WO2012165926A2 - 항-ａｔｉｃ 자가면역항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention provides a fragment comprising an autoantibody or an antigen-binding site (paratope) that specifically binds to ATIC, an antigen fragment that specifically binds to the autoimmune antibody, the autoimmunity
  • the present invention relates to a liver cancer diagnostic composition comprising an agent for measuring the expression level of an antibody or fragment comprising the antigen-binding portion thereof, a hybridoma cell line producing the autoimmune antibody, and a liver cancer diagnostic kit comprising the composition of the present invention.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing liver cancer using the composition of the present invention and a method for screening a liver cancer therapeutic agent using the autoimmune antibody.
  • Liver diseases including hepatitis, cirrhosis, and liver cancer, are the most common single disease in Korea, Japan, Taiwan, China, and most Southeast Asian countries, and liver cancer ranks 5th among all cancers in Korea. 9.2%) (Korean Ministry of Health, Welfare and Family Affairs 2007).
  • liver cancer marker protein test such as AFP
  • biomarkers are known for such diagnosis, prognosis, or therapeutic evaluation.
  • AFP and PIVKA-II are the best known markers, but they still have limitations regarding specificity and sensitivity.
  • liver cancer marker candidate proteins and genes have been reported by Genomics and Proteomics studies, but the reported genes are mainly tissue-targeted genes and the possibility of diagnosis in the blood. The situation is still not disclosed. This is because the discovery of most tumor markers due to the intrinsic characteristics of the biomarker has been studied based on the difference in gene expression of tissues, and because of the high gene expression in tissues, the diagnosis of urine or serum is not possible. . Therefore, it is important to discover tumor markers secreted from blood or urine for the convenience of diagnosis, and a method of analyzing biomarkers and diagnosing liver disease including liver cancer is required by a different approach.
  • the immune system is built as a unique system that distinguishes self from non-self early in the generation of an organism, resulting in antigen-only antigens to foreign antigens exposed to the immune system in the normal state of the individual. It develops to induce antibody immune response and cellular immune response.
  • antibodies are generated against self-antigens.
  • the expression position of the antigens is different from normal, and intracellular expression proteins are secreted or modified. It has been reported that this is due to the appearance of different forms, or other features that appear different from normal individuals.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • HER-2 / neu oncoprotein is known to induce autoimmune antibodies as a receptor protein present in the cell membrane
  • p53 a protein with cancer cell growth inhibitory function
  • CENP-F centromere protein F
  • Hu and Yo onconeurological proteins
  • cancer diagnosis that detects different autoimmune antibodies at one time may be more effective than one autoimmune antibody. Therefore, studies on multiple detection of autoimmune antibodies have been presented as important tasks. For example, it has been reported that breast cancer can be diagnosed with 100% specificity and 80% sensitivity by detecting autoimmune antibodies against ASB-9, SERAC1, and RELT (L. Zhong et al. Breast Cancer Res). 10: 3 (2008) R40), simultaneous detection of autoimmune antibodies against PIM1, MAPKAPK3, and ACVR2B confirmed colon cancer with 74% specificity and 83% sensitivity (I. Babel et al. Mol Cell Proteomics 8:10 (2009) 2382-2395). As cancer diagnosis using cancer-derived autoimmune antibodies has been shown to be highly effective, new discovery of cancer-derived autoimmune antibodies has become an important field for deriving cancer biomarkers.
  • Proteomics technique is to spread the cancer cell-derived protein by two-dimensional electrophoresis (2D-PAGE), using the plasma of cancer patients as an autoimmune antibody sample to identify the reactive protein spot, and then identified the identified protein by mass spectrometry Including abbreviation process, it is also called SERPA (serological proteome analysis).
  • MAPPING Multiple affinity protein
  • MAPPING Multiple affinity protein
  • affinity chromatography resin which conjugates the antibodies isolated from the patient's blood, and shedding cancer cell proteins to catch the binding proteins and identifying them by mass spectrometry. profiling techniques are also used. It also finds autoimmune antibodies by dividing cancer cell debris into thousands of fractions to produce protein chips and examine the responsiveness of the patient's blood to them.
  • proteomic assays have the advantage of directly identifying antibody responsiveness to cancer cell-derived proteins that retain their post-transcriptional modification (PTM) properties, which can identify several autoimmune antibodies not found by the SEREX technique. But it still has another limitation.
  • PTM post-transcriptional modification
  • First is the quantity of antibodies. If the target to be analyzed is a mixture of two or more of them, the analysis of a large amount is preferred, and the rest are likely to be excluded from the range that can be analyzed.
  • the patient serum is a mixture of numerous antibodies and an autoimmune antibody constituting the same. Analytical levels may be determined by quantitative differences and affinity for antigens, making it impossible to analyze the desired autoimmune antibody.
  • autoimmune antibody sample to be analyzed depends on the patient, there is a limitation in systematically analyzing the autoimmune antibody generation according to the onset of cancer, and also because it is difficult to overtake the patient's blood for the experiment. There is a limit to itself.
  • antibody response sites can be divided into two types, one is a protein sequence dependent epitope, and the other is a protein structure dependent epitope. to be. Induction of antibodies to specific antigens in vivo reflects the state of the antigen that first encounters the immune cell antibody, which results in a structure in which the antigen-antibody reaction proceeds in solution and the antigenic protein remains dissolved in the blood.
  • the SERPA method mentioned above uses two-dimensional electrophoresis, which is a method of analyzing the reaction of the antibody in a state in which the analyte protein is denatured and spread using SDS and urea. Therefore, there is a limit that can be detected when the epitope is protein sequence dependent, but not when it is structure dependent.
  • autoimmune antibody research that can be used as a marker for cancer development has a limited diagnostic effect despite the suggested application possibility, and thus there is a limitation in using autoimmune antibodies as a biomarker for cancer diagnosis.
  • autoimmune antibody markers for diagnosing liver cancer cannot be found.
  • the present inventors have made efforts to develop autoimmune antibodies for liver cancer diagnosis.
  • an ELISA method for the detection of autoimmune antibodies was devised, and completed the present invention by confirming that it is possible to diagnose human liver cancer individuals. .
  • One object of the present invention is to provide a fragment comprising an autoimmune antibody or antigen-binding site thereof that specifically binds to ATIC.
  • Another object of the present invention is to provide an antigen fragment that specifically binds to the autoimmune antibodies of the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing liver cancer comprising an agent for measuring the expression level of an autoimmune antibody of the present invention or a fragment comprising the antigen-binding site thereof.
  • Still another object of the present invention is to provide a hybridoma cell line producing the autoimmune antibody of the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing liver cancer comprising the composition of the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing liver cancer using the composition of the present invention.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for screening a liver cancer therapeutic agent using the autoimmune antibody of the present invention.
  • the anti-ATIC specific autoimmune antibody of the present invention When used as a diagnostic marker for liver cancer, a sensitivity of about 87% is obtained by using non-invasive biological samples such as blood, plasma, serum, and lymphatic fluid, without using an invasive diagnostic method. About 88% of the specificities can diagnose the development of liver cancer.
  • the present invention by identifying the sequence to react with the marker, it is possible to easily diagnose liver cancer using only the identified amino acid sequence without having to design a complex reactant to identify the marker, it is effective in developing a liver cancer diagnostic kit to be.
  • Figure 1 shows the procurement of XC154 autoimmune antibody derived from liver cancer mouse and the proposal of a cancer diagnostic method using the same.
  • HBx liver cancer model The autoimmune antibodies obtained from mouse-derived B-cell hybridoma clones were confirmed to be responsive to liver cancer cells to obtain XC154 antibodies.
  • HepG2 and Hepa1c1c7 cells which are liver cancer cell lines, were immobilized, permeabilized, and treated with autoimmune antibodies derived from liver cancer model mice. Fluorescently labeled secondary antibodies were identified by flow cytometric ananlysis after the reaction.
  • Phage expressing epitopes corresponding to XC154 antibodies obtained by the panning method using a phage expressing cyclic peptide library (Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library kit; New England Biolabs) forming a cyclic structure
  • a phage expressing cyclic peptide library Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library kit; New England Biolabs
  • CDR sequences of TAB-XC154 autoimmune antibodies show complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain mutation region (V H , FIG. 2A) and the light chain mutation region (V L , FIG. 2B) of the obtained XC154 antibody.
  • CDNA was synthesized from total RNA extracted from XC154 antibody-producing B cell hybridoma and amplified by PCR using a heavy chain mutation region complementarity determining region primer and a light chain mutation region complementarity determining region primer.
  • the recombinant plasmid was then prepared by ligation to the pTOP Blunt V2 vector. Recombinant plasmids were amplified in host cells, extracted and analyzed by sequencing. Protein sequences were identified from the analyzed nucleotide sequences, and CDR sequences were determined based on Kabat CDR definitions.
  • Figure 3 shows the results of the flow cytometry (a) and intracellular staining (b) to confirm the XC154 antibody reactivity against various cancer cells.
  • a flow cytometry
  • b intracellular staining
  • FIG. 5 shows the results of screening a phage cyclic peptide library with an XC154 antibody to screen XC154 antibody-specific antigen-expressing phage as a result of screening TAB-XC154 antibody-specific epitope expression phage.
  • FIG. 5A panning using the XC154 antibody was performed five times, and four phages (XC154p1, XC154p2, and XC154p4. XC154p9) having different peptide sequences were selected.
  • FIG. 5B as a result of confirming the reactivity with respect to these XC154 antibodies by ELISA method, it was confirmed that the XC154p1 phage had the highest TAB-XC154 antibody specific reactivity.
  • liver cancer diagnosis using XC154p1 epitope expression phage Serum cancer patients and normal serum were analyzed by ELISA using TAB-XC154 antibody specific reaction peptide expression phage XC154p1 as a coating antigen. As a result, when the cutoff value was set to 0.059, it was confirmed that hepatocarcinoma patients could be distinguished by sensitivity of 86.96% and specificity of 88.24%.
  • FIG. 8 shows the results of breast cancer diagnosis using XC154p1 epitope expressing phage.
  • 9 shows the identification of XC154 antibody specific antigen antigen proteins.
  • 9 a shows purification of XC154 antibody reactive antigen protein.
  • LnCap-LN3 cell lysate with overexpressed TAB-XC154 antibody-responsive antigen was prepared and fractionated with HitrapQ-sepharose, an anion exchange resin, to partially purify the antigen. Only the fraction containing the excess of the antigen was concentrated and developed on SDS-PAGE, and only the corresponding region of XC154 antigen was extracted, and in-gel digestion was carried out for protein identification by the zebra analysis.
  • 9b shows the mass spectrometry results of the XC154 antibody specific antigen antigen protein.
  • ATIC As a result of protein identification of XC154 antigen, it was confirmed that ATIC had the highest score value.
  • ATIC is known as a protein involved in purine biosynthesis and plays an important role in the proliferation of cancer cells, and its calculated molecular weight is 64.5 KDa, which is similar to the molecular weight of the XC154 antigen.
  • 10 shows verification of the identified XC154 antibody specific antigenic proteins.
  • 10 a shows ATIC expression inhibition using siRNA. After 48 hours after transfecting siRNA specifically acting on ATIC into HepG2 cells, the expression of the gene was confirmed by RT-PCR. As a result, it was confirmed that more than 50% of the expression was suppressed.
  • Figure 10b shows the result of the somatic cell assay for confirming the XC154 antibody response after inhibition of ATIC gene expression. As a result of confirming the reactivity of the XC154 antibody to the cells treated with siRNA in the same manner as above, it was confirmed that the antibody response is reduced by about 20%.
  • Figure 10c shows the result of Western blotting to confirm the XC154 antibody response after inhibition of ATIC gene expression.
  • the present invention provides a fragment comprising an autoimmune antibody or antigen-binding site thereof that specifically binds to ATIC.
  • ATIC (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase / IMP cyclohydrolase) is a protein with two functions that catalyzes the last two stages of the de novo biosynthesis process of purine.
  • the biosynthesis process of purine and pyrimidine is a reaction that generates the nucleotides necessary for DNA and RNA synthesis. It is rarely used in normal cells but is active in rapidly dividing cells such as cancer cells.
  • liver cancer patients' blood liver cancer can be diagnosed using a novel epitope structure that specifically reacts with them. It became clear.
  • the term "autoantibody” refers to an antibody that specifically reacts with its body composition and is also referred to as an autoantibody or an autoantibody.
  • individuals do not produce antibodies because they do not generate an immune response to their inherent essence.
  • an antibody is generated by recognizing a substance originally possessed as an antigen, which is a disease phenomenon and is an autoimmune disease such as systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.
  • the autoimmune antibody of the present invention refers to an antibody produced against an antigen derived from cancer cells involved in abnormal growth of cancer cells, and specifically, an antibody generated against ATIC, a cancer-derived antigen.
  • Anti-ATIC autoimmune antibodies "or" autoimmune antibodies that specifically bind to ATIC ".
