide. Examples of the terminator sequence include T7 terminator, SP6 terminator, and T3 terminator.
  • the transcription construct may have a function as a vector in order to amplify itself.
  • the transcription construct may further include a selection marker gene for selecting a cell into which the transcription construct has been introduced.
  • selectable marker genes include genes that are resistant to conventionally known antibiotics, genes that compensate for mutations related to auxotrophy, and genes that express an enzyme that catalyzes a color reaction using a reagent.
  • the transcription construct can be amplified using, for example, PCR.
  • the transcriptional construct may be a linear polynucleotide chain amplified by PCR that is not inserted into plasmid DNA.
  • the primer pair is designed to amplify including the promoter region of RNA in the template.
  • the transcriptional construct When generating a transcriptional construct that further encodes the CD1d mRNA, the transcriptional construct is polycistronic or monocistronic. When the transcription construct is polycistronic, the transcription construct contains one promoter upstream of the two coding regions. When the transcription construct is monocistronic, the transcription construct contains one promoter upstream of each coding region.
  • two transcription constructs can be prepared separately for the nucleic acid construct of the present invention and for CD1d mRNA. In addition to these embodiments, there is an embodiment in which the WT1 gene product and CD1d are expressed as a fusion protein.
  • mRNA is generated in which a specific proteolytic signal sequence (such as a T2A sequence) is inserted between the WT1 gene product and CD1d.
  • a specific proteolytic signal sequence such as a T2A sequence
  • the fusion protein can be decomposed into two proteins after being expressed and exhibit activity as individual proteins.
  • the nucleic acid construct of the present invention is produced by a known technique such as a combination of amplification of a polynucleotide encoding the nucleic acid construct, cloning of the polynucleotide and an in vitro transcription reaction, or chemical synthesis.
  • a known technique such as a combination of amplification of a polynucleotide encoding the nucleic acid construct, cloning of the polynucleotide and an in vitro transcription reaction, or chemical synthesis.
  • a primer pair capable of introducing a desired mutation into a known WT1 gene cDNA is designed.
  • the primer pair is designed, for example, to delete the N-terminus of the wild-type sequence. At this time, it is usually unnecessary to adjust the number of bases to be deleted. This is because in vitro transcribed RNA does not cause a frameshift mutation unless the mutation described in the section [Nucleic acid construct of the present invention] occurs. If the cDNA sequence of the template to be used is determined, it can be determined whether or not a frameshift mutation has occurred. Therefore, the template DNA can be sequenced before use according to a known method.
  • the desired polynucleotide is amplified by PCR using the primer pair and the template cDNA.
  • the amplified polynucleotide and the vector used for cloning are digested with the same restriction enzymes.
  • the vector and polynucleotide digested with ligase are ligated to obtain a vector (transcription construct) containing the polynucleotide.
  • suitable E. coli is transformed with a vector containing the polynucleotide of the present invention.
  • Transformed E. coli is grown in an appropriate medium.
  • the vector contains, for example, a gene showing resistance to a specific antibiotic, and the medium used for the growth of E. coli contains the specific antibiotic.
  • a vector is extracted from the cells using a commercially available kit or the like.
  • the collected vector remains in a circular form or is linearized and then subjected to an in vitro transcription reaction using a commercially available kit.
  • a cap structure is added to the 5 ′ end of the transcript using a commercially available kit.
  • a poly A sequence can be added to the 3 ′ end of the transcript.
  • the method for producing the nucleic acid construct of the present invention mainly using a kit has been briefly described.
  • those skilled in the art understand that some of the reagents used in the manufacturing process can be prepared by themselves. Therefore, those skilled in the art can produce more appropriate RNA by partially modifying a commercially available kit or changing a part of the reagent according to the properties of the RNA to be produced.
  • those skilled in the art will fully understand the preferred method for preparing the nucleic acid construct of the present invention, the reagent to be prepared, the kit to be selected, and the points to be changed in these. .
  • the present invention also provides a kit for producing immunotherapeutic cells.
  • the kit contains the nucleic acid construct or polynucleotide described above.
  • the user introduces the nucleic acid construct into any cell described in [Cell for immunotherapy of the present invention] using the kit.
  • the polynucleotide of the present invention (as a transcription construct) is included in the kit, the user transcribes the nucleic acid construct of the present invention in vitro or in vivo, and introduces the nucleic acid construct into any cell.
  • the kit may further comprise instructions for use.
  • the instruction manual describes, for example, necessary items in the production of the immunotherapeutic cell (optionally a nucleic acid construct) of the present invention as understood from the description so far in the present specification. .
  • the present invention includes the following features in order to solve the above problems.
  • An immunotherapeutic cell comprising a nucleic acid construct encoding a Wilms tumor gene product or a fragment thereof, wherein the nucleic acid construct corresponds to positions 194 to 493 of SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1 A region encoding a fragment of the Wilms tumor gene product indicated by the corresponding position of the sequence to be encoded, and present at the 5 ′ end of the region via a base of 3 m (m is 0 or a positive integer) An immunotherapeutic cell containing only AUG as a functional start codon, (2) An immunotherapeutic cell into which a nucleic acid construct encoding a Wilms tumor gene product or a fragment thereof has been introduced, wherein the nucleic acid construct is represented by positions 69 to 517 of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: All of the CUG shown in SEQ ID NO: 2 from position 191 to position 193, comprising a region encoding a fragment of the Wilms tumor gene product indicated by the corresponding position of the sequence
  • an immunotherapeutic cell according to (1) which has a C to A substitution
  • (3) The amount of protein directly translated from the nucleic acid construct is 25 of the amount of protein directly translated from RNA having the coding region shown in positions 191 to 1741 of SEQ ID NO: 2.
