WO2012156551A1 - Métodos de regeneración celular post-infarto agudo de miocardio - Google Patents

Métodos de regeneración celular post-infarto agudo de miocardio Download PDF

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WO2012156551A1
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Noela RODRÍGUEZ LOSADA
Eduardo DE TERESA GALVÁN
Manuel Francisco JIMÉNEZ NAVARRO
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Universidad de Malaga
Servicio Andaluz de Salud
Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
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Universidad de Malaga
Servicio Andaluz de Salud
Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to specific methods of cell, tissue and organ regeneration, especially the heart, after suffering a cardiac pathology, preferably an acute myocardial infarction. Said methods are based on the use of plasma isolated from the coronary sinus and, preferably from patients who have suffered said acute myocardial infarction.
  • AMI Acute myocardial infarctions
  • Ischemia or poor oxygen supply resulting from such obstruction produces angina pectoris, which if recanalized early does not cause death of heart tissue, while if this anoxia is maintained, heart injury and finally necrosis occurs, that is , the heart attack.
  • AMI affects the function of the heart and, in particular, its electrophysiology resulting in ventricular fibrillation or tachycardia, which can lead to greater ischemia and a more extensive infarction and eventually lead to sudden cardiac death.
  • the ischemia that accompanies AMI results in cardiac necrosis of the infarcted area of the heart.
  • the body itself to repair said cardiac necrosis, begins a process of vascular remodeling that includes angiogenesis processes, releasing a large number of proliferation inducing factors and chemoattractants that stimulate the migration of stem cells resident in the heart to the area. damaged and also stimulates its multiplication and differentiation in cardiac muscle and coronary microvasculature.
  • Said angiogenic procedure is mainly carried out by proliferation inducers such as: hypoxia-inducible factor (HIF-1), granulocyte stimulating factor (G-CSF) (Engelmann MG et a 2006, J Am Coll Cardiol.
  • HIF-1 hypoxia-inducible factor
  • G-CSF granulocyte stimulating factor
  • progenitor cells which can give rise to cardiomyocytes, by the peripheral route, makes most of these cells not viable, or end up accumulating in the spleen or in reservonic organs, such as the lungs, and even when these cells have been implanted directly in the heart muscle, nor has a normalization or standardization been achieved in terms of the number of cells that must be implanted, the vehicle in which they are immersed to perform the implantation of them or even the place of the implant or the moment after suffering AMI (M. Hristov et al. Intracoronary infusion of autologous bone marrow cells and left ventricular function after acute myocardial infarction: a meta-analysis. J. Cell.
  • Another of the therapies currently used in the state of the art for the regeneration of the damages produced in post-AMI patients is the combined treatment of proliferation stimulating factors together with progenitor cells.
  • the proliferation factor G-CSF was administered to the patients along with bone marrow derived cells isolated from peripheral blood samples obtained from said patients. The results showed that despite the improvement in the ejection fraction of the left ventricle, that is, the ability to eject blood into the bloodstream, presented by patients treated with such therapy, it was observed that there was a serious restenosis of the implanted stent.
  • the implanted cells covered the stent obstructing and preventing blood flow, so that such therapy is also not advisable for the treatment of patients who have suffered an AMI (Kang HJ et al., Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem- cells mobilized with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarctiomthe MAGIC cell randomized clinical trial. Lancet. 2004; 363 (9411): 751-6).
  • the present invention describes the use of the isolated plasma of the coronary sinus (SC), preferably of patients. they have caused a heart disease to, more specifically, an AMI, as a medicine.
  • SC coronary sinus
  • the present invention also describes the use of said plasma isolated from the coronary sinus, preferably from patients who have suffered a cardiac pathology, for obtaining growth factors and / or for the preparation of a pharmaceutical composition aimed at the stimulation of survival, regeneration and / or repair of organs, specifically of the heart.
  • plasma isolated from the coronary sinus of patients who have suffered from heart disease and more specifically an AMI has a greater capacity for chemoattraction of cells important for cell and organ regeneration, in general, that the plasma isolated from peripheral blood samples from patients who have also suffered from heart disease, and more specifically an AMI.
  • the present invention also demonstrates that damaged cells after suffering a cardiac pathology, such as an AMI, release said SC a large number of growth factors and chemotactic factors, involved in the repair and proliferation of progenitor cells, such as, for example, Bone marrow derived progenitor cells (HSC), endothelial progenitor cells (EPC) or mesenchymal progenitor cells (MSC), among others.
  • a cardiac pathology such as an AMI
  • progenitor cells such as, for example, Bone marrow derived progenitor cells (HSC), endothelial progenitor cells (EPC) or mesenchymal progenitor cells (MSC), among others.
  • the present invention also describes an in vitro method for stimulating the survival, repair and / or regeneration of organs, characterized by the application of plasma isolated from the coronary sinus of patients who have suffered a cardiac pathology, preferably an AMI, in said organs.
  • Both the plasma isolated from the coronary sinus, preferably from patients who have suffered a cardiac pathology, as well as the methods described in the present invention, are capable of inducing a greater regeneration of the organs, particularly of the heart after the damage suffered, without presenting histocompatibility problems. as in the case of heart cell transplants.
  • the methods based on cell transplantation in addition to presenting the aforementioned disadvantage, are very expensive, both economically and in the use of material and human resources. If instead of performing cell transplants in patients who have suffered an AMI or any other cardiac pathology, growth factors are used, the process would be fast, cheap and affordable to the majority of patients who need it.
  • the term coronary sinus refers to a venous duct located in the posterior wall of the heart that receives all the venous blood from it and transfers it to the right atrium.
  • growth factor refers to a set of substances, most of a protein nature, which, together with hormones and neurotransmitters, play an important role in intercellular communication. Its main function is to stimulate cell proliferation by regulating the cell cycle by initiating mitosis, in addition to maintaining cell survival, stimulating cell migration and cell differentiation. These growth factors are transported by serum and produced by a large number of cells.
  • growth factors included in the present invention are: platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor beta (TGF-beta), bone morphogenic proteins (BMPs), fibroblast growth factors (FGF and KGF), epidermal growth factor (EGF) and related (TGF-alpha), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin type 1 growth factor (IGF-1), nerve growth (NGF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte and macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin (EPO), and thrombopoietin (TPO), among others.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF-beta transforming growth factor beta
  • BMPs bone morphogenic proteins
  • FGF and KGF fibroblast growth factors
  • EGF and KGF epidermal growth factor
  • TGF-alpha epidermal growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • chemotactic factor or “chemoattractant” refers to substances capable of preferentially attracting cells. This concept refers especially to those factors released as a result of tissue damage, invasion or immune activity, capable of attracting leukocytes, macrophages, progenitor cells or other cells, to the site of damage or where an infection is occurring.
  • chemoattractants or chemoattractants included in the present invention are: different types of interferons ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , etc.), interleukins, VEGF, SDF-1, TSP-1, IGF-1, BMP (natriuretic peptides), growth hormone (GH) secretagogues: Ghrelin, TGF-beta and matrix metalloproteinases, among others.
  • the term "vehicle” refers to the substance or medium, preferably liquid, together with which the progenitor cells isolated from peripheral blood of patients presenting with heart disease or any other type of pathology should be administered in the that the stimulation of the survival, repair and / or regeneration of some organ or tissue is necessary, such as diseases that lead to the production of cutaneous fistulas, Chron's disease, diseases in which cell regeneration is necessary endothelial, or bone tissue, or dermal tissue, etc.
  • the term “vehicle” refers to plasma isolated from the coronary sinus of patients suffering from heart disease and more preferably, patients who have suffered an AMI.