  • the autoimmune antibodies obtained from the hybridoma clones derived from liver cancer model mice were identified as "XC154 autoimmune antibodies” or "TAB-XC154 autoimmune antibodies” by confirming their reactivity to liver cancer cells. . Subsequently, as a result of identifying the specific antigen-binding protein for the antibody, it was finally confirmed that the ATIC has a molecular weight of 64.5 KDa, and the autoimmune antibody was confirmed to be an anti-ATIC autoimmune antibody (FIGS. 9 and 10).
  • antigen-binding site refers to a site of an antibody that binds to an antigen.
  • the antigen-binding site is a small site of the Fv region of the antibody and includes the heavy and light chain portions of the antibody, and binds to the antigenic determinant (epitoe) of the antigen.
  • the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding portion thereof may be one that recognizes an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 to 20, and more preferably, an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17. It may be to recognize.
  • CLPSWFHRC (Cys-Leu-Pro-Ser-Trp- of the present invention) Phe-His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 17), CAPSWLHRC (Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu-His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 18), CSPSGLFSC (Cys-Ser-Pro-Ser-Gly- Specific for any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of Leu-Phe-Ser-Cys; SEQ ID NO: 19) and CTPSWFHRC (Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 20) It was confirmed that the reaction was possible, and among them, the most reactive with the amino acid sequence of
  • one antibody molecule has two heavy chains and two light chains, each of which has a variable region at its N-terminus.
  • Each variable region consists of three complementarity determining regions (CDRs) and four framework regions (FRs), which determine the antigen binding specificity of an antibody and determine the structure of the variable region.
  • CDRs complementarity determining regions
  • FRs framework regions
  • the autoimmune antibody of the present invention comprises an autoimmune antibody consisting of a CDR1 sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 sequence of SEQ ID NO: 4, or a CDR3 sequence of SEQ ID NO: 5, or a fragment comprising an antigen binding site thereof It may include, and may be an autoimmune antibody or fragment thereof including all of the sequences of CDR1, CDR2, and CDR3.
  • the autoimmune antibody of the present invention as part of the light chain variable region, a fragment comprising an autoimmune antibody or antigen-binding portion thereof consisting of a CDR1 sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2 sequence of SEQ ID NO: 7 or a CDR3 sequence of SEQ ID NO: 8 It may include, and may be an autoimmune antibody or fragment thereof including all of the sequences of CDR1, CDR2, and CDR3. Furthermore, it is obvious that a nucleic acid sequence encoding the sequence is also included in the present invention.
  • the autoimmune antibody of the present invention may be an autoimmune antibody consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as a heavy chain variable region sequence or a fragment comprising an antigen-binding site thereof, and a light chain variable region sequence of SEQ ID NO: 2 It may comprise a fragment comprising an autoimmune antibody or antigen-binding site thereof consisting of an amino acid sequence.
  • the heavy and light chains may be used individually or together according to the purpose, and a free combination of a plurality of CDR sequences and light and heavy chains is possible according to conventional genetic engineering methods as desired by those skilled in the art.
  • the analysis of the complementarity determining region (CDR) sequence to study the characteristics of the autoimmune antibody as a result of the heavy chain CDR1 of the autoimmune antibody of SEQ ID NO: 3; A heavy chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 4; And a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 as set out in SEQ ID NO: 5 and a light chain CDR1 as set out in SEQ ID NO: 6; Light chain CDR2 set forth in SEQ ID NO: 7; And it was confirmed that the light chain variable region comprising a light chain CDR3 described in SEQ ID NO: 8, it was confirmed that the autoimmune antibody comprising a heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (Fig. 2). ).
  • Autoimmune antibodies of the invention include polynucleotides encoding fragments having the immunological activity of an antibody molecule capable of achieving heavy chain or antibody-antigen binding comprising two full lengths.
  • antibodies of the invention include polynucleotides encoding fragments with immunological activity of an antibody molecule capable of achieving a light chain comprising two full lengths or antibody-antigen binding.
  • a fragment having an immunological activity of an antibody molecule refers to a fragment having an antigen binding function. Examples of antibody fragments include (i) the variable region of the light chain (V L ) and the variable region of the heavy chain (V H ) and the constant of the light chain.
  • Fab fragment consisting of region (C L ) and the first constant region (C H1 ) of the heavy chain; (ii) a Fd fragment consisting of the V H and C H1 domains; (iii) a Fv fragment consisting of the V L and V H domains of a monoclonal antibody; (iv) a dAb fragment consisting of a V H domain; (v) isolated CDR regions; (vi) a F (ab ') 2 fragment that is a bivalent fragment comprising two linked Fab fragments; (vii) a single chain Fv molecule (scFv) bound by a peptide linker that binds the V H domain and the V L domain to form an antigen binding site; (viii) bispecific single chain Fv dimers and (ix) diabodies, which are multivalent or multispecific fragments produced by gene fusion, and the like.
  • scFv single chain Fv molecule
  • the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof of the present invention may preferably be a fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof produced by the hybridoma cell line of Accession No. KCTC 11873BP.
  • the present invention provides an antigen fragment that specifically binds to an autoimmune antibody that specifically binds to the ATIC.
  • an antigen that specifically binds to an autoimmune antibody that specifically binds to ATIC includes all proteins capable of specifically binding to an autoimmune antibody, and is not limited to a specific protein or polypeptide.
  • the antigen may include all fragments or variants thereof as long as they can be recognized by anti-ATIC autoimmune antibodies.
  • the antigen may consist of at least 9 amino acids, preferably 12 or more amino acids.
  • the antigen may be an epitope sequence sequence that can be recognized by the autoimmune antibody marker of the present invention.
  • the sequence is not limited to the size or type of the sequence as long as the sequence is recognizable by the autoimmune antibody of the present invention.
  • the sequence may be a polypeptide sequence having cysteine at the end of seven amino acids.
  • the sequence in which cysteine exists at the end of these seven amino acids is CLPSWFHRC (Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 17) and CAPSWLHRC (Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu -His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 18), CSPSGLFSC (Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys; SEQ ID NO: 19) and CTPSWFHRC (Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe It may be any one or more amino acid sequence selected from the group consisting of -His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 20), and the recognition by the autoimmune antibody may be more effective by forming a cyclic structure in the presence of the cysteine.
  • the above examples do not limit the kinds of sequences recognizable by the autoimmune antibodies of
  • the present invention provides a composition for diagnosing liver cancer comprising an agent for measuring the expression level of the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof.
  • the term "diagnosis” refers to confirming the presence or characteristics of a pathological condition, and for the purposes of the present invention, as well as confirming the development of liver cancer, as well as recurrence, metastasis, drug reactivity, resistance of the subject after treatment of liver cancer. It may include determining whether or the like.
  • determining whether or the like may include determining whether or the like.
  • an autoimmune antibody that specifically binds to the ATIC of the present invention by determining the level of ATIC expression from a sample of a suspected liver cancer, whether or not the individual has a good prognosis in the future, Prediction is possible up to
  • sample is from the group consisting of whole blood, serum, blood, plasma, saliva, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid and intercellular fluid with different expression levels of anti-ATIC autoimmune antibodies, which are indicators of liver cancer diagnosis. It may be any one or more samples selected, but is not limited thereto.
  • diagnostic marker is a substance capable of diagnosing cancer cells from normal cells, and has a prognosis compared to normal cells or cancer cells having a good prognosis.
  • Polypeptides or nucleic acids e.g. mRNA, etc.
  • lipids e.g. glycolipids, glycoproteins or organic biomolecules such as sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like that increase or decrease in cells with poor cancer.
  • sugars monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.
  • the hepatic cancer diagnostic marker of the present invention exhibits a particularly high level of expression in whole blood, blood, serum or plasma of an individual exhibiting liver cancer, as compared to whole blood, blood, serum or plasma of an individual with normal liver. It is a visible anti-ATIC autoimmune antibody.
  • liver cancer generally refers to a cancer that originates in hepatocytes.
  • Liver cancer includes primary liver cancer in the liver from the beginning and metastatic liver cancer in which cancer from other tissues has spread to the liver.
  • the cause is unclear in most cases, cirrhosis is frequently found, and liver cancer is found to occur in patients with cirrhosis and carriers of chronic active hepatitis B or hepatitis B.
  • the present inventors have confirmed that, when using the autoantibody marker of the present invention, it can be diagnosed with a high level of sensitivity and specificity for the development of liver cancer from an individual.
  • the agent for measuring the expression level of the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to ATIC is increased in the expression of whole blood, serum, plasma, lymph and intercellular fluid in the onset or suspected liver cancer.
  • CLPSWFHRC Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 17
  • CAPSWLHRC Cys-Ala-Pro-Ser-Trp- Leu-His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 18
  • CSPSGLFSC Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys; SEQ ID NO: 19
  • CTPSWFHRC Cys-Thr-Pro-Ser-Trp- Phe-His-Arg-Cys; SEQ ID NO: 20
  • Examples of analytical methods for this include Western blot, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunity staining, immunization Precipitation assays, complement fixation assays, FACS and protein chips, and the like.
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • radioimmunoassay radioimmunoassay
  • radioimmunoassay radioimmunoassay
  • oukteroni immunodiffusion rocket immunoelectrophoresis
  • tissue immunity staining immunization Precipitation assays
  • complement fixation assays FACS and protein chips, and the like.
  • the method for diagnosing liver cancer can be achieved through an antibody-antigen reaction between an anti-ATIC autoimmune antibody of the present invention and an antigen specifically binding thereto.
  • the term "antigen-antibody complex” is an autologous marker that is a liver cancer marker. It refers to a combination of an immune antibody and an antigen specific thereto, and the amount of antigen-antibody complex formation can be measured quantitatively through the magnitude of a signal of a detection label.
  • Such detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not necessarily limited thereto.
  • enzymes available when an enzyme is used as the detection label include ⁇ -glucuronidase, ⁇ -D-glucosidase, ⁇ -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetyl Cholinesterase, glucose oxidase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyru Bait decarboxylase, ⁇ -latamases and the like, but is not limited thereto.
  • Examples of the fluorescent material include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde, fluorescamine, and the like.
  • Examples of ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.
  • Examples of luminescent materials include, but are not limited to, acridinium ester, luciferin, luciferase, and the like.
  • Examples of the microparticles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like.
  • redox molecules examples include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN) 8 , [Os (bpy) 3 ] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ , [MO (CN) 8 ] 4- and the like.
  • radioisotopes include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re and the like. It is not limited.
  • phage display cyclic peptide library system in which cysteine is present at the end of the sequence of seven amino acids to form a cyclic structure. Phages that specifically bind to -ATIC autoimmune antibodies are selected, while only those groups that are highly reactive with the anti-ATIC autoimmune antibodies of the present invention among the selected phages are purified and treated with a coated antigen, followed by These amino acid sequences were confirmed by confirming the reactivity with the binding immune antibody (Table 1).
  • the present invention provides a liver cancer diagnostic use of the composition comprising an agent for measuring the expression level of the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof.
  • composition comprising the autoimmune antibody or fragment comprising the antigen-binding site and an agent for measuring the expression level thereof is as described above, in the present invention, an autoimmune antibody or antigen thereof that specifically binds to ATIC. Fragment itself comprising a binding site, or a composition comprising an agent for measuring the expression level thereof may be used for the diagnosis of liver cancer.
  • the present invention provides a hybridoma cell line producing the autoimmune antibody of the present invention.
  • hybrida is a cell made by artificially fusion of two different cell types, using two or more homologous or heterologous cells using a substance or a virus that causes cell fusion, such as polyethylene glycol. Refers to a fused cell.
  • Hybridomas integrate different functions of different cells into one cell. Lymphocytes are representative of hybridomas. In particular, hybrid cells in which myeloma cells and B cells, the progenitor cells of antibody-producing cells, are fused among lymphocytes in the spleen or lymph nodes produce monoclonal antibodies and are widely used in research and clinical practice.
  • Hybridomas producing the autoimmune antibodies of the present invention can be used by appropriate modification of cells known in the art by those skilled in the art.
  • the splenic cells of the HBx transgenic mice whose liver cancer has been identified are secured as B cell populations, and cell-fused with Sp2 / 0, a mouse myeloma cell, to prepare a B cell hybridoma cell population.
  • the hybridoma cell line producing the -XC154 clone secreting antibody was selected and deposited with the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center on February 21, 2011, and was assigned accession number KCTC 11873BP.
  • the hybridoma cell line may be a cell line having accession number KCTC 11873BP.
  • the present invention provides a kit for diagnosing liver cancer comprising the composition of the present invention.
  • the kit for diagnosing liver cancer of the present invention is an analysis method as well as an antibody that recognizes a primer, a probe, or optionally a marker for measuring the expression level of an anti-ATIC autoimmune antibody that is a marker for diagnosing liver cancer or an antigen-binding site thereof.
  • One or more other component compositions, solutions, or devices suitable for use may be included.
  • the kit for measuring the protein expression level expressed by the coding of genes encoding the diagnostic marker ATIC in the present invention is labeled with a substrate, a suitable buffer, a chromophore or a fluorescent material for immunological detection of the antibody.
  • the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like.
  • the chromophore may be a peroxidase or an alkaline force.
  • Fatase alkaline phosphatase
  • the fluorescent material may be used FITC, RITC and the like
  • the colorant substrate is ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfur Phonic acid)) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethyl benzidine) can be used.