  • a method for producing a cell for immunotherapy comprising the step of introducing the nucleic acid construct according to (4) or (5) into an arbitrary cell, (7) a polynucleotide encoding the nucleic acid construct according to (4) or (5), (8)
  • a kit for producing an immunotherapeutic cell comprising the nucleic acid construct according to (4) or (5) or the polynucleotide according to (7), (9) It further comprises mRNA encoding CD1d, and a glycolipid recognized by an NKT cell antigen receptor is bound to the CD1d present on the cell surface.
  • the cell for immunotherapy as described in any one of 3).
  • the expected chain length of the amplified product of ATG-WT1 (corresponding to positions 191 (substituted from c to a) to 1741 of SEQ ID NO: 3) by PCR is about 1580 base pairs
  • ⁇ N-WT1 (sequence No. 3 (corresponding to positions 395 to 1741) is about 1350 base pairs
  • agarose gel electrophoresis was performed to confirm that it was consistent with the theoretical value.
  • Each of the amplified products was cloned into plasmid pcDNA3 and named pcDNA3-ATG-WT1 and pcDNA3- ⁇ N-WT1, respectively.
  • RNA Ribonucleic acid sequence
  • pcDNA3-ATG-WT1 and pcDNA3- ⁇ N-WT1 were linearized using the restriction enzyme NotI (the recognition sequence is on pcDNA3).
  • NotI the recognition sequence is on pcDNA3
  • Each of the linearized plasmids was purified by QIAquick PCR Purification Kit (# 28106, Qiagen) and then used as a template for RNA synthesis to synthesize desired RNA.
  • HEK293 (3 ⁇ 10 6 cells) seeded in three dishes using the same amounts of two mutant WT1 mRNAs and wild-type WT1 mRNA were transfected according to the lipofection method. Each transfected cell was incubated at 37 ° C. in a CO 2 incubator. After discarding the culture solution, a lysis buffer for electrophoresis was added, and the incubated cells were scraped using a cell scraper and transferred to a tube. The cell lysate in the tube was further disrupted by sonication to obtain a sample.
  • each band The results of detecting each band are shown in FIG.
  • the number before the “x” listed above each lane indicates how many times the sample applied to the polyacrylamide gel has been diluted from the original cell lysate.
  • the full-length protein (517 amino acids) was detected as a major band, and bands shorter than the full-length were detected as minor bands (CTG 1 ⁇ and 5 ⁇ ).
  • WT1 RNA lacking a part of the N-terminal was detected as a band having an intensity of about 50 times or more at the same position as the minor band in wild-type WT1 (delta 25 ⁇ , 50 ⁇ ).
  • WT1 RNA in which the first base of the coding region was replaced with A was also detected as a band of about 50 times or more intensity at the same position as the major band in wild-type WT1 (ATG 25 ⁇ and 50 ⁇ ) .
  • the band in std is detected by 50 ng protein. From a comparison with the intensity of the band at std, the detected amount of wild type WT1 is at least about 50 ng at 1 ⁇ . Since the applied sample represents 1/10 of the original sample, the expression level per 1 ⁇ 10 6 cells is at least about 250 ng. Therefore, it cannot be said that the amount of protein is sufficient to induce immunity in an animal weighing about 3 kg. On the other hand, since the expression level of WT1 from the two mutant RNAs (delta and AUG) is also at least about 50 times or more, the expression level per 1 ⁇ 10 6 cells is about 30 ⁇ g or more.
  • the present invention is expected to be applied in the biological and medical fields, particularly in the treatment of tumors.

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Abstract

　本発明の細胞は、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる細胞であって、核酸構築物が、ＷＴ１遺伝子産物の所望の断片をコードしている領域、および機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる。本発明によれば、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片の発現量を顕著に向上させた核酸構築物が導入された細胞を提供し得る。

Description

ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている改変型核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞、当該細胞の製造方法、および当該核酸構築物
　本発明は、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物、ならびに当該核酸構築物が導入されており、当該産物またはその断片の発現量が顕著に増強されている細胞に関する。
　これまでに知られているＮＫＴ細胞の抗腫瘍効果としては、腫瘍に対する直接効果および樹状細胞の成熟化を介した間接効果（アジュバント効果）が挙げられる。以前より、ＮＫＴ細胞を利用した免疫療法として、腫瘍抗原を提示させた樹状細胞を投与する免疫療法が知られており、当該免疫療法の臨床応用に関する検討が重ねられている（非特許文献１～７）。また、腫瘍抗原をコードしているｍＲＮＡが導入されている樹状細胞を利用する抗原特異的な免疫療法は、既に確立されており、臨床応用されている（非特許文献８～１５）。これらの免疫療法において、利用する細胞材料に免疫誘導用の抗原を導入する手法として、発現ベクターなどを使用することが簡便である。しかし、発現ベクターを細胞に導入した場合には、遺伝子治療とみなされ得るために、規制などを考慮すると利用範囲を狭めるおそれがある。そこで、樹状細胞に対してＲＮＡを導入する方法が考えられるが、ＲＮＡ導入効率、および樹状細胞における腫瘍抗原の発現量の低さが問題であるため、アジュバントとの組合せによって、これらの免疫療法の治療効果の改善が試みられている。
　また、腫瘍に対する他の免疫療法としては、ウィルムス腫瘍遺伝子（Wilms tumor 1：ＷＴ１）によってコードされているＷＴ１タンパク質に含まれている複数のエピトープを利用したペプチド療法が挙げられる。
　一方で、本発明者らも独自の免疫療法をこれまでに開発している（特許文献１および２など）。特許文献１に開示されているのは、ＮＫＴ細胞のリガンドを提示しているＣＤ１ｄが細胞表面に存在している、患者から単離された異常な細胞およびこれらの製造方法である（特許文献１）。当該細胞は、ＮＫＴ細胞の活性化および腫瘍特異的なＴ細胞免疫応答の両者を誘導可能である。特許文献２に開示されているのは、ＮＫＴ細胞のリガンドを提示しているＣＤ１ｄが細胞表面に存在しており、疾患特異的な抗原を発現している、患者由来の細胞ではないアロ細胞およびこれらの製造方法である。当該細胞は、特許文献１に記載の細胞と同種の免疫誘導能を、患者から単離することなく示し得る。これらの免疫療法は、白血病等の様々な抗腫瘍免疫療法などへの応用が期待されている。
国際公開公報「ＷＯ２００７／０９７３７０号（２００７年８月３０日公開）」 国際公開公報「ＷＯ２０１０／０６１９３０号（２０１０年６月３日公開）」
Nat. Immunol. 3, 867-874(2002). J. Immunol. Meth. 272, 147-159(2003). J. Exp. Med. 198, 267-279(2003). J. Exp. Med. 199, 1607-1618(2004). J. Immunol. 167, 3114-3122(2001). Int. J. Cancer 109, 402-11(2004). J. Immunol. 171, 5140-5147(2003). J. Clin. Invest. 114, 1800-11(2004). J. Exp. Med. 184:465-472(1996). Nat. Med. 2:1122-1128(1996). Nat. Med. 6:1011-1017(2000). J. Clin. Invest. 109:409-417(2002). J. Immunol. 174:3798-3807(2005). Br. J. Cancer 93:749-756(2005). Cancer Gene Ther. 13:905-918(2006).