  • the plasma of the invention used as a vehicle may further comprise other therapeutically and / or pharmaceutically acceptable substances, known in the state of the art and which are obviously compatible with said progenitor cells.
  • progenitor cell refers to that cell capable of generating one or more differentiated cell types and which also has the capacity for self-renewal.
  • the progenitor cells can be selected from any of the group comprising: HSC, EPC, MSC, bone marrow derived cells (BMDC), umbilical cord derived endothelial cells (HUVEC), embryonic stem cells (ESC), KDR + embryonic stem cells ( Kinase inserted domain receptor also called VEGFR2: VEGF factor 2 receptor) and induced pluripotent cells (iPS), among others.
  • BMDC bone marrow derived cells
  • VEC umbilical cord derived endothelial cells
  • ESC embryonic stem cells
  • KDR + embryonic stem cells KDR + embryonic stem cells
  • iPS induced pluripotent cells
  • the term pharmaceutically acceptable substances or excipients refers to excipients that do not produce any toxic effects when administered to animals, including humans. Said excipients may be selected from any of the list or a combination thereof: binders, fillers, disintegrants, lubricants, coaters, sweeteners, flavorings and dyes, among others.
  • the term “therapeutically effective amount” refers to that amount necessary to achieve the desired result, that is, it is the minimum effective amount, above which a composition, drug or active ingredient initiates its therapeutic effect.
  • the term "heart disease” refers to the presence of myocardial involvement of any etiology.
  • ischemic heart disease AMD
  • hypertensive heart disease CAD
  • valvular heart disease diseases related to heart valves
  • family heart disease myocarditis, infiltrative myocardial disease, dilated cardiomyopathy, among others, and any of your combinations Description of the figures
  • Figure 1 Photographs obtained by flow cytometry (Dako cytomation, Dako, USA) showing circulating endothelial progenitor cells expressing the CD133 + and KDR + markers, obtained from peripheral plasma samples of patients with heart disease and that have been grown for 5 days (A) and 7 days (B) in Endothelial Basal Medium Medium EBM-2 (Cambrex, Lonza, Switzerland) supplemented with growth factors.
  • Circulating endothelial progenitor cells have been incubated in the presence of monoclonal antibodies CD133 bound to phycoerythrin (CD-133-PE) (clone AC133, Milteny Germany) and KDR bound to allophycocyanin (KDR-APC) (clone 89106 R&D, USA).
  • CD133-PE phycoerythrin
  • KDR-APC KDR bound to allophycocyanin
  • FIG. 1 Photographs obtained with an inverted fluorescence microscope of cells labeled with calcein AM that have passed through the fluoroblock membrane (BD Bioscience, USA) in the presence of the chemotactic factor VEGF (a) or the plasma of a patient who has suffered acute myocardial infarction with more than 7 days post-infarction (b) or chemotactic factor SDF-1 (c) or coronary sinus plasma of a patient with 1 day post-infarction (d).
  • the images have been taken using a Nikon inverted microscope model TE2000-U and images were taken with the Nikon camera model DS5MC.
  • FIG. 3 Migration test.
  • the graph shows the increase in the number of mononuclear cells (Y axis) from plasma obtained from peripheral blood (PP) and coronary sinus (PSC) samples of patients with AMI who have passed through the fluoroblock membrane ( BD Bioscience, USA) in the presence of the different chemotactic factors used in the assay (X axis) with respect to the positive control (10% is fetal bovine serum, FBS).
  • the graph shows the mean ⁇ standard deviation of coronary sinus cells (black bars) vs peripheral blood (white bars).
  • TSP-1 thrombospondin-1
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SDF-1 stromal-derived factor 1
  • PP peripheral plasma from patients with diluted AMI at a concentration of 10% in EBM-2 culture medium
  • PSC coronary sinus plasma from patients with AMI diluted at a concentration of 10%> in EBM-2 culture medium.
  • the plasma obtained from the coronary sinus has factors, different from those known so far in the state of the art, capable of inducing proliferation and chemotaxis, of the stem cells present in the myocardium, favoring thus, the regeneration of said organ, and can therefore be used in cardiac regeneration procedures in those patients who have suffered a cardiac event, such as an AMI.
  • the present invention discloses the use of isolated plasma from the coronary sinus of patients suffering from heart disease as a medicine.
  • said plasma can be isolated from the coronary sinus of patients suffering from heart disease.
  • this object refers to plasma isolated from the coronary sinus, particularly of patients suffering from heart disease, to be used as a medicine.
  • Another object of the present invention relates to the use of plasma isolated from the coronary sinus, preferably from patients suffering from heart disease, to obtain a pharmaceutical composition intended to stimulate the survival, repair and / or regeneration of organs and / or tissues, such as endothelial tissue, bone, dermal, etc.
  • Another object of the present invention relates to the use of plasma isolated from the coronary sinus, preferably from patients suffering from heart disease, for obtaining growth and / or chemotactic factors intended to stimulate survival, repair and / or regeneration of organs and / or tissues.
  • HGF, IGF-1 stand out.
  • Another object of the present invention relates to the use of plasma isolated from the coronary sinus, preferably of patients suffering from heart disease, as a vehicle for the administration of progenitor cells intended for the stimulation of survival, repair and / or regeneration of organs. and / or tissues.
  • the cells parents are preferably isolated from peripheral blood, preferably from the patient who suffers from heart disease or from any patient who suffers from a disease in which the stimulation of survival, repair and / or regeneration of damaged organs and / or tissue is necessary, as for example, Chron's disease, diseases that develop with the appearance of skin fistulas, among others.
  • the progenitor cells isolated from said peripheral blood are preferably selected from any of the list: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR +, and / or iPS or combinations thereof.
  • the patients to whom the blood samples are taken from the coronary sinus to obtain the plasma are patients who have suffered an AMI.
  • the preferred organ capable of regenerating and / or repairing after an injury is the heart.
  • the preferred tissues capable of regenerating and / or repairing after an injury are preferably bone tissue, dermal tissue and epithelial tissue.
  • compositions comprising plasma isolated from the coronary sinus, preferably from patients suffering from heart disease, said heart disease preferably being AMI.
  • the composition described in the present invention is a pharmaceutical composition.
  • the composition of the invention further comprises pharmaceutically acceptable excipients.
  • the composition further comprises progenitor cells, which are selected from any of the list: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR + and / or iPS or combinations thereof.
  • composition described in the present invention can be used for the stimulation of the survival, repair and / or regeneration of tissues and / or organs, the heart being the preferred organ.
  • Another preferred embodiment of the invention would consist of a composition for preservation of extracted organs comprising plasma isolated from the coronary sinus, preferably from patients suffering from heart disease, preferably AMI.
  • Another object of the present invention relates to an in vitro method to stimulate the survival, repair and / or regeneration of extra-corporeal organs, characterized by the application of plasma isolated from the coronary sinus, preferably from patients suffering from heart disease, preferably AMI, or a composition comprising said plasma, to said mentioned organs.
  • the in vitro method described in the present invention is characterized in that the organ is preferably the heart.
  • Another object described in the present invention relates to the isolated plasma of the coronary sinus, preferably of patients suffering from heart disease, preferably AMI, to be used in the stimulation of survival, repair and / or regeneration of organs and / or tissues. .
  • Another object of the present invention relates to the plasma described in the present invention to be used as a vehicle for the administration of progenitor cells intended for the stimulation of survival, repair and / or regeneration of organs and / or tissues.
  • Another object of the present invention relates to a method of treating patients suffering from diseases that need for their treatment the stimulation of survival, repair and / or regeneration of organs and / or tissues, which comprises the administration of a quantity therapeutically effective of any of the compositions described in the present invention.