  • kits for measuring protein levels in the kit include Western blot, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), radioimmunoassay, radioimmunospreading, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrolysis There are, but are not limited to, electrophoresis, tissue immunity staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS and protein chips.
  • the kit of the present invention may be a kit using an ELISA method.
  • the ELISA method for measuring protein expression level is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, or a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of an antibody that recognizes an antigen attached to a solid support.
  • Indirect ELISA direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in a complex of antibody and antigen attached to a solid support, reacted with another antibody that recognizes the antigen in a complex of antibody and antigen attached to a solid support.
  • various ELISA methods including indirect sandwich ELISA using a labeled secondary antibody which then recognizes this antibody.
  • a labeled antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex is enzymatically developed or labeled for an antibody that recognizes an antigen of the antigen-antibody complex. It can be detected by the sandwich ELISA method which attaches the secondary antibody thus enzymatically and colors it.
  • the expression level of the anti-ATIC autoimmune antibody which is a diagnostic marker, can be checked to determine the onset of liver cancer.
  • the peptide phage library was used to identify an epitope sequence that reacts with the autoimmune antibody of the present invention, and reacted with the primary antibody which is an autoimmune antibody in the sample using the identified sequence.
  • the anti-human IgGAM-HRP was reacted with each other to confirm the formation and the amount of the antigen-antibody complex. As a result, a distinct pattern was observed in the serum of normal and liver cancer individuals (FIG. 7).
  • liver cancer When detecting anti-ATIC autoimmune antibodies and diagnosing liver cancer using the same method, liver cancer can be diagnosed with high specificity and sensitivity, and in an exemplary embodiment of the present invention, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) As a result of the detection, it was confirmed that normal and liver cancer individuals can be distinguished and diagnosed with sensitivity of about 87% and specificity of about 88% (FIG. 7). In addition, as a result of the breast cancer patient serum by the same method, the results of the breast cancer patient serum showed a result that is indistinguishable from normal, confirming that the method of the present invention is specific for diagnosing liver cancer (FIG. 8).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the term "sensitivity” refers to a ratio of positively detecting a diseased individual, and when using a diagnostic method, it is a criterion of how well to actually find a corresponding object.
  • the term “specificity” refers to the rate of detecting a normal subject negatively, and is a criterion of how well to classify the subject that does not correspond to the disease.
  • Western blot using one or more antibodies to the diagnostic marker can be used.
  • the whole protein is isolated from the sample, electrophoresed to separate the protein according to size, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody.
  • tissue immunostaining with one or more antibodies to the marker can be performed. After tissues are collected and fixed in a subject with liver cancer or suspicion, paraffin format blocks are prepared by methods well known in the art.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read to confirm the presence or expression level of the protein, You can check for the development of liver cancer.
  • the present invention provides a method for diagnosing liver cancer, comprising detecting fragments comprising autoimmune antibodies or antigen-binding sites thereof that specifically bind to ATIC using the composition of the present invention. .
  • the method for diagnosing liver cancer of the present invention preferably comprises the steps of: (a) measuring the expression level of an autoimmune antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to ATIC from a sample of a subject suspected of liver cancer; And (b) comparing the expression level with the expression level of the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof that specifically binds to the ATIC of the normal control sample.
  • the term "individual” includes, but is not limited to, stray animals, including horses, dogs, cats, pigs, goats, rabbits, hamsters, monkeys, guinea pigs, rats, mice, lizards, Snakes, sheep, cattle, fish and birds, preferably humans.
  • control refers to a sample derived from an individual whose expression of the anti-ATIC autoimmune antibody is expressed at a lower level than the onset or suspected liver cancer, and the antigen using the anti-ATIC autoimmune antibody of the present invention- It refers to a sample that is a standard for diagnosing liver cancer by an antibody reaction.
  • sample is from the group consisting of whole blood, serum, blood, plasma, saliva, urine, sputum, lymph, cerebrospinal fluid and intercellular fluid with different expression levels of anti-ATIC autoimmune antibodies, which are indicators of liver cancer diagnosis. It may be any one or more samples selected, but is not limited thereto.
  • Method for measuring the expression level of the protein in the present invention Western blot, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), radioimmunoassay (radioimmunoassay), radioimmunoassay, ukuteroni immune diffusion method, rocket Immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, FACS and protein chip methods, but are not limited thereto. Details of the method for measuring the expression level of the protein are as described above.
  • the present invention provides a method for screening a liver cancer therapeutic agent using the autoimmune antibody of the present invention. Specifically, (a) measuring the expression level of the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof that specifically binds to ATIC; (b) administering a candidate for treating liver cancer; And (c) confirming that the expression level of the fragment including the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof that specifically binds to ATIC is reduced compared to the step (a). do.
  • step (a) is a step of measuring the expression level of a fragment comprising an autoimmune antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to ATIC, a method of measuring the general expression level as described above Can be used without limitation.
  • the step (b) and (c) is the step of administering a candidate for treating liver cancer and the expression level of the fragment comprising the autoimmune antibody or antigen-binding site thereof that specifically binds to ATIC (a) This step confirms the decrease compared to the step.
  • the term "cancer candidate for treating liver cancer” is a substance which is expected to be able to treat liver cancer, and may be used without limitation as long as it is a substance which is expected to improve or improve liver cancer directly or indirectly. Or all therapeutically predictable substances, such as proteins.
  • the screening method of the present invention confirms the expression level of the anti-ATIC autoimmune antibody or fragment comprising the antigen-binding site thereof before and after administration of the candidate, while the expression level is decreased compared to before administration of the candidate, Candidates can be determined as therapeutic agents for liver cancer.
  • HBx transgenic mice which have been previously reported to develop liver cancer similar to human liver cancer, were used.
  • spleen cells of individuals whose liver cancer was confirmed were obtained as B cell groups, and cell B fusion was performed with Sp2 / 0, a mouse myeloma cell, to prepare a B cell hybridoma cell group.
  • Cell fusion followed the usual B cell hybridoma preparation. Fusion cells were first screened using HAT medium (hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium), and only cloned cells were cultured separately. Among them, only the cells in which the cancer cell-responsive antibody was detected in the cell culture were selected and maintained again.
  • HAT medium hyperoxanthine-aminopterin-thymidine medium
  • the cells were washed again three times, and the cells were precipitated in 300 ⁇ l of PBS and analyzed by FACScalibur (BD). Mean fluorescence values corresponding to antibody responses were obtained to compare the respective reactions. 50 ⁇ l of the primary antibody-free DMEM medium was added to the control without antibody reaction.
  • TAB-XC154 clone secreting antibody FIG. 1
  • the hybridoma cell line producing TAB-XC154 clone-secreting antibody was deposited on February 21, 2011 with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) Biological Resource Center (KCTC) to receive accession number KCTC 11873BP.
  • the complementary determination region (CDR) sequence of the antibody was analyzed to obtain information about the antigen specificity of the XC154 antibody.
  • the detailed method is as follows.
  • RNA extraction kit Qiagen. CDNA was synthesized from 5 ⁇ g total RNA using a complementary DNA (cDNA) synthesis kit (Invitrogen), and 1 ⁇ g synthesized cDNA and Mouse heavy chain constant region primer F 5 ′.
  • cDNA complementary DNA
  • Recombinant plasmids were transformed into E. coli DH5 ⁇ and plated on LB restriction medium plates containing ampicillin and incubated at 37 ° C. for 15 hours. One of the colonies formed on the plate was incubated for at least 12 hours in an LB liquid limiting medium and the plasmids were extracted to analyze the base sequence. Protein sequences were determined from the analyzed base sequences, which were analyzed based on Kabat CDR definitions to determine the CDRs of the XC154 antibody (FIG. 2).
  • XC154 antibody specific reactions requires autoimmune antibodies purified from single components. Therefore, in the present invention, a cell culture solution or an antibody producing cell cultured with a large amount of XC154 antibody-producing clones was injected into the mouse abdominal cavity to secure ascites fluid and used for antibody purification. Isotyping of the XC154 antibody confirmed IgM, and thus MBP-Agarose (Mannose-binding protein immobilized agarose, Pierce) or Protein L agarose (Protein L) for affinity chromatography for IgM purification. agarose) was used. Purified antibody was confirmed by Coomassie staining after SDS-PAGE, and quantitatively used by Bradford method.
  • MBP-Agarose Mannose-binding protein immobilized agarose, Pierce
  • Protein L agarose Protein L agarose
  • Example 1 In order to confirm the reactivity of XC154 autoimmune antibodies against various cancer cell lines, various cancer cells were stained intracellularly as in Example 1 and analyzed by flow cytometric ananlysis (FIG. 3). As a result, it was confirmed that the expression of the XC154 antibody-reactive protein was overexpressed in hepatocellular cell lines such as HepG2 and SK-Hep-1 and cancer cell lines of various species such as HeLa, LNcap-LN3, and A549.
  • NP40 buffer PBS containing 1.0% (v / v) NP40, protease inhibitor cocktail (Roche)
  • Protein quantitation was carried out by the Bradford method.
  • Prepared protein samples were run in SDS-PAGE conditions reduced by 10% 50 ⁇ g, and transferred to PVDF membrane (membrane). Transfer membranes were immersed in 5% (w / v) skim milk / TBS (Tris-buffered saline) and blocked and treated with primary antibody.
  • the purified XC154 antibody was diluted in a blocking solution at a concentration of 0.1 ⁇ g / ml. After primary antibody treatment, the cells were washed thoroughly with TBST (TBS containing 0.1% (v / v) tween-20) and treated with secondary antibody (anti-mouse IgGAM-HRP), and then enhanced chemiluminescence (ECL) method. The antibody reaction protein band was confirmed. As a result, in the HepG2 liver cancer cell line and HT29 colon cancer cells, the XC154 antibody specific antigen antigen protein was identified as a band having a molecular weight of about 64 KDa (FIG. 4).
  • liver cancer mouse-derived autoimmune antibodies recognize specific proteins expressed in human liver cancer cells. Based on these results, screening of the epitope mimetics of XC154 antibody from a random peptide expression library to derive antibody detection methods It was.
  • the XC154 antibody specific reaction epitope is the most important factor in the construction of a detection method to confirm the presence of autoimmune antibodies against the same epitope in human serum.
  • XC154 antibody-specific peptide antigens were screened from random peptide expression libraries to simply utilize epitopes without using whole antigen proteins as XC154 antibody-specific reaction sites.
  • Peptide expression libraries include phage expressing cyclic peptide libraries (Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library kit; 7 amino acids are randomly expressed and cysteine residues at both ends to form a cyclic structure). England Biolabs) was used, and the panning process followed the method suggested by the manufacturer.
  • 300 ng of XC154 antibody was mixed with phage virions expressing 2 ⁇ 10 11 different peptides in 200 ⁇ l TBST solution for 20 minutes at room temperature, and the blocking solution (0.1 M NaHCO 3 , pH 8.6, 5 mg / ml BSA, 0.02% (w / v) NaN 3 ) was treated with 25 ⁇ l of protein L-agarose beads (protein L-agarose bead) and reacted at room temperature for 15 minutes.
  • Antibody reaction phages were recovered as precipitates by centrifugation in the form of antibody-phage-protein L agarose conjugates, washed several times with TBST, and then eluated at pH 2.2 (0.2 M).
  • phages having four different peptide sequences were obtained after five panning procedures for the XC154 antibody.
  • the number of amplified phages increased as the number of times increased to 4th, and it was estimated that the phages that specifically bind were amplified (FIG. 5 a).
  • Ten of the acquired phages were randomly selected to determine the sequence of the peptide region by DNA sequencing and the amino acid sequence obtained therefrom (Table 1).
  • the sequence of the PSWFHR was repeatedly identified in the six antigen mimetic sequences, indicating that the sequence of the antigen mimetics was important.
  • the phage was used as a coating antigen, and the ELISA method was used as the primary antibody as the XC154 antibody. Details are as follows. As a result of peptide sequencing, it was confirmed that phages of different sequences (XC154p1, XC154p2, XC154p4, XC154p9) were selected, and these were amplified and partially purified by PEG / NaCl solution treatment to be used as ELISA coating antigens.
  • 10 10 purified phages were diluted in 100 ⁇ l coating solution (0.1 M sodium bicarbonate buffer, pH 8.6) and added to each well of a 96-well Maxisorp ELISA plate. Phage added plates for antigen coating were stored at 4 ° C. for at least 16 hours. After phage coating, 300 ⁇ l of a skim milk solution (5% (w / v) skim milk / TBST) was added and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining area after antigen coating. After blocking, the cells were washed twice with TBST (TBS containing 0.1% Tween-20), and 100 ng / 100 ⁇ l of XC154 antibody was added and reacted at room temperature for 90 minutes.
  • TBST TBS containing 0.1% Tween-20
  • the cells were washed 6 times with TBST again and treated with anti-mouse IgGAM-HRP (Pierce), which is a secondary antibody, in a ratio of 1: 2500. Secondary antibodies were also reacted at room temperature for 90 minutes, washed six times with TBST, and then colored by using TMB solution (Pierce) as a substrate for HRP. Antigen-antibody reactions were quantified by measuring absorbance at 450 nm. As a result, it was confirmed that XC154p1 showed the highest reactivity among four phages used as antigens (FIG. 5B).