　本発明者らの開発した免疫療法では、従来と同様にアジュバントとの組合せによって治療効果の改善を図り得るが、投与される細胞自体が患者の免疫系による攻撃対象であるため、腫瘍抗原タンパク質の発現量の向上が免疫誘導の効率化に大きく寄与し得ることが見出された。腫瘍抗原タンパク質の発現量は、導入するＲＮＡの量を増加させることによって向上する。この場合の発現量の向上はＲＮＡの導入量と概ね比例する。しかし、細胞に導入可能なＲＮＡの総量には限界がある。よって、例えば、他のＲＮＡ（ＣＤ１ｄをコードしているＲＮＡなど）をさらに細胞に導入する場合、腫瘍抗原タンパク質の発現量を所望の程度に向上させ得ないことが考えられる。このため、導入するＲＮＡの量を可能な限り抑えつつも顕著に高い発現量を達成させることが望ましい。
　本発明者らによって見出された上述の課題に鑑みて、本発明の目的は、腫瘍特異的な抗原タンパク質としてＷＴ１タンパク質を選択した場合に、発現ベクターなどに含まれている発現調節エレメントに依存せずに、ＷＴ１タンパク質の細胞における発現量を顕著に上昇させることである。すなわち、本願の目的は、ＷＴ１に由来するポリペプチドの発現量がＤＮＡ非依存的に向上している改変型のＷＴ１核酸構築物を含んでいる細胞、および当該細胞に導入するための改変型のＷＴ１核酸構築物を提供することである。
本発明者らは、公知の配列を有しているＷＴ１の核酸配列に変異を導入することによって、ＷＴ１に由来するポリペプチドの発現量が予想を遥かに超えて増強されることを見出した。かかる発現量の顕著な増強は、これまでの改変型のＷＴ１では知られていない。本発明者らは、これらの知見に基づいて研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
　ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞であって、上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、および当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる、免疫治療用細胞。
　本発明は、発現ベクターなどに含まれている発現調節エレメントに依存せずに、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片の発現量を顕著に向上させた核酸構築物が導入されている免疫治療用細胞、および当該核酸構築物を提供できるという効果を奏する。これらは遺伝子治療に依存しない、効果的な免疫療法に利用され得る。
本発明の核酸構築物からのタンパク質の発現量について試験した結果を示す図である。
　〔本発明の免疫治療用細胞〕
　本発明は、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞（以下、単に本発明の細胞と記載）を提供する。上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、ならびに当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる。
　上記核酸構築物は、後述する〔本発明の核酸構築物〕の項に説明するように、任意の細胞に導入されることによって、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片の顕著に増強された発現を示す。したがって、本発明の免疫治療用細胞を用いれば、わずかな数の投与によって、大量または必要量のタンパク質を所望の生体に投与し得る。
　本発明の細胞は、腫瘍抗原を提示させている樹状細胞の投与を包含している免疫療法を目的とする、投与対象である生体に由来する樹状細胞であり得る。樹状細胞を使用する免疫療法については種々の公知文献を参照すればよいので、本明細書では詳細な説明を省略する。
　よってここでは、本発明の細胞として特に好ましい細胞について詳述する。当該細胞は、本発明者らによって開発された免疫療法（国際公開第２００７／０９７３７０号および国際公開第２０１０／０６１９３０号を参照）を目的として、ＣＤ１ｄをコードしているｍＲＮＡをさらに含んでいる。また、当該細胞は、ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質が、細胞表面に存在する当該ＣＤ１ｄと結合していることが好ましい。本発明の細胞の表面にあるＣＤ１ｄによって上記糖脂質が提示されているので、当該細胞が生体に投与されると、ＮＫＴ細胞によって本発明の細胞は効率的に傷害を受ける。この傷害によって、本発明の核酸構築物から発現されたＷＴ１遺伝子産物またはその断片がペプチド断片に処理される。例えば、周辺の樹状細胞が当該ペプチド断片を取り込むと、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子とともに当該ペプチド断片をＴ細胞に提示し、Ｔ細胞が活性化される。これと同時に、本発明の細胞を傷害したＮＫＴ細胞は、上記ペプチド断片を取込んだ樹状細胞によって活性化される。つまり、本発明の細胞の投与によって、自然免疫および腫瘍特異的な抗原ペプチドに依存する獲得免疫が生じる。このようにして、本発明の細胞は、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片を大量に発現しているので、腫瘍に対する生体の免疫能を効率的に向上させ得る。
　ＣＤ１ｄは、上述のように糖脂質を提示するＭＨＣ様分子である。ＣＤ１ｄは、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）および特定の組織（例えば腸管、肝臓）における上皮細胞、ならびに一部の腫瘍細胞（例えば固形腫瘍細胞、白血病細胞）およびウイルス感染細胞において発現している。
　ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質の例としては、α－ＧａｌＣｅｒ（α－ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ（α－Ｃ－ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ｉＧＢ３（ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｒｉｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ＧＤ３（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ　３）、ＧＳＬ－１（α－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、およびＧＳＬ－１’ＳＡ（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）が挙げられる。これらのうちα－ＧａｌＣｅｒまたはα－Ｃ－ＧａｌＣｅｒが好ましい。