  • the diseases that need for their treatment the stimulation of the survival, repair and / or regeneration of organs and / or tissues are preferably selected from any of those included in the list: Chron's disease, diseases that they develop with the appearance of cutaneous fistulas, diseases in which regeneration of endothelial tissue, and / or bone tissue and / or dermal tissue, among others, is necessary.
  • Another object described in the present invention relates to a method of treating patients suffering from heart disease comprising the administration of a therapeutically effective amount of any of the compositions described in the present invention.
  • the treatment method described in the present invention is characterized in that the heart disease is AMI.
  • Example 1 Collection and processing of blood samples from patients with AMI.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • heparin BD vacutainer, USA
  • the peripheral blood and coronary sinus blood samples were centrifuged, immediately after extraction, at 3000 rpm for 15 minutes at a temperature of 4 ° C. Subsequently, a second centrifugation was carried out to eliminate the possible residual platelet residues that were left in said plasma sample. The conditions of the second centrifugation were 10,000 rpm at a temperature of 4 o C for 10 minutes.
  • the plasma samples obtained were stored at a temperature of -80 ° C until the time of the migration tests.
  • EBM-2 Growth factors added to the EBM-2 culture medium include fibroblast growth factor (FGF), endothelial growth factor (EGF) and insulin growth factor (IGF).
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF endothelial growth factor
  • IGF insulin growth factor
  • EBM-2 was added to the medium: glucagon, amphotericin D, penicillin-streptomycin and 20% FBS (Cambrex, Lonza, Switzerland). The cultivation was carried out in culture chambers at a temperature of 37 ° C and in a humid atmosphere at 5% CO 2 . This culture method allows in a first phase of culture of 48 hours of incubation, to discard mature circulating cells such as adult endothelial cells and monocytes, which adhere to the fibronectin coated culture plate.
  • the non-adhered cells are seeded in the culture medium specified above, remaining 7 days in incubation, replacing the medium every 3 days.
  • possible contaminations with non-adherent cells that preexist in the mononuclear phase of the blood such as lymphocytes, erythrocyte contaminations, etc. they are discarded, and the growth of circulating endothelial progenitor cells is favored (Figure 1).
  • the cells were trypsinized in a solution of Trypsin-EDTA lx (Sigma-Aldrich, USA) for 3 minutes in the culture chamber at a temperature of 37 ° C and in a humid atmosphere at 5% CO 2 .
  • the cells were then collected and resuspended in a 10% EBM-2 culture medium solution of FBS and centrifuged.
  • the cell pellet formed by circulating progenitor cells CD133 + was resuspended in lml of EBM culture medium supplemented with 10%> of FBS and also contained 5 ⁇ of calcein AM (Invitrogen, Spain), subsequently being kept in culture for 12 hours in a culture chamber at a temperature of 37 ° C, in a humid atmosphere with 5% CO 2 .
  • Calcein AM is a marker of cell viability, which allows the identification of living cells by giving rise to a green fluorescent staining in the cells that incorporate it into their metabolism, which can only happen when the cells are live Through this procedure of cell viability it was revealed through the use of the Nikon inverted microscope model TE2000-U, together with the Nikon camera model DS5MC, that 100% of the cultured cells were stained with AM calcein (Invitrogen, Spain) ( Figure 2).
  • FIGS. 2 The photographs shown in Figure 2 are the representation of the cells that have passed through the fluoroblock membrane (BD Bioscience, USA), which prevents the fluorescence of both ends of the membrane from adding up, therefore only they will quantify the cells that pass through said membrane, in the presence of VEGF chemoattractants (Figure 2a), SDF-1 (Figure 2c), plasma of a patient with AMI with more than 7 days post-infarction (Figure 2b) or plasma of the coronary sinus of a patient with 1 day post-infarction (Figure 2d).
  • Figure 2a VEGF chemoattractants
  • Figure 2c SDF-1
  • Figure 2b plasma of a patient with AMI with more than 7 days post-infarction
  • Figure 2d plasma of the coronary sinus of a patient with 1 day post-infarction
  • the cells were washed and resuspended in 0.1% EBM-2 medium of bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich, Spain) to carry out the migration assays.
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 2 Cell migration assays. For the performance of the cell migration assays, 100,000 cells, grown as explained in Example 1, were seeded in the upper part of a modified Boyden culture chamber with fluoroblock membrane (BD Bioscience, USA) of 8 ⁇ diameter in 0.1% EBM-2 culture medium of BSA. The size of the cells that are investigated determines the pore size of the membrane, and this is essential to choose a diameter that allows active transmigration. In this sense, a diameter of 8 ⁇ has been selected to allow passage through it of the endothelial progenitor cells present in the peripheral blood and coronary sinus plasma samples of patients with AMI described in the present invention.
  • fluoroblock membrane BD Bioscience, USA
  • chemoattractants tested were: 10% diluted FBS solution> in EBM-2 culture medium (positive control), thrombospondin-1 (TSP-1, RD USA) at a concentration of 200ng / ml (Maier KG 2009, Am J Surg. Nov; 198 (5): 664-9); Vascular endothelial growth factor (VEGF) at a concentration of 50ng / ml (Yu JX 2009 J Vasc Surg.
  • EBM-2 culture medium positive control
  • TSP-1 thrombospondin-1
  • RD USA thrombospondin-1
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • the readings were taken on a FLX800 BT model plate fluorimeter (Izasa, Spain) (480-530nm) to determine the migration capacity of said isolated cells in the presence of each of the tested substances.
  • a calibration line was used with ranges ranging from 150,000 cells to 1000 cells labeled with calcein-AM in EBM-2 medium. The results were expressed as the increase in the number of cells that pass through the relativized fluoroblock membrane with respect to the positive control of the study (10% FBS).
  • the plasma from the blood samples taken from the coronary sinus of patients with AMI has a greater chemoattractant capacity of both peripheral mononuclear cells, and, even more, of coronary sinus cells, more even than the factors SDF-1 and VEGF, widely known in the state of the art as one of the main and major chemo-agents present in plasma (Zaruba MM et al, 2010, Expert Opin Biol Ther. Mar; 10 (3): 321-35) .
  • plasma from the coronary sinus (PSC) of patients who have suffered AMI has a greater ability to chemoattract both progenitor endothelial cells obtained from peripheral blood, and, even more, for progenitor endothelial cells obtained from the blood of the coronary sinus of patients who have suffered an AMI. Therefore, the present invention shows that the coronary sinus in an important niche for the search of new therapeutic targets for the "homing" cell of progenitor cells, that is, for the ability of the progenitor cells to migrate from remote reservoirs from the affected or damaged area of the patient, to the ischemic, infarcted or damaged areas and for cell chemotherapy.
  • Example 3 Analysis of the presence of chemoattractant factors VEGF, SDF-1, HGF and TSP-1 in blood samples from coronary sinus of patients with AMI.
  • Table 1 shows the concentration (pg / mL) of the chemotactic agents mentioned above, in the blood samples from the coronary sinus of patients, between days 1-8 after suffering an AMI. As can be seen in said Table 1, no significant differences were found regarding the concentration of said chemoattractants with respect to the days elapsed since the coronary event, AMI.
  • the chemoradiant capacity shown in the present invention, which presents the plasma / serum of the coronary sinus of post-AMI patients, is not a consequence of the main markers recognized for their chemoattractant capacity: VEGF, SDF-1, HGF or TSP-1; but it is due to the existence in said plasma / serum of the presence of other molecules that possess said chemoattractant capacity, for the regeneration of the myocardial infarcted area.