  • XC154 antibody-specific reactive phage when measuring the response of XC154 antibody to cell-expressing antigen protein by flow cytometry to confirm that antibody-specific selected phages sufficiently mimic the epitopes of cancer cell-expressing antigenic proteins. was added to confirm that the reaction was competitively inhibited.
  • the detailed method of the flow cytometry is as described in Example 1.
  • As the primary antibody only the XC154 antibody alone was treated, and the XC154 antibody was previously mixed with the XC154p1 phage, reacted for 1 hour, and then treated. In this case, 100 ng of antibodies were used and 10 11 or 10 12 phages were used.
  • M13 phage (Eph) which does not express antigen peptide was used, and the response was confirmed in HepG2 and LnCap-LN3 cells.
  • the site (epitope) that protein antigens stimulate the body's immune system to induce antibody response is limited to a specific site corresponding to the size of less than 20 amino acids of the entire protein structure.
  • the characteristics of such epitope sites work similarly even if the individual is different from humans, mice, goats, and the like.
  • autoimmune antibody response epitopes obtained from liver cancer model mice are expected to work in humans.
  • the XC154p1 phage which has confirmed the specificity of XC154 antibody response, was applied to the detection of human autoimmune antibodies, and it was confirmed that autoimmune antibodies in human serum could be detected. Details are as follows.
  • anti-human IgGAM-HRP anti-human IgGAM-HRP, Pierce
  • a protein-free blocking solution treated with 100 ⁇ l, and reacted at room temperature for 90 minutes.
  • the resultant was washed 6 times with TBST again, and 100 ⁇ l of TMB solution was added thereto to proceed the HRP reaction, and then the absorbance was measured at 450 nm.
  • ELISA for human serum using XC154p1 was repeated three or more times to confirm reproducibility, the most representative of which is shown in FIG.
  • the ELISA method prepared in the same manner as above was performed on the serum of breast cancer patients.
  • XC154 antibody was also highly reactive with autoimmune antibodies obtained from liver cancer model mice and other types of cancer cell lines, and thus could be expected to diagnose breast cancer.However, as shown in FIG. 8, the serum of breast cancer patients is normal unlike that of liver cancer patients. Did not show distinct results.
  • the ELISA diagnostics with specificity for the diagnosis of liver cancer could be constructed with the XC154p1 phage antigen, which mimics the antigenic response to XC154 autoimmune antibodies.
  • XC154 autoimmune antibody is a meaningful biomarker in liver cancer.
  • the present inventors carried out the identification process of XC154 antibody specific antigen antigen protein. Details are as follows.
  • LN-Cap-LN3 cell lysate (using RIPA buffer) having high expression of the antigenic protein was fractionated by HiTrap-Q (GE healthcare). From the Western blotting results for each fraction, fractions containing the XC154 antibody specific antigen antigen protein were selected, and the fractions were concentrated by acetone precipitation. The concentrated antigenic protein solution was separated from the 8-10% SDS-PAGE gel, and some of them were used to confirm the presence of the XC154 antigen by Western blotting. The corresponding protein band was cut out and subjected to in-gel digestion reaction using trypsin protease (FIG. 9A).
  • siRNA that inhibits the expression of ATIC was used siRNA provided by Bioneer, and was injected into HepG2 cells using Lipofectamine 2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen). 48 hours after siRNA treatment, cells were harvested and total RNA was extracted and cDNA was synthesized using 5 ⁇ g of RNA as a template. The synthesized cDNA as a template was subjected to polymerase chain reaction with primers having specificity for the ATIC gene, and the result was analyzed on 1% agarose gel (FIG. 10 a).

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Abstract

본 발명은 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체(autoantibody) 또는 이의 항원결합부위(antigen-binding site, paratope)를 포함하는 단편, 상기 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물, 상기 자가면역항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트, 상기 조성물을 이용한 간암 진단 방법 및 상기 자가면역항체를 이용한 간암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항-ATIC 특이반응 자가면역항체를 간암 진단 마커로 사용하면, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액 등과 같은 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 약 87%의 민감도와 약 88%의 특이도로 간암의 발병 여부를 진단할 수 있으며, 본 발명에서 동정된 아미노산 서열만을 이용하여 용이하게 간암을 진단할 수 있어 간암 진단용 키트 개발에 효과적이다.

Description

항-ＡＴＩＣ 자가면역항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물
본 발명은 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체(autoantibody) 또는 이의 항원결합부위(antigen-binding site, paratope)를 포함하는 단편, 상기 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 항원 단편, 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물, 상기 자가면역항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 본 발명의 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 이용한 간암 진단 방법 및 상기 자가면역항체를 이용한 간암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
간염, 간경변, 간암 등을 포함한 간질환은 한국, 일본, 대만, 중국, 대부분의 동남아 국가에서 단일 질병으로는 가장 많은 환자가 발생하고 있고, 장기별 기준으로 간암은 전체 암 발생 중에서 국내 5위(9.2%)를 차지하고 있으며(보건복지가족부 2007), 한국 남성들의 간암 사망률은 세계 1위로 알려져 있다.
현재까지 간암 진단을 위하여, 조직검사를 실시하거나 AFP와 같은 간암표지 단백질 검사를 실시하여 왔다. 또한 이러한 진단, 예후판정, 또는 치료평가에 몇 가지 바이오 마커가 알려져 있으며, 그 중 가장 잘 알려진 마커로 상기 AFP 및 PIVKA-II가 있으나 이들은 특이도, 민감도와 관련하여 여전히 한계점을 갖는다. 최근, 지노믹스(Genomics), 프로테오믹스(Proteomics) 연구에 의해 몇 가지 종류의 간암 마커 후보 단백질과 유전자가 보고되고 있으나, 보고된 유전자들은 주로 조직을 대상으로 한 유전자들이며 혈액 분비 여부 및 혈액으로의 진단 가능성에 대해서는 여전히 밝히지 못하고 있는 실정이다. 이는 상기 바이오마커의 본질적 특성으로 인해 대부분의 종양 표지자 발굴이 조직의 유전자 발현차이를 중심으로 연구되고 있으며, 바이오 마커의 성질상 조직에서 유전자 발현이 높다고 해서 뇨 또는 혈청으로 진단이 가능한 것은 아니기 때문이다. 따라서 진단의 편의성을 위하여 혈액이나 뇨에서 분비되는 종양 표지자 발굴이 중요하며, 이전과는 다른 접근방식으로 바이오 마커를 분석하고, 간암을 포함하는 간질환을 진단하는 방법이 요구되고 있다.
상기와 같은 문제점에 의해 혈액, 조직, 배설물로부터 다수의 종양 표지자가 개발되어 있으나, 많은 종류의 종양 표지자는 암이 없어도 증가하거나 검출되는 경우가 있다. 따라서 이러한 진단 마커를 이용한 암의 진단 방법은 어디까지나 부수적인 수단에 불과하고, 그 자체로서 독립적 진단 도구로 사용되지 못하고 있다.
한편, 면역시스템은 개체 생성 초기에 자기(self)와 비자기(non-self)를 구별해내는 독특한 시스템으로 구축되고, 그 결과 정상적인 개체의 상태에서 면역시스템에 노출되는 외래항원들에 대해서만 항원-항체반응(humoral immune response), 면역세포반응(cellular immune response)을 유도할 수 있도록 발달한다. 하지만 특정 질병들의 경우에는 자가 유래의 항원(self-antigen)에 대해서도 항체를 생성하는 것이 확인된 바 있는데, 이러한 경우, 해당 항원의 발현 위치가 정상과는 달라 세포 내 발현 단백질이 세포 밖으로 분비되거나, 변형된 형태가 나타나거나, 또는 그 밖의 특징들이 정상적인 개체와 다르게 나타나기 때문인 것으로 보고되었다. 암 발병의 경우에도 비정상적인 암세포 성장에 동반하여 암세포 유래의 항원들에 대한 자가면역 항체들이 생성된다는 사실이 1970년대 이후 계속 보고되고 있으며, 이들 항원을 암유래 항원(tumor-associated antigen; TAA)이라 한다. 현재까지 확인된 암유래 항원들의 종류는 매우 다양한데, 그 중 HER-2/neu oncoprotein은 세포막에 존재하는 수용체 단백질로서 자가면역항체를 유도한다고 알려져 있고, 암세포 성장억제기능을 갖는 단백질인 p53 또한 자가면역항체를 유도한다고 보고되었다. 또한 세포 증식과 관련된 단백질인 cyclin B1 및 CENP-F(centromere protein F), 및 onconeurological protein 인 Hu와 Yo도 자가면역 항체를 유도한다고 알려져 있다. 이와 같은 결과들로 볼 때 더 많은 종류의 암 유래 항원들에 대한 자가면역 항체가 존재할 것이라고 추측되어, 이에 따른 암 관련 자가면역 항체들을 대량으로 스크리닝해 내기 위한 시도들이 계속되고 있다.
또한, 하나의 자가면역항체보다는 서로 다른 자가면역항체를 한꺼번에 검출하는 암진단법이 훨씬 더 효과적일 수 있다는 결과들이 제시되어 자가면역항체의 다중검출에 대한 연구가 중요한 과제로 제시된 바 있다. 예를 들면 ASB-9, SERAC1, RELT에 대한 자가면역항체를 함께 검출함으로써 100%의 특이도와 80%의 민감도로 유방암을 진단할 수 있음이 보고된 바 있고(L. Zhong et al. Breast Cancer Res 10:3(2008) R40), PIM1, MAPKAPK3, ACVR2B에 대한 자가면역항체의 동시검출로 74%의 특이도와 83%의 민감도로 대장암을 진단할 수 있음이 확인되었다(I. Babel et al. Mol Cell Proteomics 8:10(2009) 2382-2395). 이와 같이 암유래 자가면역항체를 이용한 암진단이 높은 유효성을 보여줌에 따라 암유래 자가면역항체의 신규 발굴은 암바이오마커 도출의 중요한 분야로 자리잡게 되었다.
자가면역 항체를 동정하기 위하여 종래에는 암세포 유래 단백질 발현 라이브러리를 대상으로 암 환자의 혈액의 반응성을 분석하여 자가면역 항체를 찾는 SEREX (serological analysis of recombinant cDNA expression libraries of human tumors with autologous serum) 기법을 이용하였다. 그러나, 상기 방법은 암세포 유래 단백질을 라이브러리 수준에서 최대한의 다양성을 갖도록 발현해내는데 한계가 있고, 단백질의 최종산물은 전사(transcription) 이후에도 여러 가지 변형과정(posttranslational modification; PTM)을 거치기 때문에, 이러한 점이 반영되지 않는 단백질 발현 라이브러리는 자가면역항원 검출용으로 충분치 못한 분명한 한계점이 존재한다.
이에 대한 대안으로 최근 단백체학 기법을 기본으로 하는 자가면역 항체 발굴연구가 진행되고 있다. 단백체학 기법은 암세포 유래 단백질을 이차원 전기영동(2D-PAGE)으로 펼치고, 암환자의 혈장을 자가면역 항체 시료로 사용하여 반응성을 보이는 단백질 스팟을 확인해낸 후, 확인된 단백질을 질량분석기술로 동정해내는 과정을 포함하는 것으로, 약칭하여 SERPA(serological proteome analysis)라고도 한다. 또한 환자 혈액에서 분리해 낸 항체들을 결합(conjugation)시킨 친화성 크로마토그래피 레진(affinity chromatography resin)을 제조하고 여기에 암세포 단백질을 흘려주어 결합하는 단백질을 잡아 질량분석법으로 동정해내는 MAPPING (Multiple affinity protein profiling) 기법도 사용되고 있다. 또한 암세포 파쇄액을 수천 개의 분획으로 나눠 단백질 칩을 제조하고 이들에 대한 환자혈액의 반응성을 조사하는 방법으로 자가면역항체를 찾아내기도 한다.