　また、本発明の細胞は樹立細胞系であることが好ましい。樹立細胞系は、生体から得られた細胞などと比べて増殖効率および遺伝子の導入効率が高く、安定して大量の細胞を調製することが可能である。樹立細胞系は哺乳類に由来する細胞であり得る。ヒトに対する臨床応用という観点から、ヒトの特に正常細胞に由来する細胞が好ましい。なお、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ）に対する用途には、投与対象の動物種に由来する細胞を使用し得るし、ヒトに対する用途と同様にヒト由来の細胞を使用し得る。
　〔本発明の核酸構築物〕
　また、本発明は、ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている、発現量が向上された核酸構築物を提供する。当該核酸構築物は、上述のように、配列番号１の１９４位から４９３位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、ならびに当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる。
　本明細書に使用されるとき、“ウィルムス腫瘍遺伝子産物”または“その断片”という用語は、ウィルムス腫瘍遺伝子（Wilms tumor 1：ＷＴ１）にコードされている野生体のタンパク質と同じアミノ酸配列によって示されるポリペプチド（以下、野生体と同じポリペプチドと記載）、野生体のタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列によって示されるポリペプチド（以下、野生体と類似のポリペプチドと記載）、または腫瘍特異的な抗原ペプチドとして知られているＷＴ１由来のペプチドを含んでいるポリペプチド（以下、腫瘍特異的なポリペプチドと記載）を意味している。
　ここで、野生体と同じポリペプチドは、公知のＷＴ１遺伝子のｃＤＮＡにコードされているポリペプチドである。ＷＴ１遺伝子には種々のバリアントが存在している。当該バリアントのうち最も全長の長いポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは配列番号３の配列（GenBnak# NM_024426）によって示される。この配列によって示されるものはＷＴ１のバリアントＤとして知られている。現在のところＷＴ１にはバリアントＡ～Ｄ（Ａ：GenBank# NM 000378、Ｂ：GenBank# NM 024424、Ｃ：GenBank# NM 024425、Ｄ：GanBank# NM 024426）が存在することが知られている。本明細書において、野生体と同じポリペプチドは、例えば種々のバリアントと比較したときに見られる置換、欠失または付加が、配列番号３の配列の対応する箇所に対して任意に導入されている配列に示されるポリヌクレオチドにコードされているポリペプチドを意味している。なお、ＷＴ１遺伝子は長さの異なる２つのタンパク質を発現することが知られている。よって、野生体と同じポリペプチドは、上述のようなバリアントに見られる変異ありまたはなしの、長さの異なる２つのタンパク質と同じアミノ酸配列によって示されるものを包含している。
　またここで、野生体と類似のポリペプチドは、野生体と同じポリペプチドのアミノ酸配列について比較したとき、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上のアミノ酸が一致しているポリペプチドである。さらに、野生体と類似のポリペプチドは、免疫誘導能を損なわないか、増強し得るか、または適用可能なヒト白血球型抗原の型を変更し得ることが知られている変異が、腫瘍特異的な抗原ペプチドの領域に対して導入されているポリペプチドである。
　当該変異としては、例えば国際公開第０５／０４５０２７号に記載の変異が挙げられる。当該変異は、９アミノ酸残基からなるペプチド部分におけるＣ末端側から１、４、６または９番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換である。上記文献にしたがって、以下のように対応するアミノ酸残基が置換され得る。１番目のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリン、イソロイシン、ロイシンまたはメチオニンのいずれかに置換され得る。４番目のアミノ酸は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかに置換され得る。６番目のアミノ酸は、アスパラギン、セリン、スレオニン、グルタミン、リジンまたはアスパラギン酸のいずれかに置換され得る。９番目のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグルタミンのいずれかに置換され得る。
　上記変異としては、例えば国際公開第号０５／０５３６１８号に記載の変異がさらに挙げられる。当該変異において、本願の配列番号３における７７０～７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの９番目がロイシンに置換されている。
　上記変異としては、例えば国際公開第号０７／０１６４６６号に記載の変異がさらに挙げられる。当該変異において、本願の配列番号３における７７０～７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの９番目がメチオニンに置換されている。
　上記変異としては、例えば欧州特許１１２７０６８号の意見書に記載の２つの変異がさらに挙げられる。１つ目の変異において、本願の配列番号３における７７０～７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの２番目がロイシンに置換されている。２つ目の変異において、本願の配列番号３における７７０～７９６番目の塩基に対応する塩基にコードされている９アミノ酸残基のうちの２番目がロイシンに、９番目がバリンに置換されている。