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Abstract

La presente invención describe el uso de plasma aislado de muestras de sangre del seno coronario de pacientes que han sufrido una patología cardiaca, preferentemente un infarto agudo de miocardio para estimular la supervivencia, regeneración y/o reparación del órgano dañado. Además, la presente invención también describe el uso de dicho plasma aislado para la obtención de factores de crecimiento y/o para la elaboración de una composición farmacéutica que comprenda dicho plasma destinada a estimular la supervivencia, regeneración y/o reparación de órganos, específicamente del corazón. En la presente invención también se describe un método de tratamiento de pacientes aquejados de enfermedad cardiaca que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprenda plasma aislado del seno coronario de pacientes que padecen dicha enfermedad cardiaca.

Description

MÉTODOS DE REGENERACIÓN CELULAR POST-INFARTO AGUDO DE
MIOCARDIO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos específicos de regeneración celular, tisular y de órganos, especialmente el corazón, tras sufrir los pacientes una patología cardiaca, preferentemente un infarto agudo de miocardio. Dichos métodos están basados en el uso de plasma aislado del seno coronario y, preferentemente de pacientes que han sufrido dicho infarto agudo de miocardio.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los infartos agudos de miocardio (IAM) son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Son producidos por un riego sanguíneo insuficiente del corazón producido por una oclusión u obstrucción en los vasos sanguíneos coronarios. La isquemia o suministro deficiente de oxígeno que resulta de tal obstrucción produce la angina de pecho, que si se recanaliza precozmente no produce muerte del tejido cardíaco, mientras que si se mantiene esta anoxia se produce la lesión del corazón y finalmente la necrosis, es decir, el infarto. El IAM afecta a la función del corazón y, particularmente, a su electrofisiología dando como resultado la fibrilación ventricular o la taquicardia, que pueden provocar una mayor isquemia y un infarto más extenso y conllevar finalmente una muerte súbita cardiaca.
La isquemia que acompaña al IAM tiene como consecuencia la necrosis cardiaca de la zona infartada del corazón. El propio organismo, para reparar dicha necrosis cardiaca, comienza un proceso de remodelación vascular que incluye procesos de angiogénesis, liberando al torrente circulatorio gran cantidad de factores inductores de proliferación y quimioatrayentes que estimulan la migración de las células madre residentes en el corazón hacia la zona dañada y, además, estimula su multiplicación y diferenciación en músculo cardiaco y microvasculatura coronaria. Dicho procedimiento angiogénico es llevado a cabo principalmente por inductores de proliferación como: el factor inducible por hipoxia (HIF-1), el factor estimulante de granulocitos (G-CSF) (Engelmann MG et a 2006, J Am Coll Cardiol. Oct 17;48(8):1712-21., Lapidot T et al, Blood. 2005 Sep 15;106 (6):1901-10. May 12), el factor de crecimiento placentario (P1GF) y sus receptores (Khurana 2005, Circulación 111 : 2828-2836), diferentes miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y sus receptores (van Laake 2006, circulación, 114:2288 - 2297 de ALK; Bobik 2006, Biol 26 del florero de Arterioscler Thromb: 1712-1720; Bertolino 2005, tórax suplementa 128: 585-590), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), y factores de crecimiento angiogénicos, tales como el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), el factor derivado del estroma (SDF-1), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), (Hiasa K et al 2004 Circulation 109: 2454-2461 ; Dar A et al, 2006, Exp Hematol. Aug; 34(8):967-75), además de citoquinas y metaloproteinasas de matriz, que han sido también descritas como potentes factores angiogénicos (Nyberg F, 1990. FEBS Lett. 1990 Jul 2;267(l):75-7).
Las investigaciones de nuevas terapias en pacientes con infarto agudo de miocardio tratan de alcanzar la regeneración intrínseca de los cardiomiocitos para reparar los daños producidos por el infarto, así como en identificar los diferentes factores de crecimiento también implicados en dicha regeneración como una posible solución para la regeneración del corazón tras un IAM. En este sentido, uno de los tratamientos más utilizados, hasta la fecha, en el estado de la técnica, para reparar los daños producidos por el IAM es el transplante de cardiomiocitos o de células progenitoras, ya sean pluripotentes o multipotentes, es decir, aquellas células con capacidad intrínseca de diferenciarse a cardiomiocito y que son capaces de anclarse, implantarse (engraftment) ó fusionarse con el tejido preexistente sin ocasionar cambios en el control eléctrico del corazón, o arritmias ventriculares. Los principales problemas que presenta este tipo de tratamiento es que no se ha conseguido estandarizar un método específico para el transplante de dichos cardiomiocitos o células progenitoras ya que en los diferentes estudios existentes en el estado de la técnica, tanto el modo, como el número y como la capacidad de implantación de dichas células es muy heterogénea (Leone AM et al. From bone marrow to the arterial wall: the ongoing tale of endothelial progenitor cells. Eur Heart J. 2009 Apr; 30(8):890-9).
Además, existen estudios que demuestran que la implantación de células progenitoras, que pueden dar lugar a cardiomiocitos, por vía periférica, hace que la mayoría de dichas células no sean viables, o acaben acumulándose en el bazo o en órganos reservónos, como los pulmones, e incluso cuando dichas células han sido implantadas directamente en el músculo cardiaco tampoco se ha llegado a una normalización o estandarización en cuanto al número de células que deben implantarse, el vehículo en el que están inmersas para realizar la implantación de las mismas o incluso el lugar del implante o el momento después de sufrir el IAM (M. Hristov et al. Intracoronary infusión of autologous bone marrow cells and left ventricular function after acute myocardial infarction: a meta-analysis. J. Cell. Mol. Med. Vol 10, No 3, 2006 pp; Abdel-Latif A, et al., Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis. Arch Intern Med. 2007 May 28;167(10):989-97; Yousef M et al., The BALANCE Study: clinical benefit and long-term outcome after intracoronary autologous bone marrow cell transplantation in patients with acute myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology2009; 53(24):2262-9). Otros ensayos llevados a cabo también con células progenitoras procedentes de muestras de sangre periférica extraída de pacientes que han sufrido un IAM y que poseen el marcador CXCR4, que le permite el anclaje al tejido, tampoco han mostrado mejorías en los pacientes (Tendera M, et al. Intracoronary infusión of bone marrow-derived selected CD34+CXCR4+ cells and non-selected mononuclear cells in patients with acute STEMI and reduced left ventricular ejection fraction: results of randomized, multicentre Myocardial Regeneration by Intracoronary Infusión of Selected Population of Stem Cells in Acute Myocardial Infarction (REGENT) Trial. European Heart Journal. 2009; 30(11):1313-21).
Otra de las terapias utilizadas actualmente en el estado de la técnica para la regeneración de los daños producidos en los pacientes post-IAM es el tratamiento combinado de factores estimulantes de la proliferación junto con células progenitoras. En este sentido, en el ensayo clínico MAGIC trial se administró a los pacientes el factor de proliferación G-CSF junto con células derivadas de la médula ósea aisladas de muestras de sangre periférica obtenida de dichos pacientes. Los resultados pusieron de manifiesto que a pesar de la mejora de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo, es decir, de la capacidad de eyeccionar sangre al torrente sanguíneo, que presentaban los pacientes tratados con dicha terapia, se observó que se producía una seria restenosis del stent implantado. Es decir, las células implantadas recubrían al stent obstruyendo e impidiendo el flujo sanguíneo, por lo que dicha terapia tampoco es aconsejable para el tratamiento de pacientes que han sufrido un IAM (Kang HJ et al., Effects of intracoronary infusión of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarctiomthe MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 2004; 363(9411):751-6).