이와 같은 다양한 단백체학적 분석기법들은 전사후 변형(PTM) 특성까지 유지하고 있는 암세포 유래 단백질들에 대한 항체반응성을 직접 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있어 SEREX 기법으로는 찾지 못했던 여러 자가면역항체들을 확인해낼 수 있었으나, 여전히 또 다른 한계를 갖는다. 첫째, 항체의 양적인 문제이다. 분석하고자 하는 대상이 두 가지 이상의 혼합물인 경우에는 그 중 양이 많은 것에 대한 분석이 우선되기 때문에 나머지들은 분석 가능한 범위에서 제외될 가능성이 많은데, 환자 혈청은 수많은 항체들의 혼합물이며 이를 구성하는 자가면역항체들의 양적인 차이 및 항원에 대한 친화력 차이에 의해 분석 가능 수준을 결정하게 되어 목적하는 자가면역항체에 대한 분석이 불가능할 수 있다. 둘째, 분석할 자가면역항체 시료를 환자에 의존하기 때문에 암 발병 상태에 따른 자가면역항체 생성을 체계적으로 분석하는데 한계가 있으며, 또한 환자혈액을 실험용으로 과량 채취하는 것이 어려운 일이기 때문에 연구를 진행하는 자체에 한계가 있다. 마지막으로, 항체가 반응하는 항원결정부위(epitope)의 보존에 관한 문제이다. 현재까지 알려진 면역학적 지식에 의하면, 항체반응 부위는 두 가지로 구분될 수 있는데, 하나는 단백질 서열 의존적 항원결정부위(sequential epitope)이고, 또 다른 하나는 단백질 구조 의존적인 항원결정부위(conformational epitope)이다. 생체 내에서 특정항원에 대한 항체가 유도될 때에는 면역세포 항체와 처음 만나는 항원의 상태가 반영되는데, 이는 용액상태에서 항원-항체반응이 진행되고 항원 단백질은 혈액 내에 용해되어있는 상태를 유지하는 구조를 가지고 있다는 것을 뜻한다. 따라서 체외에서 진행되는 항원-항체반응 검사의 경우에도 용액 상에서 진행하는 것이 본래의 결합 상태를 잘 반영하기 때문에 항원-항체 반응 검사조건으로 바람직하다. 하지만 앞에서 언급한 SERPA 분석법의 경우, 단백질 혼합액의 분석을 위해 이차원 전기영동법 즉, 분석대상 단백질을 SDS와 urea를 이용해 변성시켜 펼쳐 놓은 상태에서 항체와의 반응을 검사하는 방법을 이용하고 있다. 따라서 항원결정부위가 단백질 서열 의존적인 경우에는 검출가능하나, 구조 의존적인 경우에는 검출되지 않는 한계가 있다.
상기와 같이 기존에 보고된 암 발병 관련 마커로 사용 가능한 자가면역항체 연구는 제시된 활용 가능성에도 불구하고 진단효과가 미미하여 여전히 자가면역항체를 암 진단용 바이오마커로 활용하는데 한계가 있고, 자가면역항체 검출 방법 또한 수많은 경우의 수를 포함하지 못하거나 과도한 실험을 요구하는 방법으로서 수행하는데 한계가 존재하여 간암을 진단하기 위한 자가면역항체 마커를 발굴하지 못하고 있는 실정이다.
본 발명자들은 간암 진단을 위한 자가면역항체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 간암 모델 마우스에서 효과적인 암관련 자가면역항체의 동정방법을 개발하였고, ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체가 간암 모델 마우스에서 유도됨을 확인하였다. 또한, 이에 특이반응하는 항원결정부위(에피토프) 발현 파아지를 펩타이드 라이브러리로부터 스크리닝하여 자가면역항체 검출을 위한 ELISA법을 고안하였으며 이를 이용하여 인체 간암 개체를 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 항원 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 자가면역항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 이용한 간암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 자가면역항체를 이용한 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 항-ATIC 특이반응 자가면역항체를 간암 진단 마커로 사용하면, 침습적인 진단 방법을 이용하지 않고, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액 등과 같은 비침습적 생물학적 시료를 이용하여 약 87%의 민감도와 약 88%의 특이도로 간암의 발병 여부를 진단할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 마커와 반응하는 서열을 동정함으로써, 마커를 동정하기 위해 복잡한 반응물질을 디자인할 필요 없이 동정된 아미노산 서열만을 이용하여 용이하게 간암을 진단할 수 있어, 간암 진단용 키트 개발에 효과적이다.
도 1은 간암 마우스 유래 XC154 자가면역항체의 확보 및 이를 이용한 암 진단 방법의 제안을 나타낸다. HBx 간암 모델 마우스 유래 B세포 하이브리도마 클론들로부터 얻은 자가면역항체들의 간암세포에 대한 반응성을 확인하여 XC154 항체를 확보하였다. 간암 세포주인 HepG2, Hepa1c1c7 세포를 고정화하고, 세포막을 투과화한 후 간암 모델 마우스 유래 자가면역항체들을 처리하였고, 형광표지가 붙은 이차항체를 반응 후 유성세포측정법(flow cytometric ananlysis)으로 확인하였다. 고리형 구조를 형성하는 파아지 발현 고리형 펩타이드 라이브러리(Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library kit; New England Biolabs 사)를 사용하여 패닝 방법으로 확보한 XC154 항체에 대응하는 에피토프를 모사하는 파아지를 선별하고 선별된 파아지를 이용하여 간암환자와 정상인자의 차이를 확인하는 방법을 제안하였다.
도 2a 및 2b는 TAB-XC154 자가면역항체의 CDR 서열로서, 확보한 XC154 항체의 중쇄 변이영역(VH, 도 2a)와 경쇄 변이영역 (VL, 도 2b)의 상보성 결정부위(CDR)를 분석한 결과를 나타낸다. XC154 항체 생성 B세포 하이브리도마로부터 추출한 총 RNA(total RNA)에 대해 cDNA를 합성하고, 중쇄 변이영역 상보성 결정부위 프라이머와 경쇄 변이영역 상보성 결정부위 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후 pTOP Blunt V2 백터에 붙여(ligation) 재조합 플라스미드를 제조하였다. 재조합 플라스미드를 숙주세포에서 증폭시키고, 추출하여 해당부위를 염기서열 분석하였다. 분석된 염기서열로부터 단백질 서열을 확인하고, Kabat CDR 정의를 바탕으로 CDR 서열을 결정하였다.
도 3은 각종 암세포들에 대한 XC154 항체 반응성 확인을 위한 유성세포분석(a) 및 세포내 염색(b)의 결과를 나타낸다. 각종 암세포들에 대한 XC154 항체의 반응성을 암세포내 염색 후 유성세포측정법으로 분석한 결과, HepG2, SK-Hep1 등의 간암 세포주 뿐만 아니라 여러 다른 암세포에서도 높은 반응성을 보이는 결과를 확인하였다. 또한, XC154 항체가 인지하는 항원단백질의 세포내 발현위치를 형광염색법으로 확인한 결과, 암세포주인 HepG2, Hepa-1c1c7에서는 세포질에서 세포막 쪽으로 집중됨을 볼 수 있는 것에 비해 정상인 간세포에 가까운 Chang 세포주에서는 세포질에 주로 집중됨을 확인하였다.
도 4는 XC154 자가면역항체 특이반응 항원 단백질의 확인을 위한 웨스턴 블럿팅의 결과를 나타낸다. 여러 종류의 암세포주들의 세포파쇄액 및 혈청이 첨가되지 않은 세포배양액을 정량하여 50 ㎍씩 10% SDS-PAGE 상에 전개한 후 XC154 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 실시한 결과, 64KDa 정도의 분자량을 인지함을 확인하였다(M, 분자량마커; 1, Hepa1c1c7; 2, HepG2; 3, HT-29).
도 5는 TAB-XC154 항체 특이반응 에피토프 발현 파아지의 스크리닝 결과로서, XC154 항체로 파아지 고리형 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하여 XC154 항체 특이반응 항원 발현 파아지를 선별해낸 결과를 나타낸다. 도 5의 a에서는 XC154 항체를 이용한 패닝을 5차에 걸쳐 진행하였고, 서로 다른 펩타이드 서열을 갖는 4종의 파아지들(XC154p1, XC154p2, XC154p4. XC154p9)을 선별해냈다. 도 5의 b에서는 이들의 XC154 항체에 대한 반응성을 ELISA법으로 확인한 결과, XC154p1 파아지가 TAB-XC154 항체 특이 반응성이 가장 높음을 확인하였다.
도 6은 XC154p1 에피토프 발현 파아지에 의한 TAB-XC154 항체의 세포반응의 경쟁적 억제를 나타낸다. 선별된 XC154p1 파아지가 TAB-XC154 항체와 결합하는 항원의 에피토프 구조를 모사하여 TAB-XC154 항체-항원 결합을 경쟁적으로 억제함을 확인하였다. 간암 세포주인 HepG2, 전립선암 세포주인 LNcap/LN3 세포를 고정화하고, 세포막을 투과화한 후 XC154p1 파아지와 먼저 반응시킨 XC154 항체를 처리하였고, 형광표지가 붙은 이차항체를 반응 후 유성세포측정법으로 확인하였다. 그 결과 XC154p1 파아지가 세포발현항원의 항체반응을 거의 완전히 억제함을 확인하여 파아지발현 에피토프가 원래 항원의 항원결정부위 구조를 잘 모사하고 있음을 확인하였다.
도 7은 XC154p1 에피토프 발현 파아지를 이용한 간암 진단의 결과를 나타낸다. TAB-XC154 항체 특이반응 펩타이드 발현 파아지인 XC154p1을 코팅항원으로 사용한 ELISA법으로 간암환자와 정상인 혈청 분석을 실시하였다. 그 결과, cutoff 값을 0.059로 정할 때 86.96%의 민감도(sensitivity)와 88.24%의 특이도(specificity)로 간암환자를 구별해낼 수 있음을 확인하였다.
도 8은 XC154p1 에피토프 발현 파아지를 이용한 유방암 진단의 결과를 나타낸다. XC154 항체 특이반응 펩타이드발현 파아지인 XC154p1을 코팅항원으로 사용한 ELISA법을 유방암 환자 및 정상인 혈청 분석에 활용하였을 때, 간암의 경우와는 달리 유방암 환자 혈청은 정상인의 혈청에 대해 구별되지 않았다.
도 9는 XC154 항체 특이반응 항원 단백질의 동정을 나타낸다. 도 9의 a는 XC154 항체 반응 항원 단백질의 정제를 나타낸다. TAB-XC154 항체 반응 항원이 과량발현되는 LnCap-LN3 세포 파쇄액을 제조하여 음이온교환수지인 HitrapQ-sepharose로 분획하여 해당 항원을 부분 정제하였다. 해당 항원이 과량존재하는 분획만을 농축하여 SDS-PAGE 상에 전개하고 XC154 항원 해당부위만을 추출하여 in-gel digestion 후 질랑분석법으로 단백질 동정을 실시하였다. 도 9의 b는 XC154 항체 특이반응 항원 단백질의 질량분석 결과를 나타낸다. XC154 항원을 단백질 동정한 결과, ATIC가 가장 스코어값이 높음을 확인하였다. ATIC는 퓨린 생합성에 관여하며 암세포의 증식에 중요한 기능을 하는 단백질로 알려져 있으며 계산된 단백질분자량이 64.5 KDa로써 XC154 항원의 분자량과 유사하다.
도 10은 동정된 XC154 항체 특이반응 항원 단백질의 검증을 나타낸다. 도 10의 a는 siRNA를 이용한 ATIC 발현억제를 나타낸다. ATIC에 특이적으로 작용하는 siRNA를 HepG2 세포에 형질주입하고 48 시간 후에 해당유전자의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과, 50% 이상 발현을 억제함을 확인하였다. 도 10의 b는 ATIC 유전자 발현 억제 후 XC154 항체반응을 확인하기 위한 유성세포 분석의 결과를 나타낸다. 위와 동일한 방법으로 siRNA를 처리한 세포에 대한 XC154 항체의 반응성을 확인한 결과, 항체 반응이 20% 정도 감소함을 확인하였다. 도 10의 c는 ATIC유전자 발현 억제 후 XC154 항체 반응을 확인하기 위한 웨스턴 블럿팅의 결과를 나타낸다. 발현 억제된 단백질이 XC154 항체 반응 단백질인지 확인하기 위해 웨스턴 블럿팅을 실시하였다. 그 결과, ATIC의 발현이 억제된 세포의 경우 XC154 항체반응도 없어짐을 확인하여 XC154 항원이 ATIC임을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 제공한다.
본 발명에서 용어, "ATIC(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/IMP cyclohydrolase)"는 퓨린의 신생(de novo) 생합성 과정의 마지막 두 단계 반응을 촉매하는 두 기능을 가진 단백질이다. 퓨린과 피리미딘의 생합성 과정은 DNA 및 RNA 합성에 필요한 뉴클레오타이드를 생성하는 반응으로, 정상 세포에서는 거의 활용되지 않으나, 암세포와 같이 빨리 분열하는 세포에서는 활발히 작용한다. 그러나, ATIC와 암 발병과 관계된 연구결과들이 거의 제시되어 있지 않으며, 본 발명에서 처음으로 간암환자 혈액에서 항-ATIC 자가면역항체를 확인하였으며 그에 특이반응하는 신규 에피토프 구조를 이용하여 간암 진단이 가능한 것을 규명하게 되었다.
본 발명에서 용어 "자가면역항체(autoantibody)"는 자기의 체성분과 특이적으로 반응하는 항체를 의미하며, 자가항체 또는 오토항체라고도 한다. 일반적으로 개체는 자신이 본래적으로 가지고 있는 본질에 대해서는 면역반응을 일으키지 않으므로, 항체를 생성하지 않는다. 그러나, 특정한 경우 본래 자신이 가진 물질을 항원으로 인식하여 항체를 생성하기도 하는데, 질병으로 나타나는 현상으로 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus) 및 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 자가면역질환(autoimmune disease)을 일으킨다. 본 발명의 자가면역항체는 상기와 달리 정상적이지 않은 암세포 성장에 수반되는 암세포 유래의 항원에 대해 생성되는 항체를 의미하며, 구체적으로는 암유래 항원인 ATIC에 대해 생성되는 항체로서, 본 발명에서는 "항-ATIC 자가면역항체" 또는 "ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체"와 혼용된다.