　またここで、腫瘍特異的なポリペプチドは、野生体と同じポリペプチドにおける抗原ペプチドを含んでいる領域のアミノ酸配列について比較したとき、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上のアミノ酸が一致しているポリペプチドである。さらに、野生体と類似のポリペプチドは、免疫誘導能を損なわないか、増強し得るか、または適用可能なヒト白血球型抗原の型を変更し得ることが知られている変異が、導入されているポリペプチドである。当該変異は上述の通りである。
　以上のことから、本発明の核酸構築物は、野生体と同じポリペプチド、野生体と類似のポリペプチドまたは腫瘍特異的なペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。したがって、本発明の核酸構築物は、上述のようなＷＴ１遺伝子における変異に加えて、コードしているアミノ酸が変化しない保存的な変異を任意に有している。
　なお、以下のような場合、本発明の核酸構築物には先頭のＡの５’末端側に１または２つの塩基を挿入する変異がさらに導入される：配列番号２の１９２位から７６９位の領域内または配列番号２に対応する配列における、当該領域と対応する領域内の任意の位置にＡＵＧによって表される塩基が、上述した変異のいずれかによって生成され、先頭のＡが１９１＋３ｎ位（ｎは１～１９２の整数）以外に存在する場合。
　本明細書に使用されるとき、配列番号２を参照している記載における“対応する配列”は、上述のようなＷＴ１遺伝子の種々のバリアントを表す公知のｃＤＮＡに対応するＲＮＡの配列を意味しており、これらのバリアントには、上述のように種々の変異が導入され得る。また、“対応する塩基”は、配列番号２のＸ位（Ｘは任意の整数）の塩基およびその周囲の塩基と比較して、上記“対応する配列”において特定される塩基を意味している。本明細書に接した当業者であれば、“対応する配列”および“対応する塩基”の意味を容易に理解し、適宜選択した配列番号２と“対応する配列”において、配列番号２のＸ位の塩基と“対応する塩基”を容易に見出し得る。よって、これ以降において、配列番号２を参照配列として、本明細書において本発明の核酸構築物について説明するが、すべての記載は、配列番号２と対応する配列における塩基の位置または領域を指すことが意図されている。
　本発明の核酸構築物において、配列番号２の１９１位に対応する塩基は、例えばＡ、ＵまたはＧによって表される塩基に置換され得る。いずれの塩基に置換されていても、真核生物において開始コドンとして機能している場合が報告されているコドンを生成し得る。また、本発明の核酸構築物において、配列番号２の１９１位に対応する塩基から始まる連続する塩基であり、配列番号２における７６９位の塩基までの任意の塩基を欠失し得る。これによって、上述のようなこれまでに公知の腫瘍特異的な抗原ペプチドを含んでいるポリペプチドをコードしている核酸構築物を提供し得る。
　本発明の核酸構築物において、ＡＵＧによって表される３塩基から始まる領域を生成する変異が導入されていることが好ましい。この変異によって、真核生物において最も多く見られる開始コドンが生成される。よって当該領域がコード領域として認識される精度が向上するので、本発明の核酸構築物にコードされているポリペプチドの発現量が向上する。このような変異が生成されている核酸構築物に含まれているＲＮＡの例として、以下の３つが挙げられる。
　（１）配列番号２における１９１位の塩基がＡに置換されているＲＮＡ。（２）配列番号２における１９１位の塩基から始まる連続する２０４塩基が欠失しているＲＮＡ。（３）ＡＵＧによって表される３塩基、および３ｍ（ｍは、０または１～２５０、より好ましくは１～２００の整数）の任意の塩基の順に５’末端側から連続している領域、ならびに当該領域に続いて配列番号２における７７０位～１６６３位の領域を含んでいるＲＮＡ。
　上記（１）は、本発明の核酸構築物におけるＷＴ１ポリペプチドをコードしている領域の第１番目の塩基がＡによって表される塩基に置換されているＲＮＡである。上記（２）は、本発明の核酸構築物におけるＷＴ１ポリペプチドをコードしている領域において最初に現れるＡＵＧによって表される３塩基から始まっているＲＮＡである。上記（３）は、これまでに腫瘍特異的な抗原ペプチドをコードしていることが同定されている領域（配列番号２における７７０位～１６６３位の領域）を含んでいるポリペプチド鎖のＣ末端側に、ＡＵＧに続いて０または３の倍数個の塩基が付加されているＲＮＡである。（１）～（３）のいずれを採用しても、野生型と比べて発現量がはるかに向上したＲＮＡを得ることができる。
　さらに、本発明の核酸構築物は、配列番号２の１位～１００位まで、より好ましくは１５０位、さらに好ましくは１２０位まで、最も好ましくは１９０位までの塩基または対応する配列における、当該塩基に対応する塩基が欠失していることが好ましい。このような欠失を有している本発明の核酸構築物は、後述する転写用コンストラクトに挿入された場合に、プロモータから開始コドンまでの距離が適切に調節されているため、タンパク質をより適切に発現させる。
　ここで、本発明の核酸構築物からのタンパク質の発現量は、野生型と比べて、少なくとも５倍以上であり、２５倍以上であることが好ましい。本発明の核酸構築物を細胞に導入して利用する場合に、少数の細胞を用いてタンパク質の必要な量を準備し得る。特にこのような細胞を生体に投与する場合、当該生体に所望の反応を誘導し得るタンパク質の量を、少ない細胞数によって生体に提供し得る。したがって、本発明の核酸構築物は、このような細胞を均質かつ大量に調製するときに生じる煩雑さを大きく軽減し、当該細胞の生体への投与を容易にする。後述の実施例に記載するように、本発明は、野生型と比較して最大で約５０倍以上にタンパク質の発現量が向上した核酸構築物を提供することができる。よって、本発明の核酸構築物は野生型と比べてはるかに取扱いが容易であり、非常に有用である。
　本発明の核酸構築物は、実施例にその有効性が示されているように、配列番号４または配列番号５によって示される領域を含んでいることが好ましい。本発明の核酸構築物が当該領域を有していれば、タンパク質の発現量が野生型と比べて２５倍以上に増強され得る。
　また、本発明の核酸構築物は５’キャップ構造をさらに有していることが好ましい。本発明の核酸構築物における５’キャップ構造は、インビトロまたはインビボにおいて付与され得る。精製および単離の容易さを考慮すると、ＷＴ１ポリペプチドをコードしている領域を含んでいるＲＮＡを用いてインビトロにおいて転写を行い、さらにインビトロにおいて５’キャップ構造を付与することが好ましい。インビトロにおける転写および５’キャップの付与は、当業者に公知の方法、市販の試薬または市販のキットなどを利用して容易に実施され得る。