Por lo tanto, hasta la fecha, no se ha encontrado un tratamiento estandarizado capaz de inducir la regeneración del miocardio dañado tras un IAM, ya sea mediante transplante directo de células progenitoras o mediante la implantación de factores inductores de proliferación o crecimiento. Existen estudios clínicos que demuestran que el tratamiento con el factor de proliferación G-CSF, puede mejorar la regeneración del miocardio de dichos pacientes, pero aún no se ha obtenido un tratamiento estandarizado para los mismos (Ellis SG, et al. Granulocyte colony stimulating factor in patients with large acute myocardial infarction: results of a pilot dose-escalation randomized trial. American Heart Journal.2006; 152(6): 1051 e9-14; Takano H, et al. , Feasibility and safety of granulocyte colony-stimulating factor treatment in patients with acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology. 2007; 122(l):41-7; Zohlnhofer D, et al., Stem cell mobilization by granulocyte colony- stimulating factor in patients with acute myocardial infarction: a randomized controlled trial. Jama. 2006; 295(9):1003-10).
En este sentido, todos los estudios, realizados hasta la actualidad, en el estado de la técnica para averiguar cuales eran los factores de crecimiento capaces de inducir la regeneración del corazón tras un IAM, se han basado en análisis de muestras de sangre periférica de pacientes con IAM. Hasta el momento, no se conoce cuales son los factores de crecimiento específicos o una combinación de los mismos, presentes en dichas muestras de sangre periférica que son capaces de inducir y estimular la migración de las células madre residentes en el corazón hacia la zona dañada y, además, estimular su multiplicación y diferenciación en músculo cardiaco y microvasculatura coronaria. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
Para solventar el problema existente en el estado de la técnica en cuanto a cuáles son los factores de crecimiento implicados en la estimulación de la supervivencia, regeneración y/o reparación de órganos dañados, así como los métodos alternativos a los conocidos en el estado de la técnica, capaces de inducir una mayor estimulación y capacidad de supervivencia, regeneración y/o reparación de órganos dañados tras una patología, preferentemente cardiaca, la presente invención describe el uso del plasma aislado del seno coronario (SC), preferentemente de p aciente s que han p adecido una enferme dad cardiac a, más específicamente, un IAM, como medicamento.
Además, la presente invención también describe el uso de dicho plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que han sufrido una patología cardiaca, para la obtención de factores de crecimiento y/o para la elaboración de una composición farmacéutica destinada a la estimulación de la supervivencia, regeneración y/o reparación de órganos, específicamente del corazón. Como se describe a lo largo de la presente invención, el plasma aislado del seno coronario de pacientes que han padecido una enfermedad cardiaca y más específicamente un IAM posee una mayor capacidad de quimioatracción de células importantes para la regeneración celular y de órganos, en general, que el plasma aislado de muestras de sangre periférica de pacientes que también han padecido una enfermedad cardiaca, y más específicamente un IAM.
La presente invención también demuestra que las células dañadas tras sufrir una patología cardiaca, como por ejemplo un IAM, liberan a dicho SC gran cantidad de factores de crecimiento y factores quimiotácticos, implicados en la reparación y proliferación de células progenitoras, como por ejemplo, las células progenitoras derivadas de médula ósea (HSC), las células progenitoras endoteliales (EPC) o las células progenitoras mesenquimales (MSC), entre otras.
También la presente invención describe un método in vitro para estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos, caracterizado por la aplicación de plasma aislado del seno coronario de pacientes que han sufrido una patología cardiaca, preferentemente un IAM, en dichos órganos.
Tanto el plasma aislado del seno coronario preferentemente de pacientes que han padecido una patología cardiaca, como los métodos descritos en la presente invención, son capaces de inducir una mayor regeneración de los órganos, particularmente del corazón tras el daño sufrido, sin presentar problemas de histocompatibilidad como sucede en el caso de los transplantes de células cardiacas. Además, los métodos basados en el transplante de células además de presentar la desventaja mencionada previamente, son muy caros, tanto desde el punto de vista económico, como en el uso de recursos materiales y humanos. Si en lugar de realizar transplantes celulares en pacientes que han sufrido un IAM o cualquier otra patología cardiaca, se utilizan factores de crecimiento, el proceso seria rápido, barato y asequible a la mayoría de enfermos que lo necesitan.
A efectos de la presente invención, el término seno coronario se refiere a un conducto venoso ubicado en la pared posterior del corazón que recibe toda la sangre venosa de éste y la traslada a la aurícula derecha. A los efectos de la presente invención el término factor de crecimiento se refiere a un conjunto de sustancias, la mayoría de naturaleza proteica, que, junto con las hormonas y los neurotransmisores, desempeñan una importante función en la comunicación intercelular. Su función principal es estimular la proliferación celular mediante la regulación del ciclo celular iniciando la mitosis, además de mantener la supervivencia celular, estimular la migración celular y la diferenciación celular. Dichos factores de crecimiento son transportados por el suero y producidos por gran número de células. Entre los factores de crecimiento incluidos en la presente invención destacan: factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), proteínas morfogénicas del hueso (BMPs), factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF y KGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y relacionados (TGF-alfa), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G- CSF), factor estimulante de colonias de granulocito y macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina (EPO), y trombopoyetina (TPO), entre otros.
A los efectos de la presente invención el término factor quimiotáctico o quimioatrayente hace referencia a sustancias capaces de atraer, preferentemente, a células. Dicho concepto se refiere especialmente a aquellos factores liberados como resultado de un daño tisular, invasión o actividad inmunológica, capaces de atraer a leucocitos, macrófagos, células progenitoras u otras células, al sitio del daño o en el que se está produciendo una infección. Entre los factores quimiotácticos o quimioatrayentes incluidos en la presente invención destacan: distintos tipos de interferones (α, β, δ, κ, γ, ε, etc), interleucinas, VEGF, SDF-1, TSP-1, IGF-1, BMP (péptidos natriuréticos), secretagogos de la hormona del crecimiento (GH): Ghrelina, TGF- beta y metaloproteinasas de matriz, entre otros.
A efectos de la presente invención, el término vehículo hace referencia a la sustancia o medio, preferentemente líquido, junto con el cuál se deben administrar las células progenitoras aisladas de sangre periférica de pacientes que presenten una enfermedad cardiaca o cualquier otro tipo de patología en la que sea necesaria la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de algún órgano o tejido, como por ejemplo, enfermedades que se den lugar a la producción de fístulas cutáneas, enfermedad de Chron, enfermedades en las que sea necesario la regeneración de células endoteliales, o de tejido óseo, o de tejido dérmico, etc. En la presente invención, el término vehículo hace referencia al plasma aislado del seno coronario de pacientes que padecen enfermedad cardiaca y más preferentemente, enfermos que han sufrido un IAM. El plasma de la invención utilizado como vehículo puede además comprender otras sustancias terapéuticamente y/o farmacéuticamente aceptables, conocidas en el estado de la técnica y que obviamente sean compatibles con dichas células progenitoras. A efectos de la presente invención el término célula progenitora se refiere a aquella célula capaz de generar uno o más tipos de células diferenciadas y que además posee la capacidad de autorrenovación. Las células progenitoras pueden seleccionarse de entre cualquiera del grupo que comprende: HSC, EPC, MSC, células derivadas de médulas ósea (BMDC), células endoteliales derivadas de cordón umbilical (HUVEC), células madre embrionarias (ESC), células madre embrionarias KDR+ (Kinase inserí domain receptor también denominado VEGFR2: receptor 2 del factor VEGF) y células pluripotentes inducidas (iPS), entre otras.