본 발명에의 일실시예에서는 간암 모델 마우스 유래의 하이브리도마 클론들로부터 얻은 자가면역항체들의 간암세포에 대한 반응성을 확인하여 "XC154 자가면역항체" 또는 "TAB-XC154 자가면역항체"로 명명하였다. 이후, 상기 항체에 대한 특이반응 항원 단백질을 동정한 결과, 최종적으로 64.5KDa의 분자량을 갖는 ATIC임을 확인하여, 상기 자가면역항체가 항-ATIC 자가면역항체임을 확인할 수 있었다(도 9 및 10).
본 발명에서 용어 "항원결합부위(antigen-binding site, paratope)"는 항원과 결합하는 항체의 부위를 의미한다. 상기 항원결합부위는 항체의 Fv 부위의 작은 부위로서 항체의 중쇄와 경쇄의 부분을 포함하며, 항원의 항원결정부위(antigenic determinant, epitope)와 결합한다.
본 발명에서 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편은 바람직하게는 서열번호 17 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 인식하는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 인식하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 자가면역항체의 구체적인 항원결정부위 서열을 동정하기 위하여 펩타이드 발현 라이브러리로부터 XC154 항체 특이반응 항원을 스크리닝한 결과, 본 발명의 CLPSWFHRC(Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; 서열번호 17), CAPSWLHRC(Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu-His-Arg-Cys; 서열번호 18), CSPSGLFSC(Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys; 서열번호 19) 및 CTPSWFHRC(Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; 서열번호 20)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 특이적으로 반응할 수 있음을 확인하였고, 그 중에서 CLPSWFHRC(Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; 서열번호 17)의 아미노산 서열과 가장 반응성이 높음을 확인하였다(도 5).
일반적으로 하나의 항체 분자에는 두 개의 중쇄(heavy chain)와 두 개의 경쇄(light chain)가 있으며, 각각의 중쇄와 경쇄는 그의 N-말단에 가변영역을 포함한다. 각 가변영역은 3개의 상보성 결정부위(Complementarity determining region: CDR)와 4개의 구조형성부위(framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩타이드 서열로 존재한다. 바람직하게 본 발명의 자가면역항체는 중쇄 가변영역의 일부로서, 서열번호 3의 CDR1 서열, 서열번호 4의 CDR2 서열 또는 서열번호 5의 CDR3 서열로 구성된 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 포함할 수 있으며, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열을 모두 포함하는 자가면역항체 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, 본 발명의 자가면역항체는 경쇄 가변영역의 일부로서, 서열번호 6의 CDR1 서열, 서열번호 7의 CDR2 서열 또는 서열번호 8의 CDR3 서열로 구성된 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 포함할 수 있으며, 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열을 모두 포함하는 자가면역항체 또는 이의 단편일 수 있다. 나아가 상기 서열을 코딩하는 핵산 서열 또한 발명에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 자가면역항체는 보다 바람직하게는, 중쇄 가변영역 서열로서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편일 수 있고, 경쇄 가변영역 서열로서 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 또한 상기 중쇄 및 경쇄는 목적에 따라 각각 또는 함께 사용될 수 있으며, 당업자가 목적하는 바에 의해 통상적인 유전공학적 방법에 따라 다수의 CDR 서열 및 경쇄와 중쇄의 자유로운 조합이 가능하다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 자가면역항체의 특성을 연구하기 위하여 상보성 결정부위(Complementarity determining region: CDR) 서열을 분석한 결과, 본 발명의 자가면역항체가 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 5로 기재된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 확인하였고, 서열번호 1로 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 자가면역항체임을 확인하였다(도 2).
본 발명의 자가면역항체는 2개의 전장을 포함하는 중쇄 또는 항체-항원 결합을 달성할 수 있는 항체 분자의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장을 포함하는 경쇄 또는 항체-항원 결합을 달성할 수 있는 항체 분자의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 항체 분자의 면역학적 활성을 가진 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일클론항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편은 바람직하게는 기탁번호 KCTC 11873BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 항원 단편을 제공한다.
본 발명에서 "ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 항원"은 상기 자가면역항체 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 모두 포함하며, 특정 단백질 또는 폴리펩타이드에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 항원은 항-ATIC 자가면역항체에 의해 인식될 수 있으면 그의 단편 또는 그의 변형체 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 항원은 최소 9개의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.
상기 항원은 본 발명의 자가면역항체 마커에 의해 인식될 수 있는 항원결정부위 서열일 수 있다. 상기 서열은 본 발명의 자가면역항체에 의해 인식 가능한 서열이면, 서열의 크기나 종류에 제한되지 않으며, 바람직하게 상기 서열은 7개의 아미노산의 끝에 시스테인이 존재하는 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 이러한 7개의 아미노산의 끝에 시스테인이 존재하는 서열은 CLPSWFHRC(Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; 서열번호 17), CAPSWLHRC(Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu-His-Arg-Cys; 서열번호 18), CSPSGLFSC(Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys; 서열번호 19) 및 CTPSWFHRC(Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; 서열번호 20)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열일 수 있으며, 상기 시스테인의 존재로 고리형 구조를 형성하여 자가면역항체에 의한 인식이 더 효과적일 수 있다. 그러나, 상기 예에 의해 본 발명의 자가면역항체에 의해 인식 가능한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상 간암의 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 간암의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체를 이용하는 경우, 간암 의심 개체의 시료로부터 ATIC 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 간암 발병 여부뿐 아니라, 향후 해당 개체의 예후가 좋을 것인지 여부에 대해서까지 예측이 가능하다.
본 발명에서 용어, "시료"는 간암 진단의 지표인 항-ATIC 자가면역항체의 발현 수준이 차이나는 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시료일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "진단 표지자, 진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"는 암세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포 또는 예후가 좋은 암 세포에 비하여 예후가 좋지 않은 암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 간암 진단 마커는 정상 간을 가진 개체의 전혈, 혈액, 혈청 또는 혈장 등에 비하여, 간암을 나타내는 개체의 전혈, 혈액, 혈청 또는 혈장 등에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 항-ATIC 자가면역항체이다.
본 발명에서 용어 "간암 (liver cancer)"이란 일반적으로 간세포에서 기원하는 암을 의미한다. 간암에는 처음부터 간에서 생기는 원발성 간암과 다른 조직에서 발생한 암이 간에 전이되어 발병하는 전이성 간암이 있다. 원인은 대부분 불분명하나, 간경변이 있는 경우가 많으며, 간경변이 있는 환자와 만성 활동성 B형 간염, 또는 B형 간염 보균자에서 간암이 잘 발생하는 것으로 밝혀지고 있다. 본 발명자들은 본 발명의 자가항체 마커를 사용하는 경우, 개체로부터 간암의 발병 여부에 대해 높은 수준의 민감도 및 특이도를 가지고 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 간암 발병 또는 의심 개체의 전혈, 혈청, 혈장, 림프액 및 세포간액 등에서 발현이 증가하는 마커인 항-ATIC 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 CLPSWFHRC(Cys-Leu-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; 서열번호 17), CAPSWLHRC(Cys-Ala-Pro-Ser-Trp-Leu-His-Arg-Cys; 서열번호 18), CSPSGLFSC(Cys-Ser-Pro-Ser-Gly-Leu-Phe-Ser-Cys; 서열번호 19) 및 CTPSWFHRC(Cys-Thr-Pro-Ser-Trp-Phe-His-Arg-Cys; 서열번호 20)으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열인 것일 수 있다. 이를 위한 분석 방법의 예로는 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 분석 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암 발병 또는 의심 개체에서의 항원-항체 복합체 형성량을 비교할 수 있으며, 이를 통해 실제 간암 의심 개체에서의 간암 발병 여부에 대해 진단할 수 있게 된다.
간암을 진단하는 방법은 본 발명의 항-ATIC 자가면역항체 및 이와 특이적으로 결합하는 항원 간에 항체-항원 반응을 통하여 달성될 수 있는데, 본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 간암 마커인 자가면역항체와 이에 특이적인 항원의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소의 예로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 형광물의 예로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 리간드의 예로는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 발광물의 예로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 미소입자의 예로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자의 예로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소의 예로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명자들은 본 발명의 자가면역 항체에 결합하는 에피토프 서열을 동정하기 위하여, 7개의 아미노산의 서열 끝에 시스테인이 존재하여 고리형 구조를 형성하는 파아지 디스플레이 사이클릭 펩타이드 라이브러리 시스템을 사용하였으며, 바람직하게는 항-ATIC 자가면역항체와 특이적으로 결합하는 파아지를 선별하는 한편, 선별된 파아지 중 본 발명의 항체인 항-ATIC 자가면역항체와의 반응성이 좋은 그룹만을 정제하여 코팅항원으로 처리 후, 상기 항원에 결합하는 면역항체와의 반응성을 확인함으로써, 이들 아미노산 서열을 확인하였다(표 1).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물의 간암 진단 용도를 제공한다.
상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편 및 이의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 본 발명에서는 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편 자체, 또는 이의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 이용하여 간암 진단을 위한 용도로 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 자가면역항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명에서 용어, "하이브리도마"는 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합된 세포를 말한다. 하이브리도마는 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 것으로, 하이브리도마의 대표적인 것은 대표적인 것은 림프구이다. 특히 골수종 세포(myeloma cell)와 비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데 항체 생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단일 클론항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 그 밖에 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리드마 등도 실용화되고 있다. 본 발명의 자가면역항체를 생산하는 하이브리도마는 당업계에 공지된 세포를 당업자에 의해 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 HBx 형질전환마우스들 중 간암 발생이 확인된 개체들의 지라 세포를 B 세포군으로 확보하여 마우스 골수종 세포인 Sp2/0 과 세포 융합하여 B 세포 하이브리도마 세포군을 제조하고, TAB-XC154 클론 분비 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 선택하여 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 2월 21일자로 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 11873BP를 부여받았다. 바람직하게 상기 하이브리도마 세포주는 기탁번호 KCTC 11873BP인 세포주일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 간암 진단용 키트는 간암을 진단하는 표지자인 항-ATIC 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 진단 표지자인 ATIC를 암호화하는 유전자들의 코딩에 의해 발현된 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
상기 키트에서 단백질 수준을 측정하기 위한 분석방법으로는, 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 본 발명의 키트는 ELISA 방법을 이용한 키트일 수 있다.
단백질 발현수준 측정을 위한 ELISA 방법으로는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 진단 표지자인 항-ATIC 자가면역항체의 발현 정도를 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 17 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 항-ATIC 자가면역항체를 포획하는 포획자로 사용할 경우, 더욱 바람직하게는 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 사용할 경우, 높은 민감도와 특이도로 간암을 진단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 펩타이드 파아지 라이브러리를 이용하여 본 발명의 자가면역항체와 반응하는 에피토프 서열을 동정하였으며, 상기 동정된 서열을 이용하여 시료 내의 자가면역항체인 1차 항체와 반응시키고, 이를 다시 이차항체로서 항-인간 IgGAM-HRP와 반응시킴으로써 항원-항체 복합체의 형성 여부 및 형성량을 확인한 결과, 정상 개체와 간암 개체의 혈청에서 확실하게 구별되는 패턴을 관찰할 수 있었다(도 7). 이와 같은 방법으로 항-ATIC 자가면역항체를 검출 및 이를 이용하여 간암을 진단하는 경우, 높은 특이성과 민감성을 가지고 간암을 진단할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 검출한 결과, 약 87%의 민감도와 약 88%의 특이도로 정상 개체와 간암 개체를 구분 및 진단할 수 있음을 확인하였다(도 7). 또한, 동일한 방법으로 유방암 환자 혈청에 대해서도 실시한 결과, 유방암 환자 혈청에 대해서는 정상과 구별되지 않는 결과를 보임에 따라 본 발명의 방법이 간암을 진단하는데 특이적임을 확인하였다(도 8).
본 발명에서 용어, "민감도"는 질병이 있는 개체를 양성으로 검출하는 비율을 의미하며, 진단법을 사용하였을 때 실제로 이에 해당하는 개체를 얼마나 잘 찾아내는지의 기준이 된다. 또한, 용어 "특이도"는 정상 개체를 음성으로 검출하는 비율을 의미하며, 질병에 해당하지 않는 개체를 얼마나 잘 분류하는가 하는 기준이 된다.
또한, 상기 진단표지자에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 간암의 발병 여부를 확인할 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 조직 면역 염색을 실시할 수 있다. 간암 발병 또는 의심 개체에서 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포맷 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 본 발명의 자가면역항체의 항원결합부위를 포함하는 단편을 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 간암의 발병 여부를 확인할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 이용하여 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 간암 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 간암 진단 방법은 바람직하게는, (a) 간암이 의심되는 개체의 시료로부터 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체"는 이에 제한되지는 않으나, 인간을 포함한 표유류로서, 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pigs), 랫트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 포함하며, 바람직하게는 인간을 포함한다.
본 발명에서 용어, "대조군"은 항-ATIC 자가면역항체의 발현이 간암 발병 또는 의심개체에 비해 낮은 수준으로 발현되는 개체에서 유래한 시료로, 본 발명의 항-ATIC 자가면역항체를 이용한 항원-항체 반응으로 간암을 진단하는데 기준이 되는 시료를 말한다.