　また、ＲＮＡの安定性およびタンパク質の発現量を向上させるために、本発明の核酸構築物は、３’末端にポリアデニレーション（ポリＡ）鎖をさらに有していることが好ましい。ポリＡ鎖は、５’キャップ構造と同様にインビトロおよびインビボにおいて本発明の核酸構築物に付与され得るが、同様の理由から、インビトロにおいて付与されることが好ましい。ポリＡ鎖の付与も同様に、当業者に公知の方法、市販の試薬または市販のキットなどを利用して容易に実施され得る。
　〔本発明の核酸構築物をコードしているポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを含んでいる転写用コンストラクト〕
　本発明は、上述のような本発明の核酸構築物をコードしているポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＷＴ１遺伝子産物またはその断片をコードしているＷＴ１遺伝子の領域を含んでいる。また、当該ポリヌクレオチドは、上述したような本発明の核酸構築物に導入されている変異と対応する変異が導入されている。本発明のポリヌクレオチドは本発明の核酸構築物の製造に特に適している。本発明の核酸構築物の製造に使用する場合、本発明のポリヌクレオチドは、本発明の核酸構築物を転写するためのコンストラクトに組み込まれている。
　上述のように、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んでいる転写用コンストラクトを提供する。転写用コンストラクトは、当該ポリヌクレオチドからのＲＮＡの効率的な転写を実現し得る種々の要素をさらに含んでいる。上述のように、本発明の核酸構築物の転写がインビトロにおいて実施されることが好ましいので、転写用コンストラクトに含まれている上記要素は、インビトロにおける転写の方法またはキットなどに合わせて選択され得る。インビトロ転写用の市販のキットに適合させたコンストラクトの詳細を本発明の転写用コンストラクトの例として以下に説明する。
　転写用コンストラクトは、上記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されているプロモータを含んでいる。当該プロモータは、インビトロにおいて上記ポリヌクレオチドからのＲＮＡの転写を促進し得るプロモータであればよく、その例としてはＴ７プロモータ、ＳＰ６プロモータおよびＴ３プロモータが挙げられる。また、転写用コンストラクトは、上記ポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル（すなわちターミネータ配列）をさらに含み得る。当該ターミネータ配列としては、Ｔ７ターミネータ、ＳＰ６ターミネータおよびＴ３ターミネータが挙げられる。なお、上記ポリヌクレオチドの下流において転写用コンストラクトを制限酵素などによって切断して転写させる場合、転写終結シグナルは不要である。
　転写用コンストラクトは、それ自体を増幅するために、ベクターとしての機能を有し得る。この場合、転写用コンストラクトは、転写用コンストラクトが導入されている細胞を選択するための選択マーカー遺伝子をさらに含み得る。選択マーカー遺伝子としては、従来公知の抗生物質に対して抵抗性を示す遺伝子、栄養要求性に関する変異を補う遺伝子、および試薬を用いた呈色反応を触媒する酵素を発現する遺伝子などが挙げられる。なお、転写用コンストラクトがこのような選択性を有していない場合には、例えばＰＣＲを利用して転写用コンストラクトを増幅し得る。したがって、転写用コンストラクトは、プラスミドＤＮＡに挿入されていない、ＰＣＲによって増幅された直鎖状のポリヌクレオチド鎖であり得る。この場合、プライマー対は、鋳型におけるＲＮＡのプロモータ領域を含めて増幅するように設計される。
　なお、ＣＤ１ｄのｍＲＮＡをさらにコードしている転写用コンストラクトを生成する場合、当該転写用コンストラクトは、ポリシストロニックであるか、またはモノシストロニックである。転写用コンストラクトがポリシストロニックである場合、当該転写用コンストラクトは２つのコード領域の上流に１つのプロモータを含んでいる。転写用コンストラクトがモノシストロニックである場合、当該転写用コンストラクトはそれぞれのコード領域の上流にプロモータを１つずつ含んでいる。もちろん、２つの転写用コンストラクトを本発明の核酸構築物用とＣＤ１ｄのｍＲＮＡ用とに分けて作製し得る。これらの態様の他に、ＷＴ１遺伝子産物およびＣＤ１ｄを融合タンパク質として発現させる態様が挙げられる。この場合、例えば、ＷＴ１遺伝子産物とＣＤ１ｄとの間に、特異的なタンパク質分解シグナル配列（Ｔ２Ａ配列など）が挿入されるようなｍＲＮＡが生成される。当該ｍＲＮＡが導入された細胞において、上記融合タンパク質は、発現された後に、２つのタンパク質に分解されて個々のタンパク質としての活性を示し得る。
　〔本発明の核酸構築物の製造方法〕
　本発明の核酸構築物は、例えば当該核酸構築物をコードするポリヌクレオチドの増幅と当該ポリヌクレオチドのクローニングとインビトロ転写反応との組合せ、または化学合成などの公知技術によって製造される。本発明の核酸構築物の製造方法の一例について以下に説明する。
　公知のＷＴ１遺伝子のｃＤＮＡに対して所望の変異を導入し得るプライマー対を設計する。当該プライマー対は、例えば野生体の配列のＮ末端を欠失するように設計される。このとき、通常は欠失させる塩基の数を調節する必要はない。〔本発明の核酸構築物〕の項において説明したような変異が生じない限り、インビトロ転写されるＲＮＡは、フレームシフト変異を起こさないからである。使用する鋳型のｃＤＮＡの配列を決定すれば、フレームシフト変異を起こしているか否かが分かるので、公知の方法にしたがって使用する前に鋳型ＤＮＡの配列決定を行い得る。
　当該プライマー対および鋳型のｃＤＮＡを用いたＰＣＲによって、所望のポリヌクレオチドを増幅する。増幅されたポリヌクレオチドおよびクローニングに使用するベクターを同じ制限酵素を用いて消化する。リガーゼを用いて消化したベクターおよびポリヌクレオチドをライゲーションして、当該ポリヌクレオチドを含んでいるベクター（転写用コンストラクト）を得る。
　本発明のポリヌクレオチドを含んでいるベクターを用いて、例えば適切な大腸菌を形質転換する。形質転換した大腸菌を適切な培地において増殖させる。当該ベクターは、例えば特定の抗生物質に対して耐性を示す遺伝子を含んでおりり、大腸菌の増殖に使用する培地は特定の抗生物質を含んでいる。市販のキットなどを用いて菌体からベクターを抽出する。
　回収されたベクターを環状のままか、または直鎖状にしてから市販のキットを用いて、インビトロ転写反応に供する。転写産物が５’末端のキャップ構造または３’末端にポリＡ付加などの修飾を受けていない場合、いずれも市販のキットを利用して、転写産物の５’末端に対してキャップ構造を付与し、転写産物の３’末端にポリＡ配列を付与し得る。