A los efectos de la presente invención el término sustancias o excipientes farmacéuticamente aceptables se refiere excipientes que no producen ningún efecto tóxico cuando son administrados a animales, incluyendo los seres humanos. Dichos excipientes pueden seleccionarse de entre cualquiera de la lista o una combinación de los mismos: aglutinantes, rellenadores, disgregantes, lubricantes, recubridores, edulcorantes, saborizantes y colorantes, entre otros. A los efectos de la presente invención el término cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado deseado, es decir, es la cantidad mínima efectiva, por encima de la cuál una composición, fármaco o principio activo, inicia su efecto terapéutico. A los efectos de la presente invención el término enfermedad cardiaca se refiere a la presencia de afectación miocárdica de cualquier etiología. Entre las enfermedades cardiacas referidas en la presente invención se encuentran la cardiopatía isquémica (IAM), la cardiopatía hipertensiva, valvulopatías (enfermedades relacionadas con las válvulas del corazón), cardiopatías familiares, miocarditis, enfermedad miocárdica infiltrativa, miocardiopatía dilatada, entre otras y cualquiera de sus combinaciones. Descripción de las figuras
Figura 1. Fotografías obtenidas mediante citometría de flujo (Dako cytomation, Dako, USA) en las que se muestran las células progenitoras endoteliales circulantes que expresan los marcadores CD133+ y KDR+, obtenidas de muestras de plasma periférico de pacientes con enfermedad cardiaca y que han sido cultivadas durante 5 días (A) y 7 días (B) en medio de cultivo Endothelial Basal Médium EBM-2 (Cambrex, Lonza, Switzerland) suplementado con factores de crecimiento. Las células progenitoras endoteliales circulantes se han incubado en presencia de los anticuerpos monoclonales CD133 unido a ficoeritrina (CD-133-PE) (clon AC133, Milteny Alemania) y KDR unido a aloficocianini (KDR-APC) (clon 89106 R&D, USA). En el eje X se muestran las células que expresan el marcador CD133 expresado como unidades de emisión de fluorescencia al estar unidas al anticuerpo CD133-PE. En el eje Y se muestran las células que expresan el marcador KDR expresado como unidades de emisión de fluorescencia al estar unidas al anticuerpo KDR-APC.
Figura 2. Fotografías obtenidas con microscopio invertido de fluorescencia de células marcadas con calceína AM que han pasado a través de la membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA) en presencia del factor quimiotáctico VEGF (a) o del plasma de un paciente que ha sufrido infarto agudo de miocardio con más de 7 días post-infarto (b) o del factor quimiotáctico SDF-1 (c) o del plasma del seno coronario de un paciente con 1 día post-infarto (d). Las imágenes han sido tomadas empleando un microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U y se tomaron imágenes con la cámara Nikon modelo DS5MC.
Figura 3. Ensayo de migración. La gráfica muestra el incremento en el número de células mononucleares (eje Y) procedentes del plasma obtenido de muestras de sangre periférica (PP) y sangre del seno coronario (PSC) de pacientes con IAM que han pasado a través de la membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA) en presencia de los diferentes factores quimiotácticos utilizados en el ensayo (eje X) respecto al control positivo (10% se suero bovino fetal, FBS). En la gráfica se muestran la media ± desviación estándar de las células del seno coronario (barras negras) vs sangre periférica (barras blancas). TSP-1 : trombospondina- 1, VEGF: factor de crecimiento vascular endotelial, SDF-1 : factor derivado de estroma 1, PP: plasma periférico procedente de pacientes con IAM diluido a una concentración del 10% en medio de cultivo EBM-2, PSC: plasma del seno coronario procedente de pacientes con IAM diluido a un concentración del 10%> en medio de cultivo EBM-2. (Lonza Cambrex, Switherland). La significación estadística se expresa como p<0,05 del PSC respecto al resto de quimioatrayentes.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención han encontrado que el plasma obtenido del seno coronario posee factores, diferentes a los conocidos hasta ahora en el estado de la técnica, capaces de inducir la proliferación y la quimiotáxis, de las células madre presentes en el miocardio, favoreciendo así la regeneración de dicho órgano, pudiendo por tanto ser utilizado en procedimientos de regeneración cardiaca en aquéllos enfermos que han sufrido un evento cardiaco, como por ejemplo, un IAM.
Así, la presente invención, divulga el uso de plasma aislado del seno coronario de pacientes que padecen enfermedad cardiaca como medicamento. Preferentemente, dicho plasma puede ser aislado del seno coronario de pacientes que padecen enfermedad cardiaca. Además, este objeto hace referencia al plasma aislado del seno coronario, particularmente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, para ser usado como medicamento.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere al uso de plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, para la obtención de una composición farmacéutica destinada a estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos, como por ejemplo, tejido endotelial, óseo, dérmico, etc.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere al uso del plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, para la obtención de factores de crecimiento y/o quimiotácticos destinados a la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos. Entre los factores de crecimiento y/o quimiotácticos presentes en dicho plasma destacan, el HGF, IGF-1. TGF-beta, TGF-alfa, BMPs, PDGF, VEGF, IGF-1, Interferon-gamma, interleucinas, secretagogo de la hormona del crecimiento Ghrelin, FGF, KGF, EGF, NGF, G-CSF, GM-CSF, EPO, TPO, SDF-1 y TSP-1, entre otros y cualquiera de sus combinaciones.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere al uso del plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, como vehículo para la administración de células progenitoras destinadas a la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos. En este sentido, las células progenitoras se aislan preferentemente de sangre periférica, preferentemente del propio paciente que padece una enfermedad cardiaca o bien de cualquier paciente que padece una enfermedad en la que sea necesaria la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejido dañado, como por ejemplo, la enfermedad de Chron, enfermedades que se desarrollan con la aparición de fístulas cutáneas, entre otras. Además, las células progenitoras aisladas de dicha sangre periférica se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de la lista: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR+, y/o iPS o combinaciones de las mismas. En una realización preferida de la presente invención, los pacientes a los que se les extraen las muestras de sangre del seno coronario para obtener el plasma, son pacientes que han sufrido un lAM.
En otra realización preferida de la invención, el órgano preferido capaz de regenerarse y/o repararse tras una lesión es el corazón.
En otra realización preferida de la invención, los tejidos preferidos capaces de regenerarse y/o repararse tras una lesión son preferentemente el tejido óseo, el tejido dérmico y el tejido epitelial.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a una composición que comprende plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, siendo preferentemente dicha enfermedad cardiaca, IAM. En una realización preferida, la composición descrita en la presente invención es una composición farmacéutica. En una realización más preferida, la composición de la invención, además comprende excipientes farmacéuticamente aceptables. En otra realización aún más preferida, la composición, además comprende células progenitoras, que se seleccionan de entre cualquiera de la lista: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR+ y/o iPS o combinaciones de las mismas.
La composición descrita en la presente invención, puede ser usada para la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de tejidos y/o órganos, siendo el órgano preferido el corazón. Otra realización preferida de la invención consistiría en una composición para conservación de órganos extraídos que comprenda plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, preferentemente IAM. Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método in vitro para estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos extraídos extra-corpóreamente caracterizado por la aplicación del plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, preferentemente IAM, o una composición que comprenda dicho plasma, a dichos órganos mencionados.
En una realización preferida, el método in vitro descrito en la presente invención se caracteriza por que el órgano es preferentemente el corazón.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al plasma aislado del seno coronario, preferentemente de pacientes que padecen enfermedad cardiaca, preferentemente IAM, para ser usado en la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere al plasma descrito en la presente invención para ser usado como vehículo para la administración de células progenitoras destinadas a la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.