본 발명에서 용어, "시료"는 간암 진단의 지표인 항-ATIC 자가면역항체의 발현 수준이 차이나는 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시료일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법으로는, 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질의 발현 수준 측정 방법의 자세한 내용은 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 자가면역항체를 이용한 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 간암 치료용 후보물질을 투여하는 단계; 및 (c) ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준이 상기 (a) 단계에 비해 감소되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 간암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 단계는 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 단계로서 상기에서 설명한 바와 같이 통상의 발현 수준을 측정하는 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 및 (c) 단계는 간암 치료용 후보물질을 투여하는 단계 및 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준이 상기 (a) 단계에 비해 감소되는 것을 확인하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "간암 치료용 후보물질"은 간암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로, 직접 또는 간접적으로 간암을 호전 또는 개선시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 모든 치료가능 예상물질을 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보물질의 투여 전후의 항-ATIC 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 확인하는 한편, 상기 발현 수준이 후보물질 투여 전에 비해 감소된 경우, 해당 후보물질을 간암 치료제로서 결정할 수 있다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: HBx 마우스 유래의 XC154 자가면역항체 확보
암 발생에 동반하여 생성되는 자가면역항체를 확보하기 위해 인체 간암과 유사한 형태의 간암이 발생하는 것으로 이미 보고된 HBx 형질전환 마우스를 활용하였다. 사육 중인 HBx 형질전환 마우스들 중 간암 발생이 확인된 개체들의 지라(spleen) 세포를 B세포군으로 확보하여 마우스 골수종 세포인 Sp2/0 과 세포 융합하여 B세포 하이브리도마 세포군을 제조하였다. 세포융합은 일반적인 B세포 하이브리도마 제조법을 따랐다. 융합세포들은 HAT 배지(hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium)를 이용해 1차 선별하였고, 클론을 형성한 세포들만을 따로 배양하였다. 이들 중 세포배양액 중에서 암세포 반응 항체가 검출된 세포들만을 또 다시 선택하여 유지하였다.
암세포에 대한 자가면역항체의 반응성의 확인은 고정화 및 투과화(fixation & permeabilization)시킨 암세포주에 대한 세포 내 염색(intracellular staining) 후 유성세포측정법(flow cytometric ananlysis) 분석으로 수행하였다. 상세한 설명은 다음과 같다. 70~80% confluency 상태의 HepG2 또는 Hepa1c1c7 세포를 트립신 처리로 세포 배양 플레이트로부터 떼어내고 PBS로 세척한 후 2×105 세포당 100 ㎕의 Cytofix/Cytoperm 용액(BD사)를 4℃에서 20분간 처리하여 고정화 및 투과화시켰다. 반응 후에는 Cytowash/Cytoperm 용액(BD사)을 1ml씩 첨가하여 잘 섞어준 후 1700rpm에서 5분간 원심분리하여 세포침전을 얻는 과정으로 세포 세척을 실시하였다. 세척이 끝난 시료에는 50 ㎕의 1차 항체용액(B cell hybridoma 세포배양액 또는 정제한 1차 항체 용액)을 첨가하여 4℃에서 40분간 반응시켰다. 반응 후 다시 세포세척을 세 차례 실시하고 항-마우스 Igs-FITC(anti-mouse Igs-FITC(DaKo사))를 4℃에서 40분간 처리하였다. 반응 후 다시 세포세척을 3회 실시하고, 300 ㎕의 PBS에 세포침전을 풀어 FACScalibur(BD사)로 분석을 실시하였다. 항체반응에 해당하는 형광수치의 평균값(mean fluorescence)을 얻어 각각의 반응을 비교하였다. 항체반응이 없는 대조군에는 1차 항체 없는 DMEM 배지를 50 ㎕씩 첨가하였다.
그 결과, B세포 하이브리도마세포들 중 자가면역항체생성 클론들을 여러 가지 확인할 수 있었는데, 본 발명에서는 그들 중의 하나인 TAB-XC154 클론 분비 항체에 대한 분석을 실시하였다(도 1). 이와 같이, TAB-XC154 클론 분비 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 2011년 2월 21일자로 한국생명공학연구원(KRIBB) 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 11873BP를 부여받았다.
실시예 2: XC154 항체의 상보성 결정부위(Complementary Determining Region, CDR)의 분석 및 항체의 정제
XC154 항체가 암세포에서 발현되는 항원을 특이하게 인지함을 확인한 후, XC154 항체의 항원인지 특이성에 대한 정보를 확보하기 위해 해당 항체의 상보성 결정부위(Complementary Determination Region, CDR) 서열을 분석하였다. 상세한 방법은 다음과 같다.
XC154 항체 생성 세포를 106개 정도 수집하여 RNA 추출키트(Qiagen 사)를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 상보성 DNA 합성(complementary DNA (cDNA) synthesis) 키트(Invitrogen 사)를 이용하여 총 RNA 5 ㎍으로부터 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA 1 ㎍과 마우스 중쇄영역 프라이머(Mouse heavy chain constant region primer) F 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3'(서열번호 21), R 5'-GGA AGA TCT GAC ATT TGG GAA GGA CTG ACT CTC-3'(서열번호 22)과 마우스 경쇄영역 프라이머(Mouse light chain constant region primer) F 5'-GGG AGC TCG AYAT TGT GMT SAC MCA RWC TMC A-3'(서열번호 23), R 5'- GGT GCA TGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3'(서열번호 24)을 이용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 마우스 중쇄와 경쇄의 CDR 포함부위를 증폭한 후 TOPcloner Blunt kit(Enzynomics 사)를 사용하여 pTOP Blunt V2 벡터에 접합(ligation)하였다. 재조합 플라스미드는 E. coli DH5α에 형질전환(transformation)하였고 앰피실린(ampicilin)을 포함한 LB 제한배지 플레이트에 도말하여 37℃에서 15시간 배양하였다. 플레이트에 형성된 콜로니들 중 하나씩 LB 액체제한배지에서 12시간 이상 배양하고 플라스미드를 추출하여, 해당 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열로부터 단백질 서열을 결정하였고, 이를 Kabat CDR 정의를 기준으로 분석하여 XC154 항체의 CDR을 결정하였다(도 2).
XC154 항체 특이반응에 대한 분석을 위해서는 단일성분으로 정제된 자가면역항체가 필요하다. 따라서 본 발명에서는 XC154 항체 생성클론을 대량 배양한 세포배양액이나 항체 생성세포를 마우스 복강에 주사하여 복수액(ascites fluid)을 확보하여 항체 정제를 위해 사용하였다. XC154 항체를 아이소타이핑(isotyping) 한 결과, IgM임을 확인하였고, 따라서 IgM 정제를 위한 친화성 크로마토그래피를 위해 MBP-아가로스(Mannose-binding protein immobilized agarose, Pierce사) 또는 단백질 L 아가로스(Protein L agarose)를 사용하였다. 정제된 항체는 SDS-PAGE 후 쿠마시 염색(comassie staining)하여 확인하였고 브래드포드(Bradford) 방법으로 정량하여 사용하였다.
실시예 3: XC154 항체 특이반응 항원의 각종 암세포에서의 발현 확인
XC154 자가면역항체의 여러 암세포주들에 대한 반응성을 확인하기 위해 상기 실시예 1과 같이 각종 암세포들을 세포 내 염색한 후 유성세포측정법(flow cytometric ananlysis)으로 분석하였다(도 3). 그 결과, XC154 항체반응 단백질의 발현이 HepG2, SK-Hep-1 등의 간암 세포주와 HeLa, LNcap-LN3, A549 등 여러 다른 종의 암세포주에서 과발현됨을 확인하였다.
또한 세포 내의 발현위치를 확인하기 위해서 세포 내 염색 후 공촛점 형광현미경으로 관찰하였으며, 세포질 위치 또는 세포막 위치에서 염색이 강하게 확인되었다(도 3).
실시예 4: XC154 자가면역항체 특이반응 항원 단백질의 확인
XC154 항체 특이반응 항원 단백질의 발현을 웨스턴 블럿팅 방법으로 암세포주에서 확인하였다. 분석대상인 세포들을 수집하여 NP40 버퍼(NP40 buffer: PBS containing 1.0 % (v/v) NP40, protease inhibitor cocktail(Roche사))에 녹여 단백질 분석 시료로 사용하였다. 단백질 정량은 브래드포드(Bradford) 방법으로 실시하였다. 준비된 단백질 시료는 50 ㎍씩 10% 환원된 SDS-PAGE 조건에서 전개하였고, PVDF 막(membrane)에 이동시켰다. 이동(transfer)이 끝난 막은 5%(w/v) 스킴 밀크(skim milk)/TBS(Tris-buffered saline)에 담가 블로킹(blocking)하고 1차 항체를 처리하였다. 1차 항체로는 정제한 XC154 항체를 0.1 ㎍/ml의 농도로 블로킹 용액에 희석하여 사용하였다. 1차 항체 처리 후 TBST(0.1%(v/v) tween-20 포함하는 TBS)로 충분히 세척해주고 이차 항체(항-마우스 IgGAM-HRP)를 처리한 후 증대된 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL) 방법으로 항체반응 단백질 밴드를 확인하였다. 그 결과, HepG2 간암 세포주 및 HT29 대장암세포에서 XC154 항체 특이반응 항원 단백질이 64KDa 정도의 분자량을 갖는 밴드로 확인되었다(도 4).
이상의 결과들로 간암 마우스 유래 자가면역항체가 인체간암세포에 발현되는 특정단백질을 인지함을 확인하였으며, 이러한 근거 하에 XC154 항체의 항원결정부위 모사체를 무작위 펩타이드 발현 라이브러리로부터 스크리닝하여 항체 검출법을 도출하고자 하였다.
실시예 5: XC154 항체 특이반응 펩타이드 항원 발현 파아지(phage)의 탐색
XC154 항체 특이반응 항원결정부위는 인체 혈청 중에 동일한 항원결정부위에 대한 자가면역항체가 존재하는지 확인하는 검출법의 구성에 가장 중요한 요소이다. XC154 항체 특이반응부위로 전체 항원 단백질을 사용하지 않고 간편히 항원결정부위만을 활용하기 위해 무작위 펩타이드 발현 라이브러리로부터 XC154 항체 특이반응 펩타이드 항원을 스크리닝하였다. 펩타이드 발현 라이브러리로는 7개의 아미노산이 무작위서열로 발현되고 양 끝에 시스테인 잔기가 있어 7개의 아미노산이 고리형 구조를 형성하는 파아지 발현 고리형 펩타이드 라이브러리(Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library kit; New England Biolabs 사)를 사용하였고, 패닝 과정은 제조사가 제시한 방법을 따랐다.
XC154 항체 300 ng을 2×1011개의 서로 다른 펩타이드를 발현하는 파아지 비리온(virion)들과 200 ㎕ TBST 용액 중에 혼합하여 상온에서 20분간 반응시키고 미리 블로킹 용액(0.1 M NaHCO3, pH 8.6, 5 mg/ml BSA, 0.02%(w/v) NaN3)을 처리한 단백질 L-아가로스 비드(protein L-agarose bead) 25 ㎕와 섞어 상온에서 15분간 반응시켰다. 항체 반응 파아지들은 항체-파아지-단백질 L-아가로스(antibody-virion-protein L agarose) 결합체 형태로 원심분리에 의해 침전물 형태로 회수하고, TBST로 여러 차례 세척해 준 후 pH 2.2의 용출액(0.2 M Glycine-HCl, pH 2.2, 1 mg/ml BSA)을 1 ml 처리하여 용출하였다. 그리고 재빨리 pH 9.1의 1 M Tris-HCl 용액을 첨가하여 중성 pH로 전환시켰다. 용출해낸 파아지들 중의 일부는 파아지 수를 적정(titration) 하는데 사용하고 나머지는 파아지를 증폭시키는데 사용하였다. 증폭된 파아지에 대해서는 다시 상기한 방식대로 패닝을 실시하였다.
그 결과, XC154 항체에 대한 5번의 패닝 과정 후 4개의 서로 다른 펩타이드 서열을 갖는 파아지를 확보하였다. XC154 항체를 이용한 패닝 과정에서는 4차까지 횟수 증가에 따라 증폭된 파아지의 수가 증가하여 특이 결합을 하는 파아지들이 증폭되고 있는 것을 짐작할 수 있었다(도 5의 a). 확보된 파아지들 중 10개를 무작위로 선정하여 펩타이드 부위의 서열을 DNA 염기서열 분석으로 결정하고 이로부터 얻은 아미노산 서열을 결정하였다(표 1). 확보된 항원 모사체의 서열을 비교해 본 결과 PSWFHR의 서열이 6가지의 항원 모사체 서열에서 반복적으로 확인되어 항원 모사체의 서열로 중요함을 짐작할 수 있었다.