　ここでは、主にキットを利用して本発明の核酸構築物を製造する方法について簡単に説明した。しかし、当業者であれば、製造工程に使用する試薬の一部を自ら調製可能であることを理解する。したがって、当業者であれば、製造されるＲＮＡの性質にしたがって、市販のキットを部分的に改変すること、または試薬の一部を変更することによって、より適切なＲＮＡの製造が可能である。特に後述の実施例の記載を参照すれば、本発明の核酸構築物の製造にとって好適な手法、調製すべき試薬、選択すべきキット、およびこれらにおける変更すべき点を、当業者は十分に理解する。
　〔本発明の免疫治療用細胞を製造するためのキット〕
　また、本発明は、免疫治療用細胞を製造するためのキットを提供する。当該キットは、上述の核酸構築物またはポリヌクレオチドを含んでいる。当該キットに本発明の核酸構築物が含まれている場合、ユーザは、当該キットを用いて〔本発明の免疫治療用細胞〕に記載されている任意の細胞に核酸構築物を導入する。また、当該キットに本発明のポリヌクレオチド（転写用コンストラクトとして）が含まれている場合、ユーザは、インビトロまたはインビボにおいて本発明の核酸構築物を転写させ、当該核酸構築物を任意の細胞に導入する。キットは取扱説明書をさらに含み得る。当該取扱説明書には、例えば、本明細書におけるこれまでの記載から理解されるような、本発明の免疫治療用細胞（必要に応じて核酸構築物）の製造における必要な事項について記載されている。
　以上をまとめると、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
　（１）ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞であって、上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、および当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる、免疫治療用細胞、
（２）ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物が導入されている免疫治療用細胞であって、上記核酸構築物は、配列番号１の６９位から５１７位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域を含んでおり、配列番号２の１９１位から１９３位に示されているＣＵＧのうち、すべてを欠失しているか、もしくはＣからＡへの置換を有している、（１）に記載の免疫治療用細胞、
（３）上記核酸構築物から直接翻訳されるタンパク質の産生量が、配列番号２の１９１位から１７４１位に示されているコード領域を有しているＲＮＡから直接翻訳されるタンパク質の産生量の２５倍以上である、（１）または（２）に記載の免疫治療用細胞細胞、
（４）（１）～（３）のいずれか１つに記載の細胞を製造するための上記核酸構築物であって、導入された細胞においてタンパク質に直接翻訳される、核酸構築物、
（５）配列番号４または配列番号５によって示される領域を含んでいる、核酸構築物、
（６）（４）または（５）に記載の核酸構築物を任意の細胞に導入する工程を包含している、免疫治療用細胞の製造方法、
（７）（４）または（５）に記載の核酸構築物をコードしている、ポリヌクレオチド、
（８）（４）もしくは（５）に記載の核酸構築物、または（７）に記載のポリヌクレオチドを含んでいる、免疫治療用細胞を製造するためのキット、
（９）ＣＤ１ｄをコードしているｍＲＮＡをさらに含んでおり、細胞表面に存在する当該ＣＤ１ｄに対して、ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質が結合している、（１）～（３）のいずれか１つに記載の免疫治療用細胞。
　以下に本発明に係るＲＮＡの調製方法の一例および調製されたＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を野生型と比較した結果について説明する。本実施例は、本発明を例証しているのみであり、本発明の範囲を限定しない。
　〔本発明に係るＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドのクローニング〕
　目的とするＷＴ１のポリヌクレオチド配列をＰＣＲによって得た。鋳型には、購入したヒトＷＴ１のバリアントＤをコードするｃＤＮＡ（#SC308799、Origene社、配列番号３）を挿入したプラスミドＤＮＡを用いた。ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼとして、KOD-Plus-Ver.2（#KOD-211、東洋紡）を使用した。オリゴヌクレオチドの各プライマー対の配列およびＰＣＲの反応条件は以下の通りである。
　（ＡＴＧ－ＷＴ１用プライマー対）
フォワード：５’－ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＧ－３’（配列番号６、３位～８位：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列、９位～１３位：コザック配列、１４位～３４位：ＷＴ１の翻訳領域配列）；
リバース：５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号７、３位～８位は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列、９位～３１位：ＷＴ１の翻訳領域配列）
　（ΔＮ-ＷＴ１用プライマー対）
フォワード：５’－ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧＡ－３’（配列番号８、３位～８位：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列、９位～１３位：コザック配列、１４位～３３位：ＷＴ１の翻訳領域配列）；
リバース：５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧ－３’（配列番号９、３位～８位は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列、９位～３１位：ＷＴ１の翻訳領域配列）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＰＣＲによるＡＴＧ－ＷＴ１（配列番号３の１９１位（ｃからａに置換されている）から１７４１位に対応）の増幅産物の予想される鎖長は約１５８０塩基対であり、ΔＮ－ＷＴ１（配列番号３の３９５位から１７４１位に対応）のそれは約１３５０塩基対であり、アガロースゲル電気泳動を行って理論値と矛盾しないことを確認した。増幅産物のそれぞれをプラスミドｐｃＤＮＡ３にクローニングし、ｐｃＤＮＡ３－ＡＴＧ－ＷＴ１およびｐｃＤＮＡ３－ΔＮ－ＷＴ１とそれぞれを名づけた。