Otro de los objetos de la presente invención se refiere a un método de tratamiento de pacientes aquejados de enfermedades que necesitan para su tratamiento la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones descritas en la presente invención. A efectos de la presente invención, las enfermedades que necesitan para su tratamiento la estimulación de la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de las comprendidas en la lista: enfermedad de Chron, enfermedades que se desarrollan con la aparición de fístulas cutáneas, enfermedades en las que es necesario la regeneración del tejido endotelial, y/o del tejido óseo y/o del tejido dérmico, entre otras. Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere a un método de tratamiento de pacientes aquejados de enfermedad cardiaca que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones descritas en la presente invención. En una realización preferida, el método de tratamiento descrito en la presente invención se caracteriza por que la enfermedad cardiaca es IAM.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar la invención y no pretenden limitar el alcance de la misma.
Ejemplo 1. Obtención y procesamiento de las muestras sangre de pacientes con IAM.
Se han tomado muestras de sangre tanto periférica como del seno coronario de pacientes con IAM (n=8), previo consentimiento informado durante la intervención quirúrgica no invasiva a la que fueron sometidos. Dichas muestras de sangre fueron procesadas por separado, aislando en ambas muestras de sangre, periférica y del seno coronario, por un lado el plasma, utilizando para ello ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y, por otro lado, las células progenitoras endoteliales, utilizando heparina (BD vacutainer, USA) como anticoagulante.
Para la obtención del plasma, las muestras de sangre periférica y de sangre del seno coronario se centrifugaron, inmediatamente a su extracción, a 3000 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 4°C. Posteriormente se realizó una segunda centrifugación para la eliminación de los posibles restos plaquetarios residuales que quedasen en dicha muestra de plasma. Las condiciones de la segunda centrifugación fueron 10000 rpm a una temperatura de 4o C durante 10 minutos. Las muestras de plasma obtenidas se almacenaron a una temperatura de -80°C hasta el momento de realizar los ensayos de migración.
Para la obtención de las células progenitoras endoteliales de las muestras de sangre periférica y del seno coronario de los pacientes con IAM, dichas muestras de sangre fueron sometidas a un proceso de centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll (Sigma-Aldrich, USA) a 800g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares obtenidas de la primera centrifugación se lavaron con buffer fosfato (PBS) al 1% de suero bovino fetal (FBS, Cambrex, Lonza, Switzerland). Posteriormente, se sembraron en placas de cultivo recubiertas con fibronectina según el método descrito por Hill y colaboradores (Hill JM et al 2003, N Engl J Med 348: 593-600) y se mantuvieron durante 7 días en medio de cultivo específico para el crecimiento de células endoteliales el Endothelial Basal Médium EBM-2 (Cambrex, Lonza, Switzerland) suplementado con diferentes factores de crecimiento para potenciar el crecimiento de las células progenitoras circulantes periféricas. Mediante ensayos de citometría, usando el marcado primitivo CD133+ que está asociado a regeneración celular, se comprobó que el tiempo óptimo de cultivo para obtener las células progenitoras endoteliales fueron 7 días (Figura 1). Por tanto, durante dichos 7 días, las células se mantuvieron en cultivo para obtener las células progenitoras endoteliales.
Entre los factores de crecimiento adicionados al medio de cultivo EBM-2 se encuentran el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), el factor de crecimiento endotelial (EGF) y el factor de crecimiento insulínico (IGF). Además, se añadió al medio EBM-2: glucagón, anfotericina D, penicilina-estreptomicina y 20% de FBS (Cambrex, Lonza, Switzerland). El cultivo se llevó a cabo en cámaras de cultivo a una temperatura de 37 °C y en una atmósfera húmeda al 5% de CO2. Esté método de cultivo permite en una primera fase de cultivo de 48 horas de incubación, descartar las células circulantes maduras como son células endoteliales adultas y los monocitos, que se adhieren a la placa de cultivo recubierta por fibronectina. En una segunda fase de cultivo se siembran las células no adheridas en el medio de cultivo especificado con anterioridad, permaneciendo 7 días en incubación, recambiando el medio cada 3 días. De esta manera, las posibles contaminaciones con células no adherentes que preexisten en la fase mononucleada de la sangre, como linfocitos, contaminaciones con eritrocitos, etc. son descartadas, y se favorece el crecimiento de las células progenitoras endoteliales circulantes (Figura 1).
Transcurrido dicho tiempo las células fueron tripsinizadas en una solución de Tripsina-EDTA lx (Sigma-Aldrich, USA) durante 3 minutos en la cámara de cultivo a una temperatura de 37°C y en atmósfera húmeda al 5% de CO2. A continuación, las células se recogieron y se resuspendieron en una solución de medio de cultivo EBM-2 al 10% de FBS y se centrifugaron. El pellet celular formado por células progenitoras circulantes CD133+ se resuspendió en lml de medio de cultivo EBM suplementado con 10%> de FBS y que además contenía 5μΜ de calceina AM (Invitrogen, España), manteniéndose posteriormente en cultivo durante 12 horas en cámara de cultivo a una temperatura de 37°C, en atmósfera húmeda con un 5% CO2. La calceina AM es un marcador de viabilidad celular, que permite la identificación de las células vivas al dar lugar a una tinción verde fluorescente en las células que lo incorporan en su metabolismo, lo cual solo puede suceder cuando las células están vivas. Mediante dicho procedimiento de viabilidad celular se puso de manifiesto a través del empleo del microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U, junto con la cámara Nikon modelo DS5MC, que el 100% de las células cultivadas se encontraban teñidas con calceína AM (Invitrogen, España) (Figura 2). Las fotografías mostradas en la Figura 2 son la representación de las células que han pasado a través de la membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA), la cual impide que la fluorescencia de ambos extremos de la membrana se sume, por lo tanto solo se cuantificarán las células que pasan a través de dicha membrana, en presencia de los quimioatrayentes VEGF (Figura 2a), SDF-1 (Figura 2c), plasma de un paciente con IAM con más de 7 días post-infarto (Figura 2b) o plasma del seno coronario de un paciente con 1 día post-infarto (Figura 2d).
Posteriormente las células fueron lavadas y resuspendidas en medio EBM-2 al 0,1 % de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich, España) para llevar a cabo los ensayos de migración.