표 1
Figure PCTKR2012004396-appb-T000001
XC154 항체에 대한 특이결합으로 선택된 파아지들의 XC154 항체에 대한 반응성을 확인하기 위해서는 파아지를 코팅항원으로 사용하고 XC154 항체를 일차 항체로 ELISA법을 실시하였다. 상세한 내용은 다음과 같다. 펩타이드 서열 결정 결과로 서로 다른 서열의 파아지(XC154p1, XC154p2, XC154p4, XC154p9)가 선별되었음을 확인하였고, 이들을 증폭하고 PEG/NaCl 용액 처리로 부분 정제하여 ELISA 코팅항원으로 사용하였다. 100 ㎕의 코팅 용액(0.1 M 중탄산나트륨 버퍼, pH 8.6)에 정제된 파아지를 1010개씩 희석하여 96-웰 Maxisorp ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 항원 코팅을 위해서 파아지가 첨가된 플레이트는 4℃에서 16시간 이상 보관하였다. 파아지 코팅 후 스킴밀크 용액(5%(w/v) skim milk/TBST)을 300 ㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응시켜 항원 코팅 후 남은 부위를 블로킹하였다. 블로킹이 끝난 후에는 TBST(TBS containing 0.1% Tween-20)로 2번 세척해내고 XC154 항체를 100 ng/100 ㎕씩 첨가하고 90분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후에는 다시 TBST로 6회 세척해주고 이차 항체인 항-마우스 IgGAM-HRP(Pierce 사)를 1:2500의 비율로 희석하여 처리하였다. 이차 항체 역시 상온에서 90분 동안 반응시킨 후 TBST로 6회 세척한 후 HRP의 기질로 TMB용액(Pierce 사)을 사용하여 발색반응 하였으며, 450nm에서 흡광도를 측정하여 항원-항체반응을 정량화하였다. 그 결과, 항원으로 사용된 4개의 파아지 중 XC154p1이 가장 높은 반응성을 나타냄을 확인하였다(도 5의 b).
실시예 6: XC154p1 에피토프 발현 파아지를 이용한 XC154 항체의 간암세포반응에 대한 경쟁적 억제
항체 특이적으로 선별된 파아지들이 암세포 발현 항원단백질의 항원결정부위 (에피토프)를 충분히 모사하고 있는지 확인하기 위해서 XC154 항체의 세포발현 항원 단백질과의 반응을 유성세포분석법으로 측정할 때 XC154 항체 특이반응 파아지를 첨가하여 반응이 경쟁적으로 억제되는지 확인하였다. 유성세포측정법의 자세한 방법은 실시예 1에 기술한 바와 같다. 일차 항체로는 XC154 항체만 단독으로 처리한 경우와 XC154 항체를 XC154p1 파아지와 미리 섞어 1시간 동안 반응시킨 후 처리한 두 가지 경우를 비교하였다. 이때 항체는 100 ng씩 사용하였고 파아지는 1011 또는 1012개 사용하였다. 대조군으로는 항원 펩타이드를 발현하지 않는 M13 phage(Eph)를 사용하였으며 HepG2 및 LnCap-LN3 세포에서 반응을 확인하였다.
도 6에 제시된 결과를 보면, XC154p1 파아지는 XC154 항체의 HepG2 또는 LnCap-LN3 세포에 대한 반응을 위에 제시한 조건에서 90% 이상 억제하는 것을 알 수 있다. 이 결과로 XC154p1 파아지가 XC154 항체 특이 반응 항원 단백질의 에피토프 부위를 충분히 모사하고 있음을 입증하였다.
실시예 7: XC154p1 에피토프 발현 파아지를 이용한 간암 진단
일반적으로 단백질 항원들이 체내 면역시스템을 자극하여 항체반응을 유도하는 부위(에피토프)는 전체 단백질구조 중 아미노산 20개 이내의 크기에 해당하는 특정 부위로 한정되어 있다. 또한 이러한 에피토프 부위의 특성은 인간, 마우스, 염소 등으로 개체가 달라도 유사하게 작용함이 잘 알려져 있다. 이러한 사실에 근거한다면 간암 모델 마우스로부터 얻게 된 자가면역항체 반응 에피토프는 인체에서도 동일한 작용을 할 것으로 예상된다. 이에 XC154 항체 반응특이성이 확인된 XC154p1 파아지를 인체 자가면역항체의 검출에 적용시켜 인체혈청 내의 자가면역항체를 검출할 수 있음을 확인하였다. 상세한 내용은 다음과 같다.
ELISA 플레이트의 각 웰 당 항 M13 파아지 항체 100 ng을 100 ㎕의 0.1 M 중탄산나트륨 버퍼, pH 8.6 용액에 희석 후 첨가하여 4℃에서 16시간 코팅하였다. 코팅 후, 잉여 항체를 제거하고 무단백질 블로킹 버퍼(protein-free blocking buffer, Pierce 사)를 각 웰당 300 ㎕씩 첨가하여 블로킹을 실시하였다. 블로킹 후 TBST로 2회 세척하고 웰당 1010개의 XC154p1 파아지를 100 ㎕의 무단백질 블로킹 버퍼에 희석하여 처리하였다. 처리 후 TBST로 6회 세척하고 간암 환자 및 정상인 혈청을 1차 항체로 처리하였다. 1차 항체 반응은 상온에서 2시간 동안 진행하였고, 반응 후 잉여의 항체들은 TBST로 6회 씻어냈다. 이차항체로는 항-인간 IgGAM-HRP(anti-human IgGAM-HRP, Pierce 사)를 무단백질 블로킹 용액에 1:5000의 비율로 희석하여 100 ㎕ 처리하고 상온에서 90분 반응시켰다. 반응 후에는 다시 TBST로 6회 씻어내었고, TMB 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 HRP 반응을 진행시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. XC154p1을 사용한 인간혈청에 대한 ELISA는 3회 이상 반복하여 재현성을 확인하였으며 그 중 가장 대표적인 결과를 도 7에 제시하였다.
도 7에서 볼 수 있듯이 XC154p1 파아지를 이용하여 정상인과 간암환자 혈청을 86.96%의 민감도와 88.24%의 특이도로 구별해낼 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 본 발명에서 제안하는 XC154 항체 항원결정부위 모사체인 XC154p1 파아지를 이용한 인간혈청 ELISA법이 간암 진단 기법으로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
실시예 8: XC154p1 에피토프 발현 파아지를 이용한 유방암 진단
XC154p1 파아지를 이용한 유방암 환자의 진단이 가능한지 확인하기 위해 상기와 동일한 방법으로 준비한 ELISA법을 유방암 환자 혈청에 대해서도 실시하였다.
XC154 항체는 간암 모델 마우스로부터 얻은 자가면역항체이나 다른 종류의 암세포주와의 반응성 역시 높아 유방암 진단효과도 기대할 수 있었으나, 도 8에서 보는 바와 같이 유방암환자 혈청의 경우에는 간암환자의 경우와는 달리 정상과 구별되는 결과를 보이지 않았다.
이상의 결과들을 종합할 때, XC154 자가면역항체에 대한 항원반응부위를 모사하는 XC154p1 파아지 항원으로 간암진단에 특이성을 갖는 ELISA 진단법을 구성할 수 있었다.
실시예 9: XC154 항체가 인지하는 단백질의 확인
이상의 결과에서 XC154 자가면역항체가 간암에서 의미있는 바이오마커임을 확인할 수 있었다. XC154 자가면역항체의 간암에서의 의미를 좀 더 도출해내기 위해서는 항원 단백질을 확인하고 그의 암발생 과정에서의 역할에 대한 규명이 필요하였다. 이에 본 발명자들은 XC154 항체 특이반응 항원 단백질의 동정과정을 실시하였다. 상세한 내용은 다음과 같다.
XC154 항체 특이반응 항원 단백질을 확인해내기 위해서 해당 항원 단백질의 발현이 높은 LN-Cap-LN3 세포 파쇄액(RIPA 완충액 사용)을 HiTrap-Q(GE healthcare사) 컬럼으로 분획하였다. 각각의 분획에 대한 웨스턴 블럿팅 결과로부터 XC154 항체 특이반응 항원 단백질을 포함한 분획을 선별하였고, 그 분획을 아세톤 침전하여 농축하였다. 농축된 항원 단백질 용액을 8~10% SDS-PAGE 겔에서 분리하여 일부는 웨스턴 블럿팅으로 XC154 항원의 존재를 확인하는데 사용하고, 나머지는 쿠마시 염색에 의해 단백질 밴드를 확인한 후 XC154 항체 반응 위치에 해당하는 단백질 밴드를 잘라내 트립신 단백질 분해효소를 이용한 in-gel digestion 반응을 실시하였다(도 9의 a). 그리고 in-gel digestion 후 추출한 펩타이드 분획에 대한 질량분석법으로 단백질 서열에 대한 정보를 확보하고, 그 결과로부터 XC154 항체 반응 항원이 ATIC(5-aminoimidazole-4-carboxamideribonucleotideformyl-transferase/IMPcyclohydrolase)임을 확인하였다(도 9의 b).
질량분석법으로 확인한 단백질동정 결과를 검증하기 위해서 siRNA를 이용해 ATIC의 발현을 억제한 세포들에 대해 XC154 항체 반응이 감소하는지 확인하였다. 상세한 내용은 다음과 같다. ATIC의 발현을 억제하는 siRNA는 Bioneer사에서 제공하는 siRNA를 사용하였고, 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen 사)을 이용하여 HepG2 세포에 투입하였다. siRNA처리 48시간 후에 세포들을 수거하여 총 RNA를 추출하였고 5 ㎍의 RNA를 주형으로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 다시 ATIC 유전자에 특이성을 갖는 프라이머들로 중합효소연쇄반응을 실시하고 그 결과를 1% 아가로즈겔 상에서 분석하였다(도 10의 a). 그 결과, ATIC의 발현이 50% 이상 억제된 것을 확인할 수 있었다. RT-PCR로 ATIC의 발현이 억제된 것을 확인된 세포들에 대해 XC154 항체에 대한 유성세포분석(Flow cytometric analysis)을 상기 방법대로 실시하였다. 그 결과, ATIC의 발현이 억제된 상황에서 XC154 항체 특이반응이 감소함을 확인하였다(도 10의 b). 이러한 경향은 웨스턴 블럿팅 결과에서도 확인할 수 있었다. ATIC에 대한 siRNA를 처리한 후 웨스턴 블럿팅한 결과, XC154 항체반응 항원 단백질의 양을 현저히 감소시켰다(도 10의 c). 이러한 결과들로 XC154 항체 특이반응 항원은 ATIC임을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2012004396-appb-I000001

Claims (20)

  1. ATIC(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase/ IMP cyclohydrolase)에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편은 서열번호 17 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 인식하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
  3. 제2항에 있어서, 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편은 서열번호 17로 기재된 아미노산 서열을 인식하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 자가면역항체는 서열번호 3으로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 4로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 5로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 6으로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 7로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 자가면역항체는 서열번호 1로 기재된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 2로 기재된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
  6. 제1항에 있어서, 기탁번호 KCTC 11873BP의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
  7. 제1항의 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 항원인 서열번호 17 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 단편.
  8. 제1항의 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편은 서열번호 17 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 것인 간암 진단용 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제제는 상기 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드인 간암 진단용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 자가면역항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 17 내지 20으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열인 것인 간암 진단용 조성물.
  12. 제1항의 자가면역항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
  13. 제12항에 있어서, 상기 하이브리도마 세포주는 기탁번호 KCTC 11873BP인 세포주.
  14. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 키트는 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 키트.
  16. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 간암 진단 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은
    (a) 간암이 의심되는 개체의 시료로부터 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 시료인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
  20. (a) ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 간암 치료용 후보물질을 투여하는 단계; 및
    (c) ATIC에 특이적으로 결합하는 자가면역항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편의 발현 수준이 상기 (a) 단계에 비해 감소되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 간암 치료제의 스크리닝 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113820382A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用
CN114113611A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 郑州大学 一种用于肝癌诊断的生物标志物及检测试剂盒

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101750411B1 (ko) * 2015-07-10 2017-06-27 한국생명공학연구원 엑소좀 단백질 eif3a 특이반응 오토항체검출용 항원 조성물 및 이를 이용한 간암진단법
CN106432492A (zh) * 2015-08-07 2017-02-22 广州瑞博奥生物技术有限公司 针对肿瘤标志物建立的抗体组合及其elisa方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007072225A2 (en) 2005-12-01 2007-06-28 Medical Prognosis Institute Methods and devices for identifying biomarkers of treatment response and use thereof to predict treatment efficacy
MX2010008572A (es) * 2008-02-04 2010-11-30 Bipar Sciences Inc Metodos de diagnostico y tratamiento de enfermedades mediadas por poli(adp-ribosa) polimerasa.
EP2108956A1 (en) 2008-04-07 2009-10-14 Erasmus University Medical Center Rotterdam Improved methods and kits for detecting tumor-specific fusion proteins
WO2011046309A2 (en) * 2009-10-12 2011-04-21 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology A diagnostic marker for hepatocellular carcinoma comprising anti-fasn autoantibodies and a diagnostic composition for hepatocellular carcinoma comprising antigens thereof
KR101138460B1 (ko) * 2009-10-12 2012-04-26 한국생명공학연구원 항-ｆａｓｎ 자가면역 항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113820382A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种新型哺乳动物的异源抗原的筛选方法及其应用
CN114113611A (zh) * 2021-12-13 2022-03-01 郑州大学 一种用于肝癌诊断的生物标志物及检测试剂盒

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