　（本発明に係る合成ＲＮＡの生成）
　上述のプラスミド（ｐｃＤＮＡ３－ＡＴＧ－ＷＴ１およびｐｃＤＮＡ３－ΔＮ－ＷＴ１）を、制限酵素ＮｏｔＩ（認識配列はｐｃＤＮＡ３上にある）を用いて直鎖状にした。そして、直鎖状にしたプラスミドのそれぞれを、QIAquick PCR Purification Kit（#28106、Qiagen社）によって精製した後にＲＮＡ合成の鋳型として使用して、所望のＲＮＡを合成した。
　（本発明に係る変異体ＲＮＡのからのタンパク質の発現量の確認）
　２つの変異型のＷＴ１　ｍＲＮＡを、タンパク質の発現量について野生型のＷＴ１　ｍＲＮＡと以下のように比較した。
　２つの変異型のＷＴ１　ｍＲＮＡおよび野生型のＷＴ１　ｍＲＮＡをそれぞれ同量ずつ用いて、３つのディッシュに分けて播いたＨＥＫ２９３（３×１０６個の細胞）を、リポフェクション法にしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションした各細胞を、ＣＯ２インキュベータ、３７℃においてインキュベートした。培養液を捨てた後に泳動用の溶解緩衝液を加えてから、セルスクレーパを用いてインキュベートした細胞を掻きとり、チューブに移した。チューブ内の細胞溶解物を超音波処理によってさらに破砕してサンプルを得た。
　各サンプルを適宜希釈した上で１５μｌずつを電気泳動した（各サンプルの希釈率については後述）。ゲルを平衡化し、サンプルをゲルからメンブレンに転写した。サンプルが転写されたメンブレンを、ブロッキングした後に、ウサギ抗ＷＴ１抗体（SC-192、SantaCruz社）とともにインキュベートした。３回にわたってメンブレンを洗浄し、ＨＲＰ標識されているヤギ抗ウサギＩｇＧの二次抗体（#HAF008、R&D社）とともにメンブレンをインキュベートした。０．０５％のTween20を含有しているＴＢＳを用いて３回にわたってメンブレンを洗浄した後に、Immobilon Western（#WBKLS0500、Millipore社）を用いてメンブレンを処理して各バンドを検出した。
　各バンドを検出した結果を図１に示す。各レーンの上に記載されている“×”の前の数値は、ポリアクリルアミドゲルにアプライされたサンプルが、元の細胞溶解物から何倍に希釈されているかを示している。野生型のＷＴ１のｍＲＮＡからは、全長のタンパク質（５１７アミノ酸）がメジャーバンドとして、全長より短いバンドがマイナーバンドとして検出された（ＣＴＧの１×および５×）。Ｎ末端の一部を欠失しているＷＴ１のＲＮＡからは、野生型のＷＴ１におけるマイナーバンドと同じ位置に約５０倍以上の強度のバンドとして検出された（ｄｅｌｔａの２５×、５０×）。コード領域の１塩基目がＡに置換されているＷＴ１のＲＮＡからも野生型のＷＴ１におけるメジャーバンドと同じ位置に約５０倍以上の強度のバンドとして検出された（ＡＴＧの２５×および５０×）。
　また、ｓｔｄにおけるバンドは５０ｎｇのタンパク質によって検出されている。ｓｔｄにおけるバンドの強度との比較から、野生型のＷＴ１の検出量は１×において、少なくとも約５０ｎｇである。アプライされたサンプルは元のサンプルの１／１０に相当するので、１×１０６細胞当りの発現量は少なくとも約２５０ｎｇである。よって体重が約３ｋｇの動物における免疫を誘導するには、十分なタンパク質の量とは言えない。一方で、２つの変異体ＲＮＡ（ｄｅｌｔａおよびＡＵＧ）からのＷＴ１の発現量は、同様にそれぞれ少なくとも約５０倍以上であるので、１×１０６細胞当りの発現量は約３０μｇ以上である。
　本発明は、生物学的分野および医学分野、特に腫瘍の治療などへの応用が期待される。

Claims (9)

  1. 　ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物を含んでいる免疫治療用細胞であって、
    　上記核酸構築物は、配列番号１の１９４位から４９３位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域、ならびに当該領域の５’末端側に、３ｍ（ｍは０または正の整数）の塩基を介して存在している、機能的な開始コドンとしてＡＵＧのみを含んでいる、免疫治療用細胞。
  2. 　ウィルムス腫瘍遺伝子産物またはその断片をコードしている核酸構築物が導入されている免疫治療用細胞であって、
    　上記核酸構築物は、配列番号１の６９位から５１７位によってか、または配列番号１に対応する配列の対応する位置によって示されているウィルムス腫瘍遺伝子産物の断片をコードしている領域を含んでおり、配列番号２の１９１位から１９３位に示されているＣＵＧのうち、すべてを欠失しているか、もしくはＣからＡへの置換を有している、請求項１に記載の免疫治療用細胞。
  3. 　上記核酸構築物から直接翻訳されるタンパク質の産生量が、配列番号２の１９１位から１７４１位に示されているコード領域を有しているＲＮＡから直接翻訳されるタンパク質の産生量の２５倍以上である、請求項１または２に記載の免疫治療用細胞。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞を製造するための上記核酸構築物であって、導入された細胞においてタンパク質に直接翻訳される、核酸構築物。
  5. 　配列番号４または配列番号５によって示される領域を含んでいる、請求項４に記載の核酸構築物。
  6. 　請求項４または５に記載の核酸構築物を任意の細胞に導入する工程を包含している、免疫治療用細胞の製造方法。
  7. 　請求項４または５に記載の核酸構築物をコードしている、ポリヌクレオチド。
  8. 　請求項４もしくは５に記載の核酸構築物、または請求項７に記載のポリヌクレオチドを含んでいる、免疫治療用細胞を製造するためのキット。
  9. 　ＣＤ１ｄをコードしているｍＲＮＡをさらに含んでおり、細胞表面に存在する当該ＣＤ１ｄに対して、ＮＫＴ細胞の抗原受容体によって認識される糖脂質が結合している、請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫治療用細胞。
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