Ejemplo 2. Ensayos de migración celular. Para la realización de los ensayos de migración celular se sembraron 100.000 células, cultivadas según se ha explicado en el Ejemplo 1, en la parte superior de una cámara de cultivo modificada de Boyden con membrana de fluoroblock (BD Bioscience, USA) de 8 μιη de diámetro en medio de cultivo EBM-2 al 0,1 % de BSA. El tamaño de las células que son investigadas determina el tamaño del poro de la membrana, y esto es esencial para elegir un diámetro que permita una transmigración activa. En este sentido se ha seleccionado un diámetro de 8 μιη para permitir el paso a través del mismo de las células progenitoras endoteliales presentes en las muestras de plasma de sangre periférica y de seno coronario de los pacientes con IAM descritos en la presente invención. En la parte inferior de la cámara de Boyden se sembraron las diferentes sustancias quimiotácticos que se testaron en el presente ensayo a las concentraciones previamente descritas para las mismas en el estado de la técnica. Las sustancias quimioatrayentes testadas fueron: solución de FBS diluido al 10%> en medio de cultivo EBM-2 (control positivo), trombospondina-1 (TSP-1, RD USA) a una concentración de 200ng/ml (Maier KG 2009, Am J Surg. Nov; 198(5):664-9); factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a una concentración de 50ng/ml (Yu JX 2009 J Vasc Surg. Sep; 50(3):608-l 6); factor derivado de células estromales-1 (SDF-1) a una concentración de lOOng/ml (Yu JX 2009 J Vasc Surg. Sep; 50(3):608-16), solución diluida en medio de cultivo EBM-2 al 10%> de plasma procedente del seno coronario de pacientes con IAM y solución diluida en medio de cultivo EBM-2 al 10% de sangre periférica de pacientes con IAM. Las células se mantuvieron en cultivo en presencia de los diferentes factores quimioatrayentes mencionados, así como del plasma obtenido de las muestras de sangre periférica y del seno coronario de pacientes que han padecido un IAM, en la cámara de Boyden durante 24 horas a una temperatura de 37°C y en atmósfera húmeda al 5% de CO2. Transcurrido dicho tiempo se realizaron las lecturas en un fluorímetro de placa modelo FLX800 BT (Izasa, España) (480- 530nm) para averiguar la capacidad de migración de dichas células aisladas en presencia de cada una de las sustancias testadas. Para la cuantificación del número total de células por pocilio se utilizó una recta de calibración con rangos que variaron de 150.000 células a 1000 células marcadas con calceína- AM en medio EBM-2. Los resultados se expresaron como el incremento del número de células que pasan a través de la membrana de fluoroblock relativizados con respecto al control positivo del estudio (10% de FBS). Como puede observarse en la Figura 3 el plasma proveniente de las muestras de sangre extraídas del seno coronario de pacientes con IAM posee una mayor capacidad quimioatrayente tanto de células mononucleares periféricas, como, más aún, de células del seno coronario, más incluso que los factores SDF-1 y VEGF, ampliamente conocidos en el estado de la técnica como unos de los principales y mayores quimiotrayentes presentes en el plasma (Zaruba MM et al, 2010, Expert Opin Biol Ther. Mar; 10 (3):321-35). Sin embargo y, como se muestra en la Figura 3, el plasma proveniente del seno coronario (PSC) de pacientes que han padecido IAM presenta una mayor capacidad de quimioatracción tanto para las células endoteliales progenitoras obtenidas de la sangre periférica, como, más aún, para las células endoteliales progenitoras obtenidas de la sangre del seno coronario de los pacientes que han sufrido un IAM. Por lo tanto la presente invención pone de manifiesto que el seno coronario en un nicho importante para la búsqueda de nuevas dianas terapeúticas para el "homing" celular de células progenitoras, es decir, para la capacidad que presentan las células progenitoras para migrar desde reservónos alejados de las zona afectada o dañada del paciente, hacia las zonas isquémicas, infartadas o dañadas y para la quimiatracción celular.
Ejemplo 3. Análisis de la presencia de los factores quimioatrayentes VEGF, SDF-1, HGF y TSP-1 en muestras de sangre del seno coronario de pacientes con IAM.
Para el análisis de la concentración de los factores quimiotácticos se extrajeron, en tubos con EDTA, muestras de sangre procedentes del seno coronario de los pacientes que habían sufrido un IAM (Ver Ejemplo 1), para posteriormente proceder al aislamiento del plasma de dichas muestras. Dicha sangre se almacenó rápidamente en hielo a 4o C para su procesamiento. El procesamiento de las muestras para el posterior análisis de la presencia de los factores quimiotácticos: VEGF, SDF-1, HGF y TSP-1 fue realizado en un tiempo inferior a 30 minutos debido al proceso de endocitosis plaquetario de ciertos componentes sanguíneos, como es el caso de la citoquina VEGF. Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a lOOOg a una temperatura de 4°C. Se recogió la fase plasmática que fue nuevamente sometida a centrifugación durante 10 min. a 10000g a 4°C. El plasma obtenido se almacenó a una temperatura de -80°C hasta su posterior análisis.
El análisis de la concentración de los factores quimiotácticos, mencionados previamente, en el plasma aislado de muestras de sangre extraídas del seno coronario de pacientes que habían sufrido un IAM, se realizó mediante kits comerciales de ELISA, para cada uno de los factores quimiotácticos analizados (VEGF, SDF-1, HGF y TSP-1) y siguiendo las instrucciones del fabricante (R&D systems, Minneapolis MN).
En la tabla 1 se muestra la concentración (pg/mL) de los quimiotácticos mencionados previamente, en las muestras de sangre del seno coronario de pacientes, entre los día 1-8 tras sufrir un IAM. Como se puede observar en dicha Tabla 1 no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la concentración de dichos quimioatrayentes respecto a los días transcurridos desde el evento coronario, IAM. Por lo tanto, de dichos resultados se deduce que la capacidad quimiotrayente, mostrada en la presente invención, que presenta el plasma/suero del seno coronario de pacientes post-AMI, no es consecuencia de los principales marcadores reconocidos por su capacidad quimioatrayente: VEGF, SDF-1, HGF o TSP-1 ; sino que es debida a la existencia en dicho plasma/suero de la presencia de otras moléculas que poseen dicha capacidad quimioatrayente, para la regeneración de la zona infartada del miocardio.
Tabla 1. Concentración de marcadores quimiotácticos en muestras de plasma aislado de sangre del seno coronario de pacientes con IAM.
Días VEGF SDF-1 HGF TSP-1 post-infarto (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL)
Paciente 1 5 - 1281 820 208
Paciente 2 1 28 1889 8000 -
Paciente 3 2 19 1643 4687 167
Paciente 4 7 7 2488 11939 83
Paciente 5 6 7 2359 5955 -
Paciente 6 8 7 3069 32015 1240
Paciente 7 1 7 1920 32773 317
Paciente 8 6 51 3686 10045 662

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1.- Uso del plasma aislado del seno coronario para la fabricación de un medicamento.
2.- Uso del plasma aislado seno coronario según la reivindicación 1 caracterizado por que el plasma es de pacientes que padecen enfermedad cardiaca.
3. - Uso del plasma aislado del seno coronario según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para la obtención de una composición farmacéutica destinada a estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.
4. - Uso del plasma aislado del seno coronario según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para la obtención de factores de crecimiento y/o quimiotácticos destinados a estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.
5. - Uso del plasma aislado del seno coronario según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 como vehículo para células progenitoras destinadas a estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.
6.- Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado por que la enfermedad cardiaca es preferentemente infarto agudo de miocardio.
7. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que el órgano es el corazón.
8. - Uso según las reivindicaciones 5 a 7 caracterizado por que las células progenitoras se seleccionan de entre cualquiera de la lista: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR+ y/o iPS o combinaciones de las mismas.
9.- Composición que comprende plasma aislado del seno coronario.
10.- Composición según la reivindicación 9 caracterizada por que el plasma es de pacientes con enfermedad cardiaca.
11- Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 que es una composición farmacéutica.
12. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que además comprende excipientes farmacéuticamente aceptables.
13. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que además comprende células progenitoras.
14.- Composición según la reivindicación 13, donde las células progenitoras se seleccionan de entre cualquiera de la lista: HSC, EPC, MSC, BMDC, HUVEC, ESC, KDR+ y/o iPS o combinaciones de las mismas.
15. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 para su uso en estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos y/o tejidos.
16. - Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 para la conservación de órganos extraídos extra-corpóreamente.
17.- Método in vitro para estimular la supervivencia, reparación y/o regeneración de órganos extraídos extra-corpóreamente caracterizado por la aplicación de plasma aislado del seno coronario o de una composición que comprenda dicho plasma, según se define en las reivindicaciones 9 a 14, a dichos órganos.
18.- Método según la reivindicación 17 caracterizado por que el plasma aislado del seno coronario pertenece a pacientes que padecen enfermedad cardiaca.
19. - Método según la reivindicación 18 caracterizado por que la enfermedad cardiaca es infarto agudo de miocardio.
20. - Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 caracterizado por que el órgano es el corazón.
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